102

London, UK, Taylor & Francis, 2002, 1-30.Holterman M., van der Wurff A., van den Elsen S, 28. et al. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep

phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Molecular Biology and Evolution. 2006, 23, 1792-1800.

Jairajpuri M.S., Ahmad W. 29. Dorylaimida. Free-living, predaceous and plant-parasitic nematodes. E.J.Brill, Leiden, 1992, 458 pp.

Mullin P.G., Harris T.S., Power T.O. Phylogenetic relationship of Nygolaimina and Dorylaimina (Nematoda: 30. Dorylaimida) inferred from small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology, 2005, 7, 59-79.

Poiras L. 31. Nematodes from the deciduous forests in Moldova. Bull. Stiint. Revista de Etnografie, Stiinte ale Naturii si Muzeologie. 2006, .V4 (17), Stiinte ale Naturii, Chisinau: 87-97.

Yeats G.W. Observation on phylogeny and evolution in the Dorylaimina (Nematoda). New Zealand J. Sci., 32.

1967, V.10, p. 683-700.ArticolulesteprezentatdeacademicianulI.Todera

MICROBIOLOGIA I BIOTEHNOLOGIA

SPECTRUL AMINOACIZILOR I COMPONENA CALITATIV A PROTEINELOR LA SPIRULINA CULTIVAT N PREZENA UNOR

COMPUI COORDINATIVI AI Cr(III)

Rudic V., Bulimaga Valentina*, Ciumac Daniela, Zosim Liliana*, Chiriac Tatiana

InstitutuldeMicrobiologieiBiotehnologiealAM,*CentruldeCercetritiinificetiinealeVieii,USM

Introducere

Dei este parte component a irului de microelemente eseniale, cromul nu este absolut necesar pentru a asigura homeostaza cianobacteriilor, excesul lui, ndeosebi a Cr(VI) producnd efecte toxice asupra creterii i dezvoltrii acestor microorganisme fotosintetizatoare [6,19].

n prezent, cercetrile la capitolul Cromul i cianobacteriile se desfoar n dou direcii. Prima direcie este consacrat studiului posibilitii utilizrii cianobacteriilor (ex. Oscillatoria sp., Nostoc sp., Synechococcus sp., Spirulina sp., etc.) n calitate de sorbeni naturali ce neutralizeaz i micoreaz titrul ionilor toxici de Cr(VI) n ape i soluri [1, 3, 11, 14]. Cea de a doua direcie este dezvoltat n baza capacitii cianobacteriilor (n special celor din genul Spirulina) de a acumula acest bioelement n procesul de cultivare i bioconverti prin incorporarea lui n diverse fracii de principii bioactive ale biomasei, valorificat n calitate de surs non convenional de nutraceutice i remedii medicamentoase cromcomponente [2, 4, 16, 22].

n aspect fundamental, aceste studii vizeaz elucidarea mecanismelor implicate n biosorbia sau bioacumularea cromului. Parte component i principii de realizare a acestor procese sunt liganzii biologici, printre care aminoacizii, peptidele i proteinele cu rol de ageni intracelulari de chelatare i de coordinare a ionilor de Cr 3+ [11,14].

103

Cianobacteria Spirulina (diverse specii ale ei) reperzint, cu certitudine, obiectul model i de tangen n studiile nominalizate, fiind promotorul unor substane bioactive valoroase, dintre care ponderea cea mai mare revine componentelor proteice.

Prezint interes cercetrile consacrate evalurii i stabilirii unor schimbri calitative i cantitative ale proteinelor n biomasa de spirulin, obinut la cultivare n prezena unor concentraii nalte ale cromului. Acestea sunt importante n aspect informativ, n vederea furnizrii de noi date asupra sintezei unor componente proteice noi, precum i asupra compoziiei lor aminoacide.

Astfel, scopul prezentului studiu a constituit evaluarea modificrilor survenite n spectrul aminoacizilor i n componena calitativ a proteinei sumare la tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02 cultivat n prezena unor compui coordintaivi ai Cr(III).

Materiale i metode

Obiectul cercetrilor expuse a fost tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02 (CYANOPhYTA), depozitat n Colecia Naional de Microorganisme nepatogene de pe lng Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al Academiei de tiine a Moldovei.

Biomasa de spirulin a fost obinut conform unor procedee care au inclus inocularea cianobacteriei pe mediul nutritiv cu urmtoarea compoziie: macroelemente (g/l) NaNO

3-

2,25; NaHCO3-8,0; NaCl-1,0; K

2SO

4-0,3; Na

2HPO

4-0,2; MgSO

47H

2O-0,2; CaCl

2-

0,024; microelemente (mg/l (mediu): H3BO

3-2,86; MnCl

24H

2O-1,81; CuSO

45H

2O

-0,08; MoO3 0,015, cultivarea ei n retorte Erlenmeyer a cte 250 ml cu 100 ml

suspensie timp de 6 zile, suplimentarea la a 3-a zi a unuia din compuii coordinativi ai Cr(III) - K

2[Cr(NTA)(C

2O

4)(H

2O)]2H

2O, n care NTA acidul nitrilotriacetic (varianta

experimental I) i [K2Cr

2(SO

4)

4]12H

2O (varianta experimental II) n concentraie de

30 mg/l. Pe durata cultivrii a fost respectat temperatura de 300 - 320 C i iluminarea n limitele a 2 - 3mii lx .

Pentru a extrage din biomasa de spirulin proteinele sumare a fost utilizat soluia-tampon: Tris-HCl 0,628 mM, pH=8,0 (1g prob : 5 ml), acid ascorbic 0,03%, EDTA 1 mM. Dup expunerea timp de 30 min., amestecul a fost centrifugat la 6000 rot/min. timp de15 min. Supernatantul a fost colectat, iar sedimentul a mai fost splat de 2 ori cu extragent proteic. Precipitarea proteinelor a fost realizat cu acetat de amoniu pn la concentraia final de 90%, apoi splat cu acid tricloracetic de 5%. Sedimentul obinut a fost splat cu etanol, aceton, eter, iar apoi uscat i utilizat pentru prepararea probelor [15].

Compoziia aminoacid a fraciei de proteine sumare a fost determinat la analizatorul AAA-339 al Firmei Microtechna (Cehia) i a fost precedat de hidroliza acid a fraciei studiate.

Determinarea calitativ a proteinelor prin SDS-PAGE a fost realizat in sistemul de tampoane Laemmli, n plci verticale de poliacrilamid cu grosimea de 1 mm, n condiii denaturante cu SDS. Operaiile post-electroforetice au fost efectuate conform metodei standard [15]. Masele moleculare relative ale fraciilor polipeptidice separate au fost determinate n funcie de indicii mobilitii electroforetice, folosind curba de etalonare a proteinelor standard.

104

Rezultate i discuii

Dat fiind faptul c proteinele sunt componentele de baz structurale i funcionale ale celulei, tot mai des se recurge la metoda fracionrii n diverse tipuri de geluri prin metoda electroforetic, pentru a stabili componena lor calitativ. n baza relaiei dintre sarcin i masa molecular pot fi izolate i caracterizate complexele proteice native, spectrele electroforetice ale acestora reflectnd ntr-o anumit msur specificul i modul de organizare a proteinelor n celul.

Procesele biosintetice din celulele n cretere i dezvoltare se finalizeaz cu formarea noilor aminoacizi i includerea lor n structurile proteice i alte substane organice. Existena mecanismelor care controleaz formarea substanelor de natur proteic, precum i a altor metabolii indic c celulele n stare normal nu acumuleaz substanele organice n exces, ci le sintetizeaz doar ntr-o cantitate strict necesar pentru cretere.

Mecanismele de reglare a sintezei proteinelor sunt determinate i de adaptabilitatea nalt a cianobacteriilor la modificrile componenei chimice a mediilor de cultivare, n special, de capacitatea acestor microorganisme de a-i schimba cile metabolice n dependen de compoziia mediului i de preferinele n utilizarea metaboliilor finali pentru economia resurselor energetice celulare.

Tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02 a demonstrat capacitatea de a acumula cantiti intracelulare nalte a cromului, la cultivarea ei n prezena compuilor K

2[Cr(NTA)(C

2O

4)(H

2O)]2H

2O (circa 500mg% crom) i [K

2Cr

2(SO

4)

4]12H

2O (circa

320mg% crom), distribuite preponderent n fracia de proteine sumare (circa 88% i respectiv, circa 74% din coninutul total de crom).

Analiza spectrului aminoacizilor din proteina sumar a biomasei de spirulin, n variantele experimentale cu utilizarea compuilor coordinativi ai Cr(III) nominalizai denot prezena (ca i n martor) a tuturor aminoacizilor eseniali i non eseniali (tabelul 1).

Au fost semnalate, ns, diferene semnificative n coninutul unor aminoacizi non eseniali fa de varianta martor. Astfel, n variantele cu utilizarea K

2[Cr(NTA)

(C2O

4)(H

2O)]2H

2O i [K

2Cr

2(SO

4)

4]12H

2O, cu un coninut mai nalt de 3,25 i 3,26

ori s-a soldat sinteza glicinei i de 2,73 i 3,39 ori a acidului glutamic. n comparaie cu varianta martor, s-a majorat considerabil i coninutul cisteinei/acidului cisteinic, care n cazul primului compus a sporit de 2,92/4,44 ori iar n cazul celui de al doilea de 3,05/2,53 ori.

Variaii semnificative denot i coninutul aminoacizilor eseniali: lizina, metionina, fenilalanina i valina. Schimbrile cantitative majore s-au produs, ns, pentru treonin i lizin, coninutul crora s-a majorat de circa 2,94-2,99 ori n varianta experimental cu administrarea K

2[Cr(NTA) (C

2O

4)(H

2O)]2H

2O.

Astfel, modificrile survenite n spectrul aminoacizilor proteinei sumare izolate din biomasa de spirulin produs la cultivare n prezena unor compui coordinativi ai Cr(III) sunt probabil, rezultatul cilor i interrelaiilor metabolice destul de complexe ale acestor principii bioactive - parte a structurii catenelor polipeptidice, importante pentru procesul de stocare a ionilor de metal. Creterea ponderii unor aminoacizi, n special a glicinei, acidului glutamic i cisteinei/acidul cisteinic care fac parte din structura unor peptide nonribozomale i dotate cu rol de ageni de chelatare a ionilor metalelor,

105

n unele cazuri, chiar foarte apreciabil, poate fi explicat i prin rspunsul metabolic intracelular al spirulinei fa de doza mai mare (30mg/l) fa de cea fiziologic optim pentru creterea i dezvoltarea ei a compuilor chimici ai Cr(III). Pe de alt parte nu ar fi trebuit exlus nici rolul ligandului care prin disociere, poate servi donor de grupri funcionale pentru biosinteza i acumularea celor mai variate structuri metabolice, inclusiv cele ce conin aminoacizi.

Studiul comparativ al spectrului polipeptidic al proteinei sumare din biomasa de spirulin, cultivat n prezena compuilor coordinativi ai Cr(III) i supuse SDS-electroforezei n gel de poliacrilamid de 15% a permis evidenierea unor noi benzi cu masele moleculare aparente de 60,4 kDa i de 66,7 kDa (Fig.1).

Tabelul 1. Spectrul aminoacizilor (mg/100mg) proteinei sumare din biomasa de spirulin cultivat n prezena unor compui coordinativi ai Cr(III)

Aminoacidul Martor*

K2[Cr(NTA)(C

2O

4)

(H2O)]2H

2O

(varianta experimentala I)

[K2Cr

2(SO

4)

4]12H

2O

(varianta experimental II)

Non eseniali

Acidul cisteinic 0,1045 0,2616 0,4644

Acidul aspartic 4,108 5,7492 4,4161

Serina 2,7197 7,7578 6,4346Acidul glutamic 7,5095 25,4852 20,4791

Prolina 1,713 2,0569 2,4547Glicina 2,5887 8,4304 8,4081Alanina 4,0214 4,0113 5,4515

Cisteina 0,6606 2,0162 1,9279Tirozina 1,4579 1,1798 3,624

Histidina 0,7822 0,7176 1,5861

Arginina 3,026 2,51 3,974

aminoacizilor non eseniali 28,6915 60,176 59,2205

eseniali

Izoleucina 3,0763 3,4056 4,0547

Leucina 5,2098 5,5239 5,6438Lizina 1,7674 5,2807 2,7758

Metionina 0,9100 1,9452 1,7998Fenilalanina 2,5277 4,4094 2,86Treonina 2,4215 7,1299 4,9803Valina 4,4259 2,5949 6,2938Triptofanul 0,1 0,18 0,14

aminoacizilor eseniali 19,6196 30,4696 28,5482

aminoacizilor imunoactivi 28,5553 63,3549 58,5314

106

Sinteza peptidelor cu mas molecular de 66,2 kDa a fost observat i n cazul cultivrii cianobacteriei Spirulina platensis n prezena concentraiilor nalte de ioni de Na+ [21]. Proteinele cu mase moleculare similare fac parte din familia aperonilor, care au rolul de reparare a proteinelor cu o conformaie spaial eronat [9].

Masa molecular aparent de 60,7 kDa este caracteristic fitochelatin sintazei (EC 2.3.2.15), enzim responsabil de sinteza din glutation a fitochelatinelor (PC). Fitochelatinele sunt o clas de peptide sintetizate posttranslaional i joac un rol important n reglarea concentraiilor intracelulare a metalelor eseniale la eucariote, incluznd plantele superioare, fungii i microalgele [8].

Fig 1. Electroforegrama proteinelor sumare din biomasa de spirulin.

M marker; 1 proteinele totale extrase din spirulin cultivat pe mediu fr suplinirea compuilor coordinativi ai Cr(III); 2 - proteinele totale extrase din biomasa de spirulin cultivat n prezena a 30mg/l de [K

2Cr

2(SO

4)

4]12H

2O; 3 - proteinele totale

extrase din spirulin cultivat pe mediul nutritiv suplinit cu 30mg/l de K

2[Cr(NTA)

(C2O

4)(H

2O)]2H

2O.

Pn n prezent la procariote i n special, la cianobacterii nu au fost identificate nici PC, nici gene care ar codifica PC sintaza. Totui, n urma secvenrii genomului cianobacteriei Nostoc sp. PCC7120, a fost stabilit prezena genei care codeaz o protein similar PC sintazei alr0975. Proteina conine un domeniu N-terminal conservat, dar nu i domeniul C-terminal variabil, specific eucariotelor. n rezultatul recombinrii cu alte proteine, a fost demonstrat c proteina alr0975 este o form primar a PC sintazelor descrise la organismele eucariote [20].

De asemenea, au fost depistate benzi similare dup masa molecular aparent caracteristice polipeptidelor cu masele moleculare de 24,5 kDa, 22,2 kDa, 20,0 kDa i 19,1 kDa, care corespund i -subunitilor ficocianinei i aloficocianinei [18].

Benzile cu masele moleculare aparente de 11,6 kDa corespund citocromului c550 din fotosistema II, iar cele de 11,03 kDa posibil c fac parte din familia feridoxin-reductazelor care particip la procesul de transfer al electronilor [10,12].

n ce privete polipeptidele cu mobilitate joas, SDS-electroforeza a scos n eviden o band cu masa molecular de 110 kDa, care este caracteristic proteinelor membranare (SecA i SecY) izolate din biomasa cianobacteriei Synechococcus PCC7942. Proteinele

107

de tip Sec sunt implicate la translocarea altor proteine prin membrana tilacoidal [7, 13]. Totodat, masa molecular apropiat de 110 kDa, este caracteristic i sistemului Clp care particip la hidroliza proteinelor i peptidelor n form agregat sau neagregat. La cianobacteria Plectonema boryanum a fost depstat ClpB - o protein indus de stres, care controleaz agregarea sau denaturarea componenilor celulari, acionnd ca un reglator proteolitic [5].

Aa dar, n baza analizei rezultatelor obinute se poate concluziona c, la cultivarea tulpinei cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02 n prezena unor compui coordinativi ai Cr (III) se produc schimbri cantitative n spectrul aminoacizilor i n componena proteinelor sumare: se majoreaz coninutul de cistein/acid cisteinic, glicin, acid glutamic, aminoacizi care fac parte din structura unor peptide nonribozomale i dotate cu rol de ageni de chelatare a ionilor metalelor, precum i se sintetizeaz noi polipeptide cu masa molecular de 60,4 kDa, apropiat proteinelor din familia aperonilor, cu rol de reparare a proteinelor cu o conformaie spaial eronat, i 66,7 kDa, caracteristic fitochelatin sintazei (EC 2.3.2.15), enzim responsabil de sinteza din glutation a fitochelatinelor (PC).

Bibliografie

Azeez P., Banerjeek D. Effect of chromium on cyanobacteria and it accumulation. 1. Toxicol Environ Chem, 1998, vol. 16, p. 229-240.

Belokobylsky A., Gintury E., Kuchava N., Kikesali E., Mosulasvili L., Frontasieva M., Pavlov 2. S., Aksenova N. Accumulation of selenium and chromium in the growth dynamics of Spirulina platensis. J Radianal Nucl Chem, 2004, vol. 259, p. 65-68.

Brierley C. Bioremediation of metal-contaminated surface and ground-waters. 3. Geomicrobiology , 1999, vol. 18, p.201223.

Bulimaga V., Rudic V., Gulea A., Gudumac V., Dencicov L., Cordeleanu C., Ciornea V., Chihai 4. E., Crjev M. Perspectiva utilizrii unor compui coordinativi ai Cr(III) n biotehnologie. Analele tiinifice ale Universitii de Stat din Moldova, Seria tiine chimico-biologice, 2003, p. 156-159;

Celerin M., Gilpin A., Schisler N., Ivanov A., Miskievicz E., Krol M., Laudenbach D. ClpB in a 5. cyanobacterium: predicted structure, phylogenetic relationships, and regulation by light and temperature. J Bacteriology, 1998, vol. 180, no. 19, p. 51735182.

Chen H., Pan G., Yan, H., Qin Y. Toxic effects of hexavalent chromium on the growth of blue-6. green microalgae. huan Jing Ke Xue, 2003, vol. 24, no. 2, p. 13-18.

7. Gupta R., Pereira M., Chandrasekera C., Johary V. Molecular signatures in protein sequences that are characteristic of cyanobacteria and plastid homologues International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2003, no. 53, p. 18331842

Hirata K., Tsuji N., Miymyamoto K. Biosynthetic Regulation of Phytochelatins, Heavy Metal-8. Binding Peptides. Journal of Bioscience and Bioengineering 2005; 100(6):593-99.

Horwich A., Fenton W., Charman E., Farr G. Two families of chaperonin: physiology and 9. mechanism. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 2007, no. 23, p. 115-145;)

Hurley J., Morales R., Martinez M., Brodie T., Medina M., Gomez-Moreno C., Tolin G. 10. Structurefunction relationships in Anabaena ferredoxin: NADP+ reductase electron transfer: insights from site-directed mutagenesis, transient absorption spectroscopy and X-ray crystallography. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, vol. 1554, p. 5 21.

Li Z.Y., Guo S.Y., Li L. Study of the process thermodinamical isotherm and mechanism of Cr(III) 11. uptake by Spirulina platensis. J Food Eng, 2006, vol. 75, p.129-136.

Minami Y., Wada, K, Matsubara H. The isolation and characterization of a cytochrome b6f 12. complex from the cyanobacterium Spirulina sp. Plant and Cell Physiology, 1989, vol. 30, no. 1, p. 91-98.

Nakai 13. M., Nohara T., Sugita D., Endo T. Identification and characterization of the sec-A protein homologue in the cyanobacterium Synechococcus PCC7942. Biochem Biophys Res Commun, 1994, no. 200(2), p. 844-851.

108

Pandi, M., Shashirekha, V., Swamy, M. Bioadsorption of chromium from retan chrome liquor by 14. cianobacteria. Microbiol Res, 2007; www. elsevier.de/micres. 9p.

Reva, V., Ciobanu, V., Mueller-Uri, F. Strategia i tactica izolrii i purificrii proteinelor. 15. Chiinu, 2001, 186 p.

Rudic V. , Cojocari A., Cepoi L., Chiriac T., Rudi L., Gudumac V., Macari V., Codreanu Sv., 16. Bulimaga V, Dudnicenco T., Dencicov L, Ghelbet V., Crudu D., Miscu V., David Sv. Ficobiotehnologie - cercetri fundamentale i realizri practice. Chiinu: Elena VI SRL, 2007. 365 p.

Shashirekha V., Pandi M., Mahadeswara S. Bioremediation of tannery effluents and chromium 17. containing wastes usin cianobacterial species. JALCA 2005, vol.100, no.11, p. 419-426.

Soundarapandia18. n P., Vasanthi B. Effects of chemical parameters on Spirulina platensis biomass production: optimized method for phycocyanine extraction. International Journal of Zoological Research, 2008, vol. 4, no.1, p. 1-11.

Thompson S., Manning F., Mc-Coll S. Comparisation of the toxicity of chromium III and 19. chromium VI to cyanobacteria. Bull Environ Contam. Toxicol, 2002, vol. 69, p. 286-293.

Tsuji 20. N., Nishikori S., Iwabe, O., Shiraki K., Miyasaka, H., Takagi M., Hirata K., Miyamoto K. Characterization of phytochelatin synthase-like protein encoded by alr0975 from a prokaryote, Nostoc sp. PCC 7120. Biochem Biophys Res Commun, 2004, no. 315, p. 751-755.

Verma K. Mohanti P. Alterations in the structure of phycobilisomes of the cyanobacterium, 21. Spirulina platensis in response to enhanced Na+ level. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2000, vol. 16, no. 8-9, p. 795-798.

., . 22. Spirulina platensis. , 2004, no. 2, . 28-31.

EFECTELE UNDELOR MILIMETRICE DE INTENSITATE JOAS ASUPRA POPULAIEI DROJDIEI SACCHAROMYCES

CARLSBERGENSISCNMN-Y-15

Usati Agafia, Molodoi Elena., Rotaru Anatol, Topala Lilia, Moldoveanu Taisia

InstitutuldeMicrobiologieiBiotehnologiealAM

Anterior au fost selectate tulpini de drojdii valoroase pentru producerea preparatelor cu activitate D-vitaminic, utilizate n hrana animalelor, psrilor, n medicin, cosmetologie. Pentru a elabora tehnologii eficiente de obinere a preparatelor vitaminice este necesar de a mbunti calitile biosintetice ale productorului. Exist un ir de procedee de intensificare a proceselor de sintez a principiilor bioactive la microorganisme. Interes deosebit, important att din punct de vedere teoretic ct i practic, prezint interaciunea obiectelor biologice cu cmpul electromagnetic milimetric exterior.

Pe parcursul ultimilor ani cercetrile impactului cmpului electromagnetic asupra obiectelor biologice s-au amplificat n Germania, Italia Frana, Rusia, Ucraina [7-8]. Ca rezultat a fost creat o direcie nou biologia electromilimetric. Cercettorii au analizat factorii ce influeneaz interaciunea obiectelor biologice cu cmpul electromagnetic milimetric, au elucidat unele legiti n procesul interaciunii undelor electromagnetice cu obiectele biologice [2, 8].

Actualmente, cercetrile experimentale au dovedit c undele electomagnetice coerente pot aciona practic asupra majoritii tipurilor de celule: nervoase, musculare,