This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

RNA GEHALT UND ANTIGENEIGENSCHAFTEN VON POLIOVIREN 9 4 5

RNA Gehalt und Antigeneigenschaften von Polioviren vor und nach Hitzeinaktivierung

RNA Content and Antigenicity of Polioviruses before and after Inactivation by Heating

C . MIETENS u n d K . KOSCHEL

Universitätskinderklinik und Institut für Virologie der Universität Würzburg

(Z. Naturforsch. 26 b, 945—950 [ 1 9 7 1 ] ; eingegangen am 3. Mai 1971, revidiert am 21. Mai 1971)

The question of a possible relationship between the RNA content of poliovirus and its reactivity as N- or H-antigen was examined with double-labeled virus preparations (32P-RNA, 14C-Protein). The following results were obtained: 1. Complete virus particles containing RNA may be N- or H-reactive. 2. Heat inactivation of poliovirus causes dissociation of capsid and RNA. 3. Under certain experimental conditions of thermal inactivation, the N/H conversion preceeds RNase sensi-tivity of viral RNA.

The results lead to the conclusion that during thermal inactivation N/H conversion is indepen-dent of the presence of RNA in the particles and that it preceeds the dissociation of viral RNA and viral capsid.

Polioviruspräparate aus infizierten Gewebekultu-ren enthalten Viruspartikel, die in Struktur, Dichte und Sedimentationsverhalten differieren1-5 . Durch Ultrazentrifugation lassen sich schneller sedimentie-rende Virusteilchen mit einer Sedimentationskon-stanten von 160 S, die sogenannten D-Partikel dar-stellen. Ihr Aufbau entspricht dem Virion, ein gro-ßer Teil von ihnen ist infektiös. Leichtere Virusteil-chen sind in der sogenannten C-Fraktion vorhanden und besitzen eine Sedimentationskonstante zwischen 65 und 74 S. Sie enthalten keine RNA 6 und stellen sich bei entsprechender Präparation im Elektronen-mikroskop als leere Capside dar 7. Dem unterschied-lichen Sedimentationsverhalten entsprechen verschie-dene Antigeneigenschaften. Die schwereren Virus-teilchen sind vorwiegend N- (d.h. nativ), die leich-tere Fraktion H-(d. h. heated) reaktiv 4 ' 8. Durch ver-schiedene physikalische und chemische Einflüsse wie Erhitzen, UV-Bestrahlung und Formalinbehandlung werden N-reaktive in H-reaktive Teilchen umgewan-delt 9~12 .

S o n d e r d r u c k a n f o r d e r u n g e n an P r i v . - D o z . D r . C . M I E T E N S , D-8700 Wiirzburg, Universitäts-Kinderklinik, Luitpoldkran-kenhaus. B . R O I Z M A N , M . M . M A Y E R , a n d M . J . R A P P , J . I m m u n o -logy 81, 419 [1958]. M . M . M A Y E R , H . J. R A P P , a n d B . R O I Z M A N , J . I m m u n o -logy 28,435 [1957]. B . R O I Z M A N , W . H Ö P K E N , a n d M . M . M A Y E R , J . I m m u n o -logy 80, 386 [1958]. C . E . S C H W E R D T a n d F . L . S C H A F F E R , V i r o l o g y 2 , 6 6 5 [1956]. G . L . L E B O U V I E R , C . E . S C H W E R D T , a n d F . L . S C H A F F E R , Virology 4, 590 [1957].

Da beim Erhitzen von Poliovirus RNA aus dem Virion austritt, wurde von H L N U M A und Mitarbb. angenommen, daß die Freisetzung viraler RNA zur Umstrukturierung der Proteinhülle führt, und da-mit die Ursache der Umwandlung von N- in H-Antigen ist 12>13. In den Untersuchungen von H I N U M A wurden ausschließlich gereinigte, N-reak-tive Viruspräparate untersucht, so daß die Frage, ob auch RNA-haltige, jedoch H-reaktive Virusparti-kel existieren, mit diesen Methoden nicht beantwortet werden konnte.

Die Frage ob der RNA-Gehalt des Viruspartikels ausschlaggebend für seine Antigeneigenschaft ist, sollte mit Methoden untersucht werden, die eine quantitative Korrelation zwischen Antigeneigenschaf-ten, RNA-Gehalt und Sedimentationsverhalten ge-statten.

Material und Methoden

1. Virus

Poliovirus, Typ I, Stamm Mahoney, wurde in HeLa-S3-Suspensionskulturen mit Zusatz von 5% Kälber-serum gezüchtet14.

6 A . V A N E L S E N a n d A . B O E Y E , V i r o l o g y 2 8 , 4 8 1 [ 1 9 6 6 ] . 7 K . H U M M E L E R , T . F . A N D E R S O N , a n d R . B R O W N , V i r o l o g y

1 6 , 8 4 [ 1 9 6 2 ] . 8 K . H U M M E L E R a n d V . H A M P A R I A N , J . I m m u n o l o g y 8 1 , 4 9 9

[ 1 9 5 8 ] . 9 N . J . S C H M I D T a n d E . H . L E N N E T T E , J . e x p e r . M e d i c i n e

1 0 4 , 9 9 [ 1 9 5 6 ] . 1 0 G . L . L E B O U V I E R , L a n c e t 2 , 1 0 1 3 [ 1 9 5 5 ] . 11 G. L. LE BOUVIER, Brit. J. exqp. Pathol. 40, 605 [1959]. 1 2 Y . H I N U M A , S . K A T A G I R I , M . F U K U D A , K . F U K U S H I , a n d

Y . W A T A N A B E , B i k e n J. 8 , 1 4 3 [ 1 9 6 5 ] . 1 3 S . K A T A G I R I , Y . H I N U M A , a n d N . ISHIDA , V i r o l o g y 3 2 , 3 3 7

[ 1 9 6 7 ] .

9 4 6 C. MIETENS UND K. KOSCHEL

2. Radioaktive Markierung

a) D o p p e l m a r k i e r u n g v o n P o l i o v i r u s m i t 14C und 32P

R o u x - Flaschen mit Kulturen von HEp-Zellen wurden mit 10 — 30 PBE/Zelle infiziert und nach 20 Min. Adsorption mit 25 ml MEM-Medium ( E a g l e ) ohne Phosphat, bei dem die Aminosäurekonzentration auf 1/10 des regulären Gehalts eingestellt war, über-schichtet. Das Medium war 0,1 MM an Trispuffer, pH 7,0 und enthielt 1 mCi 32P-Orthophosphat und 0,1 mCi 14C-Proteinhydrolysat.

Nach 22 Stdn. wurden die Zelltrümmer abzentrifu-giert und die Viruslysate mit RNase und DNase behan-delt (7,5 pg/ml, 30 Min. 37 °C). Daran schloß sich eine Konzentrierung des Virus in der präparativen Ultrazentrifuge an, (Spinco L 50, Rotor 30, 30.000 UpM, 4 Stdn.). Der radioaktive Überstand wurde ver-worfen, das Sediment in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und gegen 0,25 M KCl-Puffer, pH 7,1, bei mehrmaligem Pufferwechsel über Nacht dialysiert. Um eine ausreichende Antigen-konzentration für die Komplementbindungs-Reaktion zu erreichen wurde vor der weiteren Behandlung dem radioaktiven Virus die 5 —10-fache Menge von unmar-kiertem, in gleicher Weise gewonnenen Virus zugesetzt. Zur weiteren Reinigung erfolgte eine Gel-Filtration durch eine mit PBS äquilibrierte Sepharosesäule (Sepharose 2 B, Pharmacia Uppsala, Länge 33 cm). Danach wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt und die Radioaktivität von kleinen Proben der Fraktionen ge-messen. In den Fraktionen mit der höchsten Radio-aktivität (14C, 32P) wurde gleichzeitig eine Bestimmung des Virus-Antigen-Gehalts (N und Hl durchgeführt. 7 — 8 Fraktionen, die das Maximum an Virusreaktivität enthielten, wurden vereinigt und für weitere Versuche verwendet. Das Viruspräparat enthielt noch RNase-Aktivität.

b) 32P - R N A - M a r k i e r u n g Die Züchtung von 32P-markiertem Poliovirus er-

folgte in Suspensionskulturen von HeLa-S3-Zellen 2-108 Zellen/ml in 20 ml, 40 PBE/Zelle) in phosphat-freiem Medium unter Zusatz von 3 mCi 32P-Orthophos-phat. Die übrigen Versuchs- und Reinigungsmethoden waren die gleichen wie bei der Doppelmarkierung.

3. Gradienten-Zentrifugation a) Z o n e n z e n t r i f u g a t i o n im R o h r -

z u c k e r g r a d i e n t e n Das Viruspräparat wurde einem Saccharosegradien-

ten von 10 — 30% w/w überschichtet und 3 Stdn. 15 Min. bei 4° in der präparativen Ultrazentrifuge bei 24.900

1 4 L . LEVINTOW and J. E . DARNELL, J. biol . Chemistry 2 3 5 , 70 [I960].

15 G. A. BRAY, Analyt. Biochem. [New York] 1, 279 [I960]. 1 6 J. J. KABARA, N . R . SPAFFORD, M . A . MCKENDRY, and

N. L. FREEMAN, in: Advances in Tracer Methodology (Edit. S. ROTHCHILD) . New York 1966, p. 7 6 - 8 5 .

UpM im Rotor SW25.1 zentrifugiert. Anschließend wurden je 46 Fraktionen zu ca. 0,5 ml gesammelt und alternierend auf Radioaktivität und Antigengehalt ge-prüft.

b) C ä s i u m c h l o r i d - D i c h t e g r a d i e n t e n Von den Gradienten (nach LEVINTOW und DAR-

NELL 14) wurden nach der Zeitrifugation (18 Stdn. 35.000 UpM, Beckman-Rotor SW 39) ca. 90 Fraktio-nen zu je 0,04 ml gesammelt. Jede 2. Fraktion wurde mit Wasser auf 0,7 ml Volumen gebracht. In diesen Proben wurde nach Zugabe von BRAY-Lösung15 die Radioaktivität gemessen. Die übrigen Fraktionen wur-den mit der Komplementbindungs-Reaktion getestet. Dazu wurden jeweils 4 — 5 Fraktionen vereinigt, in 0,1 ml PBS aufgenommen und anschließend 2 Stdn. in Dialysehülsen (Sartorius, Göttingen) dialysiert (4 °C).

4. Messung der Radioaktivität Die Messung der Radioaktivität erfolgte im Flüssig-

keits-Scintillations-Spektrometer (Packard) entweder direkt nach Zugabe von BRAY-Lösung15 oder nach Fällung mit 5-proz. Trichloressigsäure und Zugabe von 0,02% Serumalbumin. Das säureunlösliche Material wurde auf Membran-Filtern gesammelt (0,45 p, Sar-torius, Göttingen), mit 6 ml Trichloressigsäure gewa-schen und getrocknet. Nach Zugabe von 10 ml Toluol/ POPOP/PPO-Gemisch wurde die 14C- und 32P-Radio-aktivität in zwei Kanälen des Flüssigkeits-Scintilla-tions-Spektrometers analog zu der für 14C und 3H beschriebenen Diskriminatorverhältnis-Methode be-stimmt 16.

5. Antiseren Anti-H-Seren wurden durch Immunisierung von

Meerschweinchen ,wie früher mitgeteilt, hergestellt17. Die Herstellung der Anti-N-Seren erfolgte nach der von HUMMELER angegebenen Methode ,8.

6. Komplementbindungs-Reaktion Die Technik der hier verwendeten Komplement-

bindungs-Reaktion wurde bereits früher mitgeteilt19.

7. Thermische N/H-Umwandlung und Messung der Umwandlungskinetik

Virus (in PBS) wurde im vorgewärmten Wasserbad auf die angegebene Temperatur gebracht und nach der Inaktivierungszeit sofort in Eis gestellt. Proben die mit RNase (10 ^g/ml) behandelt wurden, inkubierten wir anschließend 30 Min. bei 37 °C. Die Proben wurden dann mit Trichloressigsäure gefällt und aufgearbeitet wie unter 4. beschrieben.

1 7 C . MIETENS and U . FUHRMEISTER, Arch. ges. Virusforsch. 34, 23 [1971],

1 8 K . HUMMELER and H . TUMILOWICZ, J. I m m u n o l o g y 8 4 , 6 3 0 [I960].

19 C. MIETENS, Arch. ges. Virusforsch. 18, 25 [1966].

RNA GEHALT UND ANTIGENEIGENSCHAFTEN VON POLIOVIREN 9 4 7

Ergebnisse

Zur Feststellung der Beziehungen zwischen Anti-geneigenschaften und RNA-Gehalt wurde durch Sedi-mentation angereichertes Poliovirus, dessen Protein-hülle mit 14C und dessen RNA mit 32P radioaktiv markiert war mit der 10-fachen Menge an nicht-markiertem Virus vor den nachfolgenden Reini-gungsschritten gemischt und einem Rohrzuckergra-dienten überschichtet. Die nach Zentrifugation erhal-tenen Fraktionen wurden auf Radioaktivität und Antigengehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt. Das Maximum der virusbezoge-nen 14C- und 32P-Radioaktivität liegt zwischen Frak-tion 16 und 18. Die hier sich darstellenden schneller

4 8 12 16 20 2C 28 32 36 40 U Fraktion Nr.

Abb. 1. Rohrzucker-Gradienten-Zentrifugation von doppelt markiertem Poliovirus (14C-Protein, 32P-RNA; 1 5 - 3 0 % ) . Alternierend wurde in den Fraktionen Radioaktivität (A) und Antigenkonzentration (B, C) gemessen (s. Material und Me-thoden). O —O 14C-Aminosäuremarkierung, • — • 32P-RNA-

Markierung, A — A N-Reaktivität, A ~ A H-Reaktivität.

sedimentierenden Viruspartikel entsprechen den von anderen Autoren beschriebenen Partikeln mit einer Sedimentationskonstanten von 160 S. Sie enthalten RNA und sind N- und H-reaktiv. Langsamer sedi-mentierende Virusteilchen — entsprechend den 73-S-Partikeln (Procapside) — stellen sich in der Radio-aktivitäts-Verteilung zwischen Fraktion 32 und 36 dar. Das angereicherte Präparat hatte nur einen geringen Anteil 14C-Protein-markierter 73-S-Parti-kel die kein 32P enthielten. Es ist bekannt, daß diese Teilchen keine RNA enthalten6. Sie sind vorwie-gend H-, in geringerem Maße auch N-reaktiv (Abbn. 1 B und C). In den ersten Fraktionen am Boden des Gradienten zeigt sich ebenfalls N- und H-Reak-tivität, ohne daß hier ein Maximum von 14C und 32P nachweisbar wäre. Offensichtlich handelt es sich hier um schnell sedimentierende Aggregate von nichtmarkiertem Virus, das der radioaktiven Virus-präparation zugesetzt wurde.

Bei der Sedimentation in der hypertonen Lösung des Rohrzuckergradienten muß in Betracht gezogen werden, daß H-reaktive Partikel weniger stabil sind als N-reaktive Poliovirusteilchen. Da außerdem die Ergebnisse durch Aggregatbildung von Virusparti-keln beeinflußt werden können, wurden weitere Ver-suche im CsCl-Dichtegradienten vorgenommen. 14C-und 32P-markiertes Poliovirus wurde wie oben be-schrieben gezüchtet und mit der fünffachen Menge an nichtmarkiertem Virus vermischt. Nach Zentri-fugation wurde in den Fraktionen des Cäsium-chloridgradienten alternierend Radioaktivität und N-und H-Antigenkonzentration bestimmt. Mit dieser Methode untersuchten wir auch den Einfluß der ther-mischen Inaktivierung auf die Partikelzusammen-setzung nach 6 und 30 Min. langer Behandlung des Viruspräparates bei 50° im Vergleich zum unbehan-delten Virus. Die Ergebnisse der Dichtegradienten-versuche sind in Abb. 2 zusammengefaßt.

Im oberen Teil der Abbildung ist das Verhalten des nicht erhitzten Viruspräparates dargestellt. Der größte Anteil der Virusteilchen findet sich in einer Zone im 1. Drittel des Gradienten, die durch ein Maximum an 14C- und 32P-Aktivität dargestellt wird. Die hier lokalisierten Viren entsprechen den kom-pletten RNA-haltigen Virionen mit einer Sedimenta-tionskonstante von 160 S. Diese Partikel sind N-und H-reaktiv. Ein 2. Gipfel enthält leichtere Parti-kel ohne RNA, die ausschließlich H-reaktiv sind.

Nach 6 Min. Erhitzen hat sich die Höhe des 1. Gipfels hinsichtlich der 14C- und 32P-Aktivität deut-

9 4 8 C. MIETENS UND K. KOSCHEL

lieh vermindert. Er enthält jedoch auch jetzt N- und H-Reaktivität. Das zweite Maximum an 14C-Aktivität hat dagegen wesentlich zugenommen. Die hier sedi-mentierenden Partikel sind ausschließlich H-reaktiv und enthalten keine RNA. Die zwei Gipfel dieses Maximums weisen darauf hin, daß sich hier dar-stellende Partikel in bezug auf ihr Verhalten im Dichtegradienten nicht ganz homogen sind. Daneben zeigt sich jetzt ein weiteres Maximum leichterer H-reaktiver Produkte. Hierbei handelt es sich wahr-scheinlich um Zerfallsprodukte der H-reaktiven C-Partikel. Nach 30 Min. Erhitzen ist keine N-Reakti-

- 4 AE

4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 Fraktion

Abb. 2. CsCl-Gradient von doppelt radioaktiv markiertem Poliovirus (14C-Protein, 32P-RNA) ; vor (oberer Teil der Abb.) und nach 6 und 30 Min. langer Inaktivierung bei 50°. O —O 14C-Aminosäuremarkierung, • — • 32P-RNA-Markie-rung, ^ N-Reaktivität von 5 bis 6 vereinigten Fraktionen,

• H-Reaktivität.

vität mehr nachweisbar. Das Maximum an 14C-Ak-tivität ist im 2. Gipfel lokalisiert. Die Zone größter Dichte enthält ausschließlich H-reaktives Material. Die hier lokalisierten Partikel verhalten sich so, als ob sie RNA enthielten, obwohl der Anteil an 32P-Markierung nun offenbar zu gering ist, um einen Meßeffekt zu ergeben. Freigesetzte RNA wird unter unseren Bedingungen rasch abgebaut, da die Virus-präparate noch RNase aus der Vorreinigung enthal-ten. In den erhitzten Viruspräparaten befindet sich eine Mischung von natürlich vorkommenden und durch die Inaktivierung erzeugten RNA-freien Parti-kel, auf deren unterschiedliches Sedimentations-Ver-halten im Falle von Boratpuffener behandeltem Po-liovirus bereits von anderen Autoren hingewiesen wurde20. Mit steigender Inaktivierungsdauer findet man zunehmend auch die Zerfallsprodukte mit H-Reaktivität.

Zur Überprüfung der Frage ob N-Antigen durch die Bedingung des Cäsiumchloridgradienten even-tuell in H-Antigen umgewandelt werden könnte, wurde Poliovirus, dem eine geringe Menge 14C-mar-kiertes Virus zugesetzt war, mehrmals mit Fluoro-carbon (Frigen 113) behandelt, so daß das Präparat ausschließlich N-reaktiv war8 '1 9 . Bei der Dichte-gradienten-Zentrifugation fand sich im Gradienten eine scharfe Bande von N-Reaktivität, die dem Gipfel der 14C-Radioaktivität entsprach. Eine Umwandlung von N- in H-Antigen unter den Versuchsbedingungen des Cäsiumchloridgradienten ist somit ausgeschlos-sen.

Zusammenfassend ist zu schließen, daß es Polio-virusteilchen gibt, die sich wie intakte RNA-haltige Viren verhalten (Rohrzuckergradienten-Zentrifuga-tion, isopyknischer Cäsiumchlorid-Dichtegradient), aber dennoch H-Reaktivität besitzen. Versuche der Temperaturbehandlung von Polioviren zeigen, daß die RNA-haltigen Viren beim Erwärmen ihre RNA verlieren bzw. daß diese RNase sensitiv wird.

HINUMA et al. haben eine Kausalbeziehung zwi-schen dem Mechanismus der RNA-Freisetzung und der Antigenumwandlung angenommen12. Dies ist nach obigen Befunden fraglich, da es offenbar Parti-kel mit RNA gibt, die H-reaktiv sind. Es wurde da-her die Umwandlungskinetik N/H von 32P-markier-tem Poliovirus untersucht.

Dabei zeigte sich, daß die Geschwindigkeit der N/H-Umwandlung deutlich größer ist als die Ent-

2 0 J. V . M A I Z E L , B . A . PHILLIPS , and D . F . SUMMERS, Viro-logy 32, 692 [1967].

RNA GEHALT UND ANTIGENEIGENSCHAFTEN VON POLIOVIREN 9 4 9

stehung einer RNase sensitiven RNA (Abb. 3) . Mit zunehmender Temperatur wächst allerdings die Ge-schwindigkeit, mit der die RNA empfindlich gegen den enzymatischen Abbau wird (Abb. 4) . Es fällt in den Abbn. 3 und 4 auf, daß das Ausmaß der

mm —

Abb. 3. Veränderung der N- und H-Antigenkonzentration bei thermischer Inaktivierung von Poliovirus und die Empfind-lichkeit der Virus-RNA gegenüber RNase-Abbau nach der thermischen Behandlung. Die säureunlösliche 32P-Aktivität

wurde gemessen.

RNase-Empfindlichkeit geringer ist als das der N/H-Umwandlung. Es nimmt aber ebenfalls mit wachsen-der Temperatur zu und erreicht bei 56 °C etwa 75 Prozent (Abb. 4 ) . Dagegen findet stets eine völlige Umwandlung von N- in H-reaktive Partikel statt. Es fällt weiter auf, daß nach kurzem Erhitzen eine grö-ßere, nach längerem Erhitzen eine geringere RNase-

Abb. 4. RNase-Sensitivität von 32P-markierter Poliovirus-RNA nach Hitzebehandlung des Virus bei verschiedenen Tem-peraturen. Die säureunlösliche 32P-Aktivität wurde gemessen.

2 1 S . M C G R E G O R a n d H . D . M A Y O R , J . g e n . V i r o l . 4 , 2 0 3 [1971].

2 2 R . M . J A M I S O N a n d H . D . M A Y O R , J . B a c t e r i o l . 9 1 , 1 9 7 1 [1966].

2 3 N . J. S C H M I D T a n d E . H . L E N N E T T E , J . I m m u n o l o g y 8 9 , 8 5 [1962].

24 L. H. FROMMHAGEN, J. Immunology 95, 818 [1965].

Empfindlichkeit der RNA besteht. MCGREGOR und M A Y O R 21 haben kürzlich elektronenoptisch filamen-töse RNase-resistence Ribonucleoproteid-Stränge nachgewiesen, die erst nach längerer Erhitzung bei sonst gleichen Bedingungen entstehen. Dagegen fand sich bei kurzen Inaktivierungszeiten eine höhere RNase-Sensitivität.

Diskussion

Die Entstehung von zwei verschiedenen Arten von Partikeln während des Reproduktionszyklus wurde bei einer ganzen Reihe von Viren der Picornagruppe beschrieben 2 2 - 2 5 . Polioviren zeigen jedoch die Be-sonderheit, daß durch Erhitzen eine völlige Um-wandlung der Antigenstruktur eintritt, so daß solche Präparate mit Antiserum gegen native Partikel (N-Antigen) nicht mehr reagieren. Diese Eigenschaft macht es möglich, N- und H-Antigen in Viruspräpa-raten sowie die Bildung von Antikörpern gegen jedes der beiden Antigene zu untersuchen.

Untersuchungen über die Proteinbestandteile des Poliovirus zeigten, daß Procapsid, Virion und künst-liche leere Capside eine unterschiedliche Protein-zusammensetzung aufweisen20. Der Übergang vom Procapsid zum Virion ist wahrscheinlich durch den Einbau von RNA und durch die Spaltung einer nicht im Capsid enthaltenen Strukturproteinvor-stufe (NCVP6) in zwei Virusstrukturproteine VP2 und VP4 gekänzekhnet26. Da beim Erhitzen von Polioviruspräparaten RNA aus dem Virion aus-tritt 6' 21 > 27' 28, wurde angenommen, daß die Frei-setzung der RNA zur Umstrukturierung der Pro-teinhülle führt und damit die Ursache der Um-wandlung von N- in H-Antigen ist12.

Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, daß ein primärer Kausalzusammenhang zwischen der An-oder Abwesenheit von RNA im Capsid und seinen Antigeneigenschaften nicht gegeben ist. Es zeigt sich übereinstimmend bei der Zonenzentrifugation im Rohrzuckergradienten und bei der Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation, daß komplette RNA-haltige Viruspartikel N- und H-reaktiv sein können.

2 5 N . . J. S C H M I D T a n d J. DE N N I S , J . I m m u n o l o g y 9 0 , 6 5 4 [ 1 9 6 3 ] .

2 6 M . F . J A C O B S O N a n d D . B A L T I M O R E , J . m o l e c u l a r B i o l . 3 3 , 3 6 9 [ 1 9 6 8 ] .

2 7 A . B O E Y E a n d A . V A N ELSEN , V i r o l o g y 3 3 , 3 3 5 [ 1 9 6 7 ] . 2 8 S . M C G R E G O R a n d H . D . M A Y O R , J . V i r o l . 2 , 1 4 9 [ 1 9 6 8 ] ,

9 5 0 G. F. KOLAR AND R. PREUSSMANN

Eine ursächliche Beziehung im Sinne: RNA-Aus-tritt bewirkt Antigenitätsumwandlung liegt nicht vor.

Die kinetischen Befunde stützen vielmehr eine Vorstellung, nach der eine Umwandlung von N- in H-reaktive Partikel unter den beschriebenen Bedin-gungen der Freisetzung der RNA bzw. der Angreif-barkeit durch RNase vorausgeht. Das Fehlen von natürlich vorkommenden leeren Procapsiden mit N-Antigenität ist sehr wahrscheinlich durch die be-reits erwähnte (s. o.) unterschiedliche Proteinzusam-mensetzung im Vergleich zu den fertigen Virionen bedingt und nicht primär eine Frage der fehlenden RNA.

Anm. bei der Korrektur: Inzwischen erschien eine Arbeit von M. BREINDL, J. gen. Virol. 11, 147 [1971], der auf Grund anderer Versuche ebenfalls zu dem Schluß gelangt, daß die Änderung der physikalischen und biologischen Eigenschaften des Polioviruspartikels bei Hitzeinaktivierung eher durch den Verlust von Virusproteinkomponenten als durch die Freisetzung von RNA bedingt ist.

Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der Stiftung Volkswagenwerk für die Unter-stützung unserer Arbeiten. Herrn Prof. E. WECKER danken wir für eine Reihe von Diskussionen und Frau M. KUHLMANN für ihre ausgezeichnete technische Assistenz.

Validity of a Linear Hammett Plot for the Stability of Some Carcinogenic l-Aryl-3,3-dimethyltriazenes in an Aqueous System

G. F . K O L A R a n d R . PREUSSMANN *

Chemical Laboratory, Forschergruppe Praeventivmedizin am Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg im Breisgau

(Z. Naturforsch. 26 b, 950—953 [1971] ; received March 24, 1971)

The stability of fourteen carcinogenic l-aryl-3,3-dimethyltriazenes to hydrolysis in 0.15 M phos-phate buffer, pH 7.0, at 37° was determined spectroscopically. The data gave an unexpectedly wide span of half-lives resulting in a linear H a m m e t t plot with a reaction constant, {>=— 4.7. These results are in complete agreement with the currently accepted mechanisms of carcinogenic activity associated with this class of compounds. The rapid liberation of a diazonium cation from the labile triazenes (fr/i less than 2 x l 0 2 m i n ) seems to be responsible for the induction of local tumours; however, an enzymic activation is necessary for the systemic carcinogenic activity of the compounds stable to hydrolysis (fi/i more than 2 x 102 min). Convincing experimental evidence is thus provided for two different mechanisms of activity which are operative within a single class of chemical carcinogens.

l-Aryl-3,3-dialkyltriazenes of the general struc-ture (1) are a class of potent chemical carcinogens with a pronounced organotropic activity A series

JZtfabg, ' X Y

of representative compounds was tested on BD rats and the results of this biological screening suggested that an overall relationship between the chemical structure and the observed carcinogenic activity could exist2. It appeared that the triazenes with electron withdrawing groups in the aromatic nucleus

Reprint requests to Dr. G. F. KOLAR, Forschergruppe Praeventivmedizin am MPI für Immunbiologie, D-7800 Frei-burg, Stefan-Meier-Str. 8.

* Institute of Experimental Toxicology and Chemotherapy, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg.

exhibited predominantly systemic carcinogenic acti-vity in a variety of distant organs such as the neuro-genic tissue, the kidney, or the liver. On the other hand, the induction of local tumours at the site of subcutaneous injection seemed to be characteristic of compounds containing electron releasing sub-stituents in the aryl moiety. Since the triazenes are stabilized diazo compounds, it was conceivable that the observed biological activity could be associated with the susceptibility of the 2 N — 3 N bond of the triazene molecule to hydrolytic cleavage and the concomitant liberation of the latent aryldiazonium cation.

1 H . D R U C K R E Y , S . I V A N K O V I C , and R . PREUSSMANN , Natur-wissenschaften 5 4 , 1 7 1 [ 1 9 6 7 ] ; R . PREUSSMANN , H . D R U C K -REY , S . I V A N K O V I C , a n d A . v . HODENBERG , A n n . N . Y . Acad. Sei. 163, 697 [1969].

2 Unpublished results.