Tema 3: Genómica

Griffiths AJ et al., (2000)Klug WS y Cummings MR (1999)

Links to Animal Genomic Research web site and Database Resourceshttp://www.genome.iastate.edu/resources/other.html

Objetivos:

• Identificar la utilidad del análisis de los marcadores de DNA para la construcción de mapas, la identificación individual y el aislamiento de genes de interés

• Conocer las metodologías que se han utilizado para la construcción de mapas

• Establecer la relación entre genómica y la nueva producción y sanidad animal

¿Qué es un polimorfismo?

¿cuáles conoces?

¿para qué puede servir el análisis de estos polimorfismos?

¿cómo se han construido los mapas del genoma?

¿para qué nos sirven?

Contenidos

• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología

de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas

herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:

ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

Genómica

• ESTRUCTURAL:– Caracterización de la

naturaleza física de genomas completos

• FUNCIONAL:– Caracterización del

proteoma y de los patrones globales de expresión génica

Caracterización molecular de genomas completos

DNA eucariótico

Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida

DNA separador

Secuencias funcionalesSecuencias sin función

conocida

Secuencias funcionalesNo codificantes

Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)

Familias de genes dispersos

Familias de genes en tándem

Repeticiones heterocromatinaDel centrómero

VNTR

Secuencias derivadasDe transposiciones

Transposones

Retrotransposones

Clasificación del DNA eucariota

Genómica estructuralCaracterización de la naturaleza física de genomas:

- Polimorfismos del DNA

- Cartografía

Contenidos

• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología

de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas

herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:

ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

Polimorfismo genético

• Existencia de distintos alelos:– Polimorfismo bioquímico:

• Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas

– Polimorfismos del DNA:• Variaciones presentes en la secuencia de

bases– Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales– Polimorfismos del número de repeticiones en

tándem

• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales

1. Cambios de bases:a. Transiciones:

i. Purina Purina:

ii. Pirimidina Pirimidina:

b. Transversionesi. PurinaPirimidina:

ii. Pirimidina Purina

Alelo 1Alelo 2

TACGAGCTATACGGGCTA

A G Purinas

T C Pirimidinas

• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)– 10 a 30 millones de SNP en el genoma

humano– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de

mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)– Fácil estandarización– Aplicaciones en la determinación de

enfermedades y en farmacogenética

• Detección de los SNP:– RFLP:

• Southern Blot• PCR + RFLP

– Secuenciación

– Minisecuenciación

– Sondas específicas

– SSCPs

– PCR en tiempo real…

• RFLPs– Detección mediante

enzimas de restricción:• Southern Blot• PCR+RFLP

– Normalmente determinados en exones

RFLPs-SNP

• Origen: mutaciones puntuales• Variabilidad: 2 alelos• Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador

Detección de mutaciones puntuales

RFLP:Alelo 1Alelo 2

TGGACGTCTTGGATGTCT

MCL1

Aat II

Alelo 1 Alelo 2Sonda

Detección de mutaciones puntuales

Minisequencing

VNTR Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección

Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern

Microsatélites pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

• DNA satélite: – repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y

algunas Mb)• DNA no transcrito• Regiones de heterocromatina, principalmente en

centrómeros (DNA alfoide)

• DNA minisatélite– Repeticiones de tamaño moderado (60pb)– Distribuidas por todo el genoma, principalmente en

telómeros– Normalmente no se transcriben– Tipos:

• DNA minisatélite hipervariable• DNA telomérico

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

• DNA minisatélite hipervariable– Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb

de longitud, de repeticiones en tándem cortas

– Secuencia repetida común (core):

GGGCAGGAXG

– Son muy polimórficas

– Se encuentran en intrones

– Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares”

VN

TR

s

1

10

4

6

8

INDIVIDUO 2

11

7

1

345

2

3 3’

3

5

9

21

32

4

1

32

4

3’3

INDIVIDUO 1

2

4

6

8

1

3

5

7

9

1 1’

1

3

5

7

2

4

6

1

1

3

5

7

2

4

6

8

1

1

3

5

7

2

4

6

8

1

3

5

2

4

6

2

4

6

1

3

5

7

2’2

1

3

5

7

9

1

3

5

2

4

2 2’

10

2

4

6

8

4

5

7

9 10

11

8

6

INDIVIDUO 1

INDIVIDUO 2

Fingerprints

• DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de

repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)

– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)

– Herencia mendeliana codominante

CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Alelo 1

Alelo 2

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

• Visualización de los microsatélites

ACGT

Secuenciación:Genotipado:

• Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: – Expansión de microsatélites de trinucleótidos:

• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar

(SCA)

– Expansión de tetranucleótidos: DM2– Expansión de pentanucleótidos: SCA10

Enfermedades humanas se han creado animales modelo

Secuencias de DNA dispersas

¿DNA basura?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Mecanismo de reparación?- ¿Puntos de recombinación?

• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:– Diagnóstico genético– Ligamiento con fenotipos– Identificación individual – Construcción de los mapas génicos

Técnicas básicas: Extracción del DNA genómico Electroforesis Hibridación (Southern, Northern) Restriction Fragment Lenght Polymorphism Reacción en Cadena de la Polimerasa Secuenciación (método de Sanger) Clonación

Diagnóstico genético directo:

• Mutaciones puntuales • Inserciones, deleciones • Repeticiones en tándem • Transcripción diferencial • Procesamiento alternativo del RNA• Metilación

RFLPs, Secuenciación, chips

PCR, Southern

PCR, secuenciación

RT-PCR, Northern, chips

RT-PCR, North.

MPCR

Diagnóstico genético indirecto:Análisis de marcadores genéticos

XGen alterado

Marcador polimórfico

Mutación puntualMicrosatéliteRFLPDeleciónInserción

Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado

Identificación individual:

•Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos)

•Análisis de marcadores microsatélites

•PCR, secuenciación

• Fingerprinting (minisat.)

Detección mediante RFLP + Southern

Microsatélites Minisatélites

Control de filiaciónControl de libros genalógicos

Contenidos

• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología

de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas

herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:

ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

• Mapas del genoma:– Mapa genético

• Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico

• Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis

– Mapa físico• Posición exacta de un gen• Distancia entre marcadores determinada por

nº de pb

Mapas genéticos

RequerimientosExistencia de polimorfismo en los genes a mapearAnálisis de familias “informativas” (AaBb x AABB)

Estudios de ligamiento :

-Herencia ligada al cromosoma X

-Marcadores polimóficos asignados a paneles de familias

- Alozimas

- Polimorfismos del ADN (microsatélites, RFLPs)

- Caza de genes relacionados con enfermedades o caracteres productivos:

- Fibrosis Quística (9 años) humano

Mapas físicos

ResoluciónCromosoma (paneles de células híbridas somáticas)Banda cromosómica (FISH)Células híbridas irradiadasSecuencia nucleotídica

Contenidos

• Introducción• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología

de estudio y aplicaciones• Cartografía de los genomas, nuevas

herramientas • Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:

ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

Estrategias para la identificación de un gen

Clonado posicional Clonado funcional Gen candidato

Identificación del fenotipo

Mapa

Gen

Mutaciones

Función

Función

Gen

Mutaciones

Mapa

Gen

Mutaciones

Mapa

Función

Identificación de un gen

Identificación clásica

Estudios en familias(modo de herencia)

Análisis de ligamiento o mapa físico(identificación de la región cromosómica)

Acotar la zona cromosómica(clonaje en YAC)

Análisis de los clones (contigs, búsqueda de marcadores, ORF, mutaciones)

gen Estudios de expresión

Genómica

Estudios de expresión

gen

mutaciones

Gen de doble musculatura• Crecimiento anormal

del tejido muscular debido a una hipertrofia (=hiperplasia)

• 20% más de rendimiento de carne

• Aumento de cortes con gran valor económico

• Carne magra• Muy buena conversión

alimentaria• Dificultades en el parto

Azul BelgaPiamontesaLimusinaCharolésAsturiana de los Valles

1995: Carácter controlado por un gen mayor mh

Gen de doble musculatura¿mh?

Identidad? Localización cromosómicaAzul Belga x Frisona

Rastreo del genoma con microsatélites

Región BTA2 próxima centrómero

MYOS-/-

MiostatinaGen candidato

MYOS 2q11

Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura

Descripción Tipo de mutación Raza

inserción/deleción en la posición 418

Corrimiento en el marco de lectura

Belgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubrac

transición C T en la posición 610

Sin sentido - terminación

prematura de la proteína

Charoláis

transversión G T en la posición 676

Sin sentido - terminación

prematura de la proteína

Maine-Anjou, Parthenais

Deleción de 11 pb desde la posición 821 hasta la 831

Corrimiento en el marco de lectura -

terminación prematura de la

proteína

Belgian blue, Limousine, South Devon, Asturiana

de los Valles

transición G A en la posición 938

Transversión consentido. Cys Tyr en la proteina

Piemontese, Gascon

Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales

transversión C A en la posición 282

Mutación consentido. Phe Leu en la proteina

Limousine, Aubrac, Devon,

Pirenaica

transición C T en la posición 414

Transición silente – sin cambio en la

proteína

Ampliamente distribuida

Tipificación de animales:

Diagnóstico indirecto:- microsatélites

Diagnóstico directo:- mutaciones MYOS

Herencia autosómica recesiva

Ligamiento vs asociación

• Ligamiento:– Identificación de

regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias)

– Análisis de 500 pols– Regiones candidatas y

acotamiento de la región

– Alelos raros de alto riesgo

• Asociación:– Análisis de individuos

afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos

– Facilidad para la obtención de muestras

– Necesidad de analizar miles de marcadores

– Alelos de acción modesta en enfermedades comunes

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ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

Mapa genómico:

Representación lineal de los sitios genómicos importantes (genes y marcadores)

1990: Proyecto Genoma Humano (National Institute of Health and the Department of Energy, USA)

1. Construcción del mapa físico y genético2. Determinar la secuencia de 3000 millones de

caracteres del DNA humano con un 99.9% de fiabilidad3. Determinar y localizar las variaciones del DNA entre

individuos (polimorfismos)4. Localizar todos los genes humanos5. Establecer las funciones de estos genes y otras partes

del genoma

Mapear y secuenciar el genoma humano

• Mapear y secuenciar los genomas de animales modelo:– E. coli (4,6 millones pb)– S. cerevisiae (12 millones pb)– C. elegans (97 millones pb)– D. melanogaster (165 millones pb)– M. musculus (3000 millones)– Otros

• Recolectar y distribuir datos:– Publicar en 24 h toda secuencia >2000pb

• Crear bases de datos• Desarrollar programas de análisis de DNA• Desarrollar herramientas para comparar e interpretar la información

genómica– Compartir la información públicamente

• Estudiar los aspectos éticos, legales y sociales de la investigación en genética

• Entrenamiento de investigadores• Desarrollo de tecnologías

- Desarrollar el catálogo definitivo de genes codificantes de proteínas

-Utilizar la genómica comparativa para alinear el genoma humano con el de otras especies para la identificación de genes

-Encontrar los elementos funcionales que controlan el tiempo y nivel de expresión de genes y micro-RNAs

-Secuenciar el restante 20% de heterocromatina (problemas de repeticiones)

“The end of the begining”

2003: Genoma completado

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ejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

Mapas genómicos en especies domésticas

1. Mapas de ligamiento, ricos en marcadores de DNA

2. Mapas físicos, ricos en genes conservados (permiten el mapeo comparativo)

3. Unión de ambos mapas4. Mapas de EST (Expressed Sequence Tag)5. Mapas de alta resolución en cromosomas

específicos6. Identificación de genes candidatos y

regiones con QTLs

Mapas genómicos en especies domésticas

• Australian Sheep Gene mapping Web site– http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm

• BovMap database– http://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/bovmap/

intro2.pl

• Pig base– http://www.thearkdb.org/browser?species=pig

• Dogmap– http://www.dogmap.ch/

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Genómica funcional

• Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional

• Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas

• Identificación de su función• Empleo de chips (microarrays) de

DNA para estudio de regulación génica

Chips de DNA

• Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos

• En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos)

• Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.)

• Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

Aplicaciones de la Genómica

• Conocimiento y comprensión de procesos patológicos

• Precisión de diagnóstico:– Clasificación más fina (cáncer de colon, piel)– “Farmacogenómica” respuesta individual a

tratamientos, elección de quimioterapia

• Evaluación correcta del riesgo genético:– Predicción de la agresividad tumoral

• Prevención conocido el riesgo genético– Comenzar planes de vigilancia en riesgo de

cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

• Análisis de recién nacidos• Detección de portadores• Desarrollo de terapias:

– Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional

– Terapia basada en la genética: • Diseño de nuevas drogas• Tratamientos basados en las bases moleculares• Elección del tratamiento

• Identificación de genes con interés en producción.

Implicaciones del conocimiento del genoma

Videos de genómica

http://www.youtube.com/watch?v=6iFDphWXjw4&feature=related

¿Qué falta aquí?

http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhMhttp://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=relatedhttp://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=related

Microarray: