TA Cloning® Kit

TA Cloning® 试剂盒试剂盒试剂盒试剂盒 货号货号货号货号：：：：

K2000-01, K2000-40, K2020-20, K2020-40, K2030-01 K2030-40, K2040-01, K2040-40, CK2020-20, CK2020-40

ii

目 录

目 录................................................................................................................. ii 重要信息................................................................................................................ iv 附属产品............................................................................................................... vii

介介介介 绍绍绍绍 ................................................................................................................................................................................................................................................................ 1111

概 述...................................................................................................................... 1 实验概要................................................................................................................. 2

方方方方 法法法法 ................................................................................................................................................................................................................................................................ 3333

PCR 产物制备 ........................................................................................................ 3 克隆到 pCR®2.1 ..................................................................................................... 4 转化感受态细胞..................................................................................................... 5 转化子分析............................................................................................................. 7 故障诊断与排除..................................................................................................... 8

附附附附 录录录录 ............................................................................................................................................................................................................................................................ 11111111

进行自连反应....................................................................................................... 11 进行对照反应....................................................................................................... 12 添加 3´ A 尾 ......................................................................................................... 14 配 方................................................................................................................... 15 pCR®2.1 图谱和特征 ........................................................................................... 16 技术服务............................................................................................................... 18 购买者须知........................................................................................................... 19 产品质量............................................................................................................... 20 参考文献............................................................................................................... 21

iii

iv

重要信息重要信息重要信息重要信息

试剂盒种类试剂盒种类试剂盒种类试剂盒种类 本说明书适用于以下试剂盒。

试剂盒名称试剂盒名称试剂盒名称试剂盒名称 数量数量数量数量 货号货号货号货号

TA Cloning®试剂盒 20 个反应

40 个反应

K2020-20

CK2020-20

K2020-40

CK2020-40

TA Cloning®试剂盒包含 One Shot

® INVαF´

化学 E. coli 感受态 20 个反应

40 个反应

K2000-01

K2000-40

TA Cloning® 试剂盒包含 One Shot

® TOP10F´

化学 E. coli 感受态 20 个反应

40 个反应

K2030-01

K2030-40

TA Cloning®试剂盒包含 One Shot

® TOP10 化

学 E. coli 感受态 20 个反应

40 个反应

K2040-01

K2040-40

保存说明保存说明保存说明保存说明 TA Cloning®试剂盒用干冰运输，包含有一盒 TA Cloning®试剂（盒 1），一盒 One

Shot®化学感受态细胞（盒 2），货号 K2020-20, CK2020-20, K2020-40 和 CK2020-40

不包括 One Shot®化学感受态细胞。

盒盒盒盒 1111 保存在保存在保存在保存在----20202020非除霜冰箱中非除霜冰箱中非除霜冰箱中非除霜冰箱中，，，，盒盒盒盒 2222 保存在保存在保存在保存在----80808080。。。。

下页待续

v

重要信息重要信息重要信息重要信息，，，，续前续前续前续前页页页页

TA Cloning ®试剂试剂试剂试剂 TA Cloning® 试剂(盒 1) 中的试剂列表如下。注意：用户必须提供 Taq 聚合酶。40

个反应的试剂盒以两个 20 反应的试剂盒形式提供。

盒盒盒盒 1111 需保存在需保存在需保存在需保存在----20202020。。。。

项目项目项目项目 组成组成组成组成 数量数量数量数量

pCR®2.1, 线性化的 25 ng/µl in 10 mM Tris-HCl,

1 mM EDTA, pH 8 5 x 10 µl

10X PCR 缓冲液 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (于

42°C)

500 mM KCl

25 mM MgCl2

0.01% 凝胶

100 µl

10X 连接缓冲液 60 mM Tris-HCl, pH 7.5

60 mM MgCl2

50 mM NaCl

1 mg/ml 牛血清白蛋白

70 mM β-巯基乙醇

1 mM ATP

20 mM 二硫苏糖醇

10 mM 亚精胺

100 µl

50 mM dNTPs 12.5 mM dATP

12.5 mM dCTP

12.5 mM dGTP

12.5 mM dTTP

(调节 pH 至 8.0)

10 µl

T4 DNA 连接酶 4.0 Weiss 单位/µl 25 µl

无菌水 高压灭菌的去离子水 1 ml

对照 DNA 模板 0.1 µg/µl 溶于 10 mM Tris-HCl,

1 mM EDTA, pH 8 10 µl

对照 PCR 引物 各 0.1 µg/µl 溶于 10 mM Tris-HCl,

1 mM EDTA, pH 8 10 µl

下页待续

vi

重要信息重要信息重要信息重要信息，，，，续前续前续前续前页页页页

One Shot ® 试剂试剂试剂试剂 下表列出了 One Shot®感受态细胞试剂盒中包含的成份。货号 K2020-20, CK2020-20,

K2020-40 和 CK2020-40 不不不不含感受态细胞。40 个反应的试剂盒以两个 20 反应的试剂盒

形式提供。

TOP10F´ 和 TOP10 细胞的转化效率是 1 x 109 cfu/µg DNA。INVαF´细胞的转化效率是

1 x 108 cfu/µg DNA。

在在在在----80ºC80ºC80ºC80ºC 保存感受态细胞保存感受态细胞保存感受态细胞保存感受态细胞。。。。

成份成份成份成份 组成组成组成组成 数量数量数量数量

S.O.C. 培养基

(可以保存在室温或者+4ºC) 2% 胰蛋白胨

0.5% 酵母提取物

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM 葡萄糖(右旋糖)

6 ml

INVαF´, TOP10F´, 或者或者或者或者 TOP10 细

胞 -- 21 x 50 µl

pUC19 对照 DNA 10 pg/µl 溶于 5 mM Tris-

HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8

50 µl

INVααααF´的基因型的基因型的基因型的基因型 F´ endA1 recA1 hsdR17 (rk-, mk+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 φ80lacZ∆M15

∆(lacZYA-argF)U169 λ-

TOP10F´的基因型的基因型的基因型的基因型 F´ [lacIq Tn10 (TetR)] mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacΧ74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

TOP10 的基因型的基因型的基因型的基因型 F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacΧ74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR

) endA1 nupG

vii

附属产品附属产品附属产品附属产品

附加产品附加产品附加产品附加产品 可以单独从 Invitrogen 购买 TA Cloning

®试剂盒提供的试剂以及其他适合与该试剂盒

配合使用的产品。订货信息参见下表。

项目项目项目项目 数量数量数量数量 货号货号货号货号

Platinum® Taq DNA 聚合酶 100 个反应 C10966-018

250 个反应 C10966-026

500 个反应 C10966-034

5000 个反应 C10966-083

Platinum® Taq DNA 高保真聚合酶 100 单位 C11304-011

重组 Taq DNA 聚合酶 100 单位 10342-053

500 单位 10342-020

PureLink™ HQ 质粒小量提取试剂盒 100 个反应 K2100-01

IPTG 1 g 11529-019

X-gal 100 mg 15520-034

1 g 15520-018

Bluo-gal 1 g 15519-028

卡那霉素 5 g 11815-024

25 g 11815-032

氨苄青霉素 200 mg 11593-019

One Shot ® 感受态感受态感受态感受态

细胞细胞细胞细胞 E. coli 感受态细胞可以从 Invitrogen 单独购买，感受态细胞以方便使用的 One

Shot®形式提供。

项目项目项目项目 数量数量数量数量 货号货号货号货号

One Shot® INVαF´ 化学 E. coli 感受态 20 个反应 C2020-03

40 个反应 C2020-06

One Shot® TOP10F´化学 E. coli 感受态 20 个反应 C3030-03

40 个反应 C3030-06

One Shot® TOP10 化学 E. coli 感受态 20 个反应 C4040-03

40 个反应 C4040-06

One Shot® Mach1

™-T1

R化学 E. coli 感受态 20 个反应 C8620-03

1

介介介介 绍绍绍绍

概概概概 述述述述

目目目目 的的的的 含有 pCR®2.1 的 TA Cloning

® 试剂盒提供把 PCR 产物直接插入质粒载体的一步法快速

克隆策略。

优优优优 点点点点 使用 TA Cloning® 试剂盒可以:

• 免除对 PCR 产物的任何酶切修饰

• 不需要 PCR 引物中包含限制性内切酶位点

• 可以从何任何方向插入片段

TA Cloning ® 的工的工的工的工

作原理作原理作原理作原理 Taq 聚合酶具有非模板依赖性向 PCR 产物的 3´末端加单个脱氧腺苷(A)的活性。试剂

盒中提供的线性化载体的末端具有一个 3´脱氧胸苷(T)残基。这样就使得 PCR 产物可

以有效的连接到载体上。

图图图图 示示示示 下图表示了 TA Cloning®方法的原理。

3'5'

5'3'

3'5'

5'3'

PCRProduct

AA

T

T Vector

Vector

热稳定性聚合酶具有较强的 3´到 5´核酸外切酶活性，例如 Platinum® Pfx，它并不会

在 PCR 产物的末端保留 3´ A 尾。因为使用 Taq 聚合酶产生的 PCR 产物的 3´ A 尾没有

被去除掉，所以可以被高效率的克隆到 TA Cloning®系统。但是如果您使用具有校正

功能的聚合酶或者希望克隆平末端片段，您可以在 PCR 循环之后加入 Taq 并孵育以便

在产物末端加上 3´ A 尾。参见第 14 页的步骤。

或者您可以尝试使用 Zero Blunt® PCR 克隆试剂盒(货号. K2700-20 和 K2750-20)。

这个试剂盒可以高效克隆有校正功能的热稳定聚合酶得到的平末端 PCR 产物。请访问

我们的网站了解更多信息(www.invitrogen.com)，或者联络技术服务（第 18 页）。

2

实验概要实验概要实验概要实验概要

介介介介 绍绍绍绍 为了把您感兴趣的基因克隆到 pCR®2.1，首先需要获得 PCR 产物。PCR 产物连接到

pCR®2.1 之后转化感受态细胞。因为 PCR 产物连接到载体上的方向有两种，还需要分

析单克隆的基因插入方向。正确的重组质粒可以被用于后续的分析或者亚克隆。

流程图流程图流程图流程图 下表列出了把您感兴趣的基因克隆到 pCR®2.1 的主要必须步骤。

步骤步骤步骤步骤 行行行行 动动动动 页码页码页码页码

1 用 Taq 聚合酶和您自己的引物模板及参数扩增 PCR 产物。 3

2 把您的 PCR 产物连接到 pCR®2.1。 4

3 用您的连接产物转化 E. coli 感受态细胞。 5-6

4 选择转化子并提取质粒 DNA。用限制性内切酶酶切或者测序的方

法分析质粒 DNA 中 PCR 产物的存在与否及其插入方向。 7

RECO

MMEND

ATION

如果您是第一次使用 TA Cloning® 试剂盒，我们建议您使用对照反应帮助评估实验

结果 (见第 11-13 页)。

3

方方方方 法法法法

PCR 产物制备产物制备产物制备产物制备

PCR 指导指导指导指导 一般 10-100 ng DNA 足够用于作为 PCR 的模板。如果用 cDNA 作为模板，需要根据您

感兴趣的基因的相对丰度决定模板的用量。为了提高连接反应效率，我们建议不要扩

增超过 30 个循环。

需要需要需要需要用户用户用户用户提供的材提供的材提供的材提供的材

料料料料 需要您提供如下试剂和器材。

• PCR 所需的 DNA 模板和引物

• Taq 聚合酶和合适的 10X PCR 缓冲液(参见第 vii 页的订货信息)

• 热循环仪

混合聚合酶混合聚合酶混合聚合酶混合聚合酶 如果您希望使用 Taq 聚合酶和保真酶的混合酶体系，为了确保 PCR 产物有 3´ A 尾，

Taq 必须以 10:1 的比例过量。我们推荐使用 Invitrogen 的 Platinum® Taq DNA 高保

真聚合酶(参见第 vii 页的订货信息)。

如果您使用的混合聚合酶中的 Taq 聚合酶不足，或者您需要单独使用保真酶，请参

见第 14 页的步骤在产物末端加上 3´ A 尾。

PCR 产物制备产物制备产物制备产物制备 50µlPCR 反应体系中含有如下试剂：

DNA 模板 10-100 ng

10X PCR 缓冲液 5 µl

50 mM dNTPs 0.5 µl

引物 各 1 µM

水 加至体积为 49 µl

Taq 聚合酶 1 单位

总体积 50 µl

胶纯化胶纯化胶纯化胶纯化 如果您的 PCR 没有获得单一的，可分辨的条带，您可能需要在进行下一步以前对您的

片段进行胶纯化。请小心操作，尽量避免核酸酶的污染和长时间暴露在 UV 下。另外

一个办法是您可以优化 PCR 条件，避免多条带或拖尾(Innis et al., 1990)。

Invitrogen 提供的 PCR Optimizer™ (货号. K1220-01) 试剂盒可以帮您优化 PCR 反

应。需要更多信息请联系技术服务(第 18 页)。

4

克隆到克隆到克隆到克隆到 pCR®2.1

RECO

MMEND

ATION

为了提高连接效率，我们建议使用新鲜（小于 1 天）的 PCR 产物。单个的 3´ A 尾会

随这时间的延长而降解，从而降低连接效率。

操作 pCR®2.1 时需要小心，因为丢掉 3´ T 尾将导致载体平末端自连，从而降低连接效

率。

PCR 产物用量的计产物用量的计产物用量的计产物用量的计

算算算算 用下面的公式计算与 50 ng (20 fmoles) pCR

®2.1 载体连接的 PCR 产物的用量：

X ng PCR 产物 = (Y bp PCR 产物)(50 ng pCR®2.1 载体)

(pCR®2.1 载体的片段长度 bp: ~3900)

X ng 是长度为 Y 个碱基对的 PCR 产物与载体以 1:1 (载体:插入片段)的摩尔比连接时

的用量。

一般 0.5 到 1.0 µl 平均长度(400-700 bp)的常规 PCR 样品可以满足 1:1(载体:插入

片段)的比例。1:1(载体:插入片段)的比例可以得到最好的连接效率。如果您担心您

的 DNA 浓度的准确性，可以用 1:3(载体:插入片段)的比例进行第二次连接反应。

不要使用超过 2-3 µlPCR 样品进行连接反应，因为 PCR 样品中的盐会抑制 T4 DNA 连

接酶。

连接反应温度低于或者超过 14°C 可能会降低连接效率。

步步步步 骤骤骤骤 1. 离心一管 pCR

®2.1，以便把全部液体收集到管底。

2. 根据 PCR 产物的用量（参照上述方法）确定 PCR 样品的用量。如有必要可以用无

菌水稀释 PCR 样品。

3. 如下建立 10 µl 连接反应体系：

新鲜 PCR 产物 X µl

10X 连接缓冲液 1 µl

pCR®2.1 载体 (25 ng/µl) 2 µl

无菌水 加至体积为 9 µl

T4 DNA 连接酶 (4.0 Weiss 单位) 1 µl

终体积 10 µl

4. 连接反应体系在 14°C 孵育至少 4 小时（过夜更好）。进行下一步，转化感受态转化感受态转化感受态转化感受态

细胞细胞细胞细胞，见下一页。

注释注释注释注释：：：：您可以在-20°C 保存您的连接反应体系，直到准备好进行转化实验。

5

转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞

介介介介 绍绍绍绍 当您已经把插入片段连接到 pCR®2.1，您就已经可以把载体转化进感受态 E. coli

了。为了方便转化，货号是 K2000-01, K2000-40, K2030-01, K2030-40, K2040-01,

K2040-40, K2040-01,和 K2040-40 的试剂盒提供了 One Shot®细胞。本节提供了 One

Shot®细胞的转化步骤。如果要转化其他感受态菌株，请参见厂家的说明。

INVαF´ 和 TOP10 E. coli 不表达不表达不表达不表达 lac 抑制子。由于有 lac 启动子的存在，您可以在

不加 IPTG 的条件下表达您的产物。IPTG 不会影响 INVαF´细胞-

TOP10F´表达表达表达表达 lac 抑制子(lacIq)，该抑制子将抑制 lac 启动子的转录。如果要进行插

入子的蓝白斑筛选，您必须在平板中加入 IPTG 以表达 LacZα。

E. coli 宿主菌株宿主菌株宿主菌株宿主菌株 您可以使用任何 recA, endA E. coli 菌株，包括 TOP10, TOP10F´, INVαF´, DH5α™

或者其他相类似的菌株进行转化。其它的菌株也适合。请参见第 vii 页中的列表了解

Invitrogen 可以提供的感受态 E. coli。

RECO

MMEND

ATION

如果您的 PCR 产物扩增于具有氨苄青霉素抗性的质粒，请使用卡那霉素筛选 pCR

®2.1

转化子。使用卡那霉素筛选可以避免原始的带有氨苄青霉素抗性的质粒造成的污染。

需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材

料料料料 除了常规微生物学实验所需材料（例如平板和涂菌器），您还需要提供以下试剂和

仪器。

• 适合转化的化学 E. coli 感受态细胞

• S.O.C. 培养基 (预热到室温)

• 阳性对照, 可选 (例如 pUC19)

• LB 平板，含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素 (每个转化给两

个)

• 42°C 水浴锅

• 37°C 摇床和非摇动孵育箱

下页待续

6

转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞, 续前页续前页续前页续前页

准备转化准备转化准备转化准备转化 • 水浴锅预热平衡至 42°C。

• S.O.C.培养基置于室温。

• 如果您使用 INVαF´细胞，把带有抗生素的 LB 培养基置于 37°C30 分钟。每板涂

布 40 mg/ml 的 X-Gal 40 µl。让液体被平板吸收。

• 如果您使用 TOP10F´细胞，把带有抗生素的 LB 培养基置于 37°C 30 分钟。每板

涂布 100 mM IPTG 和 40 mg/ml X-Gal 各 40 µl。让液体被平板吸收。

One Shot ® 转化步转化步转化步转化步

骤骤骤骤 按照以下步骤转化 One Shot

®感受态细胞。转化其他菌株，请按照其生产厂家的说明

进行。

1. 离心装有连接产物的管子并置于冰上。

2. 在冰中化冻 50 µl One Shot®感受态细胞，每个转化化冻一管。

3. 每个转化用移液器取 2 µl 连接产物直接加入到感受态细胞中，用枪头温和搅拌

混匀。

4. 在冰中放置 30 分钟。剩余的连接体系可在-20°C 中保存。

5. 在 42°C 非振荡条件下热激细胞 30 秒，之后把反应管立即置于冰中。

6. 每管加入室温的 S.O.C.培养基 250 µl。

7. 在 37°C 摇床中，以 225 rpm 的速度水平振荡 1 小时。

8. 从转化反应管中取 10µl 至 200 µl，涂布于含有 X-Gal 和 50 µg/ml 卡那霉素或者

100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板。如果您使用的是 TOP10F´细胞，确保平板含有

IPTG。我们建议如果使用 TOP10F´或者 TOP10 细胞，涂布 10-50 µl；如果使用

INVαF´细胞涂布 50-200 µl。

注释注释注释注释：：：：确保涂布两个不同的体积，以保证至少有一个平板有可以分辨的菌落。如果需要涂

布较小的体积，在菌液中加入 20 µl S.O.C.培养基以便均匀的涂布。

9. 37ºC 过夜培养平板。把平板放置到+4°C 显色 2-3 小时。

Important

相对于其他 E. coli 菌株，转化的 INVαF´过夜培养后菌落看起来很小。在挑克隆分

析以前需要额外培养 2-3 小时。

期望的结果期望的结果期望的结果期望的结果 对于 400-700 bp 的插入片段，根据涂布的菌液量，您将得到每板 50-200 个菌落。这

些在 X-Gal 平板(INVαF´和 TOP10)或 X-Gal/IPTG 平板(TOP10F´)上的菌落有 80%是白

色的菌落。需要注意的是，连接效率与插入片段的大小有关，片段越大效率越低。

7

转化子分析转化子分析转化子分析转化子分析

分析阳性克隆分析阳性克隆分析阳性克隆分析阳性克隆 1. 挑取至少 10 个白色单菌落进行质粒的提取和酶切分析。

2. 在 2-5 ml 含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中过

夜培养菌落。

3. 提取质粒，用酶切图谱或测序的方法分析片段的插入方向。我们建议使用

PureLink™ HQ 质粒小量纯化试剂盒纯化您的质粒 DNA（请参见第 vii 页的订货信

息）。

插入片段测序插入片段测序插入片段测序插入片段测序 如果您需要对 pCR®2.1 中的插入片段测序，可以用 M13 反向引物从 lac 启动子方向测

定插入片段序列。如果需要从 lacZα片段方向测定插入片段的序列，可以使用Τ7启动

子引物或者 M13 正向引物。引物序列和引物结合位点请参见第 16 页的图谱。为了您

的方便，Invitrogen 提供引物合成服务。更多信息请浏览我们的网站

(www.invitrogen.com)或联系技术服务(第 18 页)。

Important

如果您没有获得转化子或者没有正确插入的克隆，请按照第 12-13 页进行对照反应。

这些反应将帮助您诊断和排除实验中的故障。参见第 8 页的故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除部分了解

更多技巧。

长期保存长期保存长期保存长期保存 当您鉴定得到了正确的克隆，请纯化菌落并制备甘油菌以便长期保存。我们建议您

在-20°C 保存一份质粒 DNA。

1. 用原始菌落在含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上

划线。

2. 分离单菌落接种到含有 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml 氨苄青霉素的 LB 培

养基中。

3. 培养至平台期。

4. 混合 0.85 ml 培养物和 0.15 ml 无菌甘油，加入到冻存管中。

5. 在-80°C 中保存。

8

故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除

介介介介 绍绍绍绍 如果您没有获得预期的结果，用下表诊断和排除您实验中的问题。我们推荐进行对照

反应（第 11-13 页）帮助您评估您的实验结果。

问问问问 题题题题 原原原原 因因因因 解决办法解决办法解决办法解决办法

转化没有获得菌落 细菌不是感受态菌。 使用 One Shot® 试剂盒中的 pUC19 对

照载体检测转化效率。 平板的抗生素浓度不正确或者平板

太老。 使用 50 µg/ml 卡那霉素或者 100

µg/ml 氨苄青霉素。使用新鲜的氨苄

青霉素平板（<1 个月）

白色菌落不含有插入片段 载体上的单 3´ T 尾被降解。 使用另外一管载体。避免保存载体超

过 6 个月，避免反复冻融。用自连反

应检测载体，见第 11 页。

仅得到白色菌落 平板上没有 IPTG 或 X-Gal。 蓝白斑筛选时确保加入 X-Gal，如果

使用 TOP10F´确保加入 IPTG 和 X-

Gal。

大多数菌落为蓝色或浅蓝

色，白色菌落很少 插入片段没有破坏 lacZ 基因的读

码框。 如果您的插入片段较小(< 500 bp)，

您可能得到浅蓝色菌落。分析蓝色的

菌落，它们可能含有插入片段。 使用的聚合酶不能加 3´ A 尾。 不要使用保真酶，例如 Platinum

®

Pfx，因为它们不能加 3´ A 尾。使用

Taq 聚合酶。 连接以前用胶纯化过的 PCR 产物。 胶纯化可以去除 3´ A 尾。如果需要

胶纯化，使用无核酸酶活性的试剂或

者优化您的 PCR 反应条件。 连接反应以前 PCR 产物已经保存了

较长时间。 使用新鲜的 PCR 产物。就算保存 1 天

也会减低反应效率。

连接体系中加入了过多扩增反应样

品。 PCR 反应体系中的盐会抑制连接反

应。在连接反应中使用不超过 2-

3 µlPCR 反应样品。 连接反应中使用错误的载体:插入

片段摩尔比。 估计 PCR 产物的浓度。建立载体:插

入片段摩尔比为 1:1 或 1:3 的连接

反应体系。

下页待续

9

故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除，，，，续前页续前页续前页续前页

问问问问 题题题题 原原原原 因因因因 解决办法解决办法解决办法解决办法

一些菌落为浅蓝色或外周白

色中间蓝色 lacZ 的残留表达或者插入片段只部

分破坏了 lacZ。 如果您需要小的插入片段，500bp 或

者更小，分析这些菌落，它们可能含

有插入片段。

白色菌落或者蓝色菌落大小

正常，但是围绕着一些小的

白色克隆

小克隆是氨苄青霉素敏感的卫星菌

落。不要挑小菌落因为它们不含有

质粒。

使用卡那霉素筛选。确保您的氨苄青

霉素的储液和平板都是新鲜的。

白色菌落在液体培养基中不

生长 氨苄青霉素敏感的卫星菌落 请挑取大的白色菌落。确保氨苄青霉

素新鲜。使用卡那霉素以避免这个问

题。

测序得不到结果 不小心使用了试剂盒中的扩增引物

进行测序。它们是用于制备对照

PCR 产物的引物。

使用 M13 正向(-20)和反向引物测

序。您也可以用 T7 或 Sp6 启动子引

物测定插入片段的序列。 使用的 T7 引物序列不正确。 检查 T7 启动子引物，确保其序列和

pCR®2.1 上的引物结合位点匹配。

使用 Sp6 引物对 pCR®2.1 测序。 不要使用 Sp6 引物对 pCR

®2.1 测序，

该载体上没有这个引物的结合位点。

没有 PCR 产物 Taq 聚合酶失活或者您的 PCR 反应

条件不佳。 按照第 11-13 页进行对照反应，测试

Taq 聚合酶的活性。如果 Taq 聚合酶

活性正常，您将需要优化 PCR 反应条

件。

质粒产量低 细胞在 LB 培养基中生长不良。 尝试使用含有适当抗生素的 S.O.C.

培养基。

下页待续

10

故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除故障诊断与排除，，，，续前页续前页续前页续前页

解读解读解读解读对照反应对照反应对照反应对照反应 下表说明了为了诊断和排除 TA Cloning

®实验中的问题进行的对照反应和如果解释对

照反应的结果。

对照反应对照反应对照反应对照反应 解解解解 释释释释

自连反应 这个对照反应显示 pCR®2.1 是否丢失了 3´T 外延残基。

丢失 T 外延残基导致平末端连接，破坏 lacZα的读码

框。导致产生假白色菌落。一般情况下小于 5%的菌落

是白色菌落。

转化对照 检测 One Shot®感受态细胞的转化效率。

INVαF′的转化效率应该为 1 x 108 cfu/µg DNA，TOP10

和 TOP10F′的转化效率应该为 1 x 109 cfu/µg DNA。

PCR 产物对照 检测包括 Taq 聚合酶在内的 PCR 试剂。

连接反应对照 检测连接反应试剂和 pCR®2.1。白色菌落应大于 80%，

并且含有插入克隆。

11

附附附附 录录录录

进行自连反应进行自连反应进行自连反应进行自连反应

介绍介绍介绍介绍 TA Cloning®载体如果没有经过反复冻融在 6 个月内是稳定的。载体储存超过这个时间

或者经过反复冻融将丢失 3´ T 尾，导致产生“假”阳性白色菌落。按照下面的步骤操

作进行自连反应并转化 One Shot®感受态细胞。如果您使用其他 E. coli 菌株，请参见

其生产厂家的说明。

步骤步骤步骤步骤 1. 如下建立 10 µl 自连反应体系：

无菌水 6 µl

10X 连接缓冲液 1 µl

pCR®2.1 载体 (25 ng/µl) 2 µl

T4 DNA 连接酶 (4.0 Weiss 单位) 1 µl

总体积 10 µl

2. 14-15°C 孵育过夜。短暂离心连接反应管，置于冰中。

3. 在冰中化冻 50 µl One Shot®感受态细胞，每个转化反应化冻一管。

4. 从上述第一步的对照连接体系中用移液器吸取 1 µl 连接产物直接加入到感受态细

胞中，用枪尖温和搅拌混匀。

5. 在冰中放置 30 分钟。剩余的连接体系可在-20°C 中保存。

6. 在 42°C 非振荡条件下热激细胞 30 秒，之后把反应管立即置于冰中。

7. 反应管中加入室温的 S.O.C.培养基 250 µl。

8. 反应管在 37°C 摇床中，以 225 rpm 的速度水平振荡 1 小时。

9. 转化反应管中取 50 µl，涂布于含有 X-Gal 和 50 µg/ml 卡那霉素或者 100 µg/ml氨苄青霉素的 LB 平板。如果您使用的是 TOP10F´细胞，确保平板含有 IPTG。

10. 37ºC 过夜培养平板。

期望的结果期望的结果期望的结果期望的结果 您将从涂布 50µl 的平板上得到 5-25 个蓝色菌落。由超螺旋 pCR®2.1 载体得到的白色

菌落少于 5%。随着时间的增加，3´ T 尾将降解，导致载体平末端自连。这将导致

lacZ 的移码突变，从而产生“假”白色或者浅蓝色不含插入片段的菌落。

12

进行对照反应进行对照反应进行对照反应进行对照反应

介介介介 绍绍绍绍 我们推荐您在第一次使用本试剂盒的时候进行对照反应以评估您的结果。进行对照反

应包括用试剂盒提供的试剂制备 PCR 产物并用该产物进行连接反应。

制备制备制备制备对照对照对照对照 PCR 产产产产

物物物物 使用 Taq 聚合酶和如下步骤扩增对照 PCR 产物。

1. 建立如下 50 µl PCR 反应体系：

对照 DNA 模板 (100 ng) 1 µl

10X PCR 缓冲液 5 µl

50 mM dNTPs 0.5 µl

对照 PCR 引物 1 µl

无菌水 41.5 µl

Taq 聚合酶 (1 单位/µl) 1 µl

总体积 50 µl

2. 用 70 µl 矿物油覆盖。

3. 按照下表的参数循环扩增:

步骤步骤步骤步骤 时间时间时间时间 稳定稳定稳定稳定 循环循环循环循环

变性 1 分钟 94°C

退火 1 分钟 55°C 25X

延伸 1 分钟 72°C

终延伸 7 分钟 72°C 1X

4. 从反应体系中取 10 µl 用琼脂糖凝胶电泳分析。应该得到清晰的 700bp 条带。继

续按照下一页进行对照连接反应对照连接反应对照连接反应对照连接反应。

下页待续

13

进行对照反应进行对照反应进行对照反应进行对照反应，，，，续前续前续前续前页页页页

对照连接反应对照连接反应对照连接反应对照连接反应 使用前页获得的对照 PCR 产物，按照下面的体系建立连接反应体系。一般 1 µl 对照

PCR 产物足够连接反应。或者您可以参见第 4 页的公式估计与 50 ng pCR®2.1 连接所

需的 PCR 产物的量。

1. 如下建立 10 µl 对照连接反应体系：

无菌水 5 µl

10X 连接缓冲液 1 µl

pCR®2.1 载体 (25 ng/µl) 2 µl

对照 PCR 产物 1 µl

T4 DNA 连接酶 1 µl

总体积 10 µl

2. 连接反应体系在 14°C 孵育至少 4 小时（过夜更好）。

3. 转化 1 µl 对照反应到一管 One Shot® 感受态细胞或者其他适合的 E. coli 感受

态菌株。

4. 每个转化取混合物 10-50 µl 涂布到含有 50 µg/ml 卡那霉素和 X-Gal 的平板（如

果使用 TOP10F´细胞还要包含 IPTG）。

5. 37ºC 过夜培养平板。

转化对照转化对照转化对照转化对照 含有 One Shot®感受态细胞的 TA Cloning

® 试剂盒自带 pUC19 质粒作为转化对照。按

照第 6 页的步骤，用 10 pg pUC19 转化一管 One Shot®感受态细胞。在含有 100 µg/ml

氨苄青霉素的 LB 平板涂布 10 µl 到 50 µl 转化混合物。TOP10F´转化效率应该为 1 x

109 cfu/µg DNA，INVαF´的转化效率应该为 1 x 10

8 cfu/µg DNA。

期望的结果期望的结果期望的结果期望的结果 对照连接反应应该获得>80%的白色菌落。随着时间的增加，3´ T 尾的降解将导致背景

白色菌落（没有插入片段）的增加。背景白色菌落的数量应该不超过 10%（参见第 11

页的进行自连反应进行自连反应进行自连反应进行自连反应）。如果产生这种结果，使用另外一管 pCR®2.1 并避免反复冻融。

14

添加添加添加添加 3´ A 尾尾尾尾

介介介介 绍绍绍绍 一般直接连接保真酶扩增的 DNA 与 pCR®2.1 非常困难，因为其连接效率非常低。这是

由于保真酶具有 3´ 到 5´核酸外切酶活性，该活性可以去除 TA Cloning®所必需的 3´

A 尾。Invitrogen 开发了一种克隆平末端片段的简单方法。

如果您经常克隆平末端 PCR 产物，我们推荐使用 Zero Blunt®PCR 克隆试剂盒（货号

K2700-20 和 K2750-20）克隆平末端产物。

需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材需要用户提供的材

料料料料 您将需要提供以下试剂和仪器。

• Taq 聚合酶

• 平衡到 72°C 的加热板

• 酚-氯仿

• 3 M 醋酸钠

• 100% 乙醇

• 80% 乙醇

• TE 缓冲液

步步步步 骤骤骤骤 1. 使用保真酶扩增以后，把反应管至于冰中，每管加入 0.7-1 单位 Taq 聚合酶。混

匀。不必更换缓冲液。

2. 72°C 孵育 8-10 分钟（不要循环）。

3. 立即用等体积酚-氯仿抽提。

4. 加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 2X 体积的 100% 乙醇。

5. 最大速度室温离心 5 分钟沉淀 DNA。

6. 去除乙醇，用 80%乙醇洗涤沉淀，空气中晾干。

7. 用与起始 DNA 扩增反应的等体积 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀。现在 DNA 扩增产物可

以用于与 pCR®2.1 连接。

15

配配配配 方方方方

LB (Luria -Bertani) 培养基和平板培养基和平板培养基和平板培养基和平板

配方配方配方配方::::

1.0% 胰蛋白胨

0.5% 酵母提取物

1.0% NaCl

pH 7.0

1. 配制 1 升培养基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物和 10 g NaCl，用 950 ml 去

离子水溶解。

2. 用 NaOH 调节 pH 至 7.0，补齐体积至 1 升。

3. 15 lbs./sq. inch.高压灭菌 20 分钟，如果需要可以待冷却到 55°C 加入适当的

抗生素。

4. 室温或者+4°C 保存。

LB LB LB LB 琼脂平板琼脂平板琼脂平板琼脂平板

1. 如上制备 LB 培养基，不同的是高压灭菌以前加入 15 g/L 琼脂。

2. 15 lbs./sq. in.高压灭菌 20 分钟。

3. 高压灭菌以后，冷却到约~55°C ，加入抗生素(100 µg/ml 氨苄青霉素或

50 µg/ml 卡那霉素)，倒 10 cm 平板。

4. 等待平板凝固，+4°C 倒置保存。

16

pCR®2.1 图谱和特征图谱和特征图谱和特征图谱和特征

pCR®2.1 图谱图谱图谱图谱 线性化的 pCR®2.1 载体如下图所示。箭头指示 T7 RNA 聚合酶的转录起始位点。

pCRpCRpCRpCR®®®®2.12.12.12.1 的全序列可以从我们的网站获得的全序列可以从我们的网站获得的全序列可以从我们的网站获得的全序列可以从我们的网站获得((((www.invitrogen.comwww.invitrogen.comwww.invitrogen.comwww.invitrogen.com))))，，，，您也可以联系技术您也可以联系技术您也可以联系技术您也可以联系技术

服务服务服务服务（（（（第第第第 18181818 页页页页）。）。）。）。

AGT GAG TCG TAT TA C AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA C AA CGT CGT GAC TGG GAA AAC

TCA CTC AGC ATA AT G TTA AGT GAC CGG CAG CAA AAT G TT GC A GCA CTG ACC CTT TTG

T7 Promoter M13 Forward (-20) Primer

CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG CCC TATGGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC GGG ATA

Not I Xho I

PaeR7 IAva I

Nsi I Xba I Apa I

lacZ

F1

ori

+1P

Am

picillin

pU

Co

ri

Kanamycin

pCR®2.13.9 kb

GTA ACG GCC

CAT TGC CGG

GCC AGT GTG CTG GAA TTC GGC T

CGG TCA CAC GAC CTT AAG CCG A

T A A GCC GAA TTC TGCA T T CGG CTT AAG ACG

PCR Product

AGA TAT

TCT ATA

CAG GAA ACA GCT ATG AC C ATG ATT ACG CCA AGC T

GTC CTT TGT CGA TAC TG G TAC TAA TGC GGT TCG A

M13 Reverse Primer

lacZa ATG

TG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA

AC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT

Kpn I Sac I Spe IBamH IHind III

EcoR IEcoR IBstX I

BstX IEcoR V

Comments for pCR®2.1

3929 nucleotides

LacZa gene: bases 1-545

M13 Reverse priming site: bases 205-221

T7 promoter: bases 362-381

M13 (-20) Forward priming site: bases 389-404

f1 origin: bases 546-983

Kanamycin resistance ORF: bases 1317-2111

Ampicillin resistance ORF: bases 2129-2989

pUC origin: bases 3134-3807

下页待续

17

pCR®2.1 图谱和特征图谱和特征图谱和特征图谱和特征，，，，续前续前续前续前页页页页

pCR®2.1 的特征的特征的特征的特征 下表描述了 pCR®2.1 的特征。所有特征都经过功能验证。

特征特征特征特征 优点优点优点优点

lac 启动子 让细菌表达 lacZα片段，用于α互补（蓝白斑筛

选）。

lacZα 片段 编码β−半乳糖苷酶的前 146 个氨基酸。与Ω片

段顺势互补可以用于β−半乳糖苷酶的蓝白斑筛

选。

卡那霉素抗性基因 用于质粒在 E. coli 的筛选和保存，克隆具有

氨苄青霉素抗性的质粒作为模板的扩增产物时

使用。

氨苄青霉素抗性基因 用于质粒在 E. coli 的筛选和保存。

pUC 复制起始子 用于质粒在 E. coli 中的复制，保持和高拷贝

数。

T7 启动子和引物结合位点 用于体内或体外转录反义 RNA。

用于插入片段的测序。

M13 正向(-20) 和 M13 反向引

物结合位点 用于插入片段的测序。

f1 复制起始子 用于突变或单链测序中单链的获得。

18

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中国中国中国中国:::: 上海英骏生物技术有限公司上海英骏生物技术有限公司上海英骏生物技术有限公司上海英骏生物技术有限公司 北京经济技术开发区荣昌东街 7 号隆

盛工业园 203 邮编：100176 传真：010-6780 6536 技术支持热线：800 820 8982； cntechsupport@invitrogen.com 网址：cnservice.invitrogen.com

European Headquarters:European Headquarters:European Headquarters:European Headquarters: Invitrogen Ltd Inchinnan Business Park 3 Fountain Drive Paisley PA4 9RF, UK Tel: +44 (0) 141 814 6100； Tech Fax: +44 (0)141 814 6117 E-mail: eurotech@invitrogen.com

材料安全数据表材料安全数据表材料安全数据表材料安全数据表 (MSDSs)

MSDS 可以从我们的网站 www.invitrogen.com 获得。在主页点击技术资源技术资源技术资源技术资源

（（（（Technical ResourcesTechnical ResourcesTechnical ResourcesTechnical Resources）））），根据说明下载您需要的产品的 MSDS。

有限保证有限保证有限保证有限保证 Invitrogen 致力于为我们的客户提供高品质的产品和服务。我们的目标是用我们

的产品和服务保证每个客户的 100%满意。如果您对 Invitrogen 的产品或服务有任何疑虑，请联系我们的技术服务代表。 Invitrogen 保证我们所有的产品符合产品分析报告（COA）上的指标。公司将免费更换任何不符合这些指标的产品。Invitrogen 这一保证仅限于相关产品的费用。保证不适于超过效期的产品。保证不应用于未按照说明书上的保存条件正确保存的产品。Invitrogen 保留选择产品分析方法的权利，除非 Invitrogen 在接受订单之前书面同意使用特定的方法。 Invitrogen 尽全力保证其出版物的正确，但是认识到不可避免的偶尔会出现打字错误或其它错误。所以 Invitrogen 不对其出版物或文档的内容及其相关事宜提供保证。如果您发现我们的出版物有错误，请报告给我们技术服务代表。 InvitrogenInvitrogenInvitrogenInvitrogen 不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的不承担任何形式的连带损失包括但不限于特殊的，，，，偶然的偶然的偶然的偶然的，，，，间接的连间接的连间接的连间接的连带带带带损失损失损失损失。。。。以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性以上有限保证具有独立性和排他性。。。。我们不做任何其他的保证我们不做任何其他的保证我们不做任何其他的保证我们不做任何其他的保证，，，，无论是无论是无论是无论是直接表达的直接表达的直接表达的直接表达的，，，，暗示的保证还是任何商业利益的暗示的保证还是任何商业利益的暗示的保证还是任何商业利益的暗示的保证还是任何商业利益的，，，，特殊目的的保证特殊目的的保证特殊目的的保证特殊目的的保证。。。。

19

购买者须知购买者须知购买者须知购买者须知

不知道为什么这段没有翻译过来?

20

产品质量产品质量产品质量产品质量

限制性酶切限制性酶切限制性酶切限制性酶切 为了进行质量鉴定，酶切起始的超螺旋 pCR®2.1 质粒 TA 接头之前的限制性酶切位

点。酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析，条带必须正确。

克隆效率克隆效率克隆效率克隆效率 载体制备好之后，用试剂盒提供的对照试剂进行批次质量分析。用第 11-13 页的方

法，把 750bp 的对照 PCR 产物连接到 pCR®2.1，转化试剂盒中的 One Shot

® 化学感受

态。为了满足质量要求，必须符合以下质量标准：

• 自连：< 5%白色转化子

• PCR 产物连接：> 80%白色转化子

• 克隆效率: > 90%白色转化子含有插入正确 PCR 产物的 pCR®2.1

引引引引 物物物物 两个引物都已经通过批次质量鉴定，质量鉴定使用二缩酚酸链终止技术 DNA 测序的

方法。

One Shot ® 化学化学化学化学感感感感

受态受态受态受态 E. coli 所有的感受态细胞按照以下内容进行质量鉴定：

• 用试剂盒中提供的质粒检测感受态细胞的转化效率。转化产物涂布到含有 100

µg/ml 氨苄青霉素的 LB 平板，计算感受态效率。测试重复进行。转化效率需要

达到以下标准:

INVαF´ 1 x 108 cfu/µg DNA

TOP10F´1 x 109 cfu/µg DNA

TOP10 1 x 109 cfu/µg DNA

• 为了验证没有噬菌体污染，在 LB 顶层琼脂中加入 0.5-1 ml 感受态细胞，铺到

LB 平板上。过夜培养之后，应该检测不到空斑。

• 未转化的细胞铺到含有 100 µg/ml 氨苄青霉素，25 µg/ml 链霉素，50 µg/ml 卡

那霉素或 15 µg/ml 氯霉素的 LB 平板，验证细胞不含有抗生素抗性污染。

21

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下页待续

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