seminario final de biologia molecular!!
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Cristina Cruz AgudeloLaura Fandiño GaviriaEstudiantes medicina
III semestre UPB
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INTRODUCTION
ANGIOGENESIS: the sprouting of new capillaries from preexisting blood vessels.
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INTRODUCTION
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• The angiogenesis is essential for tumor growth and progression, because the tumor growth is angiogenesis – dependent.
• One experimental avenue to understad the control of tumor angiogenesis is to identify and study molecules that have regulatory activity on endothelial cells.
• In this article they have discovered an angiogenesis inhibitor from the conditioned medium of pancreatic β tumor cells and refer to it as
• Beta 35. This protein have a gene segment of bovine transferrin.
• They reported the purification, characterization and anti- tumor activity of this protein.
INTRODUCTION
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OBJETIVE
• Prove that Beta-35 is a transferrin-derived inhibitor of angiogenesis and tumor growth
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1. PREPARACIÓN DEL MEDIO CONDICIONADO
2. ENSAYO DE INCORPORACIÓN CON TIMIDINA
3. ENSAYO DE MEMBRANA CORIOALANTOIDEA DE POLLO (CAM)
4. PURIFICACIÓN DE BETA-35
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MATERIALES Y MÉTODOS
5. MICROSECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN DE LA MASA :
• Degradación automatizada de Edman: Pehr Edman. Secuenciación de aminoácidos en un péptido.
- NO en péptidos con N-terminal bloqueado. - 50% de proteínas lo tienen bloqueado. - Rendimiento no es de 100%. Se obtienen muchos errores.
• Espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida.
Miden el peso electrónicamente. Resultados en espectro de masas . Gráfica de cada molécula,
peso y cantidad.
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6. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES HUMANAS BETA – 35.
• Clonaron y expresaron esta proteína en Escherichia coli utilizando el segmento del gen correspondiente de Beta-35 contenida en el cDNA de humanos de la transferrina .
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7. ESTUDIOS EN ANIMALES.• Se realizaron en las instalaciones del hospital
infantil de Boston.• Ratones SCID hembra de 24 – 27 g ,
inmunocomprometidos.- Condiciones .- Alimentación.- Anestesia. (metoxyflurano).
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8. TRATAMIENTO DE RATONES PORTADORES DE TUMOR CON BETA 35 INSOLUBLE.
Las células pancreáticas se implantaron
Tumor 100 – 200 mm3, se separaron en 2 grupos
Beta 35 recombinante 5mg/kg/día
16 díasInyecciones similares
Se determinó el volumen del tumor
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RESULTADOS
1. Identificación y purificación de Beta-35 del medio condicionado de las células tumorales del páncreas de ratón:
Se cuantificó la inhibición de la Timidina [3H] en el ADN de las células BCE
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RESULTADOS
2. Secuencia N-terminal y el análisis de espectrometría de masas Beta-35:
Secuencia DPERTVRWCTISTHEANK(X)ASFREN de Beta-35 es idéntica a la secuencia N-terminal de aminoácido de la transferrina
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3. La construcción y purificación de proteínas recombinantes humanas Beta-35 en el sistema de expresión de E. coli :
Con el fin de obtener cantidades suficientes de Beta-35 para iniciar experimentos contra el tumor, clonaron esta molécula mediante la inserción de un segmento de gen humano de Beta-35 en el vector sin secuencia del péptido señal.
RESULTADOS
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4. Tratamiento de tumor pancreático y melanoma humano en ratones SCDI con Beta 35 humana recombinante:
La administración sistémica de 5 mg / kg / día de Beta-35 inhibe significativamente el crecimiento de dos tipos diferentes de tumores primarios.
64%
RESULTADOS
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DISCUSSIONDISCUSSION
AUTOR REPORTS AGREE / DESAGREE
M.S. O’Reilly et al
The potent angiogenesis inhibitor, Angiostatin is a proteolytic product of endogenous proteins which in his intact form isn´t anti-angiogenic
AGREE
M.S. O’Reilly et al
The potent angiogenesis inhibitor, Endostatin is a proteolytic product of endogenous proteins which in his intact form isn´t anti-angiogenic
AGREE
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DISCUSSION
AUTOR REPORTS AGREE / DESAGREE
M.S. O’Reilly et al
The potent angiogenesis inhibitor, cleaved antithrombin III is a proteolytic product of endogenous proteins which in his intact form isn´t anti-angiogenic
AGREE
M.F. CarlevaroThe intact form of the transferrin has been reported to be angiogenic DISAGREE
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CONCLUSIONES
• This study opens a new window to cancer therapy.
• This type of study encourages us to research on the subject and move toward cure of the disease.
• The tumors have multiple causes and we need to know about these to intervene effectively.
• The reason of medicine is unstoppable search for patient welfare
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GRACIAS