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Recherche de biomarqueurs des cellules propagatrices deglioblastome : étude de la signalisation calcique et du
protéome membranaireEmilie Audran
To cite this version:Emilie Audran. Recherche de biomarqueurs des cellules propagatrices de glioblastome : étude de lasignalisation calcique et du protéome membranaire. Biochimie, Biologie Moléculaire. Université deStrasbourg, 2012. Français. �NNT : 2012STRAJ046�. �tel-00767650�
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Remerciements
Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé à la Faculté de Pharmacie de Strasbourg au
sein du Laboratoire d’Innovation Thérapeutique dirigé par le Pr Marcel Hibert et de l’Equipe
de chimie biologie intégrative conjointement dirigée par le Pr Marcel Hibert et le Pr Jacques
Haiech. Ce travail a été effectué en collaboration avec la société Transgene, présidée par
Philippe Archinard, dans le département d’Immuno-pharmacologie dirigé par Ronald Rooke.
Je tiens à remercier ces personnes ainsi que toutes celles qui, de près ou de loin, ont été
associées à la mise en place de cette thèse et à mon accueil dans leurs laboratoires de
recherche.
Je souhaite également remercier toutes les personnes qui se sont impliquées de près ou de loin
dans ce projet, merci aux membres du jury pour le temps consacré à l’examen de mon travail
de thèse.
Un grand merci à Jacques Haiech pour m’avoir accueilli dans son laboratoire, avoir dirigé ma
thèse et m’avoir permis de participer à plusieurs congrès internationaux, à des rencontres avec
des entreprises, moments stimulants et très enrichissants, ainsi que pour m’avoir laissé
prendre le temps d’organiser le Forum BIOTechno. Un grand merci également à Ron Rooke
qui m’a fait découvrir Transgene et a fait de nombreuses démarches pour que je puisse
travailler librement dans son laboratoire.
Je remercie également l’ensemble des équipes dans lesquelles j’ai été accueillie en
commençant par l’équipe de chimie biologie intégrative, Marie-Claude, Maria, Jihu et Fanny
pour leur présence et sympathie. Un grand grand merci à Marie pour ses conseils et les
nombreux moments de discussion que nous avons eu autour d’un café, d’un repas ou au
laboratoire ; tu as brillamment passé ton doctorat malgré les moments de doutes et les
épreuves de cette dernière année ! Je suis sûre que tu trouveras un post-doc à la hauteur de tes
qualités de chercheuse et d’encadrante.
Merci à l’équipe de PCBIS dirigée par Pascal Villa et qui m’a accueillie quotidiennement.
Christel, Sophie et Adeline, merci pour votre accueil, votre disponibilité, votre grande
réactivité face aux problèmes techniques (vous devriez normalement avoir un peu moins
besoin de solliciter le service de maintenance de la Flex maintenant !), merci de m’avoir fait
une place dans votre bureau pendant plusieurs semaines. Adeline, je souhaite que ton
dévouement à ton travail se concrétise de la même façon que cela a pu se passer pour Sophie
et je vous souhaite à toutes les trois une très bonne continuation.
Merci à toutes personnes que j’ai pu côtoyer dans les laboratoires de Transgène, en particulier
à Mumu, Laëtitia, Caroline, Christelle et Nicolas pour m’avoir fait une place dans le
ii
laboratoire, m’avoir passé mes cellules au FACS, m’avoir appris à manipuler les souris et
surtout pour votre serviabilité, votre dynamisme, votre bonne humeur et votre joie de vivre !
Merci à l’équipe du laboratoire de spectrométrie de masse de Cronenbourg avec qui nous
avons collaboré pour l’étude protéomique et qui nous a fourni des résultats d’une excellente
qualité.
Un très grand merci également à Françoise et Marianne, les secrétaires de l’UMR, toujours
sollicitées, qui facilitent la vie de tout le monde au laboratoire et se démènent pour que l’on
obtienne nos remboursements.
Merci à l’équipe organisatrice du Forum BIOTechno de Strasbourg 2011, en particulier Marie
et Daniel, avec qui j’ai passé de nombreuses heures et journées à préparer cet évènement ; ces
moments furent pour moi une grande source de motivation, d’enrichissement et de fous rires.
Merci également aux membres du bureau du Réseau BIOTechno qui m’ont fait découvrir la
gestion d’une association nationale.
Enfin, un très grand merci à toutes les personnes qui m’ont encouragée et supportée bien
avant et tout au long de cette thèse, en particulier Déborah, Suzanne et Jean-Louis, Fabien et
Fanny, mes mamies, Déborah. Papa et Maman, Steve.
iii
Sommaire
REMERCIEMENTS ........................................................................................................................................... I
LISTE DES FIGURES, TABLEAUX ET ENCARTS ................................................................................................. VI
ABREVIATIONS ............................................................................................................................................. XI
AVANT‐PROPOS ........................................................................................................................................ XIV
CHAPITRE 1 : GLIOBLASTOMES ET CELLULES PROPAGATRICES DE TUMEUR .................................................... 1
I. LES GLIOBLASTOMES ...................................................................................................................................... 2
1. Description, classification ..................................................................................................................... 2
2. Traitements des glioblastomes .......................................................................................................... 18
3. Le dogme des Cellules Souches Cancéreuses ..................................................................................... 24
II. CELLULES PROPAGATRICES DE TUMEUR ............................................................................................................. 25
1. Historique : mise en évidence et isolation de cellules tumorigéniques .............................................. 25
2. Caractérisation des cellules propagatrices de glioblastome .............................................................. 29
3. Origine de la cellule génératrice de tumeur : hypothèses .................................................................. 47
4. Organisation et croissance de la tumeur ........................................................................................... 50
5. Mécanismes de résistance aux thérapies classiques .......................................................................... 68
III. VERS DE NOUVELLES VOIES THERAPEUTIQUES .................................................................................................... 72
CHAPITRE 2 : RECHERCHE DE MARQUEURS DE L’ETAT PHYSIOLOGIQUE DES CELLULES PROPAGATRICES DE
GLIOBLASTOME A TRAVERS LA SIGNALISATION CALCIQUE ET L’ETUDE DE LA CALMODULINE ....................... 78
I. SIGNALISATION CALCIQUE .............................................................................................................................. 79
1. Le calcium : de la toxicité au messager incontournable ..................................................................... 80
2. Éléments de la signalisation calcique ................................................................................................. 81
3. La Calmoduline : chef d’orchestre de la signalisation calcique ........................................................ 108
4. Utilisation d’inhibiteurs de CaM ....................................................................................................... 115
II. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DE PETITES MOLECULES CHIMIQUES INTERAGISSANT AVEC LA CALMODULINE ....... 120
1. Caractérisation de la liaison des sondes de CaM à SynCaM ............................................................ 120
2. Identification et caractérisation de petites molécules interagissant avec CaM ............................... 123
3. Intérêt physiologique des touches sélectionnées ............................................................................. 131
III. CARACTERISATION DE L’INTERACTION DE CAM AVEC SES CIBLES .......................................................................... 135
IV. UTILISATION DES MOLECULES INTERAGISSANT AVEC CAM POUR INHIBER LA LIAISON DE CAM AVEC SES CIBLES ............. 139
1. IC50 de déplacement des peptides liés à CaM par chaque molécule ................................................ 139
2. Classification des molécules et CaMBDs .......................................................................................... 139
V. PERTURBATION DE LA SIGNALISATION CALCIQUE DE CELLULES SELON L’ETAT PHYSIOLOGIQUE DE LA CELLULE ................. 144
1. Mesure de la concentration calcique intracellulaire ........................................................................ 144
iv
2. Caractérisation des effets des molécules sur l’homéostasie calcique de différents types cellulaires
146
VI. CONCLUSION ............................................................................................................................................ 158
CHAPITRE 3 : RECHERCHE DE MARQUEURS MEMBRANAIRES DES CELLULES PROPAGATRICES DE
GLIOBLASTOME ......................................................................................................................................... 163
I. INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 164
1. Les protéines membranaires : interface entre les milieux intra‐ et extracellulaire .......................... 164
2. Protéomes de cellules de glioblastomes .......................................................................................... 169
3. Protéomes de cellules souches de glioblastome .............................................................................. 170
II. ISOLATION ET IDENTIFICATION DES PROTEINES MEMBRANAIRES ........................................................................... 172
1. Isolation des protéines membranaires ............................................................................................. 172
2. Localisation cellulaire des protéines identifiées ............................................................................... 174
3. Sensibilité de détection des protéines .............................................................................................. 175
4. Expression différentielle du protéome membranaire ....................................................................... 176
III. CLUSTERS DE DIFFERENCIATION ET INTEGRINES ................................................................................................ 179
IV. PROTEOME CALCIQUE ................................................................................................................................. 183
1. Protéines S100, marqueurs de tumeurs ........................................................................................... 184
2. Protéines impliquées dans la régulation de l’homéostasie calcique ................................................ 185
V. CONCLUSION ............................................................................................................................................ 186
CONCLUSION GENERALE ............................................................................................................................ 189
MATERIEL ET METHODES ........................................................................................................................... 197
I. MATERIELS ............................................................................................................................................... 198
1. Composants chimiques .................................................................................................................... 198
2. Protéines, Peptides et Sondes .......................................................................................................... 198
3. Chimiothèques ................................................................................................................................. 199
II. METHODES ............................................................................................................................................... 199
1. Mesures spectroscopiques ............................................................................................................... 199
2. Mesures de polarisation de fluorescence (FP) .................................................................................. 200
3. Titration des sondes fluorescentes sur CaM à différentes concentrations calciques ....................... 200
4. Identification de molécules interagissant avec CaM par essai FP compétitif .................................. 201
5. Facteur Z’ ......................................................................................................................................... 201
6. Titration de molécules chimiques sur SynCaM par FP compétitif avec les sondes fluorescentes ..... 201
7. Titration de peptides fluorescents sur CaM à différentes concentrations calciques ........................ 202
8. Déplacement des peptides fluorescents par les molécules chimiques par essai FP compétitif ........ 202
9. Titration microcalorimétrique isothermique de composés sur SynCaM .......................................... 203
10. Mesure de l’index d’hydrophobicité de molécules par chromatographie (CHI) ............................... 203
v
11. Culture cellulaire .............................................................................................................................. 204
12. Essai de viabilité cellulaire ............................................................................................................... 206
13. Mesures du calcium cytosolique ...................................................................................................... 207
14. Extraction des membranes cellulaires (ghosts) ................................................................................ 208
15. Spectrométrie de masse ................................................................................................................... 208
ANNEXES ................................................................................................................................................... 209
I. ANISOTROPIE DE FLUORESCENCE ................................................................................................................... 210
II. CARACTERISATION DES MOLECULES INTERAGISSANT AVEC LA CALMODULINE .......................................................... 213
III. PEPTIDES ET CONSTANTES DE DISSOCIATION A CAM EN FONCTION DE [CA²+] ......................................................... 220
IV. DEPLACEMENT DES PEPTIDES LIES A CAM PAR CHAQUE MOLECULE – IC50 ............................................................. 221
V. MODIFICATION DE L‘HOMEOSTASIE CALCIQUE PAR DES ANTAGONISTES DE LA CALMODULINE – EC50 .......................... 222
VI. MODIFICATION DE L‘HOMEOSTASIE CALCIQUE PAR DES ANTAGONISTES DE LA CALMODULINE – RELATIONS EC50 / KI ..... 223
VII. ÉLEMENTS DU CALCIUM TOOLKIT IMPLIQUES DANS LES MECANISMES ON ET OFF DU SIGNAL CALCIUM ................... 224
VIII. « EF‐HANDOME » : PROTEINES POSSEDANT AU MOINS UN MOTIF EF‐HAND ..................................................... 231
IX. IDENTIFICATION DES PROTEINES MEMBRANAIRES – COMPARAISON BIBLIOGRAPHIQUE ............................................. 237
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................................................................. 239
PUBLICATIONS........................................................................................................................................... 279
vi
ListedesFigures,TableauxetEncarts
Figures
Figure 1: Régions germinales du cerveau humain adulte ........................................................................ 3
Figure 2: Neurogenèse adulte. ................................................................................................................. 4
Figure 3: Répartition des gliomes primaires du système nerveux central selon le type histologique. .... 5
Figure 4: Voies de progression des glioblastomes et altérations génétiques fréquemment associées. .... 8
Figure 5: Altérations génétiques fréquentes de 3 voies de signalisation critiques des glioblastomes
primaires. ............................................................................................................................................... 10
Figure 6: Voie de signalisation des récepteurs à tyrosine kinase. ......................................................... 11
Figure 7: Classification de Verhaak. ..................................................................................................... 14
Figure 8: Biogenèse et mode d’action des microRNAs. ....................................................................... 15
Figure 9: Classification des glioblastomes primaires selon leur profil d’expression de microRNAs. .. 17
Figure 10: Protocole de Stupp. .............................................................................................................. 19
Figure 11 : Structure du Témozolomide et activation de l’ion méthylant. ............................................ 20
Figure 12: Altération de l’ADN et apoptose induites par le Témozolomide. ........................................ 21
Figure 13 : Structure de la Carmustine. ................................................................................................. 22
Figure 14: Essais cliniques sur les glioblastomes. ................................................................................. 23
Figure 15: Régénération de la tumeur par les cellules souches cancéreuses. ........................................ 24
Figure 16 : Mise en évidence des cellules souches cancéreuses. .......................................................... 26
Figure 17 : Isolation de cellules souches cancéreuses à partir de biopsies de tumeurs solides. ............ 28
Figure 18 : Analyse du caryotype des cellules propagatrices de glioblastome. .................................... 29
Figure 19 : Acquisition d’aberrations chromosomiques numériques et/ou structurelles. ..................... 30
Figure 20 : Voies de signalisation altérées dans les gCSCs. ................................................................. 31
Figure 21 : Modifications épigénétiques : méthylation des histones. .................................................... 36
Figure 22 : Contribution de l’EMT dans la progression de la cancérisation. ........................................ 40
Figure 23 : EMT et plasticité cellulaire. ................................................................................................ 41
Figure 24 : Origine des CSCs. ............................................................................................................... 50
vii
Figure 25 : Modèles de croissance tumorale ......................................................................................... 53
Figure 26 : Formation de microvésicules et exosomes. ........................................................................ 56
Figure 27 : Voies de communication intercellulaires régulées par TGF dans un contexte tumoral. ... 58
Figure 28 : Effet Warburg. .................................................................................................................... 62
Figure 29 : Interactions de la cellule souche cancéreuse avec les cellules de la niche immunitaire. .... 65
Figure 30 : Microenvironnement tumoral et interactions entre les différentes cellules. ....................... 67
Figure 31 : Mécanismes de résistance des gCSCs aux radio- et chimiothérapies. ................................ 68
Figure 32 : Cycle cellulaire et transitions de phases. ............................................................................ 73
Figure 33: Régulation de l’homéostasie calcique de la cellule. ............................................................ 81
Figure 34: Schématisation des premiers systèmes utilisant le Ca²+ comme messager cellulaire. ......... 82
Figure 35 : Protéines liant Ca²+ avec un motif EF-hand. ....................................................................... 84
Figure 36: Schématisation des 4 unités fonctionnelles du signal Ca²+ des premiers systèmes de
signalisation calcique, I. ........................................................................................................................ 85
Figure 37: Schématisation des 4 unités fonctionnelles du signal Ca²+ des premiers systèmes de
signalisation calcique, II. ....................................................................................................................... 87
Figure 38 : Structures de la Calmoduline. ............................................................................................. 89
Figure 39: Compartimentation de la cellule eucaryote et complexification de la signalisation calcique.
............................................................................................................................................................... 90
Figure 40: Modulation du signal calcium par les protéines tampon. ..................................................... 93
Figure 41: Régulation du signal calcium par les protéines activées par la Calmoduline. ..................... 94
Figure 42: Représentation des principaux effecteurs des mécanismes ON et OFF dans la cellule. .... 104
Figure 43 : Du « calcium toolkit » à l’empreinte calcique d’une cellule. ........................................... 106
Figure 44: Aspects spatio-temporels d’un signal calcique. ................................................................. 107
Figure 45 : Modèle séquentiel de liaison du Ca²+ à CaM. ................................................................... 110
Figure 46 : Structures de la Calmoduline liée à différentes cibles. ..................................................... 111
Figure 47 : Interaction de la Calmoduline avec ses cibles en fonction du nombre d’ions calcium liés à
la Calmoduline. ................................................................................................................................... 114
Figure 48 : Mécanismes d’activation de protéines par la Calmoduline. ............................................. 115
viii
Figure 49: Stratégie appliquée pour identifier de potentiels marqueurs de l’écosystème calcique d’une
cellule. ................................................................................................................................................. 119
Figure 50 : Structure des sondes fluorescentes de CaM sélectionnées lors d’un criblage de molécules
fluorescentes. ....................................................................................................................................... 120
Figure 51 : Constantes apparentes de dissociation Kapp des sondes S1, S2, S3 et S4 titrées sur
SynCaM en fonction de la concentration en Ca²+. .............................................................................. 121
Figure 52 : Modèle séquentiel de la liaison des sondes ou de peptides fluorescents à la Calmoduline.
............................................................................................................................................................. 122
Figure 53 : Criblage compétitif par anisotropie de fluorescence sur le complexe SynCaM – S1. ...... 124
Figure 54 : Courbes de titration des molécules interagissant avec CaM des familles amino-alkyl
pyridazine et triazine par compétition avec la sonde S1. .................................................................... 127
Figure 55 : Sites de liaison des molécules sur la Calmoduline. .......................................................... 128
Figure 56 : Courbes de titration calorimétrique isothermique de SynCaM avec différentes molécules
interagissant avec CaM. ...................................................................................................................... 129
Figure 57 : Disponibilité biologique des molécules – Valeurs CHI .................................................... 132
Figure 58 : Toxicité des composés sur les cellules TG01 et HEK. ..................................................... 134
Figure 59 : Interaction des peptides avec CaM selon le nombre d’ions Ca²+ liés à CaM.................... 136
Figure 60 : Classification des CaMBDs et des molécules interagissant avec CaM selon la capacité
(IC50) de chaque molécule à inhiber chaque complexe CaM – CaMBD. ............................................ 141
Figure 61 : Déplacement des CaMBDs liés à CaM selon l’antagoniste utilisé et la conformation de
CaM. .................................................................................................................................................... 143
Figure 62 : Influence de la sonde calcique sur le signal calcium et comparaison avec le signal transmis.
............................................................................................................................................................. 145
Figure 63 : Types de modification de l’homéostasie calcique observés après l’ajout de composés
interagissant avec CaM sur les cellules. .............................................................................................. 148
Figure 64 : Comparaison des modifications de l’homéostasie calcique induites par des antagonistes de
CaM selon les CaMBDs ciblés. ........................................................................................................... 150
Figure 65: Comparaison des valeurs d’EC50 et de Ki obtenues dans chaque type cellulaire par
différents composés selon leur famille chimique et le type de réponse induite. ................................. 153
Figure 66 : Formation de métastases. .................................................................................................. 166
Figure 67 : Ghosts membranaires. ....................................................................................................... 173
ix
Figure 68 : Répartition des protéines identifiées par spectrométrie de masse dans les différents
échantillons. ......................................................................................................................................... 174
Figure 69 : Expression des protéines membranaires dans les différents types cellulaires. ................. 177
Figure 70 : Répartition des protéines surexprimées selon les processus biologiques impliqués. ........ 178
Figure 71 : Expression des CDs dans les différents types cellulaires. ................................................ 180
Figure 72 : Expression des protéines impliquées dans la signalisation calcique. ................................ 183
Figure 73 : Structure du composé LPS 01-08-L-G06, famille des chalcones. .................................... 188
Figure 74 : Structure des composés LPS 02-20-L-B05 et LPS 02-20-L-C04 ..................................... 192
Figure 75 : Alignement des séquences de la Calmoduline. ................................................................. 198
Figure 76 : Cellules en culture. ........................................................................................................... 204
Figure 77 : Principe de mesure d’anisotropie ou de polarisation de fluorescence. ............................. 211
Figure 78 : Principe de criblage à haut débit par mesure d’anisotropie de fluorescence. .................. 212
x
Tableaux
Tableau 1: Classification des astrocytomes selon l’OMS. ...................................................................... 6
Tableau 2 : Altérations génétiques des Glioblastomes primaires et secondaires. ................................... 9
Tableau 3 : Modèles animaux de glioblastomes établis par mutations génétiques. .............................. 48
Tableau 4 : Constantes d’association de l’interaction de SynCaM avec les sondes à différents degrés
de saturation calcique. ......................................................................................................................... 122
Tableau 5 : Familles chimiques des antagonistes de la Calmoduline. ................................................. 126
Tableau 6 : Paramètres thermodynamiques de la liaison à SynCaM des molécules interagissant avec
CaM. .................................................................................................................................................... 130
Tableau 7 : Molécules induisant une modification de l’homéostasie spécifique d’un type cellulaire
donné ................................................................................................................................................... 150
Tableau 8: Répartition des molécules selon les groupes d’EC50 pour les réponses transitoire et
permanente dans les différents types cellulaires. ................................................................................ 156
Tableau 9 : Molécules ayant un comportement différent dans un nombre restreint de types cellulaires
............................................................................................................................................................. 157
Tableau 10 : Comparaison des niveaux d’expressions transcriptomique et protéomique de 3 RCPGs.
............................................................................................................................................................. 176
Encarts
Encart 1 : microRNAs ........................................................................................................................... 15
Encart 2 : Transition épithéliamo-mésenchymateuse (EMT) ................................................................ 40
Encart 3 : Signature ES ......................................................................................................................... 46
Encart 4 : Motif EF-hand ....................................................................................................................... 83
Encart 5 : Protéines tampon ................................................................................................................... 91
Encart 6 : Formation de métastases ..................................................................................................... 165
Encart 7 : Gene Onthology .................................................................................................................. 175
xi
Abréviations
ABC ATP binding cassette
ADN Acide desoxyribonucléique
aNSCs Adult neural ntem cells
ARC Canal sensible à l'acide arachidonique
ARN Acide ribonucléique
ARNm ARN messager
ATM Ataxia telengectasia mutation
ATP Adenosine tri phosphate
bFGF Basic fibroblast growth factor
C1P Ceramide 1 phosphate
Ca(V) voltage dependant calcium channel
cADPR Adénosine diphosphate reibose cyclique
CaM Calmoduline
CaMBD CaM binding domain
CaMK Calmodulin dependant kinase
CaMKK Calmodulin kinase kinase
CD Cluster de différenciation
CHI Chromatrographic hydrophobicity index
Chk checkpoint kinase
CICR Calcium induced calcium release
CNG Canal sensible aux nucléotides cycliques
CRAC Canal activé par le relargage du Ca²+ de l'ER
CSCs Cancer stem cells
DAG Diacyglycerol
DAPK Death associated protein kinase
DISC Death inducing signalling complex
EGF Epidermal growth factor
EGFR Epidermal growth factor receptor
EMMPRIN Extracellular matrix MMP inducer
EMT Epitheliamo‐mesenchymal transition
ER Endoplasmic reticulum
ES Embryonic stem (cells)
FP Fluorescence polarisation
GAD Glutamate decarboxylase
gCSCs Glioblastoma cancer stem cells
GDNF Glial cell line‐derived neutrophic factor
GDNFRalpha1 GDNF receptor alpha 1
GFAP Glial fibrillary acidic protein
GPCR Récepteur couplé aux protéines G
HDGF Hepatoma derived growth factor
HEK Human embryonic kidney (cells)
HIF‐1alpha Hypoxia inducible factor 1 alpha
xii
HSCs Haematopoietic stem cells
Hsp90 Heat shock prtein 90
IDH1 Isocitrate déshydrogénase 1
IL Interleukine
InsP3 Inositol 1,4,5‐triphosphate
IP3R Insp3 receptor
ITC Isothermic calorimetric titration
KCa Canal potasique calcium dépendant
LSCs Leukemia stem cells
MCT Mono carboxylic transporteur
MDR Mutlidrug resistance
MGMT Methylguanine‐DNA methyltransferase
MHC Complexe majeur d'histocompatibilité
miRNA micro ARN
MLCK Chaine légère de la myosine
MMP Métalloprotéase
MMR Mismatch repair
mNCX Mitochondiral NCX
NAADP Acide nicotinique adénine dinucleotide phosphate
NAD Nicotinamide adénine dinucléotide
NADP NAD phosphorylé
NCID Notch intracellular domain
NCKX ATPase Na+/K+ dépendante
NCX Echangeur Ca²+/Na+
nH Nombre de Hill
NMDAR N‐méthyl‐D‐aspartate receptor
OMS Organisation Mondiale de la Santé
PDB Protein Data Bank
PDE1A Phosphodiesterase 1A
PDGFR Platelet derived growth factor receptor
PHK Phosphorylase kinase
PI3K Phosphoinositide 3 kinase
PLC Phospholipase C
PMCA Pompe calcique de la membrane plasmique
PtdInsP2 Phosphatidylinositol 4,5‐biphosphate
PTEN Phosphatase and Tensin homolog
PTP Pore de perméabilité de potentiel membranaire
PV Parvalbumine
Rb Retinoblastoma
RE Récepteur à l'estrogène
ROC Receptor operated channel
ROS Reactive oxygen species
RTKs Récepteurs à tyrosine kinase
RyR Ryanodine receptor
S1P Sphingosine‐1‐phosphate
SCaMPER Canal sensible aux sphingolipides
xiii
SDF1 Stromal derived factor 1
SERCA Pompe calcique de l'ER
Shh Sonic Hedgehog
siRNAs Small interferent RNAs
SMOC Second messenger operated channel
SOB Sequenced and ordered binding (model)
SOC Stock operated channel
SOCE Stock operated calcium entry
SPCA Pompe calcique du Golgi
STIM Stromal interaction molecule
TCGA The Cancer Genome Atlas
TFP Trifluoperazine
TG Tumor generating
TGF Tumor growth factor
TGNM tumeur glioneuronal maligne
Tmz Temozolomide
TNFAIP3 Tumor necrosis factor‐alpha‐induced protein 3
TP Two pore channel, sensible au métabolisme cellulaire
TRP Transient receptor potential
VEGF Vascular endothélial growth factor
VOC Voltage operated channel
xiv
Avant‐Propos
Les glioblastomes primaires sont des tumeurs du système nerveux central au pronostic
défavorable. L’échec des thérapies actuelles est notamment lié à la résistance de certaines
cellules tumorales aux traitements, combinée à la sensibilité du tissu sain et au caractère
infiltrant de ce type de tumeur. Au cours des 20 dernières années, des cellules particulières
ont été mises en évidence dans plusieurs types de tumeurs, dont les glioblastomes : les
cellules souches cancéreuses (CSCs). Ces cellules sont actuellement l’objet d’une attention
toute particulière car elles permettraient d’expliquer l’échec des thérapies anti tumorales
(Dick, 2008).
En effet, ces CSCs, à l’instar des cellules souches normales, ont des capacités de divisions
symétriques et asymétriques, une vitesse de prolifération faible ainsi qu’une capacité à
régénérer l’ensemble de la tumeur après xénogreffe malgré leur très faible représentativité au
sein de la tumeur (moins de 1 %). Ces cellules sont par ailleurs radio- et chimiorésistantes aux
traitements classiques visant principalement les cellules formant la masse tumorale (Bao et
al., 2006a). Le développement de nouvelles stratégies permettant d’éradiquer spécifiquement
ces CSCs est donc primordial (Reya et al., 2001).
À ce jour, différents marqueurs ont été proposés afin de caractériser et/ou de cibler ces CSCs
(Beier et al., 2007; Blazek et al., 2007) mais il s’avère qu’aucun d’entre eux ne permet de
sélectionner spécifiquement les cellules souches de glioblastome (gCSCs) (Patru et al., 2010).
D’autre part, le signal calcium contrôle de nombreux processus cellulaires tels que la
prolifération, la différenciation, la mort cellulaire, la migration, le métabolisme… à travers sa
traduction en évènements biochimiques par des protéines senseurs du signal calcium (Haiech
et al., 2011) ; cette signalisation est modifiée dans les cellules tumorales. Parmi les senseurs
calciques, la Calmoduline joue un rôle central et sa perturbation par des molécules chimiques
permet de générer un signal calcium en absence de stimulus extérieur ; ce signal constitue une
empreinte caractéristique de l’appareillage moléculaire responsable de la signalisation
calcique (calcisomes) d’une cellule dans un état physiologique donné (Dagher et al., 2009).
L’objectif de ce travail de thèse est de déterminer des biomarqueurs des gCSCs permettant de
cibler ces cellules et de caractériser leur état physiologique. Pour cela, le travail a été organisé
sur deux axes principaux :
xv
- L’identification et la caractérisation d’antagonistes de la Calmoduline permettant de
générer une signature calcique spécifique des gCSCs
- L’identification de protéines exprimées exclusivement ou surexprimées à la surface
des gCSCs
Dans le Chapitre 1 de ce mémoire, nous présenterons les glioblastomes, leur classification
selon différents critères et les traitements actuels. Nous aborderons ensuite l’état des
connaissances actuelles de la biologie des gCSCs depuis leur découverte jusqu’à la mise en
évidence de certaines de leurs propriétés leur permettant de résister aux thérapies actuelles en
passant par leur caractérisation, leur mode de croissance, leur probable origine et leur rôle
central dans l’organisation de l’organe tumoral. Nous verrons également que cet ensemble de
propriétés des gCSCs leur confère une remarquable plasticité ainsi qu’une étonnante capacité
à s’adapter aux changements ou agressions de leur environnement. Ce dernier point justifie la
nécessité d’une multithérapie afin de pouvoir éradiquer ces cellules.
Dans le Chapitre 2, nous nous intéresserons à identifier des molécules chimiques capables de
perturber différentiellement l’homéostasie calcique des gCSCs afin de les sensibiliser aux
traitements thérapeutiques. Pour cela, nous nous attacherons tous d’abord à donner une vue
aussi globale que possible de la régulation de la signalisation calcique et de l’importance de
la Calmoduline, de la remarquable capacité de cette protéine à décoder le signal calcium pour
le traduire en évènements biochimiques à travers son interaction finement régulée avec une
pléthore de protéines. Cette introduction permettra également de mettre en évidence la
nécessité d’identifier un panel de molécules capables d’interagir différentiellement avec la
Calmoduline, ce à quoi nous nous attacherons dans une deuxième partie. Dans une troisième
partie, nous caractériserons l’interaction de la Calmoduline avec quelques-unes de ses cibles
afin de mieux comprendre, dans une quatrième partie, la capacité des antagonistes
présélectionnés à inhiber l’activation des cibles de la Calmoduline. Enfin, nous étudierons la
capacité de ces antagonistes à perturber l’homéostasie calcique des gCSCs ainsi que
d’autres types cellulaires. Cette perturbation sera caractérisée et comparée sur différents
points et permettra d’identifier des molécules révélatrices de l’état physiologique particulier
des gCSCs.
Dans le Chapitre 3, nous nous intéresserons à l’identification de protéines membranaires
exprimées spécifiquement dans les gCSCs en attachant une importance particulière aux
xvi
clusters de différenciation des cellules immunitaires et aux protéines impliquées dans
l’homéostasie calcique. Cette étude nous permettra d’identifier des protéines spécifiques des
gCSCs et jusqu’à présent jamais rapportées dans le cadre de CSCs.
L’identification de ces deux types de marqueurs des gCSCs devrait permettre de les utiliser i)
en tant qu’outils de recherche afin de mieux caractériser l’état physiologique de ces cellules,
ii) en tant qu’outils de diagnostic ou de suivi d’un traitement et iii) en tant qu’outils
thérapeutiques potentiels.
1
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
Chapitre1
GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
2
I. LesGlioblastomes
1. Description,classification
1.1. Organisationducerveauetneurogenèseadulte
Différents types cellulaires composent le cerveau :
- Les neurones (environ 100 milliards) dont les corps cellulaires forment la substance
grise et les prolongements cytoplasmiques forment la substance blanche
- Les cellules gliales qui assurent la nutrition et le soutien des neurones
Les neurones sont constitués de dendrites, receveurs de signaux extracellulaires, d’un soma,
permettant l’intégration des différentes informations, et d’axones, permettant la transmission
d’informations par conduction, propagation et transmission d’un signal nerveux. On distingue
plusieurs types de neurones selon leur morphologie et fonction :
- les neurones sensitifs ou bipolaires (1 %) portent les informations des récepteurs
sensoriels au système nerveux central
- les neurones moteurs ou multipolaires (10 %) portent les informations du système
nerveux central aux cellules musculaires ou glandes. Parmi ces neurones, on trouve les
cellules de Purkinje, les cellules pyramidales du cortex cérébral et les neurones du
cortex cérébelleux
- les interneurones ou cellules pseudopolaires permettent les connexions entre les
neurones du système nerveux central. Ils ont deux axones, l’un communiquant avec la
moelle épinière et l’autre avec la peau ou le muscle
Les cellules gliales constituent environ 90 % des cellules du cerveau. Il s’agit d’un ensemble
hétérogène de cellules composé en majorité d’astrocytes, d’oligodendrocytes et de cellules
microgliales. Contrairement aux neurones, les cellules gliales peuvent se multiplier et sont
impliquées dans les tumeurs cérébrales. Les astrocytes constituent, en association avec les
cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, la barrière hématoencéphalique.
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
6
Tableau 1: Classification des astrocytomes selon l’OMS. La classification de l’OMS distingue 4 grades d’astrocytomes selon des critères histologiques, le grade IV étant le plus agressif et de plus sombre pronostic.
1.2.2. Classificationdel’HôpitalSteAnne
Même si elle reste la première classification utilisée, la classification de l’OMS fait l’objet de
controverses, car basée essentiellement sur des données histologiques et manquant parfois de
reproductibilité. La classification de l’Hôpital Sainte-Anne complète cette classification en
s’appuyant sur des données d’imagerie. Cette classification permet de définir la structure
spatiale des gliomes, de préciser leur mode de croissance et de redéfinir certains critères de
diagnostic. Elle permet de distinguer 3 catégories de gliomes parmi les gliomes infiltrants : les
oligodendrogliomes (ou oligoastrocytomes) de grade A ou B et les glioblastomes (Daumas-
Duport et al., 2000).
Cette classification découle de l’étude de biopsies étagées stéréotaxiques basées sur le scanner
ou l’IRM, initialement réalisées afin de définir un volume cible, i.e. les limites de la tumeur,
pour le traitement par curie thérapie. Les informations qui ont ainsi pu être acquises sur le
mode de croissance des gliomes, infiltrant et/ou solide, et la traduction de ces 2 composantes
en imagerie se sont avérées capitales pour en préciser le type histologique. L’acquisition
d’images IRM / scanner se fait par injection d’un produit de contraste permettant de révéler le
réseau capillaire (prise de contraste) ; les composantes de cellules tumorales isolées ne
prennent pas le contraste mais, par l’intermédiaire de l’œdème qui leur est généralement
Grade Caractéristiques
I Astrocytomes pylocytiques localisés principalement au niveau du cervelet et des voies optiques Astrocytomes sous‐épendymaires à cellules géantes
II Tumeurs inflitrantesAstrocytes bien différenciés (de type fibrillaire, protoplasmiques, gémistocytique) Densité cellulaire faible ou modérée Absence de mitose
III Plages d’anaplasie focales ou diffusesAugmentation de la densité cellulaire Pléomorphisme cellulaire Atypies nucléaires Pas de nécrose ni de néo‐vascularisation
IV Forte densité cellulaire, pléomorphisme cellulaireMitoses typiques ou atypiques Prolifération vasculaire endothéliale Zones de nécrose
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
7
associé, elles se traduisent au scanner par une hypodensité et en IRM par un hyper signal. La
classification Ste Anne est établie en fonction des paramètres suivants :
- Gliome ne prenant pas le contraste à l’IRM : il s’agit très probablement d’un
oligoastrocytome de grade A
- Gliome prenant le contraste, i.e. angiogenèse associée à une tumeur astrocytaire : il
peut s’agir d’un oligoastrocytome de grade B ou d’un glioblastome
o Si la prise de contraste est modérée, plus ou moins multicentrique et l’hyper
signal présente des contours bien délimités, il s’agit probablement d’un
oligoastrocytome de grade B. En général, dans ce type de gliome, les premiers
symptômes surviennent avant l’âge de 45 ans
o Si la prise de contraste est unique, en anneau entouré d’un œdème et que le
patient est âgé de plus de 45 ans, un glioblastome sera fort probable. Ce
diagnostic est confirmé en présence d’une composante de tissu tumoral
présentant une différenciation astrocytaire certaine et exclusive et grâce à
l’aspect cytologique non oligodendroglial de la composante de cellules
tumorales isolées. On observe également une zone de nécrose
La classification de Ste Anne ajoute à la classification de l’OMS une étude macroscopique de
la tumeur, évitant ainsi les erreurs de diagnostic dû à la non-représentativité des échantillons
tumoraux. Cependant, dans un souci de cohérence par rapport à la littérature, nous nous
référerons dans ce manuscrit à la classification de l’OMS.
1.3. DéveloppementdesGlioblastomesetaltérationsgénétiquesmajeures
Parmi les gliomes de grade IV, on distingue les glioblastomes secondaires, évolution des
grades inférieurs, des glioblastomes primaires ou de novo, beaucoup plus agressifs (Scherer,
1940). Bien que ces 2 types de glioblastomes se présentent de la même façon au niveau
histologique, leur évolution est totalement différente (Figure 4), touchant des patients d’âges
différents, se développant par le biais de mutations génétiques différentes (Tableau 2),
montrant des profils d’expression d’ARNm ou de protéines différents, et pouvant différer
dans la réponse aux chimio-et radiothérapies.
Figure 4: L’étude ded’astrocytoaltérations
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
9
mutation de PTEN, perte d’hétérozygotie (LOH) pour le chromosome 10 (Rasheed et al.,
1995).
Tableau 2 : Altérations génétiques des Glioblastomes primaires et secondaires. Les glioblastomes primaires (GBM 1) sont issus de novo par toute une série de mutations. Les glioblastomes secondaires (GBM 2) sont issus de l’évolution d’astrocytomes grades II ou III et partagent la mutation du gène IDH1 avec les oligodendrogliomes, suggérant une origine commune. Tableau réalisé d’après Ohgaki and Kleihues, 2009.
The Cancer Genome Atlas (TCGA) regroupe près de 600 échantillons de biopsies de
glioblastomes dont 206 ont été analysés à différents niveaux : nombre de copies et
Gene
Fréquence des altérations (%) Ref
GBM 1 GBM 2
Amplification
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
39 0 1
36 8 2
40‐60 10 3
MDM2 Murine Double Minute 2 7 0 4
Délétion
PTEN Phosphatase and Tensin homolog 25 4 2
CDKN2A‐P14ARF
Cyclin‐Dependent Kinase Inhibitor 2A 44 44 2
CDKN2A‐P16INK4A
Cyclin‐Dependent Kinase Inhibitor 2A 31‐32 13‐19 2
36 4 5
LOH
10q (dont PTEN) Phosphatase and Tensin homolog 70 63 6
13q (dont RB1) Retinoblastoma 1 12 38 6
22q (dont TIMP3) TIMP metallopeptidase inhibitor 3 41 82 7
19q 54 6 6
Méthylation du promoteur
MGMT O6‐MethylGuanine‐DNA‐MethylTransferase 43 73 8
CDKN2A‐P14ARF
Cyclin‐Dependent Kinase Inhibitor 2A 6 31 2
CDKN2A‐P16INK4A
Cyclin‐Dependent Kinase Inhibitor 2A 3 19 2
NDRG2 N‐myc downstream‐regulated gene 2 62 0 8
PTEN Phosphatase and Tensin homolog 9 82 9
RB1 Retinoblastoma Protein 1 14 43 10
TIMP3 TIMP metallopeptidase inhibitor 3 28 71 7
Mutation
IDH1 Isocitrate Deshydrogenase 1 4‐12 73‐88 11, 12
PTEN Phosphatase and Tensin homolog 25‐40 4 2, 13
TP53 Tumor Protein p53 28‐29 65 2, 13
1. Tohma et al., 1998. J Neuropathol Exp Neurol 57, 684. 2. Ohgaki et al., 2004. Cancer research 64, 6892. 3. Kanu et al., 2009. Clin Med Oncol 3, 39. 4. Kleihues et al., 1999. Neuro Oncol 1, 44. 5. Biernat et al., 1997. Acta neuropathologica 94, 303. 6. Nakamura et al., 2000. J Neuropathol Exp Neurol 59, 539. 7. Nakamura et al., 2005. Lab Invest 85, 165.
8. Zawlik et al., 2009. Neuroepidemiology 32, 21. 9. Wiencke et al., 2007. Neuro Oncol 9, 271. 10. Nakamura et al., 2001. Lab Invest 81, 77. 11. Parsons et al., 2008. Science 321, 1807. 12. Yan et al., 2009. N Engl J Med 360, 765. 13. Zheng et al., 2008. Nature 455, 1129.
méthyla
mettre
glioblas
activées
PI3K/Ak
p53 et c
Figure 5: Mutations éléments rfoncés pouencadrés cconcernée
Les réce
(platelet
TGFα (
amplifié
Chap
ation de gèn
en évidenc
stomes poss
s par les R
kt-PKB/mT
celle de Rb (
Altérations gé et variations drouges indiquenur ces 2 jeux dcorrespondent (TCGA, 2008)
epteurs des
t derived g
(tumor grow
és, surexpri
pitre1:Glio
nes, transcri
ce 3 voies
sèdent au m
RTKs (récep
TOR) regrou
(Retinoblas
énétiques fréqudu nombre de nt une altératiode couleurs corà la fréquence ).
facteurs de
growth fact
wth factor α
imés et mut
oblastomes
iptome et m
de signali
moins une alt
pteurs à tyr
upées sous
stoma) (TCG
uentes de 3 voicopies des com
on activatrice errespondent auxdes tumeurs p
croissance
tor receptor
α) et PDGF
tés (activatio
setCellules
microRNAs.
isation fréq
tération dan
rosine kinas
la voie de
GA, 2008).
ies de signalisamposants des vet les éléments ux altérations leprésentant au m
EGFR (epi
r) et leurs
F (platelet d
on constitut
sPropagatr
Cette étud
quemment
ns l’une des
se : PLC-g/
signalisatio
ation critiques dvoies de signali
bleus une altées plus fréquenmoins l’une de
idermal grow
ligands EG
derived grow
tive des réc
ricesdeTu
e à grande
affectées (
s 3 voies) (F
/PKC, RAS
n de RTK/R
des glioblastomisation RTK/RAération inhibitrintes. Les pources altérations de
wth factor r
GF (epiderm
wth factor),
cepteurs) da
umeur
échelle a pe
(plus de 78
Figure 5) : l
S/Raf/MEK/
RAS/PI3K,
mes primaires.AS/PI3K, p53 ice ; les élémenentages indique la voie de si
receptor) et
mal growth
, sont fréqu
ans les gliom
10
ermis de
8 % des
les voies
/ERK et
celle de
. et RB. Les nts les plus és dans les ignalisation
PDGFR
factor),
uemment
mes. Les
récepteu
facteurs
culture
signalis
des plu
augmen
signalis
différen
apoptoti
Figure 6: L’hyperacconstitutivl’inhibition
Chap
urs tyrosine
s de croissan
in vitro de
ation de l’E
s caractéris
ntent l’activ
ation inter
nciation, la
ique (Carra
Voie de signalctivité des réceve (EGFRVIII), pn de l’apoptose
pitre1:Glio
e kinase (R
nce, dont l’
es gCSCs (
EGFR à tra
sées dans le
vation de c
rvient dan
a proliférat
acedo and Pa
lisation des récepteurs tyrosinepromeut la cro
e via la voie PI3
oblastomes
RTKs) sont
EGF et le b
Lee et al.,
avers la voie
es glioblast
cette voie d
ns de mu
tion, l’ang
andolfi, 200
cepteurs à tyroe, kinase EGF
oissance cellula3K/AKT.
setCellules
t les média
bFGF (basic
2006a). Pa
e PI3K (ph
tomes où de
de signalisa
ultiples pro
giogenèse,
08) (Figure
osine kinase. FR et PDGFR aire, l’angiogen
sPropagatr
ateurs de c
c fibroblast
armi les vo
hosphoinosi
es mutation
ation (Choe
ocessus do
l’invasivité
6).
suite à la liainèse via la voie
ricesdeTu
cytokines o
growth fac
oies de sign
itide 3 kina
ns / amplifi
e et al., 20
ont la sur
é ou enco
ison de leur li RAS/MEK/ER
umeur
oncogénique
ctor) utilisés
nalisation R
ase) / Akt, e
ications de
003). Cette
rvie cellul
ore l’échap
igand ou leur RK et la survie
11
es et de
s dans la
RTKs, la
est l’une
l’EGFR
voie de
laire, la
ppement
expression e cellulaire,
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
12
1.4. Classificationmoléculairedesglioblastomes
L’étude des altérations génétiques permet d’identifier deux sous-groupes de glioblastomes
d’origines très différentes et montre la limite de la classification de l’OMS en 4 grades.
Cependant malgré la distinction glioblastome primaire / glioblastome secondaire, les
glioblastomes primaires sont très hétérogènes et nécessitent une caractérisation plus précise
permettant de prédire la survie du patient et la réponse au traitement.
1.4.1. Classificationbaséesurletranscriptome
L’analyse du transcriptome de glioblastomes primaires permet de déterminer 4 sous-classes
définies selon les altérations majeures présentées.
La classification basée sur le profil transcriptionnel des échantillons de glioblastome fait la
distinction entre les glioblastomes proneuraux, neuraux, classiques et mésenchymateux
(Verhaak et al., 2010) ; cette classification a été effectuée à partir de 91 échantillons de The
Cancer Genome Atlas analysés avec 601 gènes. Dans cette classification, les groupes sont
formés d’après plusieurs types d’altérations de l’expression de gènes (Figure 7).
Les glioblastomes classiques sont caractérisés par une perte du chromosome 10 et une
amplification du chromosome 7, contenant le gène de l’EGFR ; cette amplification de
l’EGFR, se traduisant par une augmentation d’un facteur 4 de la transcription, est retrouvée
dans 97 % des glioblastomes classiques et est peu fréquente dans les autres classes. Par
contre, dans le type classique, la protéine TP53 est rarement mutée bien que ce soit l’un des
gènes les plus fréquemment altérés dans les glioblastomes. D’autre part, la délétion
homozygote du locus du gène CDNK2A, codant pour les protéines suppresseurs de tumeur
p16INK4A et p14ARF (Uhrbom et al., 2005), est un évènement fréquent, associé à
l’amplification de l’EGFR dans 94 % des cas, et représente la seule aberration de la voie de
signalisation Rb. Cette sous-classe de glioblastomes est également définie par l’expression de
marqueurs de précurseurs et cellules souches neuronaux tels que NES, les voies de
signalisation de Notch (NOTCH3, JAG1, LFNG) et sonic hedgehog (SMO, GAS1, GLI2).
Les glioblastomes mésenchymateux sont définis par des délétions hémizygotes et des
mutations du gène NF1 (17q11.2), rendant ce gène altéré dans 53 % des cas. La classe
mésenchymateuse est surtout caractérisée par l’expression de marqueurs mésenchymateux tels
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
13
que CHI3L1 (Chitinase 3-like protein 1) et MET. CHI3L1 est un facteur de survie activé en
réponse au stress physiologique subit par la cellule et inhibiteur de l’apoptose également
impliqué dans l’invasion et la croissance des cellules tumorales (Ku et al., 2011) ; Met est un
récepteur à tyrosine kinase activé par HGF (hepatocyte growth factor) et impliqué dans
l’angiogenèse, la progression du cycle cellulaire, l’adhésion et la migration cellulaires ainsi
que dans les réponses antiapoptotiques (Liu et al., 2011). La combinaison de l’augmentation
de l’activité de marqueurs mésenchymateux et astrocytaires (CD44 et MERTK) est sous-
jacente à une transition épithéliamo-mésenchymateuse (Encart 2) (Thiery, 2002). Les gènes
de la voie de signalisation de la famille des TNF (tumor necrosis factor, TRADD, RELB,
TNFRSF1A) sont surexprimés dans cette classe de glioblastomes, potentiellement du fait d’un
phénomène de nécrose générale et des infiltrats inflammatoires associés à la classe
mésenchymateuse.
Les glioblastomes proneuraux sont principalement définis par des altérations des gènes
PDGFRA (amplifications du locus 4q12, parfois mutations empêchant la liaison du ligand) et
IDH1 (mutations). Les mutations et pertes d’hétérozygotie de TP53 sont retrouvées
majoritairement dans ce groupe. Les glioblastomes proneuronaux sont également définis par
une forte expression de gènes du développement oligodendrocytaire (PDGFRA, NKX2-2,
OLIG2) (Noble et al., 2004), faisant de ces glioblastomes des cas atypiques. D’autre part, une
forte expression d’Olig2 diminue l’expression du suppresseur de tumeur p21, augmentant
ainsi la prolifération (Ligon et al., 2007). La signature proneurale contient également des
gènes du développement proneural tels que SOX, DCX, DLL3, ASCL1 et TCF4.
Les glioblastomes neuronaux sont caractérisés par l’expression de marqueurs neuronaux tels
que NEFL, GABA1, SYT1 et SLC12A5 ainsi qu’avec des marqueurs du développement des
oligodendrocytes et astrocytes.
Selon cette classification, un effet significatif du traitement est observé sur la survie des
patients ayant un glioblastome de type classique ou mésenchymateux alors que peu de
bénéfice en est retiré pour les deux autres classes de glioblastomes (Figure 7).
Figure 7: La classifMésenchydes patienconcomitaconcomita
EGFR
CDK6
MET
EGFR
PDGFRA
NF1
PTEN
CNKN2A
RB1
TP53
PTEN
NF1
EGFR
IDH1
PIK3R1
RB1
ERBB2
EGFRvll
PIK3CA
PDGFRA
LOH
Mutatio
Gene
Amplifi
Forte am
A
Chap
Classification fication de V
ymateux. À : Alnts selon le typante à la radioante à la radioth
Pro
A
A/CDKN2B
l
A
ons
cation
mplification
pitre1:Glio
de Verhaak. Verhaak disting
ltérations géniqpe de glioblastothérapie ou mhérapie et/ou plu
oneural Neural
54 96
46 96
54 92
17 67
35 13
6 17
69 96
56 71
52 46
54 21
16 21
5 16
16 26
30 5
19 11
3 5
5 16
3 0
8 5
11 0
Classificatio
Fréqu
oblastomes
gue 4 catégoriques et transcripome et l’intens
moins de 4 cycus de 3 cycles d
l Classique
100
92
86
95
5
5
100
95
16
0
23
5
32
0
5
0
5
23
5
0
n de Verhaak
uence des altér
setCellules
ies de glioblaptionnelles des sité dela thérapcles de chimiode chimiothérap
Mésenchy
mateux
95
89
91
29
9
38
87
67
53
32
32
37
5
0
0
13
3
3
3
0
rations (%)
sPropagatr
astomes prima4 sous types depie. Bleu : thérthérapie) ; Rou
pie) (Verhaak et
B
total
83
77
78
45
17
18
85
70
44
31
23
17
17
10
9
6
6
6
5
3
ricesdeTu
ires : Proneurae glioblastomesrapie peu intenuge : thérapie t al., 2010).
B
umeur
al, Neural, Cls. B : Probabilitnsive (chimiothintensive (chim
14
lassique et té de survie hérapie non miothérapie
Encart
Les mi
sont de
mécani
régulat
Bartel,
Kersch
microR
dégrad
FigureLe gèncap, unenvirofaire ucompllie parbloque
Chap
1.4.2. Clas
t 1 : microR
icroARNs ou
e très puissa
ismes transc
teurs du déve
2004; Shi
her and Slack
RNAs ; chaq
dé par plusieu
e 8: Biogenèse ne codant pourne queue poly A
on et est exportun miRNA duplexe RISC. L’Ar complémentare la translation
pitre1:Glio
ssificationb
RNAs
u miRNAs (
ants régulate
criptionnels e
eloppement,
et al., 2010)
k, 2006). Da
que miRNA
urs miRNAs.
et mode d’actr le microRNA A et une boucleé par l’Exportinplex double bri
ARNm cible égarité à la régionet peut égaleme
oblastomes
baséesurle
(molécules d
eurs intracell
et post-transc
de la différe
) et sont im
ans le génom
peut avoir
.
ion des microRest transcrit pa
e. Ce pri-miRNne 5 dans le cyin. La séparatioalement recrutén 3’UTR (3’ unent, plus rareme
setCellules
esmicroAR
d’ARN de 2
lulaires, pou
criptionnels.
enciation et
mpliqués dans
me humain, 3
plus d’une
RNAs. ar l’ARN polym
NA est digéré paytoplasme. L’enon des 2 brins é dans le complntranslated regient, induire la d
sPropagatr
RNs
0 à 22 nuclé
uvant éteindr
Les miRNA
de la prolifé
s l’étiologie
30 % des gè
cible et cha
mérase II en unar l’enzyme Drnzyme Dicer co
permet au miRlexe RISC (RNion) des mRNAdégradation end
ricesdeTu
éotides, http
re l’expressi
As émergent
ration cellula
de nombreu
ènes environ
aque mRNA
n pri-miRNA, rosha en pre-mioupe la boucle RNA mature d
NA induced silenA. Cette interacdonucléolytique
umeur
://www.mirb
ion de gènes
comme d’im
laires (Ambr
ux cancers (
n sont régulé
A peut être
contenant une iRNA de 70 nudu pre-miRNA
d’être incorporéncing complexction miRNA –
e de l’ARNm.
15
base.org/)
s par des
mportants
os, 2004;
(Esquela-
s par des
éteint ou
structure ucléotides A pour en é dans le ) où il se – mRNA
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
16
La classification des glioblastomes selon l’expression de mRNAs est certes une avancée par
rapport au regroupement de tous les glioblastomes primaires dans une même catégorie, mais
ne permet pas de distinguer des différences de pronostiques pour l’ensemble des différentes
sous-classes identifiées. Une autre classification, basée sur l’expression de miRNAs semble
plus prometteuse et précise de ce point de vue (Lu et al., 2005; Rosenfeld et al., 2008).
Plusieurs miRNAs ont été caractérisés comme régulateurs de la croissance des glioblastomes
(Godlewski et al., 2010; Kim et al., 2011a; Silber et al., 2009; Silber et al., 2008) et il apparait
que l’expression aberrante de ces miRNAs isolés fait partie d’un cluster d’expression de
miRNAs coordonné (Kim et al., 2011b). L’étude de l’expression des miRNAs permet de
répartir les glioblastomes en plusieurs sous-groupes et doit permettre d’affiner le pronostic et
de développer des traitements plus spécifiques. Le groupe de Park a ainsi identifié 5 sous-
classes de glioblastomes basées sur l’expression différentielle de miRNAs (étude de
l’expression de 121 miRNAs dans 261 échantillons de glioblastomes de The Cancer Genome
Atlas) et présentées en Figure 9. Chaque groupe correspond à des étapes majeures de
différenciation des cellules souches neurales : signatures de précurseurs neuronaux,
précurseurs oligoneuronaux, précurseurs multipotents, précurseurs d’astrocytes et
neuromésenchymale ; ceci met en évidence la transformation de précurseurs neuronaux
comme possible origine des glioblastomes (Kim et al., 2011b).
La régulation des programmes de croissance et de différenciation par les miRNAs contribue
de façon significative à la diversité des glioblastomes et à la survie des patients : les
glioblastomes de type proneural, définis d’après l’étude transcriptomique, et associés à un
meilleur pronostique peuvent être divisés en 2 sous-groupes d’expression de miRNAs
montrant des différences significatives au niveau de la survie de patients (Figure 9).
Figure 9: À : ClustemiRNAs eglioblastométablies à p
A
C
Signatu
Précurs
neuron
Précurs
multipo
Précurs
Neuron
Précurs
mésenc
Précurs
Astrocy
Chap
Classification ers de microRNexprimés pendames. C : Comppartir des même
ure m
seurs Oligo‐
naux
m
18
3
18
seurs
otents
m
99
7e
14
seurs
naux
m
37
7,
seurs Neuro‐
chymateux
m
66
48
seurs
ytaires
m
29
14
20
pitre1:Glio
des glioblastomNAs caractérisaant le développparaison de la es tumeurs (Kim
microRNAs
miR‐26a, 135b, 1
82*, 130a, 20a,
p, 106a, 17‐5p,
81a, 181b, 149,
miR‐99b, 125a, 9
9a, let‐7c, let‐7
e, let‐7i, let‐7b
46a, 143, 145
miR‐565, 487b, 5
76a, 338, 218, 2
, 23b, 27b, 582
miR‐623, 584, 62
63, 801, 769‐3p,
86, 492, 493‐3p,
miR‐191, 425‐5p
9a, 27a, 24, 23a
46b, 22, 21, 221
04, 31, 34b, 210
oblastomes
mes primairesant les 5 sous-gement neural. Bclassification bm et al., 2011b)
196a, 196b, 10b,
25, 424, 340, 92
182, 18a, 183, 1
345, 505, 362
92b, 30a‐5p, 125
7d, 26b, 98, 195,
b, let‐7a, 335, 12
504, 128a, 128b,
19, 377, 376a, 1
29, 630, 765, 671
, 452, 451, 206,
, 513, 494, 575,
, 192, 200b, 200
a, 223, 34a, 142
1, 222, 155, 148a
0,193b, 339
setCellules
s selon leur progroupes de glioB : Probabilité basée sur l’expr).
, 9*, 9,
2, 96, 17‐
19a, 19b,
5b, 100,
135a, let‐
26*, 126,
136, 137,
127, 124a,
1, 638,
370, 490,
572
0a, 29c,
2‐3p,
a, 193a,
sPropagatr
ofil d’expressiooblastomes dan
de survie des pression des miR
B
ricesdeTu
on de microRNs lesquels sont patients en foncRNAs et de ce
umeur
NAs. t retrouvés des nction des sous-elle basée sur l
17
clusters de -groupes de les mRNAs
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
18
2. Traitementsdesglioblastomes
Le bénéfice de la radiothérapie dans le traitement des glioblastomes a été prouvé dans les
années 1970 avec la démonstration de l’augmentation de la médiane de survie avec la
radiothérapie focalisée réalisée en préopératoire (Salcman, 1980). L’impact de la
chimiothérapie a été évalué par de nombreux essais thérapeutiques, montrant l’efficacité des
agents alkylants de l’ADN (Chinot, 2005), dont le Témozolomide (Friedman et al., 2000;
Newlands et al., 1997). Cependant, les premiers essais combinant la radiothérapie et
chimiothérapie n’ont pas montré d’effet sur l’augmentation de la médiane de survie des
patients, et ont relégué l’utilisation de la chimiothérapie au traitement des récidives (Yung et
al., 2000). L’intérêt de la chimiothérapie adjuvante a été relancé par le résultat d’une méta-
analyse montrant un bénéfice modeste en termes de médiane de survie et de pourcentage de
survivants à long terme (Stewart, 2002), et notamment par la nécessité d’augmenter le nombre
de lésions de l’ADN ; les glioblastomes sont en effet des tumeurs particulièrement radio
résistantes au cœur d’un organe radio sensible.
2.1. ProtocoledeStupp
2.1.1. Étapes
Aujourd’hui, le traitement classique des glioblastomes consiste en une résection chirurgicale
de la partie la plus importante de la tumeur suivie d’un traitement chimio- et
radiothérapeutique, illustré dans la Figure 10A (Stupp et al., 2005). L’agent
chiomiothérapeutique de référence est le Témozolomide (Tmz). Les résultats de l’étude de
Stupp montrent une augmentation de la médiane de survie des patients traités par la
chimiothérapie concomitante par rapport aux patients traités seulement avec la radiothérapie
de 12,1 mois à 14,6 mois (Figure 10B) ainsi qu’une augmentation de la médiane de survie
sans progression de 5 mois à 6,9 mois (Figure 10C) ; la probabilité de survie globale à 2 ans
passe de 10,4 % à 26,5 %.
Figure 10À: Protoco(courbe rosans progr
Les radi
intracell
(transfe
cellule m
biologiq
et les m
libres (H
ces espè
cas de
chromo
A
B
Chap
: Protocole de ole appliqué lorouge) soit la raression de la tum
2.1.2. Rad
iations n’ag
lulaires pro
rt d’électro
mais les ion
que. Les rad
molécules in
H2O°, OH°,
èces réactiv
e non-rép
somiques, i
pitre1:Glio
Stupp. rs de l’étude deadiothérapie commeur (Stupp et
diothérapie
gissent pas
ovoque de
ons sur une
nisations en
diations peu
ntracellulair
H°, HO2°) h
ves avec l’A
paration, l
induisant la
oblastomes
phase cliniquembinée à la chal., 2005).
directement
s ionisatio
e couche su
ntraînent de
uvent ainsi p
es, dont l’A
hautement r
ADN entrain
es cassure
a mort cellu
setCellules
e. B : Survie mohimiothérapie p
t sur l’ADN
ons (arrach
upérieure) ;
es réactions
provoquer d
ADN, ou en
réactifs et in
ne des cassu
es chrom
ulaire.
C
sPropagatr
oyenne des patiear Témozolom
N mais leur
hement d’é
les excitat
physico-ch
des interacti
ncore entrai
nteragissant
ures simple
osomiques
ricesdeTu
ents ayant reçu ide (courbe ble
interaction
électrons) o
tions ont p
himiques ab
ions entre le
ner la produ
t avec l’AD
ou double b
génèrent
umeur
u soit la radiothéeue). C : Survi
avec les m
ou des ex
peu d’impac
boutissant à
es électron
duction de r
DN. L’intera
brins de l’A
des abe
19
érapie seule ie moyenne
molécules
citations
ct sur la
un effet
ns libérés
radicaux
action de
ADN ; en
errations
Le Tém
une exc
stabilité
molécul
carboxia
spontan
n’y a d
groupem
cérébral
générati
toxicité
Figure 11
Les lési
position
Lors de
liaison,
lors des
d’ADN
combler
manière
(Figure
Karran
Chap
2.1.3. Méc
mozolomide
cellente bio
é à pH acid
le passe p
amide), mo
née en ion m
donc qu’une
ment alkyla
les ont un
ion du mét
diminuée d
: Structure du
ions de l’A
n N7-guanin
la réplicati
entraînant u
s réplicatio
entourant
r ce trou in
e répétitive
32) et déc
et al., 1993)
pitre1:Glio
canismed’a
est un agen
odistribution
de, permett
par son hy
olécule plus
méthyldiaz
e faible fen
ant de l’AD
pH plus a
abolite hau
dans les tissu
u Témozolomid
ADN observ
ne (70 %),
on de l’AD
un mésappa
ons suivant
la base mé
ntroduit un
générant de
clenche l’ap
) (Figure 12
oblastomes
actionduT
nt alkylant d
n au niveau
ant son adm
ydrolysation
s active mai
zonium très
nêtre de pH
DN (Newlan
alcalin que
utement réac
us sains (Va
de et activation
vées suite à
O3-adenine
N, une déso
ariement de
es, le systè
ésappariée e
nouveau m
es cassures
poptose de
2).
setCellules
émozolom
de l’ADN. S
u du systèm
ministration
n en MIT
is de faible
s réactif s’e
H permettan
nds et al., 1
le tissu sa
ctif avec l’
aupel et al.,
n de l’ion méth
à l’adminis
e ou encore
oxycytidine
e bases dans
ème Mism
et la nouve
mésappariem
de l’ADN
la cellule
sPropagatr
ide
Ses propriét
me nerveux
n orale. Le
TC (5-(3-m
e biodistribu
effectue à p
nt l’hydroly
1997; Steve
ain environ
ADN dans
, 1989).
hylant.
tration du
e O6-guanin
e ou thymidi
s le double
match Repai
elle tentativ
ment ; l’act
bloque le c
via la proté
ricesdeTu
tés pharmac
x central a
mécanisme
methyltriazen
ution et don
pH plus alca
yse du Tmz
ens et al., 1
nant, favor
les tissus t
Tmz sont u
ne (5 %) (D
ine est incor
brin d’ADN
ir (MMR)
ve de l’ADN
tivation du
cycle cellula
éine p53 (H
umeur
cologiques m
ainsi qu’une
me d’action
n-1-yl)imid
nt la décom
alin (Figure
z en MITC
1987). Les
risant de ce
tumoraux a
une méthyl
Denny et al.
orporée en fa
N ; en consé
excise le m
N polyméra
système M
aire en phas
Hirose et al
20
montrent
e grande
de cette
dazole-4-
mposition
e 11) ; il
puis en
tumeurs
e fait la
avec une
ation en
., 1994).
ace de la
équence,
morceau
ase pour
MMR de
se G2/M
l., 2001;
Cet effe
l’ADN
la cellul
transfer
premier
ce proce
Figure 12L’ion methbases lorsl’apoptoseainsi l’acti
Chap
et est renfo
MGMT (O
le au Tmz :
rt de ce gro
r temps l’ac
essus, l’enz
: Altération dehyldiazonium trs de la réplicate de la cellule. Lion du Témozol
pitre1:Glio
orcé par la d
O6-methylgu
l’éliminati
oupement d
ction cytoto
yme est ina
e l’ADN et aporansfère un grotion. Ce mésapLa MGMT est lomide (Tmz) ;
oblastomes
diminution
uanine-DNA
on du résid
depuis la b
oxique du T
activée de fa
optose induitesupement méthy
ppariement entrcapable d’excicependant ceci
setCellules
du taux d’
A methyltra
du alkyl indu
base azotée
Tmz (Olsso
açon irréver
s par le Témozoyle sur les basestraîne l’interveniser le groupemi induit la méth
sPropagatr
expression
ansferase) o
uit par le Tm
vers l’enz
on and Lind
rsible (Tolch
olomide. s guanines de l’ntion répétitivement méthyle dhylation de l’enz
ricesdeTu
de l’enzym
bservée sui
mz par la M
zyme, rédui
dahl, 1980).
her et al., 20
’ADN, entrainae du système mdes bases guaninzyme et sa cons
umeur
me de répar
ite à l’expos
MGMT se fa
isant ainsi
. Cependant
003) (Figur
ant des mésappamismatch repaines de l’ADN, séquente inactiv
21
ration de
sition de
ait par le
dans un
t, durant
re 12).
ariement de ir et induit détoxifiant
vation.
2.2.
Parmi le
traiteme
d’un ag
l’interve
dans le
pas d’au
Le Bev
(vascula
Stupp d
d’augm
testé da
nouvelle
Actuelle
(http://c
utilisée
apoptoti
constitu
deux inh
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molécul
l’inhibit
cellules
D’autre
montren
par rétr
Chap
Autresthé
es molécule
ent des glio
gent alkylan
ention chiru
temps ; cep
ugmenter la
vacizumab
ar endothéli
dans le ca
menter la sur
ans plusieu
ement diagn
ement, plu
clinicaltrials
dans le but
iques ; les a
uent la maje
hibiteurs du
veloppés ;
les utilisées
tion de l’EG
moins sen
s molécules
nt que peu
rocontrôle (
pitre1:Glio
érapies
es chimique
oblastomes,
nt de l’ADN
urgicale. So
pendant l’ac
a survie des
(Avastin)
ial growth f
s des récid
rvie sans pr
urs essais c
nostiqués (N
us de 700
s.gov/ct2/re
t d’inhiber
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eure partie
u domaine à
cependant,
s en monoth
GFR induit
nsibles au
s ont été dév
d’efficacité
(O'Reilly et
oblastomes
es approuvée
la Carmus
N, généralem
n action est
ction combin
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dives (Coh
rogression
cliniques p
Narayana et
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onoclonaux
des agents
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t l’arrêt du
Tmz et au
veloppées e
é et induise
t al., 2006)
setCellules
es par la FD
stine (Figur
ment appliq
t plus faible
née du Tém
Noel et al., 2
nticorps mo
utorisé dep
hen et al.,
de 6 mois
pour son u
t al., 2012).
cliniques s
=glioblastom
e signalisat
x ou inhibite
s thérapeuti
rosine kinas
s cliniques
montre de bé
cycle cellu
ux radiation
en tant qu’in
ent même u
). La plupar
Figure 13 : La CarmustBCNU (bigroupement
sPropagatr
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re 13) est a
qué sous for
e que le Tém
mozolomide
012).
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uis 2009 en
2009). Cet
(Nagpal et
utilisation d
sont répert
ma). La pl
tion de surv
eurs chimiq
iques utilisé
se de l’EGF
sont déce
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ulaire en ph
ns dans le
nhibiteurs d
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ricesdeTu
nd drug adm
autorisée de
rme de patc
mozolomide
et de la Ca
humanisé c
n compléme
t agent thé
al., 2011)
dans le cas
toriés sur
lupart de
vie cellulair
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és (Figure
FR (Erlotin
evants puis
la survie de
hase G1, ren
cas de thé
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vation de la
is cliniques
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umeur
ministration
epuis 2002.
chs disposés
e mais est pr
armustine ne
ciblant le V
ent du proto
érapeutique
et est actu
s de gliobl
les gliobl
ces moléc
re ou les vo
oie RTK/RA
14). En par
nib et Gefiti
squ’aucune
es patients.
ndant de ce
érapies com
mTOR mais
a boucle PI3
s se basant
. ous le nom de t ajoute des ine.
22
) dans le
Il s’agit
s lors de
rolongée
e permet
VEGF-A
ocole de
e permet
ellement
lastomes
lastomes
ules est
oies anti-
AS/PI3K
rticulier,
inib) ont
de ces
De plus,
e fait les
mbinées.
s elles ne
3K/AKT
sur une
monoth
rapport
A côté
dévelop
thérapie
Figure 14Les essais partir de (A
Chap
hérapie chim
au traiteme
des thérapi
ppent à trav
es génique e
: Essais cliniqu cliniques sont Arko et al., 201
pitre1:Glio
mique ne m
ent de référe
ies classiqu
vers les an
et épigénétiq
ues sur les glioclassifiés selon
10).
oblastomes
montre que t
ence et des t
ues utilisant
nticorps mo
que (Figure
oblastomes. n le type de thé
setCellules
très peu d’a
thérapies co
t des agents
onoclonaux,
e 14).
érapie (gauche)
sPropagatr
amélioration
ombinant pl
s chimiques
, la virothé
ou selon le typ
ricesdeTu
n de la surv
usieurs cibl
s, des thérap
érapie, l’im
pe de cible (droi
umeur
vie des pati
les se dével
apies biolog
mmunothéra
ite). Graphique
23
ients par
oppent.
giques se
apie, les
es réalisés à
3. Led
La capa
diminua
recherch
plus en
cancére
représen
nombre
« norma
capable
régénére
2001).
Figure 15D’après (R
Chap
dogmedes
acité à cibl
ant la toxic
he contre le
n plus de
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nteraient qu
uses rechut
ales » const
s de régéné
er la tumeu
: RégénérationReya et al., 200
pitre1:Glio
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tumeurs
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u’un faible p
tes de cance
tituant l’ess
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ur dans son e
n de la tumeur1).
oblastomes
SouchesCa
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itement po
ette stratégi
sont rappo
ells ou CSC
pourcentage
er. En effet,
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ensemble m
r par les cellule
setCellules
ancéreuse
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our les cell
ie suppose
ortées com
Cs) résistante
e de la mass
, les traitem
a masse tum
argnées. Ces
malgré les th
es souches canc
sPropagatr
es
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ules saines
de cibler le
mme conte
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s cellules se
hérapies act
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ricesdeTu
des cellules
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s ciblent les
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uelles (Figu
umeur
s tumorales
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ellules alor
« cellules
lles. Ces ce
ient respons
s cellules tu
cellules rés
la suite cap
ure 15) (Rey
24
tout en
ur de la
s que de
souches
llules ne
sables de
umorales
sistantes,
pables de
ya et al.,
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
25
II. Cellulespropagatricesdetumeur
Les glioblastomes, ainsi que de nombreuses autres tumeurs, sont constitués de populations
cellulaires très hétérogènes aussi bien sur le plan histologique que moléculaire. La majeure
partie de ces cellules, formant la masse tumorale, est différenciée alors qu’une faible
proportion de cellules a des capacités d’auto-renouvellement importantes, de différenciation à
travers des divisions asymétriques et de régénération de la tumeur dans sa globalité. Le terme
de cellules souches cancéreuses (ou cancer stem cells CSCs) a été défini en référence aux
propriétés que partagent ces cellules tumorales avec les cellules souches normales. Ces
cellules ont parfois pu être considérées comme les cellules initiatrices de la tumeur ; dans ce
mémoire, nous considèrerons que le terme de cellules souches tumorales se rapporte à une
population clonale de cellules malignes permettant de propager la tumeur, responsables de la
génération de l’ensemble de la masse tumorale et devant être éradiquées pour permettre la
rémission du patient. Les CSCs seront considérées ici comme des cellules à caractère souche
et propagatrices de la tumeur.
1. Historique:miseenévidenceetisolationdecellulestumorigéniques
1.1. FinXIXesiècle
Le concept des cellules souches ou inductrices de cancer a été proposé pour la 1ere fois il y a
150 ans environ (1874), mais ce n'est que récemment que les avancées en biologie cellulaire
ont pu étoffer cette hypothèse (Wicha et al., 2006).
Au milieu du XIXe siècle, Virchow nota la ressemblance histologique des tissus de
tératocarcinomes avec les tissus fœtaux et émit l’hypothèse d’une relation entre les 2 tissus
(Virchow, 1855). Peu de temps après, Cohnheim et Durante postulèrent que les cancers se
développent à partir de rudiments embryonnaires présents dans des organes matures
(Cohnheim, 1875; Durante, 1874; Rotter, 1921). En 1941, les tératocarcinomes ont été définis
comme des structures malignes contenant plusieurs types de cellules différenciées ainsi que
des cellules non différenciées, suggérant la présence de cellules tumorales multipotentes
(Jackson and Brues, 1941). Il y a 50 ans, l'hypothèse de cellules souches tissue-spécifiques à
l'origine des cancers a été avancée (Till and Mc, 1961), et 6 ans plus tard celle selon laquelle
les tum
propriét
- L
s
- L
d
d
La prés
tumeur
populati
former d
vivo (B
découve
Depuis
cellule t
et la d
différen
La mise
tumeur
un mod
Figure 16Les cellulclones in vl’aide de S
Chap
meurs représ
tés importan
Les tumeur
souches (ou
Les tumeur
de cellules
différencia
ence de pop
a égalemen
ions de cell
des clones
Bruce and V
erte d’une h
l’apparition
tumorale ay
différenciatio
nciées et ne
e en éviden
originelle (
èle animal a
: Mise en évides souches canvitro ainsi que Servier Medical
pitre1:Glio
sentent une
ntes des cell
rs émergen
u leurs prog
rs contienne
souches es
ation (hétéro
pulations ce
nt été suggé
lules tumor
in vitro (Ha
Van Der G
hiérarchie c
n du conce
yant des cap
on, par op
possèdent p
nce des CS
(hétérogéné
ainsi que su
dence des celluncéreuses sont de pouvoir renl Art.
oblastomes
maturation
lules cancér
nt dans n'im
éniteurs im
ent des com
ssentielles :
ogénéité cel
ellulaires ay
érée par des
ales ayant u
amburger an
Gaag, 1963
cellulaire d
ept, la défin
pacités de p
pposition à
pas ces prop
SCs repose
ité et caract
ur sa capacit
les souches candéfinies fonctiouveler la tume
setCellules
n arrêtée de
reuses ont p
mporte quel
mmédiats)
mposants ce
auto-reno
llulaire)
yant des pr
s essais clon
une capacité
nd Salmon,
; Furth and
dans les tum
nition des C
ropagation
la majorit
priétés.
sur la capa
téristiques p
té d'auto ren
ncéreuses. ionnellement coeur originelle d
sPropagatr
es cellules
permis de fa
l tissu où l
llulaires qu
uvellement
opriétés de
nogéniques
é de prolifé
1977; Klei
d Kahn, 19
meurs (Pierce
CSCs a très
de tumeur à
té des cellu
acité d'une
phénotypiqu
nouvellemen
omme capablesdans sa globalit
ricesdeTu
souches (P
aire émerger
l'on peut tr
ui leur confè
t (moteur d
cellules so
mettant en
ération impo
insmith and
937). Ceci
e and Walla
s peu chang
à travers l'a
ules tumor
de ces cel
ues) après t
nt in vitro (
s de s’auto-rené après transpla
umeur
Pierce, 1967
r ces concep
rouver des
èrent des pr
de la cancér
ouches au se
évidence d
ortante, cap
d Pierce, 19
est appuyé
ace, 1971).
gé : il s’ag
auto renouv
rales qui so
llules à refo
transplantat
(Figure 16).
nouveler et de antation. Schém
26
7). Deux
pts :
cellules
ropriétés
risation),
ein de la
des sous-
pables de
64) et in
é par la
git d’une
ellement
ont plus
ormer la
ion dans
former des ma réalisé à
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
27
1.2. Tumeursliquides
En 1994, le groupe de Dick montre que la leucémie myéloïde sévère est organisée de façon
hiérarchique à partir d'une cellule hématopoïétique primaire et identifie pour la première fois
des CSCs par transplantation dans des souris immunodéficientes. Ces cellules comptent pour
0,01 à 1 % des cellules tumorales et sont caractérisées par le phénotype CD34+CD38- (Bonnet
and Dick, 1997; Lapidot et al., 1994).
1.3. Tumeurssolides
En 2003, le groupe de Clarke adapta au cancer du sein les méthodes utilisées pour identifier
les CSCs des leucémies et mit en évidence une sous-population de cellules cancéreuses
(cellules CD44+/CD24-/lo) capables de régénérer la tumeur dans des souris NOD-SCID
immunodéficientes ; une centaine de CSCs sont suffisantes pour régénérer la tumeur dans le
cadre d’une xénogreffe alors que plusieurs dizaines de milliers de cellules de la masse
tumorale n’en sont pas capables (Al-Hajj et al., 2003).
En 2004, le groupe de Dirks identifia pour la première fois des CSCs dans les tumeurs du
système nerveux central, capables de former des neurosphères et de régénérer la tumeur par
transplantation orthotopique dans des souris immunodéficientes ; ces cellules sont
caractérisées par le marqueur CD133+ (prominine 1) (Singh et al., 2003; Singh et al., 2004).
Des cellules ayant les propriétés des CSCs ont été identifiées dans la plupart des tumeurs du
système nerveux central, incluant les gliomes, les médulloblastomes et les épendymomes
(Galli et al., 2004; Hemmati et al., 2003; Ignatova et al., 2002; Singh et al., 2004; Yuan et al.,
2004).
L’isolation de ces cellules se fait à partir de biopsies de tumeurs coupées en fragments de
1 mm3 ; les cellules sont dissociées et mises en culture dans du milieu de culture de croissance
des cellules souches neurales, sans sérum, auquel sont ajoutés des facteurs de croissance dont
l’EGF (epithelial growth factor) et le bFGF (basic fibroblast growth factor). Les neurosphères
formées sont isolées, dissociées, remises en culture dans les mêmes conditions et ainsi de
suite pendant plus de 50 passages jusqu’à obtenir une population constituée uniquement de
cellules clonogéniques (Figure 17).
Figure 17Les morceces cellule
Depuis,
et al., 2
côlon (O
Dans le
tumorig
cellules
tumorig
allant d
solides
études é
sans (ou
marqueu
« souch
CSCs es
contrair
des moy
d’effect
CSCs d
Chap
7 : Isolation de eaux de biopsiees et de prolifér
des cellule
2007), du c
O'Brien et a
es différent
génicité des
de la tum
géniques peu
de moins de
(Quintana
étudient le p
u avec peu
ur ; il est fo
he » forment
st leur capa
rement aux
yens de s’a
tuer des pas
es tumeurs
pitre1:Glio
cellules souchee tumorale sont ation, on obtien
es inductrice
ou (Prince
al., 2007) et
ts essais m
s cellules tr
meur et de l
ut varier en
e 1 % dans
et al., 2008
potentiel tum
) de culture
ort probable
t des tumeu
acité à être m
cellules mo
assurer de l
ssages in vi
solides est p
oblastomes
es cancéreusesmis en culture
nt des « lignées
es de tumeu
et al., 2007
de la peau
menés pour
ransplantées
la nature de
n fonction d
les leucémi
8; Visvader
morigéniqu
e in vitro in
e dans ce ca
urs lors de
maintenues
ortelles qui n
la présence
itro avant la
proche de 1
setCellules
s à partir de bie avec des agen
cellulaires » ne
ur ont été ide
7), de la pr
(mélanome
isoler les
s dans l'hô
e l'hôte imm
du type de tu
ies et pouv
r and Linde
ue de cellule
ntermédiair
as que des c
xénotransp
en culture p
ne dépassen
de CSCs d
a xénotrans
1 %.
sPropagatr
iopsies de tuments mitogènes. Ae contenant que
entifiées da
rostate (Sa
es) (Quintan
CSCs et d
te dépend
munodéprim
umeur et du
ant atteindr
eman, 2008)
es tumorale
re sur le se
ellules tumo
lantations.
pendant un
nt pas une c
dans une po
splantation.
ricesdeTu
eurs solides. Après plusieurse des cellules so
ns les cance
adri-Ardekan
na et al., 200
démontrer l
des conditi
mé. La fréq
u système e
re 20 à 25 %
). Cependan
s obtenues
ul critère d
orales n’aya
L’une des c
nombre « in
cinquantaine
opulation d
Dans ce ca
umeur
s cycles de dissouches cancéreu
ers du panc
ani et al., 20
08).
leurs propr
ions d'isola
quence des
expérimenta
% dans les
nt, certaine
à partir de
de la présen
ant pas de c
caractéristiq
nfini » de p
e de passag
de cellules
as, la propo
28
sociation de uses.
créas (Li
009), du
riétés, la
ation des
cellules
al utilisé,
tumeurs
s de ces
biopsies
nce d’un
caractère
ques des
passages,
ges ; l’un
est donc
ortion de
2. Car
2.1.
L’analy
caryotyp
chromo
et 14 et
Figure 18L’analyse chromosom
Contrair
nombre
la tétrap
ségréga
l’appare
migratio
mitotiqu
cellulair
de signa
centroso
Chap
ractérisatio
Génotype
yse chromo
pe à 62 ch
somes. Glo
des pertes a
: Analyse du cchromosomiqu
mes 7 et 14 (Pa
rement aux
uses tumeu
ploïdie (Ba
ation, interv
eil spinal, d
on aux pôle
ues poussen
re. La transf
alisation ap
omes a été o
pitre1:Glio
ondescell
trèsinstab
somique de
hromosomes
balement, o
au niveau d
caryotype des ue de cellules
atru et al., 2010)
x cancers h
urs solides o
ayani and S
venant soit
de l’alignem
es cellulaire
nt la cellule
formation m
poptotiques
observée da
oblastomes
lulesprop
ble/phéno
es cellules
s, comporta
on observe d
des chromos
cellules propagTG01 par Mu
).
hématologiq
ont des cellu
Squire, 200
au momen
ment le long
es ou de la
e à l’apopto
maligne de l
et de cons
ans de nomb
setCellules
pagatrices
otypeàpe
propagatric
ant à la fo
des gains au
somes 9p et
gatrices de glioulti FISH révè
ques ayant
ules avec u
7). Ceci im
nt de la ré
g de la plaq
a cytokinèse
ose via l’ac
la cellule lu
server les a
breux cance
sPropagatr
degliobla
euprèsstab
ces de glio
is des gain
u niveau des
18q (Figure
oblastome. èle une hypotri
un caryotyp
un caryotype
mplique des
plication d
ue métapha
e. Dans un
ctivation de
ui confère la
anormalités
ers et résulte
ricesdeTu
stome
ble
oblastome (
ns et des p
s chromosom
e 18).
iploïdie avec u
pe proche
e oscillant e
s mitoses a
de l’ADN,
asique, de la
e cellule no
es points de
a capacité d’
mitotiques.
e en une ség
umeur
(gCSC) mo
pertes de pa
mes 1q, 5, 7
une surreprésen
de la diplo
entre la trip
avec des er
de l’attach
a ségrégatio
ormale, ces
e contrôle d
’échapper a
. La duplic
grégation in
29
ontre un
arties de
7, 9q, 12
ntation des
oïdie, de
ploïdie et
rreurs de
ement à
on, de la
s erreurs
du cycle
aux voies
cation de
négale du
matériel
ploïdie
tétraplo
Les tum
structur
cytogén
ou pseu
Figure 19La cellule des chromcellules filminute’ dquelques numériquenombre de
2.2.
Les cel
impliqu
l’apopto
par une
voie Wn
Chap
l génomiqu
des cellule
ïde.
meurs diploï
raux avant
nétiquement
udo triploïde
: Acquisition normale (gauc
mosomes, résultlles polysomique quelques gèngènes. (d) Al
e étant donné qe copies d’ADN
Altération
llules souc
uées dans la
ose ; dans le
surexpress
nt/-caténin
pitre1:Glio
ue (Doxsey,
es sont imp
ïdes subisse
la tétraploï
t complexes
e (Bayani et
d’aberrations che) est représetant en une cellues, l’une ayantnes par altératitération structu
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005; Nigg,
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2002). Les
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n des tume
en tant que
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sieurs voie
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2.2.1. Son
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(suppresseu
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la proliféra
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, 2011; Pan
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n et al., 200
des tumeurs
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es gènes activéaire, les cyclind) sécrétés par protéases (ADMecombinant signenhancer of sp La présence de
de gènes impliq
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s, notammen
31
la protéine ine) auquel ranscription
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nt via la
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
32
surexpression des facteurs Gli, et maintient les gCSCs dans un état indifférencié et invasif
(Clement et al., 2007).
2.2.2. Notch
Suite à un contact intercellulaire, le récepteur Notch est activé par la liaison d’un ligand
Delta-like (Dll 1, 3 et 4) ou Jagged (Jag 1 et 2), induisant la libération de la partie
intracellulaire du récepteur NCID (Notch intracellular domain) dans le cytoplasme et sa
translocation au noyau. NCID s’associe dans le noyau avec des facteurs de transcription,
induisant l’expression de gènes parmi lesquels certains sont impliqués dans l’auto-
renouvellement, la survie cellulaire et l’inhibition de la différenciation des cellules souches
neurales et progénitrices en cellules neurales (Lathia et al., 2008) (Figure 20). En condition
hypoxique, HIF-1 (hypoxia inducible factor 1 alpha) interagit avec NCID et inhibe la
transcription des gènes de différenciation (Gustafsson et al., 2005). Une signalisation
aberrante de Notch a été identifiée dans de nombreux cancers, dont les glioblastomes
(Kanamori et al., 2007) ; dans les gCSCs, l’activation de Notch permet le maintien d’un état
indifférencié, pluripotent et d’auto-renouvellement (Zhang et al., 2008b) et favorise la
tumorigénicité in vivo, notamment par l’activation de gènes impliqués dans la survie
cellulaire, la mobilité et l’angiogenèse (Fan et al., 2010), ainsi que dans la transition
épithéliamo-mésenchymateuse (voir point II-2.4, page 39) (Wang et al., 2010c).
2.2.3. Wnt/‐caténine
Les cascades de signalisation induites par la fixation de Wnt sur son récepteur Frizzled (FZD)
dépendent du corécepteur associé : les corécepteurs LRP5 et LRP6 contrôlent la voie
canonique Wnt/-caténine impliquée dans le devenir de la cellule et les corécepteurs ROR2 et
RYK la voie non canonique gérant les mouvements cellulaires et la polarité des tissus ; à ce
jour 19 protéines Wnt et 10 récepteurs Frizzled ont été identifiés (Katoh, 2007). Dans la voie
canonique et en absence de Wnt, la -caténine est associée à un complexe multiprotéique de
destruction, phosphorylée, ubiquitinée et dégradée par le protéasome. La liaison de Wnt à son
récepteur (FZD – LRP5/LRP6) libère la -caténine qui s’associe dans le noyau avec p300 ou
CBP (cyclic AMP response element binding protein) pour agir en tant que facteur de
transcription sur des gènes impliqués dans la prolifération, la différenciation et la survie
cellulaires (Figure 20). L’étude des composants nucléaires d’échantillons de glioblastome de
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
33
type mésenchymateux de The Cancer Genome Atlas a corrélé une forte activité de la voie
Wnt/-caténine avec une durée de vie plus faible des patients (Cooper et al., 2012). La
suractivation de cette voie de signalisation dans les gCSCs et l’accumulation de -caténine
dans le cytoplasme sont responsables du caractère souche des cellules, de leur invasivité via
l’induction d’une transition épithéliamo-mésenchymateuse (voir point II-2.4, page 39) (Jin et
al., 2011; Zhao et al., 2011) ou encore de la tumorigénicité des cellules in vivo (Pulvirenti et
al., 2011).
2.3. Modificationsépigénétiques
Les mécanismes épigénétiques sont de très puissants régulateurs de l’expression de gènes et
du cycle cellulaire, de la survie de la cellule. Ces mécanismes permettent également à une
population de cellules d’acquérir une grande variabilité phénotypique et de s’adapter aux
changements microenvironementaux.
2.3.1. Méthylationdel’ADN
La méthylation de l’ADN sur des résidus cytosines dans les ilots CpG est l’un des
mécanismes de répression de gènes les mieux caractérisés. Les ilots CpG ont en moyenne une
longueur de 1 kb et contiennent 5 fois plus de CpGs que le reste du génome ; ces séquences
sont estimées à 30 000 environ et représentent 7 % de l’ensemble des CpGs (Rollins et al.,
2006). Les promoteurs contenant une forte densité de CpGs sont couramment associés à des
gènes du développement (Saxonov et al., 2006). La plupart des CpGs ne sont pas méthylés
dans les tissus sains, excepté au niveau du chromosome X inactif ou de façon tissu spécifique.
L’hyperméthylation de certains ilots CpG dans les cancers est associée avec la répression de
gènes suppresseurs de tumeurs (Baylin and Herman, 2000). Dans les gCSCs, certains
promoteurs de gènes impliqués dans la réparation de l’ADN, l’apoptose, l’invasion,
l’angiogenèse et la résistance aux substances chimiques sont fréquemment hyperméthylés, et
donc inactifs ; la méthylation de MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) est
associée à un meilleur pronostic pour les patients traités par radiothérapie et par l’agent
alkylant de l’ADN, le Témozolomide (Hegi et al., 2005).
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
34
Parmi ces gènes hyperméthylés, une forte proportion est régulée par une chromatine
ambivalente dans les cellules embryonnaires (Easwaran et al., 2012). La structure
ambivalente de la chromatine est définie par de l’ADN non méthylé mais portant à la fois des
marques répressives (marque H3K27me3, voir paragraphe suivant) et inductrices (marque
H3K4me2/me3) de la transcription de gènes ; ceci induit une très faible expression des gènes
cibles. Dans les cellules embryonnaires, ce type de régulation est identifié au niveau des gènes
du développement et permet de maintenir les caractéristiques « souche » et
d’autorenouvellement des cellules, inhibe l’expression des gènes de différenciation. Dans les
cellules tumorales, l’hyperméthylation induit une conformation de la chromatine répressive
beaucoup plus importante que la structure ambivalente ; cette hyperméthylation est observée
au niveau de nombreux gènes intervenant dans la régulation du développement et confère une
signature de cellules souches aux cellules tumorales concernées (Easwaran et al., 2012).
La méthylation de l’ensemble du génome est inférieure à 50 % dans les glioblastomes
primaires (contre 75 % dans les tissus sains du cerveau) (Cadieux et al., 2006).
L’hypométhylation peut en effet contribuer à la tumorigénicité de la cellule par l’activation
d’oncogènes, la perte d’empreinte parentale (perte de la régulation monoallélique
normalement conférée par la méthylation spécifique de l’ADN parental lors de la réplication
de l’ADN) (Holm et al., 2005) et le non-masquage d’éléments répétitifs (environ 45 % du
génome, plus d’1/3 des méthylations de l’ADN dans les tissus sains), source d’instabilité
génomique et d’altération structurelle des régions chromosomiques adjacentes (Eden et al.,
2003). En particulier, la déméthylation de Sat2, proche du centromère du chromosome 1,
prédispose à des cassures du chromosome et à une altération du nombre de copies de
l’euchromatine adjacente (gains ou pertes) (Cadieux et al., 2006; Fanelli et al., 2008). L’étude
de l’expression de Sox2 dans les gCSCs et échantillons de glioblastomes montre une
amplification du locus de Sox2 (3q26.33) dans 10 % des cas environ mais surtout une
hypométhylation du promoteur dans 100 % des cas, suggérant que cette hypométhylation est
le principal facteur de la surexpression de Sox2 (Alonso et al., 2011). L’hypométhylation du
promoteur de Sox2 dans les gCSCs et les lignées de glioblastomes confère, de la même façon
que dans les cellules souches, des propriétés d’auto-renouvellement et d’inhibition de la
différenciation cellulaire.
La modification de l’expression des ADN méthyltransférases (DNMTs), notamment la
surexpression de DNMT1 et la sous-expression de DNMT3a, serait à l’origine des aberrations
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
35
de méthylation de l’ADN. En effet, l’induction de l’expression de DNMT3a dans des cellules
de glioblastome permet de retrouver quasi totalement des niveaux de méthylation normaux,
dont celui de Sat2 ; par contre, la perte de DNMT3a n’engendre pas forcément la
déméthylation de Sat2. Ces effets seraient dus à une faible expression de DNMT3a pendant la
période post natale alors qu’une augmentation de cette expression dans les progéniteurs
neuronaux est nécessaire au bon développement du système nerveux central ; la méthylation
incomplète des régions péri-centromériques créerait des instabilités dans l’ADN génomique et
l’héritage de ces anomalies serait amplifié dans les cellules progénitrices neurales aves
l’accumulation de nouvelles altérations génétiques. Ces modifications pourraient être à
l’origine de la cellule initiatrice de glioblastome à l’âge adulte (Fanelli et al., 2008).
2.3.2. Méthylationdeshistones
Les protéines Polycomb sont regroupées en complexes répressifs (PRC1 et PRC2), induisant
la triméthylation des histones H3 au niveau de la lysine 27 et l’inhibition de la transcription.
Les complexes PRC contribuent ainsi à la répression de la pluripotence et à la définition du
potentiel développemental de cellules progénitrices du système nerveux central (Sparmann
and van Lohuizen, 2006) ; 75 % des sites de méthylation de l’ADN sont occupés par des
complexes Polycomb dans les cellules souches et progénitrices adultes. Dans les
glioblastomes, l’expression aberrante des gènes polycomb (en particulier Bmi-1 et EZH2)
inhibe la différenciation et les gènes suppresseurs de tumeurs, active les gènes impliqués dans
la transformation et l’invasion et active la prolifération des gCSCs (Dimov et al., 2011).
EZH2 est le composant principal du complexe Polycomb 2, inhibant la transcription de gènes
par la triméthylation des lysines 27 et 9 des histones H3 (Figure 21). Dans les cellules souches
embryonnaires, des promoteurs de gènes cibles des complexes Polycomb sont occupés par les
facteurs de transcription Oct-4, Sox-2 et Nanog, essentiels dans le maintien de l’état
pluripotent des cellules (Lee et al., 2006b) ; dans les cellules différenciées, la triméthylation
H3K27 est retrouvée dans les régions promotrices de gènes du développement. Dans les
cellules tumorales, parmi les gènes réprimés on trouve des gènes suppresseurs de tumeur,
dont les gènes CDKN2A et CDNK2B codant pour p14 (ARF), p15 (INK4B) et p16 (INK4A)
(Gil and Peters, 2006; Kotake et al., 2007) ou les gènes casz1, clu, runx3 et ngfr récemment
identifiées comme gènes suppresseurs de tumeur dans les neuroblastomes (Wang et al., 2012).
L’inhibi
de tume
Bmi-1 f
niveau d
retrouvé
alternati
INK4a/A
2007). L
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et al., 20
Les com
laissent
(H3K4m
répressi
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en commun enH2AK119ub. Lolymérase II. PRr or zeste 12, EBmi1: homolo
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2.3.3. Acét
ylation des
rases (HAT
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du complex
e 119 (Figur
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2-like, MLL: blastoma bindin
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l’autorenouv
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l., 2009; Go
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C1 via les protés par PRC2 pouPRC1 lui-mêm
4, marque d’acmethyltransferasmolog, RING1: ASH2L: drosophR5: WD repeat
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36
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éines CBX. ur les gènes
me et par les ctivation de e), SUZ12: ring finger
hilia absent containing
e acetyl
nes et se
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
37
traduisant en une diminution de l’affinité des histones pour l’ADN et en une facilitation de la
liaison de médiateurs de la transcription (Shukla et al., 2008). Parmi les sites d’acétylation
identifiés, on trouve notamment la position H3K56, associée à l’apoptose et la réparation de
l’ADN et corrélée à un état dédifférencié ; certaines positions sont à la fois sujettes à la
méthylation et l’acétylation (H3K9, H3K27) (van Vlerken et al., 2012).
Tout comme la méthylation, l’acétylation des histones est un processus réversible catalysé par
des histone désacétylases (HDACs), inhibant la liaison de facteurs de transcription.
Cependant, ces enzymes ont également un rôle en tant que cofacteurs de transcription en
interaction avec les facteurs E2f, Stat3, p53, Rb, NF-B, …(Ropero and Esteller, 2007). Les
enzymes HDACs de classe I, HDAC1 et HDAC2, jouent un rôle clé dans le développement et
sont surexprimées dans les tissus tumoraux. Ces deux protéines sont impliquées dans
l’inhibition de l’apoptose des cellules tumorales (Marchion et al., 2009) et induisent
notamment l’accumulation de H3K56ac au niveau des lésions de l’ADN, diminuant ainsi la
sensibilité des cellules aux agents altérants de l’ADN (Miller et al., 2010). Les enzymes
HDACs de classes II et IV sont sous exprimées dans les glioblastomes et induisent une
suracétylation globale des histones H3 (Lucio-Eterovic et al., 2008). Plusieurs essais cliniques
utilisant des inhibiteurs d’HDACs sont en cours ; parmi les effets de ces inhibiteurs, on note
l’arrêt du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose, de l’angiogenèse, de l’autophagie et de la
transition épithéliamo-mésenchymateuse (Encart 2). Cependant, si les tumeurs
hématopoïétiques répondent bien à ces inhibiteurs, l’effet sur les tumeurs solides n’est à ce
jour pas satisfaisant (Khan and La Thangue, 2012).
2.3.4. MicroARNs
Le récent intérêt porté aux miRNAs montre leur importance dans les processus de
prolifération, différenciation (Encart 1) ainsi que leur activité en tant que suppresseurs de
tumeurs ou oncogènes dans de nombreux cancers. Dans les gCSCs, les miRNAs impliqués
dans la régulation de mécanismes conférant un avantage vis-à-vis de la survie, résistance, et
prolifération des cellules sont surexprimés de façon significative (Gonzalez-Gomez et al.,
2011; Silber et al., 2009). L’étude de l’expression des miRNAs des gCSCs par rapport à
différentes populations cellulaires de référence a permis de mettre en évidence la
surexpression / sous expression de différents miRNAs.
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
38
Par comparaison avec le tissu cérébral sain, les glioblastomes et astrocytomes anaplasiques
montrent une sous-expression de 2 miRNAs (miR-124 et miR-137) ; la transfection de ces
deux miRNAs inhibe la prolifération par induction de la différenciation des cellules de
glioblastome (Silber et al., 2008). Plusieurs sites potentiels de liaison de NF-B et c-Myc ont
été identifiés au niveau de promoteurs de plusieurs miRNAs surexprimés dans les
glioblastomes, impliquant ces facteurs de transcription dans la régulation de l’expression des
miRNAs.
La comparaison avec des cellules de glioblastome n’ayant pas de caractère souche montre une
sous-expression de plusieurs miRNAs dans les gCSCs dont miR-451, miR-486 et miR-425.
La transfection de ces miRNAs dans les gCSCs inhibe la formation de neurosphères et la
transfection de miR-451 inhibe la croissance cellulaire (Gal et al., 2008). La région
promotrice de miR-451 a été identifiée comme le site de fixation de SMAD3 et 4, dont la
transfection dans les cellules de glioblastome inhibe leur croissance, suggérant que SMAD
peut être un moteur de la différenciation des gCSCs à travers l’expression de miRNAs (Zhou
et al., 2010). D’autres miRNAs ont été identifiés comme sous exprimés et impliqués dans des
voies de signalisation dérégulées dans les gCSCs : miR-7 inhibe normalement l’expression de
l’EGFR et de la voie de signalisation AKT (Kefas et al., 2008), miR-1, miR-34, miR-146,
miR-199 et la famille des miRNAs Let-7 inhibent le facteur Notch dans des cellules saines ;
ces miRNAs sont impliqués dans plusieurs cancers dont les gliomes et sont souvent
sélectionnés comme candidats de thérapies anticancéreuses (Wang et al., 2010b).
Récemment, une étude différentielle de l’expression de miRNAs entre les gCSCs et les NSCs
a mis en évidence la surexpression de 8 miRNAs et la sous-expression de 2 miRNAs dans les
gCSCs participant à la tumorigenèse (Lang et al., 2012).
Enfin, une étude portant sur la répression de l’état souche des gCSCs a mis en évidence le rôle
du cluster miR 302-367. Ce cluster est en effet rapidement surexprimé lors de la mise en
culture des gCSCs dans un milieu contenant du sérum, et sa translocation dans des gCSCs
permet d’inhiber l’auto-renouvellement, l’expression de gènes associés à l’état souche des
cellules et l’infiltration des cellules à travers l’inhibition de la voie de signalisation de CXCR4
(Fareh et al., 2012).
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
39
2.4. Transitionépithéliamomésenchymateuse
Les biopsies de glioblastomes primaires ainsi que l’étude du transcriptome et de l’expression
des miRNAs ont permis de mettre en évidence la co-expression de gènes associés aux
phénotypes de cellules souches neurales et mésenchymateuses ainsi que des antigènes de
surface caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses (Kim et al., 2011b; Phillips et
al., 2006; Tso et al., 2006; Verhaak et al., 2010).
En 2008, le groupe de De Maria a démontré que certaines gCSCs peuvent avoir un potentiel
de différenciation neural mais également mésenchymateux selon les stimuli du
microenvironnement : in vitro, ces cellules sont capables, de différenciation chondro-
ostéogénique ou neurale et dans les xénogreffes, la différenciation mésenchymateuse est
associée à une réduction du taux de prolifération et de l’index mitotique de ces cellules. Ce
groupe a ainsi pu mettre en évidence l’importante plasticité des gCSCs et le rôle essentiel du
microenvironnement dans la différenciation des gCSCs. La limitation de la différenciation des
gCSCs au lignage neuronal correspondrait alors à une perte de multipotence ou à un
microenvironnement non favorable à la formation de cellules mésenchymateuses. On observe
ainsi environ 2 % des glioblastomes avec une différenciation mésenchymateuse dans le
cerveau, ce pourcentage passe à 28 et 57 % dans les cas respectifs de xénogreffe sous-cutanée
et de culture in vitro (Ricci-Vitiani et al., 2008).
La présence de phénotypes neural et mésenchymateux au sein d’un même glioblastome a
suggéré dans un premier temps des origines différentes de ces deux types de cellules, mais
l’observation de mêmes anormalités renforce l’hypothèse d’une origine clonale commune
(Borota et al., 2006) et l’acquisition du phénotype mésenchymateux à travers une transition
épithéliamo-mésenchymateuse (EMT, Encart 2). Cette transition est caractérisée par
l’expression de plusieurs facteurs de transcription définissant la signature mésenchymateuse
et est présente dans plusieurs types de tumeurs solides. Certains de ces gènes sont
caractéristiques du développement alors que d’autres entrent dans la composition de la
matrice extracellulaire et du collagène (Cheng et al., 2012).
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
42
2.5. «Marqueurs»connus
Plusieurs marqueurs ont été proposés pour caractériser et isoler les gCSCs. Parmi ces
marqueurs, certains sont caractéristiques des NSCs ou des précurseurs neuronaux et d’autres
de cellules différenciées du système nerveux central, mettant en évidence la complexité et la
particularité des gCSCs. Historiquement, la Nestine et CD133 sont les marqueurs les plus
décrits dans l’identification des NSCs ; leur utilisation dans l’isolation des gCSCs a joué un
rôle fondamental dans la détermination des propriétés de ces cellules, telles que la progression
tumorale et la résistance aux chimio- et radiothérapie.
2.5.1. Nestine
La Nestine est une protéine des filaments intermédiaires du cytosquelette exprimée par les
cellules souches neuro-épithéliales ; cette protéine est impliquée dans l’organisation du
cytosquelette, la signalisation cellulaire, l’organogenèse, le métabolisme cellulaire et est un
marqueur de cellules proliférantes et migrantes (Dell'Albani, 2008). La différenciation
cellulaire s’accompagne de la perte du marqueur Nestine et de l’augmentation de l’expression
de neurofilaments dans les neurones ou de GFAP (glial fibrillary acidic protein) dans les
précurseurs des cellules gliales (Messam et al., 2000).
L’expression de filaments intermédiaires dans plusieurs types de cancers est associée à la
mobilité et au caractère invasif des cellules (Strojnik et al., 2007) et la présence de la Nestine
dans le noyau des cellules issues de glioblastomes suggère son implication dans l’organisation
de la chromatine lors des divisions symétriques ou asymétriques des cellules souches ou dans
la régulation de l’expression de gènes (Veselska et al., 2006). La Nestine a été identifiée dans
de nombreuses gCSCs (Patru et al., 2010) mais son caractère non spécifique ne permet pas de
l’utiliser en tant que marqueur d’isolation de gCSCs ; par contre la corrélation de l’expression
de la Nestine avec une survie plus faible des patients permettrait d’utiliser cette protéine en
tant que marqueur pronostique (Zhang et al., 2008a).
2.5.2. CD133/Prominine
CD133/Prominine-1 est une glycoprotéine membranaire initialement identifiée dans les
cellules souches neuro-épithéliales murines (Weigmann et al., 1997). Depuis, la protéine a été
identifiée dans différents types de cellules souches, de cellules tumorales et est réprimée dans
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
43
les cellules différenciées (Kania et al., 2005). La localisation membranaire de CD133 au
niveau de protrusions suggère une implication de cette protéine dans des mécanismes
influençant la polarité de la cellule, la migration et l’interaction des cellules souches avec les
cellules voisines et/ou la matrice extracellulaire.
Les cellules de glioblastome immunoréactives pour CD133 ont des propriétés de cellules
souches in vitro et sont capables de former une tumeur in vivo (Singh et al., 2003; Singh et al.,
2004), suggérant que les cellules CD133+ sont des gCSCs et faisant de CD133 un marqueur
d’identification de choix de ces cellules. Cependant, le groupe de Beier a mis en évidence peu
de temps après que les cellules CD133- peuvent elles aussi avoir des propriétés de cellules
souches et de tumorigénicité dans des expériences de xénogreffes orthotopiques (Beier et al.,
2007). Depuis, il a été démontré que la xénogreffe de cellules CD133- peut donner naissance à
des cellules CD133+ (Wang et al., 2008) et que l’expression de CD133 peut être perdue lors
de cultures in vitro sans pour autant que les cellules perdent leurs caractéristiques de cellules
souches (formation de neurosphères, résistance au Témozolomide) (Patru et al., 2010). Le
marqueur CD133 ne semble donc pas être indispensable à la biologie des gCSCs mais serait
plutôt un marqueur de stress environnemental (Griguer et al., 2008) ou pourrait révéler la
nature de la cellule d’origine de la tumeur : les cellules CD133- ont un profil transcriptomique
proche des NSCs fœtales (signature proneurale, de type I) alors que les cellules CD133+ sont
plus proches des NSCs adultes (signature mésenchymateuse, de type II) (Gunther et al.,
2008; Lottaz et al., 2010). La coexpression de CD133 et Nestine est associée à un mauvais
pronostic des gliomes malins (Zhang et al., 2008a).
2.5.3. CD15/LewisX/ssea1
CD15/Lex/ssea1 (stage-specific embryonic antigen 1) a récemment été proposé comme
marqueur d’enrichissement des gCSCs (Son et al., 2009). Cet antigène est fortement exprimé
dans de nombreuses cellules souches pluripotentes telles que les cellules souches
embryonnaires dans les zones germinales du CNS en développement, certains astrocytes du
CNS adulte et les NSCs des zones neurogéniques adultes (Capela and Temple, 2002). Les
cellules CD15+, contrairement aux cellules CD15-, sont tumorigéniques in vivo, peuvent
donner naissance à des cellules CD15- et CD15+ à travers des divisions asymétriques, et sont
capables d’auto-renouvellement et de différenciation en plusieurs lignages cellulaires (Son et
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
44
al., 2009). Cependant, la capacité des cellules dérivées de glioblastome à former des
neursophères in vitro, propriété caractéristique des gCSCs, ne semble plus corrélée avec
l’expression de CD15 après quelques semaines (Patru et al., 2010).
2.5.4. CXCR4
CXCR4 est impliqué dans une voie de signalisation régulant de nombreux processus, tels que
la mobilité des cellules souches, la différenciation, l’angiogenèse, l’apoptose ou l’attraction
des lymphocytes. CXCR4 et son unique ligand connu, CXCL12/SDF-1 sont exprimés de
façon constitutive dans les cerveaux fœtal et adulte à la fois dans les cellules gliales et
neuronales, et sont impliqués dans la neurogenèse et la connectivité (Zheng et al., 2007; Zhu
et al., 2002). CXCR4 est surexprimé dans les gCSCs par rapport aux cellules plus
différenciées de la même tumeur (Ehtesham et al., 2006) et joue un rôle dans le maintien de la
quiescence de ces cellules (Khan et al., 2003) ainsi que dans le potentiel de forte invasion des
gliomes (Ehtesham et al., 2006).
2.5.5. CD44
CD44 est l’un des marqueurs principaux de cellules souches ainsi que des cellules souches
cancéreuses (Chan et al., 2009; Collins et al., 2005; Du et al., 2008a). Il appartient à une
famille polymorphique de molécules d’adhésion jouant un rôle dans les mécanismes
d’invasion tumorale et de métastases. L’expression de CD44 est surtout localisée sur le front
de la tumeur et peut être utilisée pour déterminer le caractère invasif des gliomes (Khoshyomn
et al., 1997; Ranuncolo et al., 2002). CD44 est surexprimé dans les glioblastomes, bloquant
ainsi la croissance tumorale et sensibilisant les cellules aux agents cytotoxiques in vivo. CD44
apporte à la tumeur une résistance aux espèces réactives d’oxygène et aux agents cytotoxiques
(Xu et al., 2010). L’expression de CD44 est plus élevée dans les tumeurs de grade plus
avancé, ainsi que dans le corps de la tumeur par rapport aux régions périphériques ; de plus
faibles niveaux d’expression de CD44 sont corrélés de façon surprenante avec une durée de
survie statistiquement plus courte des patients (Wei et al., 2010b).
2.5.6. Sox2
Sox2 est un facteur de transcription permettant le maintien du potentiel de prolifération des
cellules souches neurogliales et inhibant la différenciation neuronale (Graham et al., 2003),
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
45
surexprimé dans les glioblastomes et en particulier dans les gCSCs (amplification du locus du
gène, surexpression, hypométhylation du promoteur). L’utilisation de siRNAs dirigés contre
Sox2 dans des gCSCs induit la différenciation de ces cellules : perte de la capacité à former
des neurosphères, profil d’expression de cellules différenciées (diminution des marqueurs
Nestin, Oct-4 et REST, augmentation des marqueurs BMP4, -Tubuline, GFAP), diminution
de la viabilité cellulaire, accumulation des cellules en phase G0/G1 du cycle cellulaire, et
perte des propriétés de migration et d’invasion. Cependant, l’introduction de Sox2 dans une
lignée Sox2 négative ne permet ni d’induire la formation de neuropshères ni l’auto-
renouvellement mais augmente de façon significative les capacités d’invasion et de migration.
L’expression de Sox2 conditionne donc le maintien de l’expression d’un phénotype
indifférencié dans les gCSCs mais n’est pas le seul facteur permettant d’induire des propriétés
de cellules souches dans les cellules de glioblastome (Alonso et al., 2011). Cependant, Sox2 a
également été identifié dans l’ensemble de la masse tumorale et serait donc un indicateur de
différenciation aberrante plutôt que de gCSCs (Phi et al., 2008).
Sox2 fait partie, avec Oct4, Nanog et c-Myc, de la signature des cellules ES (Encart 3)
retrouvée dans les tumeurs histologiquement peu différenciées, dont les glioblastomes, et plus
particulièrement dans les CSCs ; l’expression de la signature ES est corrélée avec le grade
tumoral (Ben-Porath et al., 2008b; Murat et al., 2008).
2.5.7. GalNAcetGlcNAc
Une étude récente a mis en évidence l’expression membranaire différentielle de GlcNAc
(alpha-N-acétylglucosamine) et GalNAc (alpha-N-acétylgalactosamine) selon le degré de
différenciation des cellules, permettant d’identifier les gCSCs au sein d’une population de
cellules issues de glioblastomes ; ces cellules ont des capacités d’auto-renouvellement in vitro
et de tumorigenèse in vivo. Ces marqueurs n’ont à ce jour pas été challengés et les auteurs
suggèrent leur utilisation en tant que biomarqueurs d’identification des gCSCs au sein de la
tumeur (Tucker-Burden et al., 2012).
De nombreux marqueurs des NSCs sont identifiés dans les glioblastomes et en particulier
dans les gCSCs. Certains de ces marqueurs de surface, notamment CD133 et CD44, ont été
utilisés pour isoler les CSCs de différentes tumeurs solides ; cependant, le rôle de l’expression
de ces protéines n’est pas connu dans les CSCs. De plus, aucun de ces marqueurs n’est
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
46
exprimé exclusivement par les gCSCs, et ne permet pas de présager de la capacité des cellules
à former des sphères secondaires in vitro ou des tumeurs in vivo (Patru et al., 2010) ; la
plupart des gCSCs isolées expriment une combinaison de CD133, Nestin, Sox2, CD15, Bmi1,
Ezh2, L1CAM, Olig2 mais il n’y a pas de marqueur unique exprimé à la fois de façon
ubiquitaire et exclusive dans ces cellules (Schmalz et al., 2011) : aujourd’hui l’utilisation de
marqueurs de surface multiples est nécessaire pour caractériser complètement les gCSCs. La
récente identification des glycanes GalNAc et GlcNAc comme potentiels biomarqueurs des
gCSCs au sein de la masse tumorale reste à confirmer mais pourrait ouvrir une nouvelle voie
dans la caractérisation des gCSCs.
Encart 3 : Signature ES
La signature des cellules souches embryonnaires (ES) définit les éléments régulateurs clés de
l’identité de ces cellules, parmi lesquels OCT4, SOX2 et NANOG. Ces 3 facteurs de transcription
sont essentiels au maintien des propriétés des cellules souches, i.e. maintien de la pluripotence par
activation / répression de gènes, auto-renouvellement, régulation du cycle cellulaire à travers
l’expression de miRNAs. Ces 3 facteurs s’auto régulent en se liant à leurs propres promoteurs et en
se stabilisant mutuellement : SOX2 maintient le niveau d’expression d’OCT4 requis pour le maintien
de la pluripotence, SOX2 et OCT4 régulent l’expression de NANOG (Jopling et al., 2011).
En plus du maintien des propriétés des cellules souches, ces facteurs de transcription sont récemment
apparus comme nécessaires et suffisants à l’induction de cellules pluripotentes (IPS). La formation
de cellules IPS a dans un premier temps été démontrée par la transfection des facteurs de
transcription OCT4, SOX2, KLF4 et MYC dans des fibroblastes (Takahashi and Yamanaka,
2006) ; il a ensuite été montré que tous ces facteurs de transcription ne sont pas indispensables, selon
le type cellulaire d’origine considéré (Giorgetti et al., 2009; Nakagawa et al., 2008), jusqu’à la
reprogrammation de NSCs avec le facteur OCT4 uniquement (Kim et al., 2009). In vivo, des cellules
IPS ont pu générer un organisme entier viable jusque l’âge adulte et pouvant avoir une descendance :
les cellules IPS peuvent être totalement pluripotentes (Boland et al., 2009; Kang et al., 2011). Au
cours de ces reprogrammations, les modifications épigénétiques de la chromatine (degré de
compaction, méthylation des histones et de l’ADN) ainsi que l’expression des miRNAs sont
essentielles (Hochedlinger and Plath, 2009; Mallanna and Rizzino, 2010; Meshorer and Misteli,
2006).
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
47
3. Originedelacellulegénératricedetumeur:hypothèses
Le développement tumoral peut être expliqué par une succession d’altérations génétiques et
épigénétiques et d’étapes de sélection donnant naissance à des cellules présentant des
avantages de survie et de prolifération ; l’hétérogénéité des cellules tumorales reflète alors la
coexistence de populations évoluant en synergie et ayant des potentiels oncogéniques
différents. Durant la progression tumorale, l’acquisition de mutations supplémentaires peut
permettre l’apparition de CSCs, capables de prolifération et de différenciation. Ces dernières
sont souvent confondues avec la cellule d’origine, cellule normale dans laquelle les premières
mutations oncogéniques se produisent et dont la multiplication forme une masse tumorale ;
d’un autre côté les CSCs sont définies comme les cellules capables de maintenir ou de
régénérer une tumeur préformée (Visvader, 2011).
3.1. Cellulesouchenormaleouprogénitrice
Historiquement, il a été proposé que les astrocytomes trouvent leur origine dans les astrocytes
matures. Cependant, la mise en évidence des gCSCs et la forte ressemblance de celles-ci avec
les NSCs a favorisé l’hypothèse d’une cellule souche ou progénitrice neurale comme cellule
d’origine des gCSCs, d’autant plus que l’auto-renouvellement des cellules souches leur
permet d’accumuler des mutations. Cette hypothèse a également été émise dans nombre de
tumeurs où ont été identifiées des CSCs et est renforcée par les modèles animaux dans
lesquels les changements d’expression de quelques oncogènes ou suppresseurs de tumeurs
sont suffisants pour induire une tumeur (Tableau 3). En particulier la réactivation des gènes
Ras et Akt dans des progéniteurs neuronaux (Holland, 2001; Holland et al., 2000) ou encore
l’inactivation de Pten et P53 dans des NSCs (Jacques et al., 2010) permet d’induire un
glioblastome dans des souris immunodéprimées. Ces observations sont renforcées par
l’apparition des glioblastomes dans les zones sub-ventriculaires, régions où se trouvent les
cellules souches et progénitrices neuronales (Gil-Perotin et al., 2006).
Les CSCs des leucémies sont à ce jour les plus étudiées ; le suivi des clones de tumeurs
liquides (LSCs) et l’établissement de greffes secondaires et tertiaires permet de mettre en
évidence 3 sous types de LSCs selon leur taux d’auto renouvellement : les LSCs à court
terme, les LSCs à long terme et les LSCs quiescentes à long terme (clones transitoires ou
stables). Ces LSCs montrent une organisation hiérarchique identique à celle de
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
48
l’hématopoïèse normale (Hope et al., 2004) ainsi que des phénotypes de surface similaires à
ceux des cellules souches hématopoïétiques (HSCs) (Lapidot et al., 1994) ou progénitrices
(Krivtsov et al., 2006). De plus, la fusion de gènes MLL (mixed-lineage leukemia) (retrouvée
dans plus de 50 % des leucémies) dans des cellules hématopoïétiques primitives génère des
protéines ayant un fort potentiel de transcription, permettant l’expression aberrante de gènes
de l’homéobox (facteurs de transcription impliqués dans le développement embryonnaire et
dans la différenciation des cellules hématopoïétiques) (Barabe et al., 2007). Grâce à ces
observations, l’origine des LSCs est fortement suggérée dans le compartiment des HSCs
(HSCs ou progéniteurs) ; les LSCs suivraient un programme de développement similaire à
celui des HSCs avec quelques erreurs, plutôt que la génération d’une cellule aberrante
ressemblant aux HSCs.
Tableau 3 : Modèles animaux de glioblastomes établis par mutations génétiques. Adapté de (Visvader, 2011).
3.2. Celluledifférenciée
En réponse à une exposition au TGFα (transforming growth factor alpha), fréquemment
surexprimé dans les premiers stades des gliomes, des cellules d’astrocytes matures peuvent se
dédifférencier in vitro en cellules ayant des propriétés de cellules progénitrices neurales
(Sharif et al., 2007) et sont sensibilisées à la cancérisation, capables d’induire un glioblastome
in vivo suite à une irradiation aux rayons gamma (Dufour et al., 2009).
L’acquisition d’un phénotype de cellules souches par des cellules différenciées à travers la
transition épithéliamo-mésenchymateuse a été abordée au point II-2.4 (page 39) et est
Modèle Génétique Cellule d’origine Ref
RAS, AKT activation Progéniteur neural 1
P16Ink4a
/p19Arf, BMI1 inactivation ; EGFR mutant Progéniteur neural et astrocyte 2, 3
P53, NF1 et/ou PTEN inactivation Progéniteur neural ou NSC 4
PDGFB activation Progéniteur oligodendrocytaire 5
RAS, AKT activation ; p53 inactivation Progéniteur multipotent 6
P53 mutant Progéniteur neural, NSC 7
PTEN, p53 inactivation Progéniteur multipotent, NSC 8
1. E. C. Holland et al., 2000. Nat Genet 25, 55. 2. R. M. Bachoo et al., 2002. Cancer cell 1, 269. 3. S. W. Bruggeman et al., 2007. Cancer cell 12, 328. 4. S. Alcantara Llaguno et al., 2009. Cancer cell 15, 45.
5. N. Lindberg et al., 2009. Oncogene 28, 2266. 6. T. Marumoto et al., 2009. Nature medicine 15, 110.7. Y. Wang et al., 2009. Cancer cell 15, 514. 8. T. S. Jacques et al., 2010. Embo J 29, 222.
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
49
supportée par l’observation d’une signature mésenchymateuse dans les gCSCs (Cheng et al.,
2012) ainsi que par l’expression aberrante de facteurs de transcription inducteurs d’EMT dans
plusieurs tumeurs dont les gliomes (Ansieau et al., 2010; Elias et al., 2005). L’hypothèse de
l’EMT comme origine des CSCs est également fortement suggérée dans le cancer du sein : les
facteurs de transcription TWIST1 et SNAIL1, impliqués dans l’EMT, sont fréquemment
détectés in situ dans la tumeur avant même la dissémination de métastases, et l’expression
combinée de TWIST1 et RAS dans des cellules épithéliales mammaires est suffisante pour
induire une tumeur (Morel et al., 2012).
3.3. Modèledesdeuxhitstumorigéniques
La distinction des cellules initiatrices et propagatrices de tumeur suppose deux évènements
majeurs d’acquisition de mutations oncogéniques : un premier évènement permettant à la
cellule de se multiplier et d’accumuler des mutations et un deuxième évènement permettant à
l’une des cellules de la masse tumorale d’acquérir les propriétés de CSCs décrites jusqu’ici.
Cette hypothèse est supportée par la reprogrammation de cellules tumorales différenciées en
cellules ayant des caractères de CSCs dans plusieurs lignées de cellules cancéreuses à travers
l’expression de facteurs de transcription (Chiou et al., 2010; King et al., 2011), dont le facteur
Oct4 dans des cellules de glioblastome (Li and Laterra, 2012). De la même façon,
l’expression/répression de certains miRNAs permet à une cellule tumorale d’acquérir des
propriétés de cellule souche (Lin et al., 2008; Wellner et al., 2009).
Parmi les mutations « candidates » au premier hit tumorigénique, on trouve les mutations
décrites dans l’une des 3 voies les plus fréquemment mutées des glioblastomes, à savoir les
voies des RTKs, de P53 et de Rb, décrites au point I-1.3 (page 7).
Les mutations du second hit tumorigénique sont plus difficiles à identifier mais on peut
envisager la mutation Kras, isoforme de Ras retrouvée dans plusieurs tumeurs, favorisant
l’expansion des cellules souches / progénitrices tout en bloquant leur différenciation. Des
mutations peuvent également être acquises dans les voies de signalisation altérées des gCSCs
(Shh, Notch, Wnt/-caténine) résultant en l’activation aberrante de certains gènes, dont
certains activateurs d’une EMT (ZEB1, Twist, Snail) (Kahlert et al., 2012).
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
51
4.1. Modèlesdecroissance
4.1.1. Modèlehiérarchiqueoudecellulesouchecancéreuse
Ce modèle dérive directement de l’identification des CSCs et l’organisation hiérarchique de la
tumeur est définie suivant celle d’un tissu sain : seule une petite sous population de cellules
tumorales a une capacité de prolifération, de différenciation et ainsi la capacité de générer une
nouvelle tumeur en donnant naissance à des cellules progénitrices ayant une capacité de
prolifération limitée. Dans ce modèle, la différence entre les cellules tumorigéniques et non
tumorigéniques repose sur des variations épigénétiques et non génétiques ; ces variations
épigénétiques sont irréversibles, permettant ainsi une hiérarchisation de la tumeur.
La proportion de ces cellules, par rapport aux cellules différenciées de la masse tumorale, est
variable selon les tumeurs et leur grade, mais est généralement faible (0,01 % - 5 %)
(Dell'Albani, 2008).
D’un point de vue thérapeutique, l’élimination de ces CSCs suffit à éradiquer la croissance
tumorale et la possibilité d’une récidive ; les éventuelles récidives sont expliquées par la
résistance de l’un des clones de CSCs.
4.1.2. Modèlestochastiqueoudel’évolutionclonale
En 1963, un modèle d’évolution clonale a été proposé chez des patients atteints de leucémie
où deux « lignées » cellulaires génétiquement différentes ont été identifiées (Levan et al.,
1963).
Selon ce modèle, les cellules tumorales sont hétérogènes mais ont toutes le même potentiel
tumorigénique, l’entrée dans le cycle cellulaire étant un évènement se produisant de façon non
synchronisée et avec une faible probabilité dans certaines cellules. Dans cette hypothèse,
l’hétérogénéité des cellules tumorigéniques est générée par des mécanismes génétiques et
épigénétiques ; la hiérarchie cellulaire est définie par une petite portion de cellules qui, à un
moment donné, expriment les caractéristiques des CSCs, les autres cellules tumorales ayant
des capacités limitées de réplication et pouvant contribuer à la masse tumorale mais pas à son
maintien ni à sa régénération dans le cadre de xénogreffes.
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
52
Ce modèle explique notamment pourquoi la caractérisation moléculaire des CSCs est difficile.
Par exemple, 25 % des cellules de mélanome ont été identifiées comme ayant un potentiel
tumorigène sans qu’aucun marqueur n’ait pu être identifié pour les différencier des cellules
non tumorigènes (Quintana et al., 2008).
La distinction entre ces deux modèles de croissance tumorale repose surtout sur la
détermination d’une population distincte de cellules dans la masse tumorale qui passe par la
caractérisation de marqueurs de cellules souches cancéreuses.
Bien que ces deux modèles aient été souvent présentés comme étant mutuellement exclusifs,
ils apparaissent complémentaires dans un bon nombre de tumeurs : la plupart des cancers dans
lesquels des CSCs ont été identifiées présente une hétérogénéité interclonale, suggérant une
évolution à travers l’apparition de différents clones (Barabe et al., 2007).
4.1.3. Modèledelacoopérativitéinterclonale
Ce modèle prend en compte les interactions des cellules tumorales entre elles et leur rôle dans
le maintien de l’hétérogénéité. Ceci suppose un réseau complexe d’interactions entre les
cellules tumorales et leur microenvironnement, les interactions apportant un bénéfice mutuel
aux différents clones cellulaires et expliquant le maintien de l’hétérogénéité au détriment de
l’émergence d’un seul clone dominant (Bonavia et al., 2011). Dans ce modèle, une minorité
de cellules de phénotypes distincts peut avoir un impact important sur le comportement des
autres cellules tumorales à travers la production de facteurs conférant un avantage aux clones
environnants. Ces facteurs paracrines peuvent notamment promouvoir la croissance de
cellules à priori non per se tumorigéniques : ce phénomène a été observé par la coculture ou
co-injection de cellules non tumorales rendues tumorigéniques par la présence de cellules
tumorales exprimant le facteur Wnt ou une mutation du récepteur EGFR (Inda et al., 2010;
Vermeulen et al., 2010).
Les interactions interclonales peuvent être soient compétitives pour l’accès à l’oxygène, les
nutriments, l’espace et aboutissant à l’émergence de clones dominants à travers une sélection
naturelle, soit coopératives à travers des échanges mutualistes (échanges coopératifs
réciproques) ou commensalistes (l’échange ne profite qu’à un clone).
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
54
4.2.1. Informations
L’échange intercellulaire d’informations et l’interaction ligand-récepteur peuvent se faire de
plusieurs façons :
- échange autocrine : autostimulation de la cellule, des cellules d’un même tissu (EGF /
EGFR)
- échange juxtacrine : interaction entre un récepteur et un ligand lié à la surface d’une
cellule voisine (Delta-like / Notch)
- échange paracrine : interaction entre un récepteur et un ligand soluble sécrété par des
cellules du tissu environnant ou voisin (VEGF / VEGFR)
- échange récécrine : sécrétion d’un récepteur dans des microvésicules et incorporation
de ce récepteur à une cellule voisine (EGFRVIII)
Une multitude de facteurs autocrines permet la transmission d’informations et la stimulation
intercellulaire au sein de la tumeur (Charles et al., 2011; Hoelzinger et al., 2007). Les voies de
signalisation oncogéniques, dont Wnt, Notch, Shh, TGF-, RTKs, sont ainsi stimulées par la
liaison d’un ligand extracellulaire sur le récepteur membranaire de chacune d’entre elles ;
ces voies de signalisation sont majoritairement impliquées dans la prolifération et l’invasion
des cellules tumorales. Les chimiokines (CXCL12/SDF1) jouent également un rôle important
dans l’invasion des cellules ainsi que les phospholipides (autotaxine, acide
lipophosphatidique, sphingosine-1-phosphate). Parmi les boucles de signalisation plus
inhabituelles stimulant la mobilité des cellules, le GDNF (glial cell line-derived neutrophic
factor) fait partie d’une boucle de signalisation à trois parties surexprimée dans les
glioblastomes : la liaison du GDF au GDNFR1 (GDNF receptor alpha 1) active c-Ret dont
l’activité tyrosine kinase active les voies de signalisation RAS / MEK / ERK1/2 et PI3K /
AKT impliquées dans la mobilité cellulaire (Figure 6) (Song and Moon, 2006).
Le calcium est un élément universel de transduction du signal (décrit dans le Chapitre II de ce
manuscrit), permettant de contrôler de multiples processus tels que la sécrétion, la
prolifération la différenciation cellulaires, l’expression de gènes… et coordonne ainsi
l’activité d’une population de cellules donnée. Ainsi, une stimulation mécanique (déformation
de la membrane plasmique) induit une augmentation du calcium cytoplasmique intracellulaire
qui peut se propager de façon concentrique aux cellules voisines à travers les jonctions gap
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
55
(connexines) ou par la sécrétion d’un médiateur extracellulaire (ATP, ADP) (Himpens and
Vereecke, 2000) ou encore par un mécanisme impliquant un récepteur senseur du calcium
extracellulaire couplé à une protéine G (CaR). Dans ce dernier cas, le calcium rejeté dans
l’espace extracellulaire par une première cellule suite à la génération d’un signal calcique
intracellulaire est détecté et potentiellement traduit par les cellules voisines exprimant CaR
(Hofer et al., 2000).
4.2.2. Matière
Les cellules de tumeurs agressives relâchent des microvésicules (100 nm – 1 µm de diamètre)
et des exosomes (40 – 100 nm de diamètre) contenant des ARN messagers (ARNm), de
l’ADN, des enzymes, des récepteurs oncogéniques, des facteurs de croissance ou encore des
miRNAs qui vont pouvoir être intégrés par des cellules voisines et y induire le phénotype
associé. La quantité de microvésicules formées par les cellules tumorales est corrélée à
l’invasivité de ces cellules que ce soit in vitro ou in vivo (Ginestra et al., 1998; Ginestra et al.,
1999). Les microvésicules peuvent être générées par 3 processus différents : apoptose,
protrusion membranaire, exosomes (Figure 26). Une fois formées, ces microvésicules
permettent un transfert horizontal de molécules bioactives et leur phénotype associé aux
cellules cibles (Al-Nedawi et al., 2009).
Dans les glioblastomes, seule une petite proportion de cellules expriment la forme tronquée
oncogénique de l’EGFR (EGFRVIII) alors que la plupart des cellules exprime de façon
constitutive l’EGFR, caractéristique de la forme oncogénique. Une étude a montré que
l’EGFRVIII peut être partagé par les cellules tumorales par des transferts intercellulaires de
microvésicules dérivées de la membrane plasmique qui, suite à la fusion avec la membrane de
cellules voisines, peuvent transférer l’activité oncogénique du récepteur par l’activation des
voies de signalisation Akt et MAPK (Al-Nedawi et al., 2008) (Figure 6). De la même façon,
les microvésicules permettent le partage de la protéine P-gp, médiatrice de la résistance des
cellules aux agents chimiothérapeutiques (point II-5.2 page 70) (Bebawy et al., 2009;
Levchenko et al., 2005). Une autre étude a montré que des exosomes dérivés de cellules
tumorales peuvent être intégrés par des cellules saines, telles que des cellules endothéliales de
la microvasculature : les microvésicules dérivées de cellules tumorales et enrichies en
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
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4.2.3. Énergie
Le couplage métabolique est un processus physiologique normal existant notamment dans le
cerveau : la sécrétion de glutamate par les neurones stimule la glycolyse dans les astrocytes,
produisant du lactate utilisé par les neurones dans un métabolisme oxydatif mitochondrial et
permettant la synthèse d’ATP (Pellerin and Magistretti, 1994). Les cellules tumorales utilisent
également ce couplage métabolique pour permettre une importante synthèse d’ATP à partir de
métabolites riches en énergie (lactate, cétones, glutamine, acides gras) produits par les cellules
stromales (fibroblastes, adipocytes, cellules endothéliales, macrophages). L’un des
mécanismes employés par les cellules tumorales afin d’obtenir ces métabolites est de sécréter
du peroxyde d’hydrogène induisant un stress oxydatif dans les fibroblastes adjacents. Les
fibroblastes ainsi activés entrent en glycolyse aérobie et produisent des nutriments
cataboliques stimulant le métabolisme oxydatif des cellules tumorales : il s’agit de l’effet
Warburg inverse (la glycolyse et la synthèse d’ATP ne se font pas dans la même cellule)
(Martinez-Outschoorn et al., 2011a). Les cellules tumorales se comportent dans ce cas comme
un organisme parasite pour promouvoir leur croissance à travers un transfert d’énergie entre
les cellules stromales et tumorales (Martinez-Outschoorn et al., 2011b).
4.3. Influencedesnichesetdumicroenvironnement
La contribution du tissu sain, pouvant représenter une large proportion de la masse tumorale,
ainsi que la quantité variable de tissu à proximité immédiate de la tumeur constituent le
microenvironnement tumoral. Les cellules y sont affectées par la présence de la tumeur si bien
qu’elles ne sont pas de simples « spectatrices » mais peuvent influencer la biologie de la
tumeur. Le microenvironnement joue un rôle important dans l’initiation et la progression
tumorales comme en témoignent la sélection de certains clones métastatiques ou la formation
de tumeurs par des cellules cancéreuses, injectées en intraveineuse, seulement si elles trouvent
un environnement permissif (Suzuki et al., 2006).
Dans les tumeurs cérébrales, le microenvironnement est composé de cellules microgliales,
macrophages, astrocytes, oligodendrocytes, neurones, progéniteurs de cellules gliales et
neuronales, matrice extracellulaire, péricytes et cellules endothéliales. Cette structure
complexe est à la base d’un réseau dans lequel se forment des interactions entre des cellules
tumorales et non tumorales produisant ainsi un environnement favorable à la croissance
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
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TGF est un régulateur des cellules T, neutrophiles, monocytes, macrophages, cellules NK (natural killer), fibroblastes associés à la tumeur. TGF contribue également à la régulation de l’angiogenèse par des mécanismes directs et indirects, stimule la migration des fibroblastes, cellules T, neutrophiles et monocytes, et influence leur activité pour stopper ou stimuler la progression tumorale. TGF inhibe l’activité des cellules T, la sécrétion par ces mêmes cellules de facteurs cytolytiques, stimule la différenciation des monocytes en macrophages mais inhibe la fonction effectrice de ces macrophages. TGF stimule également les cellules T et macrophages associés à la tumeur en potentialisant l’activité de CXCR4 suite à la fixation de son ligand CXCL12 sécrété par les fibroblastes associés à la tumeur. TGF permet l’expression du ligand FAS (FASL) en inhibant l’activation des neutrophiles, cellules induisant la mort cellulaire suite à la reconnaissance de cette molécule. Ce rôle de TGF est important dans la progression tumorale car l’expression de FASL permet l’échappement immunitaire en induisant l’apoptose des cellules exprimant le récepteur FAS, parmi lesquelles les cellules T. La signalisation de TGF réduit également l’expression des gènes des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC) de classe I et II, induisant en temps normal l’activation des cellules NK, mais l’inhibition de l’activité des cellules NK par TGF contribue à la progression tumorale. Enfin, TGF influence la signalisation des cellules tumorales, pouvant ainsi inhiber ou promouvoir la progression tumorale et la formation de métastases, selon le contexte de la stimulation. Abréviations : GMCSF, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ; HGF, hepatocyte growth factor ; IL, interleukin ; MCP1, macrophage chemoattractant protein 1 ; MIP, macrophage inflammatory protein ; MST1, macrophage stimulating 1 ; TNF, tumor necrosis factor. (Bierie and Moses, 2006).
Une niche est une unité anatomique structurale entourant des cellules souches, mais peut être
aussi définie comme une unité fonctionnelle permettant des interactions complexes et
dynamiques avec des cellules souches (Scadden, 2006). Les niches sont des déterminants
majeurs du microenvironnement et peuvent être ciblées pour éliminer les CSCs,
principalement localisées dans ces microenvironnements (Binello and Germano, 2011).
4.3.1. Nichepérivasculaire
La coimplantation intracrânienne de gCSCs avec des cellules endothéliales accélère de façon
significative la croissance de la tumeur alors que le traitement de xénogreffes de
glioblastomes avec un agent anti angiogénique (Bevacizumab, anti-VEGF) réduit
considérablement la taille de la tumeur (Calabrese et al., 2007). Cette influence des cellules
endothéliales sur la croissance tumorale suggère que la signalisation entre ces deux types de
cellules dans la niche périvasculaire joue un rôle important dans la progression tumorale.
Cette observation fait écho aux niches vasculaires du tissu sain où les cellules endothéliales
régulent la fonction des NSCs (Shen et al., 2004) ainsi qu’à la forte angiogenèse observée
dans les glioblastomes (Folkerth, 2004; Plate et al., 1992).
Les gCSCs interagissent avec les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, permettant le
maintien de leur « état souche » et la propagation de la tumeur, notamment via la sécrétion
paracrine de facteurs de croissance endothéliaux (Calabrese et al., 2007). D’autre part, les
cellules gCSCs elles-mêmes entretiennent cette niche périvasculaire par la sécrétion de
facteurs angiogéniques, tels que VEGF (vascular endothelial growth factor) ou
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
60
CXCL12/SDF-1 (stromal derived factor-1) stimulant la croissance des cellules endothéliales
(Bao et al., 2006b; Folkins et al., 2009).
Les péricytes sont recrutés par les cellules endothéliales ; ils stabilisent la membrane basale
des vaisseaux sanguins et sont impliqués dans la prolifération de structures microvasculaires,
favorisant ainsi l’angiogenèse (Wesseling et al., 1995). D’autre part, la dissociation de ces
péricytes des cellules endothéliales perméabilise la vascularisation aux cellules tumorales et
facilite ainsi la formation de métastases (Hashizume et al., 2000).
4.3.2. Nichehypoxique
La diminution de la pression partielle en oxygène (PO2) induit l’expression du facteur de
transcription HIF-1 (hypoxic inducible factor -1 alpha) ; la translocation de ce facteur dans
le noyau et son association avec le facteur HIF-1, exprimé de façon ubiquitaire, induit
l’expression de nombreux gènes impliqués entre autres dans la prolifération et le degré de
différenciation (Li et al., 2009c; Seidel et al., 2010). On observe ainsi l’augmentation de
l’expression des marqueurs de cellules souches (CD133, Oct4, Sox2) et la diminution des
marqueurs de différenciation (GFAP) ; les taux de prolifération et le potentiel d’auto-
renouvellement des gCSCs sont également plus importants (Heddleston et al., 2009; McCord
et al., 2009; Soeda et al., 2009), l’angiogenèse est stimulée via l’expression du facteur VEGF
(Li et al., 2009c) ainsi que la voie de signalisation de Notch (Keith and Simon, 2007).
L’importance de la niche hypoxique dans le caractère souche des cellules est également mis
en évidence par l’acquisition de telles propriétés par des cellules différenciées mises en
conditions hypoxiques (Heddleston et al., 2009) ainsi qu’avec le maintien et la régulation des
NSCs dans ces mêmes conditions (De Filippis and Delia, 2011).
Le degré d’hypoxie des cellules influence l’expression de facteurs HIFs, de façon tout à fait
réversible (ce qui fait par ailleurs de ce facteur un très bon indicateur de la PO2). Selon la
sévérité de l’hypoxie, l’expression des facteurs HIF-1 et HIF-2 varie. L’augmentation de la
quantité HIF-1 lorsque la PO2 diminue est observée à la fois dans les gCSCs et les NSCs ;
par contre HIF-2 est exprimé uniquement dans les gCSCs et est corrélé avec la survie des
patients (Li et al., 2009c).
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
61
La présence de CSCs à la fois dans les zones périvasculaires et hypoxiques met en évidence la
présence d’au moins deux niches distinctes contenant les gCSCs bien que le facteur VEGF
soit sécrété par les cellules présentes dans ces deux zones.
Outre l’induction des propriétés souches et tumorigéniques des gCSCs, l’expression des
facteurs HIF entraine un changement métabolique de la cellule qui utilise alors la glycolyse
aérobie : il s’agit de l’effet Warburg (Figure 28). Initialement identifié dans les tissus
néoplasiques (Warburg, 1956; Warburg et al., 1927), l’effet Warburg est également présent
dans les tissus sains contenant des cellules se divisant rapidement, telles que les cellules ES et
les lymphocytes : les besoins énergétiques des cellules en expansion rapide sont
préférentiellement satisfaits par la production d’ATP via la voie métabolique de la glycolyse
aérobie. Le détournement de l’entrée du pyruvate dans la mitochondrie, initié par l’inhibition
de la pyruvate déshydrogénase par HIF1, au profit de la glycolyse génère la formation de
lactate, toxique pour la cellule. L’excrétion de l’acide lactique par le transporteur MCT4
(mono carboxylic transporteur 4), s’accompagne d’une acidification du milieu extracellulaire
et d’une alcalinisation du milieu intracellulaire (Chiche et al., 2009).
Le lactate produit par les CSCs et excrété dans le milieu extracellulaire régule l’activité des
cellules endothéliales : le lactate est importé dans la cellule endothéliale via le transporteur
MCT1, activant la transcription du gène de l’interleukine 8 par NF-B et stimulant ainsi la
migration et la prolifération des cellules endothéliales dans un processus angiogénique
(Vegran et al., 2011).
L’acidification du milieu extracellulaire, ou stress acide, joue aussi un rôle dans l’induction
et le maintien des propriétés souches des cellules (expression de marqueurs, auto-
renouvellement et prolifération cellulaire) ainsi que dans la sécrétion de facteurs antigéniques
tels que VEGF (Hjelmeland et al., 2011; Xu et al., 2002). Ceci passe notamment par
l’augmentation de l’expression de HIF2 (Heddleston et al., 2009) et par l’expression de
certains de ses gènes cibles dont Oct4, Glut1 et SerpinB9 impliqués dans le phénotype des
cellules souches et la croissance des cellules tumorales (Covello et al., 2006). Le rôle du stress
acide dans la croissance tumorale a également été mis en évidence dans un modèle de cancer
du sein où l’élévation du pH, sans modifier l’hypoxie, a permis de réduire l’invasion de la
tumeur (Robey et al., 2009).
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
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surface de cellules tumorales et dont l’expression est corrélée avec la progression et l’invasion
tumorales (Nakada et al., 1999; Sameshima et al., 2000). De façon indépendante, il a
également été montré, dans des cocultures de cellules de glioblastome et d’astrocytes, que
l’activation de proMMP2 en MMP2 est stimulée par la sérine protéinase Plasmine. Dans ce
cas, la conversion du facteur proMMP2 en MMP2 passe par l’activation du facteur uPA
(urokinase-type plasminogen activator, sécrété à la fois par les cellules de glioblastome et les
astrocytes) via sa liaison à son récepteur uPAR (exprimé par les astrocytes), permettant la
conversion du plasminogène (sécrété par les cellules tumorales) en Plasmine (Le et al., 2003).
Ces deux mécanismes ne sont pas exclusifs : l’activité enzymatique de la Plasmine pourrait
nécessiter la présence de MT-MMP afin d’activer le facteur MMP.
D’autre part, les astrocytes sécrètent des facteurs neurotrophiques dont TGF(transforming
growth factor alpha), CXCL12 (CXC motif ligand 12), S1P (sphingosine-1-phosphate),
GDNF (glial cell line-derived neruotrophic factor) augmentant les capacités d’invasivité des
cellules de glioblastome via la déstructuration de la matrice extracellulaire (Hoelzinger et al.,
2007).
4.3.4. Nicheimmunitaire
Au sein des gliomes, les macrophages, ou cellules microgliales, comptent pour 5 à 20 % des
cellules de la masse tumorale (Watters et al., 2005). Contrairement à ce que l’on pourrait
penser, la présence de macrophages au niveau de la tumeur ne constitue pas une réaction de
défense de l’organisme visant à éliminer les cellules néoplasiques mais plutôt un mécanisme
mis en place pour promouvoir la croissance de la tumeur ; une forte densité de macrophages
au sein du tissu tumoral est associée à un pronostic plus défavorable pour les patients (Leek et
al., 1996). Les cellules microgliales favorisent la croissance tumorale dans plusieurs
contextes :
- Dans la niche périvasculaire, ce sont des médiateurs de la formation de métastases
(Pollard, 2004)
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
64
- Autour des zones de nécrose, ils activent l’angiogenèse via la sécrétion de facteurs
proangiogéniques (VEGF, IL-1, TNF, angiogenine, semaphorin 4D, MMP-9)
(Coffelt et al., 2009; Du et al., 2008b)
- Aux extrémités de la tumeur, les macrophages sont impliqués dans l’invasion des
cellules tumorales (Condeelis and Pollard, 2006)
Ceci est permis d’une part par la suppression de la fonction d’effecteurs du système
immunitaire et d’autre part par la sécrétion de cytokines et facteurs de croissance permettant
aux cellules néoplasiques d’échapper au système immunitaire, de proliférer et de migrer
(Watters et al., 2005) (Figure 29). En effet, selon les stimuli extracellulaires, les monocytes
peuvent se différencier en macrophages pro-inflammatoires (phénotype M1) ou anti-
inflammatoires (phénotype M2). Au sein de la tumeur, le phénotype observé est très proche
du phénotype M2 : les macrophages favorisent la progression tumorale par leur incapacité à
activer les cellules T du système immunitaire mais aussi par la sécrétion de facteurs pro-
tumorigéniques tels que TGF, IL-10 ou les métalloprotéases (Chong et al., 1999; Pollard,
2004).
Le microenvironnement immunitairement favorable aux gCSCs serait mis en place par les
gCSCs elles-mêmes (Figure 29) via
- la sécrétion de facteurs chimio-attractants (MCP-3 monocyte chemoattraction protein
3, CCL2 macrophage chemoattractant protein 1) permettant de recruter des
macrophages anti-inflammatoires (Okada et al., 2009; Zhang et al., 2012)
- la suppression des fonctions inflammatoires de ces macrophages par la sécrétion de
cytokines immunosuppressives (IL-10, IL-4, IL-6, TGF, EG2) (Albesiano et al.,
2010)
- le recrutement de cellules T régulatrices (Treg) à la périphérie de la tumeur (Grauer et
al., 2007)
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
66
l’apoptose des cellules T, permettant aux gCSCs d’échapper au système immunitaire (Dong et
al., 2002; Wei et al., 2010a).
ii. Processusdedérégulationdel’immunitécellulaire
Les gCSCs sont également capables d’étendre le pool de cellules T régulatrices (Treg), de
supprimer la prolifération et d’induire l’apoptose des cellules T (Wei et al., 2010a).
L’imagerie in vivo de cellules Treg dans un modèle de cellules souches hématopoïétiques a pu
mettre en évidence le rôle essentiel de ces cellules en tant que médiatrices des avantages
immunitaires des cellules souches, leur conférant un environnement immunosuppressif et
corroborant le concept de niche immunitaire entourant les cellules souches normales (Fujisaki
et al., 2011). L’effet immunosuppressif des cellules Treg passe en partie par l’expression de
l’enzyme hème oxygenase-1 dont l’activité génère du monoxyde de carbone, responsable de
l’inhibition de la sécrétion d’interleukine 2 et donc de la prolifération des cellules T (El
Andaloussi and Lesniak, 2007; Pae et al., 2004).
iii. Processusdesécrétiondefacteursimmunosuppressifs
Les gCSCs sécrètent plusieurs cytokines dont TGF-(tumor growth factor beta), PGE2
(prostaglandine E2), CCL2 (chimiokine ligand 2) et Galectine 3 (Wei et al., 2010a). TGF-
pourrait être impliqué dans la prolifération des cellules Treg (Wei et al., 2010a), PGE2
diminue l’expression du MHC de classe II et active la prolifération des cellules Treg
(Albesiano et al., 2010), CCL2 est un chimioattractant pour les cellules Treg possédant le
récepteur CCR2 (Jordan et al., 2008), Galectine 3 appartient à une famille de molécules
d’adhésion ayant une affinité pour les -galactosides, exprimés dans les gliomes et est
impliquée dans l’induction de l’apoptose des cellules T (Peng et al., 2008).
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
69
5.1. Radiorésistance
Suite à une irradiation, les gCSCs ont des mécanismes de réparation de l’ADN plus efficaces
que les cellules différenciées de la masse tumorale : l’activation préférentielle des points de
contrôle des lésions de l’ADN et l’augmentation de la capacité de réparation de l’ADN. Le
groupe de Rich a en effet mis en évidence que la fraction des gCSCs est enrichie après
irradiation et que celles-ci conservent leurs capacités de différenciation in vitro et de
tumorigénicité in vivo (Bao et al., 2006a).
Suite à une radiation ionisante, les gCSCs montrent une activation des points de contrôles de
réparation de l’ADN via la phosphorylation activatrice de protéines telles que ATM (ataxia
telengectasia mutation), Rad17 (protéine régulatrice cruciale du point de contrôle des lésions
de l’ADN), Chk1 et Chk2 (checkpoint kinases 1 et 2) de façon préférentielle dans ces
cellules ; l’activation de ces protéines induit l’arrêt du cycle cellulaire (activation de p53 et
inactivation de kinases cyclines dépendantes), permettant la réparation des cassures double
brin de l’ADN et ainsi l’échappement aux mécanismes apoptotiques (Bao et al., 2006a).
D’autres voies de signalisation essentielles des cellules souches sont activées par les
radiations ionisantes des gCSCs, parmi lesquelles Wnt/-caténine (Kim et al., 2012), Notch
(Wang et al., 2010a), Sonic Hedgehog/Gli (Clement et al., 2007), Akt (Li et al., 2009a),
Bmi-1 (Facchino et al., 2010) ou encore la perte du suppresseur de tumeur PTEN (Jiang et
al., 2007). L’activation de ces voies de signalisation non seulement promeut le caractère
souche des cellules mais permet également de tolérer les altérations de l’ADN si celles-ci ne
sont pas réparées (Rich, 2007).
Comme nous l’avons vu précédemment, les cellules tumorales et les gCSCs sont intégrées
dans un microenvironnement leur conférant des propriétés de résistance particulières. La
présence de gCSCs dans des niches hypoxiques leur apporte une protection supplémentaire
face aux radiations ionisantes. En effet, dans la cellule, l’oxygène réagit avec les radicaux
libres pour former les ROS (Reactive Oxygen Species : OH°, HO2°, ROO°, H2O2, …)
responsables du stress oxydant ; lors d’une radiothérapie, ces ROS sont les médiateurs de
l’effet des radiations ionisantes sur les dommages causés à l’ADN.
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
70
5.2. Chimiorésistance
La surexpression de la MGMT, impliquée dans les mécanismes de réparation de l’ADN, peut
être observée dans les cellules différenciées de la masse tumorale (voir point I-2.1.3 page 20)
et l’analyse des transcrits de gCSCs montre une forte augmentation de l’expression de cette
enzyme, indiquant l’importance de ce mécanisme de résistance dans les gCSCs (Liu et al.,
2006). Des substrats synthétiques de MGMT (O6-methylguanine, O6-benzylguanine) ont été
testés afin de diminuer le contenu cellulaire de MGMT active avant la chimiothérapie mais
cette stratégie a révélé une myélotoxicité (Quinn et al., 2005; Quinn et al., 2002).
L’un des principaux mécanismes de résistance intrinsèque des gCSCs aux agents
chimiothérapeutiques est la surexpression de transporteurs d’efflux conférant un phénotype de
« multidrug resistance » (MDR) aux cellules. Les molécules chimiques sont alors
transportées, activement et de façon non spécifique, à travers la membrane plasmique via les
transporteurs ABC (ATP binding cassette). Ces protéines ABC ont un rôle important en tant
que transporteurs de composés hydrophiles et hydrophobes à travers le placenta et l’intestin
(rétention de drogues dans le lumen) et au niveau de la barrière hématoencéphalique afin de
protéger les cellules d’effets cytotoxiques. Les gCSCs montrent une surexpression des
transporteurs ABCB1 (glycoprotéine P, MDR-1), ABCC1 (MRP1) et ABCG2 (BCRP1)
(Dean et al., 2005). Le transporteur ABCB1 est impliqué dans l’efflux de la Doxorubicine,
l’Ectoposide (VP16), la Carboplastine, l’Erlotinib (inhibiteur de l’EGFR), la Vincristine et le
BCNU (1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea) et le transporteur ABCG2 dans la résistance au
Témozolomide, à la Carboplatine, au Paclitaxel (Taxol) et à l’Ectoposide (VP16) (Ejendal and
Hrycyna, 2002). Jusqu’à ce jour, les tentatives d’utilisation d’inhibiteurs (parmi lesquels
Reserpine, Verapamil, Cyclosporine) des transporteurs ABC en tant que sensibilisateurs des
cellules inductrices de tumeur ont échoué, car soit sont inefficaces à des doses non toxiques,
soit montrent une activité pharmacocinétique non spécifique (interaction entre l’agent
chimiothérapeutique et l’inhibiteur du transporteur ABC), soit affectent l’élimination des
agents chimiothérapeutiques du plasma, soit induisent des dommages aux cellules souches
normales (Schmalz et al., 2011). Un autre mécanisme d’élimination des agents
chimiothérapeutiques par la cellule est leur accumulation dans des microvésicules (point II-
4.2.4.2.2) permettant leur élimination de la cellule (Shedden et al., 2003), leur séquestration
dans des vésicules intracellulaires, la modification de la cible cellulaire ou encore
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
71
l’inactivation de la molécule par un accroissement de sa métabolisation (Gottesman et al.,
2006).
D’autre part, de la même façon que pour les cellules souches normales, les CSCs sont en
général en état de quiescence, i.e. elles n’entrent pas dans le cycle cellulaire et restent en
phase stationnaire G0 (Figure 32). Les chimiothérapies et radiothérapies conventionnelles
ciblent les cellules en prolifération et nécessitent l’activation du cycle cellulaire pour
déclencher l’apoptose ; la quiescence des CSCs est donc un mécanisme de résistance aux
thérapies ciblant l’ADN.
5.3. Résistanceàl’apoptose
Les mécanismes de résistance aux agents chimiothérapeutiques des gCSCs sont renforcés par
une moindre sensibilité aux stress apoptotiques dus aux faibles niveaux d’expression de
Caspases (notamment Caspase 8) médiant l’apoptose (Capper et al., 2009) et à la
surexpression d’un inhibiteur de la voie NF-κB (tumor necrosis factor-α-induced protein 3
TNFAIP3, aussi appelé A20) (Hjelmeland et al., 2010).
D’autre part, les gCSCs répondent faiblement à l’apoptose extrinsèque (Capper et al.,
2009). Dans un environnement normal, l’apoptose extrinsèque est activée par le TNF (tumor
necrosis factor alpha) via la liaison de ligands proapoptotiques, FasL et TRAIL, sur leurs
récepteurs à la surface de la cellule, respectivement Fas et DR4/DR5 (Huang et al., 1999;
MacFarlane et al., 1997). Ces voies de signalisation induisent le recrutement de FADD (Fas
associated death domain) et de la procaspase 8 dans le complexe DISC (death inducing
signaling complex) et permettent ainsi la conversion de la procaspase 8 en caspase 8 (Muzio
et al., 1998) ; dans le cytoplasme, la caspase 8 active les caspases effectrices 3, 6 et/ou 7
impliquées dans l’apoptose.
Ces effets sont amplifiés par la surexpression dans les gCSCs de molécules anti-
apoptotiques (Bcl-2, FLIP, BCL-XL) et d’inhibiteurs de protéines pro apoptotiques
(XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, Survivine) (Liu et al., 2006) qui agissent via l’inhibition des
Caspases 3, 7 et 9 (Schimmer, 2004).
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
72
III. Versdenouvellesvoiesthérapeutiques
Depuis la mise en évidence des CSCs, leurs propriétés d’invasivité et de résistance aux
thérapies classiques ainsi que leur capacité à régénérer la tumeur font de ces cellules un sujet
d’étude de choix et les cibles du développement de nouvelles thérapies dans de nombreux
cancers. La complexité et la richesse des interactions intercellulaires ainsi que du
microenvironnement entourant les cellules tumorales permettent à ces cellules de pouvoir
s’adapter rapidement à des changements de leur biologie induits par divers agents chimiques
bloquant l’une ou l’autre voie de signalisation. Ainsi, la culture des gCSCs dans des
conditions induisant la différenciation fait apparaitre des marqueurs de cellules différenciées à
la surface des cellules pendant quelques jours (4 jours) puis l’expression de certains d’entre
eux (NF, β-tubulin III, GFAP) diminue ; ceci a été interprété comme une capacité de ces
cellules à résister à la différenciation (Gunther et al., 2008; Zhang et al., 2006a). Afin de
pouvoir empêcher la cellule de trouver des voies d’échappement aux thérapies appliquées, une
stratégie à adopter pourrait être l’inhibition de plusieurs voies de signalisation en même
temps.
Une étude récente portant sur l’expression différentielle du protéome membranaire de cellules
d’astrocytomes de grades III et IV, comparé à du tissu cérébral obtenu lors de chirurgies de
patients épileptiques, a mis en évidence la modification des niveaux d’expression de protéines
impliquées dans la signalisation calcique (Polisetty et al., 2012b) ; cette dérégulation de
l’expression des protéines de liaison du calcium a également été identifiée au niveau du
transcriptome (Dong et al., 2010). Ceci est corrélé avec l’implication de la signalisation
calcique dans les divers aspects de la tumorigenèse : mobilité des cellules, angiogenèse,
génotoxicité, transcription, différenciation, régulation du cycle cellulaire, apoptose (Monteith
et al., 2007). L’omniprésence du calcium dans la vie de la cellule et des cellules tumorales,
ainsi que dans le microenvironnement tumoral, témoigne de l’importance des conséquences
que peuvent avoir des altérations de l’expression de protéines participant à la signalisation
calcique. D’autre part, il a été montré que la sensibilité au calcium des cellules ayant un
phénotype MDR est différente de celle des cellules sensibles aux molécules chimiques
(Sulova et al., 2005).
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Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
74
Tamoxifène est un antagoniste des récepteurs à l’estrogène (RE) utilisé dans le cancer du sein
mais a également un effet cytotoxique, indépendamment des RE, en se liant à CaM ; le groupe
de Luis Villa a montré que l’utilisation d’antagonistes de CaM (composés W7 et TFP) permet
de sensibiliser in vitro les cellules au Tamoxifène et d’induire l’apoptose de façon synergique
dans des cellules tumorales épithéliales (Frankfurt et al., 1995). Un autre antagoniste de CaM,
dérivé alcaloïde bisbenzylisoquinoline (EBB), a été utilisé comme inhibiteur du phénotype
MDR et potentialisateur de la doxurubicine dans des cellules de cancer du sein ; l’addition de
cet antagoniste permet en effet non seulement d’inhiber la protéine P-gp mais également
d’interférer avec la prolifération du cycle cellulaire, arrêté en phase G2/M (Figure 32), et
d’augmenter l’effet apoptotique de la Doxorubicine (Liu et al., 2010a). Le blocage chimique
G2/M est irréversible et induit des cassures double brin de l’ADN ainsi que des désordres
chromosomiques importants (Sorenson and Eastman, 1988). L’utilisation d’inhibiteurs de
CaM permet donc de potentialiser l’effet d’agents chimiothérapeutiques ciblés et d’obtenir
un bénéfice thérapeutique en limitant la toxicité de ces agents sur les tissus sains.
L’inhibition de CaM a également été considérée comme une thérapie à part entière,
permettant de cibler les protéines directement impliquées dans la tumorigenèse, dont K-ras
(Villalonga et al., 2001), l’EGFR (Li et al., 2004a) ou le récepteur aux androgènes Erb2 (Li et
al., 2004b). L’activation ainsi prolongée des voies de signalisation de K-ras et ERK1/2 induit
l’accumulation de p21WAF, inhibiteur du cycle cellulaire, produisant un arrêt de la
prolifération cellulaire dans le cas du cancer colorectal (Shim et al., 2007b). L’utilisation en
solo d’un inhibiteur de CaM (Clozapine) a aussi été testée dans le cas de cellules de
glioblastome n’exprimant pas PTEN pour inhiber la phosphorylation d’Akt. Cette inhibition
empêche d’une part l’expression de la cycline D1, essentielle dans la progression du cycle
cellulaire, et induit d’autre part l’augmentation de l’activité de GSK3, responsable de la
dégradation de la cycline D1 (Figure 6) ; les cellules s’accumulent alors en phase G1 (Shin et
al., 2006).
La plupart des études cherchant à identifier des composés thérapeutiques, inhibiteurs de CaM
ou non, se base sur la réponse cellulaire induite par des cellules différenciées de la masse
tumorale ou encore sur des lignées de cellules tumorales. Une étude récente a identifié la
Thioridazine comme ciblant sélectivement les CSCs dans les leucémies tout en n’ayant aucun
effet sur les cellules souches normales. Cet antagoniste de CaM induit la différenciation des
CSCs et permet de diminuer la prolifération et la clonogénicité des CSCs de leucémie sévère
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
75
(AML) sans induire de cytotoxicité ; les auteurs de cette étude proposent l’utilisation de la
Thioridazine en synergie avec un agent antiprolifératif (cytarabine) classiquement utilisé dans
le traitement des leucémies. Cependant, cette molécule semble inhiber un récepteur
dopaminergique et ne peut donc être utilisée pour cibler les gCSCs (Sachlos et al., 2012).
L’ensemble de ces études met en évidence la non-équivalence des inhibiteurs de CaM dans
leur mode d’action (induction de la différenciation, de l’arrêt du cycle cellulaire, d’une
cytotoxicité) et dans les cellules ciblées (CSCs, cellules tumorales non souches). D’autre part,
la toxicité de ces molécules sur les tissus sains n’est pas toujours abordée et aucun modèle in
vivo n’a permis à ce jour de valider ces composés.
OBJECTIFS
Les CSCs identifiées au sein de différentes tumeurs sont devenues des cibles privilégiées dans
l’établissement de traitements thérapeutiques. Leurs propriétés d’auto-renouvellement, de
différenciation et de résistance aux différents traitements thérapeutiques classiquement utilisés
leur permettent de régénérer la tumeur de façon très agressive ; la compréhension de la
physiopathologie de ces cellules et l’identification de traitements capables de les éradiquer ou
d’atténuer leur virulence (notamment en induisant leur différenciation) est au cœur de la
recherche contre le cancer.
Dans ce cadre, mon projet s’est attaché à identifier des biomarqueurs de gCSCs afin d’une
part de caractériser et comprendre leur état physiologique particulier et d’autre part de pouvoir
les cibler efficacement dans des thérapies biologiques en exploitant le rôle de la Calmoduline
dans la physiologie des CSCs et les promesses de l’immunothérapie dans le traitement des
glioblastomes.
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
76
Mon travail a porté sur des gCSCs isolées de tumeurs glioneuronales malignes, correspondant
aux gliomes de grades III et IV de la classification de l’OMS, par l’équipe du Dr Hervé
Chneiweiss (INSERM U752, Hôpital Sainte Anne, Paris). Les biopsies tumorales de patients
de la Pitié Salpétrière ont été disséquées, et les cellules ont été mises en culture durant
plusieurs mois de façon à ne sélectionner que celles capables de s’auto-renouveler (Figure
17) ; ces cellules ont ensuite été caractérisées pour leur clonogénicité, leur capacité de
différenciation et leur capacité à générer une tumeur orthotopique dans des souris
immunodéficientes (Patru et al., 2010) ; quatre de ces types cellulaires ont été utilisés au cours
de mes recherches (TG01, TG10, TG16 et OB1).
Les objectifs du travail présenté ont été les suivants :
1. Caractériser de nouveaux inhibiteurs de la Calmoduline utilisables en thérapie et
identifier des marqueurs de la physiopathologie des gCSCs à travers l’utilisation de
ces inhibiteurs
2. Caractériser le protéome membranaire des gCSCs dans le but d’identifier des
protéines spécifiques de ce type de cellules qui pourraient être utilisées comme
biomarqueurs ou comme cibles thérapeutiques
Au cours de ce travail, les gCSCs ont été comparées à plusieurs types cellulaires :
“Biomarkers, or biological markers, are indicators of a biological state; they
are "characteristics that are objectively measured and evaluated as indicators
of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacologic
responses to therapeutic intervention” (NIH, 1998)
Ces biomarqueurs peuvent éventuellement être utilisés comme outils de
recherche, comme cibles thérapeutiques ou encore comme adjuvants
thérapeutiques selon leur nature.
Chapitre1:GlioblastomesetCellulesPropagatricesdeTumeur
77
- Les cellules U-87 MG : lignée cellulaire établie à partir d’un glioblastome.
L’utilisation de ces cellules permettra de différencier des propriétés propres aux
gCSCs de celles des cellules de la masse tumorale
- Les cellules NSC : cellules souches neurales. Ces cellules primaires seront utilisées
pour différencier les gCSCs de cellules saines ayant des propriétés similaires
- Les cellules HEK : lignée cellulaire épithéliale dérivée de cellules embryonnaires de
rein humain. Ces cellules seront utilisées en tant que « contrôle » global
78
Chapitre2: Recherche de marqueurs de l’état physiologique des
cellules propagatrices de glioblastome à travers la signalisation
calciqueetl’étudedelaCalmoduline
Chapitre2
Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedes
cellulespropagatricesdeGlioblastomeàtraversla
signalisationcalciqueetl’étudedelaCalmoduline
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
79
I. Signalisationcalcique
Les mécanismes de signalisation cellulaire permettent de transmettre une information depuis
la surface de la cellule jusqu’à une ou plusieurs cibles intracellulaires générant un évènement
cellulaire en réponse au stimulus reçu. Cette information est codée, transmise et décodée au
moyen d’un nombre restreint de messagers intracellulaires, parmi lesquels le calcium (Haiech
et al., 2011).
Le calcium (Ca²+) joue un rôle central dans le contrôle de nombreux procédés cellulaires,
incluant la contraction musculaire ou le relâchement de neurotransmetteurs pour les plus
connus, mais également la fertilisation, la migration cellulaire, la prolifération, la transcription
de gènes, l’apoptose, le métabolisme mitochondrial, l’exocytose et bien d’autres (Berridge et
al., 1998; Berridge et al., 2000b).
Comme tout signal, le signal calcium peut être divisé en 4 unités fonctionnelles (Haiech et al.,
2011) :
- le stimulus, ou premier messager, module l’entrée et/ou la sortie de calcium
(encodage de l’information). Cette modulation s’effectue par des mécanismes
générateurs (ON) et suppresseurs (OFF) de Ca²+
- les processus sensitifs du signal calcium permettent le décodage de l’information
- les mécanismes de traduction de l’information, permettent d’associer le décodage de
l’information à un mécanisme moléculaire agissant dans une cellule donnée dans un
état physiologique spécifique
- les évènements cellulaires activés suite à la traduction de l’information, dont la
mobilité, modification du métabolisme, modulation de la prolifération, de la
différenciation…
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
80
1. Lecalcium:delatoxicitéaumessagerincontournable
Le calcium est le 4e élément le plus abondant dans l’océan après le sodium, le chlore et le
magnésium. Cependant, à de fortes concentrations, le Ca²+ s’avère toxique pour la cellule :
agrégation de protéines et d’acides nucléiques, modification de l’intégrité des lipides
membranaires, précipitation des phosphates, … les premières formes de vie ont donc
développé un système leur permettant de maintenir de faibles concentrations cytoplasmiques
en Ca²+, aux alentours de 100 nM, soit 10 000 à 20 000 fois plus faibles que dans le milieu
extracellulaire. Les pompes calciques présentes au niveau du plasmalemme des bactéries
primitives sont très similaires aux pompes calciques ATPases de la membrane plasmique
(PMCA) des eucaryotes et utilisent probablement le gradient de protons ou l’hydrolyse des
phosphates comme source d’énergie (Berkelman et al., 1994; Kanamaru et al., 1993).
Parmi les ions présents dans le cytoplasme en plus du Ca²+, on trouve Na+, H+, Mg²+, Zn²+ et
K+. Le potassium et le magnésium sont pompés à l’intérieur de la cellule et par conséquent
présents en grande quantité dans le cytoplasme (respectivement 10-1 et 10-3 M) alors que le
calcium et le sodium sont expulsés du cytoplasme pour atteindre des concentrations de 10-7 et
10-2 M respectivement. À l’intérieur du cytoplasme, une multitude protéines s’associent aux
ions Ca²+ et Mg²+ pour former des complexes avec des constantes d’associations de 10-3 à 10-4
M ; en conditions physiologiques ces protéines sont donc liées au Mg²+ mais pas au Ca²+. De
nombreuses cellules ont de plus des protéines ayant des constantes d’associations de 10-6 M
pour Ca²+ ; un simple changement de l’activité de la pompe calcique de la membrane
plasmique (procédé peu coûteux en énergie) peut rapidement élever le calcium cytosolique à
des concentrations de 10-5 M et ainsi permettre sa liaison à des protéines spécifiques. La
concentration en Mg²+ étant déjà élevée, une augmentation rapide et importante du Mg²+ telle
que celle de l’ion Ca²+ demanderait beaucoup d’énergie, empêchant ainsi l’utilisation du Mg²+
dans le cas d’activations rapides. La cellule a en effet tiré parti de la rapidité de l’encodage
d’information en [Ca²+] pour l’utiliser dans de nombreuses voies de signalisation. D’autre
part, en tant que cation divalent, le Ca²+ peut former des complexes plus stables et plus
spécifiques que les cations monovalents avec les substances organiques, dont les protéines,
sans toutefois former de liaisons covalentes (Schaub and Heizmann, 2008; Williams, 1998).
Ces propriétés uniques font du Ca²+ l’un des seconds messagers les plus utilisés par la cellule,
d’autant plus qu’il n’est ni synthétisé ni dégradé.
2. Élém
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Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
83
Encart 4 : Motif EF-hand
Le motif EF-hand est constitué d’une hélice N terminale (hélice E) suivie d’une boucle centrale de
coordination du calcium et d’une hélice C terminale (hélice F) ; l’arrangement tridimensionnel de ces
domaines peut être représenté par les doigts d’une main où le pouce et l’index représentent les
hélices alpha (Kretsinger and Nockolds, 1973) (Figure 35B).
Ca²+ lie chaque EF-hand dans un arrangement pentagonal bipyramidal à travers des liaisons ioniques
de faible énergie ; l’annotation des résidus de la boucle est basée sur la séquence linéaire des acides
aminés constituant cette boucle. Dans la boucle canonique du motif EF-hand le Ca²+ est coordonné
par les atomes d’oxygène des chaines latérales des résidus 1, 3 et 5 de la boucle (en général résidus
Asp, les résidus 3 et 5 peuvent être Asn). Les autres liaisons se font avec l’atome d’oxygène du
squelette du 7e résidu, une molécule d’H2O coordonnée par la chaine latérale du 9e résidu (D, E, S, T
ou N) et la chaine latérale d’un résidu acide (en général Glu) en position 12 (Figure 35C). Le motif
EF-hand possède d’autres éléments conservés ne liant pas Ca²+ : Gly en position 6, un résidu
hydrophobe (Ile, Leu, Val) en position 8 (Gifford et al., 2007). D’après ces observations, le motif
EF-hand peut être représenté par le patron Dx[DN]xDGx[ILV][DSTN]x (Rigden et al., 2011).
Ce motif contient le patron Dx[DN]xDG retrouvé dans des boucles appartenant à des structures très
diverses mais dont les ligands liant Ca²+ se superposent très bien (Rigden and Galperin, 2004). La
présence de ce patron dans des contextes totalement différents implique soit l’existence d’un
épissage alternatif des boucles d’une protéine à l’autre soit une évolution convergente de différents
motifs, hypothèse privilégiée aujourd’hui. La base de données ELM (eukaryotic linear motif,
(http://elm.eu.org/infos/news.html) regroupe les motifs linéaires impliqués dans des sites
fonctionnels de protéines chez les eucaryotes. La comparaison des fréquences d’apparition de
plusieurs motifs dans des protéines n’appartenant pas à la même famille met en évidence
l’importante représentation du patron Dx[DN]xDG : la moyenne d’apparition de 17 motifs différents
de cette base de données est de 9,2 et cette valeur tombe à 7,8 pour les motifs contenant 4 positions
définies alors que dans le cas du motif Dx[DN]xDG on obtient au moins 16 instances. Deux
particularités de ce motif peuvent expliquer sa formation dans différents contextes : sa séquence
riche en résidus aspartiques et sa régularité. De par la définition du patron Dx[DN]xDG, ce motif
contient au moins 2 à 3 résidus Asp, sans compter les résidus intervenant dans la coordination de
l’ion et situés à 2 résidus de ce motif : l’acide aspartique est répété en tandems. De plus, ce motif est
très régulier et pourrait être symbolisé par (Dx)3 où la position x est souvent occupée par un résidu
glycine : le motif Dx[DN]xDG peut très bien avoir évolué à partir d’une répétition de la séquence
DG. À ceci s’ajoute la proximité des codons utilisés le plus souvent par la cellule eucaryote pour Asp
(GAT ou GAC) et Gly (GGN) permettant d’expliquer l’apparition de Gly dans une séquence riche en
Asp. Aujourd’hui, ces différentes particularités du patron Dx[DN]xDG semblent expliquer la
fréquence anormale d’apparition de ce motif dans des protéines et structures très différentes. La
capacité de ce motif à lier un ion est apportée par i) un espacement suffisant entre les résidus du
début et la fin du motif, indépendamment de la variation de la structure secondaire et ii) la présence
de résidus acide ou amide, naturellement importants à la surface de la protéine (Rigden et al., 2011).
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protéine
Ce nom
système
régulati
(Kipper
Figure 36Suite à unl’homéostaconformatcytoplasmtraduit ens
Chapitre
son du Ca²+
nt ainsi la
mationnels p
otéine ont fa
es liant Ca²
aire dans l
e senseur d
mbre limité
e de signa
on des mou
rt, 1987) (Fi
: Schématisatin stimulus, les asie calcique dtion de cette p
me pour traduire suite en évènem
2:Recherà
+ au motif
fonction de
plus ou moin
fait de ce m
²+ : ce moti
les organism
du Ca²+ cont
d’éléments
alisation ca
uvements de
igure 36).
ion des 4 unitéactivités du cande la cellule. Lprotéine, lui pe
le signal calciument cellulaire e
chedemaràtraversla
EF-hand m
e la protéine
ns importan
motif une ca
if apparaît c
mes multic
tenant 4 mo
s a permis a
alcique : le
e bactéries,
s fonctionnellenal CaV et de l
La liaison du Cermettant de dum en modulanen réponse au st
rqueursdeasignalisati
modifie la c
e en répons
nts suivant l
aractéristiqu
chez les ba
cellulaires.
otifs EF-han
aux procary
es fluctuati
des réaction
es du signal Cala pompe Ca²+
Ca²+ aux motifdécoder le signnt l’activité de ptimulus de dépa
l’étatphysioncalciqu
onformation
se à la liais
la liaison d’
ue conservé
actéries, est
Les bactér
nds, la Proté
yotes d’exp
ions de [C
ns de survie
a²+ des premierATPase sont m
fs EF-hand de nal calcium et protéines effectrart.
siologiquede
n de la pro
son du Ca²+
une simple
ée au cours
t abondant
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éine S (Swa
ploiter le ca
a²+] sont i
e ou encore
rs systèmes de modifiées, indula Protéine S d’interagir av
rices. La modifi
desgCSCs
otéine (Figu+. Les chan
molécule d
s de l’évolu
chez les le
nsi dévelop
an et al., 19
alcium à tra
impliquées
e dans la spo
signalisation cuisant une modi
induit un chanvec d’autres prfication de ces p
85
ure 35A)
ngements
de Ca²+ à
ution des
evures et
ppé une
87).
avers un
dans la
orulation
calcique, I. ification de ngement de rotéines du protéines se
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
86
2.1.2. Contrôlesdelasignalisationcalcique
Le développement des organismes, la nécessité de s’adapter à plusieurs stimuli et donc
d’obtenir une réponse différentielle selon le stimulus appliqué à la cellule ont favorisé
l’apparition de nouveaux éléments dans chacune des unités fonctionnelles du signal calcium
permettant de moduler chaque étape. Ainsi, outre sa fonction d’élément intermédiaire de la
signalisation calcique, le senseur du Ca²+ joue également un rôle dans l’établissement du
signal Ca²+ lui-même. En effet, ce senseur interagit d’une part avec les protéines effectrices
mais également avec les protéines d’encodage du signal, modulant leur activité et modifiant
ainsi le signal calcique.
Le second type de canal développé par les procaryotes fut le canal potassique Ca²+ dépendant
(KCa), sensible à la fois au Ca²+ et au potentiel de membrane (Franciolini and Petris, 1989).
Ce canal permet de compenser la dépolarisation membranaire suivant l’entrée du Ca²+ dans la
cellule et ainsi d’inactiver les canaux calciques voltage dépendants et de stopper le flux
d’entrée du Ca²+ dans la cellule. Il s’agit des premiers rétrocontrôles, en plus de la
modulation de l’activité de la pompe calcique, établit par la cellule sur la concentration
intracellulaire en Ca²+, permettant à la cellule de faire varier [Ca²+] tout en restant dans des
conditions physiologiques favorables (Figure 37). On voit également apparaitre l’échangeur
NCX permettant d’expulser le Ca²+ du cytoplasme en utilisant le gradient Na+ de façon très
efficace. Cet échangeur peut être couplé à une ATPase Na+/K+ dépendante (NCKX)
(Blaustein and Lederer, 1999; Cervetto et al., 1989; Lytton, 2007).
Figure 37II. Suite à unl’homéostadans la ceprotéine, lque rétrocmodulant réponse au
2.2.
L’appar
L’acqui
fusion e
plasmiq
cytoplas
calcique
apparait
endosym
Rucketts
échange
du Ca²+
Chapitre
7: Schématisati
n stimulus, les asie calcique deellule. La liaisolui permettant dontrôle sur les l’activité de pr
u stimulus de dé
Complexif
2.2.1. Com
rition des e
isition par c
entre une
que) s’accom
sme en com
e et des méc
tre fut cer
mbiotique e
sia ou Para
eur Na+/Ca²+ via cet uni
2:Recherà
ion des 4 unité
activités du cane la cellule. L’aon du Ca²+ auxde décoder le simécanismes ONrotéines effectrépart.
ficationdu
mpartiment
eucaryotes,
ces cellules
archaebacté
mpagna éga
mpartiments
canismes de
rtainement
entre les p
acoccus den
²+ (mNCX)
iporteur, im
chedemaràtraversla
és fonctionnell
nal CaV et de laugmentation dux motifs EF-haignal calcium eN et OFF du sigices. La modifi
usystèmec
tationintra
accéléra l’é
s d’un noya
érie et une
alement de
s spécialisé
e gestion du
la mitoch
remiers eu
nitrificans
et un unipo
mpliqué dans
rqueursdeasignalisati
les du signal C
la pompe Ca²+
u Ca²+ dans le cand de la Proteet d’interagir avgnal calcium po
fication de ces
chezlesorg
acellulaire
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au (les théo
eubactérie
la formatio
és, chacun d
u Ca²+ diffé
hondrie, d
ucaryotes et
ou Rhodop
orteur du C
s le contrôl
l’étatphysioncalciqu
Ca²+ des premi
ATPase sont mcytoplasme actieine S induit unvec d’autres proour terminer le protéines se tra
rganismes
des système
ories les plu
e ou des in
n d’organel
d’entre eux
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décrite com
t une proto
pseudomona
Ca²+ intrace
e de l’activ
siologiquede
iers systèmes d
modifiées, induive le canal KCa
n changement otéines du cytop
signal et ii) traaduit ensuite en
eucaryotes
s de la sign
us probable
nvagination
lles intracel
x ayant sa p
des premie
mme résulta
obactérie al
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ellulaires. D
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desgCSCs
de signalisation
uisant une modia, inhibant l’entde conformatio
plasme pour i) aduire le signal n évènement c
s
gnalisation c
es mentionn
ns de la m
llulaires, div
propre hom
ers compart
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lpha (proba
rtant à la ce
D’autre part,
mes oxydati
87
n calcique,
ification de trée du Ca²+ on de cette agir en tant calcium en ellulaire en
calcique.
nent une
embrane
visant le
méostasie
timents à
relation
ablement
ellule un
, l’entrée
ves et la
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
88
synthèse d’ATP, permet de traduire une augmentation du Ca²+ dans le cytoplasme en
production d’énergie (Nicholls, 2005).
L’origine du réticulum endoplasmique (ER) est moins claire mais une homéostasie calcique
différente de celle du cytoplasme s’y est développée : au contraire du cytoplasme où le
maintien de faibles concentrations est vital, la concentration en calcium de l’ER est plus
proche de celle du milieu extracellulaire (de 200 à 400 µM du Ca²+ libre mais 10 mM de
calcium total). Ce second gradient de Ca²+ a créé un niveau de complexité supplémentaire :
l’entrée du Ca²+ dans le cytoplasme ne se fait plus seulement depuis le milieu extracellulaire
mais également depuis les compartiments intracellulaires (Figure 39). Afin de séquestrer
l’excès du Ca²+ du lumen de l’ER, un système de protéines spécifiques a été développé. Ces
protéines lient le Ca²+ au niveau de motifs EF-hands avec un Kd de 0,5 à 1 mM de la même
façon que la Protéine S. Cependant, contrairement à la Protéine S qui est une protéine senseur
de Ca²+, la liaison du Ca²+ peut éventuellement induire un faible changement conformationnel
de ces protéines mais insuffisant pour permettre une modification de leurs activités. Ces
protéines agissent donc comme de simples réservoirs du Ca²+ : ce sont des protéines tampon
(Encart 5). D’autre part, l’apparition de l’ER s’est accompagnée du développement de
nouvelles pompes et canaux permettant les échanges du Ca²+ entre le cytosol et l’ER.
2.2.2. ApparitiondelaCalmoduline
Au cours de l’évolution, le senseur calcique des bactéries primitives, la Protéine S, n’est pas
conservé mais a été remplacé par d’autres protéines senseurs, parmi lesquelles la
Calmoduline (CaM). CaM a une séquence très proche de la Protéine S et est présente dans
tous les organismes eucaryotes. CaM est une petite protéine (148 acides aminés, ~16,8 kDa)
composée de 4 motifs EF-hands ; les deux premiers motifs forment le lobe N terminal séparé
par un court espaceur flexible du lobe C terminal composé des EF-hands 3 et 4 (Figure 38).
Figure 38Structures Ca²+ (droit
De faço
diversif
seuleme
Apparu
à 3 gèn
séparés
mammi
mammi
gènes.
ortholog
autres v
champig
la séqu
vertébré
pour 4 i
et al., 2
chromo
protéine
préservé
chromo
Chapitre
: Structures d cristallographite ; code PDB 1
on surprenan
fié au cour
ent dans sa f
il y a près
nes pour l’e
des poisso
fères (il y a
fères mais c
Le poisson
gues précur
vertébrés (F
gnons, plan
uence de C
és (Copley
isoformes d
005). D’aut
somes diffé
es, partagea
ée au maxi
somes.
2:Recherà
de la Calmoduliques de la Cal1CLL).
nte, alors q
rs de l’évo
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de 500 mill
ensemble de
ons (il y a
a 150 millio
codent pour
n zèbre con
rseurs, tous
Friedberg a
ntes et inver
CaM de Ca
et al., 1999
de CaM part
tre part, les
érents (14, 1
ant plus de
imum en ca
chedemaràtraversla
line. lmoduline dans
ue l’ensemb
olution, la
ais égaleme
lions d’anné
es vertébrés
450 millio
ons d’année
r 3 protéine
ntient aujou
codant pou
and Rhoads
rtébrés, on o
aenorhabdit
9). Le géno
tageant 89 %
gènes coda
19, 2) et on
80 % d’ho
as de mutat
rqueursdeasignalisati
s sa forme apo
ble des com
Calmodulin
ent dans sa s
ées, le gène
s. Au cours
ons d’année
s). Aujourd
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urd’hui 6 g
ur une mêm
s, 2001; Fr
observe que
tis elegans
ome d’Arab
% d’identité
ant pour Ca
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omologie av
tions, désor
l’étatphysioncalciqu
(gauche ; code
mposants de
ne est au c
structure et
e ancestral d
s de l’évolu
es) puis les
d’hui, ces g
es à 100 %,
gènes coda
me protéine
riedberg and
elques subs
partage 96
bidopsis tha
é avec la Ca
aM chez les
lement 6 gè
vec CaM :
rdre chrom
siologiquede
e PDB 1DMO)
e la signalis
contraire tr
sa séquence
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ution, les m
s oiseaux s
gènes existe
les oiseaux
ant pour Ca
e, 100 % id
d Taliaferro
titutions d’
6 % d’ident
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aM des vert
s mammifèr
ènes codant
la fonction
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desgCSCs
et dans sa form
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e.
oduline a do
mammifères
se sont sép
ent toujours
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aM, dérivé
dentique à c
o, 2005). C
acides amin
tité avec c
ient 7 gène
tébrés (McC
res sont situ
t pour des C
nnalité de C
sur un ou p
89
me liée à 4
que s’est
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celle des
Chez les
nés mais
celle des
s codant
Cormack
ués sur 3
CaM-like
CaM est
plusieurs
Ce hau
égaleme
familles
Figure 39La comparcanaux aya
2.3.
Relative
apparue
Simulta
des org
signalis
différen
égaleme
notamm
Kd de l
devient
importa
Chapitre
ut degré de
ent essentie
s très variée
: Compartimertimentation deant des caractér
Polarisati
2.3.1. Rég
ement tôt
e à travers
anément, cer
ganismes pl
ation plus
ntielle des
ent par une
ment par la l
’ordre du m
trop impor
ant de proté
2:Recherà
conservati
el à la prése
es.
entation de la ce la cellule permristiques différe
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dans l’évo
la locali
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luricellulair
complexes
protéines d
régulation s
liaison du C
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rtante ; cepe
éines tampo
chedemaràtraversla
ion témoign
ervation de
cellule eucaryomet à de nouveaentes de celles d
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signalpar
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res. Ces de
dans leur
dans la cel
spatio-temp
Ca²+ à des p
e, leur perm
endant cette
ons, empêch
rqueursdeasignalisati
ne de l’imp
l’interactio
ote et complexiaux gradients ddes éléments pr
égulations
desprotéin
organisme
écise et la
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eux dévelop
codage et
llule, en pa
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protéines ta
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hant ainsi
l’étatphysioncalciqu
portance de
on de CaM
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spatio‐tem
nestampon
es eucaryot
a propagat
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ciblage. Ce
articulier d
ignal calciu
ampons (En
ier le Ca²+ l
finité peut ê
la diffusion
siologiquede
e CaM dan
avec des c
signalisation caettre en place, r
au de la membra
porelledu
n
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tion effectr
grégations d
ont nécessit
eci passe p
es protéine
m. Cette rég
ncart 5). Ce
lorsque sa c
être compen
n de Ca²+ d
desgCSCs
ns la cellul
cibles cellul
alcique. régulés par desane plasmique.
usignal
larité cellul
trice des
de cellules,
té des systè
par une loc
es effectrice
gulation est
es protéines
concentratio
nsée par un
dans l’ensem
90
le et est
laires de
s pompes et
laire est
signaux.
ancêtres
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alisation
es, mais
t acquise
s ont des
on locale
nombre
mble du
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
91
cytoplasme. Ceci permet une modulation spatiale et cinétique du signal, constraint à des
microdomaines (Berridge, 2006) (Figure 40).
Encart 5 : Protéines tampon
Les molécules chélatrices du Ca²+ contiennent des groupements chargés négativement et dont la
géométrie contient une « cage » pouvant accueillir 1 Ca²+. On retrouve ainsi certaines familles de
protéines conservées au cours de l’évolution dont les annexines, les protéines à domaine C2, les
protéines EF-hand (Gifford et al., 2007), les pentraxines, les protéines dépendantes de la vitamine K
ainsi que des protéines intraorganelles de faible affinité mais haute capacité de liaison du Ca²+
(Bindreither and Lackner, 2009; Teo and Wang, 1973). Cependant, le terme de protéine tampon est
appliqué à un nombre restreint de protéines cytoplasmiques à motif EF-hand, dont la Calbindin-
D9k, la Calbinding-D28k, la Calretinine, les isoformes et de la Parvalbumine. La majorité de
ces protéines peut également avoir un rôle effecteur du signal calcium lorsque la liaison du Ca²+
induit un changement conformationnel de la protéine, lui permettant ainsi d’interagir spécifiquement
avec d’autres protéines de façon calcium dépendante. Ce changement de conformation est toutefois
beaucoup moins important que dans le cas des protéines senseurs (Encart 4).
Les protéines tampon calciques n’agissent pas de la même façon qu’un tampon chimique telles que
les tampons pH qui clampent le pH à une valeur prédéterminée (le pouvoir tampon est alors plus fort
lorsque le pH est proche du pKa de la paire acide / base). Dans le cas des tampons calciques, les
constantes de dissociation du Ca²+ vont de 200 nM à 1,5 µM : à l’état de repos ([Ca²+] = 20 - 100
nM), les tampons calciques ne lient pas Ca²+. La modulation d’un signal calcium par une protéine
tampon donnée dépend de plusieurs paramètres dont la concentration calcique intracellulaire,
l’affinité pour Ca²+ en compétition avec d’autres ions métalliques dont Mg²+ (Potter and Gergely,
1975), les cinétiques de liaison et libération de Ca²+, la mobilité intracellulaire (Zhou and Neher,
1993). Les tampons calciques immobiles ont en général une faible affinité pour Ca²+ ; on retrouve
dans cette catégorie les résidus intracellulaires de phospholipides membranaires (McLaughlin et al.,
1981). L’ensemble des tampons calciques (mobiles et immobiles) est responsable de la faible
diffusion des ions Ca²+ dans la cellule et peuvent contribuer à une augmentation locale du Ca²+
(Fioravante and Regehr, 2011) (Figure 40A).
La majorité des protéines tampons calciques ont des constantes de dissociation (KD,Ca) de l’ordre du
micromolaire (Schwaller, 2010) ; ces protéines sont donc en général dans une forme libre de Ca²+ au
repos. Dans la cellule, le kon peut varier de plus de 108 M-1s-1 pour la Calbindin-D9k à 3.106 M-1s-1
pour la Parvalbumine ; cette faible valeur est notamment due à la compétition de liaison du Ca²+ avec
Mg²+ (Lee et al., 2000). Une même protéine peut avoir plusieurs sites de fixation du Ca²+ avec des
KD,Ca et kon différents.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
92
Les protéines tampons peuvent ainsi moduler les caractéristiques spatiales du signal en liant le
Ca²+ et l’empêchant de diffuser dans l’ensemble du cytoplasme. Ces protéines participent
également à la régulation temporelle du signal. En effet, le bon encodage de certains signaux
nécessite parfois une élimination rapide du Ca²+ libre. La présence des protéines tampon dans
le cytoplasme, à proximité des augmentations de [Ca²+], font de ces protéines des effecteurs
de choix du mécanisme OFF (Figure 40B) : les protéines tampon liant Ca²+ diminuent le délai
de retour à l’équilibre suivant une augmentation de [Ca²+]. D’autre part, l’intervention de ces
protéines modifie le signal Ca²+ de façon plus complexe : un retour à l’équilibre simulé par
une courbe monoexponentielle devient une courbe biexponentielle en présence de protéine
tampon comme illustré dans la Figure 40B avec la Parvalbumine (PV). La présence de la
protéine tampon accélère la diminution de [Ca²+] pour un effet immédiat mais l’élimination
totale des ions Ca²+ libres prend plus de temps ; ceci correspond au relargage des ions liés à la
protéine lors du retour à l’équilibre.
Figure 40À : Les prsans protéet généransignal calcdéclenchemparticipentchimique (sans tampexponentiedouble exp
La mito
rapidem
pendant
spatio-te
A
B
Chapitre
: Modulation drotéines tamponine tampon : le
nt plusieurs évècium dans l’enment d’un nomt au mécanism(EGTA) ou propon (fura-6F) elle de paramètponentielle de p
2.3.2. Rég
ochondrie jo
ment le Ca²+
t la phase d
emporelle d
i
ii
iii
2:Recherà
du signal calcin permettent de e signal calciumènements cellu
nsemble du cytombre plus rédu
me OFF en dimotéique (PV) ac
(iv) Simulatiotre Ƭ = 78 ms (paramètres Ƭ1 =
ulationdu
oue égaleme+ pendant la
de retour à
du signal. L
chedemaràtraversla
um par les prodiviser le cytop
m diffuse dans l’laires. Sur le soplasme, permeuit d’évènemen
minuant le délaicélère le rétablons mathémati(courbe grise) ;= 31 ms et Ƭ2 =
signalpar
ent un rôle
phase de d
l’équilibre.
La mitochon
rqueursdeasignalisati
otéines tamponplasme en micr’ensemble du cschéma de droiettant ainsi une nts cellulaires i de retour à lissement de l’éiques effectuée; simulation eff1310 ms (courb
lamitocho
dans la term
développeme
Ceci perm
ndrie peut a
iv
l’étatphysioncalciqu
n. rodomaines. Le cytoplasme, actiite, les protéineactivation des en réponse au
’équilibre. (i, iéquilibre calciques sans protéifectuée avec l’abe noire) (Mull
ndrie
minaison du
ent du signa
met de contr
ainsi former
siologiquede
schéma de gauivant ainsi toutees tampon empprotéines effecu stimulus. B ii, iii) la présenue de la cellule ne tampon av
ajout de Parvalber et al., 2007).
u signal calc
al et en le re
ôler l’ampl
une étroite
desgCSCs
uche représente es les protéinespêchent la propctrices régio-sél: Les protéine
nce de tampone par rapport à lvec une fonctibumine avec un.
cium en séq
elâchant do
litude et l’é
e collaborat
93
une cellule s effectrices pagation du lective et le es tampons s calciques la condition ion simple ne fonction
questrant
ucement
évolution
ion avec
le rétic
mitocho
de gran
Ca²+ pa
d’équili
pour so
Kretsing
Les pro
rétrocon
traduit
canaux
signal,
termina
Figure 41CaM moduréponse cepermettre terminant l’interactio
Chapitre
culum dans
ondrie à trav
nde capacité
ar l’ER (M
ibre, la mito
oit renouve
ger and Noc
2.3.3. Rég
calciq
otéines eff
ntrôle sur l
par l’activ
et pompes
pour génér
aison, afin q
: Régulation dule la fonction ellulaire au stimau signal de dpour au contr
on avec les prot
2:Recherà
s laquelle
vers un uni
é, modifiant
Montero et
ochondrie le
eler le stoc
ckolds, 197
ulation du
que
fectrices de
e signal cal
ation des p
(Figure 41
raliser un é
ue celui-ci n
du signal calciude nombreuses
mulus appliqué mdiffuser plus laraire éviter sa téines des méca
chedemaràtraversla
ce dernier
porteur de C
t les mécan
al., 2000).
e relâche à t
k ER soit
3; Lipp and
u signal pa
e la signa
lcium : une
protéines e
1). Cette mo
évènement i
ne se propa
um par les prots protéines, donmais égalementargement dans
diffusion dananismes ON (ca
rqueursdeasignalisati
r relâche
Ca²+ de faib
nismes de r
. Une fois
travers l’éc
être élimin
d Niggli, 19
ar les pro
alisation ca
e fois le si
ffectrices,
odification
initialement
age pas dans
téines activées nt des kinases, pt dans la modul la cellule et
ns les domaineanaux) et OFF (
l’étatphysioncalciqu
du Ca²+ i
ble affinité
rétrocontrôl
le Ca²+ cy
hangeur mi
né de la c
94; Quedna
otéines eff
alcique peu
gnal décod
celles-ci pe
peut soit a
t réduit à u
s l’ensemble
par la Calmodphosphatases. Clation du signalainsi d’activer
es subcellulaire(pompes).
siologiquede
immédiatem
(EC50 ~15
e qui régul
ytosolique
tochondrial
cellule (Car
au et al., 200
fectrices d
uvent égal
dé par une p
euvent mod
aboutir à un
un microdo
e du cytopla
duline. Ces dernières onl calcium lui-mê
d’autres protées voisins. Cet
desgCSCs
ment capté
µM) mais r
lent le relar
revenu à
l Na+/Ca²+ (
rafoli et al
04).
de la signa
lement exe
protéine se
duler l’acti
ne amplific
omaine, so
asme.
nt à la fois un rmême : en l’amp
éines effectricette modulation
94
par la
rapide et
rgage du
son état
(mNCX)
l., 1974;
alisation
ercer un
enseur et
ivité des
ation du
oit à une
rôle dans la lifiant pour
es ou en le n passe par
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
95
2.4. Les organismes pluricellulaires: coopération et échange d’informations
inter‐etintracellulaires
L’apparition de nouveaux gradients de Ca²+ ainsi que la diversification des stimuli et des
évènements cellulaires, a favorisé l’émergence de nouveaux éléments des mécanismes ON et
OFF, permettant une régulation de plus en plus fine des signaux générés. Ceci passe
notamment par l’apparition d’isoformes des éléments déjà existants, par leur inductibilité par
différents messagers et par l’interconnexion des voies de signalisation calciques. D’autres
messagers de la signalisation calcique viennent s’ajouter au Ca²+ lui-même :
- L’inostol 1,4,5-triphosphate (InsP3) est obtenu, conjointement avec le diacylglycérol
(DAG), suite à l’hydrolyse du phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PtdInsP2) par la
Phospholipase C (PLC). Il existe plusieurs isoformes de PLC activées par différents
mécanismes tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) (PLC), les
récepteurs couplés à la tyrosine kinase (RTKs) (PLC), une augmentation de [Ca²+]
(PLC) ou l’activation de Ras (PLC). En général, l’augmentation de [Ca²+] suivant
l’activation de la PLC est plus lente et plus durable que celle médiée par la PLC
(Berridge et al., 2003; Clapham, 1995; Kim et al., 1997).
- L’Adénosine diphosphate (ADP) ribose cyclique (cADPR) et l’acide nicotinique
adénine dinucléotide phosphate (NAADP) sont obtenus par l’activation de l’ADP
ribose cyclase CD38 à partir de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et de son
dérivé phosphorylé (NADP) (Aarhus et al., 1995; Clapper et al., 1987; Genazzani and
Galione, 1997; Lee, 1997). Ces deux messagers sont synthétisés suite à l’action
d’agonistes extracellulaires ou selon le métabolisme de la cellule (importance de
l’ATP (Tohgo et al., 1997) et de NADH (Wilson et al., 2001) pour la synthèse de ces
dérivés nucléotidiques).
- La sphingosine 1 phosphate (S1P) et la céramide 1 phosphate (C1P) sont des dérivés
lipidiques formés respectivement à partir de la sphingosine par la sphingosine kinase
et de la céramide par la céramide kinase (Hinkovska-Galcheva et al., 2008). L’action
de ces messagers sur la signalisation calcique (Young et al., 1999) peut passer à
travers des RCPGs (Anliker and Chun, 2004) ou par un message intracellulaire
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
96
intermédiaire (Hopson et al., 2011; Meyer zu Heringdorf et al., 2003; Spiegel and
Milstien, 2003)
2.4.1. Communicationintercellulaireetnouveauxstimuli
L’établissement des organismes pluricellulaires n’a pu se faire que par un échange
d’informations entre les différentes cellules. Les cellules sont donc capables d’émettre et de
recevoir des informations différentes de celles émanant de l’environnement. Différents types
de canaux et récepteurs ont été développés au cours de l’évolution à la surface de la
membrane plasmique permettant de compléter la sensibilité des cellules aux différentes
sources et types d’informations :
- les canaux calciques voltage dépendants (VOCs) activés par une dépolarisation
membranaire
- les canaux calciques dépendants de l’activation d’un récepteur (ROCs) par un ligand
extracellulaire tel que le glutamate, l’ATP ou l’acétylcholine
- les canaux activés suite à une déformation de la cellule
Les VOCs sont exprimés essentiellement dans les cellules excitables, telles que les cellules
musculaires ou neuronales, et activés par une dépolarisation de la membrane. Chez les
mammifères, les VOCs sont constitués de 5 sous unités (1, 2, , , ) : la sous unité 1 est
un canal calcique régulé par les 4 autres sous unités. De nombreuses isoformes de ces canaux
ont été identifiées, soulevant la possibilité d’une multitude de combinaisons possibles ainsi
que d’une expression tissu-spécifique conférant aux canaux VOCs des propriétés de
régulation et pharmacologiques particulières. L’ouverture des canaux VOCs génère un influx
rapide du Ca²+ dans la cellule contrôlant des procédés cellulaires rapides, telles que la
contraction musculaire ou l’exocytose au niveau des terminaisons synaptiques.
Les ROCs forment une famille de canaux structurellement et fonctionnellement variés et sont
exprimés principalement dans les cellules sécrétrices et des terminaisons nerveuses. Parmi les
récepteurs ROCS les plus connus, on trouve le récepteur nicotinique à acétylcholine et les
récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDARs). Les ROCs sont activés par la liaison d’un
agoniste (tels que l’ATP, la sérotonine, le glutamate ou l’acétylcholine) sur le domaine
extracellulaire du canal.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
97
Les canaux calciques activés mécaniquement sont présents sur de nombreux types cellulaires
et répondent aux déformations de la cellule. On trouve ce type de canaux dans les cellules
épithéliales de la trachée où la déformation d’une cellule génère une vague calcique
intercellulaire capable de synchroniser les battements de cils des cellules voisines (Boitano et
al., 1992).
2.4.2. Lescascadesdesignalisation
La mobilisation du calcium des réservoirs intracellulaires (essentiellement l’ER) ne peut se
faire directement par le stimulus, appliqué au niveau de la membrane plasmique de la cellule.
Cette mobilisation passe donc par des messagers secondaires qui relayent l’information portée
par le stimulus extracellulaire au niveau des compartiments intracellulaires afin de moduler
l’influx du Ca²+ dans le cytoplasme. Les mécanismes mis en place par la cellule pour
contrôler ce flux sont similaires à ceux situés au niveau de la membrane plasmique et sont
médiés par les canaux
- IP3R (récepteurs de l’Inositol 1,4,5-triphosphate) suite à la liaison de l’InsP3
- RyRs (récepteurs de la ryanodine) activés par la ryanodine
- PTPs (pore de perméabilité de potentiel membranaire) de la membrane mitochondriale
Il existe 3 différentes isoformes d’IP3R: IP3R1, IP3R2, IP3R3 ; ces 3 récepteurs sont très
similaires (70 % d’identité de séquence en acides aminés) mais diffèrent dans leur affinité
pour l’InsP3 ainsi que dans leur expression tissulaire. Les IP3R sont de grosses structures
composées de 4 sous unités homodimériques ou hétérodimériques, chacune capable de lier
une molécule d’InsP3, et formant un canal calcique ; les différentes combinaisons d’IP3R
permettent de former des canaux fonctionnellement différents d’une cellule à l’autre (Taylor
et al., 1999). Suite à l’activation de la phospholipase C par un récepteur membranaire, InsP3
diffuse dans la cellule et se lie aux récepteurs IP3R de l’ER, induisant une transconformation
de l’IP3R et l’ouverture du canal calcique associé.
Les récepteurs Ryanodine (RyRs) sont structuralement similaires aux IP3R et essentiellement
exprimés dans des cellules excitables (muscles, neurones) (Bootman et al., 2001). La liaison
de la ryanodine sur le récepteur (homotétramère) est ambivalente : à faible concentration (de
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
98
l’ordre du nanomolaire), c’est un activateur alors qu’à fortes concentrations (> 10 µM), la
ryanodine inhibe l’ouverture du canal (Meissner, 1986).
Les canaux de relargage de calcium de l’ER (IP3R, RyR) peuvent aussi être activés par le Ca²+
(cytoplasmique ou luminal) au cours du processus CICR (relargage du Ca²+ induit par le Ca²+
ou entrée capacitive de Ca²+). Une augmentation du Ca²+ dans le lumen augmente la
sensibilité de RyR et IP3R alors que le Ca²+ cytosolique a une action plus complexe : il peut
être à la fois activateur à faible concentration (0,5 – 1 µM pour l’IP3R et 1 – 10 µM pour
RyR) et inhibiteur à plus forte concentration (> 1 µM pour l’IP3R et > 10 µM pour RyR) de
ces canaux (Cardy et al., 1997; Iino, 1990; Marchant and Taylor, 1997; Meissner et al., 1986)
Il peut également y avoir une entrée du Ca²+ dans le cytosol depuis la mitochondrie à travers
un pore PTP (Hunter et al., 1976) activé par une forte accumulation de [Ca²+] dans la matrice
mitochondriale (mCICR), notamment suite à un captage du Ca²+ relargé par l’ER (voir
mécanismes OFF). Dans un état de faible conductance, le pore peut ainsi contribuer à la
génération d’une vague de Ca²+ (Ichas et al., 1997) ; un état irréversible de forte conductance
de ce pore engendre l’effondrement du potentiel de membrane mitochondrial, menant au
relâchement du cytochrome c (protéine essentielle à la chaine respiratoire) et à l’apoptose
(Duchen, 1999; Ichas and Mazat, 1998).
2.4.3. Communicationintracellulaire
Le contrôle des différentes homéostasies calciques de la cellule (permettant d’assurer un bon
encodage des informations extracellulaires au niveau de la membrane plasmique ou des
membranes intracellulaires) nécessite une communication entre les différents réservoirs de
Ca²+. Cette communication intracellulaire permet également à la cellule de mettre en place des
évènements cellulaires en réponse à des informations provenant de la cellule elle-même tels
qu’un changement de métabolisme, une entrée dans le cycle cellulaire... La cellule dispose de
plusieurs mécanismes :
- les canaux capacitifs (SOCs) activés en réponse au vidage d’un stock intracellulaire au
cours du processus SOCE (entrée du Ca²+ stimulée par les stocks internes) ; ce
mécanisme est essentiellement activé pendant que la cellule est au repos, lui
permettant de reconstituer ses stocks intracellulaires de Ca²+
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
99
- les canaux sensibles à des seconds messagers intracellulaires (SMOCs) tels que le
diacylglycérol (DAG), l’acide arachidonique ou les acides nucléotidiques
- les canaux sensibles à la concentration intracellulaire en sphingolipides (canaux
SCaMPER)
- les canaux sensibles au métabolisme cellulaire activés par des messagers synthétisés
en fonction de la concentration d’ATP intracellulaire (canaux TPs)
- les canaux TRPs activés par plusieurs types de stimuli
L’activation des canaux calciques SOCs passe par un couplage entre les canaux d’entrée du
Ca²+ de la membrane plasmique et les canaux de relargage du Ca²+ du réticulum
endoplasmique. Le mécanisme SOCE (store operated calcium entry) a été proposé en 1986
(Putney, 1986) mais ce n’est qu’au cours des 10 dernières années que les deux éléments
majeurs de SOCE ont été identifiés : STIM1 (stromal interaction molecule), senseur calcique
des compartiments intracellulaires (Liou et al., 2005; Roos et al., 2005; Williams et al., 2001),
et Orai1, protéine formant le pore des canaux CRAC (canaux activés par le relargage de
Ca²+) et permettant de générer le courant d’entrée capacitive de Ca²+ (ICRAC) (Feske et al.,
2006; Prakriya et al., 2006; Vig et al., 2006; Zhang et al., 2006b). STIM2 (Williams et al.,
2001), Orai2 et Orai3 (Feske et al., 2006), homologues de STIM1 et Orai1, ont également été
identifiés bien que leur participation dans le processus SOCE ne soit pas caractérisée. Suivant
le désemplissage en Ca²+ de l’ER, STIM1 multimérise et s’accumule dans la partie
membranaire de l’ER adjacente à la membrane plasmique (site de jonction) et Orai,
initialement dispersé dans la membrane plasmique, s’accumule à proximité de STIM1 (Luik
et al., 2006; Muik et al., 2008; Wu et al., 2006; Xu et al., 2006). La formation du cluster
STIM1-Orai1 (Yeromin et al., 2006) entraine la multimérisation de deux dimères Orai1 qui
formeront le pore du canal actif CRAC, sélectif des ions Ca²+ (McNally et al., 2012; Penna et
al., 2008; Prakriya et al., 2006; Yeromin et al., 2006; Yuan et al., 2009).
Les canaux régulés par l’acide arachidonique (ARC) ne sont pas associés au remplissage des
stocks intracellulaires du Ca²+ (Mignen and Shuttleworth, 2000) mais plutôt au contrôle de la
fréquence du signal (Shuttleworth and Thompson, 1996). Bien qu’indépendant du mécanisme
SOCE, les canaux ARC sont très similaires aux canaux CRAC : l’activation des canaux ARC
requiert STIM1 (localisée à la membrane plasmique) (Mignen et al., 2007) et le pore du canal
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
100
ARC est un hétéropentamère formé de 3 sous unités Orai1 et 2 sous unités Orai3 (Mignen et
al., 2009).
Les SMOCS ou canaux non SOCs : l’entrée du Ca²+ ne dépend pas d’une entrée capacitive
mais de messagers intracellulaires tels que les nucléotides cycliques ou l’acide arachidonique
(Mignen and Shuttleworth, 2000). Les canaux activés par les nucléotides cycliques (canaux
CNG) sont essentiels à la transduction de signaux relatifs à la vision (bâtonnets, cônes) et
l’olfaction et sont activés par cAMP ou cGMP. Ces canaux sont des assemblages
hétérotétramériques de 2 ou 3 types de sous unités différentes : 6 gènes codent pour ces
canaux (4 sous unités A et 2 sous unités B), donnant lieu à 3 canaux différents (Bradley et al.,
2001). Les canaux CNG activés génèrent des courants cationiques. Le Ca²+ contribue
largement à ces courants et exerce également un rétrocontrôle négatif sur ces canaux,
permettant ainsi une adaptation rapide des cellules sensorielles aux stimuli (Bradley et al.,
2005; Kaupp and Seifert, 2002; Trudeau and Zagotta, 2002).
Les canaux SCaMPER activés en réponse à une augmentation de concentration en
sphingolipides intracellulaires (sphingophosphorylocholine, S1P, C1P) dans de nombreux
types cellulaires (Mao et al., 1996; Young et al., 1999).
Le calcium peut également être mobilisé par des messagers tels que cADPR et NAADP. Le
nucléotide NAADP relargue le Ca²+ des stocks intracellulaires acides tels que les lysosomes,
endosomes ou vésicules de sécrétion via les canaux TPs (canaux à deux pores) (Potter and
Gergely, 1975; Schwaller, 2010). Ce signal calcique local peut par la suite activer des canaux
de la membrane plasmique ou engendrer une cascade CICR au niveau de l’ER (Lee et al.,
2000; Zhou and Neher, 1993). Le cADPR agit plus comme un modulateur de CICR : cADPR
induit la dissociation du complexe RyR / FKBP12.6 en se liant à la sous unité FKBP12.6 et
augmente ainsi la sensibilité des récepteurs RyR au Ca²+ cytoplasmique (Swan et al., 1987;
Teggatz et al., 2005). Dans les cellules excitables, les VOCs induisent un pulse de Ca²+ suite à
une dépolarisation de la membrane, ce qui stimule les RyRs à relarguer du Ca²+ par CICR. Le
degré d’amplification du signal initial par CICR (gain d’amplification du système) peut être
régulé par cADPR (Dargan et al., 2004). Une autre possibilité est que cADPR active la pompe
SERCA (Camacho and Lechleiter, 1995), pompe de recapture du Ca²+ par l’ER, ce qui
augmenterait l’import du Ca²+ dans l’ER, procédé connu pour augmenter la sensibilité de RyR
(Copley et al., 1999).
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
101
Les TRPs (senseurs des changements transitoires de potentiel membranaire) sont des canaux
cationiques peu spécifiques de faible conductance et pouvant par conséquent être ouverts sur
des périodes assez importantes sans pour autant saturer le cytoplasme en Ca²+. La famille des
TRPs compte 28 membres répartis en 6 sous familles : les TRP canoniques (TRPC),
vanilloides (TRPV), mélastatine (TRPM), polycystine (TRPP), mucolipine (TRPML),
ankyrine (TRPA). Les membres de la famille des TRPs sont particulièrement importants dans
le contrôle de procédés cellulaires lents, tels que la contraction des muscles lents et la
prolifération cellulaire (Friedberg and Taliaferro, 2005; Nelson and Chazin, 1998) mais aussi
dans la perception de la chaleur et de la douleur. Les canaux TRPs peuvent être activés par les
RCPGs (Obukhov et al., 1996), DAG (Clapham, 1995; Hofmann et al., 1999), l’acide
arachidonique (Mignen and Shuttleworth, 2000) ou alors par un mécanisme de type SOCE
(Berridge et al., 2000a) ; un même canal TRP peut également être activé par plusieurs stimuli
(Kim et al., 1997).
Avant que les protéines STIM1 et Orai1 ne soient identifiées, l’implication des protéines
TRPC a été suggérée dans le mécanisme SOCE de différents types cellulaires ; ces protéines
sont responsables du courant capacitif non sélectif décrit comme ISOC. Aujourd’hui, on
considère que les protéines STIM1, Orai1 et TRPC interagissent de façon dynamique pour
former un complexe ternaire médiant SOCE (Ong et al., 2007); l’interaction de STIM1 avec
Orai1 et/ou TRPC permet d’expliquer les différents courants capacitifs décrits dans différents
types cellulaires : d’un côté, les courants ICRAC (médiés par les canaux CRAC Orai1) ayant
une forte sélectivité pour Ca²+ dans les lymphocytes T, mastocytes ainsi que dans certains
muscles lisses et cellules endothéliales et de l’autre côté les courants ISOC (médiés par les
canaux CRAC TRPC1, TRPC3, TRPC4) dans les autres types cellulaires, laissant passer
différents cations sans sélectivité.
2.4.4. MécanismesOFF
Une fois le signal calcium établit, il est rapidement éliminé du cytoplasme par des pompes et
échangeurs ioniques vers le milieu extracellulaire ou les stocks intracellulaires
(majoritairement le réticulum endoplasmique). Deux principaux groupes de transporteurs sont
responsables de l’extrusion du Ca²+ du cytoplasme :
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
102
- les transporteurs ATP dépendants : PMCA (ATPase calcique de la membrane
plasmique), SERCA (ATPase calcique du réticulum sarco-endoplasmique) et SPCA
(ATPase calcique des voies de sécrétion) au niveau de l’appareil de Golgi
- les échangeurs Na+/Ca²+ (NCX) au niveau de la membrane plasmique des cellules
excitables (cœur, neurones) et mNCX au niveau de la membrane interne de la
mitochondrie s’appuyant sur le gradient électrochimique de Na+
Au niveau de la membrane plasmique, la PMCA transfère 1 Ca²+ vers le milieu
extracellulaire par molécule d’ATP hydrolysée. Aujourd’hui, il existe 4 gènes codant pour la
PMCA (1 – 4), auxquels s’ajoutent 2 sites d’épissage alternatif : le site A à proximité du
domaine de liaison de phospholipides et générant les isofomes w, x, y, z et le site C au milieu
du domaine de liaison à la Calmoduline et générant les isoformes a, b, f (Brandt et al., 1992;
Keeton et al., 1993; Strehler, 1991). Ces isoformes contribuent à la grande diversité des
pompes au niveau de leur expression (Filoteo et al., 1997), de leur vitesse (Caride et al.,
2001), de leur régulation notamment par la Calmoduline (Penniston and Enyedi, 1998). Outre
la Calmoduline, l’ATPase peut être activée par de acides phospholipidiques, des acides gras
insaturés, un traitement protéolytique, les protéines kinases A (PKA) et C (PKC), l’induction
d’un état oligomérique (Carafoli, 1992).
La pompe SERCA transfère 2 Ca²+ vers le milieu intra-réticulaire par molécule d’ATP
hydrolysée. Cette pompe représente le seul moyen de recapture du Ca²+ par l’ER ; le contrôle
de SERCA est donc primordial pour la régulation de l’homéostasie de ER/SR. Dans le
génôme humain, 3 gènes pouvant être épissés alternativement ont été identifiés comme codant
pour ces pompes (Martin et al., 2002). Les différentes isoformes de SERCA ont des propriétés
de pompage différentes et modulent différemment les concentrations du Ca²+ dans le
cytoplasme et le réticulum : l’expression différentielle des pompes SERCA permet de
moduler le signal Ca²+ spécifiquement selon le type cellulaire (Camacho and Lechleiter, 1993;
Martin et al., 2002; Morgan and Jacob, 1998). SERCA3 a une affinité pour Ca²+ beaucoup
plus faible que SERCA1 et SERCA2 : SERCA3 n’est activée que suite à une stimulation
massive ou lors du pic oscillatoire calcique (Arredouani et al., 2002). Dans certaines cellules,
l’expression de SERCA3 est induite sélectivement durant la différenciation cellulaire, alors
que durant la tumorigenèse SERCA3 est peu exprimée (Arbabian et al., 2011).
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
103
SPCA est une ATPase Ca²+/Mn²+ du Golgi (Van Baelen et al., 2001) qui ressemble beaucoup
à la pompe SERCA. En effet, si tous les organismes animaux expriment à la fois des pompes
SERCA et SPCA de structures primaires assez similaires, les champignons et levures n’ont
qu’une pompe similaire à SPCA et les plantes n’ont que des gènes relatifs à la pompe SERCA
(Wuytack et al., 2002). Dans le génome humain, 2 gènes codent pour des pompes SPCA et
pouvant être alternativement épissés. La surexpression de l’isoforme SPCA2 est souvent
associée à la prolifération cellulaire et la tumorigenisation (Feng et al., 2010).
NCX permet d’expulser le Ca²+ du cytoplasme en utilisant le gradient Na+. Cet échangeur
peut être couplé à une ATPase Na+/K+ dépendante (NCKX) (Blaustein and Lederer, 1999;
Cervetto et al., 1989). (Lytton, 2007). L’activité de cet échangeur n’est pas négligeable :
suivant la contraction du muscle cardiaque, la relaxation de la cellule musculaire requiert une
extrusion du Ca²+ du cytoplasme ; la mesure des niveaux d’activité de PMCA et NCX indique
clairement que dans ce cas l’échangeur est le mode d’efflux prédominant au niveau de la
membrane plasmique (Blaustein and Lederer, 1999).
Comme décrit au point I-2.3.2, la mitochondrie joue également un rôle dans la terminaison du
signal calcium en séquestrant rapidement le Ca²+ à travers un uniporteur du Ca²+ pendant la
phase de développement du signal et en le relâchant doucement à travers l’échangeur
mitochondrial Na+/Ca²+ (mNCX) pendant la phase de retour à l’équilibre.
La Figure 42 représente les principaux effecteurs des mécanismes ON et OFF (canaux,
pompes, second messagers) abordés dans cette partie et mis en place au cours de l’évolution ;
ces éléments sont repris en Annexe VII.
Figure 42Les influx
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Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
105
les protéines S100, certaines Annexines. Le procédé de décodage est amorcé par un
changement conformationnel de la protéine effectrice suite à la liaison de Ca²+. Ceci induit
notamment l’exposition de larges surfaces hydrophobes pouvant interagir avec d’autres
protéines et ainsi moduler leur activité (Ikura, 1996). Au cours des 20 dernières années, le
nombre de résolution de structures 3D des protéines senseurs du Ca²+ complexées à leurs
protéines cibles a considérablement augmenté et a ainsi permis de faire des progrès
considérables dans la compréhension de ces interactions (Bhattacharya et al., 2004; Grabarek,
2006; Yap et al., 2000).
2.5. Spécialisationcellulaireetrégulationgénique
Le calcium toolkit à la base des 4 unités fonctionnelles du signal calcium est codé par plus de
300 gènes. Chaque cellule exprime seulement une partie de ce calcium toolkit, le
signalosome calcique, traduit en protéines (calciprotéines) s’assemblant en complexes
marcomoléculaires autour de protéines « hub » (Barabasi and Oltvai, 2004; Batada et al.,
2006; Kar et al., 2009; Manna et al., 2009) et formant les calcisomes (Haiech and Demaille,
1981) précisément localisés dans la cellule. L’ensemble du signalosome calcique et des
combinaisons de calcisomes est spécifique d’une cellule donnée dans un état physiologique
donné et lui permet d’élaborer, de réguler, de décoder un signal calcique et de générer une
réponse cellulaire biochimique spécifique en réponse à un stimulus donné.
Par conséquent, un même stimulus pourra induire différents signaux calciques, caractérisés
par leur forme et intensité, dans différents types cellulaires ; la réponse calcique cellulaire
générée par un stimulus particulier dans une cellule donnée constitue l’empreinte calcique de
la cellule (Dagher et al., 2009) (Figure 43).
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ques rapide
embrane pla
sont générés
(Wang et al
férente amp
chedemaràtraversla
d’un signal calclocal (a) et glotes [Ca²+]. B : anternes de Ca²s voies de signts élémentairesune vague calc
par des vagues iet al., 1998; Lip
es et trans
asmique et
s par les éc
l., 2011). D
litude, duré
b
rqueursdeasignalisati
cique. obal (b). Les zoa : les évèneme²+, générant de
nalisation sont s. b : les signcique qui se prointercellulaires pp et al., 1997)
sitoires sont
des organe
changeurs d
Différents ca
ée, localisati
l’étatphysioncalciqu
ones colorées eents élémentairees concentratioactivées par de
naux calciques opage dans la cqui se propage.
t généralem
elles intrace
de Ca²+ et
anaux ou tra
ion, cinétiqu
siologiquede
n bleues indiques résultent de
ons locales de e très fortes [C
globaux émercellule. c : l’acnt d’une cellule
ment généré
llulaires alo
par une act
ansporteurs
ue.
c
desgCSCs
uent de faiblesl’entrée du Ca²Ca²+ pouvant
Ca²+] atteintes urgent de la co
ctivité de cellule à l’autre. Sch
rés par des
ors que les
tivité dimin
s calciques g
107
[Ca²+], les ²+ depuis le activer de
uniquement oordination les voisines éma réalisé
canaux
signaux
nuée des
génèrent
3. LaC
La Calm
1970). E
cerveau
and Wa
fonction
Sa cons
cette pro
3.1.
CaM es
protéine
forteme
autour
calcique
Chapitre
Calmoduli
moduline (C
Elle a été c
u et son hab
ang, 1973).
nnelles, CaM
servation au
otéine un ac
Importan
st exprimée
es totales (
ent exprimé
de l’appare
e (Li et al.,
2:Recherà
ne:chefd
CaM) fut d
caractérisée
bilité à lier
Basé sur la
M connut pl
u cours de l’
cteur très pa
ncedeCaM
e dans tout
(10-6 – 10-5
ée pendant
eil mitotiqu
1999; Luby
chedemaràtraversla
d’orchestre
découverte
e comme ac
le Ca²+ fut
a découverte
lusieurs app
’évolution,
articulier de
M danslasig
tes les cellu5 M), dans
la différenc
ue et peut
y-Phelps et a
rqueursdeasignalisati
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en 1970 (C
ctivant la p
démontrée
e progressiv
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son express
e la signalisa
gnalisatio
ules eucary
s le cytopla
ciation et la
transloquer
al., 1995).
l’étatphysioncalciqu
nalisation
Cheung, 19
phosphodies
trois ans pl
ve de ses pr
usqu’en 198
sion ubiquit
ation calciq
ncalcique
yotes, au m
asme et le
a division c
r dans le n
siologiquede
calcique
(Chin
970; Kakiuc
stérase nucl
lus tard (KD
ropriétés ph
0 (Watterso
taire et son
que et de sa
moins à hau
noyau. Ca
cellulaire où
noyau suite
desgCSCs
n and Mean
chi and Ya
léotide cyc
D ~ 1–10 µM
hysico-chim
on et al., 19
rôle centra
régulation.
uteur de 0,
aM est not
ù elle se co
à une stim
108
ns, 2000)
amazaki,
lique du
M) (Teo
miques et
80).
l font de
1 % des
tamment
oncentre
mulation
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
109
CaM interagit avec plus de 100 protéines, que ce soient des enzymes, des récepteurs ou des
protéines structurales (Yap et al., 2000) (http://structbio.vanderbilt.edu/cabp_database/) et
régule ainsi des processus nombreux, variés et fondamentaux tels que le métabolisme du
glycogène, la mobilité intracellulaire, le transport de Ca²+, le métabolisme des nucléotides
cycliques, les phosphorylations et déphosphorylations de protéines, la progression du cycle
cellulaire, la régulation de l’expression des gènes, l’inflammation, la mémoire à long et court
terme, … (Ohya and Botstein, 1994). On notera notamment l’interaction et la régulation de
plusieurs protéines du « calcium toolkit » responsables de l’entrée / sortie du Ca²+ du
cytoplasme avec la Calmoduline : PMCA (Carafoli, 1997), CNG (Trudeau and Zagotta,
2002), VOCs (Zuhlke et al., 1999), IP3R (Michikawa et al., 1999), RyR (Tang et al., 2002).
3.2. Liaisonde4calciumsdefaçonséquentielle
Afin de décrire les processus d’activation des cibles de CaM, différents concepts de liaison du
Ca²+ à CaM ont été avancés :
- Dans le 1er cas, CaM présente 4 sites équivalents et indépendants de liaison du Ca²+ ;
les changements de conformation induits par Ca²+ sont liés au nombre de sites occupés
sans aucune préférence
- Dans le 2nd cas, CaM présente 2 sites de forte affinité pour Ca²+ et 2 sites de plus
faible affinité. La liaison coopérative du Ca²+ aux 2 premiers sites induit un
changement conformationel de CaM, lui permettant d’interagir avec ses cibles ; la
fixation du Ca²+ dans les 2 derniers sites permettrait alors l’activation des protéines
cibles de CaM
- Dans le 3e cas, CaM lie Ca²+ de manière séquentielle, ordonnée et coopérative. En
absence de Ca²+, CaM ne présente qu’un seul site de liaison avec une affinité
significative pour Ca²+ ; la liaison du Ca²+ à ce site induit un changement
conformationel du 2e site qui passe d’une configuration fermée à une configuration
ouverte et dont l’affinité pour Ca²+ augmente, et ainsi de suite (Figure 45) (Zhang et
al., 1995). Ce modèle est asymétrique et est appelé modèle séquentiel (Haiech et al.,
1981).
Les mo
d’hélice
(Bhattac
années
rempliss
s’effectu
45). La
de 10-5
1991) :
CaM es
dans un
CaM ad
même t
des zon
Figure 45K1, K2, K
Les con
pour la
des plan
Chapitre
otifs EF-ha
es; cet app
charya et al
1980 (Crou
sage des sit
ue de façon
liaison du C
M environ
CaM est u
st dans sa f
ne conforma
dopte une c
temps, les 2
es hydropho
: Modèle séquK3, K4 sont les c
nstantes mac
CaM huma
ntes (séquen
SynCaM
hCaM
2:Recherà
ands sont o
pariement
l., 2004). Ce
uch and Kle
tes a été ide
n séquentiel
Ca²+ s’effec
au niveau d
un senseur d
forme apo (
ation étendu
onformation
2 domaines,
obes favoris
uentiel de liaisoconstantes mac
croscopique
aine (hCaM)
nce et aligne
K1 (µM‐
0.68 ± 0.
0.62
chedemaràtraversla
organisés en
favorise u
ette liaison
e, 1980; Ha
ntifié 10 an
lle suivant l
ctue avec de
du lobe N (
du Ca²+ sur
(libre de Ca
ue. Lorsque
n plus glob
, N et C, su
sant leur int
on du Ca²+ à Croscopiques de
es de liaison
) et SynCaM
ement de Sy
1) K2
03 0.022
rqueursdeasignalisati
n paires fo
une liaison
coopérativ
aiech et al.,
ns plus tard
l’ordre site
es affinités
(Gilli et al.,
r une large
a²+) : l’hélic
e Ca²+ se li
bulaire, prêt
ubissent des
teraction av
CaM. liaison du calc
n du Ca²+ à
M, protéine
ynCaM en F
(µM‐1)
2 ± 0.004
0.031
l’étatphysioncalciqu
ormant un
coopérativ
ve du Ca²+
1981; Kilh
(Kilhoffer e
III site
de 10-6 M e
1998; Kilh
plage de co
ce alpha joi
ie à CaM, c
te à s’enrou
s changeme
vec les proté
cium sur les 4 si
CaM K1, K
hybride en
Figure 75 pa
K3 (µM‐1)
0.028 ± 0.01
0.039
siologiquede
ensemble
ve du Ca²
à CaM a ét
hoffer et al.,
et al., 1992)
IV site
environ au n
hoffer et al.,
oncentration
ignant les 2
cette hélice
uler autour d
ents conform
éines cibles
ites de CaM non
K2, K3, K4
ntre la CaM
age 198) (D
K4 (µ
11 0.028 ±
0
desgCSCs
stable de
²+ sur la
té proposée
1988) et l’
) : la liaison
I site II
niveau du l
, 1988; Lin
ns. À faible
2 lobes de C
e alpha s’en
de sa cible.
mationels, e
(Grabarek,
n liée à ses cibl
ont été déte
des mamm
Dagher et al
µM‐1)
± 0.014
0.02
110
2 paires
protéine
dans les
ordre de
n du Ca²+
I (Figure
obe C et
nse et al.,
e [Ca²+],
CaM est
nroule et
Dans le
exposant
2006).
les.
erminées
mifères et
., 2010):
3.3.
L’intera
indépen
de la m
cristallo
remarqu
changem
permett
domaine
méthion
résidus
conform
hydroph
sa cible
cibles o
Figure 46La Calmodcodes 2KNpour le cavoltage débleu, les p
Chapitre
Caractéris
action de C
ndante. Dep
myosine (M
ographiques
uable plast
ments confo
tant aux 2 d
es de CaM
nine permet
hydrophob
mationelle d
hobe confèr
e (Ikura and
ont été résolu
: Structures dduline a été co NE pour la pomanal voltage déépendent 2.1 (Ceptides liés en v
2:Recherà
isationdel
CaM avec
uis la résolu
MLCK) (Iku
s réalisées
ticité conf
ormationnel
domaines de
possèdent d
ttant à la p
bes de sa p
de la protéi
re à CaM un
d Ames, 200
ues (www.r
de la Calmodulcristallisée avec
mpe ATPase dependent 1.1 (C
CaV2.1) et 3DVviolet et les ion
chedemaràtraversla
l’interactio
ses cibles
ution de la
ura et al.,
sur plusi
formationell
ls sont notam
e s’orienter
des surfaces
protéine d’i
protéine cib
ne, la flexi
ne remarqua
06). Aujourd
rcs.org/pdb/
line liée à difféc différents pepla membrane p
CaV1.1), 3OXQVJ pour le canans calcium en ve
rqueursdeasignalisati
ondeCaM
s peut se
structure de
1992; Me
eurs comp
le de CaM
amment dus
en solution
s « patch » h
interagir pa
ble (Gellm
ibilité des c
able plastic
d’hui plus d
/) (Boschek
érentes cibles.ptides cibles. Ceplasmique (PM
Q pour le canal al voltage dépenert.
l’étatphysioncalciqu
avecsesci
réaliser de
e CaM en c
eador et al.
plexes « Ca
M (Hoefli
à la grande
n (Barbato e
hautement h
ar des liais
man, 1991).
chaines laté
ité lui perm
de 20 struct
k et al., 2008
es structures onMCA), 2BCX po
voltage dépenndent 2.2 (CaV
siologiquede
ibles
e façon Ca
complexe av
., 1992), le
aM – cibl
ich and I
e plasticité d
et al., 1992)
hydrophobe
ons Van D
Enfin, ajo
érales des r
mettant de s’
tures de CaM
8) (Figure 4
nt été obtenues àour le récepteurdent 1.2 (CaV12.2). La Calmo
desgCSCs
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vec la chain
es études R
le » soulig
Ikura, 2002
de l’hélice
. D’autre pa
es, riches en
Der Waals
outé à la p
résidus de l
’adapter au
M liée à dif
46).
à partir de la PDr ryanodine (Ry1.2), 3VDM pooduline est repr
111
dante ou
ne légère
RMN et
gnent la
2). Ces
centrale,
art, les 2
n résidus
avec les
plasticité
la poche
mieux à
fférentes
DB sous les yR), 2VAY our le canal résentée en
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
112
Depuis les annéees 1980, plusieurs modèles ont été proposés afin de décrire l’interaction de
CaM avec ses cibles ; ces modèles font écho aux modèles proposés pour la fixation de Ca²+
sur CaM.
En absence de Ca²+, le domaine N terminal de CaM adopte une conformation fermée dans
laquelle les hélices E et F du motif EF-hand sont très proches ; le domaine C terminal adopte
une conformation semi ouverte dans laquelle une zone hydrophobe est partiellement
accessible au solvant. Cette conformation permet au lobe C d’interagir avec des protéines
cibles même à des concentrations calciques intracellulaires de repos (Swindells and Ikura,
1996). La fixation du Ca²+ sur chacun des 4 motifs EF-hands est coordonnée par 7 résidus
(Figure 35). La liaison du Ca²+ induit des changements dans l’inter-arrangement des hélices E
et F menant à une conformation plus ouverte des domaines N et C de CaM (Figure 38).
L’interaction de CaM avec ses cibles augmente l’affinité de CaM pour Ca²+ d’un facteur 10
environ (Peersen et al., 1997) ; ceci sensibilise le complexe CaM – effecteur aux changements
de [Ca²+].
3.3.1. Modèlenonspécifique
Dans ce 1er modèle, la fixation de 2 Ca²+ induit l’exposition de domaines hydrophobes
reconnus par les protéines cibles qui interagissent avec CaM. La liaison des 2 derniers Ca²+ à
CaM donne au complexe sa structure finale et régule l’activité de la protéine cible. Ce modèle
implique que la première étape de reconnaissance de CaM soit la même pour toutes les
protéines. Ce modèle a été abandonné par la construction de mutants de CaM qui interagissent
et modulent difféentiellemnt l’activité de différentes protéines cibles, mettant en évidence des
interactions spécifiques de CaM avec ses cibles (Craig et al., 1987; Putkey et al., 1986).
3.3.2. Modèledelacléetlaserrure
Le domaine de liaison à CaM (CaMBD) est généralement un peptide de 15 à 30 acides aminés
interagissant avec CaM avec une grande affinité, même lorsqu’isolé des autres domaines de la
protéine cible. Les CaMBDs ont été identifiés par comparaison des séquences de plus de 180
protéines ; ils ne sont pas caractérisés par une séquence consensus mais par une nature
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
113
hydrophobe ou basique et classés en différentes classes (Hoeflich and Ikura, 2002),
(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb) :
- CaMBDs liant CaM dans un ratio 1:1 ou classe de l’hélice alpha canonique. Dans ces
structures, CaM s’enroule autour du peptide ; cette classe et divisée en 4 sous-classes
selon la position des résidus de CaMBD interagissant avec CaM (1-10, 1-14, IQ et
autres motifs)
- CaMBDs liant CaM dans un ratio CaM:CaMBD 1:2. La liaison de CaM à des
protéines ayant un CaMBD de ce type induit l’homodimérisation et l’activation de la
protéine ou le recrutement d’une autre protéine (hétérodimère)
- CaMBDs liant CaM dans un ratio 2:2. La liaison de CaM à des protéines ayant un
CaMBD de ce type induit l’homodimérisation et l’activation de la protéine ou le
recrutement d’une troisième protéine
Dans ce modèle, une mutation donnée de CaM permet bien de diminuer son interaction avec
certains domaines spécifiques mais la dépendance au Ca²+ de ces interactions provient
uniquement d’une régulation spatiale de l’interaction de CaM avec ses cibles : l’activation
CaM-dépendante de protéines du signalosome calcique dépend de la colocalisation de ces
protéines avec CaM à proximité de l’endroit où se trouve le signal Ca²+. Ce modèle ne permet
pas la discrimination entre protéines cibles colocalisant et ayant des propriétés opposées,
telles que les canaux et pompes.
3.3.3. ModèledépendantdunombreduCa²+ liés àCaMoude l’adaptationdes
conformationsdespartenaires
Dans ce dernier modèle, l’interaction de CaM avec ses protéines cibles dépend non seulement
des spécificités structurales des 2 entités mais également de la conformation calcium
dépendante adoptée par CaM (Dagher et al., 2010) : CaM adopte différentes conformations
selon que 0, 1, 2, 3 ou 4 Ca²+ soient liés. La spécificité de l’interaction CaM – protéine cible
vient alors de la protéine cible qui reconnait soit la forme apoCaM, soit l’une des formes
CanCaM (n = 1 - 4) (Figure 47). Ce modèle permet une régulation cinétique, une régulation
tempore
par CaM
Figure 47Le nombreconformat
3.4.
Suite à
(en géné
- L
r
p
s
i
c
(
l
- R
(
m
c
(
d
o
a
Chapitre
elle s’ajouta
M pour un s
7 : Interaction de du Ca²+ liés àtions spécifique
Activation
l’interaction
éral activati
Levée de l’
ratio 1:1 av
pseudo-sub
substrat de
inhibition.
chaine légè
(calcineurin
l’anthrax Ed
Remodelag
(IQxxxRGx
myosines. C
cible indép
(Jurado et
dépendants
ou négative
al., 1999).
2:Recherà
ant à la rég
ignal calciu
de la Calmoduà la Calmodulines des protéines
ndesproté
n CaM – C
ion) peut s’e
’auto-inhibi
vec un CaM
bstrat, le Ca
s’y lier. L’e
Dans cette
re de la my
ne) ainsi qu
dema Facto
ge du site d
xxxR). Dan
Ce motif fa
pendammen
al., 1999; T
(CaV), la li
e du canal, s
chedemaràtraversla
gulation spa
um donné.
uline avec ses cne, à un momenpermettant des
éineseffect
CaMBD, la m
effectuer de
ition : ce m
MBD ayant u
aMBD obst
enroulemen
catégorie,
osine, CaM
ue la PMCA
or (Drum et
’activation p
ns cette ca
avorise dans
nt de [Ca²+
Trost et al.
iaison de Ca
selon le nom
rqueursdeasignalisati
atiale, et do
cibles en fonctient donné, dépes interactions pr
tricesdus
modulation
e plusieurs f
modèle est c
un motif di
true le site
nt de CaM a
on retrouv
M kinase kin
A (Falchett
al., 2002).
pour certain
atégorie, on
s certains c+], par exe
., 2001). D
aM au dom
mbre du Ca
l’étatphysioncalciqu
onc une spé
on du nombre end des caractérrotéine – protéin
signalcalci
n de l’activit
façons (Figu
ommun aux
ifférent d’IQ
catalytique
autour de ce
e des kinas
nase) (Kobe
o et al., 19
ns CaMBD
n retrouve
as l’associa
emple pour
Dans le cas
maine IQ peu
a²+ liés à Ca
siologiquede
écificité des
d’ions calciumristiques du signe spécifiques.
iumparla
té de la pro
ure 48):
x protéines
Q. Dans ce
e de la prot
CaMBD pe
ses (CaM k
et al., 1997
991) ou l’ad
s caractéris
des canaux
ation de CaM
les canau
des canaux
ut avoir une
aM (Lee et a
desgCSCs
s protéines
m liés à la Calmgnal calcium et
aCalmodul
otéine cible
liant CaM
modèle, mo
téine, empê
ermet de lev
kinases I, I
7), des phos
dénylate cy
sés par un m
x calciques
aM avec sa
ux capacitif
x calciques
e régulation
al., 1999; Z
114
régulées
moduline.
génère des
line
de CaM
dans un
odèle du
êchant le
ver cette
I, IV, la
phatases
yclase de
motif IQ
s et des
protéine
fs TRP4
voltage
positive
Zuhlke et
- D
s
a
Figure 48À : Éliminjaune et le
4. Util
La voie
l’activat
cancers,
(Anders
al., 200
l’étude
1995), l
de muta
2006) o
on retro
Chapitre
Dimérisatio
stœchiomét
al., 2001) o
: Mécanismesnation de l’autoes sites actifs pa
lisationd’i
e de signali
tion de ses
, de dysfo
son, 2002; C
06). Pour a
de sa local
la résolution
ants (Chin e
ou encore l’
ouve le triflu
2:Recherà
on et activ
trie 1:2 ou 2
ou la glutam
s d’activation doinihibition. B :ar des astérixes.
inhibiteur
isation Ca²+
s protéines
onctionneme
Colomer et
analyser son
lisation cell
n de structu
et al., 1997
utilisation d
uoperazine
chedemaràtraversla
vation pour
2:2, tels que
mate décarbo
de protéines paRemodelage d AID : domaine
rsdeCaM
+/CaM est
cibles, et u
ents cardia
al., 2007; M
n rôle, plus
lulaire (Hah
res RMN (B
; Craig et a
d’inhibiteur
(TFP) (Lev
rqueursdeasignalisati
r les protéi
e le canal p
oxylase des
ar la Calmoduldu site d’activate d’auto inhibit
impliquée
un certain
aques sont
Mayur et al
sieurs appro
hn et al., 1
Boschek et
al., 1987; O
rs. Parmi le
vin and We
l’étatphysioncalciqu
ines interag
potassium C
plantes (Yu
line. tion. C : Dimérition (Hoeflich a
dans plusie
nombre de
associés à
., 2006a; Sh
oches ont
992; Li et
al., 2008; Ik
Ohya and Bo
es inhibiteur
eiss, 1977),
siologiquede
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Ca²+ dépend
uan and Vog
isation. Les ionand Ikura, 2002)
eurs proces
e maladies
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été utilisée
al., 1999; L
kura et al., 1
otstein, 199
rs utilisés le
des compo
desgCSCs
ec CaM se
dent (Schum
gel, 1998).
ns Ca²+ sont rep).
ssus cellula
inflammato
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2007a; Vad
es, parmi le
Luby-Phelp
1992), l’éla
94; VanScyo
e plus coura
osés ayant u
115
elon une
macher et
présentés en
aires, via
oires, de
de CaM
akkan et
esquelles
ps et al.,
aboration
oc et al.,
amment,
un noyau
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
116
naphtalen W7 (Hidaka et al., 1978), W13 (Tanaka et al., 1982) ainsi que leurs homologues
chlorés moins actifs W5 (Hidaka et al., 1981) et W12 (Tanaka et al., 1982), le calmidazolium
ou R24571 (Gietzen et al., 1981), le bifonazole (Hegemann et al., 1993), le composé 48/80
(Gietzen et al., 1983).
L’utilisation de ces différents inhibiteurs suggère que CaM présente plusieurs sites de liaison
pour différentes molécules chimiques, inhibant ainsi sélectivement la liaison de CaM avec
certaines de ses cibles.
Les molécules capables d’interagir avec différentes conformations de CaM et ainsi de
perturber de manière différentielle les diverses fonctions de cette protéine sont des outils
nécessaires pour disséquer les mécanismes moléculaires et le rôle de CaM dans une cellule
eucaryote dans un état physiologique donné.
Les molécules utilisées aujourd’hui comme antagonistes de CaM ne permettent pas d’explorer
toutes les fonctionnalités de cette protéine. En effet, la plupart de ces molécules manquent de
spécificité vis-à-vis de CaM (Blackmore et al., 1981; Norman et al., 1979), générant des
effets secondaires plus ou moins importants lors de l’usage médicamenteux de ces composés
(Whitaker, 2004), et leur diversité chimique rend les analyses de relation structure-activité
difficiles (Hidaka et al., 1978). Pour pallier à cet obstacle, des couples de molécules
structuralement très proches ont été dessinés : une molécule ayant une forte affinité pour CaM
et son quasi homologue ayant une faible affinité. Ces couples, W5 / W7 et W12 / W13, ont
ainsi été utilisés pour différencier les effets dépendants des effets indépendants de CaM de ces
composés (Hidaka et al., 1981) et avoir une meilleure compréhension des relations structure
- activité (Tanaka et al., 1982).
Cependant, si l’utilisation de couples de molécules permet d’observer les effets de l’inhibition
de CaM de façon plus restreinte, elle ne permet ni d’assurer la spécificité d’interaction de ces
molécules avec CaM dans la cellule ni d’explorer les différentes fonctionnalités de CaM ;
ceci ne peut être approché qu’en utilisant i) plusieurs inhibiteurs de CaM d’une même famille
chimique pour s’assurer de leur spécificité d’interaction et ii) plusieurs familles chimiques de
molécules pour déchiffrer les différentes conformations de CaM impliquées dans les
évènements cellulaires observés.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
117
ObjectifetStratégie
Comme nous l’avons souligné dans cette partie, la signalisation calcique d’une cellule d’une
part et l’interaction de CaM avec les différents éléments de ce système d’autre part sont très
complexes à la fois par la quantité, l’omniprésence, les interconnexions et les régulations
spatio-temporelles de la signalisation calcique.
L’objectif de ce chapitre est d’utiliser des petites molécules chimiques afin de caractériser
l’écosystème calcique d’une cellule donnée dans le but d’identifier des biomarqueurs d’un
état physiologique donné ou en vue d’une utilisation thérapeutique ultérieure.
Pour cela, nous avons mis en place une stratégie, schématisée dans la Figure 49 nous
permettant de caractériser au mieux ces biomarqueurs.
Dans un premier temps, nous avons cherché à identifier des molécules chimiques capables
d’interagir avec CaM ; ceci a été réalisé à travers un criblage de chimiothèques par anisotropie
de fluorescence, en compétition avec une sonde liant CaM. Les molécules sélectionnées ont
ensuite été caractérisées par des études préliminaires chimiques, de thermodynamique de
liaison à CaM, de disponibilité biologique et de pertinence d’utilisation biologique.
Les molécules ainsi identifiées et caractérisées ont ensuite été utilisées dans 2 optiques
différentes : en tant qu’outils de recherche d’une part et outils thérapeutiques d’autre part.
L’utilisation de ces molécules peut en effet permettre de mieux comprendre l’interaction de
CaM avec ses cibles. Selon la concentration en Ca²+, CaM adopte différentes conformations et
peut par conséquent interagir avec des cibles différentes. Nous postulons que la liaison
d’antagonistes à CaM inhibe certaines conformations de CaM et donc la liaison de CaM à
certaines de ces cibles. Nous avons donc dans un premier temps cherché à caractériser
l’interaction de CaM avec ses cibles selon [Ca²+] puis dans un second temps à perturber les
complexes CaM – protéines cibles par les antagonistes de CaM précédemment caractérisés.
Au cours de cette étape, nous assumerons que la liaison de CaM à ses cibles peut être résumée
à un CaMBD linéaire d’une vingtaine d’acides aminés comme présenté dans cette partie (page
112). La comparaison des complexes CaM–peptides inhibés par les antagonistes selon la
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
118
conformation de CaM (dépendante de [Ca²+]) optimale requise pour l’interaction avec ses
cibles devrait nous permettre i) de confirmer la diversité des interactions des antagonistes
avec CaM et ii) d’obtenir des antagonistes inhibant CaM de façon conformation dépendante,
i.e. des antagonistes inhibant une ou plusieurs conformations de CaM.
Nous avons également postulé que l’utilisation de ces molécules pouvait avoir un effet
thérapeutique. Comme cité plus haut, l’utilisation d’antagonistes de CaM a été approuvée
pour le traitement de certaines pathologies, principalement psychiatriques. Aujourd’hui, de
rares équipes de recherche montrent les bénéfices de l’utilisation d’antagonistes de CaM dans
le traitement de certaines tumeurs. Nous cherchons donc à identifier des antagonistes de CaM
qui pourraient être utilisés dans le cadre d’un traitement des glioblastomes, permettant de
sensibiliser les gCSCs à des traitements aujourd’hui peut actifs. Nous avons pour cela
caractérisé la perturbation de l’homéostasie calcique induite suite à l’ajout des antagonistes
sur plusieurs types cellulaires que nous avons comparés à des cellules primaires propagatrices
de glioblastome. Dans cette étape, nous espérons pouvoir identifier une ou plusieurs
molécules mettant en évidence un déséquilibre spécifique de l’homéostasie calcique, i.e. une
empreinte calcique spécifique de ces cellules.
Enfin, la comparaison des cibles de CaM dont la liaison est inhibée par ces antagonistes avec
la modulation différentielle de l’homéostasie calcique de différents types cellulaires nous
paraît un bon moyen d’identifier et de caractériser le rôle de CaM dans l’homéostasie calcique
des cellules propagatrices de glioblastome.
Figure 49
Cp
‐ CarCaM
‐ PerCaM
Chapitre
: Stratégie app
Caractérisperturbati
ractérisatioM à ses ciblrturbation dM‐cible par
2:Recherà
pliquée pour id
ation de lon de CaM
Outils d
n de la liaises des complexles antago
M
s
chedemaràtraversla
dentifier de pot
Ided’antag
a M
de Recherch
son de
xes nistes
olécules meune e
spécifique d
rqueursdeasignalisati
tentiels marqu
entificatioonistes de
he Ou
ettant en éempreinte cd’un type ce
l’étatphysioncalciqu
ueurs de l’écosy
n e CaM
l’h
tils Thérap
‐ Carper
‐ Comtyp
vidence calcique ellulaire
siologiquede
ystème calciqu
‐ Criblagchimio
‐ Caractéchimiqbiologi
Perturbhoméosta
peutiques
actérisationrturbation dmparaison des cellulaire
Biomarq
desgCSCs
ue d’une cellul
ge de othèques érisation phque, pertineique
ation de asie calciqu
n de la de l’homéode différenes
queurs
119
e.
hysico‐ence
ue
stasie ts
II. Ide
inte
1. Car
Les com
partir d
(Dagher
benzoph
dans les
et al., 2
sondes
sondes
Figure 50Les sondepharmacoppara de CHS4.
1 Les don
Chapitre
entificatio
eragissan
ractérisatio
mposés fluo
d’un précéd
r et al., 200
hénones. La
s deux cas ;
2006). Les
S1 et S2, l
S3 et S4 ; l
: Structure dees ont été sélephore, ii) un fluHPO 199-5-B05
nnées de cette
2:Recherà
on et ca
ntaveclaC
ondelalia
orescents C
dent criblag
06). Ces so
a resynthèse
ces isomèr
isomères
les isomère
eurs structu
es sondes fluorectionnées au cuorophore et iii5 et CHPO 199
partie ont été
chedemaràtraversla
aractérisa
Calmodul
aisondess
CHPO 199-
ge visant à
ondes appar
e de ces com
res ont été is
CHPO 199
es CHPO 19
ures sont do
rescentes de Cacours d’un crib) un espaceur e
9-6-F07 corresp
générées par
rqueursdeasignalisati
ation de
line
sondesde
-5-B05 et C
à identifier
rtiennent res
mposés a do
solés et car
9-5-B05 ort
99-5-B05 o
onnées dans
aM sélectionnéblage précédanentre le corps depondent respect
Dr Rania Dag
l’étatphysioncalciqu
e petites
CaMàSyn
CHPO 199
des moléc
spectivemen
onné un mé
actérisés (D
tho et para
ortho et par
la Figure 5
ées lors d’un crnt (Dagher et e la molécule etivement aux so
gher, UMR 72
siologiquede
s molécu
nCaM1
9-6-F07 ont
cules fluore
nt aux fami
élange d’iso
Dagher et al
a sont appe
ra sont appe
0.
riblage de moléal., 2006) et st le dye fluores
ondes fluorescen
200.
desgCSCs
ules chim
t été sélecti
escentes lia
milles naphta
omères ortho
., 2006; Ma
elés respect
elés respect
lécules fluorescsont composée
scent. Les isomntes de CaM S
120
miques
ionnés à
ant CaM
alènes et
o et para
aximciuc
tivement
tivement
centes. es de i) un ères ortho / 1, S2, S3 et
Les son
(Dagher
d’une m
(concen
équation
et al., 2
SynCaM
ont ensu
Figure 51la concentLa matriceMOPS, 10ont été titrdissociatioune régres
La dépe
modèle
liaison d
un mod
d’associ
3 ou 4 C
Chapitre
ndes S1, S2,
r et al., 200
matrice de ti
ntration en
n supposant
006). Pour
M a été déte
uite été repr
: Constantes atration en Ca²+
e de titration a00 mM KCl, pHrées dans chaquon obtenues à lssion non linéai
endance au
macroscop
de chaque s
dèle séquent
iation A, B,
Ca²+ sur un
2:Recherà
S3 et S4 in
06) ; cette d
itration. Pou
sonde fixe
t un unique
chaque cou
erminée à u
résentées en
apparentes de +.
a été réalisée avH 7.2. Les sondue tampon calcil’équilibre (Kapre. Les valeurs
calcium du
pique (prése
sonde à CaM
tiel de liais
, C, D et E
site particu
chedemaràtraversla
nteragissent
dépendance
ur chaque [
e, concentra
e site de liai
urbe, une va
une [Ca²+] d
n fonction d
dissociation K
vec 20 tampondes de CaM (S1ique avec une cpp) des sondes de Kapp sont r
u comporte
enté en Figu
M (démontré
on, ce mod
de la liaison
ulier de CaM
rqueursdeasignalisati
t avec SynC
e au calcium
[Ca²+], la co
ation de Sy
ison en util
aleur appar
donnée. L’e
de [Ca²+], Fi
Kapp des sonde
ns calciques cal, S2, S3, S4) on
concentration dpour SynCaM
représentées en
ement des s
ure 52) en
é par titratio
dèle permet
n des sonde
M (Dagher e
l’étatphysioncalciqu
CaM (Figure
m a été étud
ourbe de lia
ynCaM var
lisant une ré
ente de diss
ensemble de
gure 51.
es S1, S2, S3 et
librés différentsnt été préparées
de SynCaM variM dans chaque t
fonction de la c
sondes de C
assumant q
on à saturat
de détermi
es à SynCaM
et al., 2010)
siologiquede
e 75) de faç
diée plus p
aison de la
riable) a ét
égression no
sociation (K
es valeurs K
t S4 titrées sur
s de 0 à 1 mMs à une concentiable de 0,08 à tampon calciquconcentration li
CaM a été m
qu’il n’y ait
tion de la so
iner les val
M liée respe
.
desgCSCs
on Ca²+ dép
précisément
matrice de
té alignée
on linéaire
Kapp) de la
Kapp ainsi o
r SynCaM en f
M dans un tamptration finale de10 µM. Les co
ue ont été déteribre de Ca²+.
modélisée s
t qu’un seu
onde). En su
leurs des co
ectivement à
121
pendante
à l’aide
titration
par une
(Dagher
sonde à
obtenues
fonction de
pon 30 mM e 0.1 µM et
onstantes de rminées par
selon un
ul site de
upposant
onstantes
à 0, 1, 2,
Figure 52L’étoile rodu calciumd’associatid’associati
Les vale
(Dagher
cette éq
Où x es
Ca²+ à
constan
Les con
sont don
Tableau 4calcique. À, B, C, Dobtenues àexpérimen
Chapitre
: Modèle séquose représente lam à chaque siteion du calcium ion du peptide o
eurs de K1,
r et al., 201
quation :
st la concen
CaM, et A
ntes d’associ
nstantes d’af
nnées dans
SynCa
SynCa
SynCa
SynCa
4 : Constantes
D, E sont les cà partir des countales ont été ex
2:Recherà
uentiel de la liaa sonde ou le p
e de CaM en abà chaque site d
ou de la sonde a
K2, K3 et K
10) ; Kapp
11
ntration du C
A la constan
iation B, C,
ffinité des c
le Tableau 4
À
M / S1 0
M / S2 0
M / S3 0
M / S4 0
s d’association
constantes d’assurbes de liaisonxploitées selon u
chedemaràtraversla
aison des sondeeptide fluorescebsence de peptide CaM en présaux différents c
K4 ont été d
est corrélé
Ca²+ libre, K
nte d’assoc
D et E sont
complexes C
4.
(µM‐1) B
0.0047 0
0,0050 0
0,0027 0
0.0028 0
de l’interacti
sociation de la n des sondes à Vun modèle de li
rqueursdeasignalisati
es ou de peptidents. K1, K2, Kide ou de sondsence de peptidcomplexes CanC
déterminées
à [Ca²+], se
K1 à K4 et
ciation des
t calculées d
CaM-Can (n
(µM‐1) C
0.0047
0.0050
0,0027
0.0028
ion de SynCaM
sonde à VU1 VU1 en fonctioiaison séquentie
l’étatphysioncalciqu
des fluorescentK3, K4 sont les de. G1, G2, G3,e ou de sonde. CaM (n = 0 – 4)
s par titratio
elon le sché
t G1 à G4 l
sondes à C
d’après ces
n = 0 - 4) po
(µM‐1) D (
48
15
8
7
M avec les son
complexée à 0on de [Ca²+] dael.
siologiquede
s à la Calmoduconstantes mac, G4 sont les coÀ, B, C, D, E r).
on calorimé
éma d’Adai
les constant
CaM en abs
relations :
our les sond
(µM‐1) E (
2.5
1.0
0.4
0.3
ndes à différen
, 1, 2, 3, ou 4 ans une matrice
desgCSCs
uline. croscopiques d’onstantes macrreprésentent les
étrique isoth
ir-Klotz, à p
tes d’associ
sence de C
des S1, S2,
(µM‐1)
6
3
1,1
0,9
nts degrés de
Ca²+. Les valee de titration. L
122
association roscopiques s constantes
hermique
partir de
iation du
Ca²+. Les
S3 et S4
saturation
eurs ont été Les données
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
123
Les résultats peuvent être résumés comme suit
- Il n’y a pas de liaison significative des sondes à apoSynCaM ou SynCaM-Ca1
- La liaison des sondes S1, S2, S3 et S4 à SynCaM requiert au moins 2 Ca²+
- L’affinité de liaison des sondes à SynCaM est modulée par la liaison des 3e et 4e Ca²+
Les 4 sondes présentent un comportement similaire de liaison aux différents complexes CaM-
Can (n = 0 - 4), suggérant qu’elles partagent le même site de liaison à SynCaM. La
comparaison des constantes d’association de la liaison des isomères S1 et S2 à VU1, montre
une différence d’un facteur 3 alors que les constantes d’association des sondes S3 et S4 aux
complexes CaM-Can sont quasiment identiques (Tableau 4). Ceci suggère que la partie
lissamine du composé CHPO 199-5-B05 est impliquée dans l’interaction de la sonde avec
SynCaM.
Une fois que la liaison des sondes à SynCaM a été caractérisée, nous avons effectué un
criblage compétitif par anisotropie de fluorescence en utilisant les isomères ortho (sondes S1
et S3), sondes ayant la plus forte affinité pour SynCaM en conditions saturantes de Ca²+.
2. IdentificationetcaractérisationdepetitesmoléculesinteragissantavecCaM
2.1. CriblageparcompétitionaveclessondesfluorescentespourlaliaisonàCaM2
Les chimiothèques Patrimoine de Strasbourg et Prestwick Chemical, contenant 6000
molécules, ont été criblées sur SynCaM à 10 µM par anisotropie de fluorescence en
compétition avec les sondes S1 et S3.
Les mesures des valeurs de FP sont basées sur un changement de la polarisation de
fluorescence lorsqu’un composé se lie à la protéine (Annexe I): en absence de molécules
compétitrices, les sondes sont liées à CaM et la valeur de polarisation de fluorescence est
2 Les données de cette partie ont été générées par Dr Rania Dagher, UMR 7200.
élevée (
la proté
(entre 3
valeurs
due à l’e
Figure 53L’essai comM KCl, 10 µM. L’polarisatiomesurées a
La qual
Le facte
protéine
obtenue
est exce
Les vale
S1 et en
S1 et S3
Chapitre
(environ 41
éine, la sond
375 et 180
FP (390 et
effet de dilu
: Criblage comompétitif a été r
10 µM CaCl2, ’effet de chaquon de fluoresceaprès l’addition
ité de l’essa
eur Z’ évalu
e) et dépola
e pour nos d
ellente du fa
eurs mFP o
ntre 170 et 3
3 est calculé
2:Recherà
0 et 375 mF
de peut être
mFP pour
t 330 mFP p
ution (Figur
mpétitif par anréalisé avec 0.1
pH 7,5. Les che composé (axeence (axe des n des composés
ai est évalué
ue la différe
arisée (sond
données est
ait de l’impo
obtenues po
340 pour la
é pour chaqu
chedemaràtraversla
FP pour S1
e déplacée e
S1 et entre
pour S1 et
re 53).
nisotropie de fl µM de sonde himiothèques Pe des abscissesordonnées). Lé.
ée par l’ana
ence des sign
e libre) en p
Z’=0,85. Ty
ortance de l
ur le cribla
sonde S2.
ue composé
rqueursdeasignalisati
et S3 respe
et la valeur
e 340 et 1
S3 respecti
luorescence suS1 mélangée à
Patrimoine et P) sur le déplaceégende : ■ vale
alyse du par
gnaux mesur
prenant en
ypiquement
la gamme dy
age compéti
Le ratio de
é selon l’équ
mFPmFP
l’étatphysioncalciqu
ectivement)
r de polaris
80 pour S3
vement) su
r le complexe 2 µM de SynC
Prestwick ont étement de S1 dueurs mFP du c
ramètre stat
rés en condi
compte la v
t, une valeu
ynamique.
itif varient e
déplacemen
uation suiva
mFPP mF
siologiquede
) ; lorsqu’un
ation de flu
3). La dimi
ivant l’ajou
SynCaM – S1.CaM dans un taté criblées à unu complexe Syncomplexe SynC
tistique Z’ (
itions polari
variabilité d
ur de Z’ com
entre 170 et
nt des sond
ante :
P
desgCSCs
ne molécule
uorescence
inution glob
ut des comp
. ampon 50 mM ne concentrationCaM – S1 estCaM-S1, ▲ va
(Zhang et al
risée (sonde
de l’essai. L
mprise entre
t 375 pour
des (Probe F
124
e se lie à
diminue
bale des
posés est
Hepes, 150 on finale de t évalué par aleurs mFP
l., 1999).
liée à la
La valeur
e 0,5 et 1
la sonde
FP–ratio)
Avec le
Les vale
De ce c
37 molé
de ces
calculée
En plus
commer
pour ce
TFP, Fl
2.2.
L’analy
familles
Fam
Fam
Fambip
Fam
Famnip
3 La clasUMS 328
Chapitre
es valeurs d
eurs calculé
criblage, nou
écules de la
composés e
e à partir de
des molécu
rciales anta
et essai com
uphenazine
Classifica
yse structura
s chimiques
mille I: éthylè
mille II: pyrid
mille III: analphényles
mille IV: alky
mille V: ammpecotates
ssification des86
2:Recherà
de mFPmax e
ées de dépla
us avons pu
chimiothèq
est un ratio
e l’équation
ules apparte
gonistes de
mpétitif. Il s
e et Clorprom
tiondeshi
ale des com
s par analog
ène diamine
dazines amin
ogues du tri
lène bis‐ami
monium quat
s molécules a
chedemaràtraversla
t mFPmin fi
acement des
u sélectionn
que de Prest
o déplacem
précédente
enant aux ch
CaM sont
s’agit des a
mazine.
itsenfami
mposés sélec
ie de structu
s N,N disubs
oalkyles et t
fluoperazine
diniums
ernaires et d
a été effectuée
rqueursdeasignalisati
ixées à resp
s sondes var
ner 10 moléc
twick présen
ment de la s
.
himiothèque
sorties de c
antagonistes
illeschimiq
ctionnés no
ure :
stitués
triazines
e ou
dérivés
e par Bruno D
l’étatphysioncalciqu
pectivement
rient entre 0
cules de la
ntées en An
sonde S1 d
es Prestwic
ce criblage,
s W7, W13
ques3
ous a permi
Didier, respon
siologiquede
430 et 170
0 et 1.
chimiothèq
nnexe II. Le
’une valeur
k et Patrimo
servant de
3, Bifonazo
is de les cla
nsable chimio
desgCSCs
0 pour les 2
que de Stras
e critère de s
r supérieure
oine, des m
« contrôle
ole, Calmida
asser en dif
othèques UMR
125
2 sondes.
sbourg et
sélection
e à 0,36
molécules
positif »
azolium,
fférentes
R 7200 et
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
126
Famille VI: 6‐aryl‐pyridazin‐4‐one
Famille VII: chalcones et analogues cycliques
Famille VIII: acides carboxyliques
Famille IX: non classifiés Tableau 5 : Familles chimiques des antagonistes de la Calmoduline. Les molécules sélectionnées au cours du criblage ont été classées en différentes familles chimiques caractérisées par un pharmacophore.
Les structures chimiques des molécules sélectionnées sont données en Annexe II.
2.3. ValeursdeKietcaractérisationdelaliaisonàCaM4
La caractérisation des mécanismes de liaison des molécules sélectionnées à SynCaM a été
effectuée dans un premier temps à travers l’analyse de leur comportement compétitif pour les
sondes S1 et S3. Les sondes S1 et S3 se lient à leur site de haute affinité avec des valeurs
respectives de Kd de 0,18 et 0,9 µM (Dagher et al., 2009). En conditions saturantes en Ca²+,
l’augmentation de la concentration des composés induit la diminution de la quantité de sonde
liée à SynCaM et l’augmentation du degré de polarisation selon une courbe sigmoïde.
Afin d’évaluer les constantes de dissociation Ki des molécules interagissant avec CaM, les
complexes SynCaM – sonde fluorescente ont été titrés avec chaque molécule sélectionnée en
conditions saturantes en Ca²+. Les données expérimentales ont permis de calculer une courbe
théorique de liaison des composés à SynCaM selon un modèle compétitif décrit par (Roehrl et
al., 2004) en considérant 1 site de liaison pour la sonde et une compétition directe entre la
sonde et la molécule sélectionnée (CaM – interactor). Quelques-uns de ces essais sont
présentés dans la Figure 54, les valeurs de Ki obtenues pour chaque molécule sont rapportées
en Annexe II.
4 Les données expérimentales de cette partie ont été générées par Dr Rania Dagher, UMR 7200.
NNH
O
Aryl
Figure 54par compLes changavec CaMSynCaM ecompétitif
D’après
chimiqu
substitu
molécul
molécul
molécul
Les son
de Ki ob
si la mo
d’un sit
caractér
liaison a
Chapitre
4 : Courbes de étition avec la
gements de polaM (de 0.5 à 500
est de 0,1 µM f décrit par (Roe
s les valeur
ue l’affinité
ution présen
les exploren
laires de l
les.
ndes S1 et S
btenues pou
olécule se li
te de liaison
risée par un
allostérique
2:Recherà
titration des msonde S1.
arisation de flu0 µM) dans un
et mélangée pehrl et al., 2004
rs de Ki o
de liaison d
nt sur le ph
nt différent
’interaction
S3 partagean
ur une mêm
ie au même
n allostériqu
n ratio entre
e.
chedemaràtraversla
molécules inter
uorescence sonttampon 5 o mMréalablement à
4).
obtenues, n
des molécul
harmacopho
ts sites de l
n de CaM
nt probable
me molécule
e site de liai
ue (Figure 5
ses deux co
rqueursdeasignalisati
ragissant avec
t mesurés en foM Hepes, 150
à 0,1 µM de so
nous pouvon
les interagis
ore représen
liaison, per
avec ses
ement un mê
en compéti
ison que les
55). Par ex
onstantes d
l’étatphysioncalciqu
CaM des fami
onction de la cmM KCl, 100
onde S1. Les d
ns en dédu
ssant avec C
ntatif de la
rmettant ain
protéines c
ême site de
ition avec S
s sondes et
emple, la m
e dissociati
siologiquede
illes amino-alk
oncentration deµM CaCl2 pH
données ont été
uire que po
CaM dépend
famille. Ce
nsi d’analys
cibles en u
liaison pou
S1 et S3 doiv
peut être d
molécule LP
on de 4,5, s
desgCSCs
kyl pyridazine
es molécules inH 7.2. La conceé analysées par
our chaque
d du groupe
eci suggère
ser les méc
utilisant dif
ur CaM, les
ivent être id
différente si
PS 02-10-L-
suggérant u
127
et triazine
nteragissant entration de r le modèle
e famille
ement de
e que les
canismes
fférentes
s valeurs
dentiques
il s’agit
-A07 est
n site de
Figure 55À : Relatiola sonde Schaque moKi obtenueS1, S3 et couleurs d
2.4.
La stœc
titration
différen
Considé
peut êtr
Avec R
représen
intrinsèq
deux co
grande
5 Les don
A
Chapitre
: Sites de liaison entre les val
S3 d’autre part àolécule. Haut : es avec les sonddes molécules
des graphes repr
Caractéris
chiométrie
n microcalo
ntes familles
érant la ther
e déterminé
R la consta
ntent respec
que de la m
onformation
est l’affinit
nnées de cette
2:Recherà
son des molécueurs de Ki obteà CaM. 4 ensemreprésentation des S1 et S3 inse liant à diff
résentés en A.
isationdum
et l’affinité
orimétrique
s chimiques
rmodynamiq
ée par les éq
∆
ante des g
ctivement le
molécule est
ns de la pro
té. Par cons
partie ont été
chedemaràtraversla
ules sur la Calmenues pour chaqmbles de molécde l’ensemble dférieures à 12 µ
férents sites de
mécanism
é de liaison
isothermiq
s.
que, l’affini
quations sui
ln
az parfaits
es changem
t déterminée
otéine (libr
séquent, à t
générées par
rqueursdeasignalisati
moduline. que molécule pocules peuvent êdes molécules, µM. B : Représ
CaM. Les cou
edeliaiso
n des comp
que (ITC)
ité intrinsèq
ivantes :
et
, T la tem
ments d’enth
e par la diff
re et liée à
température
Dr Rania Dag
B
l’étatphysioncalciqu
our l’inhibition être distingués s
bas : représentsentation schémuleurs employé
ndesmolé
posés à Syn
pour certa
que d’un sit
∆ ∆
mpérature e
halpie et d’e
férence d’én
la molécul
e constante,
gher, UMR 72
siologiquede
de la liaison deselon le ratio deation des moléc
matique de la comes dans le sché
éculesàCa
nCaM ont é
ains compo
e de liaison
∆
en degrés K
entropie du
nergie libre
le) : plus ∆
, une augm
200 et Philippe
desgCSCs
e la sonde S1 de ces 2 valeurs cules ayant des
ompétition entreéma B corresp
aM5
été détermin
osés appart
n pour une m
Kelvin, ∆H
système. L
e de Gibbs ∆
∆G est néga
mentation ∆S
e Tsekov
128
’une part et de Ki pour
s valeurs de e les sondes ondent aux
nées par
tenant à
molécule
H et ∆S
L’affinité
∆G entre
atif, plus
S et une
diminut
molécul
libératio
chimiqu
désordre
structur
flexibili
d’une m
enthalpi
hydrogè
Les cou
liaison.
Figure 56avec CaMLes changde SynCaconcentrat01-18-L-E
Chapitre
tion ∆H en
le pour Ca
on de moléc
ue : plus le n
e molécula
raux de la
ité de la pro
molécule p
iquement
ène entre le
urbes ITC d
Les résulta
6 : Courbes deM. gements d’enthaaM. Les mesurtion de SynCaM
E03, LPS 01-18
2:Recherà
ntre les 2 c
aM. L’entro
cules d’H2O
nombre de m
aire augmen
protéine d
otéine dimin
peut être e
favorable
ligand et de
e 6 compos
ats sont prés
e titration calo
alpie ∆H sont mres ITC ont étéM est de 10 µM-L-E04. Les do
chedemaràtraversla
conformatio
opie (mesur
O figées dan
molécules d
nte. Ce fac
diminuant l
nuant le dé
exothermiqu
telles que
es résidus d
sés ont été a
entés dans l
orimétrique is
mesurés en foncté réalisées dan
M pour LPS 02-onnées ont été a
rqueursdeasignalisati
ons traduise
re du déso
ns leur liaiso
d’H2O relâc
cteur peut ê
l’entropie c
sordre molé
ue (∆H<0)
e la form
du site de lia
analysées pa
la Figure 56
sothermique d
tion du nombrens 50 mM Hep-10-L-C08, LP
analysées avec 2
l’étatphysioncalciqu
ent une aug
ordre moléc
on à CaM s
chées dans l
être contreb
conformatio
éculaire. L’
) si elle m
mation de
aison de la p
ar un modèl
6 et le Table
de SynCaM av
e de molécules cpes, 150 mM KS 02-20-L-A022 ou 4 sites de l
L L L L∆ L○ TF
siologiquede
gmentation
culaire) est
uite à la lia
le solvant es
balancé par
onnelle, tel
enthalpie g
met en œu
liaisons é
protéine.
le séquentie
eau 6.
vec différentes
chimiques liéesKCl, 1 mM Ca2, LPS 05-01-Liaison proposés
LPS 01‐18‐L‐ELPS 05‐01‐L‐DLPS 02‐20‐L‐ALPS 02‐10‐L‐CLPS 01‐18‐L‐EFP
desgCSCs
de l’affinit
t augmentée
aison de la m
st important
ar des chan
ls qu’une p
globale de l
uvre un p
électrostatiq
el de 2 ou 4
molécules int
s par nombre deaCl2, pH 7,2 à L-D06 et 30 µMs par le logiciel
E03 D06 A02 C08 E04
129
té d’une
e par la
molécule
t, plus le
ngements
perte de
a liaison
rocessus
ques ou
4 sites de
teragissant
e molécules 25 °C. La
M pour LPS l Origin.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
130
TFP Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
Ka (µM‐1) 0,02 0,02 0,02 1,75
∆Hi (cal/mol) 671 (‐) 2,28E5 1,121E6 (‐) 9.108E5
∆Si (cal/mol.K) 22 (‐) 744 3777 (‐) 3023
Modèles à 4 sites de liaison séquentiels
LPS 01‐18‐L‐E04 Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
Ka (µM‐1) 6 1,1 0,07 1,1
∆Hi (cal/mol) 3052 1711 (‐) 19 600 22 360
∆Si (cal/mol.K) 41 33 (‐) 48 102
Modèles à 4 sites de liaison séquentiels
LPS 02‐10‐L‐C08 Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
Ka (µM‐1) 20 1 4,6 0,05
∆Hi (cal/mol) 1190 8499 1353 (‐) 7917
∆Si (cal/mol.K) 37 56 35 (‐) 5
Modèles à 4 sites de liaison séquentiels
LPS 05‐01‐L‐D06 Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
Ka (µM‐1) 1,27 0,04 0,02 0,18
∆Hi (cal/mol) 2453 (‐) 69 140 160 900 (‐) 114 100
∆Si (cal/mol.K) 36 (‐) 212 559 (‐) 357
Modèles à 4 sites de liaison séquentiels
LPS 01‐18‐L‐E03 Site 1 Site 2
Ka (µM‐1) 0,030 0,075
∆Hi (cal/mol) (‐) 2147 2268
∆Si (cal/mol.K) 13 230
Modèles à 2 sites de liaison séquentiels
LPS 02‐20‐L‐A02 Site 1 Site 2
Ka (µM‐1) 0,03 0,02
∆Hi (cal/mol) (‐) 1,76E4 8425
∆Si (cal/mol.K) (‐) 38 48
Modèles à 2 sites de liaison séquentiels Tableau 6 : Paramètres thermodynamiques de la liaison à SynCaM des molécules interagissant avec CaM. Les données ITC ont été analysées avec un modèle de liaison séquentiel à 4 sites pour les molécules TFP, LPS 01-18-L-E04, 05-01-L-D06 et LPS 02-10-L-C08 et à 2 sites pour les molécules LPS 01-18-L-E03 et LPS 02-20-L-A02. Les constantes d’association (ka) de chaque site de liaison ainsi que les variations d’enthalpie (∆H) et d’entropie (∆S) ont été déduites d’après les courbes ITC.
Les composés testés se lient avec une haute affinité à CaM avec des constantes d’association
de 1 à 20 µM-1, excepté pour les composés LPS 02-20-L-A02 et LPS 01-18-L-E03. Ces
composés si lient également à au moins 1 site de plus faible affinité avec des constantes
d’association de 0,05 à 0 ,3 µM-1 de façon enthalpiquement favorable. Les données montrent
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
131
que la liaison des composés aux sites de haute affinité est favorisée par l’entropie, excepté
pour la liaison du TFP favorisée par l’enthalpie.
Les données expérimentales obtenues avec le composé TFP ont été analysées avec 4 sites de
liaison, corroborant ainsi les données de cristallisation de TFP avec CaM mettant en évidence
un complexe formé de 4 molécules de TFP pour 1 molécule protéique (Osawa et al., 1998).
D’après nos données, l’un de ces sites a une affinité plus importante que les 3 autres.
Ces titrations ont été réalisées une seconde fois, avec un nombre plus important de composés,
sur un autre appareil et selon les conditions expérimentales définies au point II-9, Chapitre
matériel et méthodes. Les courbes ont été dans ce cas analysées avec 1 ou 2 sites de liaison,
les résultats sont présentés en Annexe II.
Ces analyses microcalorimétriques suggèrent que les molécules interagissant avec CaM ne
sont pas fonctionnellement équivalentes et confirment la présence de différents sites de liaison
des molécules à SynCaM ; les paramètres thermodynamiques de la liaison de ces molécules à
SynCaM illustrent la plasticité de CaM par rapport à sa capacité à adopter un large panel de
conformations reconnaissant différentes petites molécules, et éventuellement différents
CaMBDs. D’après ces résultats, nous nous attendons à ce que l’utilisation de différentes
molécules chimiques permette de déstabiliser de façon différentielle la liaison de CaM à ses
protéines cibles.
3. Intérêtphysiologiquedestouchessélectionnées
3.1. Disponibilitébiologique6
Afin de valider l’utilisation de ces composés dans un système intégré et comme outils
thérapeutiques, nous avons mesuré l’index d’hydrophobicité chromatographique (CHI) de
certains de ces composés. Les valeurs de CHI sont obtenues par un gradient rapide de phase
réverse HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) entre une phase
stationnaire aqueuse et une phase mobile organique. Le temps de rétention d’un composé dans
6 Les données de cette partie ont été générées par Patrick Gizzi, Plateforme TechMedILL.
la colon
sont ex
compos
thérapeu
lipidiqu
(CHI <
D’après
testés p
suscepti
facileme
Figure 57Les valeuraminoalkymolécules rouge.
3.2.
Nous av
signalis
(mesure
permett
sur les 2
7 Les don
Chapitre
nne reflète l
xprimés en
sé ; ces val
utique, une
ue (CHI > 5
90).
s les donné
peut être p
ibles d’être
ent dans le
7 : Disponibilitérs CHI ont été
yles et triazines pour lesquelle
Viabilitéc
vons ensuit
ation cellul
e de la viab
tant de déter
2 types cellu
nnées de cette
2:Recherà
le coefficien
pourcentag
eurs sont f
e molécule
50) mais do
ées présenté
présente dan
e retenus d
cytoplasme
é biologique deé déterminées p). La zone de b
es 50 < CHI <
cellulaire7
te voulu tes
laires, dont
bilité des c
rminer une
ulaires ; les
partie ont été
LPS 02-
chedemaràtraversla
nt de partag
ge du volu
fortement c
doit être a
it égalemen
ées en Ann
ns la phas
dans cette
e.
es molécules –pour les molécubonne disponibi90 (molécules
ster la capa
t l’induction
ellules) réa
valeur d’EC
résultats so
générées par
LPS 01‐0
-30-L-F05
rqueursdeasignalisati
ge de ce com
ume de la
corrélées au
assez hydro
nt pouvoir e
nexe II et F
se lipophile
membrane
Valeurs CHIules des famillilité biologique bleues) ; les m
acité de ces
n de la mo
alisées ont é
C50 et un no
ont présenté
Shan Peng, U
02‐L‐B11
LPS 01-17-L
l’étatphysioncalciqu
mposé entre
phase org
ux valeurs d
ophobe pou
en ressortir
Figure 57, l
e ; cependa
e et par co
les I (éthylène e est représentémolécules en de
s molécules
ort cellulair
été analysé
ombre de H
és en Annex
UMR 7200.
LPS 01-1L-E07
siologiquede
e les deux p
ganique néc
de log D. D
ur s’insérer
et diffuser
la quasi-tot
ant 4 de c
onséquent
diamine disube entre les 2 ligehors de cette z
à interagir
re. Les cou
es avec un
Hill (nH) pou
xe II.
LPS 0
8-L-C06
desgCSCs
phases : les
cessaire à
D’un point
r dans la b
dans le cyt
talité des co
ces compos
de diffuse
bstitués) et II (pgnes orange dézone sont repré
r avec des v
urbes dose-r
ne équation
ur chaque m
CH
CH01-18-L-D04
132
résultats
éluer le
t de vue
bicouche
toplasme
omposés
sés sont
r moins
pyridazines limitant les ésentées en
voies de
réponses
de Hill,
molécule
HI = 50%
HI = 90%
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
133
Les résultats montrent un effet significatif de l’ensemble de ces molécules sur la viabilité
cellulaire, ainsi que la non-linéarité de l’ensemble des EC50 obtenues dans les cellules HEK et
TG01 : la moitié des composés (20 / 40) ont un effet similaire sur les 2 types cellulaires alors
que les cellules TG01 sont plus résistantes pour 20 % des molécules et les cellules HEK pour
30 % des molécules (Figure 58). Cette non-linéarité n’est ni corrélée aux valeurs de Ki
obtenues avec les sondes S1 et S3 ni aux valeurs de CHI ; on peut donc suggérer que ces
composés activent des chemins cinétiques différents (la différence peut porter sur un nombre
très restreint de protéines) dans les 2 types cellulaires.
Figure 58À : Compvaleur du groupes dMoléculesvert : fam(monocati
ToxicitHEK LPS 01ChlorpFluphePCL 09PCL 10PCL 10LPS 02PCL 10
Compo LPS 01
Chapitre
: Toxicité des paraison des val
ratio des valeudéfinis précédems en bleu : famil
mille III (analoons et dérivés n
té plus impo
‐18‐L‐B10 promazine enazine 9G07 ‐ 706 0G10 ‐ 789 0H04 ‐ 793 ‐10‐L‐F11 0F08 ‐ 777
sé non toxiqu
-08-L-C07
2:Recherà
composés sur leurs EC50 de t
urs EC50 obtenumment. Les mlle I (éthylène dgues du trifluonipecotate).
ortante sur
ue
chedemaràtraversla
les cellules TGtoxicité obtenuues sur les celluolécules marqudiamines N,N doperazine ou b
Toxicité éet HEK LPS 02‐10LPS 02‐10LPS 02‐10LPS 02‐10LPS 02‐10LPS 02‐20LPS 02‐20LPS 02‐30LPS 01‐18TFP LPS 01‐12PCL 09E06PCL 09F04LPS 02‐17LPS 02‐18PCL 09G09LPS 01‐18LPS 01‐12W13 Calmidazo
rqueursdeasignalisati
G01 et HEK. ues sur les celluules TG01 vs cuées par * sondisubstitués), orbiphényles), vi
équivalente s
0‐L‐A02 0‐L‐A07 0‐L‐C08 0‐L‐C09 0‐L‐D02 0‐L‐B05 0‐L‐C04 0‐L‐F05* 8‐L‐C06*
2‐L‐G09 6 ‐ 685 4 ‐ 693 7‐L‐H11 8‐L‐A02 9 ‐ 708 8‐L‐E04 2‐L‐E04
olium
l’étatphysioncalciqu
ules HEK et TGcellules HEK. Bnt les moléculerange : famille Iiolet : famille
ur TG01
siologiquede
G01 et répartitiB : Répartition s dont les CHII (pyridazines aIV (biscations
Toxicité pluTG01 LPS 01‐15‐L‐LPS 01‐17‐L‐LPS 01‐18‐L‐LPS 02‐03‐L‐LPS 02‐20‐L‐LPS 02‐20‐L‐LPS 05‐01‐L‐PCL 09G06 ‐ LPS 01‐18‐L‐LPS 01‐09‐L‐W7 Compound 4
desgCSCs
ion en 3 groupdes molécules
HI ne sont pas aminoalkyles es), bleu clair :
us important
‐H06 ‐E07* ‐D04* ‐D03 ‐A02 ‐C02 ‐D06 705 ‐E03 ‐F11
48/80
134
pes selon la s dans les 3 favorables. t triazines), famille V
e sur
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
135
Le criblage de chimiothèques a permis l’identification de 56 molécules liant CaM ; ces
molécules sont caractérisées par leurs constantes d’inhibition de la liaison des sondes S1 et S3
à CaM, mettant en évidence plusieurs sites de liaison de ces molécules à CaM. Une étude
thermodynamique de la liaison de certaines de ces molécules à CaM a été effectuée ainsi que
la détermination de leur coefficient de partage entre des milieux de nature hydrophile et
hydrophobe ; ce dernier paramètre nous permet d’écarter 5 molécules de la suite de l’étude.
Enfin, l’observation de l’effet toxique des composés permet de mettre en évidence des
différences entre deux types cellulaires.
III. Caractérisationdel’interactiondeCaMavecsescibles
L’interaction de CaM avec des peptides fluorescents (séquences en Annexe III) a été étudiée
en fonction du nombre du Ca²+ liés à la protéine. Comme souligné dans l’introduction de ce
chapitre, nous considérons ici que l’interaction de CaM avec ses protéines cibles peut se
résumer à l’interaction avec le CaMBD, représenté par un peptide d’une vingtaine d’acides
aminés (point I-3.3.2 page 112).
Pour chaque courbe de titration (concentration en peptide fixe, concentrations variables de
CaM et Ca²+), la valeur de la constante de dissociation apparente Kapp a été déterminée et
représentée en fonction de [Ca²+]. Les données ont ensuite été analysées selon le modèle
d’Adair Klotz (point II-1 page 120, Figure 52) afin de déterminer les valeurs des 5 constantes
d’association A, B, C, D, E de la liaison du peptide aux complexes CanCaM (n = 0 - 4) ; pour
chaque peptide, les constantes de dissociation correspondantes sont indiquées en Annexe III.
Ceci nous a permis de classifier les peptides en 4 groupes, selon les complexes Can CaM (n =
1 - 4) reconnus par les différents peptides (Figure 59) et selon le modèle d’interaction de CaM
avec ses cibles décrit au point I-3.3.3 (page 113).
Figure 59Le nombrela CaM huaffinités re0 – (n-1)),chemins censemble ayant une
Cette a
complex
effet, da
faible af
comme
CaMBD
comme
l’affinit
précéde
suggéra
façon im
Chapitre
: Interaction de d’ions Ca²+ eumaine selon leeprésentées dan les affinités re
cinétiques repréde peptides. Lvaleur de Kapp
approche pe
xe CanCaM
ans la cellu
ffinité néce
non favora
Ds. C’est n
un CaMBD
té du peptid
ent, l’affinit
ant la forma
mportante av
2:Recherà
des peptides avst déduit de la e modèle d’Adns la partie supéeprésentées dansésentant l’évolu
La concentrationp inférieure peu
ermet de m
M (n = 1 – 4)
ule, la liaiso
ssitant la sa
ables in ce
notamment
D dans la lit
de pour CaM
té du CaM
ation du co
vec [Ca²+] (
chedemaràtraversla
vec CaM seloncomparaison de
dair-Klotz. Chaqérieure représens la partie inférution des valeun intracellulaire
uvent interagir a
mettre en
) par les cib
on de 4 Ca²
aturation de
ell, les pept
le cas du
ttérature. Da
M avec la lia
MBD pour
omplexe EG
(Dagher et a
rqueursdeasignalisati
n le nombre d’ies valeurs A, Bque peptide estntent les affinitérieure représenturs de Kapp ene de CaM est avec apoCaM in
évidence l
bles de CaM
a²+ à CaM e
CaM en Ca
tides corres
peptide SE
ans le cas l’
aison de 4 C
CaM est s
GFR - apoC
al., 2010).
l’étatphysioncalciqu
ions Ca²+ liés àB, C, D, E obtent représenté parés de chaque peent les affinités
n fonction du nindiquée par la
n cell . (a) = dom
la reconnai
M ainsi que
est raremen
a²+ pour se
spondants n
ERCA1, do
EGFR, on v
Ca²+. Cepen
significative
CaM in cel
siologiquede
à CaM. nues pour chaqur la protéine à eptide pour les s des complexesombre du Ca²+
a ligne horizonmaine PreIQ, (b
ssance spé
les liaisons
nt observée
former peuv
ne sont pro
omaine n’é
voit aussi un
ndant contra
e même en
ll ; cette af
desgCSCs
que peptide en llaquelle il appacomplexes Cam
s CapCaM (p = + liés à CaM pntale orange : lb) = domaine IQ
écifique de
s non favora
; les comp
vent être co
obablement
étant pas c
une augment
airement au
n absence d
ffinité augm
136
iaison avec artient. Les mCaM (m = n – 4). Les our chaque es peptides Q.
chaque
ables. En
lexes de
onsidérés
pas des
onsidéré
tation de
u peptide
de Ca²+,
mente de
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
137
Cette méthode permet de prédire le nombre minimal d’ions Ca²+ nécessaires à l’interaction
CaM – CaMBD. Les équations utilisées pour la détermination de ce nombre de Ca²+ sont des
équations macroscopiques et ne permettent pas d’accéder au site de fixation des ions Ca²+.
Cependant, l’association de Ca²+ à CaM a été décrite à travers plusieurs modèles (Dagher et
al., 2010; Haiech et al., 2011), évoqués au point I-3.2 (page 109).
Dans un premier modèle, CaM est décrite comme ayant 2 sites équivalents et non
indépendants de liaison de Ca²+ pour chacun des 2 lobes ; ces sites sont caractérisés par une
constante d’association kc et un facteur de couplage cc au niveau du lobe C, respectivement kn
et cn au niveau du lobe N. Chaque lobe est considéré comme symétrique mais les 2 lobes ne
sont pas équivalents. En effet, l’affinité du domaine C terminal de CaM est plus importante
que celle du domaine N terminal : les sites du lobe C sont donc occupés avant ceux du lobe N
(Linse et al., 1991). Cependant, ce modèle considère que CaM peut être la somme de 2 lobes
indépendants, ce qui a été contredit plus tard par la démonstration d’une interaction entre les
lobes (Shea et al., 1996; Sorensen and Shea, 1998).
Un deuxième modèle propose la distinction de deux états conformationels (caractérisés par
une constante d’équilibre L) et deux paires de sites. Les sites de chaque lobe sont symétriques
et caractérisés par les constantes d’association kn et kc dans le premier état conformationel et
c*kn et c*kc dans la seconde conformation, respectivement pour les lobes N et C.
Dans un troisième modèle, asymétrique, apoCaM ne possède qu’un site ayant une affinité
significative pour Ca²+ de constante d’association k1. La fixation du Ca²+ sur ce site augmente
l’affinité du second site pour Ca²+ (constante d’association k2) et ainsi de suite. Ce modèle
décrit une fixation séquentielle et ordonnée du Ca²+ sur CaM (modèle SOB).
Ces 3 modèles sont caractérisés par 4 paramètres microscopiques liés aux constantes
macroscopiques déterminées expérimentalement. Cependant, seul le dernier modèle est en
accord avec les données obtenues sur des mutants de CaM où la mutation d’un unique résidu
tryptophane dans chaque motif EF-hand permet de suivre l’occupation des sites de fixation du
Ca²+ ; ce modèle a mis en évidence l’ordre de remplissage des sites : site III site IV site
I site II (Kilhoffer et al., 1992).
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
138
L’étude du nombre minimal de Ca²+ nécessaire à l’interaction de CaM avec ses cibles
combinée à l’ordre de remplissage des différents sites de fixation du Ca²+ sur CaM, doit
permettre de déterminer quels sites de fixation du Ca²+ et quel lobe de CaM interviennent
dans la liaison de CaM à une cible donnée. Cette étude de l’interaction des complexes
CanCaM (n = 0 – 4) sans muter les motifs EF-hands de CaM permet d’éviter de perturber
l’interaction des résidus des motifs EF-hands avec certaines cibles indépendamment de la
liaison du Ca²+ (Li et al., 2009b). Cette méthode peut être utilisée pour prédire l’interaction de
CaM avec ses cibles en fonction de l’augmentation de la concentration cytoplasmique en Ca²+
observée suite à une stimulation.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
139
IV. UtilisationdesmoléculesinteragissantavecCaMpourinhiberlaliaison
deCaMavecsescibles
1. IC50dedéplacementdespeptidesliésàCaMparchaquemolécule
Nous avons précédemment caractérisé
- La liaison de CaM à différents CaMBDs rapportés dans la littérature
- Un ensemble de petites molécules interagissant avec CaM et potentiellement capables
d’inhiber la liaison de CaM avec ses cibles, de passer à travers la membrane
plasmique et ayant un effet sur la viabilité cellulaire, i.e. modifiant la signalisation
cellulaire
Nous nous intéressons maintenant à regarder plus en détail quelles sont les interactions CaM –
CaMBD préférentiellement inhibées par chaque petite molécule. Ceci a été réalisé à travers un
essai de polarisation de fluorescence dans des conditions de saturation en Ca²+ et au cours
duquel des concentrations croissantes de molécules interagissant avec CaM ont été ajoutées
sur chaque complexe CaM – CaMBD préformé. Les résultats (valeurs IC50) sont présentés en
Annexe IV.
2. ClassificationdesmoléculesetCaMBDs
Les molécules ont été classées selon les CaMBDs dont la liaison avec CaM a été
préférentiellement inhibée ; ces résultats dépendent à la fois de l’affinité des CaMBDs pour
CaM, de la conformation de CaM en liaison avec un CaMBD, de l’affinité des molécules pour
CaM et de leur accessibilité au site de liaison de CaM en présence du CaMBD. Ce classement
a été effectué avec le logiciel dChip (Figure 60A), logiciel de Windows conçut pour la
clusterisation d’expression de gènes et de SNPs (single nucleotide polymorphisms).
Les CaMBDs semblent être déplacés par les molécules chimiques selon le nombre d’ions
Ca²+ devant être liés à CaM pour permettre la formation du complexe CaM – CaMBD : les
CaMBDs liant CaM à partir de 1 Ca²+ (groupe P2) voient leur interaction avec CaM inhibée
par des molécules différentes que les CaMBDs nécessitant 3 Ca²+ liés à CaM (groupes P1 et
P3) (Figure 60B) ; les CaMBDs nécessitant 2 Ca²+ sont répartis entre ces 2 groupes. La
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
140
liaison à CaM des CaMBDs du groupe P3, représentant les protéines CAP-23/NAP-22, Heat
shock protein 90 (Hsp90), Neuromoduline et dans une moindre mesure le canal potassique
calcium dépendant (SK1), est fortement inhibée par la majeure partie des antagonistes.
D’après la Figure 59, ces peptides sont ceux ayant les constantes d’interaction avec CaM les
plus faibles en conditions saturantes en Ca²+ : ces peptides sont donc plus faiblement liés à
CaM et par conséquent potentiellement plus facilement déplaçables par l’ensemble des
antagonistes.
De la même façon, les composés peuvent être répartis en 3 groupes selon les CaMBDs
préférentiellement inhibés (Figure 60C). On observe ainsi :
- Les composés des familles II (Amino alkyl pyridazine and triazine) et III (Biphenyls)
(groupe A2) inhibent préférentiellement les CaMBDs liant les complexes Ca1CaM
- Les composés des familles I (Ethylène diamine N,N disubstituted) et V (Monocations
et dérivés nipecotates) (groupe A1) inhibent préférentiellement les CaMBDs liant les
complexes Ca3CaM
- Les composés du groupe A3 ne permettent pas de faire clairement cette distinction
entre les CaMBDs liant Ca1CaM ou Ca3CaM. Ces molécules présentent de faibles
affinités par rapport à l’inhibition des complexes CaM-CaMBDs et ne semblent pas
être spécifiques de l’inhibition de l’une ou l’autre des conformations de CaM
Figure 60molécule À : La claen M-1 ; leune forte classificatiReproductReproduct
Grou
G
A
B
Chapitre
0 : Classificatioà inhiber chaq
assification des es distances ontIC50 (µM) sonion des molécution de l’arbre dtion de l’arbre d
Group
Gr
upe A3
Groupe A1
Groupe A2
2:Recherà
on des CaMBDque complexe C
molécules et dt été calculées e
nt marquées en ules révèle 3 grode classificatiode classification
pe P3
roupe P1
chedemaràtraversla
Ds et des moléCaM – CaMBDdes CaMBDs a en fonction de bleu, les molé
oupes distincts n des CaMBDsn des molécules
Gr
rqueursdeasignalisati
écules interagD. été réalisée avela corrélation d
écules déplaçande molécules (As avec le nombs interagissant a
roupe P2
l’étatphysioncalciqu
issant avec Ca
ec le logiciel dCdes valeurs. Lent fortement lesA1, A2, A3) etre du Ca²+ néce
avec CaM selon
C
siologiquede
aM selon la ca
Chip, à partir ds molécules déps CaMBDs son3 groupes de C
essaires à la lian leurs familles
desgCSCs
apacité (IC50)
des valeurs IC50
plaçant les CaMnt marquées enCaMBDs (P1, Paison CaM – Cachimiques (de
141
de chaque
0 exprimées MBDs avec n rouge. La P2, P3). B : aMBD. C : 1 à 9).
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
142
On note cependant quelques disparités au sein de ces familles chimiques :
- La molécule LPS 01-12-L-G09 se comporte différemment du reste de la famille III
(biphényls) ; ceci s’explique par une structure différente de la plateforme chimique par
rapport aux autres molécules de cette famille.
- TFP et Chlorpromazine sont respectivement très similaires à Fluphenazine et PCL
09F04 : la Fluphenazine comprend une chaine chloroethylamine supplémentaire par
rapport au TFP et la chlorpromazine comprend un atome de chlore en plus par rapport
à PCL 09F04. Dans les deux cas, ces changements mineurs de structure ont un impact
assez important sur l’affinité de ces molécules pour CaM : la Fluphenazine et PCL
09F04 ont des valeurs de Ki beaucoup plus élevées que leurs « homologues »
respectifs ainsi que des valeurs EC50 de toxicité très différentes (Annexe II) ; ceci
suggère des interactions différentes des molécules avec CaM et il n’est donc pas
surprenant de voir de grandes différences de CaMBDs inhibés par chacune des
molécules de ces deux couples. Cette observation rejoint l’utilisation des couples de
molécules W5/W7 et W12/W13 retrouvée dans la littérature : les molécules W5 et
W12 ont une affinté pour CaM beaucoup plus faible que leurs dérivés chlorés
respectifs, W7 et W13.
Les CaMBDs représentant les domaines IQ des canaux CaV1.1 et CaV1.2 ne diffèrent que par
4 acides aminés mais leurs déplacements par les molécules utilisées donnent 2 profils très
différents : la liaison à CaM de CaV1.1 IQ est inhibée par les antagonistes du groupe A1 et
celle de CaV2.1 IQ par les antagonistes du groupe A2. Ceci témoigne de la spécificité des
molécules dans leur capacité à inhiber certaines interactions de CaM. Ainsi, nos molécules
interagissant avec CaM sont capables d’inhiber différentiellement 2 peptides de séquences
très proches ou 2 protéines appartenant à la même famille.
Cette classification permet de mettre en évidence que certaines molécules interagissant avec
CaM chassent de façon différentielle les différents CaMBDs présentés ici. Ces différences
proviennent non seulement de l’affinité de CaM pour chaque molécule (Ki) et chaque
CaMBD (EC50) mais aussi des zones d’interaction de CaM avec ces molécules : toutes les
molécules ne se lient pas au même endroit, ou du moins ne lient pas les mêmes résidus, de
CaM. C
spécifiq
CaM lié
Figure 61CaM adopavec différantagonistdistinguer antagonistpas sélecticomme les
Chapitre
Ceci nous pe
ques de CaM
ée à 1, 2 ou
: Déplacemenpte différentes rents peptides otes pour lesquel
les antagonisttes A2 permettaifs et les peptids peptides P3. S
2:Recherà
ermet d’avo
M, selon qu
3 Ca²+, et s
nt des CaMBDsconformations
ou protéines. Lels le site d’intertes A1 permetant de chasser ldes A3b se lientSur ce schéma,
chedemaràtraversla
oir un pane
ue celle-ci
ur des dom
s liés à CaM seselon le nombr
e déplacement draction avec Cattant de chassees peptides 2b t très difficilemseules les condi
rqueursdeasignalisati
el de molécu
soit liée à
maines différ
elon l’antagonibre de Ca²+ liésdes peptides liéaM est accessiber les peptideset 3 (référencés
ment à tous les ditions réalisées
l’étatphysioncalciqu
ules interag
des CaMBD
rents (Figure
iste utilisé et las ; chacune de cs à CaM par dif
ble, dépendamms 1 et 2a (réfés comme les pecomplexes CaMont été représe
siologiquede
gissant avec
Ds ou proté
e 61).
a conformationces conformatiofférents antagon
ment du peptideérencés commeeptides P1). LesM-CaMBD ; centées (notamme
desgCSCs
c des confor
téines recon
n de CaM. ons lui permet nistes est favore lié à CaM. One les peptides s antagonistes Aes peptides sont
ment vis-à-vis de
143
rmations
nnaissant
d’interagir isé pour les n peut ainsi P2) et les
A3a ne sont t référencés e [Ca²+]).
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
144
V. Perturbation de la signalisation calcique de cellules selon l’état
physiologiquedelacellule
1. Mesuredelaconcentrationcalciqueintracellulaire
1.1. Calculdelaconcentrationcytoplasmiqueencalcium
La mesure de la concentration en calcium cytoplasmique s’effectue avec la sonde Indo1. La
transformation de ce ratio en [Ca²+] s’effectue après calibration du signal obtenu dans chaque
type cellulaire. Brièvement, des solutions tamponnées de [Ca²+] connues sont ajoutées sur les
cellules, les cellules sont lysées par la digitonine, le signal obtenu pour chaque solution
tampon est comparé à la courbe théorique Stheo = f([Ca²+]) :
1
Où Smin et Smax représentent respectivement les signaux minimal et maximal obtenus avec des
solutions de 25 mM EGTA et 10 mM CaCl2, représente le ratio obtenu à 475 nm (sonde
libre de calcium) en conditions libre et saturée de calcium, Kd représente la constante de
dissociation de l’Indo1 pour Ca²+ (250 nM en théorie).
L’ajustement de la courbe théorique sur les points expérimentaux permet d’ajuster la valeur
théorique du Kd.
Une fois la calibration effectuée, la transformation des données expérimentales sous forme de
ratio S en [Ca²+] s’effectue selon l’équation suivante :
1.2. Influencedelasondecalciquesurlesignalcalciumdelacellule
L’un des points importants pour le suivi d’une cinétique mettant en œuvre une sonde pour
mesurer un signal est de s’assurer d’une part que cette sonde ne dénature pas le signal de la
cellule et d’autre part que ce signal est bien retransmis à travers cette sonde. Nous avons donc
modélisé, de façon très simplifiée, une cellule au niveau de la signalisation calcique
cytoplasmique en utilisant les logiciels Cell Designer et Copasi (Figure 62).
Figure 62À : Schémflèches bledes canauxflux de Camodélisatiencadrée concentrateffectuée pune unique
Nous av
différen
A
C
Chapitre
: Influence dema des flux de eues représentex de fuite, les fa²+ entre le cytion des différeen orange. C tion intracellulapour 2 types dee oscillation, ou
vons d’autre
ntes expérie
2:Recherà
e la sonde calciCa²+ simplifié
ent une entrée dflèches orange oplasme et la snts flux ; l’équ: Comparaisonaire en Indo1 de signaux calciqu augmentation
e part déterm
ences réalis
chedemaràtraversla
ique sur le signés dans la cellude Ca²+ dans le
représentent unsonde cytoplasmuation de modén de [Ca²+] cye 0 à 1 µM et aques : la 1ère ligtransitoire de C
miné la con
ées en com
rqueursdeasignalisati
nal calcium et cule entre le cytcytoplasme viane sortie de Camique Indo1 esélisation de l’éytoplasmique «avec KdIndo1/Ca
gne du tableau Ca²+.
ncentration d
mparant les
B
l’étatphysioncalciqu
comparaison atoplasme, le réa des canaux inda²+ du cytoplasmst représentée eéquilibre entre « réelle » et de= 250 nM, Konreprésente un t
d’Indo1 cha
valeurs de
siologiquede
avec le signal trticulum et le mductibles, les flme via des pomen violet. B : El’Indo1 libre es ratios [Indo1nIndo1/Ca = 1 µMtrain d’oscillatio
argée dans n
fluorescen
desgCSCs
ransmis. milieu extracelllèches bleues compes. La modélEquations utiliset l’Indo1 liée 1-Ca²+]/[Indo1]
M. Cette comparons, la 2e ligne
nos cellules
nce brutes o
145
lulaire. Les ourbées via lisation des ées pour la à Ca²+ est
] pour une raison a été e représente
lors des
obtenues
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
146
d’une part sur nos cellules et d’autre part avec la sonde Indo1 sans cellules, de concentration
connue. La quantité de sonde ainsi chargée dans nos cellules oscille entre 0,02 et 0,05 µM, ce
qui est bien inférieur aux quantités utilisées dans la simulation de l’effet de l’Indo1 sur le
signal calcium.
D’après les simulations effectuées avec Virtual Cell, la concentration en Indo1 présente dans
le cytoplasme a très peu d’influence sur les signaux « calciques réels » et transmis par
l’Indo1. Considérant un signal oscillatoire de Ca²+, l’introduction d’Indo1 dans le cytoplasme
modifie très légèrement l’amplitude et la fréquence des oscillations : l’amplitude est diminuée
et la fréquence est plus importante ; cet effet est proportionnel à la concentration totale
d’Indo1. Cependant, cet effet est très faible, même pour une concentration d’Indo1 de 1 µM ;
le signal S enregistré est d’autre part très fidèle au signal cytoplasmique. Dans le cas d’une
augmentation transitoire de [Ca²+] de période assez importante (ici environ 150 sec), la
quantité d’Indo1 présente dans le cytoplasme n’a aucun effet.
On peut donc considérer que
- l’Indo1 n’a aucun effet sur des signaux de période assez importante
- l’effet est très faible sur des oscillations de fréquence moyenne
- le signal fluorescent transmis par l’Indo est représentatif du signal calcique
intracellulaire
2. Caractérisation des effets des molécules sur l’homéostasie calcique de
différentstypescellulaires
Après avoir identifié, caractérisé, étudié la capacité à déplacer spécifiquement certaines cibles
de CaM, nous nous sommes attachés à caractériser la capacité des petites molécules
interagissant avec CaM à modifier l’homéostasie calcique de différents types cellulaires.
L’homéostasie calcique est modifiée dans les cellules tumorales (Figure 63A); nous
cherchons ici à identifier des molécules qui nous permettraient de mettre en évidence cette
modification dans des cellules propagatrices de glioblastome. Ces molécules seraient de bons
candidats dans le cadre d’une recherche de marqueurs de l’état physiologique de ces cellules,
en partie défini par la signalisation et l’homéostasie calciques.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
147
Les molécules chimiques utilisées sont étrangères à la cellule et ne peuvent par conséquent
être définies comme des biomarqeurs mais comme révélateurs d’un biomarqueur : l’ajout des
molécules sur une cellule induit une réponse cellulaire, marqueur de l’état physiologique de
cette cellule. Cependant, par abus de langage et pour des raisons de clarté du discours, nous
utiliserons dans ce chapitre le terme biomarqueur pour définir des molécules d’intérêt.
2.1. Modificationdel’homéostasiecalciquepardesmoléculesinteragissantavec
CaMselonletypecellulaire
Les différentes molécules interagissant avec CaM et ayant une valeur de Ki inférieure à
20 µM ont été testées sur des cellules primaires propagatrices de glioblastomes (TG01, TG10,
TG16, OB1), une lignée issue de glioblastome (U-87MG) et une lignée de type épithélial
(HEK). Des modifications de l’homéostasie calcique sont observées juste après l’ajout des
composés et peuvent être réparties en 4 catégories (Figure 63B) :
‐ Réponse nulle, type 0 : pas de modification de l’homéostasie calcique
‐ Réponse permanente, type 1 : on observe une augmentation continue de [Ca²+] jusqu’au
bout de la cinétique (12 min) qui peut éventuellement se stabiliser à une valeur plateau.
‐ Réponse transitoire, type 2 : on observe un pic d’augmentation de [Ca²+] avant un retour à
l’équilibre de repos
‐ Réponse mixte, type 3 : la réponse transitoire est suivie d’une réponse permanente se
traduisant soit par une 2e vague d’augmentation de [Ca²+] soit par une stabilisation du
signal à une valeur supérieure à celle de l’équilibre de repos
Figure 63CaM sur À : Mesurcomposés de la cinétcomposés modificatiles celluledes molécu
Les résu
sont de
d’équili
pour la
concent
entre alo
Les rép
calcisom
interagi
de répo
de ces d
A
B
Chapitre
3 : Types de mles cellules. re du calcium cn’induisant pas
tique enregistréinduisant une
ion de l’homéos. Les groupes ules.
ultats prése
e type 1 ou
ibre de la ce
quasi-totali
tration élevé
ors en apop
ponses indu
mes exprim
ssant avec C
nses induite
différences.
2:Recherà
modification de
cytoplasmique ds de modificatiée, les composéréponse de typ
stasie calcique A1, A2, A3 on
entés dans l
u 3; les ré
ellule, sont b
ité des com
ée permanen
ptose, notam
uites dans
més dans ch
CaM sur l’a
es dans les
chedemaràtraversla
e l’homéostasi
dans différenteson de [Ca²+], leés induisant unepe transitoire observés sur 6
nt été définis au
la Figure 6
ponses tran
beaucoup p
mposés testé
nte en calci
mment via le
les différen
hacun de c
activité de c
6 types cel
rqueursdeasignalisati
ie calcique obs
s cellules au repes composés ine augmentationimmédiatemen
6 types cellulairu point IV-2 sel
63C montren
nsitoires sim
plus rares. C
és en viabili
ium dans le
e relargage d
nts types c
ces types c
certains de c
llulaires per
CComposés
LPS 02‐10‐
LPS 02‐10‐
LPS 02‐10‐
LPS 02‐10‐
LPS 02‐10‐
LPS 02‐20‐
LPS 02‐20‐
LPS 02‐20‐
LPS 01‐15‐
LPS 01‐18‐
LPS 02‐03‐
LPS 02‐20‐
LPS 02‐20‐
LPS 02‐18‐
LPS 05‐01‐
PCL 09E06
PCL 09F04
PCL 09G07
PCL 10G10
PCL 10H04
PCL 11A08
LPS 01‐18‐
LPS 01‐18‐
LPS 01‐09‐
PCL 09G06
PCL 09G09
LPS 01‐12‐
LPS 02‐23‐
PCL 11A11
l’étatphysioncalciqu
servés après l’
pos. B : Après duisant une aug
n transitoire dent suivie d’une res selon le comlon les CaMBD
nt que la p
mples, ave
Ceci pourrait
ité cellulaire
cytoplasme
du cytochro
cellulaires d
cellulaires
ces calcisom
rmet déjà d
s Groupe
‐L‐A02 A1
‐L‐A07 A1
‐L‐C08 A1
‐L‐C09 A1
‐L‐D02 A1
‐L‐B03 A1
‐L‐B05 A1
‐L‐C04 A1
‐L‐H06 A2
‐L‐B10 A2
‐L‐D03 A2
‐L‐A02 A2
‐L‐C02 A2
‐L‐A02 A2
‐L‐D06 A1
‐ 685 A3
4 ‐ 693 A2
7 ‐ 706 A2
0 ‐ 789 A2
4 ‐ 793 A2
8 ‐ 807 A3
‐L‐E03 A1
‐L‐E04 A1
‐L‐F11 A2
6 ‐ 705 A1
9 ‐ 708 A1
‐L‐E04 A2
‐L‐G10 A3
1 ‐ 810 A3
siologiquede
’ajout de com
addition sur lesgmentation conCa²+ suivie un réponse de typ
mposé interagisDs préférentielle
plupart des
c retour de
t expliquer
e (point II-3
e est toxique
ome C de la
dépendent
et de l’act
mes. La com
e mettre en
e TG01 TG10
3 3
1 1
3 3
3 3
3 3
0
3 3
3 3
1 1
1 1
3 3
1 1
3 3
1 1
1 1
2 2
2 2
2 1
1 1
1 1
1 1
1 1
1 1
3 3
1
1
1 1
1 1
1 1
desgCSCs
mposés interagi
s cellules, on dntinue de Ca²+ tn retour à l’équipe continue. Cssant avec CaMement inhibés p
réponses ob
e [Ca²+] au
la toxicité o
3.2 page 13
e pour la ce
a mitochond
de l’ensem
tion des m
mparaison d
n évidence c
TG16 OB1 U8
3 3 3
1 1 1
3 3 3
3 3 3
3 3 3
0
3 3 3
3 3 3
1 1 3
3 1 3
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1 1 1
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1 1 1
1 1 1
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1 1 1
3 1 3
3 3 3
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1
1 1 3
1 1 1
1 1
148
issant avec
istingue les out au long ilibre et les : Types de
M ajouté sur par chacune
bservées
u niveau
observée
32) : une
ellule qui
drie.
mble des
molécules
des types
certaines
87 HEK
3 3
1 1
3 3
3 3
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3 3
3 1
3 1
3 3
1 1
3 3
1 1
1 1
2 2
2 2
3 3
3 1
3 1
3 3
1 1
3 1
3 3
1 1
1 1
3 1
1 1
1 1
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
149
Parmi l’ensemble des composés testés, environ 60 % (19/30) induisent le même type de
modification de l’homéostasie dans les différents types cellulaires testés. La comparaison de
ces molécules avec leur classification établie d’après leur capacité à inhiber la liaison de CaM
à différents CaMBDs met en évidence que la totalité (13/13) des molécules inhibant les
complexes CaMBD-CaM formés à forte [Ca²+] (peptides P1, antagonistes A1) induisent la
même réponse quelque soit le type cellulaire alors que ceci n’est observé que pour le tiers
(6/16) des composés inhibant les complexes formés à plus faible [Ca²+] (peptides P2,
antagonistes A2) (Figure 64). On peut donc mettre en évidence 2 catégories d’antagonistes :
‐ Les antagonistes ne permettant pas de différencier les types cellulaires, i.e. touchant des
calcisomes / voies de signalisation calciques communs aux différentes cellules. Ceci met
également en évidence l’importance de CaM dans la cellule et la conservation de certains
mécanismes ; ces molécules peuvent être utilisées en tant que marqueurs de calcisomes
communs. Il s’agit principalement des molécules des familles chimiques I (Ethylène
diamine N,N disubstitués) et V (Monocations et dérivés nipecotates)
‐ Les antagonistes permettant de mettre en évidence des spécificités selon les cellules, i.e.
touchant des calcisomes / voies de signalisation calciques différentes dans les différents
types cellulaires. Il s’agit principalement des familles chimiques II (Amino alkyl
pyridazines et triazines) et III (Biphenyls). Ces antagonistes sont également la preuve de
la faisabilité de notre étude : l’identification de marqueurs des gCSCs basés sur
l’utilisation d’antagonistes de CaM est possible.
Figure 64CaMBDs L’utilisatioCa2CaM, Ccalcique sugroupe A2d’autres (e
La com
antagon
d’une ou
Tableau 7
Chapitre
4 : Comparaisociblés. on d’antagonistCa3CaM et Ca1
ur les différent2 induisent égaenviron 60 %) i
mparaison d
nistes A2 pe
u plusieurs
7 : Molécules in
2:Recherà
on des modific
tes des groupe1CaM, Ca2CaMts types cellulaalement une mnduisent une m
des modifica
ermet de me
cellules (Ta
nduisant une m
chedemaràtraversla
cations de l’hom
s A1 et A2 peM. Les antagoni
ires testés (TGême modificati
modification de l
ations de l’
ettre en évid
ableau 7):
modification de
rqueursdeasignalisati
méostasie calc
ermet d’inhiberstes du groupe
G01, TG10, TGion de l’homéol’homéostasie c
’homéostas
dence des m
e l’homéostasie
l’étatphysioncalciqu
cique induites p
r préférentiellemA1 induisent u
16, OB1, U-87ostasie calciquecalcique différe
ie calcique
molécules in
e spécifique d’
siologiquede
par des antago
ment des CaMune même mod MG et HEK) e dans les diffénte selon le typ
observées
duisant une
un type cellula
desgCSCs
onistes de CaM
MBDs liant respdification de l’h
; certains antagférentes cellulepe cellulaire con
suite à l’a
e réponse sp
aire donné
150
M selon les
pectivement homéostasie gonistes du s alors que nsidéré.
ajout des
pécifique
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
151
Cependant, mis à part la molécule PCL 09G07 qui induit une réponse cellulaire différente
dans les cellules U-87 MG et HEK par rapport aux cellules TG01 et TG16 d’une part et TG10
et OB1 d’autre part, la seule observation des types de modification calciques induites par les
antagonistes de CaM ne suffit pas à mettre en évidence l’état physiologique particulier des
cellules propagatrices de glioblastome.
2.2. Classificationendifférentsgroupesd’EC50
Une valeur d’EC50 est déterminée pour chaque molécule et pour chaque type de réponse
induite à partir des courbes dose-réponses : une valeur est déterminée pour le signal transitoire
(on considère le maximum de [Ca²+] obtenue) et une valeur pour le signal permanent (on
considère la valeur du plateau ou la valeur maximale de [Ca²+] obtenue) ; on obtient ainsi une
valeur pour les réponses de type 1 et 2 et deux valeurs pour les réponses de type 3. Les
valeurs EC50 sont déterminées à partir de l’équation suivante :
1
11
Où [Ca²+]0 représente la valeur de [Ca²+] avant l’ajout des composés, [Ca²+]1 la valeur
maximale de [Ca²+] obtenue, n le nombre de Hill. L’ensemble des valeurs EC50 obtenues pour
les réponses transitoires et permanentes est présenté en Annexe V.
Ces valeurs sont ensuite comparées aux valeurs de Ki obtenues pour chaque molécule sur la
CaM purifiée.
2.2.1. Spécificitéd’interactiondesmoléculesavecCaMdanslacellule?
Pour chaque famille chimique de molécules, la comparaison EC50 / Ki permet de caractériser
la spécificité d’interaction des molécules avec CaM dans la cellule : dans une même famille
chimique et pour des molécules ayant des propriétés physico-chimiques similaires, une
corrélation entre l’ensemble des valeurs d’EC50 et de Ki montre que soit ces molécules
interagissent spécifiquement avec CaM dans la cellule soit que les interactions non
spécifiques se font exactement avec les mêmes cibles cellulaires. Dans le cas contraire, si une
molécule ne présente pas la même relation de proportionnalité entre ses valeurs d’EC50 et de
Ki, soit
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Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
154
dans les réponses induites à la fois par l’ensemble des molécules mais aussi sur les différentes
cellules ; cependant la corrélation des valeurs d’EC50 des réponses permanentes et des valeurs
de Ki montre globalement la spécificité de l’interaction de ces molécules avec CaM dans la
cellule.
Les molécules LPS 02-20-L-B05 et LPS 02-20-L-C04 ont un comportement différent dans
les cellules TG01, TG10, TG16 et OB1 : la réponse transitoire est différemment modulée
dans les cellules propagatrices de glioblastome et reflète un panel différent de protéine(s) dont
la liaison avec CaM a été inhibée. Une autre explication pourrait être la présence d’une
protéine, interagissant avec ces molécules et agissant sur l’entrée et la sortie de calcium,
présente uniquement dans ces cellules. Ces 2 molécules sont donc de bons candidats en tant
que marqueurs de l’état physiologique des gCSCs. De la même façon les molécules LPS 02-
10-L-A07, LPS 02-10-L-C09, LPS 01-18-L-B10 et LPS 02-20-L-C02 ont un comportement
différent respectivement dans les cellules TG10 et HEK, U-87 MG, TG10 et TG10, et sous-
entendent donc des différences de calciprotéines ou calcicomes entre les différentes cellules.
La comparaison des activités cellulaires d’un ensemble d’antagonistes de CaM de même
famille chimique avec leurs activités respectives sur la protéine isolée permet donc de mettre
en évidence que :
‐ La majorité des antagonistes sélectionnés interagit avec les mêmes cibles cellulaires
‐ Des composés n’interagissent pas de façon spécifique avec CaM ou n’inhibent pas la
liaison de CaM avec les mêmes calciprotéines que les autres antagonistes mais ont un
même comportement dans différents types cellulaires
‐ Des composés ne se comportent pas de la même façon que les autres composés de la
même famille chimique dans certains types cellulaires seulement. Ces composés
permettent de mettre en évidence une expression différentielle de composants de la
signalisation calcique et peuvent être utilisés en tant que marqueurs d’un ou plusieurs
types cellulaires
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
155
2.2.2. Différencesdecomportementdesmoléculesselonlestypescellulaires
La comparaison des effets induits par des molécules d’une même famille chimique n’est
possible qu’avec les familles comptant un nombre minimal de composants. Afin de pouvoir
exploiter les résultats de l’ensemble des molécules, nous avons comparé les valeurs EC50
obtenues pour chaque type cellulaire d’une part pour les réponses transitoires et d’autre part
pour les réponses continues, aux valeurs Ki.
Dans chaque cas, 3 principaux groupes de molécules ont pu être identifiés (Annexe VI):
‐ Groupe 1 : basé sur le rapport EC50 / Ki obtenu pour la majorité des molécules de la
famille I
‐ Groupe 2 : basé sur le rapport EC50 / Ki obtenu pour la majorité des molécules de la
famille II. Ce groupe a des valeurs relatives d’EC50 plus faibles que le groupe 1
‐ Groupe 3 : molécules dont les valeurs EC50 sont plus élevées que celles du groupe 1
La comparaison de la répartition des molécules montre que, pour la plupart d’entre elles, il
n’y a pas de changement de groupe entre les réponses transitoire et permanente (Tableau 8) :
les molécules se comportant de façon similaire aux molécules de la famille I, de la famille II
ou autrement pour la réponse transitoire, se comportent respectivement comme les molécules
de la famille I, de la famille II ou autrement pour la réponse permanente. On observe toutefois
une différence globale pour les molécules PCL 09G07 et PCL 11A08.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
156
Tableau 8: Répartition des molécules selon les groupes d’EC50 pour les réponses transitoire et permanente dans les différents types cellulaires. Les numéros correspondent aux groupes précédemment définis d’après l’Annexe VI. Les couleurs des composés soulignent les différentes familles chimiques.
On relève également des molécules qui changent de groupe entre les réponses transitoire et
permanente pour un nombre plus restreint de types cellulaires (Tableau 9). Le changement de
groupe d’EC50 d’une molécule entre 2 types cellulaires reflète un changement de la cinétique
d’action de la molécule. Ce changement est potentiellement causé par une altération des
niveaux d’expression des protéines dont la liaison à CaM est inhibée ou par la présence de
protéines indépendantes de la régulation de l’homéostasie calcique et liant cette molécule ou
par des protéines différentes interagissant avec CaM. Si ce changement de cinétique d’action
est observé uniquement pour l’un des deux types de réponses, on peut écarter l’idée d’une
protéine « parasite » interagissant avec la molécule.
TG01 TG10 TG16 OB1 U87 HEK TG01 TG10 TG16 OB1 U87 HEK
LPS02‐10‐L‐A02 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
LPS02‐10‐L‐A07 1 3 1 1 1 3
LPS02‐10‐L‐C08 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
LPS02‐10‐L‐C09 1 1 1 1 1 1 1 1
LPS02‐10‐L‐D02 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
LPS02‐20‐L‐B03LPS02‐20‐L‐B05 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1
LPS02‐20‐L‐C04 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1
LPS01‐15‐L‐H06 2 2 2 2 2 2 2
LPS01‐18‐L‐B10 1 2 2 1 2 2 2
LPS02‐03‐L‐D03 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2
LPS02‐20‐L‐A02 2 2 2 2 2 2
LPS02‐20‐L‐C02 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
LPS02‐10‐L‐F11 2 2
LPS02‐17‐L‐H11LPS02‐18‐L‐A02 1 1 1 1
LPS05‐01‐L‐D06 3 3 3 3 3 3
PCL10F08‐777PCL09E06‐685 1 1 1 1 1 3 3
PCL09F04‐693 2 2 2 2 2 2
PCL09G07‐706 2 2 2 2 1 1 1 2
PCL10G10‐789 2 1 1 1 1 1 1
PCL10H04‐793 1 1 1 1 1 1
PCL11A08‐807 3 3 3 1 1 1 1 1 1
LPS01‐12‐L‐G09LPS01‐18‐L‐E03 3 3 3 3 3 3
LPS01‐18‐L‐E04 1 2 2 2 2 2 2
LPS02‐23‐L‐D05LPS01‐09‐L‐F11 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 2
PCL09G06‐705 1
PCL09G09‐708 1
LPS01‐12‐L‐E04 1 2 1 1 2 1 1
LPS02‐23‐L‐G10 2 2 2 2 2 2
PCL11A11‐810 2 2 2 2 2
PCL11H09‐878
Réponses PermanentesComposés
Réponses Transitoires
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
157
LPS 02‐20‐L‐B05 TG01, TG10, TG16, OB1 LPS 01‐09‐L‐F11 TG10, TG16, U‐87 MG, HEK LPS 02‐10‐L‐A07 TG01, HEK LPS 02‐20‐L‐C04 TG01, TG10 LPS 01‐18‐L‐B10 TG10, TG16 LPS 02‐03‐L‐D03 TG01, TG16 LPS 01‐12‐L‐E04 TG01, OB1 PCL 10G10 U‐87 MG PCL 09E06 HEK
Tableau 9 : Molécules ayant un comportement différent dans un nombre restreint de types cellulaires Ces molécules appartiennent à un groupe d’EC50 pour la réponse transitoire et à un autre groupe pour la réponse permanente pour quelques types cellulaires.
Toutes ces molécules pourraient être utilisées comme marqueurs de l’état physiologique de
cellules spécifiques. Parmi elles, la molécule LPS 02-20-L-B05 semble, sur le panel de
cellules testées ici, spécifique des cellules propagatrices de glioblastome, TG01, TG10, TG16
et OB1.
La plupart des molécules appartenant au groupe 1 d’EC50 fait partie des molécules inhibant la
liaison de CaM aux peptides P2 définis au point IV-2 ; de la même façon, les molécules
inhibant la liaison de CaM aux peptides P1 font majoritairement partie du groupe 2 d’EC50.
Ceci témoigne de la spécificité d’interaction des molécules avec CaM dans la cellule : la
répartition des molécules chimiques dans les 2 premiers groupes d’EC50 correspond
globalement à l’inhibition de la régulation CaM dépendante de structures reconnaissant une
conformation particulière de CaM. Les molécules du groupe 3 semblent être moins actives
que les autres molécules. On peut émettre plusieurs hypothèses : soit une protéine dont la
liaison avec CaM est inhibée par ces molécules est présente en quantité plus importante dans
la cellule, soit la conformation globale des protéines permet de maintenir la liaison du
CaMBD avec CaM malgré la présence de l’inhibiteur, soit la molécule interagit avec d’autres
protéines intracellulaires.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
158
VI. Conclusion
Le pronostic des patients atteints de glioblastome est très sombre du fait de la présence de
cellules propagatrices de la tumeur peu sensibles aux thérapies actuelles. Il est donc
primordial d’étudier ces cellules attentivement afin de mettre au point de nouvelles thérapies
capables de les éliminer. La stratégie abordée dans ce chapitre consiste à identifier des
marqueurs de la signalisation calcique de ces cellules permettant de modifier de façon
différentielle l’homéostasie calcique des gCSCs. Comme nous l’avons abordé en introduction
de ce chapitre, nous n’appliquons pas le terme marqueur à un élément intracellulaire mais à la
molécule chimique permettant de mettre en évidence cet élément.
En effet, la signalisation calcique est modifiée dans les cellules cancéreuses et en particulier
dans nos cellules (Figure 63). Sachant que la Calmoduline est l’une des protéines les plus
importantes de la signalisation calcique, nous avons dans un premier temps cherché à
identifier et caractériser des molécules chimiques interagissant avec CaM afin d’avoir à notre
disposition une panoplie de molécules nous permettant d’explorer différentes régions de CaM
dans sa liaison avec ses cibles. Dans cette approche, il nous a semblé important d’identifier
des sets de molécules regroupées en familles chimiques afin de pouvoir faire une
pharmacologie fine de CaM. Cette stratégie a été appliquée dès le début des années 80 avec
l’utilisation de couples de molécules, W5 / W7 et W12 / W13, utilisés pour différencier les
effets de ces composés dépendants de CaM des effets indépendants (Hidaka et al., 1981).
Nous avons mis en évidence que ces molécules peuvent inhiber de façon différentielle la
liaison de CaM à ses cibles. Cette inhibition est par ailleurs très sensible aux différents types
d’interactions que CaM peut avoir avec ses cibles. Ceci nous a également permis de
démontrer que CaM interagit dans la cellule de façon [Ca²+] dépendante ; par conséquent une
modification de la signalisation calcique résultant en un mauvais encodage d’un stimulus
engendrerait différentes conformations de CaM et l’activation d’un panel tout à fait différent
de ses cibles.
Enfin, nous avons montré que ces molécules induisent in cell différentes modifications de
l’homéostasie calcique. Ces modifications dépendent pour la plus grande partie de l’inhibition
différentielle de la liaison de CaM à certaines de ces cibles. De plus, les signaux calciques
générés (ou les valeurs EC50) par certaines de ces molécules sont différents : ces molécules
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
159
mettent en évidence des interactions CaM – calcisomes différentes dans les différents types
cellulaires. Ce sont donc de bons candidats comme marqueurs (ou révélateurs de marqueurs)
d’un état physiologique donné. Nous avons notamment pu identifier les molécules suivantes :
‐ PCL 09G07 induit une réponse transitoire ou permanente dans les cellules propagatrices
de glioblastomes et une réponse mixte dans les cellules HEK et U-87 MG ; les 3 groupes
de cellules ainsi mis en évidence correspondraient à 3 sous-ensembles de calcisomes.
‐ LPS 02-20-L-B05 a une valeur d’EC50 de réponse transitoire plus élevée dans les cellules
propagatrices de glioblastome par rapport aux autres molécules de la même famille
chimique et par rapport aux cellules HEK et U-87 MG ; cette molécule met en évidence
une modification des calcisomes. De plus, l’absence de différence intercellulaire notable
induite par les autres composés de la famille des éthylene diamine N,N disubstitués met
en évidence la nécessité de réguler très finement l’interaction de CaM avec ses cibles pour
identifier des molécules ayant une action spécifique dans les gCSCs et pour
éventuellement pouvoir utiliser ces molécules comme sensibilisateurs des gCSCs aux
traitements anticancéreux.
Comme nous l’avons vu en première partie de ce chapitre, le système calcique est
omniprésent dans la cellule et les interactions des différents composants entre eux sont
complexes. À ceci s’ajoute la variabilité spatio-temporelle de l’expression des éléments du
calcium toolkit et leur assemblage en diverses combinaisons de calcisomes. La prise en
compte de l’ensemble de ces paramètres n’est donc possible que dans un modèle cellulaire,
modèle dans lequel de nombreuses inconnues participent à la réponse générée suite à
l’application d’un stimulus. Note travail en plusieurs étapes, à partir d’études visant à
caractériser i) l’interaction de CaM avec ses inhibiteurs selon leur famille chimique, ii)
l’interaction de CaM avec quelques unes de ses cibles, iii) l’effet des inhibiteurs de CaM sur
des complexes CaM – cible et enfin iv) l’effet des inhibiteurs sur un système cellulaire total,
nous a permis de nous assurer de la spécificité d’interaction des familles de molécules
chimiques identifiées comme inhibiteurs de CaM (à l’exception de quelques molécules),
d’obtenir une panoplie de molécules bloquant différentes conformations de CaM et inhibant
de façon différentielle la modulation de l’activité de certaines cibles de CaM dans le but de
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
160
caractériser l’écosystème calcique d’une cellule donnée. Malgré ces efforts, nous n’avons pu
échapper à quelques approximations dans notre travail.
En effet, lorsque nous rapportons la caractérisation de l’interaction de CaM avec les
molécules identifiées lors du criblage ou avec des CaMBDs, nous n’avons pris en compte ni
les interactions ioniques que CaM peut faire dans la cellule, et notamment avec Mg²+, ni la
place que peuvent prendre les molécules d’H2O autour des différentes conformations de CaM.
D’autre part, la littérature nous montre que la liaison de CaM à ses cibles peut être résumée à
la liaison de CaM à un peptide d’une vingtaine d’acides aminés, le CaMBD (point I-3.3.2,
page 112) ; nous nous sommes donc basés sur ces CaMBDs pour caractériser la liaison de
CaM avec ses cibles. Cependant, ceci ne prend pas en compte les possibles interactions entre
CaM et d’autres parties des protéines cibles, notamment au niveau de l’accessibilité de CaM
au CaMBD.
Ensuite, l’étude de l’inhibition de la liaison des CaMBDs à CaM par des antagonistes a été
effectuée en solution aqueuse, ne reflétant pas les conditions cellulaires et notamment les
conditions retrouvées à proximité de la membrane plasmique. D’autre part, tous nos composés
n’ont pas la même hydrophobicité et ne diffusent donc pas de la même façon dans la cellule :
certains domaines subcellulaires ne sont atteints que par certaines de ces molécules.
Enfin, l’assemblage des calciprotéines en calcisomes dans la cellule n’a pas été pris en
compte : la modification de l’activité d’une de ces protéines engendre la modification de
l’activité de l’ensemble du calcisome ; on observe alors un effet « additif » de l’action des
antagonistes de CaM.
Malgré ces inconvénients, nous avons pu montrer la possible utilisation de ces molécules en
tant que marqueurs de l’ensemble du système calcique d’une cellule, i.e. de l’état
physiologique d’une cellule donnée, et en particulier de cellules propagatrices de
glioblastomes pour lesquelles la molécule LPS 02-20-L-B05 est un bon candidat.
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
161
L’utilisation d’inhibiteurs de CaM comme traitements anticancéreux est rapportée dans la
littérature (Mayur et al., 2006b; Shim et al., 2007b; Shin et al., 2006). Ces molécules
interagissant avec CaM sont en général peu caractérisées, seule la liaison à CaM est
démontrée ainsi que les propriétés anti-prolifératives, anti-angiogéniques ou anti-MDR (multi
drug resistance). Cependant, comme nous l’avons vu dans ce chapitre et découlant du rôle
central de CaM dans la signalisation calcique, une même molécule interagissant avec CaM
inhibe rarement une seule cible de CaM et les effets rapportés sont souvent communs à
plusieurs types cellulaires. Il est donc primordial, dans un but thérapeutique, d’identifier des
molécules marqueurs de l’état physiologique des cellules ciblées dans chaque étude.
L’EGFR (epidermal growth facor receptor) joue un rôle important dans la cancérisation à
travers sa surexpression ou ses mutations dans les cellules tumorales (Sibilia et al., 2007).
L’activité de l’EGFR passe par une régulation à la fois par des kinases dépendantes de CaM et
par CaM (Dagher et al., 2010; Sanchez-Gonzalez et al., 2010) et l’utilisation d’inhibiteurs de
CaM permet de diminuer l’affinité du récepteur pour son ligand (Bodine and Tupper, 1984) ;
l’utilisation d’antagonistes spécifiques de CaM et ciblant la liaison de CaM à l’EGFR peut
donc être une approche dans la cadre d’une chimiothérapie.
D’autre part, l’utilisation d’antagonistes de CaM en synergie avec des anti-cancéreux permet
de potentialiser la réponse cellulaire dans le cadre d’une chimiothérapie. Il a ainsi été montré
il y a presque 10 ans, que l’utilisation des antagonistes TFP ou W7 permet d’augmenter
l’activité inhibitrice de CaM du Tamoxifène, traditionnellement prescrit dans le traitement du
cancer du sein ; l’utilisation de ces deux molécules en synergie permet d’induire une apoptose
plus rapide et plus efficace par des antagonistes de CaM non cytotoxiques (Frankfurt et al.,
1995).
Cette potentialisation a également été testée dans des cellules de cancer du sein ayant
développé une résistance multiple aux molécules chimiques, phénotype que nous retrouvons
dans les cellules propagatrices de glioblastomes. Il a ainsi été montré que l’utilisation d’un
antagoniste de CaM inhibant à la fois le rôle de CaM dans la progression du cycle cellulaire et
l’activité des P-glycoprotéines, protéines d’afflux responsables du phénotype de résistance
multiple aux agents chimiques, potentialise l’effet anti-tumoral de la Doxorubicine
classiquement utilisée (Liu et al., 2010a).
Chapitre2:Recherchedemarqueursdel’étatphysiologiquedesgCSCsàtraverslasignalisationcalcique
162
L’utilisation d’antagonistes de CaM est donc une voie qui peut être ciblée dans de nouvelles
thérapies ; à ce jour, l’absence de spécificité des inhibiteurs connus de CaM limite son
utilisation à quelques cas. Notre étude peut permettre de sélectionner des composés à utiliser
en synergie avec le Témozolomide, agent chimiothérapeutique de référence dans le traitement
des glioblastomes
.
163
Chapitre3: Recherche de marqueurs membranaires des cellules
propagatricesdeGlioblastome
Chapitre3
Recherchedemarqueursmembranairesdescellules
propagatricesdeGlioblastome
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
164
I. Introduction
1. Les protéines membranaires: interface entre les milieux intra‐ et
extracellulaire
Les protéines de la membrane plasmique sont les premiers senseurs des modifications du
microenvironnement et sont impliquées dans des fonctions biologiques telles que la
signalisation intra- et extracellulaire, le transport d’ions et de molécules spécifiques ou encore
les interactions cellule–cellule et cellule–matrice (Figure 30). Les protéines associées à la
membrane peuvent être liées de façon permanente ou transitoire à la membrane plasmique
(Escriba et al., 2008). Ces protéines sont des initiateurs ou médiateurs de changements
phénotypiques associés à la transformation maligne d’une cellule, incluant la prolifération,
l’adhésion, la migration et faisant de ces protéines des objets centraux dans divers processus
biologiques ainsi que des cibles potentielles de médicaments (Dorsam and Gutkind, 2007;
Gschwind et al., 2004). L’altération des niveaux d’expression de protéines de la membrane
plasmique peut passer par une surexpression de récepteurs contribuant à la croissance
cellulaire et activés par des ligands circulant dans le microenvironnement ou encore par une
sous expression de molécules d’adhésion permettant aux cellules de se détacher de la masse
tumorale et de migrer ; la neutralisation de certaines de ces protéines par l’utilisation
d’anticorps ou d’inhibiteurs chimiques a permis d’augmenter la survie de certains patients
(Swanton et al., 2006) et de bloquer la progression tumorale dans le cas de xénogreffes de
glioblastomes (Fan et al., 2010).
1.1. Protéinesmembranairesetmétastases
L’une des étapes nécessaires à la formation de métastases est le détachement de cellules de la
masse tumorale, leur invasion du tissu matriciel et leur migration à des sites distants où elles
peuvent induire l’angiogenèse et se multiplier pour former des tumeurs secondaires (Encart
6). Le processus métastatique dépend en grande partie des interactions entre les protéines de
la membrane plasmique des cellules tumorales et les protéines du microenvironnement ;
l’altération de l’expression de certaines protéines de la membrane plasmique permet aux
cellules métastatiques de se lier plus fortement à des protéines spécifiques de la matrice
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
165
extracellulaire dont les laminines, collagènes, protéoglycanes (Chambers et al., 2002). Cette
interaction active des cascades de signalisation intracellulaires, régulant l’expression de
gènes, l’organisation du cytosquelette, l’adhésion cellulaire, les mécanismes de survie et la
dégradation de la matrice extracellulaire par des enzymes spécifiques telles que les
métalloprotéinases et le plasminogène de type urokinase. L’ensemble de ces changements
permet à la cellule tumorale d’acquérir des propriétés d’invasivité, de migration et de survivre
dans différents microenvironnements (explicités dans le Chapitre 1).
Encart 6 : Formation de métastases
Les métastases permettent l’expansion de la tumeur à partir d’un site primaire vers des organes
distants. Dans le cas des glioblastomes la formation des métastases reste localisée dans le cerveau :
seuls 8 cas de métastases dans d’autres organes ont été rapportés dans la littérature (Armstrong et al.,
2011). Ce très faible pourcentage de formation de métastases dans d’autres régions de l’organisme
pourrait être expliqué par i) l’incapacité pour les cellules tumorales de survivre dans un
environnement différent de celui du cerveau, ii) des barrières physiques limitant l’expansion de la
tumeur, iii) le décès prématuré des patients des suites de la tumeur cérébrale. Que les métastases
soient présentes dans d’autres organes ou non, le diagnostic de la tumeur avant leur formation ou
l’inhibition de leur formation sont cruciaux dans la réponse au traitement.
La formation de métastases s’effectue en plusieurs étapes. Les cellules tumorales doivent
promouvoir l’angiogenèse pour supporter leurs besoins métaboliques ; la formation de nouveaux
vaisseaux sanguins est également une voie migratoire permettant aux cellules d’entrer dans le
système circulatoire (intravasation). Les cellules tumorales doivent survivre dans la circulation
sanguine ou lymphatique jusqu’à leur établissement dans un organe (extravasation) où elles doivent
être capables d’initier et de maintenir la croissance tumorale pour former des micrométastases
préangiogéniques ; cette croissance peut être supportée par le développement de nouveaux
vaisseaux sanguins pour permettre la formation d’une tumeur macroscopique (Figure 66).
La formation de métastases peut s’effectuer bien après l’éradication de la tumeur primaire comme
cela a été observé dans le cancer du sein ou les mélanomes (Karrison et al., 1999). La dormance est
difficilement observable expérimentalement mais le groupe de Folkman a montré l’existence de
micrométastases pré-angiogéniques où la division cellulaire est compensée par l’apoptose induite par
l’absence de vascularisation ; l’état de dormance apparent cesse lorsque les métastases sont capables
d’induire une angiogenèse (Holmgren et al., 1995). La dormance peut également être due à la
présence de cellules isolées incapables d’entrer dans le cycle cellulaire mais n’ayant pas perdu leur
potentiel tumorigénique lorsqu’elles sont réinjectées dans l’organe tumoral primaire (Naumov et al.,
2002), i.e. suite à une modification du microenvironnement.
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Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
167
1.2. Protéinesmembranairesetsignalisationintracellulaire
La phosphorylation des résidus d’acides aminés tyrosine, sérine et thréonine est une
modification post transcriptionnelle réversible des protéines entrant dans la régulation de
voies de signalisation intracellulaires et le contrôle de processus biologiques. Cette
phosphorylation est strictement régulée par un équilibre entre l’activité des protéines kinases
et phophatases. Le taux de protéines phosphorylées dans la cellule à un instant donné est
faible : la phosphorylation est une modification transitoire des protéines permettant à la
cellule de répondre à des changements de son environnement en activant des voies de
signalisation par phosphorylation / déphosphorylation (Thingholm et al., 2009) ; une
phosphorylation anormale des protéines a été reliée à de nombreuses maladies dont le cancer.
Les tyrosine kinases font partie des oncogènes connus les plus importants. Les récepteurs
tyrosine kinase (RTKs) sont localisés au niveau de la membrane plasmique et lient des
peptides circulants tels que EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth
factor), FGF (fibroblast growth factor), l’insuline et ILGF (insulin-like growth factor). Suite à
a liaison de son ligand respectif, le RTK dimérise et s’autophosphoryle, induisant la
phosphorylation de résidus tyrosines d’autres protéines (Schlessinger, 2000) dans des voies de
signalisation favorisant généralement la croissance cellulaire (Chapitre 1, point I-1.3). Dans le
cadre de traitements administrés aux patientes atteintes d’un cancer du sein, plusieurs
médicaments ciblent des RTKs tels que l’EGFR (Capdevila et al., 2009) ou HER-2 (Scaltriti
et al., 2009).
1.3. Protéinesmembranairesetbiomarqueurs
Les protéines membranaires peuvent être utilisées comme biomarqueurs dans la détection
précoce des tumeurs. Dans certains cancers, des tests sanguins permettent de révéler la
présence d’antigènes circulants associés à la tumeur tels que la PSA (prostate-specific
antigen), le CEA (carcinoembryonic antigen) et CD44 dans les tumeurs du sein, du côlon, de
la tête et du cou (Mayer et al., 2008) ; cependant, ces essais ne permettent pas de détecter des
molécules spécifiques et exclusives de la tumeur associée, ce qui limite leur utilisation et leur
fiabilité. D’autre part, des problèmes techniques limitent l’analyse du protéome complet du
plasma sanguin (Hanash et al., 2008). L’émission de microvésicules par les cellules tumorales
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
168
(Chapitre 1, point II-4.2.2) dans le sang ou l’urine offre une importante opportunité d’accéder
de manière non invasive et non biaisée (hétérogénéité tumorale régionale) à l’information
biologique des cellules dont elles sont issues (Al-Nedawi et al., 2008). Ces microvésicules
sont facilement accessibles pour une caractérisation moléculaire et fonctionnelle et leur
analyse dans le système sanguin de souris ayant subi une xénogreffe de glioblastome humain
a permis de mettre en évidence la présence de l’oncogène EGFRVIII exprimé seulement par
une petite fraction de cellules tumorales (Al-Nedawi et al., 2008; Biernat et al., 2004). Cette
approche est explorée pour la mise en évidence de biomarqueurs associés au cancer de la
prostate (Duijvesz et al., 2011).
Les protéines membranaires peuvent également être utilisées comme marqueurs de
pronostic ou de prédiction du bénéfice d’un traitement. Dans le cas du cancer du sein, la
mesure de l’expression du récepteur à l’oestradiol par immunohistochimie permet de prédire
la réponse aux traitements endocriniens adjuvants associés au Tamoxifène (Knoop et al.,
2001) (30 % des patientes traitées par le Tamoxifène ont une rechute de la tumeur dans les 15
ans). L’identification d’un marqueur de pronostic permettrait dans ce cas de déterminer les
patientes auxquelles administrer un traitement endocrinien et les patientes auxquelles il
faudrait ajouter une chimiothérapie. Dans ce cadre, une équipe a identifié un ensemble de 47
protéines montrant une expression différentielle entre des patientes résistantes au Tamoxifène
ou non, parmi lesquelles quelques protéines membranaires dont un inducteur de
métalloprotéinases de la matrice extracellulaire ; cette protéine a été validée comme étant
surexprimée dans les tumeurs résistant à la thérapie (Umar et al., 2009).
Depuis quelques années, la compréhension des mécanismes moléculaires de la tumorigénicité
des glioblastomes est au cœur des préoccupations à travers des études génomiques et
transcriptomiques. Certains clusters d’expression de gènes et de miRNAs ont ainsi permis de
subdiviser les glioblastomes en plusieurs groupes, reflétant l’agressivité de la tumeur et étant
corrélés à la survie des patients (Kim et al., 2011a; Phillips et al., 2006; Verhaak et al., 2010)
(Chaitre 1, point I-1.4.2). De la même façon, certains groupes se sont intéressés aux propriétés
des gCSCs en essayant de les caractériser au niveau génomique, transcriptomique et
moléculaire (Beier et al., 2007; Gonzalez-Gomez et al., 2011; Patru et al., 2010; Silber et al.,
2009).
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
169
En 2001, le groupe de Sonnhammer a décrit un modèle de prédiction des hélices
transmembranaires des protéines (modèle TMHMM), permettant ainsi de déterminer les
protéines intégrées à la membrane plasmique dans plusieurs génomes. Ce modèle a ainsi
permis de déterminer que 30 % des gènes du génome humain codent pour des protéines
membranaires (Krogh et al., 2001). Aujourd’hui, un travail initié entre la Ligue contre le
cancer et la société Transgene met en évidence que 36 % environ des protéines sont
transmembranaires et capables de s’associer en complexes supramoléculaires. Cependant, ces
protéines, peu solules, ne peuvent être analysées en gels 2D du fait de l’absence
d’isofocalisation (protéines trop basiques), ce qui rend les études de protéines membranaires
plus difficiles.
2. Protéomesdecellulesdeglioblastomes
Plusieurs études protéomiques ont été effectuées sur des cellules de glioblastome pour tenter
de comprendre la physiopathologie de ces tumeurs (Deighton et al., 2010). Une étude du
protéome de gliomes de différents grades a ainsi pu identifier un set de 72 protéines
exprimées différentiellement dont 29 ont été annotées comme ayant un rôle potentiel dans la
pathologie des gliomes (Chumbalkar et al., 2005). Une autre étude a mis en évidence un
ensemble de marqueurs potentiels corrélés avec la survie des patients (Iwadate et al., 2004).
Plus récemment, une analyse a permis l’identification de 2660 protéines représentant le
protéome total de cellules de glioblastome (Melchior et al., 2009).
Cependant, l’étude d’un protéome global, généralement à partir de gels 2D, permet
d’identifier principalement les protéines solubles. La détection de protéines plus hydrophobes
et basiques, telles que les protéines de la membrane plasmique, doit passer par une
décomplexification des échantillons, i.e. par l’isolation de sous-ensembles de protéines.
La caractérisation du protéome membranaire des glioblastomes a débuté avec l’étude de
lignées de glioblastomes (Seyfried et al., 2008) et de modèles de xénogreffes (Rajcevic et al.,
2009). Dans une étude récente, des cellules de glioblastome issues de biopsies ont été utilisées
dans une caractérisation de protéome membranaire, permettant l’identification de 7 nouvelles
protéines (codées par les gènes ANXA2, XRCC6, SCARB2, GOLIM4, CAMKIIA, RAB3A
et SV2A) exprimées de façon différentielle. Cette étude a également mis en évidence 3 voies
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
170
de signalisation principalement affectées par la tumorigénisation : la signalisation de la
réponse inflammatoire rapide, la signalisation des calvéolines et la signalisation calcique
(Polisetty et al., 2012a) ; la modification de cette dernière voie de signalisation a également
été identifiée au niveau transcriptomique (Dong et al., 2010). Parmi les éléments de la
signalisation calcique identifiés comme exprimés de façon anormale, l’étude de Polisetty a
identifié des canaux et pompes calciques de la membrane plasmique ainsi que plusieurs
protéines de liaison au calcium dont des transporteurs et senseurs de calcium, des protéines
régulatrices et effectrices, des éléments de la famille des protéines S100.
3. Protéomesdecellulessouchesdeglioblastome
Jusqu’à présent seules deux équipes ont analysé le protéome complet de cellules gCSCs. La
première équipe a mis en évidence la perturbation de la voie de signalisation IL-
6/STAT3/HIF1 décrite dans plusieurs cancers. STAT3 est un facteur de transcription
associé à la régulation des cellules souches et impliqué dans la progression du cycle cellulaire,
l’apoptose, l’angiogenèse, la surveillance immunitaire, l’invasion et la formation de
métastases (Haura et al., 2005). Cette étude a été effectuée par une approche de
phosphoprotéomique, utilisant une étape d’enrichissement en phosphoprotéines avant
l’analyse par spectrométrie de masse, et a permis de mettre en évidence l’inhibition de la
phosphorylation de STAT3 et la stimulation d’IL-6 en conditions hypoxiques (Nilsson et al.,
2010).
La seconde étude a été réalisée en comparant des cellules gCSCs, des cellules souches
neurales (NSCs) e des cellules de la masse tumorale microdissectées à partir de coupes de
biopsies tumorales. Cette analyse a été effectuée à partir de gels 2D d’extraits protéiques
différentiellement marqués et a permis l’identification de 108 protéines dont 18 sont
surexprimées de façon sélective dans les gCSCs, 22 sont communes aux gCSCs et NSCs et 19
aux gCSCs et cellules de la masse tumorale. L’étude des protéines exprimées spécifiquement
par les gCSCs a permis de mettre, entre autres, en évidence la sécrétion de HDGF (hepatoma
derived growth factor) spécifiquement par ces cellules (Thirant et al., 2012) ; HDGF est un
facteur proangiogénique influençant la migration cellulaire et est associé à une faible survie
des patients (Hsu et al., 2012).
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
171
D’autre part, certaines protéines membranaires ont été publiées comme biomarqueurs des
gCSCs, dont le plus communément utilisé étant le CD133. Cependant, comme décrit dans le
Chapitre 1 de ce manuscrit, ces marqueurs ont soit été invalidés par d’autres études soit ne
sont pas spécifiques des gCSCs car partagés avec les cellules souches neurales ou les cellules
différenciées du tissu sain (Capitre 1, point II-2.5).
Jusqu’à présent, le protéome membranaire des gCSCs n’a pas été caractérisé : l’étude du
protéome global de ces cellules ne permet d’identifier que les protéines les plus exprimées,
rarement présentes au niveau de la membrane plasmique. Nous nous sommes donc attachés à
caractériser le protéome membranaire des gCSCs que nous tâcherons d’analyser dans deux
directions :
- L’identification des protéines membranaires utilisables comme biomarqueurs ou
comme cibles thérapeutiques (Ben-Porath et al., 2008a; Murat et al., 2008) ; une
grande proportion de marqueurs membranaires étudiés dans la littérature étant des
protéines du « cluster de différenciation » (CDxxx), nous avons concentré notre
recherche de biomarqueurs sur ces ensembles de protéines
- Comme de nombreuses cascades de signalisation, le signal calcium est déclenché via
un ligand extracellulaire qui, en se liant à un récepteur membranaire, module l’entrée
du calcium ; il nous a par conséquent semblé important de caractériser l’expression
des protéines de la membrane plasmique impliquées dans le signal calcium
Afin d’obtenir des résultats les plus spécifiques possibles, nous avons comparé le protéome de
plusieurs types de gCSCs (TG01, TG10, OB1) avec des cellules souches neurales (NSC), une
lignée de cellules de glioblastome (U-87 MG) et une lignée non neurale épithéliale (HEK,
human embryonic kidney).
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
172
II. Isolationetidentificationdesprotéinesmembranaires
1. Isolationdesprotéinesmembranaires
Les protéines membranaires sont sous représentées dans les résultats d’analyses
protéomiques : dans les approches classiques, ces protéines ne représentent que 5 à 15 % des
protéines identifiées alors que 36 % environ des gènes humains codent pour des protéines
membranaires (Ahram et al., 2006; Krogh et al., 2001). Les difficultés d’analyse des protéines
membranaires sont principalement liées à leur hydrophobicité et leur faible abondance. En
effet, le caractère hydrophobe des protéines leur permet d’être intégrées dans les membranes
mais cela complique également l’accessibilité aux sites de digestion protéolytiques, étape
indispensable à leur identification, et diminue la solubilité des protéines en solution aqueuse.
D’autre part, l’identification des protéines contenues dans des mélanges complexes,
présentant une gamme dynamique de concentrations importante, se limite aux protéines les
plus fortement exprimées ; il est donc indispensable de simplifier les échantillons afin de les
enrichir en protéines membranaires.
Plusieurs méthodes ont été proposées afin d’enrichir les échantillons en protéines
membranaires parmi lesquelles le marquage des protéines de surface suivi d’une purification
par chromatographie d’affinité (Braschi and Wilson, 2006; Sabarth et al., 2002; Zhao et al.,
2004), l’utilisation de microbilles magnétiques marquées et dirigées contre la Concanavaline
A (lectine communément utilisée pour détecter les protéines membranaires glycosylées) (Lee
et al., 2008), l’utilisation d’anticorps immobilisés contre des protéines membranaires (anti-
CD15) (Chang et al., 2004), la digestion et isolation des peptides de surface (Bledi et al.,
2003), la formation de microparticules (Miguet et al., 2006; Miguet et al., 2007). L’analyse
des échantillons protéiques obtenus par ces différentes méthodes permet d’obtenir entre 30 et
80 % de protéines associées à la membrane plasmique (Josic and Clifton, 2007) ; les
contaminations les plus fréquentes proviennent de la mitochondrie et du réticulum
endoplasmique (ER).
Afin d’enrichir les échantillons en protéines membranaires, nous avons réalisé des « ghosts »
(fantômes membranaires), ou vésicules membranaire, formés par lyse mécanique et
débarrassés des débris cellulaires et protéines cytoplasmiques par centrifugations (Matériel et
méthodes, point II-14). La formation de ghosts ne permet pas l’élimination de la majeure
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Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
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Encart 7 : Gene Onthology
http://www.geneontology.org/
Gene Onthology (GO) est un projet initié dans le but de standardiser la représentation des gènes et
protéines retrouvées dans différentes bases de données à travers l’utilisation d’un vocabulaire et
d’annotations controlés. Initié en 1998, par le rassemblement des informations contenues dans les
bases de données de 3 organismes (drosopile, Saccharomyces, souris), GO rassemble aujourd’hui les
éléments d’un répertoire extensif de génômes de plantes, animaux et organismes microbiens.
GO est structuré selon 3 ontologies décrivant les produits de gènes en termes de processus
biologique, composant cellulaire et fonction moléculaire, indépendemment des espèces.
L’utilisation des termes de GO dans différentes bases de données permet une certaine uniformité des
données. La structuration du vocabulaire utilisé et les relations des différents termes entre eux
permettent un questionnement de la base de données à différents niveaux.
3. Sensibilitédedétectiondesprotéines
L’hétérogénéité intra échantillon induit un élargissement de la gamme dynamique des taux
d’expression des protéines et donc une sensibilité de détection moindre par rapport aux
protéines plus faiblement exprimées tels que les RCPGs (récepteurs couplés aux protéines G).
Une bonne évaluation de la sensibilité des résultats obtenus est donc l’identification de ces
protéines membranaires. Le génome humain contient 382 endo-RCPGs dont 84 sont exprimés
dans les cellules TG01 par plus d’une molécule ARNm par cellule d’après les données de
transcriptomique ; parmi ces RCPGs, 7 sont exprimés de façon différentielle dans les gCSCs
par rapport à des cellules de glioblastomes, de tissu cérébral sain ou épithéliales non neurales
(données non publiées). L’analyse du protéome membranaire a permis l’identification de 3 de
ces RCPGs : CD97, Latrophilin-2, GPR56, dont la détection est corrélée au niveau
d’expression transcriptomique (Tableau 10). L’analyse protéomique nous permet donc
d’identifier des protéines exprimées en transcriptomique avec une valeur de Ct ≤ 25 ; la
détection d’aucun de ces RCPGs n’a été confirmée dans les cellules U87 dans lesquelles les
RCPGs sont plus faiblement transcrits.
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
176
Tableau 10 : Comparaison des niveaux d’expressions transcriptomique et protéomique de 3 RCPGs. Les données ont été normalisées par rapport au gène RPLP0 exprimé à 21,2 Ct. Abréviation : Ct = threshold cycle : cycle de PCR minimal à partir duquel l’ADN rétrotranscrit est détecté.
L’absence d’identification d’un nombre plus important de RCPGs est probablement due à la
structure particulière de ces protéines. Ces protéines sont composées d’un domaine N terminal
extracellulaire, d’un cœur hydrophobe de 7 hélices transmembranaires et d’un domaine C
terminal cytoplasmique. Les domaines extracellulaire et membranaire sont impliqués dans la
liaison du ligand tandis que le domaine cytoplasmique, composé de 3 boucles et d’une région
C terminale, est impliqué dans la transmission du signal et le recrutement de complexes
protéiques de domaines intracellulaires (Rosenbaum et al., 2009). La composition des RCPGs
contient peu de sites de protéolyse intra membranaires pour la trypsine et la chymotrypsine,
communément utilisées pour obtenir des peptides identifiables par spectrométrie de masse ;
cette caractéristique des RCPGs limite donc la détection des peptides requis pour
l’identification de ces protéines et ne permet d’identifier que les RCPGs ayant une grande
queue extracellulaire, contenant potentiellement des peptides identifiables en spectrométrie de
masse.
4. Expressiondifférentielleduprotéomemembranaire
L’expression des protéines membranaires a été comparée dans les différents échantillons
selon le nombre de peptides identifiés pour chaque protéine (Figure 69). Pour un type
cellulaire donné, la surexpression d’une protéine a été définie soit par son absence dans les
autres types cellulaires soit par un ratio de nombre de peptides identifiés supérieur ou égal à
1.5 par rapport aux autres types cellulaires ; on peut ainsi identifier
- 114 protéines surexprimées spécifiquement dans les cellules TG0, dont 93 avec un
ratio ≥ 2
CD97 LPHN2 GPR56
TG01 25,3 24,0 24,2
U‐87 MG 27,5 28,1 24,9
NSC 31,3 28,7 22,6
TG01 2 5 3
U‐87 MG 0 0 0
NSC 0 0 7
Protéome
(nb peptides)
Transcriptome
(Ct)
-
r
-
u
- 7
- 3
-
Ces obs
propriét
le rassem
proximi
al., 201
TG01 s
HEK.
Figure 69L’expressidans les dià une suremoyenne o
Les gèn
sont imp
protéine
protéine
égaleme
l’homéo
observe
dans les
de mob
expérim
154 protéin
ratio ≥ 2
107 protéin
un ratio ≥ 2
75 protéine
37 protéine
12 protéine
servations p
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ité des profi
2) des deux
sont proche
: Expression dion des protéineifférentes cellul
expression, les pou identique da
nes surexpri
pliqués (Fig
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es impliqué
ent retrouv
ostasie cellu
er qu’aucun
s cellules U
bilité des gC
mentations d
Chapitre3desC
nes surexpri
nes surexpri
2
s exprimées
s exprimées
s exprimées
permettent d
ules souche
des cellules
fils transcrip
x types cel
s des cellu
des protéines mes membranaireles. Le clusterinprotéines marqu
ans les différent
més ont ens
gure 70). Ce
es dans la ph
ées dans la
é dans les
ulaire et cer
ne protéine
U-87 MG ; c
CSCs et cel
de xénogreff
3:RecherchellulesPro
imées spéci
imées spéci
s communém
s communém
s communém
de caractéris
es neurales
TG01 et N
ptomique (L
lulaires : d’
les NSC et
membranaires es détectées avng a été effectuéuées en bleu à us échantillons.
suite été cla
es résultats
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cellules U
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impliquée
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hedeMarqpagatrices
ifiquement
ifiquement
ment dans l
ment dans l
ment dans l
ser les cellu
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’après le pr
t beaucoup
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assés selon l
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logie des gC
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U-87 MG m
s de signali
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s cellules U
queursMemdeGlioblat
dans les ce
dans les ce
les cellules
les cellules
les cellules
ules TG01 c
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clustering p
2006a) et pr
rotéome me
plus éloign
rents types cellou plus dans aul dChip ; les prossion, les proté
les processu
de mettre e
CSCs. On p
ion cellulai
mais basé s
isation intra
gration cell
t donc être i
iquerait l’ab
U-87 MG. D
mbranairestsome
ellules NSC
llules U-87
TG01 et NS
TG01 et U-
TG01 et HE
comme part
ellules tumo
présenté en
otéomique
embranaire
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lulaires. moins un type
otéines marquéeines marquées
us biologiqu
en évidence
eut en parti
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sur des pro
acellulaires.
lulaire ne s
imputée au
bsence de m
’autre part,
s
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7 MG, dont
SC
-87 MG
EK
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orales. D’au
Figure 69 r
globaux (T
global, les
ellules U-87
e cellulaire a étéées en rouge cor
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iculier ident
ogenèse (p
otéines diff
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caractère in
métastases
la surexpre
177
avec un
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fois des
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celluels
7 MG et
é comparée rrespondent expression
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dans les
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protéine
fort pote
Figure 70Résultats pnombre tocomptabiliéchantillon
es angiogén
entiel angio
: Répartition présentés sous lotal de protéinisées sont cellns. L’annotation
10
Chapitre3desC
niques dans
ogénique de
des protéines sla forme de pounes correspondes exprimées an des processus
00 13
3:RecherchellulesPro
les cellules
ces cellule
surexprimées surcentages du ndant est indiquavec un ratio ≥s biologiques a
37 8
hedeMarqpagatrices
s TG01 et U
s tumorales
selon les procenombre total deué au-dessus d≥ 1.5 pour le été faite d’aprè
87 5
queursMemdeGlioblat
U-87 MG m
s.
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/ les échantillès Gene Ontholo
59
mbranairestsome
met en évide
ues impliqués. xprimées dans onnet de l’histons concerné(sogy.
s
dence et con
chaque type cetogramme. Less) par rapport
178
nfirme le
ellulaire ; le s protéines aux autres
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
179
III. ClustersdedifférenciationetIntégrines
Les clusters de différenciation (CD) sont des molécules de surface constituant la carte
d’identité des cellules immunitaires. Ces clusters ont été définis en 1984 par le « human
leucocyte differentiation antigens workshops » (HDLA) pour permettre de développer des
anticorps ciblant ces cellules. D’un point de vue physiologique, ces molécules peuvent agir en
tant que récepteurs ou ligands et être impliquées dans des voies de signalisation ou dans
l’adhésion cellulaire ; plus de 350 CD ont été identifiés chez l’homme (Zola et al., 2007).
Parmi les CD, certains sous également connus sous une nomenclature intégrine. Les
intégrines sont des glycoprotéines formant des récepteurs hétérodimériques pour les
molécules de la matrice extracellulaire et jouant un rôle essentiel dans la formation des
métastases (Hood and Cheresh, 2002). Ces récepteurs sont constitués d’une sous unité et
d’une sous unité : les combinaisons de 18 sous unités et 8 sous unités permettent de
former au moins 24 hétérodimères différents. Dans le cas du cancer du sein, les intégrines 1,
V et 6 sont plus fortement exprimées dans les cellules capables de générer des métastases et
la surexpression de l’intégrine 1 est corrélée avec un pronostic plus sombre (Lund et al.,
2009) ; l’étude du protéome de cellules tumorales du pancréas a également révélé une
surexpression de l’intégrine 1 (Chen et al., 2005). Dans le cas des glioblastomes, l’expression
d’51 est associée à un phénotype tumoral plus agressif et la surexpression de la sous unité
5 est corrélée avec une survie plus faible des patients ; cette surexpression est également
responsable de l’inhibition de la voie p53 suite à l’action du Témozolomide (Janouskova et
al., 2012).
L’expression de ces protéines a été comparée dans les différents types cellulaires (Figure
71A). Cette classification permet i) de distinguer les cellules HEK, non neurales et pour
lesquelles peu de CDs sont exprimés, des autres types cellulaires et ii) de mettre en évidence
le partage de molécules entre les gCSCs et NSC d’une part et entre les gCSCs et cellules
différenciées de la masse tumorale d’autre part ; très peu de protéines sont surexprimées
conjointement dans les autres types cellulaires.
Figure 71À : Clusteeffectuée conjointem
Parmi le
5 (CD4
2005) a
2000). L
glioblas
dans la
l’intégri
le conte
retrouve
cellules
(Guo e
thérapeu
al., 2009
A
B
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: Expression derisation de l’enavec le logicie
ment dans les ce
es intégrin
49e) et 1 (
ainsi que la
La sous unit
stomes (Xia
périphérie
ine V3 a u
exte microen
er la molécu
de gliobla
et al., 2003
utique dans
9; Shi et al.
D 104D 109D 138D 148D 205D 239D 243D 316D 339D 47D 49fD 58D 63D 97
CD et inté
Chapitre3desC
des CDs dans lnsemble des CDel dChip. B : ellules TG01 et
nes exprimé
(CD29), cor
sous unité
té 3 (CD49
ao et al., 20
invasive de
un rôle pro
nvironemen
ule CD140b
astome (Ma
3; Shen et
s plusieurs c
, 2011).
HEK NSC0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 05 70 00 20 0
égrines spécif
3:RecherchellulesPro
les différents tyDs détectés aveCDs spécifiqueU87 (droite) av
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rrélées à un
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9c) a égalem
009) ainsi q
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ntal (Kanam
b, aussi con
aderna et al
t al., 2009
cancers (Co
C TG016
3023
2923442
15262
iques de TG01
hedeMarqpagatrices
ypes cellulaireec au moins 2 pes ou surexprivec le nombre d
ement par T
n phénotype
), surexprim
ment été ide
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que mais pe
mori et al., 2
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l., 2007) et
9) ; cette m
oluccia et al
U8705000000000020
1
CCCCCCCC
queursMemdeGlioblat
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TG01 et U8
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mée en prése
entifiée com
unité (C
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ut égalemen
2006). Cette
e nom de PD
fortement
molécule es
l., 2008; Ka
CD 140bCD 222CD 29CD 44CD 49bCD 49cCD 49eCD 61
CD et intég
mbranairestsome
un type cellulaicellules TG01 ntifiés pour cha
87, on retro
des glioblast
ence de TG
mme étant su
CD 61) en a
e associée a
nt être anti-
e analyse pe
DGFR, su
impliquée
st étudiée
aplan et al.,
HEK NS05 1
11 10
15 1000
grines spécifiq
s
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ouve les sou
tomes (Che
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urexprimée
association
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-angiogéniq
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urexprimée
dans l’angi
en tant qu
2006; Rein
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12 4412 232 7
13 290 160 130 10
ques de TG01
180
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ke et al.,
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avec V
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que selon
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dans les
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ue cible
nmuth et
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56219
2818229
et U87
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
181
Parmi les protéines surexprimées spécifiquement dans les cellules TG01, CD109 est une
glycoprotéine impliquée dans la signalisation de TGF en intervenant au niveau de
l’internalisation du récepteur, initiant la dégradation du récepteur et l’inhibition de la
signalisation intracellulaire de TGF(Bizet et al., 2011). La dérégulation de l’expression de
CD109 a été identifiée dans de nombreux cancers tout en n’étant pas détecté dans les tissus
sains (à l’exception des testicules) (Hashimoto et al., 2004). Le profil d’expression
protéomique de cette molécule sur nos différents types cellulaires confirme ces données :
CD109 n’est exprimée ni dans HEK ni dans NSC mais est détectée dans les cellules U-87
MG. À ce jour, l’expression de CD109 n’a pas été reportée dans les CSCs ; notre analyse
montre donc pour la première fois une forte surexpression de CD109 dans les gCSCs par
rapport aux cellules de la masse tumorale.
CD205 est un récepteur impliqué dans le processus de présentation des antigènes de classe I
et de classe II permettant d’initier la réponse immunitaire ; ce récepteur est également
impliqué dans la reconnaissance des cellules apoptotiques ou nécrotiques (Shrimpton et al.,
2009). Dans une étude portant sur le cancer des ovaires, l’expression de CD205 a été
identifiée dans des cellules tumorales, stimulée par l’expression de l’interleukine 6 (Il6) ; cette
étude met en évidence le rôle de CD205 dans l’adhésion à la matrice extracellulaire et la
formation de métastases (Giridhar et al., 2011). De façon surprenante, CD205 est sous
exprimé dans d’autres types de tumeurs, et agit probablement comme un gène suppresseur de
tumeur, associé avec un état différencié et une diminution de la prolifération, probablement
sous l’effet de l’interleukine 4 (al-Tubuly et al., 1996; Tungekar et al., 1996). D’après nos
résultats, CD205 est surexprimé de façon spécifique dans les TG01 ; on peut donc supposer
que, de la même façon que dans le cancer des ovaires, CD205 est impliqué dans le processus
métastatique des gCSCs.
CD104, intégrine 4, est impliqué dans l’activation des voies de signalisation PI3K-AKT-
mTOR, Ras-ERK, NFAT suite à la liaison d’un ligand extracellulaire (Hu et al., 2012). Bien
que l’expression de CD104 ait été reliée à la tumorigénicité des cellules, dont des cellules de
gliomes de haut grade (Giancotti, 2007; Previtali et al., 1996), la comparaison de plusieurs
lignées de glioblastomes a mis en évidence l’absence d’expression dans les cellules U-87 MG
(Belot et al., 2001), confirmée par nos données. L’analyse protéomique effectuée a permis
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
182
d’identifier CD104 uniquement dans les cellules TG01, reflétant le phénotype tumorigénique
de ces cellules. Cependant, cette détection n’a pas été effectuée avec un nombre assez
important de peptides (6) pour pouvoir supposer que cette protéine soit surexprimée par
rapport aux cellules de la masse tumorale (cellules de glioblastome autres que U-87 MG) ; la
présence de CD104 devra être confirmée sur d’autres lignées de gCSCs.
L’intégrine 61 forme un point d’ancrage des cellules souches neurales adultes dans la niche
périvasculaire. La sous unité 6 (CD49f) été décrite comme surexprimée dans les gCSCs et
impliquée dans la prolifération et la tumorigénicité des cellules (Lathia et al., 2010) ainsi que
dans l’invasion des gCSCs (Velpula et al., 2012). Nos résultats sont cohérents avec nos
données : expression de CD49f dans les NSCs, surexpression dans les TG01 et absence dans
les U-87 MG ; à travers la littérature et nos résultats, cette protéine peut être considérée
comme surexprimée spécifiquement dans les gCSCs et pourrait être utilisée comme
biomarqueur de ces cellules.
IV. Pro
La liste
été filtré
protéine
ont été
nous pe
(Figure
Figure 72À : Clustedans un tydans les ceTG01 et Uavec le log
A
Ge
ATP
ACT
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PLC
PLC
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S10
S10
S10
S10
S10
S10
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SPT
SRICA
B
otéomeca
e des protéin
ée par rapp
es appartena
conservées
ermet ici e
72A).
: Expression derisation de l’enype cellulaire. Lellules TG01 (g
U87 (droite, basgiciel dChip ; le
ne name HEK
P2B4 2
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LML5 0
B1 0
BP9 0
CAT1 0
YL6B 0
CD6 0
CD1 0
CD3 0
N3 0
OT1 0
00A11 0
00A13 0
00A16 0
00A7 2
00A8 2
00A9 3
ARC 0
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0CNA2D1 0
Protéines sp
Chapitre3desC
alcique
nes membr
port à l’imp
ant au calci
. La compa
encore d’ob
des protéines insemble des proLa clusterisatiogauche) et sures) avec le nombes protéines son
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0 30
8 21
0 6
0 2
3 9
4 6
4 6
0 2
0 2
0 5
0 2
2 6
0 5
0 5
2 5
0 3
2 3
0 7
2 9
58 133
4 63 30
pécifiques de T
3:RecherchellulesPro
anaires, ou
lication des
ium toolkit
araison de c
bserver des
mpliquées danotéines impliquon a été effectuexprimées conjobre de peptides nt représentées p
01 U87
0 11
13
0
0
0
2
0
0
0
0
0
3
3
0
0
0
0
2
0
3 16
00 2
TG01
hedeMarqpagatrices
associées à
s protéines
ou au EFh
ce sous prot
propriétés
ns la signalisatiuées dans la siguée avec le logointement dansidentifiés pour par les noms de
Gene
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SLC25
Pro
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ITPR1
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S100A
S100A
S100A
Pro
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à la membr
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téome dans
commune
ion calcique. gnalisation calcgiciel dChip. B les cellules TGchaque type ce
e leurs gènes re
e name HEK
NS1 0
10 0
0
T1 0
F1 0
6B 0
T2 0
5A25 0
otéines spécifiq
e name HEK
1 0
2C1 0
N4 5
U 8
2 17
A10 0
A11 0
A6 0
otéines spécifi
mbranairestsome
rane, obtenu
nalisation c
stées en An
les différen
s aux cellu
cique détectées : Protéines spé
G01 et NSC (drellulaire. La cluspectifs.
NSC TG01
2 2
8 2
2 2
4 6
2 2
4 6
7 2
6 6
ques de TG01
NSC TG01
0 5
0 2
19 37
10 16
17 26
0 7
0 5
0 3
iques de TG01
s
ue précédem
calcique : se
nnexes VII
nts types ce
ules TG01
avec au moinsécifiques ou suroite, haut) ou usterisation a ét
1 U87
0
0
0
2
0
0
0
0
et NSC
1 U87
53
3
31
15
30
6
3
3
et U87
183
mment a
eules les
et VIII)
ellulaires
et NSC
s 2 peptides urexprimées les cellules té effectuée
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
184
1. ProtéinesS100,marqueursdetumeurs
Parmi les protéines surexprimées dans les cellules TG01 ou conjointement avec les cellules
NSC ou U-87 MG, on retrouve les protéines de la famille S100, souvent impliquées dans la
progression tumorale. Bien que le rôle précis de ces protéines ne soit pas identifié, plusieurs
membres de cette famille sont associés à la formation de métastases à travers l’interaction
avec les métalloprotéinases de la matrice extracellulaire (Salama et al., 2008) ou ont un rôle
de chimioattractants (Phipps et al., 2011) ; certaines de ces protéines peuvent également
réguler des facteurs de transcription, dont p53 (Grigorian et al., 2001).
L’expression de la protéine S100A6 a notamment été corrélée avec le grade des gliomes
(Camby et al., 1999) et la migration cellulaire (Kucharczak et al., 2001) et est
préférentiellement exprimée dans les cellules associées à la niche périvasculaire (niche des
cellules souches) dans un modèle génétique de gliome (Harris et al., 2008). Les protéines
S100A10 et S100A11 sont également communément surexprimées dans les cellules TG01 et
U87 et rapportées dans la littérature comme impliquées dans plusieurs cancers (Hao et al.,
2012; Liu et al., 2010b; Tan et al., 2011). Cependant, à ce jour aucune étude n’a rapporté la
surexpression de ces protéines dans les glioblastomes.
Parmi les protéines exprimées spécifiquement ou surexprimées dans les cellules TG01,
S100A9 est associée entre autres avec les tumeurs du sein de haut grade (McKiernan et al.,
2011) et S100A13 a été détectée dans les gliomes de haut grade au niveau des niches
périvasculaires (Landriscina et al., 2006), environnements privilégiés des gCSCs. Cette
observation rejoint les données obtenues lors de notre analyse mettant en évidence la
surexpression de S100A13 dans les cellules TG01 ; l’absence d’expression de cette protéine
dans les cellules U-87 MG peut être corrélée au fait que ces cellules soient une lignée
cellulaire et non des cellules primaires issues de la tumeur ou que la protéine S100A13,
marqueur de tumeurs de haut grade, soit exprimée principalement dans les gCSCs et non dans
les cellules de la masse tumorale.
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
185
2. Protéinesimpliquéesdanslarégulationdel’homéostasiecalcique
Parmi les protéines impliquées dans la signalisation calcique, nous nous intéressons
particulièrement aux protéines impliquées dans la régulation de l’entrée / sortie de calcium du
cytoplasme, modulant l’homéostasie calcique. Certaines familles de protéines n’ont été
identifiées dans aucun type cellulaire : il s’agit probablement d’une difficulté d’accès aux
peptides utilisés pour l’identification des protéines concernées, de la même façon que pour les
RCPGs (point II-3).
La sous unité 2 des canaux calciques voltage dépendants est fortement surexprimée
dans les cellules TG01 par rapport aux cellules NSC et U-87 MG. L’expression de cette sous
unité augmente la densité des canaux calciques voltage dépendant au niveau de la membrane
plasmique (Davies et al., 2007; Shistik et al., 1995). Plus récemment, il a été mis en évidence
que cette protéine est impliquée dans la synaptogenèse, processus altéré dans les cellules
TG01 (mis en évidence au point II-4), indépendamment de la fonction du canal calcique
(Garcia et al., 2008). Dans des modèles de douleur neuropathique, la surexpression de la
protéine 21 et sa localisation périphérique laissent supposer un rôle dans la régénération
neuronale et la plasticité cellulaire (Bauer et al., 2009).
Les pompes calciques ATPasiques ont un profil d’expression assez intéressant : on retrouve
en effet une sous-expression de PMCA1 et une surexpression de PMCA4 dans les cellules
TG01 ; PMCA4 est également légèrement surexprimée dans les cellules U-87 MG. Dans la
cellule, l’altération des capacités d’efflux du calcium peut avoir de nombreuses conséquences
dont la réduction de la sensibilité à l’apoptose ou l’augmentation de la réponse cellulaire à un
facteur de croissance. Cependant, les différentes études ayant rapporté l’altération de
l’expression d’isoformes des pompes calciques membranaires ont mis en évidence une
surexpression de PMCA1 et une sous-expression de PMCA4. En effet, la sous-expression de
PMCA1 favorise la nécrose et l’expression de PMCA4 est associée à un phénotype de
différenciation (Curry et al., 2012; Roberts-Thomson et al., 2010). Ces données vont dans le
sens du nombre de peptides identifiées pour U-87 MG pour les protéines PMCA1 et PMCA4
(respectivement 24 et 11) mais sont contraires à ce que l’on obtient pour les cellules TG01 ;
cette observation met en évidence la biologie particulière de ces cellules, notamment au
niveau de la signalisation calcique dont la régulation est altérée.
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
186
V. Conclusion
L’étude des protéines de la membrane plasmique est de plus en plus utilisée dans la recherche
de biomarqueurs dans le cadre de pronostiques, de monitoring et de prédiction des bénéfices
d’un traitement. Ces protéines peuvent également être utilisées comme cibles thérapeutiques
potentielles : aujourd’hui environ 2/3 des molécules ciblant des protéines particulières sont
dirigées contre des protéines de la membrane plasmique. Cependant, les protéines
membranaires sont hydrophobes et possèdent plusieurs domaines transmembranaires, ce qui
complexifie les méthodes requises pour leur isolation et identification. La plupart des études
du protéome membranaire sont effectuées sur des lignées cellulaires mais des stratégies
utilisant des tissus cliniques couplées à des études de spectrométrie de masse sont de plus en
plus développées (Leth-Larsen et al., 2010). L’utilisation de marqueurs potentiels identifiés en
protéomique nécessite leur validation à travers l’utilisation d’un nombre assez important de
matériels cliniques.
La comparaison des protéomes membranaires issus de cellules de gCSCs avec des cellules
souches neurales, tumorales et épithéliales nous a permis de mettre en évidence plusieurs
protéines surexprimées dans les cellules TG01. Cette analyse décrit pour la première fois
l’étude du protéome membranaire de gCSCs et a permis l’identification de plusieurs
biomarqueurs potentiels des gCSCs. En effet, les protéines CD109 et CD205 ont certes été
décrites dans des cellules tumorales, dont des cellules de glioblastome, mais la surexpression
de ces protéines dans les cellules TG01 par rapport aux cellules U-87 MG est amplement
suffisante pour considérer ces protéines en tant que candidats biomarqueurs des gCSCs. De la
même façon, les protéines S100A9 et S100A13 ont préalablement été identifiées dans des
tumeurs du sein et de glioblastome de haut grade mais n’ont pas été reliées aux gCSCs. Cette
étude nous a également permis de détecter des protéines impliquées dans la signalisation
calcique comme étant différentiellement exprimées dans les cellules TG01 par rapport aux
autres types cellulaires, dont la PMCA1, la PMCA4, la sous unité 21 des canaux calciques
voltage dépendants.
L’ensemble des protéines différentiellement exprimées n’a pas été commenté mais contribue
au phénotype de cellules souches tumorales des TG01, partageant à la fois des propriétés de
cellules souches et de cellules de glioblastome comme mis en évidence par l’expression
Chapitre3:RecherchedeMarqueursMembranairesdesCellulesPropagatricesdeGlioblatsome
187
commune de certaines protéines ou de processus biologiques affectés. Cependant, les
quelques protéines discutées nous semblent de bon candidats en tant que biomarqueurs
potentiels des gCSCs. La sélection de ces protéines devra être confirmée par une seconde
analyse protéomique incluant d’autres gCSCs (OB1 et TG10) et réalisée par le Laboratoire de
Spectrométrie de Masse BioOrganique (UMR 7178, Dr Sarah Cianferani, Dr Jean-Michel
Saliou, Sarah Lenon) ainsi que par un marquage en cytométrie en flux ou sur des coupes
histologiques de neurosphères.
Certaines protéines ont été décrites dans plusieurs types de cancers ou voies de signalisation
associées à la tumorigénisation mais n’ont été identifiées dans aucun de nos échantillons
cellulaires. Ces éléments peuvent donner un aspect biaisé dans le cas d’une caractérisation
protéomique mais n’est pas gênante dans le cadre d’une étude différentielle. D’autre part, la
comparaison de notre étude avec celle de Polisetty réalisée sur le protéome membranaire de
cellules de glioblastome en comparaison avec du tissu cérébral de patient épileptique
(Polisetty et al., 2012a) montre l’identification commune d’une certain nombre de protéines,
dont les protéines de la famille S100, des intégrines, des clusters de différenciation ou des
protéines impliquées dans la signalisation calcique (Annexe IX).
Cependant, cette étude n’a pas permis l’identification de certaines protéines rapportées dans
les glioblastomes. Il s’agit en autres de l’intégrine 4, de la protéine S100A4, de la famille des
annexines (Polisetty et al., 2012a; Thirant et al., 2012) ; la protéine HDGF, potentielle cible
thérapeutique des gCSCs (Thirant et al., 2012), n’a été identifiée dans notre analyse
spectrométrique qu’avec 1 peptide, ce qui ne permet pas de valider sa présence. Ces
différences peuvent être dues à la structure des protéines (problème de génération des peptides
nécessaires à leur identification) ou à la préparation des échantillons. En effet, nos
échantillons sont congelés une première fois à -20 °C avant d’être recentrifugés ; cette étape
peut induire la perte des protéines les moins ancrées à la membrane. Cependant, dans le cas
d’une étude différentielle, ces différences ne sont pas gênantes bien qu’elles induisent
inévitablement la réduction du nombre de biomarqueurs potentiels.
Dans le
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189
ConclusionGénérale
ConclusionGénérale
ConclusionGénérale
190
Ce travail s’inscrit pleinement dans les deux axes développés au laboratoire : d’une part
l’étude des cellules propagatrices de glioblastome, et d’autre part l’étude de la Calmoduline,
protéine majeure de la signalisation calcique, interagissant avec une pléthore d’autres
protéines cellulaires intervenant dans la gestion de la signalisation calcique et contrôlant des
évènements cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la mort cellulaire, ….
Les cellules propagatrices de glioblastome, plus communément appelées cellules souches
cancéreuses de glioblastome, sont considérées comme responsables de l’agressivité et de la
résistance aux traitements usuels des gliomes de haut grade. Ces cellules ont des propriétés de
cellules souches normales : elles sont rares, ont des capacités d’auto-renouvellement illimitées
et peuvent se différencier par le biais de divisions asymétriques pour reformer la tumeur
originelle in vivo (Reya et al., 2001). Parmi les nombreux mécanismes de survie cellulaire
activés dans ces cellules et médiant leur résistance aux traitements standard, ces cellules sont
capables d’interagir avec leur microenvironnement pour faciliter l’immunosuppression, la
migration des cellules, l’angiogenèse et l’invasivité tumorale (Bonavia et al., 2011; Li and
Laterra, 2012). Cette grande plasticité cellulaire permet aux gCSCs de trouver des « voies de
secours » et de s’adapter à des traitements ciblés. Ceci est renforcé par la redondance des
voies de signalisation activées dans les cellules de glioblastome, comme en témoigne
l’observation d’un « switch RTK » dans le cadre de thérapies ciblant l’EGFR : les cellules
sont capables d’activer d’autres voies des RTKs promouvant la survie cellulaire et
responsables de l’effet transitoire des inhibiteurs de l’EGFR (Engelman et al., 2007; Stommel
et al., 2007). Les thérapies nouvelles doivent donc s’attacher à cibler plusieurs voies de
signalisation des CSCs, permettant à la fois d’affaiblir le système tumoral et de booster le
système immunitaire.
Cependant, la mise en place d’une thérapie agressive pour éliminer ces CSCs nécessite
l’identification de marqueurs de ces cellules afin de pouvoir i) les isoler et cibler de façon très
sélective, en épargnant les cellules du tissu sain environnant, et ii) caractériser l’état
physiologique et évaluer l’efficacité d’un traitement sur la physiologie de ces cellules. Jusqu’à
aujourd’hui, différentes équipes ont cherché à identifier de tels marqueurs mais aucun ne s’est
révélé être spécifique des gCSCs (Patru et al., 2010).
D’autre part, la signalisation calcique est modifiée dans les cellules tumorales ; le signal
calcium contrôle de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la
ConclusionGénérale
191
différenciation, la mort cellulaire, la migration, le métabolisme,… à travers sa traduction en
évènements biochimiques par des protéines senseurs du signal calcium (Haiech et al., 2011).
Parmi les senseurs calciques, la Calmoduline (CaM) joue un rôle central et sa perturbation par
des molécules chimiques permet de générer un signal calcium en absence de stimulus
extérieur ; ce signal constitue une empreinte caractéristique de l’appareillage moléculaire
responsable de la signalisation calcique (calcisomes) d’une cellule dans un état physiologique
donné (Dagher et al., 2009).
L’objectif de ce travail a été de déterminer des biomarqueurs des gCSCs permettant de cibler
ces cellules et de caractériser leur état physiologique. Pour cela, le travail a été organisé sur
deux axes principaux :
- L’identification et la caractérisation d’antagonistes de CaM permettant de générer une
signature calcique spécifique des gCSCs
- L’identification de protéines exprimées exclusivement ou surexprimées à la surface
des gCSCs
Dans une première partie, nous avons recherché des petites molécules chimiques capables
d’interagir différentiellement avec CaM à travers un criblage de chimiothèques par
anisotropie de fluorescence. Les molécules sélectionnées ont ensuite été caractérisées par des
études préliminaires chimiques, de thermodynamique de liaison à CaM, de disponibilité
biologique et de pertinence d’utilisation biologique. Une caractérisation plus approfondie a
ensuite été réalisée afin d’identifier les protéines dont la liaison à CaM est préférentiellement
inhibée pour chacune de ces molécules. En parallèle, nous avons caractérisé la perturbation de
l’homéostasie calcique induite suite à l’ajout des antagonistes sur plusieurs types cellulaires
que nous avons comparés à des cellules primaires propagatrices de glioblastome.
Cette étude nous a permis de mettre en évidence dans un premier temps
- La diversité chimique des molécules capables d’interagir avec CaM
ConclusionGénérale
192
- L’interaction préférentielle de CaM avec certaines cibles intracellulaires (représentées
par des peptides d’une vingtaine d’acide aminés) selon [Ca²+]
- La capacité des antagonistes de CaM à inhiber la liaison de CaM à ses cibles
- L’inhibition de la liaison de CaM à ses cibles dépemment à la fois de la famille
chimique de l’antagoniste (groupes A1, A2, A3) utilisé et de la quantité minimale (1,
2, 3, 4) de Ca²+ nécessaire à la liaison de CaM à ses cibles (groupes P1, P2) : les
antagonistes A1 inhibent préférentiellement les peptides P1 interagissant avec CaM
liée à 2 ou 3 Ca²+ tandis que les antagonistes A2 inhibent les peptides P2 interagissant
avec CaM liée à 1 ou 2 Ca²+
- La capacité des antagonistes de CaM à générer des signaux calciques différents et
parfois dépendants du type cellulaire
- La spécificité d’interaction de la majorité des antagonistes avec CaM dans la cellule
En combinant l’ensemble de ces résultats, nous avons dans un deuxième temps pu mettre en
évidence que les antagonistes du groupe A1 peuvent être considérés comme des marqueurs de
calcisomes communs alors que les antagonistes du groupe A2 peuvent être utilisés comme
biomarqueurs d’un ou plusieurs type(s) cellulaire(s). Parmi ces antagonistes, la molécule LPS
02-20-L-B05, et dans une moindre mesure la molécule LPS 02-20-L-C04 se comportent
différemment dans les cellules de gCSCs par rapport aux cellules HEK et U-87 MG : ces
molécules sont de bons candidats en tant que biomarqueurs de l’état physiologique des
gCSCs. De façon surprenante, ces deux molécules ont été classées dans le groupe A1,
marqueurs des calcisomes communs. Ceci suggère que soit ces molécules interagissent avec
une protéine spécifiquement exprimée dans ces cellules, dépendante ou indépendante de CaM,
soit l’expression / l’activité d’un calcisome commun est dérégulée, reflétant une modification
profonde de la signalisation calcique de ces cellules.
Figure 74 : Structure des composés LPS 02-20-L-B05 et LPS 02-20-L-C04 Ces 2 composés appartiennent à la famille des éthylène diamine N,N disubstitués dont la plateforme chimique est représentée en noire ; le cycle aromatique bleu est également commun à l’ensemble des molécules de cette famille.
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LPS 02-20-B05
NNH2
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F
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LPS 02-20-C04
ConclusionGénérale
193
Dans une seconde partie, nous nous sommes attachés à caractériser de façon différentielle le
protéome membranaire de gCSCs. Nous avons pu mettre en évidence plusieurs protéines
exprimées spécifiquement ou surexprimées dans les cellules TG01, principalement impliquées
dans la migration et l’adhésion cellulaires, l’angiogenèse, l’homéostasie cellulaire et des voies
de signalisation intracellulaires. Nous avons identifié des protéines surexprimées
communément dans les cellules TG10 et NSC d’une part et TG01 et U-87 MG d’autre part,
reflétant les propriétés partagées des gCSCs avec les NSC et les cellules de la masse tumorale.
Nous nous sommes particulièrement intéressés à deux ensembles de protéines : les clusters de
différenciation (CD) et les protéines impliquées dans la signalisation calcique. Cette analyse a
permis d’identifier des protéines exprimées à la fois dans les cellules TG10 et U-87 MG et
déjà corrélées dans la littérature avec un phénotype agressif de glioblastome ; il s’agit des
intégrines 5, 1, 2, 3, du récepteur PDGFRdes protéines S100A10 et S100A11. D’autres
protéines ont été identifiées de façon spécifique dans les cellules TG01 :
- CD109, impliquée dans l’inhibition de la signalisation de TGF et dont l’expression
est dérégulée dans de nombreux cancers
- CD205, dont le rôle peut être ambivalent mais dont une surexpression impliquée dans
la formation de métastases a été rapportée dans le cancer de l’ovaire
- L’intégrine 4, impliquée dans l’activation des voies de signalisation angiogéniques et
tumorigéniques PI3K-AKT-mTOR, ras-ERK, NFAT ; la surexpression de cette
protéine est cependant moins importante que pour les deux précédentes
- S100A6 et S100A13, impliquées dans la migration cellulaire, exprimées dans les
cellules de glioblastomes de haut grade et associées à la niche périvasculaire
- S100A9, décrit dans les tumeurs du sein de haut grade
- La sous unité 2 des canaux calciques voltage dépendants, impliquée dans la
synaptogenèse et la plasticité cellulaire
- La pompe calcique PMCA4 et la sous-expression de l’isoforme PMCA1. Cette
distribution particulière est opposée à celle observée dans les cellules U-87 MG et
d’autres cellules tumorales et met en évidence la biologie particulière des cellules
TG01
ConclusionGénérale
194
Certaines de ces protéines ont été identifiées dans différents cancers, dont des glioblastomes,
mais n’ont jamais été rapportées dans des CSCs ; d’autre part, la surexpression de ces
protéines dans les cellules TG01 par rapport aux cellules U-87 MG présage de leur
importance dans le processus tumoral et permet de proposer ces molécules en tant que
biomarqueurs des gCSCs.
De plus, la combinaison des deux études rapportées dans ce travail, d’une part l’altération de
l’expression de deux isoformes de la pompe calcique spécifiquement dans les cellules TG01
et d’autre part la caractérisation des antagonistes de CaM comme inhibiteurs spécifiques de la
liaison de CaM à un sous ensemble de ses protéines cibles, permet de proposer la molécule
LPS 01-08-L-G06 comme biomarqueur de gCSCs.
Ce travail de thèse nous a permis de développer deux types de biomarqueurs des cellules
souches cancéreuses, un biomarqueur fonctionnel caractéristique du système de gestion de
l’homéostasie calcique d’une cellule et des biomarqueurs protéiques ciblant les protéines
membranaires différentiellement exprimées dans les cellules cancéreuses de glioblastomes. La
molécule LPS 02-20-L-B05 a été identifiée à partir de 4 types de gCSCs et peut donc être
supposé assez fiable. Par contre, l’étude protéomique différentielle n’a été effectuée qu’avec
un type de gCSCs ; l’étude de l’expression des marqueurs identifiés dans les cellules TG01
ainsi que dans d’autres types de CSCs par cytométrie en flux ou western blot devrait
permettre leur confirmation / infirmation en tant que biomarqueurs des gCSCs.
Les biomarqueurs membranaires pourront être utilisés soit comme cibles thérapeutiques pour
des agents chimiothérapeutiques soit dans le cadre d’une immunothérapie. En effet, le
manque de réponse du système immunitaire face aux glioblastomes (le cerveau est un organe
immunoprivilégié) a poussé au développement de méthodes permettant de stimuler le système
immunitaire vis-à-vis d’antigènes spécifiques de ces glioblastomes. L’immunothérapie
passive utilise des anticorps monoclonaux spécifiques des cellules tumorales bloquant la
fonction d’un récepteur ou ayant une activité ADCC (antibody dependent cellular toxicity).
Plusieurs anticorps ciblant l’EGFR ont été synthétisés, dont le Nimotuzumab ; ces anticorps
ConclusionGénérale
195
induisent l’internalisation du complexe formé ainsi qu’une cytotoxicité. Les études cliniques
de phase I/II ont montré une augmentation de la survie des patients de 3 mois par rapport aux
patients traités avec le protocole de référence seul (Ramos et al., 2006). Ces anticorps peuvent
également être couplés à des molécules chimiques (ADCs : antibody-drug connugates)
permettant de cibler précisément la biodistribution des agents chimiothérapeutiques (Alley et
al., 2010). Une deuxième stratégie, l’immunothérapie adoptive consiste à prélever des
cellules immunitaires spécifiques de la tumeur, les amplifier ex vivo et les réintroduire dans
l’organisme du patient. Cette stratégie a été utilisée avec des cellules LAK (lymphokine-
activated killer) en tant que thérapie adjuvante dans le cas de glioblastomes nouvellement
diagnostiqués dans une étude de phase II ; la médiane de survie des patients est passe à 20,5
mois (Dillman et al., 2009). Une troisième méthode, l’immunothérapie active spécifique ou
vaccination thérapeutique, consiste à stimuler le système immunitaire envers les cellules
tumorales et une réponse cellulaire cytotoxique ; cette réponse est induite via des antigènes
des cellules tumorales présentés par les molécules du CMH (complexe majeur
d’histocompatibilité) aux cellules effectrices du système immunitaire. Les cellules du système
immunitaire peuvent être activées de 3 façons différentes : i) en rendant les cellules
immunitaires plus agressives, ii) en rendant les cellules tumorales plus immunogènes, i.e. par
l’expression de cytokines ou molécules de costimulation à proximité de l’antigène tumoral,
iii) par des cellules présentatrices d’antigènes amplifiées et chargées avec l’antigène cible ;
cette dernière stratégie a été approuvée par la FDA dans le cas du cancer de la prostate en
avril 2010 (Thara et al., 2011). Enfin, une autre stratégie consiste à générer des cellules
dendritiques (DC, cellule présentatrices d’antigènes) in vitro, à les activer par exposition
avec des peptides tumoraux (antigènes synthétiques ou présents dans un lysat de cellules
tumorales, cellules tumorales irradiées, mRNAs tumoraux, …) et induire leur maturation par
des cytokines (IL-1, TNF, PGE2, IFN) avant de les injecter en intradermique (Xu et al.,
2012); les DCs sont alors capables d’induire une forte réponse immunitaire intracrânienne
(Yu et al., 2001) permettant de diminuer la quantité de TNF intratumorale et d’augmenter la
survie des patients dans des essais cliniques de phase I, I/II ou II (Fadul et al., 2011; Liau et
al., 2005).
ConclusionGénérale
196
Les biomarqueurs de la signalisation calcique, et notamment LPS 02-20-L-B05, peuvent être
utilisés pour définir une signature des gCSCs ; cette approche peut être abordée pour
déterminer l’effet d’un agent chimiothérapeutique sur la physiologie de ce type de cellules.
Nous avons également postulé que l’utilisation de ces molécules pouvait avoir un effet
thérapeutique. En effet, l’utilisation d’antagonistes de CaM a été approuvée pour le traitement
de certaines pathologies, principalement psychiatriques. Aujourd’hui, de rares équipes de
recherche montrent les bénéfices de l’utilisation d’antagonistes de CaM dans le traitement de
certaines tumeurs. Ces antagonistes sont principalement utilisés conjointement avec un agent
chiomiothérapeutique plus classique et permettent de sensibiliser les cellules à des traitements
peut actifs, notamment du fait de leur toxicité sur les tissus sains environnants (Aloy et al.,
2008; Beier et al., 2008; Bilir et al., 2008). L’étape suivante de ce travail effectué pour
identifier des biomarqueurs de la signalisation calcique sera de tester et de caractériser les
effets de ces molécules en synergie avec le Témozolomide ou d’autres agents
chimiothérapeutiques.
L’ensemble de ce travail a permis d’identifier des biomarqueurs des gCSCs et de mettre en
évidence l’utilisation de petites molécules comme outils de recherche ou comme potentiels
agents thérapeutiques. Ceci nous également permis de mettre en évidence les effets très
différents que peuvent avoir plusieurs antagonistes d’une même protéine et de considérer la
Calmoduline comme une cible thérapeutique à part entière. Enfin, l’étude du protéome
membranaire nous a permis de mettre en évidence plusieurs processus biologiques altérés
dans les gCSCs, de façon spécifique ou conjointement avec les NSC ou cellules différenciées
de la masse tumorale ; ceci souligne les propriétés que partagent les gCSCs à la fois avec les
NSC et les cellules tumorales.
197
MatérieletMéthodes
MatérieletMéthodes
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MatérieletMéthodes
199
3. Chimiothèques
3.1. Strasbourg
Cette chimiothèque appartient à la plateforme de chimie et biologie intégrative de Strasbourg
(PCBIS) et est référencée dans la Chimiothèque Nationale du CNRS (http://chimiotheque-
nationale.enscm.fr/). La chimiothèque de Strasbourg comprend plus de 5300 composés
conservés dans des plaques 96 puits à 10 mM dans du DMSO ; la pureté des composés est de
plus de 80 % (caractérisation par LC-MS). Cette chimiothèque est labélisée ISO 9001:2000
depuis 2007.
3.2. Prestwick
Cette chimiothèque contient 1120 molécules dont 90 % sont des médicaments et 10 % des
alcaloïdes bioactifs ; ces molécules présentent sont déjà ou très proches d’une forme
médicamenteuse. Les composés ont été sélectionnés d’après leur diversité chimique et
pharmacologique ainsi que pour leur distribution et absence de toxicité chez l’homme.
3.3. Composéscommerciaux
Les composés commerciaux Trifluoperazine, Fluphenazine, Clorpromazine, Calmidazolium
et Bifonazole ont été commandés chez Sigma ; W7, W5, W12 et W13 chez Calbiochem.
II. Méthodes
1. Mesuresspectroscopiques
Les spectres d’absorption ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Nanodrop (Thermo
Scientific). La concentration protéique des échantillons est mesurée à 280 nm avec des
coefficients d’extinction molaire de 1 500 M-1cm-1 et 2 560 M-1cm-1 pour SynCaM et la CaM
humaine respectivement. La concentration des peptides et des sondes est mesurée avec des
coefficients d’extinction molaire de 103 000 M-1cm-1 à 565 nm.
MatérieletMéthodes
200
2. Mesuresdepolarisationdefluorescence(FP)
Le degré de polarisation est défini par l’équation FP = (I// - I) / (I// + I) avec I// et I les
intensités de fluorescence des émissions polarisées verticalement (//) et horizontalement ()
lorsque l’échantillon est excité par une lumière polarisée verticalement (Annexe I).
Les mesures de polarisation de fluorescence sont effectuées sur un appareil Victor3 (Perkin
Elmer et Analytical Sciences, Boston, MA) avec une longueur d’onde d’excitation de 530 nm
(bande passante 7 nm) et une longueur d’onde d’émission de 610 nm (bande passante 10 nm).
3. Titration des sondes fluorescentes sur CaM à différentes concentrations
calciques
Les tampons calciques (0 nM – 1,35 µM) sont préparés à partir des solutions CaEGTA et
K2EGTA ; la concentration calcique finale est déterminée par
Avec la constante de dissociation de l’EGTA et du Ca²+, et [CaEGTA] / [K2EGTA] le
ratio des deux solutions mères à 10 mM.
Les sondes fluorescentes sont préparées dans les différents tampons calciques à 0,2 µM.
SynCaM est préparée dans le tampon d’essai (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7,2) à 20 µM
puis diluée robotiquement (BiomeK 2000) en cascade (0,16 – 20 µM) dans chaque tampon
calcique.
L’essai est réalisé en ajoutant robotiquement dans une plaque 96 puits 15 µl de sonde et 15 µl
de SynCaM dilués dans le même tampon calcique. La plaque est mélangée et incubée 5 min à
température ambiante. La constante d’équilibre (Kd) de la liaison de chaque sonde à SynCaM
(FP = f([SynCaM])) dans chaque tampon calcique est calculée en utilisant le complément
Solver de Microsoft Excel d’après l’équation décrite au Chapitre 2, point II-1.
MatérieletMéthodes
201
4. IdentificationdemoléculesinteragissantavecCaMparessaiFPcompétitif
Les chimiothèques sont criblées en ajoutant robotiquement (BiomeK 2000) dans une plaque
96 puits (Corning Costar 3686, noire à fond plat) 15 µl de composé à 20 µM dilué dans du
tampon d’essai (50 mM Hepes, 150 mM KCl, 10 µM CaCl2, pH 7.5) et 15 µl du mélange
SynCaM à 4 µM – sonde fluorescente à 0,2 µM diluées dans le même tampon. La plaque est
mélangée et incubée 5 min à température ambiante. L’équilibre entre la sonde liée et la sonde
libre est mesuré pour chaque puits par polarisation de fluorescence.
5. FacteurZ’
La qualité de l’essai de criblage haut débit est évaluée par le facteur Z’ calculé selon :
13 3
avec SD l’écart type de l’ensemble des valeurs et mFP les valeurs de polarisation de
fluorescence exprimées par 1000 x FP. L’état « bound » représente la sonde liée à SynCaM et
l’état « free » représente la sonde non liée
6. Titration de molécules chimiques sur SynCaM par FP compétitif avec les
sondesfluorescentes
Dans une plaque 96 puits (Corning Costar 3686, noire à fond plat) et dans un volume de 30
µl, les composés (concentrations finales 0,5 – 500 µM) sont ajoutés robotiquement (BiomeK
2000) au mélange SynCaM (2 µM) – Sonde fluorescente (0,2 µM) dans le tampon d’essai (50
mM Hepes, 150 mM KCl, 100 µM CaCl2, pH 7,5) ; les concentrations finales de DMSO
n’excèdent pas 1 %. La plaque est mélangée et incubée 5 min à température ambiante.
L’équilibre entre la sonde liée et la sonde libre est mesuré pour chaque puits par polarisation
de fluorescence.
Les paramètres à l’équilibre sont déterminés par la courbe FP = f([composé]) en utilisant le
complément Solver de Microsoft Excel et le modèle compétitif décrit par (Roehrl et al.,
2004).
MatérieletMéthodes
202
7. Titration de peptides fluorescents sur CaM à différentes concentrations
calciques
Les peptides fluorescents sont dilués robotiquement (BiomeK 2000, Beckman Coulter) dans
les différents tampons calciques à 0,2 µM dans une plaque 96 puits (Corning Costar 3686,
Acton, MA). CaM est préparée dans le tampon d’essai (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7,2)
à 20 µM puis diluée en cascade (0,02 – 20 µM) dans chaque tampon calcique.
L’essai est réalisé en ajoutant robotiquement dans une plaque 96 puits 7,5 µl de peptide et 7,5
µl de CaM dilués dans le même tampon calcique. La plaque est mélangée et incubée 5 min à
température ambiante. Les résultats sont traités de la même façon qu’au point II-3.
8. Déplacementdespeptidesfluorescentsparlesmoléculeschimiquesparessai
FPcompétitif
Les peptides et CaM sont mélangés à des concentrations respectives de 0,2 µM et 2 µM dans
le tampon d’essai (30 mM MOPS, 100 mM KCl, 100 µM CaCl2, pH 7,2) et distribués
robotiquement (BiomeK 2000) dans une plaque 96 puits (Corning Costar 3686, Acton, MA).
Les molécules chimiques sont préparées dans le même tampon et diluées en cascade de 2000
à 0,02 µM.
L’essai est réalisé en ajoutant robotiquement dans une plaque 96 puits 7,5 µl de composé dans
chaque puits contenant 7,5 µl du mélange peptide – CaM. La plaque est mélangée et incubée
5 min à température ambiante. L’équilibre entre la sonde liée et la sonde libre est mesuré
pour chaque puits par polarisation de fluorescence et la concentration pour laquelle 50 % des
peptides sont déplacés (IC50) pour chaque molécule est en utilisant le complément Solver de
Microsoft Excel d’après l’équation suivante :
1é
1é
Avec, pour chaque couple peptide – composé, FP0 la valeur FP sans composé, FPmin la valeur
FP obtenue pour 100 % de déplacement du peptide, n le nombre de Hill.
MatérieletMéthodes
203
9. TitrationmicrocalorimétriqueisothermiquedecomposéssurSynCaM
Les mesures sont effectuées à 25 °C dans le tampon d’expérimentation (0 mM Hepes, 150
mM KCl, 1 mM CaCl2 à pH 7,5) sous agitation (300 rpm) continue avec un calorimètre de
titration VP-ITC. Les solutions sont dégazées par un barreau magnétique sous vide avant
utilisation.
La cellule est chargée avec 1,4 ml SynCaM diluée dans la solution tampon à 10 µM pour les
composés LPS 02-10-L-C08, LPS 02-20-L-A02, LPS 05-01-L-D06 ou 30 µM pour les
composés LPS 01-18-L-E03, LPS 01-18-L-E04 ; la cellule de référence contient de l’eau
distillée. Les titrations sont réalisées avec une seringue de 300 µl contenant l’un des composés
dilué dans la solution tampon à 1 mM pour LPS 02-20-L-A02, LPS 05-01-L-D06 ou 0,5 mM
pour LPS 01-18-L-E03, LPS 01-18-L-E04, LPS 02-10-L-C08. Chaque titration consiste en 60
injections consécutives de 3 µl pendant 5,1 sec et avec un intervalle de 3 min entre chaque
injection ; l’effet de la dilution est mesuré en injectant les composés dans la solution tampon
sans protéine.
La variation enthalpique de chaque injection est calculée en intégrant l’aire sous la courbe aux
temps correspondants et dont les valeurs dues à l’effet de dilution sont soustraites. Les
données sont analysées avec le logiciel MicroCal Origin. Les valeurs des variations
enthalpique, entropique, de Kd, de stoechiométrie sont dérivées de l’analyse des données.
La deuxième série de mesure est réalisée par Philippe Tsekov dans une solution tampon
contenant 50mM Hepes, 2 mM CaCl2 à pH 7,5, 25 °C avec 15 µM de SynCaM et 150 – 500
µM de composés.
10. Mesuredel’indexd’hydrophobicitédemoléculesparchromatographie(CHI)
Ces mesures ont été effectuées par la plateforme TechMedILL.
Brièvement, chaque composé est préparé précisément à 10 mM dans du DMSO et dilué au
1/50, en duplicata, dans NH4+CH3COO- / CH3CN (3/2 v/v). Une solution de standardisation
contenant 10 molécules de CHI connus est préparée dans le même tampon à 0,1 mg/ml pour
chaque molécule. Les échantillons et les standards sont injectés en HPLC (Gilson) et les
colonne
à tempé
La phas
mobile
comme
- 0
- 2
- 3
Les tem
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11. Cult
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0 – 0,2 min
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CHI des éc
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: Cellules en cles TG01, B : spectifs dans un
A
C
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(solvant B)
n : solvant A
min: solvant A
min: solvant A
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A 0 % - sol
A 100 % - s
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(2) 100 A 5
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D
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%
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Cellules HEKdité.
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D
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0 nm.
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M pH 7,4 ;
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ur tracer la d
ession linéa
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sont cultivées
204
e inverse
la phase
2 ml/min
droite de
ire et les
dans leurs
MatérieletMéthodes
205
11.1. CellulesTG
Les cellules TG sont dérivées de gCSCs isolées par l’équipe du Pr H. Chneiweiss (Hôpital Ste
Anne et Centre Broca Paris, CNRS) à partir de biopsies de glioblastomes ; plus de 10 types de
cellules primaires, chacune provenant d’un patient différent, ont été obtenues parmi lesquelles
les cellules TG01, TG10, TG16 et OB1.
Les cellules sont cultivées en suspension dans du milieu NS34 (Dubelcco’s Modified Eagle
Medium:F12 1:1, glucose 0.6 %, GlutaMAX-I 2 mM, Hepes buffer 5 mM, Sodium
bicarbonate 0.1 %, pénicilline 1 U/mL, streptomycine 1 µg/mL, N-2 supplément 1X, G-5
supplément 1X, B-27 supplément 0.5X ; les composants sont achetés chez Invitrogen) dans
une atmosphère à 37 °C, 5 % CO2, 100 % humidité. Le temps de doublement des cellules est
de 3 à 4 jours mais celui-ci peut être plus long lorsque les cellules s’agglutinent en
neuropshères.
Le milieu est changé tous les 3 à 4 jours et est accompagné d’une dissociation mécanique des
neurosphères (100 aller-retour avec une pipette P1000) ; les cellules sont réensemencées avec
10 % de milieu conditionné et 90 % de milieu frais à 2,5.106 cellules par flasque T75.
11.2. CellulesNSC
Les cellules souches neurales primaires sont obtenues à partir de cellules souches neurales
fœtales isolées par l’équipe de M.P. Junier (Hôpital Ste Anne Paris V, CNRS INSERM).
Les cellules sont cultivées en semi-adhérence sous forme de neurosphères dans le milieu
« murine NSC basal medium » (Neurocult, StemCell) supplémenté par des suppléments de
prolifération (Neurocult, StemCell), 10 ng/ml bFGF recombinant humain, 20 ng/ml EGF
humain dans une atmosphère à 37 °C, 5 % CO2, 100 % humidité. Le temps de génération de
ces cellules est de 10 jours environ.
Les cellules sont dissociées mécaniquement (100 aller-retour avec une pipette P1000) 1 fois
par semaine et réensemencées dans 10 % de milieu conditionné et 90 % de milieu frais à
2,5.106 cellules par flasque T75.
MatérieletMéthodes
206
11.3. CellulesU‐87MG
La lignée U-87 MG (ATCC HTB14) est dérivée d’un astrocytome humain de grade IV
d’après la classification 2007 de l’OMS.
Les cellules croissent en adhérence et sont cultivées dans le « Eagle’s Minimal Essential
Medium » supplémenté par 10 % sérum de veau fœtal, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml
pénicilline, 100 µg/ml streptomycine (composants achetés chez Invitrogen) dans une
atmosphère à 37 °C, 5 % CO2, 100 % humidité.
Les cellules sont divisées tous les 3 à 4 jours lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 %
environ. Les cellules sont détachées du support avec de la Trypsine / EDTA (Invitrogen) et
réensemencées au tiers dans du milieu frais.
11.4. CellulesHEK
La lignée cellulaire HEK293 est dérivée de cellules embryonnaires de rein humaines ; la
lignée a été générée par la transformation de cellules primaires par l’adénovirus 5 DNA.
Les cellules croissent en adhérence et sont cultivées dans le « Minimal Essential Medium »
supplémenté par 10 % sérum de veau fœtal, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml pénicilline, 100
µg/ml streptomycine (composants achetés chez Invitrogen) dans une atmosphère à 37 °C, 5 %
CO2, 100 % humidité.
Les cellules sont divisées tous les 3 à 4 jours lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 %
environ. Les cellules sont détachées du support avec de la Trypsine / EDTA (Invitrogen) et
réensemencées au quart dans du milieu frais.
12. Essaideviabilitécellulaire
Les cellules sont ensemencées dans une plaque 96 puits (Greiner 655090) à une densité de
3.104 cellules pour TG01 ou 5.104 cellules pour HEK dans 100 µl de milieu. Les cellules sont
incubées avec chaque composé à différentes concentrations (1 – 500 µM) pendant 24h. La
viabilité cellulaire à 24h est déterminée par le kit luminescent « Cell Titer Glo » (Promega)
selon le protocole fourni. La luminescence est enregistrée sur un appareil Victor et les courbes
de titration sont analysées avec le complément Solver de Microsoft Excel d’après cette
équation :
MatérieletMéthodes
207
1
11
Avec S le signal enregistré, S0 le signal sans compose, S1 le signal obtenu pour l’effet
maximal, EC50 la concentration pour laquelle on obtient 50 % de l’effet maximal, n le nombre
de Hill.
13. Mesuresducalciumcytosolique
Deux jours avant l’expérimentation, les cellules sont ensemencées dans une flasque T75 de
façon ce qu’elles arrivent à 80 % de confluence 2 jours plus tard. Le jour de
l’expérimentation, les cellules sont lavées au PBS et incubées 45 min dans le noir à 37 °C
avec 5 µM Indo1-AM dans le tampon d’expérimentation (NaCl 137,5 mM, MgCl2 1,25 mM,
KCl 6 mM, Glucose 5,6 mM, Hepes 10 mM, NaH2PO4 0,4 mM, pH 7,2). Les cellules sont
ensuite rincées au PBS, resuspendues dans le tampon d’expérimentation et ensemencées à
5.104 cellules, 37,5 µl dans une plaque 384 puits (Greiner 781091) ; la plaque est centrifugée
5 min à 800 rpm. En parallèle, les molécules chimiques sont diluées en cascade (8 µM – 2
mM) dans le tampon d’expérimentation et 60 µl sont déposées dans une plaque 384 puits
(Greiner 784201) ; la digitonine (500 µM), l’EGTA (10 mM) et CaCl2 (25 mM) sont dilués
dans le même tampon et distribués dans la même plaque.
Chaque essai est réalisé en triplicat et robotiquement (FlexStation, Molecular Devices) ;
l’excitation est fixée à 385 nm, l’émission de la sonde Indo1 liée à Ca²+ à 401 nm et de la
sonde libre à 475 nm. Les lectures de fluorescence sont réalisées toutes les 5 secondes sur une
durée de 12 min à 24 °C. À t = 35 sec, 12,5 µl de composés sont ajoutés sur les cellules et à t
= 635 sec 12,5 µl de digitonine sont ajoutés. Les résultats sont analysés sous forme de ratio de
valeurs obtenues à 401 et 475 nm ; S est ensuite converti en [Ca²+] et l’EC50 de la
modification de la concentration cytoplasmique en Ca²+ est déterminée comme décrit au
Chapitre 2, point V-1.1.
MatérieletMéthodes
208
14. Extractiondesmembranescellulaires(ghosts)
Les cellules contenues dans 4 flasques 225 sont lavées au PBS et avec du tampon de lyse (10
mM Hepes pH7.4, 2 mM EGTA, cocktail d’inhibiteur de protéases). La lyse des cellules
s’effectue de façon mécanique dans du tampon de lyse (10 ml) par des allers-retours de la
suspension cellulaire à travers une aiguille 22G montée sur une seringue de 25 ml toutes les 5
– 10 min jusqu’à la lyse de plus de 90 % des cellules. Les débris cellulaires sont éliminés par
centrifugation (10 min, 3 000 rpm) et le surnageant est centrifugé 1h30 à 14 000 rpm. Les
ghosts membranaires sont resuspendus dans 300 µl de tampon de lyse, dosés par Bradford et
conservés à -20 °C.
15. Spectrométriedemasse
Cette analyse a été réalisée par la plateforme de Spectrométrie de Masse de Cronenbourg,
Laboratoire de Spectrométrie de masse BioOrganique, UMR 7178.
Les échantillons sont concentrés au Speedvac jusqu’à obtenir un volume de 60 µl, dénaturés
et déposés sur un gel 1D acrylamide (8 - 15 %) à migration lente ; le gel est ensuite fixé,
coloré au bleu de Coomassie, les pistes sont découpées de façon systématique en bandes de 2
– 4 mm de largeur et déposées en plaque 96 puits. Les bandes sont trypsines, les peptides sont
extraits du gel (solvant ACN/H2O/HCOOH) et évaporés (volume final 8 µl). Les échantillons
(5 µl) sont ensuite injectés sur nanoUPLC couplée au spectromètre de masse ESI-Q-TOF
Synapt ; les spectres de fragmentation des peptides sont comparés à ceux de la banque
SwissProt et les protéines sont annotées selon GO (gene onthology). Le critère de validation
de la présence d’une protéine est l’identification de 2 peptides de cette protéine avec un taux
de faux positifs nul.
209
Annexes
Annexes
Annexes
210
I. Anisotropiedefluorescence
Les molécules fluorescentes absorbent les photons ayant une longueur d’onde particulière et
émettent, dans un délai de quelques nanosecondes, à une autre longueur d’onde de plus faible
énergie. Un champ électromagnétique (tel que la lumière) peut induire des oscillations par
résonance des électrons d’un fluorophore. L’interaction entre la lumière et les électrons peut
permettre à une paire d’électrons de passer d’une orbitale S0 stable à un état d’excitation de
plus grande énergie (orbitale S1). La capacité d’un fluorophore à absorber une longueur
d’onde particulière (photon d’énergie donnée) est reliée à la capacité de chaque électron à
entrer dans un état excité ; cette valeur est définie expérimentalement par le coefficient
d’extinction molaire (ou coefficient d’absorption molaire) ε d’une molécule à une longueur
d’onde donnée. Un électron dans un état excité perd rapidement de l’énergie par relaxation
vibratoire entre états excités de haute énergie ; l’électron revient alors à un état de plus faible
énergie avec une émission de photon (de plus faible énergie que le photon absorbé
initialement). Cette différence d’énergie entre les longueurs d’onde d’excitation et d’émission
est connue sous le nom de «shift de Sokes ».
En 1946, Förster exploita cette théorie quantitative basée sur le transfert non radioactif
d’énergie d’excitation entre 2 fluorophores, basée sur l’interaction électrostatique de 2 dipôles
(donneur et accepteur) géographiquement proches (1 – 10 nm), distance caractéristique
d’interaction de molécules biologiques (Förster, 1946). Le transfert d’énergie de résonance de
Förster (FRET) est aujourd’hui utilisé dans de nombreux laboratoires pour mettre en
évidence l’interaction de cibles moléculaires (Erickson et al., 2001; Erickson et al., 2003;
Truong and Ikura, 2001). Une variante de FRET, homoFRET, se réfère au transfert d’énergie
entre 2 mêmes fluorophores dont les spectres d’émission et d’excitation se superposent ; cette
technique est notamment utilisée pour identifier des états d’oligomérisation d’une protéine
(Gautier et al., 2001). L’homoFRET a également été utilisé pour mesurer la liaison d’une
protéine marquée à une cible quelconque dans la cellule : la perte d’anisotropie (i.e. perte de
polarisation) d’émission lorsque le fluorophore est excité avec une lumière polarisée reflète la
modification des propriétés hydrodynamiques de la protéine marquée.
Dans une population de fluorophores orientés aléatoirement et excités par une lumière
polarisée, les molécules orientées parallèlement à l’axe de polarisation sont préférentiellement
excitées
polarisé
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Dans le
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Annexes
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211
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Annexes
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212
rescence,
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à une petite les mêmes
émettra une
Annexes
213
II. CaractérisationdesmoléculesinteragissantaveclaCalmoduline
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
Family I : Ethylene diamine N,N disubstituted
LPS 02‐ 10‐L‐A02
2,34 ± 0,04
6,00 ± 0
2,6 1 2,49E+05
‐1,9 5,5 76,1 11,4 2,8 14,4 2,7
LPS 02‐10‐L‐A07
0,72 ± 0,01
3,25 ± 0,07
4,5 84,7 5,7 7,2 7,5 11,0
LPS 02‐10‐L‐C08
3,26 ± 0,17
4,00 ± 0
1,2 2 5,20E+05
9,50E+06
3 1,7 9,6 11,2 62,4 14,5 2,4 18,9 4,3
LPS 02‐10‐L‐C09
2,75 ± 0,03
3,22 ± 0,08
1,2 1 1,24E+06
‐5,8 2,5 79 8,4 5,8 7,6 3,3
LPS 02‐10‐L‐D02
2,80 ± 0,81
3,47 ± 0,25
1,2 1 2,03E+05
‐2,5 4,7 76,6 10,1 6,3 9,9 2,6
LPS 02‐20‐L‐B03
1,27 ± 0,1
2,01 ± 0,02
1,6 1 1,09E+05
‐
15,4 ‐7,7 53,3
LPS 02‐20‐L‐B05
0,901 ±
0,004
1,654 ±
0,133 1,8 84,2 11,4 4,1 9,7 4,6
NNH2
O
COOHCOOH
NNH2
NH
S
OO
F
F
F
ClH
ClH
NNH2
OH
BrH
NNH2
COOHCOOH
NNH2
COOHCOOH
NNH2
NH
NHNH2
ClH
NNH2
ClClH ClH
Annexes
214
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
LPS 02‐20‐L‐C04
4,04 ± 0,2
3,63 ± 0,13
0,9 1 1,91E+06
3,8 12,4 75,7 31,3 4,6 32,1 13,6
LPS 02‐30‐L‐F05
3,40 ±0,01
3,81 ± 0,01
1,1 1 3,98E+05
‐1,5 6,1 96,1 67,7 2,1 48,5 3,4
Family II: Amino alkyl pyridazine and triazine
LPS 01‐02‐L‐B11
96 ± 2 106 ± 9
1,1 45,7
LPS 01‐02‐L‐D08
45 ± 2 43 ± 3 1,0 78,5
LPS 01‐05‐L‐B11
23,7 ± 0,04
16,5 ± 0,3
0,7 1 1,34E+05
‐5,3 1,7 65,7
LPS 01‐15‐L‐H06
6,5 ± 0,3
6,6 ± 0,1
1,0 1 6,20E+05
‐3,4 4,5 73,3 24,6 2,1 9,2 4,2
LPS 01‐17‐L‐E07
3,9 ± 0,2
4 ± 0,1 1,0 93,2 10,3 7,5 4,1 4,8
N
NH2
NH
O
F
F
F
ClH
ClH
NN
O
N
ClH ClH
N N
N NH
H Cl
HO
H
N N
O N
O
ClH
N N
O
N
O
ClH
N N
NH
N
ClH
ClH
N N
NH
N
ClH ClH
Annexes
215
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
LPS 01‐18‐L‐B10
4,8 ± 0,4
4,8 ± 0,4
1,0 1 7,56E+04
‐9,4 ‐2,8 84,2 37,3 2,5 53,3 3,0
LPS 01‐18‐L‐C06
0,65 ± 0,05
0,74 ± 0,09
1,1 100,4
18,3 5,3 15,9 19,7
LPS 01‐18‐L‐D04
1,85 ± 0,01
1,92 ± 0,15
1,0 1 2,95E+05
6 13,5 91,8 19,0 3,3 12,0 2,0
LPS 02‐03‐L‐A10
21,4 ± 0,3
20 ± 1 0,9 63,8
LPS 02‐03‐L‐D03
10 ± 0,6
10,6 ± 0,5
1,0 2 7,90E+04
9,00E+05
23,9 0,1 30,7 8,2 76,6 142,3
4,3 82,9 1,8
LPS 02‐20‐L‐A02
7,4 ± 0,1
7,7 ± 0,2
1,0 82,3 181,7
2,8 91,1 1,9
N N
NH
N
ClH ClH
N N
NH
N
ClHClH
N N
NH
N
ClHClH
N N
N
NH
N
COOHCOOH
N N
N
NH
N
COOHCOOH
N N
N
NH
N
OH
O
OH
O
Annexes
216
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
LPS 02‐20‐L‐C02
10,4 ± 0,6
11 ± 1 1,1 1 1,74E+05
‐1,7 5,4 50,5 68,0 3,4 41,5 2,8
Family III: Trifluoperazine an
alogues
TFP
0,86 ± 0,06
0,86 ± 0,05
1,0 136,4
8,6 96,0 2,1
Chlorpromazine
6,5 ± 0,1
6,4 ± 0,1
1,0 42,7 5,0 63,7 2,0
Fluphenazine
6,5 ± 0,2
6,3 ± 0,2
1,0 10,8 1,6 38,3 6,7
LPS 01‐12‐L‐G09
2,12 4,4 2,1 1 5,59E+04
‐4,9 1,6 11,3 4,8 8,5 6,8
PCL 09E06 – 685
1,96 ± 0,05
2,02 ± 0,15
1,0 1 6,16E+05
‐2,9 5 37,8 4,4 36,0 2,7
PCL 09F04 – 693
10,4 ± 0,6
11,5 ± 0,3
1,1 74,8 5,4 63,9 1,9
Cl
NN
NNH
NCOOHHOOC
NH
COOH
COOH
NN
NClH
N
S
N
NCH3
FF
F
N
S
NCH3
CH3
Cl
N
S
N
NCl
FF
F
N
S
NCH3
CH3
Annexes
217
N
N
Cl
CH3
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
PCL 09G07 – 706
5,5 6,1 1,1 1 1,53E+06
2,6 11,1 45,8 2,3 72,1 2,3
PCL 10G10 – 789
7,4 ± 0,1
7,3 ± 0,3
7,0 90,2 2,7 132,3
1,9
PCL 10H04 – 793
5,5 ± 0,7
4,9 ± 0,1
1,0 55,1 2,3 99,9 1,8
PCL 11A08 – 807
3,6 ± 0,01
3,6 ± 0,00
1,0 1 9,16E+04
‐5 1,8
Family IV
: Alkylene bis‐amidiniums. Biscations
LPS 02‐10‐L‐F11
4,5 ± 0,0
8,2 ± 0,5
1,8 27,7 1,8 52,1 2,2
LPS 02‐17‐L‐H11
1,10 ± 0,01
1,13 ± 0,04
1,1 1 3,77E+05
‐6,1 1,5 5,1 4,1 4,2 2,6
LPS 02‐18‐L‐A02
1,06 ± 0,07
1,25 ± 0,23
1,2 1 2,10E+05
‐5 2,2 3,6 4,7 3,4 4,6
O ON
CH3
CH3
NO
Cl
ClH
NNN
Cl
CH3
CH3
ClH
N+
NH2
N+
NH2
BrBr
N
NH3
+S
S
NH3
+
N
N
NH3
+S S
N
NH3
+
BrBr
Annexes
218
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
LPS 02‐18‐L‐A06
69 46 0,7
LPS 05‐01‐L‐D06
0,22 ± 0,00
0,38 ± 0,01
1,7 29,9 2,5 19,7 1,9
PCL 10F08 – 777 0,032 ±
0,003
0,16 ± 0,000
5,0 1 3,81E+05
‐3,5 4,1 5,7 2,4 8,8 4,7
Family V: Monocations (Quaternary am
moniums) and Nipecotates
derivatives
PCL 09G06 – 705
0,64 ± 0,20
1,19 ± 0,02
1,9 8,4 6,4 5,6 3,2
PCL 09G09 – 708
0,8 ± 0,5
1,1 ± 0,1
1,4 2 5,59E+06
1,96E+07
0,5 ‐0,5 9,7 9,5 14,1 2,5 11,6 2,9
LPS 01‐18‐L‐E03
1,18 ± 0,02
1,29 ± 0,01
1,1 35,3 2,2 22,6 6,1
LPS 01‐18‐L‐E04
5,53 ± 0,03
10,65 ± 0,24
1,9 88,2 4,2 70,1 5,5
Family VI : 6‐aryl‐
pyridazin‐4‐one LPS 01‐08‐L‐C07
36 ± 1 39 ± 9 1,1 1 2,00E+05
3,6 10,8 1000,6
1,2 2295,1
0,9
Family VII: Chalcones
and cyclic analogues
LPS 01‐09‐L‐F11
4,8 ± 0,3
4,4 ± 0,1
0,9 1 7,95E+05
‐4,6 3,4 34,5 4,9 21,8 1,7
Cl
N
SNH3
+
S N
NH3
+
Cl
Br
Br
NH
NH
NHCl
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NHCl
NN
NH
NHNH
NH
NNN
N
CH3
CH3
CH3CH3
OO
N+
N+
O
CH3
CH3
CH3
CH3
O
CH3
CH3CH3
NH
O
O
O
O
OH
O
OH
O
NH
O
O
O
O
OH
O
OH
O
N NH
OH
O
NHO
Cl
O
N
O
O
ClH
Annexes
219
O
O
OO
NH2
O
O
ClH
Famille chim
ique
Antagonistes
Compétition de liaison à CaM avec
les sondes
Caractéristiques thermodynamiques de liaison à CaM
Disponibilité
Induction de la mort cellulaire
Ki / S1 (µM)
Ki / S3 (µM) ra
tio
nb
sites Ka1
(M‐1) Ka2 (M‐1)
ΔH1 (kcal M‐1)
ΔH2 (kcal M‐1)
TΔS1
(kcal M‐1)
TΔS2
(kcal M‐1)
CHI EC50 HEK (µM)
nH HEK
EC50 TG01 (µM)
nH TG01
LPS 01‐08‐L‐G06
106 ± 11
104 ± 0
1,0
Family VIII: Carboxylic acids
LPS 02‐23‐L‐D05
6,1 ± 0,2
6,3 ± 0,3
1,0
LPS 01‐02‐L‐H11
43 ± 3 30 ± 0 0,7
Family IX
: Unclassified
LPS 01‐12‐L‐E04
3,7 ± 0,4
7,2 ± 0,2
1,9 157,0
4,1 146,2
4,1
LPS 02‐23‐L‐G10
5,9 ± 0,3
5,8 ± 0,2
1,0
PCL 11A11 – 810
6,5 ± 0,2
6,6 ± 0,4
1,0
O
Cl
O
N
O
O
O
ClH
NH
COOH
O
O
OH
Cl
NH
NH
O
NH2
O
NH
O
O
N+
O
OOH
N
N
S Cl
Cl
Cl
Annexes
220
III. PeptidesetconstantesdedissociationàCaMenfonctionde[Ca²+]
La séquence peptidique du peptide 30, indiquée comme représentant le domaine PreIQ du canal CaV1.1 représente également le domaine PreIQ du canal CaV1.2. La liaison de chaque peptide a été testée avec SynCaM (VU1) et la CaM humaine (human). Le nombre du Ca²+ nécessaires à l’interaction CaM – peptide déduit des valeurs A-1, B-1, C-1, D-1, E-1 est indiqué dans la dernière colonne.
Lab
numberPeptide Sequence CaM A‐1 (µM) B‐1 (µM) C‐1 (µM) D‐1 (µM) E‐1 (µM)
nb
Ca²+
VU1 4,5E+01 3,7E‐03 3,7E‐03 3,7E‐03 3,7E‐03 1human 1,0E+02 6,1E‐03 6,1E‐03 6,1E‐03 6,1E‐03 1VU1 4,9E+02 4,9E+02 4,9E+02 3,0E+02 3,9E‐02 4
human 1,8E+02 1,8E+02 1,8E+02 1,8E+02 8,2E‐03 4
VU1 2,6E+00 2,6E+00 3,3E‐04 3,3E‐04 3,3E‐04 2human 2,2E+00 2,2E+00 1,4E‐04 1,4E‐04 1,4E‐04 2VU1 9,6E+01 9,6E+01 3,9E‐02 3,9E‐02 3,9E‐02 2
human 7,6E+01 7,6E+01 1,0E‐02 1,0E‐02 1,0E‐02 2VU1 8,3E+00 8,3E+00 8,3E+00 4,4E‐04 4,4E‐04 3
human 2,1E+00 2,1E+00 2,1E+00 2,7E‐04 2,7E‐04 3VU1 1,0E+02 1,1E‐02 1,1E‐02 1,1E‐02 1,1E‐02 1
human 1,0E+02 9,5E‐03 9,5E‐03 9,5E‐03 9,5E‐03 1VU1 6,3E+01 6,3E+01 6,3E+01 2,2E‐04 2,2E‐04 3
human 3,7E+01 3,7E+01 3,7E+01 6,6E‐05 6,6E‐05 3VU1 3,7E+02 3,7E+02 3,2E‐01 3,2E‐01 3,2E‐01 2
human 3,8E+02 3,8E+02 5,9E‐01 5,9E‐01 5,9E‐01 2VU1 1,1E+01 1,1E+01 1,1E‐03 1,1E‐03 1,1E‐03 2
human 1,6E+01 1,6E+01 9,4E‐04 9,4E‐04 9,4E‐04 2VU1 3,4E+02 3,4E+02 3,4E+02 3,4E+02 3,7E‐01 4
human 4,0E+02 4,0E+02 4,0E+02 4,0E+02 1,3E‐01 4VU1 2,2E+02 2,2E+02 2,1E+00 2,1E+00 2,1E+00 2
human 1,2E+02 1,2E+02 2,0E+00 2,0E+00 2,0E+00 2VU1 3,3E+00 3,3E+00 3,3E+00 3,3E+00 1,1E‐05 4
human 2,1E+00 2,1E+00 2,1E+00 2,1E+00 1,5E‐05 4
VU1 6,5E+01 1,7E‐02 1,7E‐02 1,7E‐02 1,7E‐02 1human 3,2E+00 2,7E‐02 2,7E‐02 2,7E‐02 2,7E‐02 1VU1 1,8E+01 1,8E+01 1,4E‐03 1,4E‐03 1,4E‐03 2
human 3,2E+00 3,2E+00 2,1E‐05 2,1E‐05 2,1E‐05 2VU1 1,1E+02 3,2E‐03 3,2E‐03 3,2E‐03 3,2E‐03 1
human 5,1E‐02 6,2E‐03 6,2E‐03 6,2E‐03 6,2E‐03 1VU1 4,7E+00 4,7E+00 2,5E‐05 2,5E‐05 2,5E‐05 2
human 5,9E+00 1,1E‐02 1,1E‐02 1,1E‐02 1,1E‐02 1VU1 1,8E+01 1,8E+01 9,1E‐04 9,1E‐04 9,1E‐04 2
human 2,8E+01 2,8E+01 2,7E‐03 2,7E‐03 2,7E‐03 2VU1 2,8E+01 4,2E‐01 4,8E‐04 5,9E‐04 6,7E‐04 2
human 6,1E+00 1,2E+00 7,3E‐04 7,3E‐04 7,3E‐04 2VU1 5,8E+01 5,8E+01 1,6E‐02 1,6E‐02 1,6E‐02 2
human 2,0E+01 2,0E+01 2,3E+00 2,3E+00 2,4E‐02 2VU1 1,7E+01 1,7E+01 6,5E+00 7,2E‐04 7,2E‐04 2
human 1,9E+01 1,9E+01 8,6E‐04 8,6E‐04 8,6E‐04 2VU1 3,4E+02 3,4E+02 3,4E+02 5,6E‐04 5,6E‐04 3
human 3,6E+02 3,6E+02 3,6E+02 6,8E‐03 6,8E‐03 3VU1 6,0E+00 6,0E+00 4,5E‐03 4,5E‐03 4,5E‐03 2
human 2,4E+00 2,4E+00 3,6E‐03 3,6E‐03 3,6E‐03 2VU1 5,4E+00 5,4E+00 2,3E‐03 2,3E‐03 2,3E‐03 2
human 1,8E+00 1,8E+00 7,3E‐04 7,3E‐04 7,3E‐04 2
VU1 2,4E+01 2,4E+01 1,8E‐03 1,8E‐03 1,8E‐03 2human 6,6E‐01 6,6E‐01 1,7E‐03 1,7E‐03 1,7E‐03 2
VU1 6,5E+01 6,5E+01 8,0E‐03 8,0E‐03 8,0E‐03 2human 3,2E+01 3,3E+01 9,4E‐01 4,9E‐04 5,7E‐04 2
VU1 6,1E+01 6,1E+01 3,3E‐03 3,3E‐03 3,3E‐03 2human 2,1E+02 2,1E+02 4,7E‐04 4,7E‐04 4,7E‐04 2
VU1 6,1E+00 6,1E+00 6,1E+00 1,2E‐03 1,2E‐03 3human 5,1E+00 5,1E+00 4,5E‐01 8,5E‐03 8,5E‐03 3VU1 9,5E‐01 9,5E‐01 3,2E‐03 3,2E‐03 3,2E‐03 2
human 4,9E+01 4,9E+01 6,8E‐04 6,8E‐04 6,8E‐04 2VU1 1,8E+02 1,8E+02 1,8E+02 2,0E‐01 2,0E‐01 3
human 1,9E+02 1,9E+02 1,9E+02 2,1E‐01 2,1E‐01 3VU1 8,6E‐01 8,6E‐01 6,5E‐04 6,5E‐04 6,5E‐04 2
human 1,6E‐01 1,6E‐01 2,1E‐03 2,1E‐03 2,1E‐03 2
VU1 3,0E+02 3,0E+02 3,0E+02 6,8E‐02 6,8E‐02 3human 3,2E+02 3,2E+02 1,4E‐01 1,4E‐01 1,4E‐01 2VU1 7,3E+01 7,3E+01 7,3E+01 1,6E‐02 1,6E‐02 3
human 7,0E+01 7,0E+01 7,0E+01 1,8E‐02 1,8E‐02 3VU1 1,8E+04 1,9E‐02 1,9E‐02 1,9E‐02 1,9E‐02 1
human 6,9E+02 5,4E‐02 5,4E‐02 5,4E‐02 5,4E‐02 138 GAD (glutamate decarboxylase) HKKTDSEVQLEMITAWKKFVEEKKKK
Autres
20Heat Shock Protein 90 ‐ beta (Hsp84)
(Hsp90), humanNSAFVERVRKRGFEVV
21 Neuromodulin TKIQASFRGHITRKKLKGE
36 SERCA1 NELPAEEGKTLWELVIEQFEDLL
14CAP‐23/NAP‐22 (neuronal axonal membrane
protein, brain acid soluble protein 1)GGKLSKKKKGYNVNDEKAKE
23 MYOSIN‐5A , human CIRIQKTIRGWLLRKKYLRM
Modulation du cytosquelette
5 MARCKS KKRFSFKKSFKLSGFSFKK
7 alphaII‐spectrin SPWKSARLMVHTVATFNSI
cAMP signal
17 PDE1A KPRFRSIVHVVQAGIFVERM
Phosphatases
3 calcineurin, alpha isoform AAARKEVIRNKIRAIGKMARVFSVL
NO signal
6 Nitric‐oxide synthase, endothelial RKKTFKEVANAVKISASLMG
42 CaMkII alpha IKKFNARRKLKGAILTTMLATRNFS
43 CamKII gamma LRKFNARRKLKGAILTTMLVSRNFS
40 PHK5 LRRLIDAYAFRIYGHWVKKGQQQNR
41 PHK13 GKFKIVCLTVLASVRIYYQYRRVKP
24 DAPK RKKWKQSVRLISLCQRLSR
25 DAPK_Phos RKKWKQEVRLISLCQRLSR
11 sk‐Myosin l ight chain kinase (sk‐MLCK) KRRWKKNFIAVSAANRFKKI
12 sm‐Myosin l ight chain kinase (sm‐MLCK) RRKWQKTGNAVRAIGRLSSM
8Ca2+‐calmodulin‐dependent kinase kinase
alpha (CaMKK)VKLIPSWTTVILVKSMLRKRSFGNPF
10 DAPK2 RRRWKLSFSIVSLCNHLTR
39 EGFR RRRHIVRKRTLRRLLQ
Kinases
4Calmodulin‐Dependent Protein Kinase I
(CaMKI)IKKNFAKSKWKQAFNATAVVRHMRK
34 Cav2.1 (c) LMAHESGLKESPSWVTQRAQEMF
35 Cav 3.1 RRRAPSSDSKDPLASGPPDSMAASPSPKK
32 Cav2.1 (a) DAELRKEMMAIWPNLSQKTLDLL
33 Cav2.1 (b) KIYAAMMIMEYYRQSKAKKLQ
30 Cav1.1 (a) NEELRAIIKKIWKRTSMKLL
31 Cav1.1 (b) KFYATFLIQEHFRKFMKRQEE
18 potassium (K+) channel (SK1) QRKFLQAIHQAQKLRSVKIE
22 Serotonin 5‐HT (1A) receptor ‐1 YGRIFRAARFRIRKTVKKVEKTG
13 Cardiac Ca(v)1.2; alpha‐1C KFYATFLIQEYFRKFKKRKEQ
Pompes
1 Plasma membrane calcium pump (PMCA) LRRGQILWFRGLNRIQTQIK
Cannaux et Récepteurs
Annexes
221
IV. DéplacementdespeptidesliésàCaMparchaquemolécule–IC50
Les peptides sont désignés par la dénomination Px où x représente le numéro du peptide présenté dans l’Annexe III.
IC50 (µM)
P1
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P10
P11
P12
P13
P14
P17
P18
P20
P21
P22
P23
P30
P31
P33
LPS 02‐10‐L‐A02
718
1 992
1 602
81138
122
506
862
3 165
522
999
13160
5415
1310
69482
96420
LPS 02‐10‐L‐A07
188
316
4824
2831
135
183
1 376
109
232
1473
1016
813
4864
28173
LPS 02‐10‐L‐C08
767
2 608
2 131
100
204
170
598
1 007
2 474
536
1 015
11266
8318
1612
113
923
196
607
LPS 02‐10‐L‐C09
248
262
417
2034
39156
294
676
132
329
452
146
43
16258
44177
LPS 02‐10‐L‐D02
640
1 154
1 428
67124
127
495
797
3 635
581
948
1697
8023
235
23595
74284
LPS 02‐20‐L‐B03
601
2 063
3 848
96172
189
631
1 419
3 378
719
2 023
4654
608
310
186
608
332
1 167
LPS 02‐20‐L‐B05
181
221
302
2138
30117
204
349
113
233
832
1311
63
13266
33158
LPS 02‐20‐L‐C04
883
1 923
2 673
68117
86387
760
2 141
354
826
7112
379
77
45570
111
510
LPS 01‐02‐L‐D08
158 869
2 183
13 684
6 221
11 130
2 621
82 149
74 805
6 325
11 705
17 735
554 420
751
110
109
5 425
6 595
35 573
6 405
8 512
LPS 01‐05‐L‐B11
10 211
1 963
34 508
10 713
10 899
7 517
6 124
5 718
15 894
8 213
11 192
219 993
1 810
5577
6 605
8 821
16 884
10 046
15 665
LPS 01‐15‐L‐H06
6 127
354
16 250
178
303
708
2 547
18 653
2 901
2 639
7 633
7471
9921
18961
3 240
1 519
815
8 175
LPS 01‐18‐L‐B10
1 146
896
2 163
160
303
180
900
1 167
870
1 203
1 723
8317
100
1515
294
548
843
281
555
LPS 02‐03‐L‐A10
6 378
3 708
4 099
1 525
3 052
3 093
5 874
2 045
20 266
6 594
12 054
365 009
818
89112
2 499
17 516
13 000
15 616
3 479
LPS 02‐03‐L‐D03
5 470
1 705
2 072
380
782
711
1 559
1 864
4 214
3 266
5 779
30755
200
3846
639
1 303
10 000
1 984
2 834
LPS 02‐20‐L‐A02
6 187
1 277
1 903
304
837
1 209
2 514
2 464
5 201
5 547
5 143
151 418
194
3227
447
906
4 903
487
1 702
LPS 02‐20‐L‐C02
3 622
2 224
1 869
341
636
1 447
2 098
1 490
4 180
2 601
6 234
17406
188
3836
396
978
3 289
1 141
2 558
LPS 01‐12‐L‐G09
488
135
281
3065
64252
217
1 036
286
639
960
1911
855
208
358
139
400
LPS 02‐10‐L‐F11
447
201
269
52130
98238
249
1 194
424
721
9161
3618
15108
216
231
155
326
LPS 02‐17‐L‐H11
3 329
1 010
6450
391
54 562
4 327
48 878
49 075
9 705
32 548
164
3143
15 131
20 000
1 546
23 182
LPS 02‐18‐L‐A02
1 752
479
2 049
31163
130
995
1 988
2 355
2 308
10 428
5224
126
483
630
14 783
281
7 997
LPS 02‐18‐L‐A06
2 212
4 496
7 235
3 711
10 134
3 196
9 943
12 231
11 817
11 842
12 208
158
11 412
796
272
409
8 266
24 277
8 373
7 911
37 868
LPS 05‐01‐L‐D06
6517
404
63
4062
8147
121
49
35
27
3929
15288
LPS 01‐02‐L‐H11
2 382
5 855
2 015
1 268
10 327
6 704
2 090
2 361
3 255
3 369
3 698
1413 637
7 061
4348
516
2 000
29 894
6 414
2 600
LPS 01‐08‐L‐C07
2 334
3 340
1 461
819
10 363
10 928
2 154
4 378
4 471
4 331
758
2 356
1 400
111
68884
666
23 588
3283
LPS 01‐08‐L‐G06
2 418
4 194
9 946
11 044
10 075
2 606
10 142
11 806
11 447
11 291
12 257
2124 480
9 302
3336
33 971
18 565
12 222
8 227
44 062
LPS 01‐09‐L‐F11
1 412
524
1 710
87200
156
777
1 279
1 597
1 622
10 220
7211
6512
12152
3 316
2 127
166
1 263
LPS 01‐12‐L‐E04
2 154
662
1 045
91296
931 037
1 317
1 952
1 500
9 997
10276
3615
19304
6 317
2 086
175
2 683
LPS 01‐18‐L‐E03
7148
6519
2123
62161
148
115
166
2335
1335
1245
252
1914
31
LPS 01‐18‐L‐E04
189
125
129
3550
66158
463
447
284
439
2282
3428
2066
557
385
239
575
LPS 02‐23‐L‐D05
10 428
8 497
6 048
182
5 951
3 035
4 011
4 245
4 419
4 434
10 135
2147
4 267
2423
1 277
2 907
14 973
9 948
5 357
LPS 02‐23‐L‐G10
10 262
10 112
10 246
9 704
10 398
3 632
50 142
52 693
50 154
48 711
10 050
2151
461
2833
3 838
907
5 317
7 707
11 893
W7
751
519
578
94133
106
394
856
790
430
614
11192
7614
18157
1 222
507
305
732
W13
1 053
898
1 036
224
314
226
885
834
1 272
746
1 476
12366
129
1318
347
1 694
785
464
1 030
Calmidazolium
812
1211
54
810
1142
497
75
95
711
2522
26
Clorpromazine
251
436
323
6087
97266
318
1 104
611
1 061
9183
4319
17102
226
213
177
189
Bifonazole
20 374
10 136
11 337
21 126
20 076
2 667
50 091
82 319
128 604
45 285
33 986
5767
106
8675
32 131
28 912
50 000
40 000
14 758
Fluphenazine
602
828
737
237
422
314
3 293
1 618
2 445
2 032
3 086
17325
8134
31224
826
529
397
295
Phenoxybenzamin
25 846
21 854
22 733
21 248
20 763
1 848
33 535
49 073
33 760
23 471
31 692
4041
150
1614
1 009
2 382
176 878
17 763
7 914
Compound48/80
508
2216
710
1419
2921
158
143
1121
813
510
2712
816
TFP
95187
137
2953
36152
258
496
220
354
649
1310
739
114
1 307
940
1 349
PCL 09E06
5 410
3 486
3 639
446
941
2 383
4 806
6 872
30 941
3 650
9 417
83 871
296
1214
1 052
2 981
10 135
1 161
1 118
PCL 09F04
1 002
1 043
1 146
216
488
344
1 492
2 002
5 108
2 849
2 914
22582
130
3750
333
500
660
443
302
PCL 09G06
2519
2410
138
1924
7841
404
114
74
919
1410
19
PCL 09G07
6 178
654
1 119
229
429
370
2 048
1 502
3 093
3 281
9 870
20396
131
2835
339
858
2 870
614
1 146
PCL 09G09
5742
6117
2518
5760
128
72156
1020
812
622
3730
2141
PCL 10G10
29 705
1 560
1 864
298
593
546
5 040
2 505
5 302
4 734
10 130
31519
163
4452
475
1 449
5 850
848
2 017
PCL 10H04
10 441
1 163
1 533
274
560
363
3 777
2 005
5 155
4 676
10 119
19518
148
2430
497
3 384
22 861
964
2 871
PCL 10F08
106
94
53
710
2614
194
42
62
46
N/A
N/A
N/A
PCL 11A08
7 619
4 372
4 982
979
2 110
1 630
10 215
4 999
5 513
6 023
10 153
133 884
561
1839
1 878
66 078
773 075
30 998
9 306
PCL 11A11
7 577
6 299
7 199
7 053
9 247
2 642
10 266
30 008
30 025
28 984
10 149
2536
3737
2983
38 795
8 450
11 615
6 355
PCL 11H09
6 935
10 621
11 641
30 840
31 310
53158
120
370
266
400
6 617
29 911
12 361
8 351
8 800
59 747
59 800
138 931
15 896
27 032
Annexes
222
V. Modification de l‘homéostasie calcique par des antagonistes de la
Calmoduline–EC50
TG01
TG10
TG16
OB1
U87
HEK
TG01
TG10
TG16
OB1
U87
HEK
LPS02‐10‐L‐A02
2,34
85 ± 6
110
75 ±
713
071
± 1
410
0 ±
26120 ± 16
120
175
± 7
180
120
± 34
190
± 26
LPS02‐10‐L‐A07
0,72
60 ± 0
100
7080
93 ±
19
164
± 41
LPS02‐10‐L‐C08
3,26
123 ± 15
160
100
150
98 ±
15
140
± 36
140 ± 20
150
± 28
160
200
140
± 23
200
± 16
LPS02‐10‐L‐C09
2,75
127 ± 23
140
7013
012
0 ±
1713
3 ±
626
0 ±
1418
0 ±
17
LPS02‐10‐L‐D02
2,8
123 ± 15
140
± 28
8013
010
0 ±
1410
8 ±
19165 ± 37
185
± 7
220
207
± 31
207
± 42
LPS02‐20‐L‐B03
1,27
LPS02‐20‐L‐B05
0,901
8590
9015
050
± 0
46 ±
12
60 ± 0
8580
7077
± 6
93 ±
3
LPS02‐20‐L‐C04
4,04
130
150
100
165
133
± 15
180
± 22
7070
120
180
200
± 2
210
± 28
LPS01‐05‐L‐B11
23,7
‐-
-‐
--
LPS01‐15‐L‐H06
6,5
145
± 21
153 ± 53
200
148
± 32
200
214
± 23
163
± 23
LPS01‐18‐L‐B10
4,8
120
85100
290
± 14
7016
5 ±
2115
5 ±
26
LPS02‐03‐L‐D03
10142 ± 33
330
320
183
± 32
218
± 38
198 ± 33
240
170
200
290
± 71
196
± 50
LPS02‐20‐L‐A02
7,4
118 ± 25
240
145
± 7
190
173
± 31
17 ±
6
LPS02‐20‐L‐C02
10,4
144 ± 22
120
140
250
173
± 32
123
± 6
133 ± 36
125
175
± 21
227
± 23
180
± 30
LPS02‐10‐L‐F11
4,5
100
80
LPS02‐17‐L‐H11
1,1
LPS02‐18‐L‐A02
1,06
58 ± 26
8045
63 ±
29
LPS05‐01‐L‐D06
0,22
80 ± 28
6050
7045
± 2
170
± 8
PCL10F08‐777
0,032
PCL09E06‐685
1,96
84 ± 16
9580
115
88 ±
19
134
300
PCL09F04‐693
10,4
127 ± 6
160
± 28
110
180
176
± 17
211
± 55
PCL09G07‐706
5,5
87 ± 12
100
85 ±
24
85 ±
929
0 ±
1430
031
3 ±
4818
0 ±
0
PCL10G10‐789
7,4
180
± 32
365 ± 21
350
380
± 28
350
365
± 24
347
± 37
PCL10H04‐793
5,5
253
± 15
218 ± 57
240
± 14
280
350
± 50
292
± 58
PCL11A08‐807
3,6
290
± 14
240
± 10
260
± 42
167 ± 41
230
± 0
195
± 21
260
± 28
310
± 14
280
± 44
LPS01‐12‐L‐G09
2,12
LPS01‐18‐L‐E03
1,18
195 ± 19
180
250
300
266
± 23
220
± 57
LPS01‐18‐L‐E04
5,53
170
90 ± 10
118
± 18
120
110
133
± 59
102
± 22
LPS02‐23‐L‐D05
6,1
LPS01‐09‐L‐F11
4,8
155 ± 7
160
150
± 42
200
± 28
156
± 26
170
167 ± 15
140
135
± 21
205
± 7
155
± 31
167
± 49
PCL09G06‐705
0,64
50
PCL09G09‐708
0,8
80
LPS01‐12‐L‐E04
3,7
118
± 18
100 ± 18
230
230
8027
5 ±
3523
3 ±
61
LPS02‐23‐L‐G10
5,9
80 ± 14
110
95 ±
49
8073
± 1
264
± 2
4
PCL11A11‐810
6,5
73 ± 22
120
130
91 ±
26
85 ±
7
PCL11H09‐878
4,2
Composés
Ki
(µM
)REPONSESTRANSITOIRES‐EC50(µM)
REPONSESPERMANENTES‐EC50(µM)
VI. Mo
Cal
Représentaaux valeurmolécules
A
B
dification
moduline
ation des valeurs Ki de chaqu.
n de l‘ho
e–Relatio
urs EC50 obtenue molécule. Le
oméostasi
onsEC50/
ues sur les cellue rapport EC50 /
Annexes
ie calciq
/Ki
ules pour les ré/ Ki de chaque
que par
éponses transitomolécule perm
des anta
oires (A) et permet de distingue
agonistes
rmanentes (B) er 3 différents
223
de la
par rapport groupes de
Annexes
224
VII. Élémentsducalcium toolkit impliquésdans lesmécanismesONetOFF
dusignalcalcium
Famille Nom Gene Gene ID
Localisation principale Fonctions biologiques principales Maladies liées à une déficience / surexpression / épissage alternatif
Références
MECANSIMES ON
Voltage operated calcium channels (VOCs)
L‐type
CaV1.1 CACNA1S 779 muscles squelettiques couplage excitation‐contraction, régulation de l'expression génique
paralysie hypocalémique périodique 1, 2
CaV1.2 CACNA1C 775 muscles cardiaques et lisses, cellules endocrines, neurones
couplage excitation‐contraction, sécrétion endocrine, intégration synaptique, régulation de l'expression génique
syndrome de Timothy, arythmie cardiaque, hypertension, infarctus chronique du myocarde, autisme
1, 2
CaV1.3 CACNA1D 776 cellules endocrines, neurones, myocytes cardiaques, cellules ciliées auditives, rétine
sécrétion endocrine, pacemaker cardiaque, régulation synaptique, régulation de l'expression génique
1, 2
CaV1.4 CACNA1F 778 rétine, moelle épinière, glandes adrénaliennes, mastocytes
relâchement de neurotransmetteurs perte de la vision nocturne 1, 2
P/Q‐type CaV2.1 CACNA1A 773 neurones, cellules neuroendocriniennes
relâchement de neurotransmetteurs et hormones, signaux calciques transitoires dendritiques
ataxie spino‐cérébrale de type 6, ataxie épisodique de type 2, migraine hémiplégique familiale
1, 2
N‐type CaV2.2 CACNA1B 774 neurones, cellules neuroendocriniennes
relâchement de neurotransmetteurs et hormones, signaux calciques transitoires dendritiques
migraine hémiplégique familiale, ataxie cérébrale, douleur
1, 2
R‐type CaV2.3 CACNA1E 777 neurones potentiels d'action, relâchement de neurotransmetteurs, signaux calciques transitoires des dendrites
douleur 1, 2
T‐type
CaV3.1 CANCA1G 8913 neurones, muscles cardiaques et squelettiques
pacemaking, potentiels d'action répétitifs épilepsie absences 1, 2
CaV3.2 CACNA1H 8912 neurones, muscle cardiaques pacemaking, potentiels d'action répétitifs épilepsie absences 1, 2
CaV3.3 CACNA1I 8911 neurones épilepsie absences 1, 2
Receptor operated calcium channels (ROCs)
Récepteurs NMDA, au glutamate
NR1 GRIN1 2902 cerveau (hippocampe, cortex cérébral, cérébellum)
transmission synaptique, régulation de gènes, modulation de CREB, sensibilité à la douleur aigüe
retard mental (processus de mémoire verbale altérée, susceptibilité de schizophrénie
3‐9
NR2A GRIN2A 2903 cerveau transmission synaptique, régulation de gènes, modulation de CREB, sensibilité à la douleur aigüe
épilepsie avec lésions du développement neural
5, 10‐12
NR2B GRIN2B 2904 cerveau plasticité synaptique, morphogenèse neuronale
retard mental 11‐16
NR2C GRIN2C 2905 cerveau transmission synaptique, régulation de gènes, modulation de CREB, sensibilité à la douleur aigüe
17
NR2D GRIN2D 2906 cerveau animaux: réduction de l'activité spontanée dans un test "open field"
13, 18
NR3A GRIN3A 2906 cerveau développement d'éléments synaptiques, canal imperméable à Ca²+
19, 20
NR3B GRIN3B 116 444
cerveau, neurones moteurs diminution de l'amplitude du courant calcique et de la perméabilité du récepteur à Ca²+
pas de phénotype: absence compensée par d'autres protéines
19‐21
Récepteurs ATP, purinergiques
P2X1 P2RX1 5023 plaquettes et cellules sanguines différenciation des monocytes maladies sanguines, modèles animaux: réduction de la fertilité chez les mâles
22‐26
P2X2 P2RX2 22 953 cœur, cerveau, pancréas transmission synaptique réduction / perte du goût 27, 28
P2X3 P2RX3 5024 moelle osseuse, cœur transmission synaptique réduction / perte du goût, modèles animaux : perte de la sensation de douleur périphérique
28‐31
Annexes
225
Famille Nom Gene Gene ID
Localisation principale Fonctions biologiques principales Maladies liées à une déficience / surexpression / épissage alternatif
Références
P2X4 P2RX4 5025 monocytes, cellules endothéliales, neurones
différenciation des monocytes, allodynie tactile
perte de l'allodynie tactile, pas de vasoconstriction,‐ dilatation suite aux changements de pression sanguine (modèles animaux)
26, 32, 34
P2X5 P2RX5 5026 cerveau, système immunitaire, muscles
différenciation des granulocytes, monocytes
leucémie 26, 35
P2X6 P2RX6 9127
P2X7 P2RX7 5027 cerveau, système immunitaire, muscles
thrombose 36‐38
P2Y1 P2RY1 5028 ubiquitaire différenciation des monocytes pas d'agrégation des plaquettes 26, 38‐41
P2Y2 P2RY2 5029 développement et régénération neuronale, migration des neutrophiles et phagocytes
fibrose cystique 42, 43
Récepteur nAch
NACHR CHRNA4 1137 synapses transmission rapide du signal épilepsie nocturne du lobe frontal 44
Second messenger operated calcium channels (SMOCs)
cyclic nucleotide gated channels
CNGA1 CNGA1 1259 bâtonnets visuels phototransduction dégénérescence des bâtonnets visuels, achromatie
45, 46
CNGA2 CNGA2 1260 épithélium olfactif, aorte 47, 48
CNGA3 CNGA3 1261 photorécepteurs des cônes et des neurones olfactifs
transduction sensorielle des photorécepteurs et neurones olfactifs
vision monochromatique, achromatie 49‐53
CNGA4 CNGA4 1262 transduction des signaux odorants, adaptation aux signaux olfactifs
54‐56
CNGB1 CNGB1 1258 phototransduction "retinitis pigmentosa" 57‐59
CNGB3 CNGB3 54 714 transduction sensorielle des photorécepteurs des cônes et des neurones olfactifs
achromatie 52, 60, 61
Tyrosine kinase linked receptors (TRPs)
TRPA TRPA1 ANKTM1 système nerveux, cœur, intestin, poumon, peau, rein, pancréas
sensation au froid, à un stimulus mécanique
douleur inflammatoire, hyperalgésie au froid, hypersensibilité mécanique
63, 65
TRPC
TRPC1 TRPC1 7220 système nerveux central, cellules de Purkinje
canal mécano‐sensitif 66‐69
TRPC2 TRPC2 7221 Souris : organe voméronasal 69, 70
TRPC3 TRPC3 7222 système nerveux central vasorégulation (résistance artérielle) 69, 71‐74
TRPC4 TRPC4 7223 système nerveux central, cœur, pancréas, placenta, rein
vasorégulation, perméabilité microvasculaire? motilité gastro‐intestinale
69, 75, 76
TRPC5 TRPC5 7224 système nerveux central, muscles lisses gastriques
"growth cone morphology", extension des "neurites"
67, 69, 77
TRPC6 TRPC6 7225 système nerveux central, muscle lisse? Dendrites de l'hippocampe, synapses
vasorégulation (résistance artérielle), "kidney podocyte regulation"
cardiomyopathie (hypertrophie) 69, 72, 78, 79
TRPC7 TRPC7 57 113 rein, intestine, glande pituitaire, cerveau
69, 72, 80
TRPV
TRPV1 TRPV1 7442
ganglio trigeminal, rein, pancréas, placenta, testicules, utérus, rate, estomac, intestin grêle, poumon, foie
nociception induite par la chaleur, hyperalgésie d'inflammation thermique, toux chronique, sensibilisation bronchiale
défauts de nociception, maladie inflammatoire de bowel (surexpression), vulvodynie, ostéoarthrose
69, 81‐85
TRPV2 TRPV2 51 393 cerveau, ganglion trigeminal, corde spinale, poumon, rate, intestin
douleur thermique, dégénération de muscles cardiaque et squelettique, "osmo‐sensing" dans les myocytes aortiques
dystrophie musculaire et cardiomyopathie (surexpression)
69, 86, 87
Annexes
226
Famille Nom Gene Gene ID
Localisation principale Fonctions biologiques principales Maladies liées à une déficience / surexpression / épissage alternatif
Références
TRPV3 TRPV3 162 514
cerveau, peau, testicules, estomac, langue, trachée, intestin grêle, placenta, follicules pileux, adipocytes
sensation de chaleur, douleur "mild temp‐related pain deficit" 69, 88, 89
TRPV4 TRPV4 59 341
cerveau, poumon, rate, rein, testicules, cœur, prostate, pancréas, placenta, glandes salivaires
"CNS osmatic sensing", hyperalgésie thermique
neuropathie motrice et sensorielle 69, 90‐92
TRPV5 TRPV5 56 302 rein, prostate, testicules, placenta, pancréas, cerveau
absorption du Ca²+ dans le rein diabète, hyperalcémie hypocalciurique, adénocarcinomes (surexpression)
69, 93‐95
TRPV6 TRPV6 55 503
intestins, estomac, rein, poumon, rate, foie, cerveau, placenta, prostate, pancréas, glandes adrénaliennes, peau
absorption du Ca²+ dans le rein et l'intestin
alopécie, "dermatitis", adénocarcinomes (surexpression)
69, 96, 97
TRPM
TRPM1 TRPM1 4308 peau, mélanocytes, épithélium pigmenté de la rétine
invasivité des mélanomes 69, 98, 99
TRPM2 TRPM2 7226
cellules gliales, immunitaires, cellules bêta du pancréas, cerveau, thymocytes, endothélium vasculaire
senseur de stress oxydatif dans les cellules immunitaires
troubles bipolaires, surdité héréditaire non syndromique
69, 100‐102
TRPM3 TRPM3 608 961
rein, endothélium pulmonaire, foie, pancréas, ovaires, testicules, corde spinale, cerveau, iris, cellules pigmentés de la rétine
sensation osmotique, homéostasie calcique rénale, mécanosenseur
gène candidat pour l'ALS avec démence fronto‐temporelle, cataracte précoce
69, 103
TRPM4 TRPM4 54 795 estomac, endothélium des artères, œsophage, pancréas, rein, cerveau
sensation du goût, oscillations de Ca dans les cellules T, effet bayles dans les muscles lisses, dépolarisation hypoxique
hypertrophie cardiaque, arythmie 69, 87, 104
TRPM5 TRPM5 29 850 langue, estomac, intestins, utérus, testicules
sensation du goût candidat pour le rhabdomyosarcome, tumeur de Wilms, Beckwith‐Widemann
69, 105, 106
TRPM6 TRPM6 140 803
intestin grêle, rein absorption rénale et gastrointestinale de Mg²+
hypomagnesemia avec hypocalcémie secondaire
69, 107
TRPM7 TRPM7 605 692
ubiquitaire relâchement des neurotransmetteurs, mort cellulaire induite par l’anoxie
sclérose latérale amyotrophique guamanienne, démence de parkinson
69, 108‐110
TRPM8 TRPM8 79 054 ganglions trigem, testicules, prostate
sensation de froid, signalisation de la douleur
présent dans plusieurs carcinomes (prostaste, sein, colon, poumon, peau)
69, 111, 112
TRPML, mucolipidin
TRPML1 MCOLN1 57 192 cerveau, muscle squelettique, colon, thymus, foie, poumon, leucocytes
mucolipidose de type IV
113, 114
TRPML2 MCOLN2 255 231
lymphocytes B 115
TRPML3 MCOLN3 55 283 cellules ciliées de l’oreille interne
perte de l’audition, anormalité de la pigmentation
116
Ryanodine Récepteurs (RyR)
RyR1 RYR1 6261
muscle squelettique, estomac, rein, thymus, glandes adrénaliennes, ovaire, testicule, lymphocytes B
hyperthermie, rhabdomyolyse induite par la chaleur et l’exercice, paralysie atypique périodique
117‐120
RyR2 RYR2 6262 muscle cardiaque, cellules de Purkinje du cérébellum et du cortex
tachycardie catécholaminergique polymorphique du ventricule
118, 121
RyR3 RYR3 6263
cerveau, muscles squelettiques, poumons, reins, ileum, jejunum, rate, estomac, aorte, utérus, urètre, vessie, œsophage
maladie d'Alzheimer 118, 122, 123
Inositol triphosphate receptors (IP3R)
IP3R1 ITPR1 3708 cerveau ataxie, épilepsie absences, mortalité in utero
124‐126
Annexes
227
Famille Nom Gene Gene ID
Localisation principale Fonctions biologiques principales Maladies liées à une déficience / surexpression / épissage alternatif
Références
IP3R2 ITPR2 3709 migration cellulaire, métabolisme croissance, métabolisme 126, 127
IP3R3 ITPR3 3710 cellules hématopoïétiques diabète de type I, lupus érythémateux systémique
126, 128
Polycystins (PC)
PC‐1 PKD1 5310 ubiquitaire structure, fonction de la tubulure rénale polycystite rénale 129, 130
PC‐2 PKD2 5311 ubiquitaire structure, fonction de la tubulure rénale polycystite rénale 130, 131
PC‐3 PKD3 5312 polycystite rénale 132
STIM
STIM1 STIM1 6786 ubiquitaire anémie hémolytique autoimmune, hypotone musculaire, thrombocytopénie
133, 134
STIM2 STIM2 57 620 ubiquitaire 135
Orai
Orai1 ORAI1 84 876 Ubiquitaire déficit immunitaire lié à l'inactivation des cellules T
136
Orai2 ORAI2 80 228 Ubiquitaire 136
Orai3 ORAI3 93 129 ubiquitaire 136
MECANSIMES OFF
Plasma membrane calcium ATPases (PMCA)
PMCA1a
ATP2B1 490
corde spinale, cerveau, muscles squelettique et cardiaque
mortalité embryonnaire (délétion homozygote)
137, 138
PMCA1b ubiquitaire mortalité embryonnaire (délétion homozygote)
137, 138
PMCA1c muscles squelettique, cardiaque, corde spinale, cerveau
mortalité embryonnaire (délétion homozygote)
137, 138
PMCA1d muscles squelettique, cardiaque mortalité embryonnaire (délétion homozygote)
137, 138
PMCA2a
ATP2B2 491
"auditory and vestibular hair cells"
surdité, ataxie 137‐139
PMCA2b "auditory and vestibular hair cells"
surdité, ataxie 137‐139
PMCA3a
ATP2B3 492
cerveau 140
PMCA3b corde spinale, cerveau, glandes adrénaliennes
137, 140
PMCA3f muscles squelettiques 141
PMCA4a
ATP2B4 493
ubiquitaire perte de mobilité des spermatozoïdes 137, 138
PMCA4b muscles squelettique, cardiaque, intestin grêle, corde spinale, cerveau
perte de mobilité des spermatozoïdes 137, 138
sarco(endo)plasmic reticulum Ca²+ ‐ATPases (SERCA)
SERCA1a
ATP2A1 487
muscles squelettiques adultes myopathie de Brody, détresse respiratoire 142, 145
SERCA1b muscles squelettiques fœtaux 142, 143
Annexes
228
Famille Nom Gene Gene ID
Localisation principale Fonctions biologiques principales Maladies liées à une déficience / surexpression / épissage alternatif
Références
SERCA2a
ATP2A2 488
muscles cardiaque et squelettique, cellules de Purkinje
en association avec SERCA3: baisse de performance cardiaque, cellules tumorales squameuses, mauvaise relaxation des muscles lisses vasculaires et de la trachée
142, 146, 147
SERCA2b ubiquitaire maladie de Darier‐White (peau) 148
SERCA3
ATP2A3 489
cellules épithéliales sécrétrices de l'intestin, trachée et glandes salivaires, cellules endocrines pancréatiques beta, cellules immunitaires, cœur, neurones de Purkinje
relaxation endothéliale‐dépendante des muscles vasculaires lisses
tumorigenèse (colon, gastrique, leucémie), diabète de type II
149‐151
SERCA3a cellules lymphoïdes, mastocytes, plaquettes, pancréas
152, 153
SERCA3b plaquettes, poumon, pancréas 153
SERCA3c plaquettes, poumon, pancréas 153
SERCA3d ubiquitaire 146
SERCA3e plaquettes, poumon, pancréas 146
SERCA3f 154
Golgi pumps (SPCA)
SPCA1a
ATP2C1 27 032
kératinocytes de l'épiderme maladie de Hailey ‐ Hailey (peau) 155, 156
SPCA1b kératinocytes de l'épiderme maladie de Hailey ‐ Hailey (peau) 155, 156
SPCA2a
ATP2C2 9914
SPCA2b rein, cerveau, poumon, pancréas, testicules, ovaires, rate
surexpression associée à la prolifération cellulaire et la tumorigenèse
155
Echangeur Na+/Ca²
+ (NCX)
3 Na+/Ca²+ exchangers (NCX)
NCX1 SLC8A1 6546 cœur, cerveau, rein, ubiquitaire
couplage de l'excitation ‐ contraction du cœur, signalisation neuronale, réabsorption du Ca²+ dans le rein, hypertension induite par le sel
apoptose des myocytes cardiaques 157
NCX2 SLC8A2 6543 cerveau signalisation neuronale 158
NCX3 SLC8A3 6547 cerveau, muscle squelettique signalisation neuronale
nécrose des fibres des muscles squelettiques, transmission neuromusculaire défectueuse (anormalités électromyographiques), augmentation des lésions neuronales après une occlusion moyenne de l'artère cérébrale
159‐161
4 Na+/Ca²+ K+ exchangers (NCKX)
NCKX1 SLC24A1 9187 bâtonnets photorécepteurs de la rétine
"stationary night blindness" 162, 163
NCKX2 SLC24A2 25 769 cônes photorécepteurs, cerveau diminution du Ca²+ cytosolique suite à un stimulus lumineux
164
NCKX3 SLC24A3 57 419 cerveau, ubiquitaire 165
NCKX4 SLC24A4 123 041
cerveau, ubiquitaire pigmentation des yeux, cheveux 165‐167
NCKX5 SLC24A5 283 652
peau, épithélium rétinien, cerveau
pigmentation de la peau 168
Ca²+/2 cations exchanger
NCLX SLC24A6 80 024 ubiquitaire 169
Annexes
229
1. Catterall, 2011. Cold Spring Harb Perspect Biol 3, a003947. 2. Liao et al., 2009. Arch Toxicol 83, 61. 3. Moriyoshi et al., 1991. Nature 354, 31. 4. Grunwald et al., 1999. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 12085. 5. Hardingham et al., 2002. Biochim Biophys Acta 1600, 148. 6. Salter et al., 2005. Nature 438, 1167. 7. Hamdan et al., 2011. Am J Hum Genet 88, 306. 8. Begni et al., 2003. Biol Psychiatry 53, 617. 9. Zhao et al., 2006. Biol Psychiatry 59, 747. 10. Takano et al., 1993. Biochem Biophys Res Commun 197,
922. 11. Liu et al., 2004. Science 304, 1021. 12. Endele et al., 2010. Nature genetics 42, 1021. 13. Hess et al., 1996. J Pharmacol Exp Ther 278, 808. 14. Setou et al., 2000. Science 288, 1796. 15. Kawakami et al., 2003. Science 300, 990. 16. Matta et al., 2011. Neuron 70, 339. 17. Lin et al., 1996. Brain Res Mol Brain Res 43, 57. 18. Ikeda et al., 1995. Brain Res Mol Brain Res 33, 61. 19. Andersson et al., 2001. Genomics 78, 178. 20. Chatterton et al., 2002. Nature 415, 793. 21. Niemann et al., 2008. Neurology 70, 666. 22. Valera et al., 1995. Receptors Channels 3, 283. 23. Clifford et al., 1998. Blood 91, 3172. 24. Oury et al., 2000. J Biol Chem 275, 22611. 25. Mulryan et al., 2000. Nature 403, 86. 26. Adrian et al., 2000. Biochim Biophys Acta 1492, 127. 27. Lynch et al., 1999. Mol Pharmacol 56, 1171. 28. Finger et al., 2005. Science 310, 1495. 29. Garcia‐Guzman et al., 1997. Brain Res Mol Brain Res 47, 59. 30. Cockayne et al., 2000. Nature 407, 1011. 31. Souslova et al., 2000. Nature 407, 1015. 32. Garcia‐Guzman et al., 1997. Mol Pharmacol 51, 109. 33. Tsuda et al., 2003. Nature 424, 778. 34. Yamamoto et al., 2006. Nat Med 12, 133. 35. Le et al., 1997. FEBS letters 418, 195. 36. Rassendren et al., 1997. J Biol Chem 272, 5482. 37. Wiley et al., 2002. Lancet 359, 1114. 38. Leon et al., 1999. Thromb Haemost 81, 775. 39. Ayyanathan et al., 1996. Biochem Biophys Res Commun
218, 783. 40. Leon et al., 1996. Gene 171, 295. 41. Arthur et al., 2005. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 19138. 42. Parr et al., 1994. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 13067. 43. Elliott et al., 2009. Nature 461, 282. 44. Steinlein et al., 1996. Genomics 32, 289. 45. Dryja et al., 1995. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10177. 46. Kaupp et al., 1989. Nature 342, 762. 47. Dhallan et al., 1990. Nature 347, 184. 48. Biel et al., 1993. FEBS letters 329, 134.
49. Bonigk et al., 1993. Neuron 10, 865. 50. Weyand et al., 1994. Nature 368, 859. 51. Biel et al., 1994. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 3505. 52. Kohl et al., 1998. Nature genetics 19, 257. 53. Wissinger et al., 1998. Genomics 51, 325. 54. Liman et al., 1994. Neuron 13, 611. 55. Bradley et al., 1994. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8890. 56. Munger et al., 2001. Science 294, 2172. 57. Kondo et al., 2004. Invest Ophthalmol Vis Sci 45, 4433. 58. Korschen et al., 1995. Neuron 15, 627. 59. Chen et al., 1994. Nature 368, 545. 60. Gerstner et al., 2000. J Neurosci 20, 1324. 61. Sundin et al., 2000. Nature genetics 25, 289. 62. Mignen et al., 2000. J Biol Chem 275, 9114. 63. Jaquemar et al., 1999. J Biol Chem 274, 7325. 64. Stokes et al., 2006. Cellular signalling 18, 1584. 65. Obata et al., 2005. J Clin Invest 115, 2393. 66. Zitt et al., 1996. Neuron 16, 1189. 67. Strubing et al., 2001. Neuron 29, 645. 68. Kim et al., 2003. Nature 426, 285. 69. Dadon et al., 2010. Int J Biochem Cell Biol 42, 1430. 70. Vannier et al., 1999. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 2060. 71. Zhu et al., 1996. Cell 85, 661. 72. Riccio et al., 2002. Brain Res Mol Brain Res 109, 95. 73. Li et al., 2005. Nature 434, 894. 74. Balzer et al., 1999. Cardiovasc Res 42, 543. 75. McKay et al., 2000. Biochem J 351 Pt 3, 735. 76. Freichel et al., 2001. Nat Cell Biol 3, 121. 77. Greka et al., 2003. Nat Neurosci 6, 837. 78. Hofmann et al., 1999. Nature 397, 259. 79. Winn et al., 2005. Science 308, 1801. 80. Riccio et al., 2002. J Biol Chem 277, 12302. 81. Hayes et al., 2000. Pain 88, 205. 82. Caterina et al., 1997. Nature 389, 816. 83. Fernihough et al., 2005. Neurosci Lett 388, 75. 84. Geppetti et al., 2004. Br J Pharmacol 141, 1313. 85. Yiangou et al., 2001. Lancet 357, 1338. 86. Caterina et al., 1999. Nature 398, 436. 87. Iwata et al., 2003. J Cell Biol 161, 957. 88. Smith et al., 2002. Nature 418, 186. 89. Xu et al., 2002. Nature 418, 181. 90. Liedtke et al., 2000. Cell 103, 525. 91. Delany et al., 2001. Physiol Genomics 4, 165. 92. Todaka et al., 2004. J Biol Chem 279, 35133. 93. Muller et al., 2000. Genomics 67, 48. 94. Janssen et al., 2002. J Histochem Cytochem 50, 789. 95. Hoenderop et al., 2003. J Clin Invest 112, 1906. 96. Peng et al., 2000. Biochem Biophys Res Commun 278, 326. 97. Bianco et al., 2007. J Bone Miner Res 22, 274. 98. Duncan et al., 1998. Cancer research 58, 1515.
99. Miller et al., 2004. Cancer research 64, 509. 100. Uemura et al., 2005. Biochem Biophys Res Commun 328,
1232. 101. McNulty et al., 2005. Pflugers Arch 451, 235. 102. Wilcox et al., 2001. Cell 104, 165. 103. Lee et al., 2003. J Biol Chem 278, 20890. 104. Launay et al., 2004. Science 306, 1374. 105. Prawitt et al., 2000. Hum Mol Genet 9, 203. 106. Perez et al., 2002. Nat Neurosci 5, 1169. 107. Schlingmann et al., 2002. Nature genetics 31, 166. 108. Fonfria et al., 2006. J Recept Signal Transduct Res 26, 159. 109. Hermosura et al., 2005. Proc Natl Acad Sci U S A 102,
11510. 110. Aarts et al., 2003. Cell 115, 863. 111. Tsavaler et al., 2001. Cancer research 61, 3760. 112. Peier et al., 2002. Cell 108, 705.
113. Bargal et al., 2000. Nature genetics 26, 118. 114. Bargal et al., 1997. J Inherit Metab Dis 20, 625. 115. Lindvall et al., 2005. Cell Immunol 235, 46. 116. Di Palma et al., 2002. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14994. 117. Takeshima et al., 1989. Nature 339, 439. 118. Lanner et al., 2010. Cold Spring Harb Perspect Biol 2,
a003996. 119. Capacchione et al., 2010. Anesthesiology 112, 239. 120. Zhou et al., 2010. Neuromuscul Disord 20, 166. 121. Nakai et al., 1990. FEBS Lett 271, 169. 122. Hakamata et al., 1992. FEBS letters 312, 229. 123. Supnet et al., 2010. J Neurochem 112, 356. 124. Matsumoto et al., 1996. Nature 379, 168. 125. Supattapone et al., 1988. J Biol Chem 263, 1530. 126. Taylor et al., 1999. Cell calcium 26, 237. 127. Futatsugi et al., 2005. Science 309, 2232.
Annexes
230
128. Roach et al., 2006. Am J Hum Genet 79, 614. 129. Hughes et al., 1995. Nature genetics 10, 151. 130. Song et al., 2009. Hum Mol Genet 18, 2328. 131. Mochizuki et al., 1996. Science 272, 1339. 132. McConnell et al., 2001. J Med Genet 38, 238. 133. Parker et al., 1996. Genomics 37, 253. 134. Picard et al., 2009. N Engl J Med 360, 1971. 135. Williams et al., 2001. The Biochemical journal 357, 673. 136. Feske et al., 2006. Nature 441, 179. 137. Brandt et al., 1992. J Biol Chem 267, 4376 138. Okunade et al., 2004. J Biol Chem 279, 33742. 139. Bortolozzi et al., 2010. J Biol Chem 285, 37693. 140. Brown et al., 1996. Biochim Biophys Acta 1283, 10. 141. Filoteo et al., 2000. J Biol Chem 275, 4323. 142. Brandl et al., 1986. Cell 44, 597. 143. Chami et al., 2001. J Cell Biol 153, 1301. 144. Zhang et al., 1995. Genomics 30, 415. 145. Odermatt et al., 1996. Nature genetics 14, 191. 146. Martin et al., 2002. J Biol Chem 277, 24442. 147. Periasamy et al., 1999. J Biol Chem 274, 2556. 148. Sakuntabhai et al., 1999. Nature genetics 21, 271.
149. Dode et al., 1996. Biochem J 318 ( Pt 2), 689. 150. Brouland et al., 2005. Am J Pathol 167, 233. 151. Varadi et al., 1999. Diabetologia 42, 1240. 152. Wuytack et al., 1994. J Biol Chem 269, 1410. 153. Dode et al., 1998. J Biol Chem 273, 13982. 154. Bobe et al., 2004. J Biol Chem 279, 24297. 155. Wuytack et al., 2002. Cell calcium 32, 279. 156. Hu et al., 2000. Nature genetics 24, 61. 157. Komuro et al., 1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 4769. 158. Li et al., 1994. J Biol Chem 269, 17434. 159. Nicoll et al., 1996. J Biol Chem 271, 24914. 160. Sokolow et al., 2004. J Clin Invest 113, 265. 161. Molinaro et al., 2008. J Neurosci 28, 1179. 162. Tucker et al., 1998. Hum Genet 103, 411. 163. Riazuddin et al., 2010. Am J Hum Genet 87, 523. 164. Prinsen et al., 2000. J Neurosci 20, 1424. 165. Kraev et al., 2001. J Biol Chem 276, 23161. 166. Li et al., 2002. J Biol Chem 277, 48410. 167. Sulem et al., 2007. Nature genetics 39, 1443. 168. Lamason et al., 2005. Science 310, 1782. 169. Cai et al., 2004. J Biol Chem 279, 5867
Annexes
231
VIII. «EF‐handome»:protéinespossédantaumoinsunmotifEF‐hand
Protéine Gene Gene ID Chromosome Chromosome locus
actinin, alpha 1 ACTN1 87 chr14 14q22‐q24
actinin, alpha 2 ACTN2 88 chr1 1q42‐q43
actinin, alpha 3 ACTN3 89 chr11 11q13.1
actinin, alpha 4 ACTN4 81 chr19 19q13
Aftiphilin AFTPH 54 812 chr2 2p14
Allograft inflammatory factor 1 AIF1 199 chr6 6p21.3
Allograft inflammatory factor 1‐like AIF1L 83 543 chr9 9q34.13‐q34.3
A kinase anchor protein 13 AKAP13 11 214 chr15 15q24‐q25
Ankryrin repeat domain 5 ANKRD5 63 926 chr20 20p12.2
N‐terminal EF‐hand calcium bindng protein 3 APBA2BP 63 941 chr20 20q11.22
Chromosome 17 open reading frame 57 C17orf57 124 989 chr17 17q21.32
Stromal derived factor 4 Cab45 51 150 chr1 1p36.33
Calcium binding protein 1 CABP1 9478 chr12 12q24.31
Calcium binding protein 2 CABP2 51 475 chr11 11q13.1
Calcium binding protein 4 CABP4 57 010 chr11 11q13.2
Calcium binding protein 5 CABP5 56 344 chr19 19q13.33
Calcium binding protein 7 CABP7 164 633 chr22 22q12.2
Calbindin D28 CALB1 793 chr8 8q21.3‐q22.1
Calbindin D29K CALB2 794 chr16 16q22.2
Calbindin 3 / S100 calcium binding protein G CALB3 795 chrX Xp22.2
Calmodulin 1 CALM1 801 chr14 14q24‐q31
Calmodulin 2 CALM2 805 chr2 2p21
Calmodulin 3 CALM3 808 chr19 19q13.2‐q13.3
Calmodulin‐like 3 CALML3 810 chr10 10pter‐p13
Calmodulin‐like 4 CALML4 91 860 chr15 15q23
Calmodulin‐like 5 CALML5 51 806 chr10 10p15.1
Calmodulin‐like 6 CALML6 163 688 chr1 1p36.33
Calneuron 1 CALN1 83 698 chr7 7q11
Calumenin CALU 813 chr7 7q32.1
Calpain 1 CAPN1 823 chr11 11q13
Calpain 11 CAPN11 11 131 chr6 6p12
Calpain 12 CAPN12 147 968 chr19 19q13.2
Calpain 13 CAPN13 92 291 chr2 2p22‐p21
Calpain 2 CAPN2 824 chr1 1q41‐q42
Calpain 3 CAPN3 825 chr15 15q15.1
Calpain 8 CAPN8 388 743 chr1 1q41
Calpain 9 CAPN9 10 753 chr1 1q42.11‐q42.3
Calpain, samll subunit 1 CAPNS1 826 chr19 19q13.12
Calpain, samll subunit 2 CAPNS2 84 290 chr16 16q12.2
Calcyphosine CAPS 828 chr19 19p13.3
Calcyphosine 2 CAPS2 84 698 chr12 12q14.1
Calcyphosine‐like CAPSL 133 690 chr5 5p13.2
MICU1 (mitochondiral calcium uptake 1) CBARA1 10 367 chr10 10q22.1
Cbl proto‐oncogene, E3 ubiquitin protein ligase CBL 867 chr11 11q23.3
Cbl proto‐oncogene, E3 ubiquitin protein ligase B CBLB 868 chr3 3q13.11
Cbl proto‐oncogene, E3 ubiquitin protein ligase C CBLC 23 624 chr19 19q13.2
Centrin 1 CETN1 1068 chr18 18p11.32
Centrin 2 CETN2 1069 chrX Xq28
Centrin 3 CETN3 1070 chr5 5q14.3
CFD2 90 411 chr2
Cell growth regultor with Ef‐hand domain 1 CGREF1 10 669 chr2 2p23.3
Annexes
232
Protéine Gene Gene ID Chromosome Chromosome locus
Calcium binding protein P22, Calcineurin B homologous protein
CHP 11 261 chr15 15q13.3
Calcineurin B homologous potein 2 CHP2 63 928 chr16 16q12.2
Calcium and integrin binding 1 CIB1 10 519 chr15 15q25.3‐q26
Calcium and integrin binding 2 CIB2 10 518 chr15 15q24‐q25
Calcium and integrin binding 3 CIB3 117 286 chr19 19p13.12
Calcium and integrin binding 4 CIB4 130 106 chr2 2p23.3
Cornulin CRNN 49 860 chr1 1q21
Kv channel interacting prtein 3, Calsenilin CSEN 30 818 chr2 2q21.1
IRF4‐binding protein, Differentially expessed in FDCP6 homolog
DEF6 50 619 chr6 6p21.33‐p21.1
DAG kinase alpha 80 kDa DGKA 1606 chr12 12q13.3
DAG kinase beta 90 kDa DGKB 1607 chr7 7p21.2
DAG kinase gamma 90 kDa DGKG 1608 chr3 3q27.2‐q37.3
Dystrophin DMD 1756 chrX Xp21.2
Dystrophin related protein 2 DRP2 1821 chrX Xq22
Dystrobrevin alpha DTNA 1837 chr18 18q12
Dystrobrevin beta DTNB 1838 chr2 2p24
Dual oxidase 1 DUOX1 53 905 chr15 15q15.3
Dual oxidase 2 DUOX2 50 506 chr15 15q15.3
Dystonin DST 667 Chr6 6p12.1
Dystrotelin DYTN 391 475 chr2 2q33.3
DAZ interacting protein 3, zinc finger DZIP3 9666 chr3 3q13.13
EF‐hand calcium binding domain 1 EFCAB1 79 645 chr8 8q11.21
EF‐hand calcium binding domain 11 EFCAB11 90 141 chr14 14q32.11
EF‐hand calcium binding domain 2 EFCAB2 84 288 chr1 1q44
EF‐hand calcium binding domain 3 EFCAB3 146 779 chr17 17q23.2
EF‐hand calcium binding domain 4A EFCAB4A 283 229 chr11 11p15.5
EF‐hand calcium binding domain 4B EFCAB4B 84 766 chr12 12p13.32
EF‐hand calcium binding domain 6 EFCAB6 64 800 chr22 22q13.2
EF‐hand calcium binding domain 7 EFCAB7 84 455 chr1 1p31.3
EF‐hand calcium binding domain 8 EFCAB8 388 795 chr20 20q11.21
EF‐hand calcium binding domain 9 EFCAB9 285 588 chr5 5q35.1
N‐terminal EF‐hand calcium binding protein 2 EFCBP2 54 550 chr16 16q23.3
EF‐hand domain family, member A1 EFHA1 221 154 chr13 13q12.11
EF‐hand domain family, member A2 EFHA2 286 097 chr8 8p22
EF‐hand domain family, member B EFHB 151 651 chr3 3p24.3
EF‐hand domain (C‐terminal) containing 1 EFHC1 114 327 chr6 6p12.3
EF‐hand domain (C‐terminal) containing 2 EFHC2 80 258 chrX Xp11.3
EF‐hand domain family, member D1 EFHD1 80 303 chr2 2q37.1
EF‐hand domain family, member D2 EFHD2 79 180 chr1 1p36.21
EH‐domain containing 1, PAST homolog 1, Testilin EHD1 10 938 chr11 11q13
EH‐domain containing 2, PAST homolog 2 EHD2 30 846 chr19 19q13.33
EH‐domain containing 3, PAST homolog 3 EHD3 30 845 chr2 2p21
EH‐domain containing 4, PAST homolog 4 EHD4 30 844 chr15 15q11.1
EGF, latrophilin and seven transmembrane domain containing 1
ELTD1 64 123 chr1 1p33‐p32
Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15
EPS15 2060 chr1 1p32
Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15
EPS15L1 58 513 chr19 19p13.11
ERO1‐like protein alpha ERO1L 30 001 chr14 14q22.1
Family with sequence similarity 188, member A FAM188A 80 013 chr10 10p13
FK506 binding protein 10, 65 kDa FKBP10 60 681 chr17 17q21.2
FK506 binding protein 14, 22 kDa FKBP14 55 033 chr7 7p14.3
Annexes
233
Protéine Gene Gene ID Chromosome Chromosome locus
FK506 binding protein 14, 22 kDa FKBP7 51 661 chr2 2q31.2
FK506 binding protein 9, 63 kDa FKBP9 11 328 chr7 7p11.1
Filaggrin FLG 2312 chr1 1q21.3
Filaggrin family member 2 FLG2 388 698 chr1 1q21.3
neuronal calcium sensor 1 NCS1 23 413 chr9 9q34
Follistatin‐like 1 FSTL1 11 167 chr3 3q13.33
Follistatin‐like 4 FSTL4 23 105 chr5 5q31.1
Follistatin‐like 5 FSTL5 56 884 chr4 4q32.3
Grancalcin GCA 25 801 chr2 2q24.2
N‐acetylglucosamine‐1‐phosphate transferase, alpha and beta subunits
GNPTAB 79 158 chr12 12q23.2
Glycerol‐3‐phosphate dehydrogenase 2 (mitochondrial)
GPD2 2820 chr2 2q24.1
Guanylate cyclase activator 1A (retina) GUCA1A 2978 chr6 6p21.1
Guanylate cyclase activator 1B (retina) GUCA1B 2979 chr6 6p21.1
Guanylate cyclase activator 1C GUCA1C 9626 chr3 3q13.1
Hornerin HRNR 388 697 chr1 1q21.3
Hippocalcin HPCA 3208 chr1 1p35‐p34.2
Hippocalcin‐like 1 HPCAL1 3241 chr2 2p25.1
Hippocalcin‐like 4 HPCAL4 51 440 chr1 1p34.2
Myosin light chain, phosphorylatable, fast skeletal muscle
MYLPF 29 895 chr16 16p11.2
Integrin, alpha V ITGAV 3685 chr2 2q31‐q32
Intersectin 1 ITSN1 6453 chr21 21q22.1‐q22.2
Intersectin 2 ITSN2 50 618 chr2 2pter‐p25.1
Kv channel interacting protein 1 KCNIP1 30 820 chr5 5q35.1
Kv channel interacting protein 2 KCNIP2 30 819 chr10 10q24
Kv channel interacting protein 4 KCNIP4 80 333 chr4 4p15.32
KIAA0494 KIAA0494 9813 chr1 1pter‐p22.1
Lymphocyte cytosolic protein 1 (L‐plastin) LCP1 3936 chr13 13q14.3
Leucine zipper‐EF‐hand containing transmembrane protein 1
LETM1 3954 chr4 4p16.3
uncharacterized LOC100653115 LOC100653115
100 653 115 chr6 6
uncharacterized LOC391722 LOC391722 391 722 chr4 4q35.1
Lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 LPCAT1 79 888 chr5 5p15.33
Lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 LPCAT2 54 947 chr16 16q12.2
Microtubule‐actin crosslinking factor 1 MACF1 23 499 chr1 1p32‐p31
Mesoderm induction early response 1 homolog (Xenopus laevis)
MI‐ER1 57 708 chr1 1p31.3
Myosin, light chain 6B, alkali, smooth muscle and non‐muscle
MYL6B 140 465 chr12 12q13.13
Myosin, light chain 12A, regulatory, non‐sarcomeric
MYL12A 10 627 chr18 18p11.31
Myosin, light chain 12B, regulatory MYL12B 103 910 chr18 18p11.31
Myosin, light chain 1 MYL1 4632 chr2 2q33‐q34
Myosin, light chain 2 MYL2 4633 chr12 12q24.11
Myosin, light chain 3 MYL3 4634 chr3 3p21.3‐p21.2
Myosin, light chain 4 MYL4 4635 chr17 17q21‐qter
Myosin, light chain 5 MYL5 4636 chr4 4p16.3
Myosin, light chain 6 MYL6 4637 chr12 12q13.2
Myosin, light chain 7 MYL7 58 498 chr7 7p21‐p11.2
Myosin, light chain 9 MYL9 10 398 chr20 20q11.23
Myosin, light chain 10 MYL10 93 408 chr7 7q22.1
Annexes
234
Protéine Gene Gene ID Chromosome Chromosome locus
Myelin transcription factor 1‐like MYT1L 23 040 chr2 2p25.3
Neurocalcin delta NCALD 83 988 chr8 8q22.2
N‐terminal EF‐hand calcium binding protein 1 NECAB1 64 168 chr8 8q21.3
Ninein (GSK3B interacting protein) NIN 51 199 chr14 14q22.1
Ninein‐like NINL 22 981 chr20 20p11.22‐p11.1
NADPH oxidase, EF‐hand calcium binding domain 5
NOX5 79 400 chr15 15q23
Nucleobindin 1 NUCB1 4924 chr19 19q13.33
Nucleobindin 2 NUCB2 4925 chr11 11p15.1
Oncomodulin 2 OCM2 4951 chr7 7q21.2
Oncomodulin OCM 654 231 chr7 7p22.1
Prolyl 4‐hydroxylase, transmembrane (endoplasmic reticulum)
P4HTM 54 681 chr3 3p21.3‐p21.2
Programmed cell death 6 PDCD6 10 016 chr5 5p15.33
penta‐EF‐hand domain containing 1 PEF1 553 115 chr1 1p34
Polycystic kidney disease 2 (autosomal dominant) PKD2 5311 chr4 4q22.1
Phospholipase C, delta 1 PLCD1 5333 chr3 3p22‐p21.3
Phospholipase C, delta 3 PLCD3 113 026 chr17 17q21.31
Phospholipase C, delta 4 PLCD4 84 812 chr2 2q35
Phospholipase C, gamma 1 PLCG1 5335 chr20 20q12‐q13.1
Phospholipase C, eta 1 PLCH1 23 007 chr3 3q25.31
Phospholipase C, eta 2 PLCH2 9651 chr1 1p36.32
Plastin 1 PLS1 5357 chr3 3q23
Plastin 3 PLS3 5358 chrX Xq23
Protein phosphatase, EF‐hand calcium binding domain 1
PPEF1 5475 chrX Xp22
Protein phosphatase, EF‐hand calcium binding domain 2
PPEF2 5470 chr4 4q21.1
Protein phosphatase 2, regulatory subunit B'', alpha
PPP2R3A 5523 chr3 3q22.1
Protein phosphatase 2, regulatory subunit B'', gamma
PPP2R3C 55 012 chr14 14q13.2
Protein phosphatase 3, regulatory subunit B, alpha
PPP3R1 5534 chr2 2p15
Protein phosphatase 3, regulatory subunit B, beta PPP3R2 5535 chr9 9q31.1
Protein phosphatase 2, regulatory subunit B'', beta
PR48 28 227 chrY Xp22.33; Yp11.3
Protein kinase C substrate 80K‐H PRKCSH 5589 chr19 19p13.2
Parvalbumin PVALB 5816 chr22 22q13.1
RAB11 family interacting protein 3 (class II) RAB11FIP3 9727 chr16 16q13.3
RAB11 family interacting protein 4 (class II) RAB11FIP4 84 440 chr17 17q11.2
RAS and EF‐hand domain containing RASEF 158 158 chr9 9q21.32
RAS guanyl releasing protein 1 (calcium and DAG‐regulated)
RASGRP1 10 125 chr15 15q14
RAS guanyl releasing protein 2 (calcium and DAG‐regulated)
RASGRP2 10 235 chr11 11q13
RAS guanyl releasing protein 3 (calcium and DAG‐regulated)
RASGRP3 25 780 chr2 2p25.1‐p24.1
Reticulocalbin 1, EF‐hand calcium binding domain RCN1 5954 chr11 11p13
Reticulocalbin 2, EF‐hand calcium binding domain RCN2 5955 chr15 15q23
Reticulocalbin 3, EF‐hand calcium binding domain RCN3 57 333 chr19 19q13.33
Recoverin RCVRN 5957 chr17 17p13.1
Repetin RPTN 126 638 chr1 1q21.3
RALBP1 associated Eps domain containing 1 REPS1 85 021 chr6 6q24.1
RALBP1 associated Eps domain containing 2 REPS2 9185 chrX Xp22.2
Rhomboid, veinlet‐like 1 (Drosophila) RHBDL1 9028 chr16 16p13.3
Annexes
235
Protéine Gene Gene ID Chromosome Chromosome locus
Rhomboid, veinlet‐like 3 (Drosophila) RHBDL3 162 494 chr17 17q11.2
Ras homolog family member T1 RHOT1 55 288 chr17 17q11.2
Ras homolog family member T2 RHOT2 89 941 chr16 16p13.3
Ryanodine receptor 1 (skeletal) RYR1 6261 chr19 19q13.1
Ryanodine receptor 2 (cardiac) RYR2 6262 chr1 1q43
Ryanodine receptor 3 RYR3 6263 chr15 15q14‐q15
S100 calcium binding protein A1 S100A1 6271 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A10 S100A10 6281 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A11 S100A11 6282 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A11 pseudogene 1 S100A11P1 729 659 chr7 7q22.1
S100 calcium binding protein A11 pseudogene 2 S100A11P2 347 701 chr7 7q14.2
S100 calcium binding protein A12 S100A12 6283 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A13 S100A13 6284 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A14 S100A14 57 402 chr1 1q21.3
S100 calcium binding protein A7A S100A15 338 324 chr1 1q21.3
S100 calcium binding protein A16 S100A16 140 576 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A2 S100A2 6273 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A3 S100A3 6274 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A4 S100A4 6275 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A5 S100A5 6276 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A6 S100A6 6277 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A7 S100A7 6278 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A7‐like 2 S100A7L2 645 922 chr1 1q21.3
S100 calcium binding protein A8 S100A8 6279 chr1 1q21
S100 calcium binding protein A9 S100A9 6280 chr1 1q21
S100 calcium binding protein B S100B 6285 chr21 21q22.3
S100 calcium binding protein P S100P 6286 chr4 4p16
S100 calcium binding protein Z S100Z 170 591 chr5 5q13.3
Secretagogin SCGN 10 590 chr6 6p22.3‐p22.1
Selenoprotein N, 1 SEPN1 57 190 chr1 1p36.13
Solute carrier family 25 (aspartate/glutamate carrier), member 12
SLC25A12 8604 chr2 2q24
Solute carrier family 25 (aspartate/glutamate carrier), member 13
SLC25A13 10 165 chr7 7q21.3
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 23
SLC25A23 79 085 chr19 19p13.3
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 24
SLC25A24 29 957 chr1 1p13.3
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; phosphate carrier), member 25
SLC25A25 114 789 chr9 9q34.11
SPARC related modular calcium binding 1 SMOC1 64 093 chr14 14q24.2
SPARC related modular calcium binding 2 SMOC2 64 094 chr6 6q27
Sentan, cilia apical structure protein SNTN 132 203 chr3 3p14.2
Secreted protein, acidic, cysteine‐rich (osteonectin)
SPARC 6678 chr5 5q31.3‐q32
SPARC‐like 1 (hevin) SPARCL1 8404 chr4 4q22.1
Spermatogenesis associated 21 SPATA21 374 955 chr1 1p36.13
Sparc/osteonectin, cwcv and kazal‐like domains proteoglycan (testican) 1
SPOCK1 6695 chr5 5q31.2
Sparc/osteonectin, cwcv and kazal‐like domains proteoglycan (testican) 3
SPOCK3 50 859 chr4 4q32.3
Spectrin, alpha, erythrocytic 1 (elliptocytosis 2) SPTA1 6708 chr1 1q21
Spectrin, alpha, non‐erythrocytic 1 (alpha‐fodrin) SPTAN1 6709 chr9 9q34.11
Sorcin SRI 6717 chr7 7q21.1
Annexes
236
Protéine Gene Gene ID Chromosome Chromosome locus
SWAP switching B‐cell complex 70kDa subunit SWAP70 23 075 chr11 11p15
Synergin, gamma SYNRG 11 276 chr17 17q12
TBC1 domain family, member 8B (with GRAM domain)
TBC1D8B 54 885 chrX Xq22.3
TBC1 domain family, member 9 (with GRAM domain)
TBC1D9 23 158 chr4 4q31.21
TBC1 domain family, member 9B (with GRAM domain)
TBC1D9B 23 061 chr5 5q35.3
Trichohyalin‐like 1 TCHHL1 126 637 chr1 1q21.3
Trichohyalin THH 7062 chr1 1q21.3
Troponin C type 1 (slow) TNNC1 7134 chr3 3p21.1
Troponin C type 2 (fast) TNNC2 7125 chr20 20q12‐q13.11
Transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1
TRPA1 8989 chr8 8q13
TSC 54 997 chr12
Ubiquitin specific peptidase 13 (isopeptidase T‐3) USP13 8975 chr3 3q26.2‐q26.3
Ubiquitin specific peptidase 32 USP32 84 669 chr17 17q23.3
Utrophin UTRN 7402 chr6 6q24.1
Visinin‐like 1 VSNL1 7447 chr2 2p24.3
WD repeat domain 66 WDR66 144 406 chr12 12q24.31
Zinc finger, ZZ‐type with EF‐hand domain 1 ZZEF1 23 140 chr17 17p13.2
Annexes
237
IX. Identification des protéines membranaires – comparaison
bibliographique
Ratio Protéine – nom complet Gene_id HEK NSC TG01 U87
Récepteurs BCAP31 2 B‐cell receptor‐associated protein 31 10 134 11 11 12 11 CD163 3,8 CD163 antigen isoform b 0 0 0 0 CD44 4,4 CD44 antigen 960 0 2 7 9 CD74 4,4 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain 972 0 0 0 9 EGFR 3,3 Epidermal growth factor receptor 1956 4 12 0 12
FCER1G 6,4 Fc fragment of IgE, high affinityI, receptor for, gamma polypeptide precursor
0 0 0 0
FCGR3A 5 Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor (CD16a) isoform d precursor
0 0 0 0
HLA‐A 3 HLA class I histocompatibility antigen, A‐2 alpha chain 0 0 0 17
HLA‐C 3,9 HLA class I histocompatibility antigen, Cw‐12 alpha chain
0 0 7 0
HLA‐DRA 4,4 HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain 3122 0 0 0 8 ICAM1 3,4 Intercellular adhesion molecule 1 precursor 0 0 0 0 ITGA5 2,2 Integrin alpha‐5 3678 0 0 13 22 ITGB1 2,6 Integrin beta‐1 3688 11 12 23 21 ITGB2 3,1 Integrin, beta 2 precrsor 0 0 0 0 MRC2 7,6 C‐type mannose receptor 2 9902 0 22 14 14 MSR1 4 Macrophage scavenger receptor 1 isoform type 1 0 0 0 0
PTPRC 2,6 Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C isoform 2 precursor
0 0 0 0
SCARB2 2,7 Lysosome membrane protein 2 950 5 17 12 5
Protéines de liaison au calcium ANXA1 4,8 Annexin A1 301 0 14 7 10 ANXA2 3,8 Annexin A2 302 18 9 24 30 ANXA4 2,7 Annexin A4 0 0 0 0 ANXA5 5,3 Annexin A5 308 3 17 8 1 ASPH 2,2 Aspartyl/asparaginyl beta‐hydroxylase 444 3 25 15 0 ATP2B2 0,5 Plasma membrane calcium ATPase 2 isoform 2 0 0 0 0 CADM3 0,4 Cell adhesion molecule 3 isoform 2 0 0 0 0 CALR 2 Calreticulin 811 18 19 19 18 CALU 3,2 Calnexin 821 22 34 34 35
CAMK2G 0,4 Calcium/calmodulin‐dependent protein kinase II gamma isoform 4
0 0 0 0
CANX Calnexin 821 22 34 34 35 CAPN5 2,1 Calpain‐5 726 0 5 5 0 CCDC47 2,2 Coiled‐coil domain‐containing protein 47 57 003 5 14 12 17 F2 2,3 Coagulation factor II preprotein 0 0 0 0 FGG 2,8 Fibrinogen, gamma chain isoform gamma‐A precursor 0 0 0 0 HSP90B1 2,4 Endoplasmin 7184 50 40 46 46 ITGA5 2,6 Integrin beta‐1 3688 11 12 23 21 ITGAM 3,5 Integrni alpha M isoform 2 precursor 0 0 0 0 ITGB1 2,6 Integrin beta‐1 3688 11 12 23 21 ITGB2 3,1 Integrin, beta 2 precrsor 0 0 0 0 ITPR2 2,4 Inositol 1,4,5‐trisphosphate receptor type 2 3709 13 57 9 0 ITSN1 0,4 Intersectin 1 isoform ITSN‐s 0 0 0 0 LMAN2 2,1 Vesicular integral‐membrane protein VIP36 10 960 13 9 13 14 LPCAT1 2,2 Lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 79 888 0 4 6 2 MPO 3,3 Myeloperoxidase 0 0 0 0 MRC2 7,6 C‐type mannose receptor 2 9902 0 22 14 14 MYL6 2,2 Myosin light chain 6B 140 465 0 4 6 0 PLG 10,2 Plasminogen 0 0 0 0 PON2 3 Serum paraoxonase/arylesterase 2 5445 4 11 4 5
Annexes
238
Ratio Protéine – nom complet Gene_id HEK NSC TG01 U87
PPP3CA 0,4 Protein phosphatase 3, catalytic subunit, alpha isoform isoform 3
0 0 0 0
PPP3R1 0,3 Protein phosphatase 3, regulatory subunit B, alpha isoform 1
0 0 0 0
RCN1 2,4 Reticulocalbin‐1 5954 7 8 8 4 S100A10 6 Protein S100‐A10 6281 0 0 7 6 S100A4 2,2 S100 calcium binding protein A4 0 0 0 0 S100A8 5,6 Protein S100‐A8 6279 2 2 3 0 S100A9 6,2 Protein S100‐A9 6280 3 0 7 2 SCG2 0,4 Secretogranin‐2 7857 0 0 2 0 SLC8A2 0,4 Solute carrier family 8 member 2 precursor 0 0 0 0 SPARC 3,5 Spectrin non erythrocytic 6678 0 2 9 0 SRI 2,1 Sorcin 6717 0 4 6 0 SSR1 2,4 Translocon‐associated protein subunit alpha 6745 4 5 4 4 SYP 0,4 Synaptophysin 0 0 0 0 SYT1 0,3 Synaptotagmin‐1 6857 0 0 4 0 SYT5 0,4 Synaptogamin V 0 0 0 0 TPM4 25 Tropomyosin alpha‐4 chain 7171 0 0 0 2 VSNL1 0,4 Visinin‐like 1 0 0 0 0
Comparaison des protéines identifiées dans notre analyse avec celles de (Polisetty et al., 2012a). Le ratio désigne le taux d’expression des protéines dans des cellules de glioblastome par rapport à celui de cellules de tissu épileptique d’après (Polisetty et al., 2012a). Les 4 dernières colonnes correspondent aux protéines (nombre de peptides) identifiés dans notre analyse dans chacun des 4 types cellulaires testés.
239
RéférencesBibliographiques
RéférencesBibliographiques
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