Parte Il

RICERCHE E METODOLOGIE

NOTE SREVI

RICORDO DI

Ann I8t. Super. SoniM Vol. 23, N. l(1987). pp. 123-128

RICERCHE E ME TODOLOGIE

VALUTAZIONE COMPARATIVA DEI METODI DI ULTRACENTRIFUGAZIONE ANALITICA

E DI CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE PER L'ANALISI DEI COMPONENTI

MOLECOLARI DELLE IMMUNOGLOBULINE UMANE PER USO TERAPEUTICO

N. MUCCI (a), G. LANZI (a) e M. E. GRANDOLFO (b)

(a) hboratorio di Immunologia; (b) Laboratorio di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Superiore di Sanitd, Roma

Riassunto. - Cinquantacinque lotti di immunoglobuline antitetaniche commerciali sono stati analizzati mediante ultracentri~~gazione analitica e gel filtrazione. I valori ottenuti sono stati elaborati ed analizzati con il metodo della regressione lineare al fine di comparare criticamen- te i due metodi Sono state inoltre omlizzate le relazioni tra le varie forme molecolari di immunoglobuline eviden- ziabili con la gel filtrazione. I risultati confermano l'esistenza di un equilibrio tm componente monomerica (picco C) e gli altri componenti tranne gli aggregati

Summary (Comparative evaluation of the methods of analytical ultracentrifugation and gel chromatography for the analyais of molecular components of human immunoglobulin for therapeutic uee). - Fiftyfive lots of human immunoglobulins for thempeutic use were ana l~zed by analytienl ultracentrifugation and gel chromtogmphy. Compariaon between the two methods was performed by regression annlysis according to the linear model. The results appear to point out gel chromatogmphy ar a more sensitive method than analy- tical ultmcentri~ugation Moreover the posaible relation- ships among the different molecular forma detected by gel chrornatography were inuestigoted. The results confirm the presence of an inverse correlation between the levels of monomera and the other molecular com- ponents ercept aggregates.

Introduzione

Le preparazioni commerciali di immunoglobuline umane, normali e specifiche, rappresentano uno stru- mento profilattico e terapeutico molto importante in svariate condizioni cliniche. In tali preparazioni, accanto alla componente monomerica di anticorpi di classe IgG con coefficiente di sedimentazione 7 S. possono essere presenti aggregati ad alto peso molecolare con coeffi- ciente di sedimentazione 20-40 S che si formano, come artefatti, nel coi80 dei processi produttivi. Tali aggregati

sono stati ritenuti possibili cause di effetti couaterali tramite l'attivazione della via classica del complemento, con conseguenti reazioni di tipo anafilattoide [l-51, precipitazione del fattore reumatoide [6], rilascio d'istamina con reazioni cutanee [7]. L'aggregazione inoltre può portare alla formazione di nuovi determinan- ti antigeniei o alla rivelazione di determinanti "naecosti" provocando una reazione anticorpale anti-aggregati [2-51. La presenza, d'altra parte, di frammenti a baaw peso molecolare, con coefficiente di sedimentazione 3-5 S, prodotti dalla degradazione proteolitica, può pregiu- dicare l'efficacia terapeutica delle preparazioni stesse [SI.

Rivestono grande importanza, a tal riguardo, i metodi di analisi messi a punto per controllare le forme mole- colari (aggregati, dimeri, monomeri e frammenti) presen- ti nelle preparazioni in commercio. Tra questi, l'analisi alliiltracentrifuga analitica è stato il primo metodo di controllo adottato dalla Farmacopea Ufficiale (F.U.) [9 ] , in base al quale venivano prescritti i limiti quantita- tivi per le varie forme molecolari presenti nelle prepara- zioni stesse. Studi successivi [lo-111 hanno però messo in evidenza i vantaggi dell'analisi cromatografica per gel filtrazione, dimostrando il maggior potere risolutivo di questo metodo nell'individuazione e nella valutazione quantitativa delle varie forme molecolari presenti nel preparato.

Nel presente lavoro vengono riferiti i risultati di un confronto tra i due metodi, ultracentrifugazione anali- tica e gel filtrazione, utilizzati per il controllo delle forme molecolari in 55 lotti di immunoglobuline umane antitetaniche. Sono stati anche valutati i rapporti di amociazione tra le varie forme molecolari presenti nelle preparazioni determinate con la gel filtrazione.

Materiali e Metodi

Immunoglobuline. - Sono stati analizzati 55 lotti di immunoglobuline umane antitetaniche di sette diversi produttori secondo il seguente schema: ventuno della

casa produttrice n.1, nove della n.2, otto della n.3, otto della n.4, quattro della n.5, tre della n.6 e due della n.7.

Cromtografia per gel filtrazione. - E' stata effet- tuata nelle condizioni descritte da Araco et al. [l11 su una colonna (2.5 x 100 cm) di Ultrogel AcA 34 (LKB Produkter, Bromma, Svezia).

~tracentrifugozione annlitica. - E' stata realizzata nelle condizioni fissate dalla F.U. [9] con una ultracen- trifuga Beckmann Spinco modello E, dotata di un &tema ottico Schlieren. Le analisi sono state effettuate a temperatura ambiente.

Valutazione quantitativa delle aree dei singoli pic- ch i - La determinazione quantitativa dei componenti 6 stata effettuata per pesate dei singoli picchi ottenuti o direttamente dal tracciato di gel filtrazione o ingran- dendo x 1 0 la lastra fotografica ottenuta dall'ultracentri- fuga e proiettandola su carta miìlimetrata.

Anoliri statirtica - Per ciascun metodo sono stati calcolati la media (i), la deviazione standard (SD) ed il coefficiente di variazione (CV% ) delle frazioni ritenute confrontabili [l]]. La significatività della differenza tra le medie delle suddette frazioni, analizzate mediante gel filtrazione ed ultra~entrifu~azione analitica, è stata controllata con il test t di Student.

La correlazione tra i due metodi e tra le differenti specie molecolari determinate con la gel filtrazione è stata saggiata con l'analisi deUa regressione secondo il modello lineare.

Risultati

In Fig. 1 sono rappresentati i diversi componenti molecolari presenti in una preparazione commerciale di immunoglobuline umane antitetaniche analizzate me- diante gel filtrazione (a) ed ultracentrifugazione analitica (b). In (a), i picchi da A a D corrispondono a componen- ti a peso molecolare via via decrescente; in (b), i com- ponenti si risolvono in picchi omogenei di materiali a peso molecolare crescente da sinistra a destra. In partico- lare il picco B della gel filtrazione corrisponde alla frazione 10 S dell'ultracentrifuga, i picchi B1-C-CI alla frazione 7 S deil'ultracentrifuga, il picco A corrisponde agli eventuali aggregati, corrispondenti alla frazione > 19 S dell'ultracentrifuga: secondo questo criterio d'asso- ciazione è stato fatto il confronto tra i due metodi. Come evidente, rispetto all'ultracentrifuga, la gel filtra: zione mette in evidenza un maggior numero di forme molecolari, dà una migliore risoluzione degli aggregati (picco A) e dei frammenti (picco D) e permette la loro quantificazione anche quando sono presenti in percen- tuali molto basse(< 5%).

In Tab. 1 sono riportati la media (i), la deviazione standard (SD) ed il coefficiente di variazione (CV%) dei

valori percentuali delle frazioni corrispondenti e con- frontabili ottenute analizzando ogni singolo campione di immunoglobulina antitetanica commerciale con k gel filtrazione e I'ultracentrifugazione. Il valore di t confer- ma quanto già individuato sulle tre colonne precedenti e cioè che la differenza fra le medie ottenute con i due metodi non è significativa. Tuttavia questa indicazione non sufficiente a definire quanto sia corretto associare in questo modo i risultati ottenuti con due metodi diversi e se i raggruppamenti fatti corrispondono effetti- vamente alle stesse forme molecolari che, a seconda della capacità risolutiva del metodo usato, si evidenziano in un singolo picco (all'ultracentrifuga) o in più picchi (alla gel filtrazione). L'analisi dei parametri delk retta di regres- sione (Tab. 2) ottenuta dal confronto dei valori percen- tuali calcolati con i due metodi dà un'indicazione in tal senso. Il valore del coefficiente di correlazione lineare (r) indica che, per quanto riguarda le frazioni considerate, la possibilità di associazionc fra i due metodi, cioè la possibilità della confrontabilità tra i valori ottenuti con un metodo e quelli ottenuti con l'altro, non è estrema- mente elevata (I = 0,617 per il primo gruppo di frazioni, r = 0,628 per il secondo gruppo di frazioni), anche se sicuramente significativa dal momento che tutti gli inter- valli fiduciali al 95%dei parametri calcolati sono disposti al di sopra dello zero.

La Tab. 3 riporta i risultati di uno studio di correla- zione fra le diverse forme molecolari evidenziabili con la gel filtrazione, distinte e confrontate secondo la suddi- visione del tracciato in Fig. la . I valori d i r e la pressoché totale sovrapponibilità degli intervalli fiduciali nei confronti fra le singole frazioni considerate mostrano una correlazione significativa fra le diverse iorme mole- colari, eccetto che nei casi di A contro C e A contro B dove la presenza del picco A, corrispondente a materiali ad alto peso molecolare, considerabili forme aggregate, genera un intervallo fiduciale d i r passante per il valore zero e quindi non correlabile con le specie molecolari contenute in C P B.

Dilicuasione e wnclusioni

Il presente studio su un campione di 55 lotti di im- munoglobuline sntitetaniche commerciali conferma i risultati precedentemente ottenuti, in condizioni speri- mentali pressoché uguali, su un campione di dimensioni più piccole [ I l ] .

Nell'analisi comparativa dei due metodi si rileva che le medie delle percentuali delle frazioni considerat~ cor- rispondenti non differiscono significativamente, come dimostrato con il test t di Student. I1 valore relativamen- te basso del coeffici~nte di correlazione lineare r fra i due metodi (Tab. 2). rivela una associazione non elevata e il basso valore di b indica una sovrastima nella 8eelta delle frasioni della gel filtrazione che, in definitiva, potrebbero risultare più eterogenee rispetto alle frazioni considerate corrispondenti dell'ultracentrifuga, le quali

V o l u m e e l u i t o (m11

b

Fig. 1. a) Tracciato cromatografico su Ulhogel A d 3 4 di una preparazione rommereiale di Immunoglobiiline antitetaniehe. Nomenektu-

ra dei picchi: Aaqgregati o polimeri, A, ol'iomeri, B dimeri, B, forme intermedie, C monameri. C, grandi frammenti o albumina, D frsm-

menti. b) Analisi all'ultracentrifuga analitica, metodo ottica Schlieren, delio stesso campione di a). La direzione della sedimentaziane è verso destra. A sinistra: fotografia scattata dopo 4' dall'inizio della sedimentaeione. La freccia indica hacce di aggregati (a > 19 C). A destra: fotografia scattata dopo 80' dall'inizio della eedimentazione. Le frecce indicano i picchi del manomero (s = 7 S) e deldimero

( a = 10 S).

Tabella 1. - Parametri statistici relativi alle fmzioni confrontabili degli stessi campioni di immunoglobuline umane ontitetaniche commerciali, analizzate con ultra- centriTuprione analitica e pel filtrazione

- Frazioni x SD CV t

confrontabili % % %

Media (Z); deviazione standard (m) e oodficiente di variazione %

(CV) dei valori percentuali delle frazioni considerate; t : valore del t di Student; m.: non significativo. (n): ulbacenhifugazione; (b): gel fiibazione.

comunque risultano abbondantemente comprese in esse. E'stata inoltre effettuata l'analisi dell'associazione tra

le diverse frazioni evidenziabili con la gel filtrazione per verificare se la presenza di determinate specie molecolari f o s e indicativa di un reale equilibrio £ra tutte o alcune delle diverse forme o se fosse da attribuire piuttosto alla qualità del procedimento di purificazione. L'analisi dei parametri della regressione lineare tra tali forme moleco- lari rivela un'associazione tra la componente C e le altre componenti molecolari eccetto che per A. Ciò indica che la presenza di forme ad alto peso molecolare è predittiva non già di una normale condizione di equilibrio di associazione =+ dissociazione a livello molecolare, henai della qualità del materiale di origine e del modo di preparazione industriale. Questi risultati confermano p e l l i ottenuti da Araco et al. [Il] anche se, nel nostro tud dio, la forza di associazione fra le diverse forme appare più bassa. L'associazione più debole potrebbe essere ascritta al fatto che vengono esaminati lotti

Tabella 2. - Confronto fra ultracentrifupione analitico egel fiftrazione medionte analisi della regressione

b: pendenza della retta d i regrcssione: a: intercetta drlla retta d i regressione; r: coefficiente di mrrelazione Lineare. In parentesi sono indicati gli intervalii fidueiali al 95.kdei parametri considerati.

Tabella 3. - Correlazione ira le uarie forme molecolnri evidenziabili con lagel filtrazione (vedi Fig. I / mediante analisi della regressione

Frazioni evidenziabili con h ( h -h,) a ( a , - a , ) r (T, - r l ) la gd filtrazione

b: prndrnzs drUa rrtta di regressionp: a: intercetta della retta di rrgrissionv: r: coefficimti di eorrrlazionr lineare. In parentrsi -no

indicati gli intervalli fiduciali al 95% dri ruddrtti parametri.

provenienti da un maggior numero di case produttrici [l21 per la valutazione del tracciato cromatografico su con conseguente aumento dell'eterogeneità. L'analisi tre componenti principali: 1) polimeri ed oligomeri; 2) comparativa delle singole frazioni permette di osservare dimeri e monomeri; 3) frammenti. che, in generale, gli intervalli fiduciali di r e di b nei casi di correlazione significativa sono all'incirca della stessa ampiezza. Queste evidenti correkzioni ben si accordano Riceuuto il 10 luglio 1986 pertanto con k scelta fatta dalla Farmacopea Europea Accettato il 21 luglio 1986

BIBLIOGRAFIA

1. PATTERSON, M.R. & SMlTH, J.K. 1974. Stahility of norma1 human IgG in saline and glyeine ailutions. Vox Sang. 26: 560-564.

2. HENNEY, C.C. & ELLIS, E.F. 1968. Antibody pmduetion to aggregated human gamma-G-globuli" in acquired hypo-gammaglo- bulinaemia.N. EngL .l. Med. 278: 1144.1149.

3. FINLAYSON, J.S. 1979. Immune globulin. Semin Thrornbos Hoemoitaria 6: 44-73.

4. TURNER, K.J., BARTHOLOMAEUS, W.N., TRIBE, A. & HODBAY, J.D. 1971. Agammaglobulinaemia and anaphylactic shock. Aun. N. Z J . Med. 1: 76-82.

5. ELLIS, E.F. & HENNEY, C.S. 1969. Advera reactions following adrniniehation of humangamma-globulin.J. Allergy 43: 45-54.

6. RICHERSON. H.B. & SEEBOHM, P.M. 1966. Anaphyladoid reaction to human gamma-globulin. Areh Intera Med. 117: 568- 572.

7. ISHIZAKA, T. & ISHIZAKA, K. 1959. Biologica1 aetivitics of aggregated gamma-globulin. Pmc. Soc. Exg. BioL Med. 101: 845- 850.

8. IMBACH, P,, BARANDUN, S., D'APUZZO, V,, BAUMGARTNER, C,, HIRT, A,, MORELL, A., ROSSI. E., SCHON1.M.. VEST, M. & WAGNER, H.P. 1981. High-dose inhavenoua gamms-globulin for idiopsthic thromboeytopenic purpura in childhood.

Loncct 1: 1228-1231.

9. Formacopeo Uffiehle del& Repubblica Itolhnir 1978. Vlll Edizione. Vol. 2, p. 588

10. KRANZ, T., GUTHOHRLHEIN, G., SCHMIDT. K.H. & HOFSTAETTER, T. 1979. Gel ehromatography applied to quantitation of , eamponents of IgG preparatiom. Deu Bio1 Stand 44: 19-30.

11. ARACO. A,, CATONI, G., LANZI, G. & VICARI, G. 1982. Gel ehromatography and analytical ultracenhifugation applied to

i qumtitztion of eomponentri af IgG preparatiom a comparative shidy. J. BioL Stand. 10: 231-240.

i 12. Formacopeo Europeo. 1984. I1 Edizione. Parte 118, monografia n.388. Maissoneuve C.A.. Sainte Ruffine, Franee