search for antiangiogenic constituents from hypoxylon ...sol. solution tsad t cell-specific adapter...

クロコブタケからの血管新生阻害活性物質の探索

～血管内皮細胞増殖阻害活性を指標として～

S e a r c h f o r A n t i a n g i o g e n i c C o n s t i t u e n t s

f r o m H y p o x y l o n t r u n c a t u m

～ E v a l u a t i o n o f A n t i p r o l i f e r a t i v e A c t i v i t i e s

a g a i n s t Va s c u l a r E n d o t h e l i a l C e l l s～

平成 2 3 年度入学

深井みゆき ( F u k a i , M i y u k i )

指導教員

小山清隆

目次

P a g e

序論

第一章キノコ 1

第二章細胞増殖

第一節 C D K とサイクリン 5

第二節細胞周期 9

第三章血管新生とがん 1 5

第四章 V E G F と V E G F 受容体

第一節 V E G F 1 9

第二節 V E G F 受容体 2 1

第五章分子標的治療薬 2 5

本論

研究目的 2 9

第一章クロコブタケ（ H y p o x y l o n t r u n c a t u m）子実体からの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索 3 1

第一節 H U V E C 増殖阻害 3 5

第二節クロコブタケ子実体抽出エキスの

H U V E C 増殖阻害活性 3 6

第三節クロコブタケ子実体 C H C l 3 エキスからの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索 3 7

第四節クロコブタケ子実体 M e O H エキスからの

構造類縁体の探索 4 3

第五節 H y p o x y l o n o l 類の構造解析 4 8

第二章血管新生阻害作用の検討 9 4

第一節細胞選択性 9 5

第二節細胞毒性試験 9 7

第三節 H U V E C 遊走阻害試験 9 8

第四節 H U V E C 管腔形成阻害試験 1 0 0

第三章標的分子の探索 1 0 2

第一節 K D R リン酸化阻害試験 1 0 3

第二節 c D N A マイクロアレイ解析を用いた

標的分子の探索 1 0 4

第三節リアルタイム R T- P C R 1 0 9

結語 111

実験の部 11 7

第一章クロコブタケ ( H y p o x y l o n t r u n c a t u m ) 子実体からの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索

第一節 H U V E C 増殖阻害試験 1 2 2

第二節クロコブタケ子実体抽出エキスの

H U V E C 増殖阻害活性 1 2 4

第三節クロコブタケ子実体 C H C l 3 エキスからの

H U V E C 増殖阻害化合物の探索 1 2 5

第四節クロコブタケ子実体 M e O H エキスからの

構造類縁体の探索 1 3 2

第五節スペクトルデータ 1 3 9

第二章血管新生阻害作用の検討

第一節細胞選択性 1 4 6

第二節細胞毒性試験 1 5 0

第三節 H U V E C 遊走阻害試験 1 5 2

第四節 H U V E C 管腔形成阻害試験 1 5 4

第三章標的分子の探索

第一節 K D R リン酸化阻害試験 1 5 5

第二節 c D N A マイクロアレイ解析を用いた

標的分子の探索 1 5 7

第三節リアルタイム R T- P C R 1 6 0

参考文献 1 6 2

謝辞 1 6 4

付表

略語一覧

A L K a n a p l a s t i c l y m p h o m a k i n a s e

A M L a c u t e m y e l o g e n o u s l e u k e m i a

B A D B c l 2 a n t a g o n i s t o f c e l l d e a t h

B c r - A b l b c r - a b l f u s i o n p r o t e i n

B R A F v - r a f m u r i n e s a r c o m a v i r a l o n c o g e n e h o m o l o g B 1

C C R 4 C - C c h e m o k i n e r e c e p t o r t y p e 4

C D c l u s t e r o f d i f f e r e n t i a t i o n

C H C l 3 c h l o r o f o r m

C M L c h r o n i c m y e l o g e n o u s l e u k e m i a

C O S Y c o r r e l a t e d s p e c t r o s c o p y

C O X c y c l o o x y g e n a s e

C T L A - 4 c y t o t o x i c T- l y m p h o c y t e a n t i g e n 4

D M S O d i m e t h y l s u l f o x i d e

D N M T D N A m e t h y l t r a n s f e r a s e

E G F R e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r

E I e l e c t r o n i o n i z a t i o n

E l k 1 e t s - l i k e g e n e p r o d u c t

E M L 4 e c h i n o d e r m m i c r o t u b u l e - a s s o c i a t e d p r o t e i n - l i k e 4

E R K e x t r a c e l l u l a r s i g n a l - r e g u l a t e d k i n a s e

e x t . e x t r a c t

F B S f e t a l b o v i n e s e r u m

f . c . f i n a l c o n c e n t r a t i o n

F l k - 1 f e t a l l e v e r k i n a s e 1

F l t - 1 f m s - l i k e t y r o s i n e k i n a s e 1

http://ejje.weblio.jp/content/Echinodermhttp://ejje.weblio.jp/content/microtubule-associatedhttp://ejje.weblio.jp/content/protein-like

F l t - 4 f m s - l i k e t y r o s i n e k i n a s e 4

F r. F r a c t i o n

F y n p r o t o - o n c o g e n e t y r o s i n e - p r o t e i n k i n a s e F y n

G I S T g a s t r o i n t e s t i n a l s t r o m a l t u m o r

G r b 2 g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r - b o u n d p r o t e i n 2

H C l h y d r o g e n c h l o r i d e

H E R 2 h u m a n E G F R - r e l a t e d 2

H D A C h i s t o n e d e a c e t y l a s e

H h h e d g e h o g

H M B C h e t e r o n u c l e a r m u l t i p l e b o n d c o n n e c t i v i t y

H M Q C h e t e r o n u c l e a r m u l t i p l e q u a n t u m c o h e r e n c e

H R h i g h r e s o l u t i o n

H U A E C h u m a n u m b i l i c a l a r t e r y e n d o t h e l i a l c e l l s

H U V E C h u m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l s

i n s o l . i n s o l u t i o n

J A K J a n u s k i n a s e

K D R k i n a s e d o m a i n r e c e p t o r

L c k l y m p h o c y t e c e l l - s p e c i f i c p r o t e i n - t y r o s i n e k i n a s e

M A P m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e

M C L m a s t c e l l l e u k e m i a

M E K M A P K / E R K k i n a s e

M E M m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m

M e O H m e t h a n o l

m p m e l t i n g p o i n t

m T O R m a m m a l i a n t a r g e t o f r a p a m y c i n

M T T m e t h y l t h i a z o l y l t e t r a z o r i u m

N D n o t d e t e r m i n a t i o n

N E T n e u r o e p i t h e l i a l c e l l - t r a n s f o r m i n g g e n e p r o t e i n

N H D F n o r m a l h u m a n d e r m a l f i b r o b l a s t

n - h e x a n e n o r m a l - h e x a n e

O D o p t i c a l d e n s i t y

O D S o c t a d e c y l s i l y l

P B S p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e

P D G F R p l a t l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r

P h + A L L P h i l a d e l p h i a - p o s i t i v e s u b t y p e o f a c u t e l y m p h o b l a s t i c

l e u k e m i a

R a f r a f g e n e p r o d u c t

R A N K L r e c e p t o r a c t i v a t o r o f n u c l e a r f a c t o r - к B l i g a n d

R a s r a s o n c o g e n e p r o d u c t

R B r e t i n o b l a s t o m a - a s s o c i a t e d p r o t e i n

r p m r o t a t i o n p e r m i n u t e

R t r e t e n t i o n t i m e

S E G A s u b e p e n d y m a l g i a n t c e l l a s t r o c y t o m a

S h b S H 2 d o m a i n - c o n t a i n i n g a d a p t e r p r o t e i n B

S H 2 S r c h o m o l o g y 2 d o m a i n

s o l . s o l u t i o n

T S A D T c e l l - s p e c i f i c a d a p t e r p r o t e i n

W S T- 8 2 - ( 2 - m e t h o x y - 4 - n i t r o p h e n y l ) - 3 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 -

( 2 , 4 - d i s u l f o p h e n y l - 2 H - t e t r a z o l i u m , m o n o s o d i u m s a l t

5 - F U 5 - f l u o r o p y r i m i d i n e - 2 , 4 ( 1 H , 3 H ) - d i o n e ( f l u o r o u r a c i l )

http://ejje.weblio.jp/content/T+cell-specifichttp://ejje.weblio.jp/content/adapterhttp://ejje.weblio.jp/content/protein

Figure 一覧

Page

Fig．1．Classification of Mycota 4

Fig．2．The Mammalian CDK Family 6

Fig．3．Mammalian Proteins with A Cyclin-box Domain 8

Fig．4．Overview of Cell Cycle 9

Fig．5．G1 Phase of Cell Cycle 11

Fig．6．G1 and S Phases of Cell Cycle 13

Fig．7．G2 and M Phases of Cell Cycle 14

Fig．8．Anatomy of Blood Vessel 17

Fig．9．Process of Vasculogenesis 17

Fig．10．Process of Physiological and Pathological Angiogenesis 18

Fig．11．Comparison of Structures of the VEGF Family 20

Fig．12． Interactions of VEGF Family with Their Receptors 21

Fig．13．VEGF-A/VEGFR-2 Signaling

in Vascular Endothelial Cell Proliferation and Migration 23

Fig．14．VEGF-A/VEGFR-2 Signaling

in Vascular Endothelial Cell Survival 24

Fig．15． Isolated Compounds from H. truncatum 33

Fig．16．Benzo[j]fluoranthene Derivatives from Natural Resource 34

Fig．17． Isolation Procedure of H. truncatum CHCl3 ext. Fr. D 40

Fig．18． Isolation Procedure of H. truncatum CHCl3 ext. Fr. B 41

Fig．19． Isolated Compounds from H. truncatum CHCl3 ext. 42

Fig．20． Isolation Procedure of H. truncatum MeOH ext. Fr. D 45

Fig．21． Isolation Procedure of H. truncatum MeOH ext. Fr. E 46

Fig．22． Isolated Compounds from H. truncatum MeOH ext. 47

Fig．23． 1H-1H COSY and HMBC Correlations of HT-1 in acetone-d6 50

Fig．24．ORTEP Drawing of HT-1 Obtained by X-ray Analysis 50

Fig．25．Structure of Hypoxylonol C（23） 51

Fig．26． 1H-1H COSY and HMBC Correlations of HT-2 in acetone-d6 54


Fig．28．Structure of Hypoxylonol F（24） 55


Fig．30．Structure of Hypoxylonol B（25） 58

Fig．31．CD spectra of Hypoxylonol D（26），E（27）and F（24） 60

Fig．32．Structure of Hypoxylonol D（26） 61


Fig．34．Structure of Hypoxylonol E（27） 64

Fig．35．CD spectra of Hypoxylonol A（28），B（25）and C（23） 66

Fig．36．Structure of Hypoxylonol A（28） 67

Fig．37． 1H-1H COSY, HMBC and NOESY Correlations of HT-7

in acetone-d6 69

Fig．38．CD spectra of Hypoxylonol E（27），F（24）and G（29） 69

Fig．39．NOESY Correlations of HT-7 in acetone-d6 70

Fig．40．Structure of Hypoxylonol G（29） 71

Fig．41． 1H-1H COSY and HMBC Correlations of HT-8 in CDCl3 73


Fig．43．Structure of Truncatone（7） 74

Fig．44． 1H-1H COSY and HMBC Correlations of HT-9 in CD3OD 76

Fig．45． 1H-NMR Spectra of HT-9 and Methylated HT-9 in CD3OD 77

Fig．46．CD spectra of Hypoxylonol B（25），C（23）and H（30） 78

Fig．47．Long-range HMBC and NOESY Correlations of HT-9

in CD3OD 78

Fig．48．ORTEP Drawing of 4-O-Methyl hypoxylonol H

Obtained by X-ray Analysis 79

Fig．49．Structure of Hypoxylonol H（30） 81

Fig．50． 1H-1H COSY, HMBC and Long-range HMBC Correlations

of HT-10 CD3OD 83

Fig．51．CD spectra of Hypoxylonol E（27），F（24）and I（31） 83

Fig．52．ORTEP Drawing of Me-HT-10 Obtained by X-ray Analysis 84

Fig．53．Structure of Hypoxylonol I（31） 86


Fig．55．CD spectra of Hypoxylonol B（25），C（23）and J（32） 88

Fig．56．Structure of Hypoxylonol J（32） 89


Fig．58．CD spectra of Hypoxylonol B（25），C（23）and K（33） 91


Fig．60．Structure of Hypoxylonol K（33） 93

Fig．61．Cytotoxicity of Hypoxylonol C 97

Fig．62． Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for Migration

of HUVEC 99

Fig．63． Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for Tubule Formation

of HUVEC 101

Fig．64．Pathway of Cell Cycle 106

Fig．65．Pathway of Adherens Junction 107

Fig．66．Pathway of Focal Adhesion 108

Fig．67．Effect of Hypoxylonol C on mRNA Expression

of Cyclins and CDKs 110

Fig．68．Effect of Hypoxylonol C on mRNA Expression

of Adhesion Molecules 110

Fig．69．HUVEC Growth Inhibition Assay Method 122

Fig．70． Isolation Procedure of the Compounds

from H. truncatum CHCl3 ext. Fr. D 126


from H. truncatum CHCl3 ext. Fr. B 127


from H. truncatum MeOH ext. Fr. D 133


from H. truncatum MeOH ext. Fr. E 134

Fig．74．HUAEC Growth Inhibition Assay Method 146

Fig．75．HeLa Growth Inhibition Assay Method 148

Fig．76．NHDF Growth Inhibition Assay Method 149

Fig．77．Cytotoxicity Assay Method 151

Fig．78．HUVEC Migration Assay Method 152

Fig．79．HUVEC Tubule Formation Assay Method 154

Fig．80．KDR Kinase Inhibitory Assay Method 156

Fig．81．Method of RNA Extraction 158

Fig．82．Method of Real-time RT-PCR 161

Table 一覧

Page

Table 1．Molecular-targeted Drugs 27

Table 2．Effect of the Compounds from H. truncatum CHCl3 ext.

on HUVEC Prolifelation Assay 42

Table 3．Effect of the Compounds from H. truncatum MeOH ext.

on HUVEC Prolifelation Assay 47

Table 4． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol C（23）

in acetone-d6 51

Table 5． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol F（24）

in acetone-d6 55

Table 6． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol B（25）

in acetone-d6 58

Table 7． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol D（26）

in acetone-d6 61

Table 8． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol E（27）

in acetone-d6 64

Table 9． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol A（28）

in acetone-d6 67

Table 10． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol G（29）

in acetone-d6 71

Table 11． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Truncatone（7）

in CDCl3 74

Table 12． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol H（30）

in CD3OD 80

Table 13． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol I（31）

in CD3OD 85

Table 14． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol J（32）

in CD3OD 89

Table 15． 1H- and 13C-NMR Spectral Data of Hypoxylonol K（33）

in CD3OD 93

Table 16．Effect of the Compounds from H. truncatum on HUAEC,

HeLa cells and NHDF Growth inhibitory Assay 96

Table 17．Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for Migration of HUVEC 99

Table 18．Inhibitory Effect of Hypoxylonol C for KDR Phosphorylation 103

Table 19．The Pathways including up-regulated genes 105

Table 20．The Pathways including down-regulated genes 105

序論

1

第一章キノコ

現在，地球上には約 1 5 0 万種の生物が存在することが確認されてお

り，生物界は細胞構造やエネルギーの摂取法により生産者，消費者，

還元者に大別される．生産者である植物は，太陽エネルギーを光合成

により二酸化炭素を固定して有機物を作り出し，消費者である動物は

植物が生産した有機物や他の動物を食する．さらに，植物や動物は，

還元者である菌類によって分解されて再び無機物へと還元され，これ

ら三生物群が共同生活を営むことによって永遠の生命と生活が保証さ

れている．菌類の生態系における役割として，生物の死骸を分解する

分解者としての働きが強調される．しかし，実際に菌類の生態を観察

すると，分解者としての働きはもちろんのこと，植物病原菌に代表さ

れる寄生者や線虫捕食菌のような捕食者，あるいは，樹木や藻類，昆

虫類と相利共生する共生者といった多芸多才な生態を観察できる．

陸生菌類の 2 大系統といえる担子菌類と子嚢菌類は様々な陸上生物

の寄生者または共生者であり，強力な分解者でもある．担子菌亜門は

約 3 万種からなり，菌類の 3 分の 1 を占める大きなグループである．

担子菌類は海水や淡水中からも報告されるが，ほとんどが陸生である

ことから陸上で多様化した系統であると考えられている．子嚢菌亜門

は 5 6 7 4 属，約 6 万 4 千種からなる菌類で最も大きなグループで，真

核生物の中でも多様性に富む生物群の一つである．子嚢菌類は陸上お

よび水中のいずれにも広く分布している．地球上の極限的な場所，例

えば南極大陸の凍結した岩の内部，深海の木材や堆積物などから子嚢

菌類が分離された報告もある．また，子嚢菌の種の約 4 0％が藻類との

共生体である地衣を形成し，地球の陸上表面の約 8％を被覆している．

2

「キノコ」と呼ばれる大形の生殖器，つまりは子実体を形成する菌は

一部であり，その大部分が担子菌亜門に，それ以外は子嚢菌亜門に属

する（ F i g． 1）．この俗にキノコと呼ばれる菌類はシダ植物や種子植

物と時代を同じくして地球上に出現し，長い進化の歴史を背景に，生

活体は単純であるが極めて複雑多彩な子実体をもつようになった．1 , 2 ）

昔から一部のキノコ類は，食用だけでなく薬用としても利用されて

きた．中国最古の薬物書『神農本草経』の上品には「赤芝」，「黒芝」，

「青芝」，「白芝」，「黄芝｣，｢紫芝｣の六芝および｢茯苓｣が，中品には「猪

苓」および「桑耳」が，下品には「雷丸」が収載されている．六芝の

うち主なものは紫芝と赤芝で，これらは霊芝と称するマンネンタケ

G a n o d e r m a l u c i d u m（ L e y s s . e x . F r.）K a r s t またはその近縁種の子実

体である．茯苓と猪苓は「桂枝茯苓丸」，｢猪苓湯｣，｢五苓散｣などの漢

方処方に使用される．桑耳は『薬性論』においては桑檽（そうじ )，桑

黄（そうおう）とも呼ばれ，それぞれキクラゲの類，サルノコシカケ

の類をさす．梁の『本草経集注』には「鬼蓋（きがい）」と「馬勃（ば

ぼつ）」があげられている．鬼蓋はヒトヨタケ科のヒトヨタケ C o p r i n u s

a t r a m e n t a r i u s（ B u l l .）F r. の子実体で小児の諸癇などに用いられる．

馬勃はホコリタケ科のオニフスベ L a s i o s p h a e r a f e n z l i i R e i c h . など

の子実体で，止血，抗炎症薬として用いられる．唐代の『新修本草』

には「槐耳」が収載されているが，これはエンジュ（中国名：槐）S o p h o r a

j a p o n i c a L . につくキクラゲ A u r i c u l a r i a a u r i c u l a（ L . e x H o o k .）

U n d e r w．で，止血薬として用いられ，また食用にもしている．『酉陽

雑爼（ゆうようざっそ）』には「猢猻眼（こそんがん）」の名がみられ

るが，これは桑黄と同類とされている．日本でも「梅寄生」と称する

生薬に抗がん作用があるとして民間で用いられているが，これも同様

3

のものである．「雷丸」はサルノコシカケ科のライガンキン P o l y p o r u s

m y l i t t a e C o o k . e t M a s s . の菌核で，条虫駆除薬とする．『本草拾遺』

には，「土菌」と「鬼筆」が収載されている．土菌のうちの 1 種「仙

人帽」は，スッポンタケ科のキヌガサタケ D i c t y o p h o r a i n d u s i a t a

F i s c h . で，血病に主効があるとされている．鬼筆はスッポンタケ科の

キツネノタイマツ P h a l l u s r u b i c u n d u s（ B o s c .）F r. の子実体などで，

できものに外用する．宋代の『図経本草』の「杉菌」は心痛を治すキ

ノコで，おそらくモエギタケ科のスギタケ P h o l i o t a s q u a r r o s a（ F r.）

Q u é l . の子実体であるという説もあるが確かではない．『証類本草』に

は「蟬花（現在では金蟬花）」と称する変わった真菌類が登場する．こ

れはセミ科の幼虫に寄生したバッカクキン科のセミタケ C o r d y c e p s

s o b o l i f e r a（ H i l l .） B e r k . e t B r o o m e の菌核（寄生虫体）および子座

で，小児の驚癇，夜啼きなどに用いている．元代の『日用本草』には

「香蕈」や「天花蕈」などが収載されている．香蕈はキシメジ科のシ

イタケ L e n t i n u s e d o d e s（ B e r k .） S i n g . で，食用キノコとして最もよ

く使われるものであるが，薬としては胃腸障害，貧血症などに用いら

れている．天花蕈はキシメジ科のヒラタケ P l e u r o t u s o s t r e a t u s（ J a c q .

e x F r.） Q u é l . で，これも食用キノコである．明代の『本草綱目』に

は食用キノコとして名高いキシメジ科のマツタケ Tr i c h o l o m a

m a t s u t a k e（ S . I t o e t I m a i） S i n g . も，「松蕈」の名で収載され，「小

便が濁って禁ぜざるを治す」とその効を誌している．清代の『本草從

新』には，「冬虫夏草」が収載されている． 3 , 4 ）

近年ではキノコ類が制がん剤として注目されている．現在，抗悪性

腫瘍剤としてクレスチン ®，レンチナン ®，シゾフィラン（ソニフィラ

ン ®）の 3 剤が臨床において使用されている．これらはそれぞれカワ

4

ラタケ C o r i o l u s v e r s i c o l o r（ L , : F r.） Q u é l . の培養菌糸体，シイタケ

L e n t i n u l a e d o d e s （ B e r k . ） S i n g . ，スエヒロタケ S c h i z o p h y l l u m

c o m m u n e F r. : F r. から得られる多糖またはタンパク質 ‐ 多糖複合体

との混合物であり，いずれも他の化学療法や放射線療法と組み合わせ

て使われている．

キノコが産生する二次代謝産物には他の菌類にはみられない特徴的

な構造をもつものがある．担子菌は高等植物に似てシキミ酸経路が発

達しており，しばしばテルフェニルキノンが得られる．その他，メバ

ロン酸経路由来のテルペン類も多く，中でも酢酸－マロン酸経路のポ

リアセチレンは担子菌に特有である．アミノ酸由来の呈味性の強い殺

蝿物質イボテン酸，幻覚性のあるインドール化合物，致死性毒のヘテ

ロ環状ペプチドなどもキノコ由来の独特な二次代謝産物である． 4 ）

しかし，キノコの二次代謝産物や，菌類の分類について，系統だっ

た研究はまだまだ充分であるとは言い難い．自然環境の保護が叫ばれ

る昨今において，自然界の秩序を正しく理解するために菌類研究の展

開は必要不可欠である．

F i g． 1． C l a s s i f i c a t i o n o f M y c o t a 1 ）

5

第二章細胞増殖

細胞の成長とは，細胞の質量の大部分を占めるタンパク質や膜，細

胞小器官やその他の構成要素を合成することにより細胞の大きさを増

加させる過程である．細胞はある程度の大きさになると，成長を止め

るか分裂をする．分裂から次の分裂までを細胞周期（ c e l l c y c l e）と呼

び，細胞分裂は，核が分裂する有糸分裂（ m i t o s i s）と細胞質が二つに

分かれる細胞質分裂（ c y t o k i n e s i s）に分けられる．多細胞生物におい

ては，細胞の成長と分裂がどのようにして連携しているのか，いまだ

未知な部分が多い．細胞，組織そして生体の大きさを制御する分子機

構は，生物学の中でも興味深く神秘的な課題の一つである．

第一節 C D K とサイクリン

細胞周期の制御機構を構成する中心的な因子は，サイクリン依存性

キナーゼ（ c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e； C D K）である．細胞周期の進行

に従い，このキナーゼ活性は急激に変化し，それに従って細胞周期の

進行を制御するタンパク質のリン酸化状態とそれによる活性化状態に

変化がもたらされる．C D K タンパク質の細胞内濃度は細胞周期を通じ

て一定であるので，C D K の活性の変動は，原則的にサイクリン（ c y c l i n）

として知られる制御サブユニットの量の変動に依存している．

C D K（ c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e）

C D K はセリン／スレオニンキナーゼの一ファミリーで，定義上すべ

ての C D K はその酵素活性に調節サブユニットであるサイクリンの結

6

合を必要とする．C D K の機能は，細胞周期の各過程において細胞内の

数多くのタンパク質の特異的なアミノ酸配列上のセリンもしくはスレ

オニン残基をリン酸化することである． 5 ）

1 9 8 7 年に N u r s e らによりヒトの C D K 1 が，1 9 9 1 年に Ts a i・H a r l o w・

M e y e r s o n，あるいは E l l e d g e らにより C D K 2 がそれぞれ同定されてか

ら，これまでに C D K 11 までが同定されている（ F i g． 2）．このうちの

C D K 1， 2， 4 および 6 のわずか 4 種が細胞周期の制御に直接関わって

いる．細胞周期の各過程は， C D K 1 と 2 という 2 つの C D K によって

制御されており，主に M 期と S 期にそれぞれ作用する．さらに，細胞

外因子に応答して細胞周期への進行を調節する 2 つの重要な C D K 4 と

6 が存在する．その他に P C TA I R E や PF TA I R E，C C R K，C H E D，C R K 7

といった高度に関連する分子も C D K ファミリーの一員と称されるが，

それぞれの活性化調節サブユニットはいまだ同定されていない． 6 , 7 ）

CDK1 297 aa

CDK2 298 aa

CDK3 305 aa

CDK5 292 aa

PCTAIRE3 502 aa

PCTAIRE1 496 aa

PCTAIRE2 523 aa

PFTAIRE1 451 aa

PFTAIRE2 435 aa

CDK4 303 aa

CDK6 326 aa

CDK10 360 aa

PITSLRE 795 aa

CCRK 346 aa

CDK9 372 aa

CHED 1512 aa

CRK7 1490 aa

CDK7 346 aa

CDK8 464 aa

CDK11 502 aa

Ser/Thr protein kinase Nuclear localization Coiled-coil domains

F i g． 2． T h e M a m m a l i a n C D K F a m i l y 7 ）

7

サイクリン

サイクリンは C D K ファミリーに属する分子と結合し活性化させる

という特徴を示す．ほとんどのサイクリンは細胞周期を通じてその細

胞内濃度を劇的に変化させ，それによって C D K 活性が周期的に変化

し，細胞周期制御の中心的役割を担っている．サイクリンの細胞内濃

度は主にサイクリン遺伝子発現とサイクリンタンパク質の分解によっ

て調節されている．

現在までに，「 c y c l i n - b o x」と呼ばれる 1 5 0 のアミノ酸残基からなる

保存されたストレッチをもつ 2 9 のサイクリン関連分子が同定されて

いる（ F i g． 3）．このドメインは 5 つのへリックス領域からなり，こ

れによって C D K などのパートナータンパク質と結合する．

細胞周期に関わるサイクリンは，主に細胞周期における発現の時期

とその機能によって G 1 期サイクリン（サイクリン D），G 1／ S 期サイ

クリン（サイクリン E），S 期サイクリン（サイクリン A）および M 期

サイクリン（サイクリン B）の 4 つのクラスに分類される．

サイクリン A には，別々の遺伝子にコードされたサイクリン A 1 と

サイクリン A 2 が存在する．サイクリン A 1 は生殖細胞および初期胚の

細胞であり，サイクリン A 2 は発生初期および成体で発現するが，細

胞周期における機能に関して 2 つのサブタイプ間でほとんど差はない．

サイクリン B にはサイクリン B 1 とサイクリン B 2，サイクリン B 3 が

存在するものの，サイクリン B 3 は分裂に関して明確な機能をもって

いない．細胞周期において，サイクリン B 1 の方がより重要だと考え

られ，よく研究されている． 5 ）

8

Cyclin F 786 aa

Cyclin O 316 aa

Cyclin A1 465 aa

Cyclin A2 432 aa

Cyclin B3 1395 aa

Cyclin B1 433 aa

Cyclin B2 398 aa

Cyclin D3 292 aa

Cyclin D1 295 aa

Cyclin D2 289 aa

Cyclin E1 410 aa

Cyclin E2 404 aa

Cyclin J 372 aa

Cyclin C 302 aa

Cyclin H 323 aa

Cyclin K 355 aa

Cyclin T1 726 aa

Cyclin T2 730 aa

Cyclin L1 526 aa

Cyclin L2 424 aa

Cyclin M3 707 aa

Cyclin M1 586 aa

Cyclin M2 854 aa

Cyclin M4 727 aa

Cables 1 633 aa

Cables 2 478 aa

Cyclin I 377 aa

Cyclin G1 295 aa

Cyclin G2 344 aa

N-terminal cyclin box C-terminal cyclin box F-box Nuclear localization signal Proline-rich

F i g． 3． M a m m a l i a n P r o t e i n s w i t h A C y c l i n - b o x D o m a i n 7 ）

9

第二節細胞周期

「細胞（ c e l l u l a）」という名称が 1 7 世紀半ばに付与されて以来，約

2 0 0 年を経て「細胞は細胞に由来する（ O m n i s c e l l u l a e c e l l u l a）」と

いう概念が提唱された．さらに約 1 0 0 年を要してはじめて，この「細

胞に由来する」過程が G 1 期（ G a p 1 p h a s e）－ S 期（ S y n t h e s i s p h a s e）

－ G 2 期（ G a p 2 p h a s e）－ M 期（ M i t o t i c p h a s e）という 4 つの位相と

して定義された．しかし細胞周期という用語がいつから使用されるよ

うになったのかは定かではない．

細胞周期のうち，有糸分裂の時期を M 期といい， M 期と M 期の間

の長い期間を間期（ i n t e r p h a s e）という．間期はさらに G 1， S， G 2

期に分けられる． S 期は核の D N A の複製がおこる時期であり， M 期

から S 期の始まりまでの期間が G 1 期，つまり最初のギャップ期であ

る． S 期を完了すると，細胞は二番目のギャップ期である G 2 期に入

る．この時期に細胞分裂の最終段階に到達し，タンパク質の合成が増

加する（ F i g． 4）． 6 ）

cyclin E

CDK2 cyclin A

CDK2

cyclin A

CDK1

cyclin B

CDK1

S

G2

G1

MG0

cyclin D

CDK4/6

F i g． 4． O v e r v i e w o f C e l l C y c l e

10

多細胞生物では新たな細胞は必要とされるときにのみ作り出される

よう，組織特異的な遺伝子のプログラミングと，他の細胞が分泌する

分裂促進因子（ m i t o g e n；マイトジェン）と呼ばれる細胞外タンパク

質から受け取るシグナルによって，その増殖が制御されている．培養

細胞から分裂促進因子を除去したときなどには，細胞は細胞周期から

完全に脱出して G 0 期と呼ばれる特別な休止状態に入る．

細胞外からのシグナルである分裂促進因子によって，細胞周期の初

期の現象を引き起こすサイクリン D－ C D K 4／ 6 の活性化が起こる．分

裂促進因子は，R a s－ M A P キナーゼ経路の活性化を介してサイクリン

D 遺伝子の発現を誘導する．休止期の細胞にわずかに残るサイクリン

D－ C D K 4 ／ 6 は，グリコーゲンシンターゼキナーゼ 3（ g l y c o g e n

s y n t h a s e k i n a s e 3；G S K 3）によって阻害的リン酸化を受けているが，

分裂促進因子の刺激はサイクリン D の脱リン酸化を引き起こす．さら

に，活性をもつサイクリン D－ C D K 4／ 6 複合体の形成には補助因子が

必要であり， p 2 7 や p 2 1 などの C i p／ K i p ファミリータンパク質が両

サブユニットと相互作用することでこれらの結合が強くなる．安定化

したサイクリン D－ C D K 4／ 6 複合体は標的である R B タンパク質が存

在する核に蓄積する．

R B タンパク質には p R B，p 1 0 7，p 1 3 0 の三つの関連タンパク質が存

在し，それぞれが E 2 F と呼ばれる特定のタンパク質複合体ファミリー

と結合する．E 2 F 複合体は，E 2 F ファミリータンパク質のサブユニッ

トと， D P ファミリータンパク質のサブユニット一つずつから成るヘ

テロ二量体であり，G 1／ S 期の標的遺伝子のプロモーターに存在する

特定の D N A 配列に結合する． E 2 F タンパク質は，その機能によって

活性化 E 2 F と抑制性 E 2 F の 2 種類に分けられる．休止期の細胞では，

11

活性化 E 2 F はリン酸化された R B タンパク質，p R B によって抑制され

ており，一方， G 1／ S 期遺伝子のプロモーターは抑制性 E 2 F と p 1 0 7

もしくは p 1 3 0 との複合体によって抑制されている．R B ファミリータ

ンパク質は，活性化したサイクリン D－ C D K 4／ 6 複合体依存的にリン

酸化されて E 2 F から解離する．D N A 上の抑制性 E 2 F は，p R B と結合

していない活性化 E 2 F に置き換わり，G 1／ S 期遺伝子の発現が活性化

され，これによって細胞周期のスタートが切られる（ F i g． 5）． 5 ）

S

G2

G1

MG0DPE2F

p107

cyclin D

CDK4/6

発現

増殖刺激

DPE2F

cyclin D

CDK4/6P

脱リン酸化

cyclin D

CDK4/6p27

DPE2F

pRB

pRBP

PDPE2F

PP

p107

DPE2F

抑制性

活性化

p27

F i g． 5． G 1 P h a s e o f C e l l C y c l e

G 1／ S 期遺伝子産物の中で決定的に重要なのは，G 1／ S 期サイクリ

ンのサイクリン E と S 期サイクリンのサイクリン A の二つである．サ

イクリン E は C D K 2 と複合体を形成するが，細胞周期に入る際の

C D K 2 の活性は p 2 7 によって部分的に抑制されている．サイクリン D

－ C D K 4／ 6 複合体の量が増加することで p 2 7 の流通量が減少し，さ

らに p 2 7 がタンパク質分解を受け不活性化されることでサイクリン E

－ C D K 2 の活性化が促進される．G 1 期後期になると，ホスファターゼ

12

C d c 2 5 A による C D K 2 の阻害的リン酸化の除去が起こり，サイクリン

E－ C D K 2 複合体の活性はさらに上昇する．サイクリン D－ C D K 4／ 6

は部分的な R B タンパク質のリン酸化と E 2 F の活性化しか行わない．

E 2 F の完全な活性化は，サイクリン E－ C D K 2 複合体の活性が G 1 期

後期に上昇し， R B タンパク質が完全にリン酸化されたときに起こる

（正のフィードバック）．そして S 期初期になるとサイクリン E－

C D K 2 がサイクリン E の T h r 3 8 0 をリン酸化するなどして，ユビキチ

ン化を経てサイクリン E が分解される．

サイクリン A は C D K 2 と複合体を形成するが，サイクリン A－ C D K 2

の活性化は D N A の複製を開始するために必要である．サイクリン E

－ C D K 2 と同様に，サイクリン A－ C D K 2 複合体は p 2 7 によって部分

的に抑制されるので，完全な活性化には p 2 7 の除去が必要である．ま

た，サイクリン A－ C D K 2 の活性化は C d c 2 5 A による脱リン酸化にも

依存している．サイクリン A－ C D K 2 は活性化されると，複製開始点

の p r e - r e p l i c a t i o n c o m p l e x をリン酸化し，D N A 合成が開始される（ F i g．

6）． 5 ）

13

S

G2

G1

MG0DPE2F

p107

DPE2F

DPE2F

pRB

pRBP

PDPE2F

PP

p107

DPE2F

抑制性

活性化

cyclin E

CDK2 p27

Pp27

cyclin E

CDK2

Cdc25A

CDK2

cyclin E

CDK2 P

自己リン酸化

cyclin A

CDK2 p27

P

p27

Cdc25A

cyclin A

CDK2

Cdc6 Cdt1

Dbf4Cdc7

ORC

ORC

ORC

DNApol

DNA合成

Cdc6

P+

F i g． 6． G 1 a n d S P h a s e s o f C e l l C y c l e

サイクリン A はまた，サイクリン B とともに M 期開始における主

要かつ必須な制御因子でもある．サイクリン A は M 期前期にはその

パートナーを C D K 1 に変え，活性化した状態で核内に存在する．染色

体の凝縮などといった M 期最初の核内での事象は，おそらくサイクリ

ン A－ C D K 1 複合体によって開始される．

サイクリン B は G 2 期に発現量が上昇し，細胞質に存在する．サイ

クリン B－ C D K 1 複合体の活性化は M 期初期の初めに細胞質で始まり，

とりわけ中心体で顕著である．M 期初期に蓄積した不活性化状態のサ

イクリン B－ C D K 1 は， C d c 2 5 ファミリーホスファターゼによって

C D K 1 の阻害的リン酸化が除かれ活性化される．サイクリン A－ C D K 1

は C d c 2 5 などをリン酸化し，サイクリン B－ C D K 1 を活性化するフィ

ードバックを手助けする． M 期前期の後半には，ほとんどのサイクリ

14

ン B－ C D K 1 は突然核内に移行し，核膜崩壊を誘導する．その後間も

なく核膜は消失し，サイクリン B－ C D K 1 は細胞全体に分布される．

一部は細胞質に残り，中心体の分離やゴルジ体の再構築など M 期に起

こる他の事象を推し進める．さらに，染色体凝縮の完了も誘導する

（ F i g． 7）． 5 ）

S

G2

G1

MG0

cyclin A

CDK1

cyclin B

cyclin B

CDK1

PP P

cyclin B

CDK1

P Cdc25

核膜崩壊

CDK1

中心体の分離ゴルジ体再構築

F i g． 7． G 2 a n d M P h a s e s o f C e l l C y c l e

15

第三章血管新生とがん

血管は，全身に分布し血液の灌流を可能にする生体にとって基本的

な組織の一つである．血管は，内腔を覆う一層の血管内皮細胞と血管

基底膜，その周囲を取り囲む壁細胞（動静脈においては平滑筋細胞，

毛細血管においては周皮細胞（ペリサイト））により構成されている

（ F i g． 8）．

生体内で血管が形成される現象は，脈管形成（ v a s c u l o g e n e s i s）と

血管新生（ a n g i o g e n e s i s）の二つに大別される．脈管形成は，胎生期

において胎児外の卵黄嚢に血島と呼ばれる細胞集団が形成されること

に始まる．血島の内側の細胞は血球に分化し，外側付近の細胞は内皮

細胞に分化して原始血管叢を形成する（ F i g . 9）．一方，血管新生とは

既存の血管から新たな血管ネットワークが形成される現象のことであ

る．この血管新生の過程は，脈管形成の終了後，臓器中に血管が張り

巡らされる際に観察されるが，成熟固体の生理的，病的血管新生でも

同様の機序が観察される． 8 ）

血管新生の生物学的な基礎研究は，固形腫瘍の発育が腫瘍血管新生

に依存しているとの仮説がされ開始された．近年，血管の分子生物学

のめざましい発展とともに，血管新生はがんの増殖と遠隔転移に深く

関与していること，また，血管新生には多くの因子が関与することが

明らかになった． 8 , 9 ）

血管新生は，① ペリサイトの離解，②細胞外マトリックスの消化，

③内皮細胞の遊走と増殖， ④内皮細胞による管腔形成，⑤ペリサイト

による血管の成熟化のプロセスからなる．通常では，ペリサイトから

分泌される A n g - 1 （ a n g i o p o i e t i n - 1 ）が内皮細胞上の受容体 T I E 2

16

（ t y r o s i n e k i n a s e w i t h I g a n d E G F h o m o l o g y d o m a i n）に結合し，

内皮細胞から P D G F（ p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r；血小板由来増

殖因子）が産生される．この P D G F の刺激により，ペリサイトが内皮

細胞を取り囲むように集積するとともに , 細胞外マトリックスを介し

て血管構造を安定化している．しかし，低酸素や低栄養状態になると，

内皮細胞や周囲の間葉系細胞から A n g - 1 のアンタゴニストの A n g - 2

（ a n g i o p i e t i n - 2）の産生が高まる． A n g - 2 が T I E 2 と結合し，一過性

に T I E 2 を不活性化させて下流のシグナル伝達を競合的に阻害すると ,

ペリサイトは内皮細胞との接着を失い，離解する．ペリサイトが離解

した部分の内皮細胞は，血管新生促進因子の刺激を受けやすくなる．

血管新生促進因子の中でも特に，V E G F（ v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h

f a c t o r；血管内皮増殖因子）が重要である．内皮細胞同士は V E -カド

ヘリンという細胞間接着因子により接着しているが， V E G F の刺激に

より V E -カドヘリンがリン酸化されることで内皮細胞同士の接着が弱

まる．さらに， V E G F の刺激を受けた内皮細胞は種々のプロテアーゼ

を産生し，基底膜や周囲の細胞外マトリックスを消化する．内皮細胞

は接着因子であるインテグリンを介して細胞外マトリックスに接着し，

接着方向に向かって遊走する．基底膜を破り，間質へと浸潤した内皮

細胞は，遊走と増殖によってその細胞数を増加していく．この際，隣

接した内皮細胞同士は V E -カドヘリンにより接着する．このようにし

て形成された未熟な血管は，ペリサイトが接着することで成熟化する．

A n g - 1 が T I E 2 に結合し，内皮細胞が刺激されて P D G F の産生を促進

することで，ペリサイトは内皮細胞に続いて遊走，増殖し，新生血管

の周囲を取り囲む．ペリサイトから産生された T G F -（ t r a n s f o r m i n g

g r o w t h f a c t o r ）により内皮細胞の遊走と増殖は停止し，新たな基底

17

膜が形成され，成熟した血管が構築される（ F i g． 1 0 - a）．

腫瘍血管新生は正常な血管新生と異なる部分がある．がん細胞は，

はじめは自身により 1 - 2 m m 3 まで成長するが，それ以上の大きさにな

るとがん細胞の周囲では低酸素状態となり，二酸化炭素，一酸化窒素，

C O X - 2 などの上昇が起こる．このうち特に低酸素状態を引き金として，

V E G F をはじめとする様々な血管新生促進因子が分泌され，がん細胞

へ向かって血管の新生が誘導される．腫瘍血管新生では， A n g - 2 の分

泌が優勢であるためペリサイトが欠如あるいは減少していると考えら

れており，がん細胞から分泌される持続的な V E G F の刺激により，未

成熟な新生血管が構築されるプロセスを繰り返す．その中で，脆弱，

不規則，無秩序，透過性亢進などの特徴をもつ腫瘍血管が形成されて

いく．こうして新たな血管を形成したがん細胞は，栄養素や酸素を取

り込み，二酸化炭素や乳酸などの老廃物を排泄して，加速度的に成長

するとともに，新たな組織へと転移する（ F i g． 4 - b）． 8 )

F i g． 8． A n a t o m y o f B l o o d Ve s s e l 6 )

F i g． 9． P r o c e s s o f Va s c u l o g e n e s i s 4 )

18

a ) P h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n b ) P a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n

F i g． 1 0． P r o c e s s o f P h y s i o l o g i c a l a n d P a t h o l o g i c a l A n g i o g e n e s i s

19

第四章 V E G F と V E G F 受容体

血管新生は一般に，促進因子と抑制因子のバランスによって制御さ

れる．実際に，様々な腫瘍において血管新生促進因子の発現亢進と抑

制因子の発現低下が確認されている．促進因子の一つである V E G F は

その受容体， V E G F R（ V E G F r e c e p t o r； V E G F 受容体）を介して，血

管新生において重要な役割を担っている． 1 0 ）

第一節 V E G F

V E G F は，血管内皮細胞特異的な増殖促進作用と血管透過性亢進作

用をもつ因子として単離された分子量 2 3 k D のサブユニットがジスル

フィド結合によりホモダイマーを形成した糖タンパク質である．

V E G F ファミリーとして V E G F - A， P I G F（ p l a c e n t a g r o w t h f a c t o r；

胎盤由来増殖因子）， V E G F - B， V E G F - C， V E G F - D，パラポックスウ

イルス由来の V E G F - E，ヘビ毒由来の V E G F - F が知られている．アミ

ノ酸配列の相同性は 3 0 - 5 0％程度であるが， 8 つのシステイン残基が

保存されているという特徴をもつ．ヒトには 2 3 対の染色体があり，

ヒト V E G F 遺伝子は 7 番染色体上に存在する．遺伝子 D N A は 8 つの

エクソンからなり， D N A を鋳型として R N A が合成されるが，転写の

際のスプライシングの違いにより大きさの異なる m R NA が産生され

る． 7 , 8 ） V E G F - A は単に V E G F とも呼ばれ，血管新生に最も関わりが

深いといわれる． V E G F - A はスプライシングの違いにより，ヒトゲノ

ムにおいて 9 つのアイソフォームが確認されており，中でも

V E G F - A 1 6 5 は最も豊富に存在する（ F i g． 11）． 1 1 , 1 2 ）

20

V E G F はほとんどの臓器をはじめ，上皮系細胞，繊維芽細胞，平滑

筋細胞，心筋細胞など様々な細胞や，多くの固形腫瘍とそれに由来す

る細胞株において発現している．また，低酸素状態に反応して転写が

誘導されるという大きな特徴があり， V E G F の転写開始点の上流には

H I F - 1（ h y p o x i a - i n d u c i b l e f a c t o r - 1；低酸素誘導因子）が結合する配

列が存在する． 8 ）

F i g． 11． C o m p a r i s o n o f S t r u c t u r e s o f t h e V E G F F a m i l y 1 1 , 1 2 )

21

第二節 V E G F 受容体

V E G F R には，V E G F R - 1（ F l t - 1），V E G F R - 2（ K D R / F l k - 1），V E G F R - 3

（ F l t - 4）の 3 種が存在する．これらは，細胞外ドメイン，膜貫通ドメ

イン，チロシンキナーゼドメインをもつ典型的な受容体型チロシンキ

ナーゼである． V E G F R - 1 および 2 は，細胞外ドメイン内に 7 つの I g

様構造をもち，キナーゼドメイン内には約 7 0 のアミノ酸のキナーゼ

挿入領域をもつ． V E G F R - 3 も類似の構造をもつが， 5 番目の I g 様ド

メインが開裂し，ジスルフィド結合で架橋されている． 9 , 1 1 ）

V E G F R はそのリガンドである V E G F および P I G F が結合すること

で活性化するが，V E G F - A は V E G FR - 1 および 2 と結合する．V E G F - C

および D は V E G F R - 2 および 3 と結合するが，P I G F，V E G F - B および

V E G F - E はそれぞれ V E G F R - 1， 2 に特異的に結合する（ F i g． 1 2）．

S S

S S

VEGFR-1

(Flt-1)VEGFR-1

(Flt-1)VEGFR-2

(KDR/Flk-1)

VEGFR-2

(KDR/Flk-1)

VEGFR-3

(Flt-4)

VEGF-A

VEGF-B

PIGF

VEGF-A

VEGF-C

VEGF-D

VEGF-E

VEGF-A

VEGF-B

PIGF

VEGF-A

VEGF-C

VEGF-D

VEGF-E

VEGF-C

VEGF-D

Monocytes

MacrophargesVascular endothelium Lymphatic endothelium

F i g． 1 2． I n t e r a c t i o n s o f V E G F F a m i l y w i t h T h e i r R e c e p t o r s 1 3 )

22

このうち，血管新生に最も関わりが深いのは血管内皮細胞に発現し

ている V E G F R - 2 であり， 2 番目と 3 番目の I g 様ドメインを介して

V E G F - A と結合し，受容体の二量体化が起こる．受容体が相互にリン

酸化しあえる距離まで近づき，キナーゼドメインが活性化されると，

受容体の自己リン酸化が起こり細胞内へとシグナルが伝達される．

V E G F R - 2 の主な自己リン酸化部位には 9 5 1，1 0 5 4，1 0 5 9，11 7 5，1 2 1 4

番目のチロシン残基（ Y 9 5 1， Y 1 0 5 4， Y 1 0 5 9， Y 11 7 5， Y 1 2 1 4）があ

る．リン酸化された Y 11 7 5（ p Y 11 7 5）は P L C （ p ho s p h o l i p a s e C - ；

ホスホリパーゼ C ）経路により血管内皮細胞増殖のシグナル伝達を

行う． P L C はその S H 2 ドメインを介して Y 11 7 5 と結合し， P I P 2

（ p ho s p h at i d y l i no s i t o l 4 , 5 - b i s p ho s p hat e；ホスファチジルイノシト

ール 4 , 5‐二リン酸）を D A G（ d i ac y l g l yc e r o l；ジアシルグリセロー

ル）と I P 3（ i no s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p hat e；イノシトール 1 , 4 , 5‐三

リン酸）に加水分解する． D A G は P K C（ p ho s p h o k i nas e C；プロテ

インキナーゼ C）を， P K C は R a s を介することなく R a f を活性化し，

M A P K（ m i t o ge n - a c t i va t e d p r o t e i n k i nas e；分裂促進因子活性化タ

ンパク質キナーゼ）カスケードである R a f - M E K - E R K 経路を介してシ

グナルを核内へと伝える．活性化された E R K は核内へ移行し，標的

である転写因子 E l k 1 を活性化して遺伝子転写を行い，細胞増殖のシ

グナルを伝達する． p Y 11 7 5 はさらに，アダプター分子の S h b にも結

合する．S h b を介して P I 3 K（ p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 k i n a s e；ホスフ

ァチジルイノシトール 3－キナーゼ）がリン酸化されると，細胞の遊

走を調節する接着斑の会合が誘導される． p Y 1 2 1 4 は G r b 2 の S H 2 ド

メインを介して G r b 2 に結合する． Y 1 2 1 4 のリン酸化は C d c 4 2 や

p 3 8 M A P K の活性化に必要であり，アクチンの再構成を引き起こす．

http://ejje.weblio.jp/content/Phospholipase+C+gamma+1http://ejje.weblio.jp/content/phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphatehttp://ejje.weblio.jp/content/diacylglycerolhttp://ejje.weblio.jp/content/inositol+1%2C4%2C5-trisphosphatehttp://ejje.weblio.jp/content/phosphokinase+Chttp://ejje.weblio.jp/content/mitogen-activated+protein+kinasehttp://ejje.weblio.jp/content/%E5%88%86%E8%A3%82%E4%BF%83%E9%80%B2%E5%9B%A0%E5%AD%90%E6%B4%BB%E6%80%A7%E5%8C%96%E3%82%BF%E3%83%B3%E3%83%91%E3%82%AF%E8%B3%AA%E3%82%AD%E3%83%8A%E3%83%BC%E3%82%BChttp://ejje.weblio.jp/content/%E5%88%86%E8%A3%82%E4%BF%83%E9%80%B2%E5%9B%A0%E5%AD%90%E6%B4%BB%E6%80%A7%E5%8C%96%E3%82%BF%E3%83%B3%E3%83%91%E3%82%AF%E8%B3%AA%E3%82%AD%E3%83%8A%E3%83%BC%E3%82%BC

23

p Y 9 5 1 は T S A d（ T-c e l l - s p e c i f i c a d a p t o r p r o t e i n）と結合する． Y 9 5 1

を介した V E G F R - 2 と T S A d の結合もまた，アクチンの再構成や細胞

の遊走に必要不可欠である（ F i g． 1 3）．

PIP2 DAG

1175

PLC-P

+

IP3

Ca2+

release

PKC

Raf

MEK

ERK

Elk1Gene transcription

Cell proliferation

PIP2

1175

TSAd

951

P

PIP3PI3K

Src

ShbP

FAK

Paxillin

Rac

Rho

Focal adhesion

turn over

Actin

reorganization

Cell migration

1214

Grb2P

Cdc42

p38MAPK

FAK

Actin

reorganization

VEGFR-2

VEGF-A

VEGFR-2

VEGF-A

F i g． 1 3． V E G F - A / V E G F R - 2 S i g n a l i n g i n Va s c u l a r E n d o t h e l i a l C e l l

P r o l i f e r a t i o n a n d M i g r a t i o n 1 3 )

V E G F R は V E -カドヘリン， -カテニン， P I 3 K と複合体を形成する

ことで，内皮細胞の生存にも関与する． P I 3 K の活性化により P I P3

（ p h o s p h a t i d y l - i n o s i t o l 3 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e；ホスファチジルイノ

シトール 3 , 4 , 5 -三リン酸）が増加すると A k t が活性化される． A k t の

活性化は B A D やカスパーゼ 9 に作用し，アポトーシス促進経路を阻

害することで細胞の生存を引き起こす（ F i g． 1 4）． 1 3 ）

24

PIP2

VE-cadherinPIP3

PI3K

-catenin

Akt

Caspase 9

Cell survival

BAD

VEGFR-2

VEGF-A

F i g． 1 4． V E G F - A / V E G F R - 2 S i g n a l i n g i n Va s c u l a r E n d o t h e l i a l C e l l

S u r v i v a l 1 3 ）

25

第五章分子標的治療薬

がん化学療法は，メトトレキサートやシクロホスファミドといった

D N A 合成を阻害する抗がん剤の使用が中心的であった 1 9 6 0 年代以降，

抗がん性抗生物質やプラチナ製剤などの新たな抗がん剤が導入される

とともに進歩し，治癒の期待できるがんも増えてきた．しかし，従来

の抗がん剤を用いる治療法でほとんど効果が得られないものも多い．

一方で，がんのベーシックサイエンスの発展に伴い，がん細胞の特性

を規定する様々な分子機構が明らかになってきた．これらの分子機構

に関与する分子を明確にし，その機能を制御することで治療に結びつ

けようとする分子標的治療の研究が現在，勢力的に展開されている . 1 4 ）

分子標的の理想条件としては，がん特異的であること（特異性），機

能修飾によりがんの生育が阻止されること（奏功性），生命維持に直結

する生理機能をもたないこと（安全性）が挙げられる．従来の抗悪性

腫瘍薬はいずれもそれ自体が細胞毒性を示すのに対し，分子標的治療

薬の中には，単独では影響を与えないが併用によって顕著な抗腫瘍効

果を示すものもあると予想される． 9 ）

これまでに世界では 4 7 剤，日本では 2 9 剤のがん分子標的薬が承認

されている（ Ta b l e 1）．これら 4 7 剤を化学的特性で分類すると， 3 0

剤が低分子医薬品， 1 6 剤がモノクローナル抗体医薬品， 1 剤が受容体

／ I g G 抗体 F c 融合タンパク質医薬品となる．これら分子標的治療薬

を標的から分類すると，シグナル伝達系阻害剤，細胞周期阻害剤，血

管新生阻害剤，プロテアソーム阻害剤，ヒストン脱アセチル化酵素阻

害剤，スプライシング阻害剤，テロメラーゼ阻害剤，抗体療法などが

ある．その内訳は全 4 7 剤中の 6 0％に相当する 2 8 剤が，シグナル伝

26

達や細胞周期，血管新生に関与するキナーゼを標的としたものである．

1 5 ）2 0 0 8 年 1 月には V E G F R などをターゲットとするソラフェニブ（ネ

クサバール ®），同年 4 月にはスニチニブ（スーテント ®）といったキ

ナーゼ阻害剤が国内で承認された．血管内皮細胞はがん細胞と異なり

遺伝的に安定しているため，これを標的とした治療薬は耐性を生じに

くい．また，ベバシズマブ（アバスチン ®）は V E G F に対するヒト型

モノクローナル抗体であり，2 0 0 4 年に世界初の血管新生阻害剤として

米国で認可され，日本でも 2 0 0 7 年に承認された．日本では，ベバシ

ズマブは， F O L F O X や F O L F I L I といった静注 5 - F U 系抗悪性腫瘍薬

を含む化学療法との併用が原則となっており，有意な延命効果を示し

ている．さらに， V E G F R - 2 の抗体で治療するとがんの血管構築を正

常血管の構築に近いものにすることにより，抗がん剤のがんへの蓄積

が増大する可能性が示唆されている． 1 4 ）

現在，国内外では延べ 4 4 2 化合物が低分子性分子標的抗がん剤の臨

床試験ステージにあり，その標的数は 9 5 に上る．このうちの 6 5％に

あたる 2 8 9 剤がキナーゼ阻害剤であり，その内訳は，マルチターゲッ

ト型阻害剤（ 2 6 剤），チロシンキナーゼ阻害剤（ 11 4 剤），セリン／ス

レオニンキナーゼ阻害剤（ 1 4 9 剤）である． 1 5 ）イマチニブは，標的酵

素 B C R - A B L を産生するフィラデルフィア染色体の発見から承認まで

約 4 0 年の月日を要したが，2 0 11 年に米国で承認された A L K 阻害薬ク

リゾチニブではその標的である E M L 4 - A L K の発見から承認までわず

か 4 年であった．このことからも臨床試験ステージにおけるキナーゼ

を標的とする阻害剤開発が盛んであることがわかる．

まるで「奇跡の新薬」のように思われる分子標的治療薬であるが，

これも使用期間が長期間になるにつれ，腫瘍の薬剤抵抗性が発現する

27

という問題が生じてきた．そこで治療前後の腫瘍細胞を比較してがん

再発後に特異的な二次変異を同定し，薬剤耐性の原因を明らかにする

研究も始められている．また ,耐性の出現を回避するという観点から，

細胞増殖におけるシグナル伝達系での阻害箇所を垂直もしくは水平方

向に増やして併用療法を行う手法も注目を集めている．一方，皮膚障

害を高頻度で発症することも分子標的薬の特徴である．従来の「薬疹」

はアレルギー機序により発症するため，治療の中止，休薬が原則であ

る．分子標的治療薬の皮膚障害の多くは，薬剤の効果の一端であり，

防ぎようの無い副作用として生じることから，皮膚障害をコントロー

ルしつつがん治療を継続するという新たな課題が残されている． 1 6 ）

今後，臨床試験ステージにある薬剤が優れた治療成績を収め，分子

標的抗がん剤の治療効果が量，質ともに充実することを期待しつつ，

さらに効果が大きく副作用や薬剤耐性の生じる可能性の低い新規開発

候補化合物の創成が望まれている．

Ta b l e 1． M o l e c u l a r - t a r g e t e d D r u g s 1 5 ）

一般名（商品名）標的分子適応がん種日本承認

Rituximab（Rituxan） CD20 B 細胞性非ホジキンリンパ腫，MCL 2001 年

Trastuzumab（Herceptin） Her2 乳がん，胃がん 2001 年

Imatinib（Gleevec） Bcr-Abl/Kit CML，GIST，Ph+ALL 2001 年

Gefitinib（Iressa） EGFR 非小細胞肺がん 2002 年

Gemtuzumab ozogamicin

（Myelotarg） CD33 再発・難治性 AML 2005 年

Bortezomib（Velcade） Proteasome 多発性骨髄腫，MCL 2006 年

Bevacizumab（Avastin） VEGF 大腸がん，非小細胞肺がん，乳がん，グリ

オブラストーマ，腎細胞がん，卵巣がん 2007 年

Erlotinib（Tarceva） EGFR 非小細胞肺がん，膵がん 2007 年

Cetuximab（Erbitux） EGFR 大腸がん，頭頸部がん 2008 年

Sorafenib（Nexavar） Multi-kinases 腎細胞がん，肝細胞がん 2008 年

Sunitinib（Sutent） Multi-kinases GIST，腎細胞がん，NET 2008 年

Ibritumomab tiuxetan

（Zevalin） CD20 B 細胞性非ホジキンリンパ腫，MCL 2008 年

Dasatinib（Sprycel） Bcr-Abl/Src CML，Ph+ALL 2009 年

28

Ta b l e 1． M o l e c u l a r - t a r g e t e d D r u g s（ C o n t i n u e d） 1 5 ）

一般名（商品名）標的分子適応がん種日本承認

Lapatinib（Tykerb） EGFR/Her2 乳がん 2009 年

Nilotinib（Tasigna） Bcr-Abl CML 2009 年

Panitumumab（Vectibix） EGFR 大腸がん 2010 年

Temsirolimus（Torisel） mTOR 腎細胞がん 2010 年

Everolimus（Afinitor） mTOR 腎細胞がん，SEGA，NET，乳がん，

腎血管筋脂肪腫 2010 年

Azacitidine（Vidaza） DNMT 骨髄異形成症候群 2011 年

Vorinostat（Zolinza） HDAC 皮膚 T 細胞性リンパ腫 2011 年

Ruxolitinib（Jakafi） JAK 骨髄線維症 2011 年

Pazopanib（Votrient） Multi-kinases 腎細胞がん，軟部腫瘍 2012 年

Denosumab（Ranmark） RANKL 多発性骨髄腫による骨病変及び固形が

ん骨転移による骨病変 2012 年

Crizotinib（Xalkori） ALK 非小細胞肺がん 2012 年

Axitinib（Inlyta） Multi-kinases 腎細胞がん 2012 年

Mogamulizumab（Poteligeo） CCR4 成人 T 細胞白血病リンパ腫 2012 年

Ofatumumab（Arzerra） CD20 慢性リンパ性白血病 2013 年

Regorafenib（Stivarga） Multi-kinases 大腸がん，GIST 2013 年

Pertuzumab（Perjeta） Her2 乳がん 2013 年

Brentuximab vedotin

（Adcetris） CD30

再発・難治性ホジキンリンパ腫，

未分化大細胞リンパ腫申請中

Trastuzumab emtansine

（Kadcyla） Her2 乳がん申請中

Afitinib（Gilotrif） EGFR/Her2 非小細胞肺がん（EGFR/exon19del，

L858R）申請中

Vandetanib（Caprelta） Multi-kinases 甲状腺髄様がん Phase III

Bosutinib（Bosulif） Bcr-Abl/Src CML Phase III

Ipilimumab（Yervoy） CTLA-4 メラノーマ Phase III

Decitabine（Dacogen） DNMT 骨髄異形成症候群 Phase I/II

Vemurafenib（Zelboraf） BRAF（V600E）メラノーマ（BRAF/V600E） Phase I/II

Carfilzomib（Kyprolis） Proteasome 多発性骨髄腫 Phase I/II

Panatinib（Iclusig） Bcr-Abl（T315I） CML，Ph+ALL Phase I/II

Romidepsin（Istodax） HDAC 皮膚 T 細胞性リンパ腫 Phase I/II

Alemtuzumab（Campath） CD52 慢性リンパ性白血病 Phase I

Ziv-aflibercept（Zaltrap） VEGF 大腸がん Phase I

Cabozantinib（Cometriq） Multi-kinases 甲状腺髄様がん Phase I

Tositumomab（Bexxar） CD20 再発・難治性非ホジキンリンパ腫未治験

Vismodegib（Erivedge） Hh signaling 基底細胞がん未治験

Dabrafenib（Tafinlar） BRAF（V600E）メラノーマ（BRAF/V600E）未治験

Trametinib（Mekinist） MEK メラノーマ（BRAF/V600E/K）未治験

本論

29

研究目的

動植物の分類や生態に関する調査，研究が進展する中，菌類の研究

はいまだ未成熟である． H a w k s w o r t h によれば，菌類の現存種数が 9

万 7 千種であるとすれば総種数は 1 5 0 万と推定されるが，水中の菌類

や生植物体内生息菌（ e n d o p h y t e），昆虫体内・体表生息菌，深部土壌

環境生息菌などは調査が乏しく，これらを追加するとその数は大幅に

増えるものと考えられる．一方，人類は菌類を有用か有害かに二分し，

その有用な働きを利用して発酵・醸造食品を作り，また菌体そのもの

である「キノコ」を食用として利用してきた．さらに近代になると，

菌類のもつ二次代謝物産生能に着目し， -ラクタム系抗生物質や高脂

血症治療薬の開発が行われるようになった．日本には 2 5 0 0 種程度の

キノコが生息するが，その中には伝統的に薬用として使われるものや，

産生される多糖が抗がん剤として用いられるキノコも知られている．

このようにキノコは，生物活性を有する独特な二次代謝物を生産する

ため，薬用資源としての期待が高まっている．

さて，悪性新生物は，1 9 8 0 年代に脳血管疾患を抜いてから今日に至

るまで，日本人の死亡原因の第一位を維持している．一方，ヒトがん

遺伝子やがん抑制遺伝子が発見され，がんが遺伝子疾患であることが

証明された．これら遺伝子の産物をターゲットとする分子標的治療薬

の開発が活発になり，現在世界で 4 0 を超える分子標的抗がん剤が承

認されている．中でも，がんの成長や転移に関わる血管新生を標的と

する薬剤は，最も注目を集める分子標的治療薬の一つである．しかし，

奇跡の新薬のように思われる薬剤であっても，予期せぬ副作用や耐性

の出現，効果に個人差が大きいなど克服すべき課題は多く，より良い

30

治療薬の創成のために M e - t o o - d r u g の開発や骨格ホッピングアプロー

チ，バイオアイソスター探索などが盛んに行われている．

以上の背景から著者は，血管内皮細胞の増殖阻害活性を指標として

子嚢菌クロコブタケ（ H y p o x y l o n t r u n c a t u m）子実体の二次代謝産物

から，血管新生阻害剤のリード化合物の探索研究を展開した．すでに

クロコブタケ子実体からは数種の b e n z o [ j ] f l u o r a n t h e n e 誘導体が単離，

構造決定されているものの，詳細な成分探索とその生物活性について

の報告はない．また，天然から見出された他の b e n z o [ j ] f l u o r a n t h e n e

誘導体もその生理活性についての報告は数少ない．本研究では特に，

h y p o x y l o n o l C の i n v i t r o における血管新生阻害作用およびその作用

機序の解明を目指して創薬研究を展開した．

31

第一章クロコブタケ（ H y p o x y l o n t r u n c a t u m）子実体からの H U V E C

増殖阻害化合物の探索

クロコブタケはチャワンタケ亜門，フンタマカビ綱，クロサイワイ

タケ目，クロサイワイタケ科，ヒポキシロン属に属する不食性のキノ

コである．子座は黒色できわめて硬く，子嚢殻を埋没又は半埋没する．

子座の形は半球形から平らに広がるものなど変化に富む．ナラなどの

広葉樹の枯幹に多く，シイタケ栽培のほだ木に生じた場合，シイタケ

の発育を競合的に阻害し病害菌となる． 1 8 )

すでに当研究室の倉持らはクロコブタケ子実体抽出物から，

b e n z o [ j ] f l u o r a n t h e n e 誘導体の h y p o x y l o n o l A（ 1）， B（ 2）， C（ 3）

および D（ 4）を単離し，その平面構造を報告した． 1 9 , 2 0 )

一方， A n d e r s o n らは 5 - m e t h y l m e l l e i n （ 5 ）を， 2 1 ) 浅川らは

4 , 5 , 4 ' , 5 ' - t e t r a h y d r o x y - 1 , 1 ' - b i n a p h t h y l（ 6），t r u n c a t o n e（ 7），L i n y p h i a

t r i a n g u l a r i s の性フェロモンである 3 R - h y d r o x y b u t y r i c a c i d（ 8）， 8

の二量体である 3 R - ( 3 R - h y d r o x y b u t y r y l o x y ) b u t y r i c a c i d（ 9）， 8 の三

量体である 3 R - [ 3 R - ( 3 R - h y d r o x y b u t y r y l o x y ) b u t y r y l o x y ] b u t y r i c a c i d

（ 1 0）をそれぞれ単離，報告している． 2 2 , 2 3 ) さらに，クソニンジン

A r t e m i s i a a n n u a の茎の内生菌 H . t r u n c a t u m（ s t r a i n N o . I F B - 1 8）

32

から， d a l d i n o n e C（ 11）および D（ 1 2）が単離されている．前者は

C D スペクトルによる励起子キラリティー法を用いて，その不斉中心

である 9， 1 0， 1 9 位がそれぞれ S，R， S であり，後者の 9， 1 0， 1 6，

1 9 位はそれぞれ S，R，S，S であると決定された．なお，d a l d i n o n e C

（ 11）および D（ 1 2）はヒト結腸・直腸がん培養株 S W 111 6 細胞に対

して細胞毒性を示し，その I C 5 0 はそれぞれ 4 9 . 5 M および 4 1 . 0 M

であり， 5 - f l u o r o u r a c i l と同程度であると報告されている． 2 4 )

その他，天然資源より 10 種の b e n z o [ j ] f l u o r a n t h e n e 誘導体が単離，

報告されている．ゴムタケ B u l g a r i a i n q u i n a n s より紫色結晶の

b u l g a r h o d i n（ 1 3）および b u l g a r e i n（ 1 4）が，2 5 ) チャコブタケ D a l d i n i a

c o n c e n t r i c a より d a l d i n o n e A（ 1 5）および B（ 1 6）が単離されている．

D a l d i n o n e A（ 1 5）の絶対構造は C D スペクトルによる励起子キラリ

ティー法により決定されており， d a l d i n o n e B（ 1 6）の不斉中心は

N O E S Y によりその相対配置が確認されている． 2 6 ) また，地中海に生

息する海綿 A p l y s i n a a e r o p h o b a より分離された菌 H o r t a e a w e r n e c k i i

からは h o r t e i n（ 1 7）が得られた．2 7 ) C l a d o s p o r i u m c f . c l a d o s p o r i o i d e s

からは，4 種の b e n z o [ j ] f l u o r a n t h e n e 誘導体（ 1 8～ 2 1）が単離された．

化合物 1 8 の相対立体構造は N O E S Y と X 線結晶解析の結果より明ら

かになっている．化合物 1 9～ 2 1 は 1 H - 1 H カップリング定数を 1 8 と比

較し，その相対立体構造を決定した．1 8 は I L - 2 産生抑制作用及び F y n，

L c k，A b l，E G F R などのチロシンキナーゼに対する阻害活性をもつこ

とが報告されている．2 8 , 2 9 ) また G a r c i n i a a t r o v i r i d i s の葉から単離さ

れた X y l a r i a c e o u s 属の菌 P S U - A 8 0 からは x y l a r e n o l （ 2 2）が得られ

ている．本品の 1 位および 3 位の相対立体配置は，差 N O E により決

定されたが， 6 b 位の立体配置は未決定である． 3 0 )

33

F i g． 1 5． I s o l a t e d C o m p o u n d s f r o m H . t r u n c a t u m

34

F i g． 1 6．B e n z o [ j ] f l u o r a n t h e n e D e r i v a t i v e s f r o m N a t u r a l R e s o u r c e s

35

第一節 H U V E C 増殖阻害

血管内皮細胞の増殖は血管新生において必要不可欠なステップであ

り， V E G F はその促進因子として重要な役割を果たしている．

本研究では， H U V E C 増殖阻害化合物の探索を目的としたエキスの

分画，化合物の精製を， H U V E C 増殖阻害活性を指標として行った．

すなわち，1 n M の V E G F および s a m p l e を培養した H U V E C に添加し，

W S T- 8 試薬を用いたホルマザン法により，その細胞増殖阻害活性を測

定した．細胞増殖阻害活性は V E G F のみを添加した場合の細胞生存率

を c o n t r o l とし， c o n t r o l に対する s a m p l e の I C 5 0（ g / m L）として数

値化して評価した．なお，p o s i t i v e c o n t r o l として d o x o r u b i c i n を用い

た．

36

第二節クロコブタケ子実体抽出エキスの HUVEC 増殖阻害活性

本研究にはクロコブタケ H . t r u n c a t u m は，2 0 0 9 年 9 月に東京都東

久留米市にて採集したものを用いた．このクロコブタケ子実体から菌

糸体を誘導し， D N A 塩基配列に基づく真菌同定法により， H .

t r u n c a t u m であると同定した．

乾燥クロコブタケ子実体 4 0 2 g を C H C l 3， M e O H で順次抽出し，

C H C l 3 エキス（ 1 5 . 9 g）， M e O H エキス（ 4 5 . 6 g）をそれぞれ作成し

た． M e O H で抽出後，残渣が着色していたので，さらに a c e t o n e で抽

出し， a c e t o n e エキス（ 1 4 . 3 g）を作成した．

これらのエキスについて H U V E C 増殖阻害試験を実施したところ，

C H C l 3 エキスに H U V E C 増殖阻害活性が認められた．

そこでまず，C H C l 3 エキスについて H U V E C 増殖阻害活性化合物の

単離を試みた．

37

第三節クロコブタケ子実体 C H C l 3 エキスからの H U V E C 増殖阻害化

合物の探索

H U V E C 増殖阻害活性が認められたクロコブタケ子実体 C H C l 3 エキ

ス（ 1 5 . 9 g）を，s i l i c a g e l の c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y（以下 S i . C . C . ）

にて分画し， F r. A～ E の 5 つの画分を得た（ F i g . 1 7）．それぞれにつ

いて H U V E C 増殖阻害試験を行ったところ，F r. B（ 2 . 3 g）と F r. D（ 5 . 1

g）に阻害活性が認められた． F r. B は F r. D より強い阻害活性を示し

たが，両画分の収量と T L C 上でのスポットの挙動から，含有成分の単

離が容易と思われる F r. D をさらに分画することとした．

F r. D を S i . C . C . により分画し，F r. D - a～ D - e を得た．この分画の

過程で F r. D - d の一部が C H C l 3 により沈殿したので，可溶部と不溶部

に分離した．この不溶部は単一の化合物であり， H T- 1 と仮称した．

H T- 1 は新規化合物であったので， h y p o x y l o n o l C（ 2 3）と命名した．

また，C H C l 3 可溶部 F r. D - d - s o l .，を S e p h a d e x L H - 2 0 C . C .，S i . C . C .，

O D S H P L C を用いて分離，精製し， H T- 2 と仮称する単一の化合物を

得た． H T- 2 は新規化合物であったため， h y p o x y l o n o l F（ 2 4）と命名

した． H y p o x y l o n o l C（ 2 3）および F（ 2 4）はいずれも H U V E C 増殖

阻害試験において細胞増殖阻害活性を示した．

続いて H U V E C 増殖阻害活性類似化合物の探索を目的として， T L C

上のスポットと H U V E C 増殖阻害活性を指標に， F r. D - b および F r.

D - d - s o l . を分画した．まず， F r. D - b を O D S C . C .， O D S H P L C を用

いて分離，精製し， H T- 3～ 6 と仮称する 4 種の化合物を得た． M S，

各種 N M R などのスペクトルデータを用いた構造解析の結果， H T- 3～

6 はそれぞれ当研究室の倉持らによりクロコブタケから単離され，平

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面構造が明らかとなっている p r e v i o u s n a m e : h y p o x y l o n o l C（ 3），

B（ 2）， D（ 4）， A（ 1）であると同定した． 1 9 , 2 0 ) そこでさらに立体構

造を決定するため，X 線結晶解析および N M R データ，C D スペクトル

を詳細に検討し，これらの絶対構造を推定した．その構造的特徴から，

H T- 3（ p r e v i o u s n a m e： h y p o x y l o n o l C（ 3））を h y p o x y l o n o l B（ 2 5），

H T- 4（ p r e v i o u s n a m e： h y p o x y l o n o l B（ 2））を h y p o x y l o n o l D（ 2 6），

H T- 5（ p r e v i o u s n a m e： h y p o x y l o n o l D（ 4））を h y p o x y l o n o l E（ 2 7），

H T- 6（ p r e v i o u s n a m e： h y p o x y l o n o l A（ 1））を h y p o x y l o n o l A（ 2 8）

に改名した（ F i g． 1 9）．

なお， h y p o x y l o n o l D（ 2 6 ) および E （ 2 7）は比較的強い H U V E C

増殖阻害活性を示した（ Ta b l e 4）．

次に， F r. B を S i . C . C . により分画し， F r. B - a～ B - f を得た．これ

ら 6 画分のうち，F r．B - c～ B - f の 4 画分に阻害活性が認められた．F r．

B - c に h y p o x y l o n o l 類に特徴的なスポット（ T L C にて U V 3 6 5 n m 照

射下で橙色）が見られたため，さらに S i . C . C . により分画し，5 画分

を得た．このうち， T L C において既知の h y p o x y l o n o l 類と同様の U V

吸収を示すが， R f 値の異なるスポットを含む F r. B - c - 2 を 7 0％ M e O H

可溶部と不溶部に分画した． H y p o x y l o n o l 類は比較的低極性の化合物

であるが， H 2 O－ M e O H 系の混合溶媒にも可溶である． F r. B - c - 2 の

7 0％ M e O H 可溶部を O D S C . C . および S i . C . C . を用いてさらに分画

し， H T- 7 と仮称する単一の化合物を 3 . 5 m g 得た． H T- 7 は新規化合

物であったので， h y p o x y l o n o l G（ 2 9）と命名した．

F r. B - b は H U V E C 増殖阻害活性を示さなかったが， T L C �

search for antiangiogenic constituents from hypoxylon ...sol. solution tsad t cell-specific adapter...

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