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Técnica de CGH-array
María Rodríguez-Rivera Laboratori de Citogenètica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Càncer-IMIM. Barcelona
• Introducción a los microarrays
• Arrays genómicos
• Condiciones del ADN
• Técnica de CGH-array
• Aplicaciones
Índice
Introducción
• ¿Qué es un microarray?
• Tipos de microarrays
Introducción
• ¿Qué es un microarray?
• Tipos de microarrays
• Mikro (del griego,pequeño) y array (del inglés,distribución ordenada)
• Colección de biomoléculas ordenadas en filas y columnas sobre un soporte sólido miniaturizado.
Introducción: ¿Qué es un microarray?
Introducción
• ¿Que es un microarray?
• Tipos de microarrays
• Tejido (TMA)
• Proteínas
• Células
• Genómicos
• Expresión
• miRNA
• Metilación
Introducción: Tipos de microarrays
• Tejido (TMA)
• Proteínas
• Células
• Genómicos
• Expresión
• miRNA
• Metilación
Introducción: Tipos de microarrays
Microarrays genómicos
Microarrays genómicos
• Colección de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte sólido que permiten detectar alteraciones en el genoma
• Tipos de microarrays genómicos:
– Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
– Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Microarrays genómicos
• Colección de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte sólido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
• Tipos de microarrays genómicos:
– Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
– Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
• Array de “oligos” comerciales:
- Oligonucleótido: secuencias pequeñas de ADN 50pb
- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM
- Diferentes formatos
- Microarrays “prefabricados” o custom
• Array de BACs:
- BAC: Bacterial Artificial Chromosome
- Puede ser “casero”
- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM
Microarrays genómicos: Arrays de CGH
Microarrays genómicos: Arrays de CGH
• Estudio de hibridación comparativa (ADN tumoral vs ADN control) que permite detectar ganancias y/o pérdidas de material genético
Microarrays de CGH
Microarrays genómicos
• Colección de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte sólido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
• Tipos de microarrays genómicos:
– Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)
– Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Microarrays genómicos: Arrays de SNPs
• Contiene además sondas de oligonucleótidos
correspondientes a variantes alélicas de SNPs seleccionados
(oligoarray).
• SNP ( Single nucleotide polymorphism ):
- Variación de la secuencia de ADN que afecta a una
sola base
- 1 SNP cada 1000 bases
Microarrays genómicos: Arrays de SNPs
• Permite obtener el número de copias de ADN y el
genotipo (señal de fluorescencia para cada alelo)
• Hibridación no competitiva:
- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan
en arrays independientes
- Posterior comparación de resultados
Microarrays de SNP
Microarrays genómicos: Arrays de SNPs
Pérdida de heterocigosidad sin cambio en el número de copias (CNN-LOH)
Importancia en genes supresores de tumores:
mutación heterocigota mutación homocigota
Genes supresores de tumores: p53
Mutación p53
Proliferación células anormales
CGH SNP Hibridación competitiva Hibridación no competitiva
Muestra y control en Muestra y control se hibridan
un mismo array por separado
Ganancias y pérdidas Ganancias y pérdidas
LOH
CGH vs SNP
• No detecta alteraciones equilibradas
• No detecta diferentes clones
• >30% células tumorales
CGH y SNP:Limitaciones
Protocolo técnico
arrays CGH
• ADN:
– Sangre periférica o médula ósea • Separación de poblaciones celulares (microbeads)
– Tejido en fresco
– Tejido congelado (OCT) • Micro-Macrodisección del tumor
– Parafina • Micro-Macrodisección del tumor
Microarrays genómicos: ADN
• Extracción automatizada
• Extracción manual
– Kits columnas
– Kit manual
ADN: Tipos de extracción
• Extracción automatizada
• Extracción manual
– Kits columnas
– Kit manual
ADN: Tipos de extracción
Preparación ADN
Marcaje
Hibridación
Lavados y secado
Escaneado
Análisis de datos
• Cantidad ADN:
– 500ng
• Calidad ADN:
– Espectofotómetro
ADN: Criterios de calidad
• Espectofotómetro: NanoDrop 1000
ADN: Criterios de calidad
• Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80
• Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80
Concentración
• Integridad ADN
ADN: Criterios de calidad
ADN no degradado ADN degradado (smear)
Preparación ADN
Marcaje
Hibridación
Lavados y secado
Escaneado
Análisis de datos
Marcaje del ADN
ADN tumoral
ADN control
Desnaturalización
Marcaje
Cy5 -dUTP Cy3 -dUTP
Marcaje del ADN
• Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN
• Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN
• Marcaje aleatorio (Random Priming)
Marcaje del ADN
• Marcaje aleatorio (Random Priming)
• Preparación del array e hibridación (muestra y control)
Hibridación
Muestra (Cy5)
Control (Cy3)
Hibridación
• Unimos el mixer con el array
Hibridación: Preparación del array
• Pipeteamos la muestra dentro del mixer
Hibridación
• Horneado
Hibridación
48-72h
Preparación ADN
Marcaje
Hibridación
Lavados y secado
Escaneado
Análisis de datos
• Lavados de astringencia
Lavados y secado
• Secado
Preparación ADN
Marcaje
Hibridación
Lavados y secado
Escaneado
Análisis de datos
• Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM
Escaneado del array
Preparación ADN
Marcaje
Hibridación
Lavados y secado
Escaneado
Análisis de datos
• Se obtiene una imagen con la lectura de los dos fluorocromos (Cy3 y Cy5)
• Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder analizar en forma de datos
Visualización de datos
Análisis
ADN tumoral > ADN control
Ganancia
ADN tumoral < ADN control
Pérdida
ADN tumoral = ADN control
Normal
• Software para la visualización de los datos
• Análisis paralelo con tablas de datos
Análisis de datos
• Software para la visualización de los datos
• Análisis paralelo con tablas de datos
Análisis de datos
Análisis de datos: Principios
Sonda
Cromosoma Ideograma Cariotipo molecular
Análisis visual: Ejemplos
DEVA
Análisis visual: Ejemplos
Nexus
Análisis visual: Ejemplos
Nexus
Ganancia
Pérdida
• Software para la visualización de los datos
• Análisis paralelo con tablas de datos
Análisis de datos
Análisis datos: Ejemplos
Nº sondas: > 5 Log2 Ratio: < - 0.2 (Pérdidas) > 0.2 (Ganancias)
Aplicaciones arrays genómicos
• Oncohematología – Diagnóstico
– Pronóstico
– Investigación
• Post-natal y Pre-natal – Síndromes asociados a ganancias/pérdidas de material genético:
• Deleciones: ej síndrome de Cri-du-chat (5p-)
• Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y (Sd.Turner, …)
• Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo
– Nuevos síndromes
Aplicaciones arrays genómicos
• Estudio de carcinomas de células renales (CCR) mediante arrays de CGH y cariotipo – N=24
• 16 CCR de células claras
• 5 CCR papilares
• 2 CCR cromófobos
• 1 Oncocitoma
• Tejido fresco: – Estudio citogenético
– Extracción ADN
Aplicaciones arrays genómicos: Ejemplos
Poster SEAP- 081. M.Salido
CCR-CC: Citogenética
45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14
CCR-CC: CGH-arrays
CCR-CC: CG vs CGH-arrays
• Buena herramienta complementaria
• Diferentes formatos
• Limitaciones
• Coste cada vez menor
Resumen
Laboratori de Citogenètica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Càncer-IMIM. Barcelona
Agradecimientos: Dra.Blanca Espinet Dra.Marta Salido Dra.Anna Puiggros Carme Melero Dra.Silvia de Muga Dra.Nuria Juanpere Dr.Josep Lloreta Dr.Josep Mª Corominas Prof.Sergi Serrano
Agradecimientos: