Syphilis Total Ab 1 плака – 96 72530 5 плаки – 480 72531 КИТОВЕ ЗА КАЧЕСТВЕНО ОТКРИВАНЕ НА АНТИТЕЛА КЪМ TREPONEMA PALLIDUM В ЧОВЕШКИ СЕРУМ ИЛИ ПЛАЗМА, КАТО СЕ ИЗПОЛЗВА ТЕХНИКА ЗА ЕНЗИМЕН ИМУНОАНАЛИЗ

883679 - 2014/11

[BG] 1

СЪДЪРЖАНИЕ

1. ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ ................................................................................ 2 2. КРАТКО ОПИСАНИЕ И ОБЯСНЕНИЕ НА ТЕСТА .................................... 2 3. ПРИНЦИПИ НА ПРОЦЕДУРАТА .............................................................. 2 4. РЕАКТИВИ .............................................................................................. 3 5. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ .......................................... 4 6. ПРОБИ .................................................................................................... 6 7. ПРОЦЕДУРА ........................................................................................... 6 8. ОГРАНИЧЕНИЯ НА ТЕСТА ..................................................................... 9 9. РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ .............................................................. 1 0 10. БИБЛИОГРАФИЧНИ ПРЕПРАТКИ. ........................................................ 1 3

[BG] 2

1. ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ Тези китове са предназначени за използване от преминал подходящо обучение и квалифициран персонал за качествено определяне на антитела срещу Treponema pallidum в човешкия серум и плазма. Продуктът може да бъде използван за скрининг на дарителите на кръв, както и да помогне при диагностицирането на пациенти, при които има съмнение за заразяване със сифилис.

2. КРАТКО ОПИСАНИЕ И ОБЯСНЕНИЕ НА ТЕСТА Сифилисът е хроничнa инфекция, която минава през обособени стадии на инфекцията: първичен, вторичен, третичен и четвъртичен. През тези стадии се изявяват разнообразни клинични симптоми, обикновено се появяват първоначални разязвявания, известни като твърд шанкър, след което сифилистичен обрив, последван от дълги периоди на латентност. Нелекуваната инфекция в крайна сметка може да доведе до сърдечно-съдови проблеми и невросифилис. Инфекцията се причинява от спирохетата Treponema pallidum и обикновено е придобита чрез сексуален контакт, въпреки че болестта може да бъде предадена чрез преливане на заразена кръв. Също така може да настъпи вътрематочна инфекция. На практикa се оказва почти невъзможно този организъм да се култивира в изкуствена среда и диагностиката на инфекцията обикновено зависи от доказването на антитела в кръвта, които се появяват скоро след първоначалната инфекция и могат да персистират в продължение на много години. Изследванията за сифилис попадат в четири категории: директно микроскопско изследване, тестове за антитела срещу трепонема, тестове за антитела, които не са срещу трепонема и директни антигенни тестове. Поради дългите периоди на латентност и неспецифичния характер на не-трепонемалните тестове, методите, които откриват специфични анти-трепонемални антитела в кръвни проби придобиват нарастваща популярност за скрининг. Syphilis Total Ab е един такъв тест.

3. ПРИНЦИПИ НА ПРОЦЕДУРАТА Syphilis Total Ab използва три рекомбинантни антигени при анализ тип сандвич. Антигените ще открият специфични за T. pallidum IgG, IgM и IgA; което дава възможност на това изследване да открива антитела по време на всички стадии на инфекцията. Вдлъбнатините се покриват със смес от 15Kd, 17Kd и 47Kd рекомбинантни антигени на T. pallidum. Специфичните антитела в серум или плазма се комбинират с тези антигени и със същите антигени, конюгирани с пероксидаза от хрян, когато конюгата се добавя към вдлъбнатината, в която е била инкубирана пробата. След като нереагиралият материал е бил отстранен чрез промиване, наличието на свързан ензим, което показва наличие в пробата на специфични антитела, се разкрива чрез промяна в цвета на субстрата/хромогената смес. Интензитетът на цвета се сравнява с този на контролните вдлъбнатини, за да се определи наличието или отсъствието на специфични антитела.

[BG] 3

4. РЕАКТИВИ

4.1. Описание

Означение на етикета

Описание Представяне/ подготовка

72530

Представяне/ подготовка

72531

R1

Microplate

Микроплака 12 тест ленти, всяка с по 8 вдлъбнатини, покрити с Рекомбинантни антигени срещу T. pallidum (rAg) Специфичен идентификационен (ID) номер = 97

1 плака Готов за употреба

5 плаки Готов за употреба

R2 Concentrated

Washing Solution (20X)

Концентриран промиващ разтвор (20X) Трис-буфериран NaCl pH 7.4 Консервант: ProClin™ 300 (0,04 %)

1 флакон 70 ml

Да се разреди

1 флакон 235 ml

Да се разреди

R3 Negative control

Негативна контрола Трис буфер, съдържащ BSA (говежди серумен албумин) Консервант: ProClin™ 300 (0,1 %)

1 флакон 2,1 ml

Готов за употреба

1 флакон 2,1 ml

Готов за употреба

R4 Positive control

Положителна контрола (при хора) Човешки серум, съдържащ антитела срещу T.pallidum отрицателен за HIV1/2, HBs Ag и HCV, разреден в Tрис буфер, съдържащ BSA (говежди серумен албумин) Консервант: ProClin™ 300 (0,1 %)

1 флакон 1,6 ml

Готов за употреба

1 флакон 1,6 ml

Готов за употреба

R6 Conjugate Конюгат T.pallidum rAg/Пероксидаза Консервант: ProClin™ 300 (0,05 %)

1 флакон 8 ml

Готов за употреба

1 флакон 30 ml

Готов за употреба

R8 Substrate buffer

Субстратен буфер Лимонена киселина и разтвор на натриев ацетат, рН 4.0, съдържащ H2O2 (0,015 %) и DMSO (диметилсулфоксид) (4 %)

1 флакон 60 ml Да се

разтвори

1 флакон 60 ml Да се

разтвори

R9 Chromogen: TMB solution

(11X)

Хромоген: ТМВ разтвор (розов) Разтвор, съдържащ 3,3’, 5,5’ тетраметилбензидин (ТМВ)

1 флакон 5 ml

Да се разреди

1 флакон 5 ml

Да се разреди

R10 Stopping solution

Стопиращ разтвор Разтвор на сярна киселина (H2SO4 1N)

1 флакон 28 ml

Готов за употреба

1 флакон 28 ml

Готов за употреба

4.2. Изисквания за съхранение и боравене

Този набор трябва да бъде съхраняван при +2–8 °C. Всеки елемент от набора, консервиран при +2–8 °C, може да бъде използван до датата на срока на годност, посочена върху етикета на опаковката (освен ако не е посочено друго). След отваряне и при липса на замърсяване, реактивите R3, R4, R6, R8, R9 и R10, съхранявани при температура +2–8 °C, могат да бъдат използвани до датата на срока на годност, посочена върху етикета.

[BG] 4

Идентификация Консервиране

R1

След отваряне на вакуумно уплътнения сак, тест ленти с микровдлъбнатини, съхранявани при +2–8 °C в тяхната внимателно уплътнена оригинална опаковка, могат да бъдат използвани в продължение на 1 месец.

R2 Разреденият промиващ разтвор може да бъде съхраняван при +2–30 °C в продължение на 2 седмици. Концентрираният промиващ разтвор (R2) може да бъде съхраняван при +2–30 °C.

R8+R9 След разтваряне реактивите, съхранявани на тъмно, могат да бъдат използвани в продължение на 6 часа при стайна температура (18–30 °C).

5. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ За употреба при in vitro диагностика. За професионално използване в здравеопазването.

5.1. Предпазни мерки за безопасност и опазване на здравето: С този тестов набор трябва да работи само квалифициран персонал, с подходящо обучение върху лабораторните процедури и запознат с техните потенциални рискове. Да се носи подходящо предпазно облекло, ръкавици и защита за очите и лицето, и да се работи при спазване на задължителните Добри лабораторни практики.

Тест комплектът съдържа компоненти от човешка кръв. Изходните материали от човешки произход, които са използвани при получаването на реагентите, са тествани и е установено, че са нереактивоспособни по отношение на повърхностен антиген на хепатит В (HBs Ag), антитела срещу човешки имунодефицитен вирус (HIV-1 и HIV-2) и антитела срещу вируса на хепатит С (HCV). Не е известен метод, който да гарантира пълното отсъствие на заразни вещества. Затова всички човешки кръвни продукти, реактиви и човешки проби, трябва да се считат за потенциални преносители на инфекциозни болести, като се спазват универсалните предпазните мерки за пренасяни по кръвен път патогени, както е определено от местните, регионалните и националните разпоредби.

Биологични разливи: Разлетите материали от човешки произход следва да се считат за потенциално заразни.

Разливи, които не съдържат киселини, трябва да се обеззаразят незабавно, включително площта, където е разлято, материалите и всякакви замърсени повърхности или оборудване, с подходящ химически дезинфектант, който действа ефикасно срещу потенциалните биологични опасности, свързани със съответните проби (обичайно се използва обикновена белина, разредена 1:10, 70–80 % етанол или изопропанол, йодофор [като например 0,5 % Wescodyne™ Plus и др.) и да се подсуши.

Разливи, които съдържат киселини, следва да се попият (избършат) по подходящ начин или да се неутрализират, като облятата площ се изплакне с вода и се подсуши; може да е необходимо материалите, използвани за попиване на разлива, да се подложат на обезвреждане като биологически опасни отпадъци. След това площта следва да се обеззарази с един от химическите дезинфекционни препарати.

ЗАБЕЛЕЖКА: Не поставяйте разтвори, съдържащи белина в автоклава! Всички проби и материали, използвани за теста, следва да се изхвърлят като съдържащи заразни вещества. Лабораторните, химически и биологично опасни отпадъци трябва да се използват и да се изхвърлят в съответствие с всички действащи местни, регионални и национални нормативни разпоредби.

[BG] 5

За съвети относно рисковете и предпазните мерки, свързани с някои от химическите съставки на теста, прегледайте пиктограмата(ите) на етикетите и прочетете информацията в края на настоящата инструкция за употреба.

Информационният лист за безопасност е наличен на www.bio-rad.com.

5.2. Предпазни мерки, свързани с процедурата

5.2.1. Подготовка

Надеждността на резултатите зависи от правилното прилагане на следните добри лабораторни практики: Да не се използват реактиви с изтекъл срок на годност. Да не се смесват и използват съвместно реактиви от различни партиди в рамките на един ход на изследването. Преди употреба да се изчака за 30 минути, за да се стабилизират реактивите при стайна температура (18–30 °C). Наименованието на теста, както и специфичният идентификационен номер на теста са вписани в рамката на всяка микроплака. Този специфичен идентификационен номер е посочен също и върху всяка тест лента. Syphilis Total Ab: Специфичен идентификационен (ID) номер = 97 Проверете специфичния идентификационен номер преди употреба. Ако идентификационният номер липсва или е различен от указания номер, съответстващ на пробата, която ще бъде тествана, тест лентата не трябва да бъде използвана. ЗАБЕЛЕЖКА: За промиващ разтвор (R2, маркировка на етикета: 20X оцветен в зелено), субстратен буфер на пероксидаза (R8, маркировка на етикета: ТМВ буфер, оцветен в синьо), хромоген (R9, маркировка на етикета: ТМВ 11Х, оцветен в пурпурно) и стопиращ разтвор (R10, маркировка на етикета: 1N оцветен в червено), е възможно да се използват различни партиди от тези, съдържащи се в набора, при условие, че една и съща партида се използва в рамките на даден ход на теста. Тези реактиви могат да бъдат използвани с някои други продукти на нашата компания. Свържете се с нашия отдел по техническо обслужване за подробна информация. • Внимателно да се разтворят реактивите, като се избягва каквото и да е замърсяване. • Да се използват стъклени съдове, старателно измити и изплакнати с дейонизирана вода или за предпочитане е да се използват материали за еднократна употреба. • Да не се допуска микроплаката да изсъхне между края на операцията по измиване и накапването на реактива. • Ензимната реакция е много чувствителна към метални йони. Следователно, не се допуска какъвто и да е метален елемент да влиза в контакт с различните конюгати или субстратни разтвори. • Проявяващият разтвор (субстратен буфер + хромоген) трябва да бъде оцветен в розово. Промяната на този розов цвят в рамките на няколко минути след разтваряне показва, че реактивът не може да бъде използван и трябва да бъде подменен. Подготовката на проявяващия разтвор може да бъде направена в чиста пластмасова лабораторна тавичка за еднократна употреба или стъклен съд, който първо е бил измит с 1N HCl и изплакнат добре с дестилирана вода и изсушен. Този реактив трябва да се съхранява на тъмно. • Никога да не се използва един и същ контейнер за накапване на конюгата и проявяващия разтвор.

5.2.2. Обработка

• Да не се променя процедурата на анализа. • Да не се извършва изследването при наличието на изпарения от реактива (киселинни, основни, алдехидни изпарения) или прах, които биха могли да променят ензимната активност на конюгата. • Да се използва нов накрайник за накапване за всяка проба.

[BG] 6

• Доброто измиване е много важна стъпка в тази процедура: да се спазва препоръчителният брой цикли на измиване и да е сигурно, че всички вдлъбнатини са изцяло напълнени и след това изцяло изпразнени. Неправилното измиване може да доведе до неточни резултати. • Внимателно да се следват процедурите за измиване, които са описани, за да се постигне максимално добро изпълнение на изследването. При някои от апаратите за измерване може да се наложи оптимизация на процедурата за измиване (увеличаване на броя на циклите за етап от измиването и/или обема на измиващия буферен разтвор за всеки цикъл), за да се постигне приемливо ниво на фонова оптична плътност OD за негативната проба. • Свържете се с нашата компания за адаптациите и специалните процедури.

6. ПРОБИ Кръвната проба да се взема в съответствие със съвременните практики. Тестовете трябва да бъдат извършени върху неразреден серум или плазма (взети в епруветки с EDTA, натриев цитрат, натриев хепарин или ACD) Проби, съдържащи агрегати, трябва да бъдат избистрени посредством центрофугиране преди тестването. Пробите трябва да се съхраняват при температура +2–8 °C, ако изпитването трябва да бъде извършено в рамките на 7 дни или да се съхраняват при температура от –20 °C за по-дълъг период от време. Не повтаряйте повече от 5 цикъла на замразяване/размразяване. Пробите, които са били подложени на термична обработка при 56 °C в продължение на 1/2 час могат да се използват. Проби, които съдържат до 120 g/l албумин, 200 mg/l билирубин, 33 g/l триолеин или 2 g/l хемоглобин няма да повлияят на резултатите. Въпреки това не е препоръчително да се използват хиперлипемични или хиперхемолизирани серуми или плазма. Пробите трябва да бъдат размразени и добре разбъркани преди тестване. Ако пробите ще се транспортират, те трябва да бъдат опаковани в съответствие с действащите разпоредби по отношение на транспортирането на етиологични агенти и е за предпочитане да се транспортират замразени.

7. ПРОЦЕДУРА

7.1. Необходими материали, които не са включени в набора • Дестилирана вода. • Натриев хипохлорит (домакинска белина) и натриев бикарбонат. • Попивателна хартия. • Ръкавици за еднократна употреба. • Предпазни очила. • Епруветки за еднократна употреба. • Автоматични или полуавтоматични, регулируеми или предварително настроени пипети или мултипипети за измерване и накапване 50 μl, 1 ml и 10 ml.

• Мерителни цилиндри с вместимост от 100 ml и 1 L. • Автоматична, полуавтоматична или ръчна система за измиване на микроплаки (*). • Инкубатор за микроплаки, термостатично установен на 37 °C ±1 °C (*). • Контейнер за биологично опасни отпадъци. • Четец за микроплаки, снабден с филтри 450, 490 nm и 620–700 nm (*). (*) Свържете се с нас за подробна информация относно оборудването, препоръчано от нашия технически отдел.

7.2. Подготовка на реактивите

7.2.1. Готови за употреба реактиви

Реактив 1 (R1): Микроплака Всяка опорна рамка, съдържаща 12 тест ленти, е увита в уплътняващо фолио. Отрежете опаковката, като използвате ножици или скалпел, на разстояние 0,5 до 1 cm от уплътнителния ръб. Отворете опаковката и извадете рамката. Поставете неизползваните тест ленти обратно в опаковката. Затворете внимателно опаковката и я поставете обратно на мястото за съхранение при температура +2–8 °C.

[BG] 7

Реактив 3 (R3): Негативна контрола Реактив 4 (R4): Положителна контрола Реактив 6 (R6): Конюгат Да се хомогенизира преди употреба, като го обръщате. Реактив 10 (R10): Стопиращ разтвор

7.2.2. Реактиви за разтваряне

Реактив 2 (R2): Концентриран промиващ разтвор (20X) Да се разтвори в съотношение 1:20 в дестилирана вода, за да се получи готов за използване промиващ разтвор. Да се подготвят 800 ml за една плака от 12 тест ленти. Реактив 8 (R8) + Реактив 9 (R9): Ензимен проявяващ разтвор Да се разтвори в съотношение 1:11 хромоген (R9) в субстратния буфер (напр. 1 ml реактив R9 + 10 ml от реактив R8), като трябва да се има предвид, че са необходими 10 ml и те са достатъчни за третиране на 12 тест ленти. Хомогенизиране.

7.3. Процедура на теста Строго да се следва процедурата. Да се използват негативните и положителните контролни серуми за всеки тест, за да се валидира качеството на теста. Да се спазва следната добра лабораторна практика:

1) Внимателно да се установи накапването на пробата и плана за идентифицирането. 2) Да се приготви разреден промиващ разтвор R2 3) Да се извади от защитната опаковка опорната рамка и необходимият брой тест ленти

(R1). Неизползваните тест ленти да се поставят обратно в опаковката им. Да се затвори опаковката и да се върне обратно за съхранение при температура +2–8 °C.

4) Да се накапе във вдлъбнатините в следния ред (препоръчително накапване на плаките): • 50 μl негативна контрола (R3) в А1, В1 и С1 • 50 μl положителна контрола (R4) в D1, E1 • 50 µl от неразредена проба във всяка вдлъбнатина, F1, G1 и т.н. • 50 μl конюгат (R6) във всяка вдлъбнатина

В зависимост от използваната система е възможно да се променят позициите на контролите или реда на накапване. Да се хомогенизира реакционната смес с най-малко 3 аспирации или с шейкър за микроплаки в продължение на 5 секунди. ЗАБЕЛЕЖКА: Разпределението на пробата и контролите може да бъде контролирано визуално на този етап на манипулацията, налице е разлика в оцветяването между празна вдлъбнатина и вдлъбнатина с проба. Да се постави конюгат в рамките на 5 минути след разпределението на пробата. Има ясна разлика в оцветяването между празна вдлъбнатина и вдлъбнатина, съдържаща червено оцветен конюгатен разтвор (R6) (отнесете се за справка към § 7.7)

5) Когато е възможно, плаката да се покрива с нов самозалепващ се филм. 6) Микроплаката да се поставя в инкубатор за 30 до 35 минути при температура 37 °C ± 1

°C. 7) Ако е необходимо, отстранете самозалепващия се филм. Съдържанието на всички

вдлъбнатини да се аспирира в контейнер за течни отпадъци и да се добави минимум 370 µl от миещия разтвор във всяка вдлъбнатина. Да се аспирира отново и да се повтори измиването минимум 4 пъти (общо 5 цикъла на измиване). Остатъчният обем трябва да бъде по-малък от 10 μl (ако е необходимо, тест лентичките се подсушават, като се обръщат обратно върху попивателна хартия). Ако имате автоматична миеща машина, следвайте същия работен цикъл.

[BG] 8

ЗАБЕЛЕЖКА: Да се премине към етап измиване в рамките на 20 минути.

8) Подгответе проявяващ разтвор (реактиви R8 + R9). 9) Бързо да се разпределят във всяка вдлъбнатина по 50 μl от приготвения проявяващ

разтвор (R8 + R9), приготвен непосредствено преди употреба. Да се остави реакцията да се развива на тъмно в продължение на 25 до 35 минути при стайна температура (18–30 °C). Да не се използва самозалепващ се филм по време на това инкубиране.

ЗАБЕЛЕЖКА: Накапването на проявяващия разтвор, който е розов, може да бъде визуално контролирано на този етап от манипулацията. Съществува ясна разлика в оцветяването между празна вдлъбнатина и вдлъбнатината, която сдържа розов субстратен разтвор. (отнесете се за справка към § 7.7). 10) Да се добавят 50 μl стопиращ разтвор (R10), като се използва същата последователност

и скорост на накапване, както за субстратния разтвор. Да се хомогенизира реакционната смес.

ЗАБЕЛЕЖКА: Накапването на стопиращия разтвор може да бъде контролирано визуално на този етап на обработка. Цветът на субстрата, розов (за отрицателни проби) или син (за положителни проби), избледнява от вдлъбнатините, които са станали безцветни (за отрицателните проби) или жълти (за положителните проби) след добавяне на стопиращ разтвор. 11) Внимателно да се подсуши дъното на всяка плака. Да се изчака поне 4 минути след

добавянето на стопиращия разтвор и в рамките на 30 минути от стопирането на реакцията да се отчете оптичната плътност 450/620-690 nm, като се използва четец на плаки.

12) Да се провери съответствието между спектрофотометричните и визуалните показания и спрямо плаката и накапването на пробата и плана за идентифицирането.

7.4. Контрол на качеството Да се използват отрицателните (R3) и положителните (R4) контроли за всяка серия, за да се валидизират резултатите от тестовете. (отнесете се за справка към § 7.5).

7.5. Критерии за валидиране на теста Този тест е валидизиран, ако условията, посочени по-долу, са спазени:

1) За негативната контрола R3: OD R3 ≤ 0,080

Ако една контролна стойност е над тази стойност, да се пренебрегне това и да се извърши изчислението с останалите две отрицателни контролни стойности.

2) За положителната контрола R4: OD R4 ≥ 0,700

7.6. Изчисляване/интерпретация на резултатите Граничната стойност се определя с помощта на отрицателната контрола R3: Да се изчисли средната измерена стойност на абсорбция за отрицателна контрола R3 и да се изчисли граничната стойност (COV), както следва: COV = Средна стойност на OD R3 + 0,100 Проби с OD, по-малко от CОV, се считат за отрицателни при изследване със Syphilis Total Ab. Резултати, точно под праговата стойност (COV -10 % < OD < COV), все пак трябва да се тълкуват с повишено внимание. Препоръчително е да се повтори изследването на съответстващите проби двукратно, когато системите и лабораторните процедури разрешават това.

[BG] 9

Проби с OD, по-голямо или равно на CОV, се считат за положителни при изследване със Syphilis Total Ab и трябва да се изследват повторно двукратно преди окончателното тълкуване. Изследваните повторно проби, които са над CОV при поне една от дублираните проби, се считат за положителни и трябва да бъдат изследвани допълнително. Пробите, които са под граничния праг и в двете повторени проби, се считат за отрицателни. В случай на много ниска оптична плътност за тестваните проби (отрицателна OD) и когато наличието на пробите, както и на реактива, се контролира, резултатите могат да бъдат разчетени като отрицателни. Препоръчително е да се потвърдят положителните проби, като се следват действащите на национално ниво препоръки и алгоритми.

7.7. Спектрофотометрична верификация на проба и пипетиране на конюгат (не задължително)

Проби и контроли Наличието на проби и контроли във вдлъбнатината може да бъде верифицирано посредством автоматично разчитане при 450/620 nm. Вдлъбнатина с добавена проба ще има OD между 0,050 и 1,100. Конюгат Конюгатът е оцветен в червено. Наличието на конюгат във вдлъбнатините може да бъде контролирано посредством автоматично разчитане при 450/620 nm. Вдлъбнатина с проба и конюгат ще има OD ≥1,200. Верификация на пипетирането на проявяващия разтвор Възможно е да се потвърди наличието на розов проявяващ разтвор във вдлъбнатината посредством автоматично разчитане при 492 nm. Вдлъбнатина с проявяващ разтвор трябва да има оптична плътност >0,100 (по-ниска OD показва лошо накапване на проявяващия разтвор).

8. ОГРАНИЧЕНИЯ НА ТЕСТА Както при всички серологични тестове за сифилис интерпретацията на резултатите, получени с анализа Syphilis Total Ab EIA, трябва да се отнася във връзка с клиничните симптоми на пациента, медицинската анамнеза и другите лабораторни находки, за да се получи цялостната клинична диагноза. Не се разполага с нито един отделен тест или окончателен сравнителен стандарт, който да е приложим за всеки стадий на болестта. Следователно, диагнозата на сифилиса може да бъде сигурна главно въз основа на серологични тестове, които изискват резултати както от нетрепонемални, така и от трепонемални методи. Не диагностичен тест обезпечава абсолютна сигурност, че пробата не съдържа ниски нива на антитела срещу T. pallium, като например тези, които присъстват в много ранен стадий на инфекцията. Поради това отрицателен резултат във всеки един момент не изключва възможността за излагане на инфекция със сифилис. Всяка техника ELISA може да даде фалшиво положителни реакции. Препоръчително е да се провери специфичността на реакцията на всяка проба, за която е установено, че е повторно положителна, в съответствие с критериите за тълкуване на кита Syphilis Total AB, като се използва подходящ метод: Хемаглутинационен анализ за Treponema Pallidum. Всички резултати от трепонемални тестове имат склонност да остават реактивни след трепонемална инфекция, поради което те не трябва да се използват, за да се преценява повлияването от терапията. Заради персистирането на реактивност, в повечето случаи за целия живот на пациента, трепонемалните тестове са без никаква стойност при определяне на

[BG] 10

рецидив или повторно заразяване на пациент, който е имал реактивен резултат. В този случай се препоръчва да се използват други анализи: Syphilis IgM EIA, RPR и TPHA. Спектрофотометричният метод за проверяване на пробата, конюгата, утаяването на проявяващ разтвор не позволява да се потвърди точността на разпределения обем проби и конюгат. Този метод показва само наличието на проба и конюгат. Коефициентът на грешките с този метод е силно свързан с точността на използваната система (акумулиран коефициент на разлики от над 10 % за разпределение и отчитане значително намалява качеството на тази стъпка).

9. РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ

9.1. Прецизно измерване Повторяемостта и междинната прецизност са определяни, като са използвани проби с различна концентрация на антитела срещу сифилис. Пробите са тествани 30 пъти по време на една и съща серия от тестове, за да се определи повторяемостта. Пробите също са изследвани двукратно в продължение на 20 дни при скорост от 2 изследвания на ден. Изчислени са съотношението на средните стойности, стандартните отклонения и коефициентите на вариация (CV).

9.1.1. Повторяемост:

Проби N Средна

стойност на съотношенията

Стандартно отклонение CV %

Слабо Отрицателен 30 0,14 0,014 9,5 %

Високо Отрицателен 30 0,68 0,051 7,5 % Слабо положителен Syphilis ab 30 1,90 0,070 3,7 %

Положителен Syphilis ab 30 3,76 0,130 3,5 %

CVs, получени при положителните проби, са по-малко от 10 %.

9.1.2. Междинна прецизност

Проби N

Средна стойност на съотношени

е

Вътрешен анализ

Междинен анализ/операто

р

Междинен ден

Обща възпроизводимос

т

SD CV % SD CV % SD CV

% SD CV %

Слабо Отрицателен

80

0,15 0,035

22,5 % 0,023 14,7 % 0,01

7 10,9 % 0,045 29,0 %

Високо Отрицателен

80

0,74 0,038

5,1 % 0,074 10,0 % 0,00

6 0,8 % 0,084 11,2 %

Слабо положителен Syphilis ab

80

2,30 0,112

4,9 % 0,312 13,5 % 0,09

9 4,3 % 0,346 15,0 %

Положителен Syphilis ab

80

4,13 0,180

4,3 % 0,543 13,1 % 0,19

5 4,7 % 0,604 14,6 %

CVs, получени при положителните проби, са по-малко или равни на 15 %.

[BG] 11

9.2. Клинични характеристики Клиничните характеристики на анализа Syphilis Total Ab са определяни посредством тестване на проби от проспективни и ретроспективни проучвания: Проспективно проучване:

- 5195 проби от случайни кръводарители; - 460 проби от пациенти, за които се подозира, че имат сифилис

Ретроспективно проучване: - 350 пациенти, положителни за болести, предавани по полов път (БПП).

Проучванията са осъществени в 2 центъра за кръводаряване, в център за БПП (болести, предавани по полов път) и в центъра Bio-Rad.

9.2.1. Специфичност на диагностиката Проучването е извършено върху проби със серум и с EDTA плазма, събрани в 2 кръвни банки на случайни донори във Франция. Проучването за специфичност е осъществено също и върху проби от пациенти. Всички резултати са сравнени с тези, получени от други тестове за сифилис с маркировка за CE (разрешени в Европейската общност). Таблица 1: Тест за специфичност (IR = Първоначален реактив; RR= Повторен реактив)

Популация Център Тип проба Общ брой

проби

Първоначален

реактив (IR)

Повторен реактив

(RR)

RR специфичност (%)

95 % CI (интервал

на доверителност) (%)

Кръводарители #1 + #2

Серум SST (епруветка за отделяне на серума)

3127 2 2* 3125/3125

EDTA K2 плазма 2068 2 2* 2066/2066

Общо 5195 4 4* 100 % 5191/5191

99,93 % – 100 %

Пациенти #3 Серум 351 1 1 99,72 % 350/351

98,42 – 100 %

*Повторените реактивни проби, показали положителни резултати с други ензимни имуноанализи (EIA) със СЕ маркировка Анализ за сифилис са изключени от изчисляването на специфичността на диагностиката

9.2.2. Чувствителност на диагностиката Ретроспективно проучване: Проучването е направено върху 350 замразени проби, от които 2 проби са обявени за отрицателни и 348 са потвърдени като положителни със CE маркирани за изследване на сифилис анализи. Сред тези 348 позитивни проби 7 проби са от пациенти в ранен стадий на инфекцията. Всичките тези 348 проби са установени като положителни с анализа Bio-Rad Syphilis Total Ab. Проспективно проучване: Общо 460 пресни проби са оценени с анализа Bio-Rad Syphilis Total Ab и са сравнени със CE маркирани тестове за сифилис. 348 са установени като отрицателни както с тестове Bio-Rad, така и с референтни тестове (при две проби, окачествени като фалшиво положителни с референтен тест за ензимен имуноанализ – EIA) При 109 е установен положителен резултат и с двата теста за анализ.

[BG] 12

3 проби са показали противоречиви резултати (след повторно изследване с анализа Bio-Rad): • 1 проба е положителна с анализа Bio-Rad и високо отрицателна с референтните

тестове. Тази проба с ниска степен на сифилис е на границата на пределните стойности и за двата EIA теста:

• 1 проба, положителна с референтни тестове, е отрицателна с анализа на Bio-Rad (от 1 пациент без признаци)

• 1 проба е положителна с референтни тестове, отрицателна с IR и положителна при повторен тест с анализа Bio-Rad,

Ретроспективни и проспективни проучвания: Общата диагностична чувствителност е равна на 99,56 % (457/459) при доверителен интервал 95 % от [98,44 % – 99,95 %]. Клинична чувствителност Клиничната чувствителност е също проучвана при 3 налични на пазара набора и 1 набор със сероконверсия. Анализът Bio-Rad Syphilis Total Ab е сравнен със CE-маркирани анализи за сифилис. Откриването на всяка проба от наборите е равностойно между анализа Bio-Rad и референтния анализ за изследване на сифилис.

9.3. Аналитична чувствителност Аналитичната чувствителност е оценена на 2 NIBSC стандарти и се изчислява при пределна стойност, като се използва регресия:

1. Границата на откриване за IgG/IgM е оценявана при 3 партиди на анализа Syphilis Total Ab и е изчислена на 0,53 mIU/ml с CI 95 % [0,10 mIU/ml – 1,30 mIU/ml], като е използван стандарт на СЗО за IgM/IgG (NIBSC код: 05/132).

2. Границата на откриване за IgG е оценявана при 1 партида на анализа Syphilis Total Ab и е изчислена на 0,11 mIU/ml с CI 95 % [0,02 mIU/ml – 0,27 mIU/ml], като е използван стандарт на СЗО за IgG (NIBSC код: 05/122).

9.4. Аналитична специфичност/проучване на кръстосана реактивност Общо 125 потенциално интерферентни проби, съдържащи антитела спрямо патогени, които биха могли да доведат до инфекциозни заболявания (Лаймска болест, токсоплазмоза, EBV - Ебщайн-Бар вирус, лептоспироза, SLE - системен еритематозен лупус (лупус), хепатит A антитяло, хепатит B антитяло, хепатит C антитяло, човешки Т-лимфотропен вирус - HTLV I/II и човешки имунодефицитен вирус - HIV), проби от пациенти от групи, изложени на риск (бременни жени и многораждали жени) или проби от пациенти с нарушения на имунната система (ревматоидни фактори) са изследвани с анализа Syphilis Total Ab. Сред 125 изследвани проби 1 проба е установена като повторяемо положителна с анализа Syphilis Total Ab; тази проба е потвърдена като истински положителна с други, приети в ЕО ензимни имуноанализи (EIA) и потвърдителни анализи. Специфичността, която е наблюдавана при тази прицелна популация е равна на 100 % (124/124) с 95 % доверителен интервал [97,1 % - 100,0 %].

9.5. Прозон ефект Наличието на възможен прозон ефект е проучено чрез изследване на 6 позитивни проби за сифилис с високи титри при различни разреждания. Равностойността на резултатите, наблюдавани при неразредени и разредени проби, показва липсата на прозон ефект при изследваните проби.

[BG] 13

10. БИБЛИОГРАФИЧНИ ПРЕПРАТКИ. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992. 2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57. 3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21. 4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar; 33(3):525–7. 5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209. 6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309. 8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009 9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, ‘It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis’, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.

[BG] 14

[BG] 15

[BG] 16

[BG] 17

[BG] 18

Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430, Marnes-la-Coquette, Франция Тел.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Факс: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11

www.bio-rad.com 883679