Slide based cytometry– princip a pou!ití

O. Hovorka1, V. Budínsk"2

1Mikrobiologick" ústav AV #R, Víde$ská 1083, Praha 4

2Ústavu imunologie 2. Léka%ské fakulty FN v Motole, V Úvalu 84,150 06 Praha 5

1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie

2. Princip

3. P!íklady a vyu"ítí

1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie

2. Princip

3. P!íklady a vyu"ítí

Vazba lektinu WGA (FITC) na 3T3 my&í fibroblasty po 24h inkubaci s 2 typy polymerníchlé'iv (doxorubicin)

Jezierska A et all., Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM) is associated with suppression of breast cancer cells invasion.Med Sci Monit. 2006 Jul;12(7):BR245-56. Epub 2006 Jun 28.

Figure 5. Comparison of ALCAM, E-cadherin, #-catenin, andMMP-2 expression in tumors graded according to Elston and

Ellis criteria: noninvasive

(NG), grade 1 – well differentiated (G1), grade 2 – moderatelydifferentiated (G2), grade 3 – poorly differentiated) (G3). Proteinconcentrations in individual cells were measured by LSC andexpressed as a ratio of protein-related green fluorescence (GreenIntegral) to the nucleus area marked by DNA-related redfluorescence.

Fig. 3 Comparative analysis of DNA content of the two Giardia nuclei by laserscanning cytometry. To categorize nuclei, only events from R1 region are used.Nuclei that fall outside the scattergram dynamic range are excluded from furtheranalysis. Nuclei of R1 region are separated into six subpopulations (marked bydifferent colors) according to Ratio of Integral of Fluorescence to Average Pixelvalue.

Pavla T(mová et all., Cytogenetic evidence for diversity of two nuclei within a single diplomonad cell of Giardia. Chromosoma, 2007 Feb;116(1):65-78.Epub 2006 Nov 4.

1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie

2. Princip

3. P!íklady a vyu"ítí

1. Kvantitativní záznam souboru obraz$

2. Anal%za obrazu a identifikace jednotliv%chudálostí

3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí

1. Kvantitativní záznam souboru obraz$

2. Anal%za obraz$ a identifikace jednotliv%chudálostí

3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí

Excitace lasery

Záznam signálu pomocí

fotonásobi&$

Excitace v%bojkou

Záznam signálu pomocí CCD

kamery

Segmentace získaného souboru obraz( vymezením úrovn) pozitivity vjednom z kanál(

Sestavení scatergram(, dotplot( a histogram( odpovídajícíchfluorescen'ním vlastnostem m)%eného vzorku

1. Kvantitativní záznam souboru obraz$

Excitace lasery

Záznam signálu pomocí

fotonásobi&$

Excitace v%bojkou

Záznam signálu pomocí CCD

kamery

Laserov% skenovací cytometrCompuCyte iCys

Zobrazovací cytometr

Olympus Scan^R

Laserov" skenovací cytometrCompuCyte iCys

LASERY

SKENOVACÍZA!ÍZENÍ

SKENOVACÍOPTIKA

OBJEKTIV

MOTORIZOVAN" STOLEK

DETEKTORROZPTYLU SV#TLA

ZDROJPROCHÁZEJÍCÍHO

SV#TLAFOTONÁSOBI$E

ZELENÁ

ORAN%OVÁ

$ERVENÁ

FAR RED

VZOREK

CCD KAMERA

Konfigurace LSC

•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode

Konfigurace LSC

•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode

•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu

Konfigurace LSC

•AutofokusRychl" laserov" AutoFocusnezávisl" na intenzit)fluorescence

•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode

•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu

Konfigurace LSC

•AutofokusRychl" laserov" AutoFocusnezávisl" na intenzit)fluorescence

•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode

•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu

•MikroskopOlympus IX-serie10x, 20x, 40x, 60x objektivyAutomatick" stolek s posunem0.5*m

Konfigurace LSC

•AutofokusRychl" laserov" AutoFocusnezávisl" na intenzit)fluorescence

•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode

•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu

•MikroskopOlympus IX-serie10x, 20x, 40x, 60x objektivyAutomatick" stolek s posunem0.5*m

•KameraBarevná CCD kamera prozáznam snímk( s vysok"mrozli&ením

Zobrazovací cytometrOlympus Scan^R

vzorek

kostka

Fluorochrom

Excita&níFiltr

Dichroické

zrcadlo

Emisní Filtrdiafragma

Objektiv

CCD kamera

Zdroj sv'tla –v%bojka

Hardware

• Mikroskop Olympus IX81

• Vysoce citlivá CCD / motorizovan" stolek,

• Illumin'ní systém MT20

• Real-Time PC kontroler

• Hardwarov" i softwarov" autofokus

• Inkubátor (teplota, CO2, vlhkost)

• Robotick" podava' vzork(

ShutterAttenuator Light guideXe or XeHg Filter wheel

MT 20 – Nov% sv'teln% zdroj pro fluorescen&ní aplikaceZcela integrované !e(ení

! Sv)tlovod ! Zdroj energie

! Záv)rka

! Sada filtr(! Atenuátor

! Xe nebo Hg/Xe Arc v"bojka

! Elektronika

All Inclusive

Termáln) i mechanicky je tento zdroj izolovánod mikroskopu – eliminují se tedy vibracevyvolané tepeln"mi zm)nami i pohybemmechanick"ch sou'ástek

PC controler pro Imaging System: Serial operation, PC jitter, ...

Real-time synchronizace

Paralelní operace, eliminace PC jitter, vysoce p%esn" timing, redukce bleachingu

CCD

Shutter

Filter wheel

)as

shutter

Readout 1Exposure 1 Exposure 2 Readout 2

change filter

PC jitter PC jitter PC jitterPC jitter

shutter Exposure 1 Readout 1 shutter change filter shuttervibrations Exposure 2 Readout 2

1. Kvantitativní záznam souboru obraz$

2. Anal%za obraz$ a identifikace jednotliv%chudálostí

3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí

Excitace lasery

Záznam signálu pomocí

fotonásobi&$

Excitace v%bojkou

Záznam signálu pomocí CCD

kamery

Segmentace získaného souboru obraz( vymezením úrovn) pozitivity vjednom z kanál(

Sestavení scatergram(, dotplot( a histogram( odpovídajícíchfluorescen'ním vlastnostem m)%eného vzorku

3T3 fibroblast, paclitaxel-OregonGreen + doxorubicin

3T3 fibroblast, paclitaxel-OregonGreen + doxorubicin

Periferní kontura

pozadíSubkontura

Primární kontura

Roz(í!ení primární kontury

Segmentace událostí (Triggering)

Segmentace událostí (Triggering)fantomové (virtuální) události

jaterní tká& karcinom prsu slezina

parafínové %ezy, zna'eno SytoxOrange

1. Kvantitativní záznam souboru obraz$

2. Anal%za obraz$ a identifikace jednotliv%chudálostí

3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí

Excitace lasery

Záznam signálu pomocí

fotonásobi&$

Excitace v%bojkou

Záznam signálu pomocí CCD

kamery

Segmentace získaného souboru obraz( vymezením úrovn) pozitivity vjednom z kanál(

Sestavení scatergram(, dotplot( a histogram( odpovídajícíchfluorescen'ním vlastnostem m)%eného vzorku

Zaznamenané parametry• Fluorescence inegrováná v rámci segmentovacích kontur

• Maximální intenzita jednoho pixelu (“Maximal Pixel”)

• Integra&ní plocha (po&et pixel$)

• Pr$m'r integra&ních kontur

• Fluorescence integrovaná v oblasti vymezené perifernímobrysem (nap!. jádro vs cytoplazma)

• Fluorescence pozadí (m$"e b%t automaticky ode&tena)

• xy sou!adnice v(ech pixel$ (poloha na sklí&ku)

• )as m'!ení

• U sekundárních kontur jejich fluorescen&ní parametry,jejich po&et a vzdálenost

1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie

2. Princip

3. P!íklady a vyu"ítí

Red Max Pixel

A

rea

100

A

A B

B

C

C

Granulocytes (C)

Lymphocytes (A)0

Monocytes (B)

100

Identifikace populací PBL na LSC pomocí rozídl$ v barveníjaderné DNA

Anal"za bun)'ného cyklu

M-fázeG1-fáze

3T3 fibroblasty, PI + phalloidin-FITC

Detekce apoptotick%ch a mitotick%ch bun'k pomocízm'n hodnoty maximálního pixelu

(hyperchromicita chromatinu)R

ed

In

teg

ral

Red Max PixelRed Max Pixel

40

020 0 20

40

A B

G2

M

G1

S

Ctr CPT, 3h

0 50 150

10

20

30

40

0 50 150

10

20

30

40

A B

DNA Content DNA Content

DN

A S

tran

d B

reaks

DN

A S

tran

d B

reaks

Apoptotické bu*ky

Fale(n' pozitivníapoptotické bu*ky

Detekce apoptózy a identifikace “fale(n' pozitivních”apoptotick%ch bun'k

Pro ka"dou zvolenou populaci je mo"nézobrazit galerii událostí, které do ní pat!ía to umo"*uje p!ímou vizuální kontrolu

nastavení

Translokace NF-!B z cytoplasmy do jádra

Kontrola TNF 6h

Primární ('ervená) + periferní kontura (modrá) pro anal"zu jadernétranslokace NF-!B

Cytoplasmatická

exprese

Jaderná exprese

Translokace NF-!B z cytoplasmy do jádra

Anal"za tká$ov"ch %ez(

+ez z my(ích jater zna&en% DAPI a FITC-ApoBrdU technikou

Kvantifika'ní anal"za tká$ov"ch %ez(

ZNA#ENÍ

ANAL+ZALIKVIDACE

FLUOROCHROMU

„RECYKLACE“ vzorku

Ale kdo má tohleanalyzovat????????

• Bu$ky jsou analyzovány ve fyziologickém prost%edí

• Je mo!né provád)t anal"zu bun)k p%ímo v tkáni tzn. v p%irozen"chinterakcích s prost%edím, co! podstatn) ovliv$uje celou %adufyziologick"ch parametr(

• Je mo!né provád)t sekven'ní anal"zu v rámci dlouhodobé inkubacebun)k

• Pro ka!dé nastavení analytick"ch parametr( je okam!itá vizuálníkontrola

V"hody zobrazovací cytometrieoproti pr(tokové cytometrii

• Zobrazovací cytometrie spojuje simultánní multiparametrovou kvantitativnícytometrii a anal"zu obrazu u vzork( na pevn"ch substrátech (adherentní bu$ky,st)ry, tká$ové %ezy).

• ,iroké spektrum pokro'il"ch aplikací fluorescen'ní mikroskopie se zam)%ením nakvantitativní anal"zu a lokaliza'ní studie. Nap%: anal"za bun)'ného cyklu,detekce jednotliv"ch fází apoptózy, morfometrie jadérka, transloka'ní studie,anal"za !iv"ch bun)k, immunofenotypizace, FRET, FRAP a kvantitativní anal"zatká$ov"ch %ez(.

• Anal"zu je mo!né provád)t ve v&ech b)!n"ch laboratorních kultiva'níchnádobách (nejen na skle) jako jsou mikrotitra'ní desti'ky, petriho misky, lahvepro tká$ové kultury atd…Bu$ky jsou tedy analyzovány ve fyziologickémprost%edí.

SHRNUTÍ

D)kuji za pozornost....