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高橋 浩
(群馬大学・工学部・共通講座)
SPring-8 ワークショップ ヘルスケア(SPring-8推進協議会 第2回ヘルスケア研究会)
両親媒性脂質分子集合体のX線構造解析
2006年 11月 9日(木)
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1.脂質とは
糖質や蛋白質とともに生体を構成している有機物質群(『生物学辞典』)
1. 有機溶媒(クロロホルム、ベンゼン等)に溶ける
2. 高級脂肪酸等を含む分子
3. 生物体に利用されているもの
両親媒性脂質 上記の条件+親水基を持つ
親水的
疎水的
4
界面活性剤
親水性部分と疎水性部分をあわせ持つ
濃度が高いとき自己集合体を形成する
この領域に注目する
『界面活性の化学と応用』妹尾・辻著 大日本図書掲載図を改変
(I) (II)
(III)クラフト点
温度
濃度
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両親媒性脂質=界面活性剤
脂質・水系の仮想的な相図
Nibu & Inoue (1998) J Colloid Interface Sci 205, 305-315.
界面活性剤(C10E6)・水系
の相図
Seddon (1990) Biochim. Biophys. Acta 1031, 1–69.
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2. X線回折 : 周期構造の情報
基本式 2dsinθ = nλd:周期、θ:Bragg角、
n:整数、λ :波長
長い周期 → θ:小さい(小角)短い周期 → θ:大きい(広角)
小角(ラメラ)
Sample
広角(chain packing)
dla
5~20 nm
X-ray
~0.4 nmdch
7
Cubic
Hexagonal II
Diffraction Angle
Lamellar
L:7:2:3:1
L
L
8:6:4:2
8:7:2:3
L:5:4:3:2:1
脂質分子の様々な
自己集合構造とX線回折パターン
2次元
3次元
1次元
3.相構造の決定
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温度変化による脂質・水系の相構造変化を小角X線回折で調べた例
Pn3m
Im3m
Lβ
Lα
Takahashi et al., (2002) Phys.Chem. Chem.Phys. 4, 2365–2370
?
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(小角)X線回折パターンから相構造決定の際の注意事項
ピークの存在位置(スペーシングの比)→ 弱いピークを見落とさない→ ピークの重なりの分離を見極める
最小角側の第1ピークを確実に測定する→ 十分な小角分解能を確保する
スペーシングの比だけでなく、強度にも注意する
相図上での位置 : 他のデータとの比較
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4.ラメラ相の構造解析4.1 ラメラ相の種類
ラメラ液晶相 (Lα)炭化水素鎖が融解:流動状態
ラメラゲル相 (Lβ 、Lβ’ )炭化水素鎖はトランスジグザグ構造回転の自由度有 (回転相と呼ぶ分野も)
ラメラ結晶相(コアゲル相) (Lc 、Lc’ )炭化水素鎖はトランスジグザグ構造回転の自由度は停止親水性頭部の自由度も停止??
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各ラメラ相からのX線回折像の例
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Inte
nsity
(arb
. uni
ts)
S (nm-1)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Inte
nsity
(arb
. uni
ts)
S (nm-1)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Inte
nsity
(arb
. uni
ts)
S (nm-1)
ラメラの高次反射
ラメラの高次反射
ラメラの高次反射
炭化水素鎖
炭化水素鎖
炭化水素鎖
ラメラ液晶相 (Lα)
炭化水素鎖融解のため広角領域にブロードなハロー
ラメラゲル相 (Lβ)
広角領域に、数本のやや幅広な回折ピーク、六方格子ならピークは1本
ラメラ結晶相(コアゲル相) (Lc 、Lc’ )
広角領域に、比較的多数の回折ピーク、隣合うラメラ間にも相関があれば、鋭い回折ピークとなる
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ラメラ相:水層の厚さの見積もり
第0近似 脂質、水とも比容:1.0 cm3/gと仮定dl=cd dw=(1-c)d c:重量濃度d:ラメラ周期、dl:ラメラ周期 dw:水層の厚さ
第1近似 (Luzzati法)脂質、水の比容(vl,vw)を考慮
lipidd
dw
dl
water
1
l
wla
11−
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ −⋅+=
cc
vvdd
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Luzatti法の適応例と問題点
水含量が少ない時、脂質の比容測定は極めて困難
水層と脂質層は明確に分けることが出来るか?
過剰水が存在し始める条件を明確決定できるか?
ラメラ周期
脂質膜の厚さ
脂質1分子当たりの断面積
Janiak et al., (1979) J. Biol.Chem. 254,6068-6078
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両親媒性脂質を水に → ベシクル形成
Polar head
Non-polar Chain
マルチ・ラメラ・ベシクル
炭化水素鎖:側面を水に接したくない→ 閉じた袋状の構造膜の曲げ弾性中心部分に水のプール
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X線回折:電子密度のフーリエ変換
リン脂質二重層膜
水 水
電子密度
構造因子
フーリエ変換
観察強度
観察強度
(構造因子)2 X ラウエ関数
=観察強度
強度:振幅の2乗
マルチラメラベシクル↓
ラメラ周期の関数(ラウエ関数)
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Inte
nsity
S
位相決定の方法
膜間距離を変化
→膜の内部構造
大きくは変化しない
(仮定)
対称構造→ 符号の決定のみ
サンプリング定理の応用で位相決定
D.Sayre (1952) Acta Crystallogr. B 5, 843
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膜間距離(水層)を変化させる方法
水含量を変える
配向膜系:水蒸気圧の変化浸透圧法
水溶性中性高分子の添加 (McIntosh & Simon, (1986) Biochemistry 25, 2058-4066)
氷の化学ポテンシャルの利用(膜間水はラメラ内では凍結しないことを利用)(Takahashi & Quinn, (2001) Mol.Cryst. Liq.Cryst. 1418, 335-348)
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実際のデータアミノリン脂質DDPCに適用した例
Takahashi et al., (2005) Biochim. Biophys. Acta, 1713,40-50
高分子
氷
氷を利用する方法利点:1試料でOK弱点:低温相にしか適用
できない
高分子を利用する方法利点:すべての相、温度
に対応弱点:多くの試料を用意
する必要がある
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水層の厚さ:本当は明確に定義できない!
リゾビスホスファチジン酸(LBPA)膜のコンピューター・シュミレーション
水分子は膜内部に進入している!
Hayakawa et al., (2006) Biochemistry 45, 9198-9209
LBPA 256Na+ 256Water ~6000278K (5oC)
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膜表面近傍の水の密度は1.0g/cm-3か?
リン脂質・糖脂質混合(DPPC/GM1)ベシクルユニラメラベシクル・散乱法で解析
構造のモデル図最適モデルの電子密度(コントラストで表現:通常の水のレベルを1.0)
コントラストの高い水の層
Hirai et al., (2003) Biophys. J., 85, 1600-1610
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位相決定:MDシュミレーションとの比較で決定
LBPAのX線回折パターン
X線回折からの電子密度分布
MDシュミレーションからの電子密度分布
Hayakawa et al., (2006) Biochemistry 45, 9198-9209
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( )( )( )
2
222
222*(mod)
2sin
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡++
++=
lkhaLlkhFMI
hkl
hklS
hklhklhkl παπα
5.他の相構造の解析両相連続キュービック相の場合
Garstecki-Holyst Model (Langmuir, 2002,Vol.18,pp.2519-2528)
仮定1. Q相: 周期的極小曲面 膜厚 どこでも一定
2. 膜内の電子密度:一定3. 計算上:周期的極小曲面 ≒ Nodal Surface反射の回折強度膜の厚さをパラメーターにした関数式
回折強度の理論値と実験値との比較から膜厚を求める