seminario molecular
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Impacts of a long-term programme of active surveillance and chlorhexidine baths on the clinical and molecular epidemiology of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in an Intensive Care Unit in Scotland.Vartul Sangala, E. Kirsty Girvanb, Sagar Jadhava, Timothy Lawesc, Andrew Robbb, Leila Vali d, Giles F. Edwardsb, Jun Yua, Ian M. Gouldc.
Jhon M. Cardona B.Mateo Aránzazu U.
UPB 2012
INTRODUCTION
• Combining surveillance and infection control
procedures, can be a key factor to prevent
MRSA (meticillin-resistant Staphylococcus
aureus), but there are some obstacles such as
the number of single rooms and antibiotic
resistance. Most infections are caused by two
strains EMRSA-15 and EMRSA-16, identified by
PFGE, MLST and spa typing, these strains are
from the ICU, which is an important reservoir of
MRSA
Staphylococcus aureus
• Family StaphylococcaceaeStaphylococcaceae Genus StaphylococcusStaphylococcus Specie Aureus Aureus
• Is an anaerobic Gram-positive coccal bacterium. It is frequently found as
part of the normal skin flora, S. aureus is a successful pathogen due to a
combination of bacterial immuno-evasive strategies.
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
• MRSA is any strain
of Staphylococcus aureus that has
developed resistance to beta-lactam
antibiotics, which include
the penicillins(methicillin, dicloxacilli
n, nafcillin, oxacillin, etc.) and
the cephalosporins by alteration of
target site
Meticillin
• Is a narrow-spectrum beta-lactam antibiotic of the penicillin class
• Acts by inhibiting the synthesis of bacterial cell walls. Inhibits cross-linkage between
the linear peptidoglycan polymer chains of the cell wall of Gram-positive bacteria. It
does this by binding to and competitively inhibiting the transpeptidase enzyme used
in peptidoglycan synthesis
Chlorhexidine
• Chlorhexidine is a chemical antiseptic that
destabilizes and penetrates the bacterial
cell membrane, precipitate the cytoplasm
and interfere with the membrane function
by inhibiting the use of oxygen, causing a
decrease in ATP levels and cell death
Relationship
• Methicillin-resistant Staphylococcus aureus is commonly
found in ICU, and is responsible for most of hospital-acquired
infections, also is difficult to treat due to methicillin resistence,
so scientist and doctors have been creating new
measurements to avoid the generation and propagation of
MRSA, one of the strategies is the inclusion of chlorhexidine
baths, combined with surveillance, this one is a very
successful strategy because the MRSA is not chlorhexidine
resistant.
GENERAL OBJECTIVE
• Evaluate the impacts of a long-term programme
of active surveillance and chlorhexidine baths on
the clinical and molecular epidemiology of
methicillin-resistant staphylococcus aureus
(MRSA) in an intensive care unit
MATERIALES Y METODOS
Diseño
• Es un estudio descriptivo
• Está enfocado en el control de MRSA en las unidades de cuidados intensivos,
se inicio en mayo de 2003, y se alargó durante cuatro años, se estudiaron 85
aislamientos del mismo periodo de tiempo, mediante pruebas de resistencia a
antibióticos, y métodos genopiticos (PFGE, spa typing y MLST).
Lugar
• El estudio se realizo desde mayo del 2003
hasta abril de 2007 en la unidad de
cuidados intensivos del Aberdeen Royal
Infirmary, en el noreste de escocia.
• La unidad de cuidados intensivos posee
16 camas y cuatro salas de aislamiento, y
una tasa media de 800 pacientes/año
Intervención
• Se tomaron muestras de todos los pacientes en diferentes sitios
(nariz, garganta, axila, ingle) y se comenzó un tratamiento, aplicación
de una solución tópica nasal anti-MRSA cada 6 horas y baños diarios
con una solucion al 4% de gluconato de clorhexidina. En septiembre
de 2003 se detuvieron los procesos debido a resultados negativos
Intervención
• Se realizo la aplicacion de tres preparaciones tópicas nasales• Ácido fusídico al 2% (Fucidin crema, Leo Pharma, Risborough)• Sulfato de neomicina al 0.5% combinado con hidrocloruro de
clorhexidina al 0.1% (Crema Naseptin; Farmacéuticos Alianza, Chippenham, Reino Unido)
• Bacitracina de zinc (500 U / g) en combinación con polimixina B sulfato (10 000 U / g) (pomada Polyfax; Teva, Castleford, Reino Unido)
• Posteriormente, todos los pacientes que dieron positivo para MRSA, fueron aislados en una sola habitación
Recoleccion de datos
• Los datos acerca de MRSA, algunas vigilacias de infecciones y la
adherencia fueron recuperados de vigilacias rutinarias y de monitoreos del
programa de control de MRSA de la unidad de cuidados intensivos.
• Los aislamientos de MRSA fueron enviados al Scottish MRSA Reference
Laboratory y al Stobhill Hospital para fenotipificación antimicrobiana,
pruebas de susceptibilidad antiséptica y genotipado
Caracterización fenotípica y pruebas de sensibilidad
• La producción de ureasa fue probada
inoculando Agar de úrea con 10 Litros de
inoculo de Mcfarland. Se incubaron
durante 48 horas a 35°C, el color rosado
indicaba resultados positivos, y el
amarillo, negativos. Los resultados
registrados fueron blanco, crema y
amarillo
Estándar de McFarland
• se usa en suspensiones bacteriológicas para saber el número de bacterias por mililitro. Se mide en una escala que va de 0.5 a 10. se mezclan soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1%, es pruebas se sensibilidad se usa para evitar falsos positivos y estandarizar el proceso
Pruebas de sensibiliad
• Se hicieron pruebas para 10 antibioticos
usando Vitek, entre los cuales estaban:
Selfametoxazol, neomicina, teicoplanina,
vancominica
• Las pruebas dieron positivas para
teicoplanina y vancomicina
PCR
• La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis en
los años 80, es usada para obtener numerosas copias de un fragmento de DNA específico.
• Se hace en 3 pasos, desnaturalización, alineamiento y sintesis.
• Es un proceso de alto rendimiento, de alta especificidad y alta fidelidad.
• Sus aplicaciones son variadas, en el estudio se uso para evaluar la suceptibilidad a la
clorhexidina
Electroforesis en gel de campo pulsado
• La electroforesis se hace para separar moleculas segun su tamaño. En el estudio se realizo el siguiente proceso:
• Las colonias de S. aureus se incorporaron en bloques de agarosa
• Despues de la lisis bacteriana, el AND genónico fue digerido y luego se realizo la electroforesis de campo pulsado
Spa
• El método de tipificación spa se basa en la secuencia polimorfica X del gen de la proteina A (spa) presente en todas las cepas de Staphylococcus aureus. La región X está constituido por un número variable de 24 pares de bases que son bastante repetitivas. debido a su estructura de repetición, permite identificar micro y macrovariacione entre las diferentes cepas de Staphylococcus aureus
Tipificación multilocus de secuencias
• Se usa para caracterizar bacterias y microrganismos mediante el uso de secuencias de genes de mantenimiento.
• En el estudio, se extrajo el ADN genómico, de 7 genes de mantenimiento, y se procesaron de acuerdo a los protocolos de el sitio web http://saureus.mlst.net/misc/info.asp
RESULTADOS
No hubo evidencia de pérdida en la eficacia clínica de la estrategia de control, Como se describió previamente.No hubo cambios significativos en las tasas de otros índices de vigilancia de infecciones por organismos MSSA u otras bacteriemias.
Eficacia a largo plazo del programa de control MRSA
Propiedades moleculares y fenotípicas de clones aislados de MRSA
De los 85 MRSA, 11 fueron adquiridos en un periodo antes de la admisión a la UCI y 74 aparentemente adquiridos en la UCI.
Estos agrupan en tres grupos, con la excepción de cuatro aislamientos. Los perfiles en dos de estos grupos fueron fácilmente identificados como asociados con EMRSA-15 y EMRSA-16. El tercer grupo estaba bien definido fenotípicamente y se ha encontrado que corresponden a CC45.
RESULTADOS
Cuatro cepas encontradas están muy extendidas, aunque no son comunes en Escocia y es probable que hayan sido adquiridos por los pacientes antes ingreso en la UCI.
De acuerdo con estos resultados, tres clones MRSA son prevalentes dentro de la UCI. raramente se observaron cepas ST5 y ST8, en el período de estudio, pero éstos no persisten.
De los 11 aislamientos encontrados antes de admisión 7 eran CC30, y 4 CC22. Todos los aislamientos CC45 fueron adquiridos.
RESULTADOS
RESULTADOS
La figura. 2. Dendrograma construido por análisis de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)
También se muestra en el diagrama susceptibilidad antimicrobiana, tipos de spa y tipificación de secuencias multilocus (MLST) resultados.
Fuente: ETA, aspirado traqueal, BAL lavado broncoalveolar; ET, endotraqueal, CVP, central catéter venoso presión.
Las susceptibilidades antibióticas: PN, penicilina G; Ox, oxacilina, Cp, ciprofloxacina, Er, eritromicina, Cl, clindamicina, No, neomicina, Tb, tobramicina; Km,kanamicina, Su, sulfametoxazol; Tr, trimetoprim, Fd, ácido fusídico; Mp, mupirocina
La ureasa: P, positivo, N negativo. Pigmento: C, crema, W, blanco, Y, amarillo.
RESULTADOS
Propiedades fenotípicas de los linajes de Staphylococcus aureus
Los aislamientos se probaron para la producción de ureasa y la pigmentación en Iso-Sensitest agar, todos CC22 aislados fueron negativos para la producción de ureasa, mientras que todos otros clones fueron positivos.
CC30 no presento pigmentación en Iso-Sensitest, (registrado como blanco). La mayoría de CC22 y CC45 se registraron como de color crema, y todos los clones restantes en este estudio se registraron como amarillo.
RESULTADOS
Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Se ha probado susceptibilidad antimicrobiana en todos grupos de aislamientos con 12 agentes antimicrobianos.
EMRSA-15 y aislados EMRSA-16 tenían diferentes patrones de susceptibilidad a los antimicrobianos. Cepas de EMRSA-15 fueron resistentes en general a menos antibióticos que EMRSA-16, a pesar de que todos los aislamientos de los linajes comunes eran resistentes a la ciprofloxacina.
Sólo una diferencia en antibiogramas entre el EMRSA-16 aislamientos y las cepas CC45 CC45 fue que los aislamientos fueron resistentes a sulfametoxazol.
La mayoría de las cepas fueron resistentes a ciprofloxacina, sin embargo, la susceptibilidad a otros antimicrobianos fue variable.
DISCUSSION
AUTHOR OPINION YES OR NOGould IM, et al We found no evidence of
deterioration in the effectiveness of a control program for MRSA in the ICU of Aberdeen Royal Infirmary after application in May 2001
yes
Khandavilli S, et tal This typing method has a high discriminatory power and is suitable for characterizing the outbreak and transmission tracking intensive care unit.
yes
AUTHOR OPINION YES OR NO Melles DC, et al PFGE is a technique that
recognizes identification microvariation genome. PFGE has been a gold standard for investigating the local epidemiology and characterization in outbreaks of MRSA
yes
Hunt AC, et al both of these strains remain the most
commonly isolated in healthcare settings, with CC30 replacing CC22 aspreviously described
yes
DISCUSSION
Molecular biology methods provide the ability to identify and relate the origin of clonally human isolates and distinguish between strains associated with epidemics. These techniques should be used for the monitoring of the various infections.
Using molecular biology techniques provides assistance to public health to implement appropriate and timely preventive measures, not only during hospitalization but in the community.
The development of these methods has proven effective in the differentiation of microorganisms, their main usefulness lies in its high discriminatory power of clones in the same species.
Most discrimination of clones could generate more selective and specific treatments for particular pathogen. Allowing more effectively attack and perhaps with less effects for the patient.
CONCLUSIONS
Jhon M. Cardona
GRACIAS