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Temas selectos de laboratorio einvestigación en hematologia

Derechos reservados, Copyright © 2003:Academia Nacional de Medicina de México, A.C.

Gaceta Médica de México

SuplementoSupplement 2

Marzo-AbrilMarch-April 2003Volumen

Volume 139

edigraphic.com

S 81Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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La Hematología como otras ramas de la Medicina, se havisto favorecida con la aplicación del diagnóstico de tipomolecular, el laboratorio ha desempeñado un papelfundamental en este proceso a través de la implemen-tación de técnicas moleculares. Desde que se originó laidea de que el material genético está compuesto deácidos nucleicos, cuando Griffith en 1928 observó elfenómeno de “la transformación” y los estudios de Averyen 1944 demostraron que el principio transformadoraislado correspondía químicamente al DNA, hasta elProyecto del Genoma Humano en donde se ha logradodeterminar el orden de cerca de 3,200 millones denucleótidos que forman nuestro genoma, ha aumentadola necesidad de desarrollar y aplicar tecnologías nuevaspara realizar análisis detallados de esta nueva informa-ción. Han sido de gran utilidad los métodos basados enla reacción en cadena de la polimerasa (PCR), quefacilita el diagnóstico molecular debido a que se realizaa partir de cualquier muestra proveniente del sujeto enestudio y sólo requiere de una pequeña cantidad deDNA. El diagnóstico molecular puede tener dos posibi-lidades, la primera es caracterizar la mutación o muta-ciones en un gen causante de la enfermedad, medianteel secuenciamiento directo de productos de PCR o conla metodología de los microarreglos. Los microarreglosdel DNA es una tecnología que responde a la necesidadde analizar simultáneamente patrones de expresión decientos o miles de genes y ofrece grandes ventajassobre las técnicas de escrutinio genético. La segundaposibilidad se realiza mediante la identificación de losalelos de un polimorfismo genético situado muy cerca oen el interior (intrón o exón) del gen causante de laenfermedad. Una de las aportaciones importantes, hasido la identificación de un grupo de genes cuya funciónes la vigilancia genómica, estos genes detectan losdaños que sufre el DNA e inducen a las células adiversos mecanismos como apoptosis, ignorancia deldaño e introducción de errores en la síntesis de DNA oreparación, mediante estos procesos se ponen a salvo

las células en todo el organismo. Los genes de vigilanciagenómica, se han podido reconocer debido a que suausencia causa enfermedad, algunos de ellos se hanestudiado en cuanto a los procesos moleculares en queestán involucrados, las interacciones con otras víascelulares y su asociación con mecanismos celularesnormales así como también en los mecanismos patogé-nicos. Uno de los padecimientos en donde ha sido deespecial utilidad el diagnóstico citogenético y moleculares el Síndrome mielodisplásico (SMD) ya que en lamitad de los casos presentan algún tipo de alteracióncromosómica, como aneuploidías o rearreglos estructu-rales. Los subgrupos del SMD en base a la citogenéticatienen una gran importancia con respecto al pronósticode la enfermedad. Asociados a las alteraciones citoge-néticas se han identificado alteraciones a nivel molecu-lar como mutaciones en oncogenes, inactivación deproteínas reguladoras de la apoptosis y alteración engenes reguladores del ciclo celular.

Uno de los problemas que debe enfrentar el Laborato-rio de Hematología es el disponer de métodos de altasensibilidad que permitan detectar un número pequeño decélulas neoplásicas e identificarlas de entre las célulasnormales que las acompañan. A continuación semencionan tres casos relacionados.1. Identificación de blastos en líquido cefalorraquídeo

(LCR). La detección de infiltración leucémica alsistema nervioso central, se realiza por la identifica-ción de los blastos mediante el estudio citomorfológicodel LCR, esto tiene un significado diagnóstico ypronóstico importante. Actualmente en la búsquedade aumentar la sensibilidad en la detección algunosautores han propuesto adicionar el estudio de LCRmediante citometría de flujo, esperándose que conesta combinación de métodos se logre aumentar laexactitud del diagnóstico.

2. Detección de enfermedad residual mínima. En elcaso de la detección de las células tumoralesresiduales en un individuo a quien se le aplicó un

TEMAS SELECTOS DE LABORATORIO E INVESTIGACIÓN EN HEMATOLOGÍA

I. Introducción

Lina T. Romero-Guzmán*

* Jefe del Laboratorio de Hemato-Oncología. Instituto Nacional de Pediatría. Insurgentes Sur 3700-c. Col Insurgentes Cuicuilco. Tel. 56060002-Ext. 329, 483. ltrg1027@yahoo.com

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esquema terapéutico antineoplásico, si se tieneun número elevado de células tumorales, la enfer-medad residual se observa al microscopio, perocuando son escasas es necesario recurrir a méto-dos como la citometría de flujo y además a técni-cas genéticas y moleculares que involucran hibri-dación con sondas fluorescentes (FISH) yretrotranscripción-amplificación (RT-PCR). La com-binación de los métodos parece aumentar la sen-sibilidad y así la probabilidad de detección hasta10-4 a la 10-5 células.

3. Trastorno mieloproliferativo transitorio (TMT).- Esuna enfermedad que se ha observado al nacimientoy durante las primeras semanas de la vida, en cercadel 10% de los niños con Síndrome de Down (SD). Secaracteriza por la presencia de células anormales(blastos) en la circulación de naturaleza clonal. Enestos pacientes se produce remisión espontánea enlos primeros tres meses de vida, pero se han reportadocasos en los cuales se ha desarrollado meses o añosdespués una forma fatal de la enfermedad (LAM-M7)con una elevada mortalidad, especialmente pacientesque presentaban alteraciones citogenéticas adi-cionales al nacimiento. Para dar algunas respuestasal fenómeno de regresión del TMT y la progresiónpotencial a LAM-M7 es importante el monitoreo enpacientes con SD-TMT con técnicas de detección deenfermedad residual mínima, mediante citometríade flujo y detección molecular.

Estudios en genómica, proteómica y bioinformáticadirigidos a ensayos de funcionalidad de genes y su

combinación con otros métodos como quimioluminiscencia,citometría de flujo, selección electromagnética de células,etc., son la base del laboratorio de investigación enHematología.

Debido a la evolución tecnológica actual, no es posibleevaluar en su totalidad ni la información de la literaturamédica ni la utilidad de las pruebas diagnósticas, esnecesario contar con un sistema que permita evaluar demanera crítica y eficiente la información existente. Unsistema mediante el cual se realice la validación (lo máscercano al valor verdadero) de los resultados, se determinela validez global de la prueba diagnóstica y la utilidad dela prueba (seguridad con que se identifica el problema deinterés). Sistemas que permitan una buena gestión dellaboratorio ayudando a una mejor planificación yaprovechamiento de los recursos.

Así mismo, con los nuevos retos tecnológicos se hacreado la necesidad de que el personal del laboratoriotenga una interrelación constante con el médico Hematólogo,esto exige una especialización en los diferentes ámbitosdel conocimiento del Laboratorio Clínico ya que es la únicaforma no sólo de dialogar, sino de contribuir al diagnóstico,control y tratamiento del paciente. Con el propósito de queel personal del laboratorio se adecue a las necesidadesreales es necesario actualizar los programas de enseñanzadesde los niveles de licenciatura de las áreas médico-biológicas y establecer programas de educación continuaque favorezcan la motivación para interesarse en todoaquello que signifique aumentar su conocimiento,desarrollarse de una mejor forma en la actualidad yformarse una mejor perspectiva del futuro.

II. Vías de modulación de la apoptosis

Angélica C. Monsiváis-Orozco

La muerte celular programada ha recibido varios nombresen los últimos dos siglos. El término finalmente adoptadofue apoptosis, acuñado por Currie y colaboradores en1972, es una palabra griega que se utiliza para describirla caída de las hojas de los árboles con este término serefiriere a los aspectos morfológicos de una muertefisiológica.

Durante la apoptosis se presentan los siguientescambios morfológicos: Disminución del tamaño celular,condensación de la cromatina nuclear, formación de

vesículas de membrana, fragmentación en cuerposapoptóticos, y fagocitosis de la célula por células vecinaso el sistema retículo endotelial. Se trata de un procesoque requiere energía y puede afectar una o varias células.Estos cambios morfológicos difieren de lo encontrado enla necrosis donde observamos edema celular, lisis de lacromatina, ruptura de la membrana citoplásmica conliberación del contenido celular, inflamación prominentecon afección de varios grupos celulares, este es unproceso que no requiere energía.

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La apoptosis participa en distintas funciones:

1. Durante el desarrollo embrionario en la formación decavidades, separación de los dedos y eliminación deestructuras vestigiales que tuvieron una funcióndurante la embriogénesis.

2. En la homeostasis celular en el mantenimiento delnúmero celular.

3. En la eliminación de células indeseables, ya seapor envejecimiento, defectos genéticos, célulasinfectadas, linfocitos autorreactivos, células tumo-rales, o células con lesiones por agentes nocivos.

La apoptosis se caracterizó por primera vez en elnematodo Caenorhabditis elegans y está regulada por losgenes ced 3 y ced 4, cuyos productos participan en laejecución de la apoptosis y por el gen ced 9 que participaen la inhibición, en mamíferos el proceso es más complejopero sigue el mismo patrón con una elevada conservacióna través de la evolución animal.

La apoptosis es un proceso complicado, requiere laactivación coordinada y ejecución de múltiplessubprogramas. Se reciben señales apoptóticasintracelulares (Vía intrínseca) o extracelulares (Vía ex-trínseca), estas señales son transducidas a proteínasadaptadoras y transmitidas a proteasas de cisteínaespecíficas llamadas caspasas de iniciación. A partir deeste momento las células están comisionadas paraapoptosis y el siguiente paso es la ejecución a través delas caspasas de ejecución.

Señales de muerte

Las señales de muerte extracelular pueden ser origina-das por: 1) eliminación de las señales extracelularesque inhiben la apoptosis 2) recepción de señalespositivas de muerte a través de los receptores demuerte. Una de las vías de señal de apoptosis mejorestudiadas es la de receptores de membrana como eldel factor de necrosis tumoral α (FNTα), y Fas Ligando.Fas (APO1 o CD95) es un receptor transmembrana tipoI que pertenece a la familia de receptores del FNT. FasLigando es una proteína transmembrana de 40 kD queinduce apoptosis al unirse a Fas, a pesar de queinicialmente se creía que el Fas L era específico delinfocitos se ha encontrado en tejidos no linfoidesincluyendo corazón y páncreas.

Los receptores de muerte como Fas y FNTR1 contie-nen dominios citoplásmicos de aproximadamente 80aminoácidos que son esenciales para generar señales demuerte y que se designan como dominios de muerte,estos dominios reclutan proteínas adaptadoras comoTRADD (TNFR1-associated death domain protein) en el

caso del R1FNT y FADD (Fas-associated death domainprotein) en el caso de Fas. Proteínas adaptadoras comoFADD contienen secuencias específicas llamadas domi-nios efectores de muerte que interactúan con la caspasa8 iniciando la cascada apoptótica.

La señales de muerte intracelular como la ocasionadapor agentes que dañan el DNA como la radiación ionizanteoriginan apoptosis mediada por p53, con un aumento enla transcripción de proteínas proapoptóticas, otros meca-nismos de daño celular aumentan la actividad de proteincinasas activadas por stress que inducen apoptosis,aunque se conoce poco sobre estos mecanismos alparecer convergen en programas de muerte que llevan ala activación secuencial de caspasas.

Caspasas

Son proteasas de cisteína, que producen ruptura despuésde un residuo de ácido aspártico, las caspasas guardanhomología entre sí y habitualmente son sintetizadas enforma de precursores inactivos (zimógenos) con cuatrodominios diferentes, estos precursores son activados porproteólisis por otras caspasas en forma de cascadaproteolítica. La acción de ejecución de las caspasas esal romper diferentes sustratos que incluyen proteínascitosólicas y nucleares que tienen un papel en la repara-ción y replicación del DNA, en el splicing del RNA, en ladivisión celular y estructuras del citoesqueleto, estoscambios bioquímicos son los responsables de los cam-bios morfológicos característicos de la apoptosis. Lascaspasas se dividen en caspasas de iniciación (corrientearriba) y en caspasas efectoras o de ejecución (corrienteabajo). Las caspasas de iniciación tienen prodominioslargos que contienen motivos estructurales (Ej Dominioefector de muerte (DED) o el dominio de reclutación decaspasas) que asocian estas caspasas a sus activado-res específicos, en contraste las caspasas efectorastienen prodominios cortos, Se han descrito más de 13caspasas, no todas participan en la apoptosis, las princi-pales caspasas de iniciación son las caspasas 2, 8, 9 y10 y las principales caspasas efectoras son las caspasas3, 6, 7 y 14.

Proteínas adaptadoras y otros reguladores

Apaf-1 (apoptotic portease activating factor-1) es unaproteína adaptadora que afecta la activación de la caspasa9, Apaf-1 se une a la procaspasa 9 en presencia decitocromo c y de ATP y activa esta proteasa, iniciando loque podríamos llamar, la vía intrínseca de la cascadaapoptótica, activándose posteriormente las caspasasefectoras 3, 6 y 7.

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Los dominios de muerte de los receptores del FNT yde Fas reclutan ciertas proteínas adaptadoras (TRADD yFADD), las moléculas FADD se asocian con la procaspasa8 iniciando la vía extrínseca de la cascada apoptótica.

Familia de las proteínas Bcl-2

Es el equivalente a las proteínas CED 9 en C elegans, sinembargo, en el nematodo tiene únicamente funcionesantiapoptóticas mientras que en los mamíferos puede serproapoptótica o antiapoptótica. El Bcl-2 fue descubiertocomo un protooncogen en el punto de ruptura cromosómicada la t (14;18) en el linfoma de células B, de donde derivasu nombre (B, cell Lymphoma). Causa oncogénesis alsuprimir la apoptosis más que por estimular la proliferacióncelular. La familia de proteínas Bcl-2 incluye tantoinhibidores de la apoptosis (Ej Bcl-2, Bcl-kl, Bcl-w, Mcl-1, Nr12 y A1/Bfl-1) y promotores de la apoptosis (Bax,Bak Bok, Diva, Bcl-xs, Bik, Bim, Hrk, Nip3, Nix, Bad,Bid), Los miembros de esta familia guardan homología,tienen 4 áreas conservadas llamadas dominios BH (BclHomology): BH1, BH2, BH3, BH4. El dominio BH3 escrítico para la formación de dímeros con otros miembrosde esta familia.

Daño mitocondrial por las proteínas Bcl-2proapoptóticas

Los miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2 ocasionanla muerte celular al formar poros en la membrana externay en ocasiones interna de las mitocondrias causandoliberación de citocromo c al citoplasma, el cual activa,junto con Apaf-1 a la procaspasa 9 iniciando la víaintrínseca de la cascada apoptótica. La mayoría de losmiembros de la familia Bcl-2 poseen en el extremocarboxiterminal dominios de anclaje que les permitenlocalizarse en la membrana externa de las mitocondrias,los miembros que carecen de estos dominios (Bad, Bid)pueden migrar a las mitocondrias al formar heterodímeroscon miembros que poseen estos dominios.

Proteínas Bcl-2 antiapoptóticas

Las principales proteínas son Bcl-2 y Bcl-xL. Bcl-2 es elhomólogo a CED 9 en el nematodo, pueden unirse a Apaf-1 evitando la activación de la caspasa 9, tienen tambiénacción mitocondrial, previniendo la permeabilizaciónmitocondrial y la liberación de citocromo c.

Antídotos de la apoptosis y anti-antídotos

Existen proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP). Enmamíferos existe un inhibidor de los IAP llamado Smac(second mitochondria-derived activator of caspases) oDIABLO (Direct IAP-binding protein with low pI), Smac/Diablo se unen a IAP y neutralizan su acción antiapoptótica,son proteínas mitocondriales e inducen la muerte celular.

Aunque se conoce que la apoptosis o su inhibiciónparticipa en la patogénesis y la sintomatología de diferen-tes enfermedades todavía queda un campo amplio deinvestigación para poder obtener un conocimiento másprofundo. Deben desarrollarse técnicas que permitan unamedición cuantitativa de la apoptosis. Una mejorcomprensión de los activadores de la apoptosis y de lasmoléculas inhibidoras así como el estudio de las basesmoleculares y de las señales de transducción puedenfacilitar el desarrollo de agentes terapéuticos comoinhibidores de las caspasas para tratar las diversasenfermedades relacionadas con la apoptosis.

Referencias

1. Pothana Saikumar, PhD, Zheng Dong, PhD, Valery Mikhailov,et al. Apoptosis: Definition, mechanisms, and Relevance toDisease. The American Journal of Medicine 1999;107: 489-505

2. Michael O. Hengartner. The biochemistry of apoptosis. Nature2000 October 12;407: 770-776

3. Marcel Leist and Masrja Jäättela. Four Deaths and a Funeral:From caspases to alternative mechanisms. Nature Reviews2001;2:589-598

4. Steven W Hetts. To die or not to die. An Overview of apoptosisand its Role in Disease. JAMA 1998; 279-4: 300-307

5. Donald W. Nicholson. From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents. Nature 2000; 407: 810-816

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El genoma, representado por el DNA que se encuentra enel núcleo celular y las mitocondrias, es el patrimoniogenético de cada individuo. Aunque el DNA es altamenteestable como lo requiere la molécula de la herencia, essusceptible de dañarse de manera espontánea, por losprocesos normales intrínsecos de la célula como larespiración que puede producir radicales libres, o por lasfunciones propias del DNA como trascripción, y replicaciónque por sí mismas pueden introducir errores y daño a losácidos nucleicos, o bien por exposición a agentesextrínsecos como radiación o agentes químicos, quegeneran una variedad de lesiones al DNA. Estas lesionesincluyen errores de apareamiento, formación de unionescovalentes entre dos bases adyacentes, como dímerosde pirimidinas, formación de aductos, intercalacionesquímicas en la doble hélice o bien rupturas de cadenasencilla o doble. Cualquiera de estas lesiones puedenafectar de manera letal a la célula, por lo que deben serreparadas para no morir. Sin embargo es posible que eldaño no letal pueda tener mayor repercusión en elorganismo debido a que en caso de no detectar el daño noletal, o bien el detectar el daño y tolerarlo, puede conducira una célula hacia el desarrollo de cáncer, lo cual puedeen un momento dado ser letal no para la célula sino parael organismo completo. Es por estas razones, que laevolución ha invertido una gran cantidad de genes queestán dedicados a mantener la integridad genómicacelular.1,2

Existe un grupo de genes dedicados a la vigilanciagenómica, que se encargan de detectar el daño al DNA,una vez censado el daño y dependiendo de su tipo ymagnitud, estos genes pueden hacer que las célulastomen una decisión de entre varias posibilidades: a)Suicidio celular b)Tolerancia del daño c) Reparación deldaño. Cada uno de estos procesos se utiliza para ponera salvo a la célula o al organismo completo.

En el primer caso, la célula tiene tal cantidad de daño queno es posible repararlo y entonces opta por la opción demuerte celular programada o apoptosis, con lo cual la célulacon daño desaparece. En el caso de que la célula encuentreen su DNA daño que puede ser tolerado, simplemente lamaquinaria de replicación ignora el daño y continúa formandolas hebras hijas de DNA, pero introduciendo errores quepueden ser mutaciones acumulativas y dañinas de maneramediata. Por último, cuando la célula toma el camino de lareparación del DNA, existen varios mecanismos de reparaciónque dejan prácticamente normal a la célula: pueden reemplazaruna base mal apareada (mecanismo MMR), escindir unsegmento de hebra de DNA (mecanismo NER) o una solabase (mecanismo BER), o bien realizar recombinación parareparación. La mayor parte de las veces, la reparación es larespuesta elegida, con lo cual el organismo normal puededefenderse exitosamente de todas las injurias a su DNA,tanto intrínsecas como extrínsecas y esto permite que unhumano viva un promedio de 70 años realizando millones dedivisiones celulares por día.2

III. Guardianes del Genoma Humano

Sara Frías*

* Instituto Nacional de Pediatría

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Para realizar cualquiera de estos procesos de repara-ción se requiere un gran número de genes, muchos de ellosaún desconocidos que pertenecen también a los guardia-nes del genoma y que se han podido reconocer debido aque su deficiencia causa enfermedad. Existe un grupo desíndromes que se les conoce en conjunto como Síndromesde Inestabilidad Cromosómica o Genómica (SIC), que secaracterizan por presentar una alta frecuencia dealteraciones a nivel de rupturas o rearreglos cromosómicoso mutaciones, así como una elevada predisposición acáncer que en algunos casos puede ser hasta 1000 vecesmayor que la frecuencia de la población normal; los SICson enfermedades monogénicas que comparten con elcáncer la característica de inestabilidad genómica.1,2

Por otra parte, se han encontrado alrededor de veintetipos de cáncer que tienen un evidente componente hereditarioy en los que el gen alterado confiere predisposición y laenfermedad se manifiesta sólo cuando se han acumuladovarias mutaciones diferentes a nivel somático; la adquisiciónde varias mutaciones somáticas precisas se puede explicara través de la existencia de Inestabilidad Genética, que seha reconocido como una característica cardinal de neoplasiay que se atribuye a mutaciones en genes de vigilancia de laintegridad genómica, como aquéllos de los SIC o como losdel cáncer colorrectal no polipósico (genes MSH, MLH,PMS) y cáncer de mama/ovario (genes BRCA1 y 2), loscuales al estar alterados generan en las células un fenotipomutador que acumula daño al DNA. Esta inestabilidadgenómica precede a la alteración de oncogenes y/o genessupresores de tumor tipo portero (“gatekeeper”) que

desencadenan alteraciones en el ciclo celular y/o la apoptosisque lleva a la transformación celular y la neoplasia.1,4

Algunos de los genes guardianes del genoma que sehan estudiado y los procesos moleculares en los queestán involucrados se observan en el cuadro I.1-5

La identificación de los genes involucrados en las víascelulares de los SIC, los mecanismos de su actividad ylas interacciones con otras vías celulares, actualmentetienen un importante impacto sobre la comprensión de losmecanismos celulares normales y particularmente conaquéllos relacionados con la tumorigénesis.5 Adicional-mente, aunque los SIC (homocigotos) tienen una bajaincidencia, los heterocigotos en conjunto pueden repre-sentar hasta el 10% de la población normal y no seconoce el riesgo de portar uno de estos genes, aunqueexisten datos que apuntan a que pueden tener elevadasusceptibilidad a agentes ambientales y predisposición acáncer.

Referencias

1. Cahil DP, Lengauer C. Tumor genome instability. En: ScriverB, Ed. The metabolic and molecular basis of inherited diseases.McGraw Hill, 8a. Ed. N. Y, 2001. pp 611-612

2. Friedberg, E. DNA repair. Nature, 421:436-440, 2003.3. Joenje H, Patel KJ. The emerging genetic and molecular basis

of Fanconi anemia. Nat Rev Genet 2:446-457,2001.4. Joeijmakers JHJ. Genome maintenance mechanisms for

preventing cancer. Nature 411:366-444, 2001.5. Shiloh Y. ATM and related protein kinases: safeguarding

genome integrity. Nature Rev 3:155-168, 2003.

Cuadro I. Genes del tipo guardianes del genoma estudiados a nivel molecular

Enfermedad Número probable Genes Proceso molecularde genes identificados

Ataxia telangiectasia 1 ATM Respuesta al daño al DNASíndrome de Bloom 1 BLM Desenrollamiento del DNA (repar/replic/recomb)

Síndrome de Werner 1 WRN Desenrollamiento del DNA (repar/replic/recomb)

Xeroderma Pigmentosum 7 XPA-XPG Reparación por excisión del DNA (NER)Anemia de Fanconi 8 FANCA-FANCC, FANCD1,

FANCD2, FANCE-FANCG ?Cáncer colorrectal hereditario(HNPCC) 5 MSH2,MSH6,MLH1,

PMS1, PMS2 Reparación de bases mal apareadas (MMR)Cáncer hereditario mama/ovario 2 BRCA1, BRCA2 Respuesta/reparación de daño al DNA

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Se define como enfermedad residual a la masa tumoraldetectable en un paciente que ha sido sujeto a un esquemacompleto de terapia anti-neoplásica. El término enfermedadmínima residual se emplea como un sinónimo, que si bienpuede reflejar el optimismo del médico tratante, en muchasocasiones es muy impreciso en cuanto a la cantidad demasa tumoral restante. En aquellos pacientes en que eltratamiento no reduce importantemente la masa tumoral, lamicroscopía experta de un extendido de médula ósea essuficiente para detectar la enfermedad residual, y no haynecesidad de emplear métodos más sofisticados y costo-sos. Sin embargo, en los casos en que la enfermedadresidual realmente es mínima, es menester disponer demétodos cuya sensibilidad permita discriminar unas pocascélulas neoplásicas entre varios miles de células normales.

Una de las interrogantes más controversiales en estamateria es el número de células neoplásicas que debemospoder detectar, pues tampoco es claro cuál es el númerode células neoplásicas residuales que permite definir lasuspensión o la continuación de la terapia anti-tumoral.Aunque no es un consenso universal, muchos autorescoinciden en afirmar que en un paciente con leucemiaaguda que tiene 1 o más células malignas por cada 1,000células hematopoyéticas normales en la médula ósea, larecidiva de la neoplasia es casi segura; cuando lafrecuencia de células neoplásicas es aún mayor de 1 en10,000, la recidiva es todavía probable; pero cuando lacantidad de células malignas es menor a esta última cifra,la probabilidad de recidiva es prácticamente nula. Parecelógico suponer entonces que la sensibilidad deseada delos métodos para la detección de enfermedad residual,debe ser la necesaria y suficiente para poder distinguir alos pacientes en riesgo de recidiva, de aquellos que notienen este riesgo. En la actualidad, existen diversosmétodos que, aislados o en combinación, permiten ladiscriminación inequívoca de 1 célula neoplásica entre10,000 células normales. Se enlistan a continuación:1. Citometría de flujo multiparamétrica (CMF).2. Detección de traslocaciones.

–Hibridación con sondas fluorescentes (FISH).–Retrotranscripción/Amplificación (RT/PCR).

3. Detección de rearreglos IgH o TcR.4. Combinaciones de CMF/FISH/PCR.

Inmunofenotipo. La citometría de flujo multiparamétricase fundamenta en la detección de perfiles antigénicosaberrantes que permitan distinguir células neoplásicas. Esmenester enfatizar que la selección de anticuerpos, lasmezclas de los mismos, el número y combinaciones deparámetros que se detectan en cada célula, y las estrategiasde adquisición de datos, son factores cruciales dado queen las muestras de médula ósea se encuentran normalmenteelementos celulares de distintas líneas y en diversasetapas de maduración, que pueden fácilmente confundirsecon células malignas. El abordaje más confiable paradistinguir a las células neoplásicas de los precursoresnormales en maduración -hematogonias, como las llamaRicardo E. Duque- es utilizando mezclas de anticuerposque permitan seguir el patrón de maduración normal en laexpresión de antígenos de cada una de las líneas celulareshematopoyéticas. Aun utilizando estos recursos, en oca-siones es muy difícil definir con certeza el origen neoplásicode algunas células, por lo que se hace necesario recurrir aestrategias adicionales para confirmarlo.

Traslocaciones balanceadas. Existen algunastraslocaciones que se encuentran con frecuencia variableasociadas a ciertas neoplasias oncohematológicas. Seenlistan las más frecuentes:

IV. Estrategias para la investigación de enfermedadresidual en leucemia aguda

Alejandro Ruiz-Argüelles*

* Departamento de Inmunología, Laboratorios Clínicos de Puebla, Puebla, México.

Quimerismo Padecimiento asociado

IgH/MYC/CEP8 L. Linfoblástica, L. No-Hodgkin, BurkittAML1/ETO L. Mieloide M2BCR/ABL p190 L. LinfoblásticaBCR/ABL p210 L. Granulocítica crónicaMLL L. Agudas (10%)TEL/AML1 L. Linfoblástica en niñosBcl2/IgH Linf. CentrofolicularPML/RARa L. PromielocíticaCBFB/MYH11 L. Mielomonocítica

Estas alteraciones pueden detectarse medianteretrotranscripción y amplificación de ADN (RT/PCR) o porhibridación fluorescente in situ (FISH). El método de RT/PCR es notablemente más sensible que el de FISH (10-5 y10-2, respectivamente), pero también es más laborioso, más

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costoso y requiere de instalaciones y adiestramiento espe-ciales. Por ello, la técnica de RT/PCR suele preferirse parala detección de enfermedad residual, en tanto que la de FISHencuentra más utilidad para detectar la traslocación en elmomento del diagnóstico, cuando la masa tumoral esabundante. Un abordaje muy lógico y altamente recomendablees demostrar la traslocación por FISH antes de iniciar eltratamiento, pues entre otras cosas el método permite lainvestigación de diversas traslocaciones en un mismoextendido celular, y relegar la técnica de RT/PCR para hacerel seguimiento de cada caso, investigando específicamenteaquella traslocación que de inicio se demostró por FISH.

Los rearreglos de los genes de las cadenas pesadasde inmunoglobulinas (IgH) o del receptor de las células T(TcR), se presentan primordialmente en las leucemiaslinfoblásticas. Su detección se realiza por RT/PCR y susensibilidad es relativamente pobre (10-3).

En nuestro laboratorio, Reyes-Nuñez y Garcés-Eisele,diseñaron y desarrollaron un método para aumentar lasensibilidad de la detección de rearreglos de IgH o TcR,consistente en la construcción de una sonda de ADNcomplementaria al rearreglo de cada paciente, que permitesu detección por hibridación en membranas denitrocelulosa. Este abordaje incrementa la sensibilidaden 1 o 2 logaritmos, amén de que permite cuantificar laenfermedad residual en cada paciente.

La combinación de FISH con CMF es un nuevoabordaje que estamos probando actualmente en nuestrolaboratorio. El método implica la demostración de unatraslocación al momento del diagnóstico, lo querutinariamente estamos realizando por el método deFISH, además del establecimiento del inmunofenotipocon diversas combinaciones de anticuerpos. Terminadoel esquema de tratamiento, las células neoplásicas seidentifican mediante su perfil inmunológico y, cuando sufrecuencia es menor de 10-4, éstas son purificadas porselección individual electromagnética directamente enportaobjetos, para investigar la traslocación por el méto-do de FISH. Los resultados preliminares son muy alenta-dores y cumplen cabalmente el requisito de sensibilidadantes mencionados (10-4 a 10-5).

Es del todo insostenible ya la rivalidad entre losmétodos inmunológicos y las técnicas moleculares parala detección de enfermedad residual en leucemia. Lacombinación de ambas categorías de métodos ofrece,sin lugar a dudas, mejores resultados que el empleoaislado de cada una de ellas. Los laboratorios involucradosen el seguimiento de pacientes con leucemia debenaceptar esta realidad y equiparse, tanto técnica comoprofesionalmente, para ofrecer la información más útilpara médicos y pacientes.

Referencias

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S 89Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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Al diagnóstico, menos del 10% de los pacientes adultoscon leucemia aguda linfoblástica (LAL) tienen infiltraciónleucémica al sistema nervioso central (SNC), yaproximadamente el 30% de los pacientes desarrollaránesta complicación durante el curso de la enfermedad. Eldiagnóstico de leucemia en el SNC tiene significadoprónostico y se establece por la identificación de blastosen el líquido cefalorraquídeo (LCR).1 La identificación delos blastos mediante el estudio citomorfológico (CM) delLCR sigue siendo el “estándar de oro” para el diagnósticode leucemia en el SNC. Recientemente, aprovechandoque la citometría de flujo (CF) permite el análisis de unmayor número de células, se ha empleado para aumentarla exactitud del diagnóstico CM.2,3,4 Los estudios realizadospor Redner et al2 y por Subirá et al3 fueron los pioneros enCF. Estos autores encontraron buena concordancia en laidentificación de blastos mediante CM y CF, y basados enque la CF constituye un método más sensible y rápido losrecomendaron para el estudio del LCR de cualquierpaciente leucémico empleando ambos métodos.

En el Departamento de Hematología y Oncología delInstituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición S. Z.se comparó la eficiencia entre el tradicional análisis CMy la CF para establecer el diagnóstico de leucemia en elSNC, y además se analizó la cinética de los blastos y delas subpoblaciones de células no malignas CD4 y CD8durante la quimioterapia intratecal (QTIT) en las muestrasseriadas de tres pacientes con infiltración leucémica enel SNC.

Se colectaron 75 muestras de LCR de 31 pacientescon LAL; 16 mujeres (53.3%) y 15 hombres (46.7%). Porinmunofenotipo, 25 pacientes se clasificaron como LALde estirpe B (80.6%), 5 de estirpe T (16.1%) y en unpaciente no se realizó inmunofenotipo. La media de edadfue de 30.5+12.43 años (intervalo 16 a 62 años). De cadauna de las punciones lumbares se obtuvo una muestra deLCR previo a la aplicación de la QTIT para el estudio CM,citoquímico, CF y la cuantificación de ferritina y de beta2 microglobulina. El análisis CM (realizado por 3hematólogos) se clasificó en: positivo (leucocitos en elLCR > 5/µL y presencia de blastos en el citocentrifugado);indeterminado (leucocitos < 5/µL y presencia de blastos);negativo (ausencia de blastos) y traumático (presenciade eritrocitos).5 En ninguna muestra hubo divergencia

entre los 3 observadores, y el resultado definitivo fueaquél en el que coincidieron por lo menos 2 de los 3observadores. Las muestras clasificadas comoindeterminadas por 2 observadores se consideraronpositivas en el análisis final, ya que se ha demostrado quela evolución clínica de los pacientes con leucocitos <5/uL en el LCR es similar a aquélla en quienes el diagnósticode infiltración se establece con los criterios del consensode Roma.6,1 Para la CF se emplearon los siguientesanticuerpos monoclonales: control de isotipo (FITC/PE),CD4FITC/CD8PE, CD10FITC/CD34PE y CD5FITC/CD19PE.

De las 75 muestras iniciales se eliminaron 7: cinco pormuestra insuficiente y 2 por punción traumática. De las 68muestras de LCR hubo concordancia entre los métodosCM y CF en 61 muestras (90%): 55 negativas y 6positivas; en 4 muestras se obtuvo resultado CM positivoy negativo por CF y en 3 muestras, la CF fue positiva yla CM negativa. Las 13 muestras positivas por ambos opor cualesquiera de los dos métodos provenían de 6pacientes (Cuadro I), de los cuales el 1, 2, 3 y 4 tuvieronsíntomas neurológicos. Los pacientes con resultado CM

V. Identificación y cinética de blastos en líquidocefalorraquídeo mediante citometría de flujo

Josefa Piedras-Ross

Cuadro I. Resultado del análisis citomorfológico (CM) yde citometría de flujo (CF), en el LCR de 6 pacientes con

LAL y quimioterapia intratecal (QTIT)

Paciente días CF CM CD 10 CD10 CD19 CD4post /CD34QTIT

1 0 + + + + + -1 + + + + + -5 + + - + + +

2 0 + + + - + -7 + + + - + -

3 0 + + + - + -4 + - + - + +7 + - + - + +21 - + - - - +

4 28 - + - - - +245 - + - - - +

5 0 + - - + + - 6 108 - + - - - -

S 90 MG Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003

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positivo se trataron con metotrexate (12.5 mg) y arabinósidode citocina (80 mg) administrados intratecalmente 2 vezpor semana hasta desaparición de los blastos en el LCR.Posteriormente la QTIT se administró semanalmentedurante 2 meses y una vez por mes durante 6 meses. Enlos pacientes sin infiltración la QTIT se administró en lassemanas 0, 1, 4, 5, 7, 9, 11, 25, 28 y 32 post-diagnósticoy posteriormente cada 3 meses durante los primeros 2años de vigilancia.

Como se muestra en las gráficas de cinética celular(Figura 1), los blastos del paciente1 (CD10+, CD19+ yCD34+) desaparecieron al día 19 y en los pacientes 2 y3 las células leucémicas expresando los antígenos CD10y CD19 ya no fueron detectadas en el día 21. Se observóun incremento de las células CD8+, y particularmente delas CD4+ concomitante con la disminución o desapariciónde los blastos. El incremento fue transitorio en el paciente1, permaneciendo aproximadamente 3 días parareaparecer el día 57; en el paciente 2 el aumento de lascélulas CD4 fue evidente entre los días 15 y 43disminuyendo al día 63, y en el paciente 3 las células CD4empezaron a ascender al día 4 permaneciendo altashasta el siguiente seguimiento al día 28. Analizando las68 muestras se encontraron 16 (de 7 pacientes) con cifraselevadas de linfocitos-T CD4+ (>15%): cuatro pacientes(con 13 muestras) con resultado CM y/o de CF positivosy 3 pacientes (3 muestras) con resultados negativos deCM y CF.

En varios reportes encaminados al estudio desubpoblaciones de linfocitos en padecimientos que afectanal SNC (enfermedades inflamatorias y no inflamatorias,esclerosis múltiple, meningitis), otros que la leucemia, seha demostrado que las células predominantes en el LCRson los linfocitos-T con fenotipo CD4.7,8 Así, parece que elenriquecimiento del LCR con células CD4 es un fenómenono específico, presente no sólo en pacientes con enfermedadneurológica no maligna, sino también en aquéllos conleucemia en el SNC recibiendo quimioterapia intratecal. Serequieren más estudios para establecer el papel de loslinfocitos-T CD4+ en el SNC de pacientes que sufren deenfermedades neurológicas de diferente etiología.

Con base en lo informado en la literatura y a nuestraexperiencia concluimos: a) en las muestras de LCR la CFpermite distinguir claramente los blastos de lassubpoblaciones de células no malignas CD4 y CD8, b) elesquema de QTIT bisemanal aparentemente elimina alas células leucémicas del LCR en aproximadamente 3semanas, c) concomitante con la desaparición de losblastos aumentan los linfocitos-T inmunorreguladores,particularmente los CD4+ y d) aun cuando la concordan-cia entre los métodos CM y de CF es buena, es necesarioestudiar un mayor número de muestras positivas.

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Figura1 . Cinética celular en tres pacientes con leucemia en el SNC. Porcentaje de células positivas para el CD10 (triángulos), CD19(cuadrados), CD4 (asteriscos) y CD8 (círculos).

paciente 1

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60dias

paciente 2

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60

días

paciente 3

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60

días

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El trastorno mieloproliferativo transitorio (TMT), es unaenfermedad con muchas preguntas y pocas respuestas.El TMT (Mielopoyesis anormal transitoria, Leucopoyesisineficaz, Leucemia transitoria, Reacción leucemoidetransitoria), es un padecimiento que se ha observado, alnacimiento y durante las primeras semanas de vida, enaproximadamente 10% de los niños con Síndrome deDown (SD).1 El cuadro clínico se caracteriza por lapresencia de células anormales en la circulación (blastos),de naturaleza clonal,2 morfológicamente idénticos a losque se observan en LA (usualmente de estirpe mieloide),lo que lo hace prácticamente indistinguible de una LAneonatal con la única diferencia de que el proceso remiteespontáneamente sin tratamiento antileucémico ensemanas o meses.3

No obstante que en la mayoría de los pacientes seproduce remisión espontánea en los primeros tres mesesde la vida lo que sugiere una condición transitoria benigna,también se han reportado casos en los cuales se hadesarrollado una forma severa potencialmente fatal de laenfermedad, caracterizada por hidropesía fetal, (derramepleural, cardíaco y peritoneal), y fibrosis hepática y/odisfunción hepática, la que se ha asociado con unaelevada mortalidad y porque se ha informado además eldesarrollo de LAM en el 20 – 30 % de los niños con SD-TMT, meses o años después del periodo neonatal,fundamentalmente en aquellos pacientes que presentabanalteraciones citogenéticas adicionales al nacimiento.4

En general los niños con SD tienen un mayor riesgo adesarrollar LA que aquéllos sin esta enfermedad y losneonatos con SD tienen una mayor propensión a presentarTMT. Algunos autores han sugerido que no existediferencia en la distribución de los tipos de LA en niñoscon y sin SD, ya que se ha observando que la formapredominante de leucemia en niños con SD antes de lostres años de edad es la LAM, mientras que la LALpredomina en niños mayores (preescolares o escolares).La variedad más frecuente de leucemia en la etapaneonatal en niños con SD es la Leucemia AgudaMegacarioblástica, aunque esta variedad de leucemiatambién suele observarse en niños sin SD en otrasetapas de la vida, en forma similar al TMT que se presentacasi exclusivamente en la etapa neonatal y en donde lascélulas frecuentemente involucradas expresan antígenosde la estirpe megacariocítica. En el cuadro I se pueden

observar los marcadores inmunológicos que han obser-vado algunos autores.2,5-7

Debe hacerse diagnóstico diferencial con otras en-fermedades que pueden dar un cuadro hematológicoparecido a TMT como síndrome de TORCH (toxoplas-mosis, rubeola, citomegalovirus y herpes virus congéni-to), septicemia neonatal, sífilis congénita, isoinmuniza-ción materno fetal, neuroblastoma y leucemia congénitaverdadera. Es importante recordar que recién nacidosfenotípicamente normales también han desarrolladoTMT; en estos casos los pacientes han tenido ya seamosaicismo de la trisomía 21 o el cariotipo trisómico haestado limitado a las células hematopoyéticas de lamédula ósea y sangre. Estos pacientes también suelenpresentar remisión espontánea , aunque también pue-den desarrollar subsecuentemente LA. Hiyashi y col.compararon los rasgos hematológicos, citogenéticos einmunofenotípicos de pacientes con TMT-SD con los deaquéllos con LAM, los cuales se muestran en el cuadroII. Los rasgos distintivos de los pacientes con TMTfueron: Hemoglobina normal, plaquetas normales o lige-ramente disminuidas, hiperleucocitosis y un menor por-centaje de blastos en médula ósea que en sangreperiférica. Los pacientes con LAM tuvieron anormalida-des citogenéticas clonales, mientras que en los de TMTno se observó ninguna. Massey G. y col. describieron lahistoria natural de 48 niños con TMT-SD, al momento deldiagnóstico, 12 (25%) se encontraban asintomáticos,56% presentaron hepatomegalia y 44% esplenomega-lia. Ocho pacientes (17%), presentaron muerte tempra-na seis de ellos por insuficiencia hepática y nueve (19%)desarrollaron LA; ocho de ellos LAM-M7 y uno LAL-PCB.8

VI. Trastorno mieloproliferativo transitorio

Lina T. Romero-Guzmán*

*Jefe del Laboratorio de Hemato-Oncología. Instituto Nacional de Pediatría. ltrg1027@yahoo.com

Cuadro I. Síndrome de Down Rasgos Inmunofenotípicos

Svaldi, et al (2002) CD7+ CD56+ CD33+ CD34+ CD117+ MPOc -Karandikar, et al (2002) CD45+ CD38+ CD33+ CD41+ CD61+Girodon, et al (2002) CD45+ CD117+ CD56+ CD41+ CD42+ CD61+ CD13+ CD1a+ CD2+

S 92 MG Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003

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No se conoce con certeza porqué el TMT está restrin-gido casi exclusivamente a pacientes con SD peroalgunas observaciones sugieren un vínculo muy estre-cho con la presencia de trisomía 21. Algunas de estasobservaciones en particular interesantes han sido laidentificación de un subgrupo de pacientes conmosaicismo a SD, en los cuales la clona leucémicaafectaba exclusivamente a las células con la trisomía 21y de un subgrupo de pacientes con fenotipos normales yTMT, en quienes la trisomía 21 se identificaba sólo en lasclonas leucémicas. Es importante destacar también elhecho de que la desaparición del TMT se acompañabacon la desaparición de la trisomía 21 en las célulasafectadas. La interrogante sobre si el riesgo de padecerTMT o la mayor propensión a desarrollar LAM essimplemente el resultado del incremento de la dosisgénica (trisomía 21) o es el resultado de una homocigosidaddisómica uniparental (herencia de dos genes supresoresde tumores mutados) debido a la no disyunción de loscromosomas paternos por un error ya sea en la segundameiosis o en etapa temprana de la mitosis postcigótica nose conoce, aunque es fuerte la evidencia actual a favorde la transmisión de un gen mutado. En un análisisreciente de 20 pacientes con TMT Niikawa y col.presentaron evidencia de homocigosidad disómicauniparental en 9 casos correspondiendo la duplicación delcromosoma 21, en siete casos a la madre y en dos alpadre y postularon en base a estos hallazgos que el genputativo del TMT se localiza en la región 21q11.2.9 Otrosautores han propuesto la región 21 q 22.1-22.2 (un área

que se cree involucrada en el fenotipo de SD) en dondese localiza el gen AML-1 involucrado en diversos tipos deLAM fundamentalmente el asociado a translocación t(8;21),pero también en la translocación t(3;21) yla translocaciónt(16;21), el gen de un trastorno plaquetario funcionalfamiliar parecido al producido por aspirina con propensióna desarrollar LAM, el receptor a / b del interferón, unafamilia de receptores de citosina y otros genes queregulan la hematopoyesis pero de manera especial lamegacariocitopoyesis. No se conoce el tipo de relaciónexistente entre algunos de los rasgos biológicos del TMT/LAM-M7 ( por ejemplo, actividad de telomerasa, fenotipomegacariocítico, mutación de p53, fibrosis hepáticavinculada a factor de crecimiento transformante b o factorde crecimiento derivado de plaquetas b , expresión degenes eritroides específicos de la g globina y la d aminolevulasa sintetasa) y la lista actual de genes localizadosen el cromosoma 21.10

En años recientes otros hallazgos importantes, útilesen el diagnóstico diferencial de TMT y LAM-M7 han sido,la ausencia de mutación en el gen supresor de tumor p53en TMT y la adquisición de mutaciones en el gen, durantela transición a LAM-M7 y la ausencia de telomerasa enTMT, la cual se encuentra elevada en más de la mitad delos pacientes con LAM-M7.

Las técnicas de detección de enfermedad residualmínima podrían facilitar el estudio del fenómeno deregresión del TMT y la progresión potencial o “recurrencia”a LAM-M7. Un monitoreo de muestras de sangre periféricao médula ósea de pacientes con TMT-SD por citometría

Cuadro II

Síndrome de Down Rasgos hematológicos distintivos

Leucemia n=13 TMT n=15

Hb < 10g/dL 9/13 69% Hb > 14.5 g/dL 15/15 100%Plaquetas < 50 x 10 9/L 13/13 100% Plaquetas > 95 x 10 9/L 13/15 87%Rango 10 - 56 x 10 9/L Rango 29 - 853 x 10 9/LLeucocitos < 50 x 10 9/L 13/13 100% Leucocitos > 50 x 10 9/L 11/15 73%Rango 3.4 - 40.6 x 10 9/L Rango 26.8 - 248.6 x 10 9/LBlastos MO > SP 13/13 100% Blastos MO < SP 15/15 100%

Síndrome de Down Rasgos citogenéticos e inmunofenotípicos distintivos

Leucemia TMT

SMD 11/13 85% SMD 0/15 0%Anormalidad clonal 13/13 100% Anormalidad clonal 0/15 0% Pseudodiploidía 7/13 54% Desarrollo de anormalidad

clonal a desarrollar LAM Hiperdiploidía 6/13 46%Blastos GpIIb/IIIa 9/12 75% Blastos GpIIb/IIIa 9/11 82%

Hayashi Y, Eguchi M, Sugita K, et al. Blood 72:15-23, 1988.

S 93Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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de flujo si la clona leucémica permanece detectable. Conel advenimiento de nueva tecnología de laboratorio,detección molecular y con los primeros agentes queidentifican las proteínas alteradas involucradas en laproliferación incontrolada, la elucidación del mecanismodel TMT podría conocerse mejor en el futuro.11

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VII. Alteraciones Citogenéticas en SíndromesMielodisplásicos (SMD)

Rosa María Arana-Trejo*

* Genética, Hospital General de México y Facultad de Medicina, UNAM. México D.F. aranat@prodigy.net.mx

En aproximadamente 50% de los casos con SMD primariose observan alteraciones cromosómicas que pueden seraneuploidías con pérdida o ganancia de cromosomasespecíficos o bien rearreglos estructurales variados comodeleciones, translocaciones e isocromosomas.1 Las alte-raciones cromosómicas simples suelen presentarse enSMD primarios, mientras que los secundarios suelen tenercariotipos complejos con múltiples anormalidades2. Laincidencia de alteraciones cromosómicas observada en lapoblación adulta atendida en nuestro Servicio es de 40%sólo para los SMD de novo3. En el sistema de estratifica-ción pronóstico internacional (IPSS) los subgrupos esta-blecidos por citogenética tienen un alto impacto en lasupervivencia y progresión de la enfermedad. De tal formaque la aparición de alteraciones cromosómicas secunda-rias durante el seguimiento es indicio de evolución del SMDo transformación leucémica.2,4

Las deleciones simples son las alteraciones cromo-sómicas más frecuentes en SMD primarios generalmen-te son parciales (intersticiales) y en poca frecuencia o

rara vez pueden ser de brazos completos. La del(5q) esla más frecuente observándose en 10-15% de los SMDde novo y en 50% de los secundarios. Nosotros obser-vamos una incidencia de 14% sólo para la deleción, sinembargo hemos observado varios casos con transloca-ciones de 5q en SMD secundarios a tumores sólidos(datos no reportados). Este marcador se asocia confactores clínico-hematológicos característicos comoanemia macrocítica, diseritropoyesis, megacariocitoshipolobulados y cifras normales o aumentadas de pla-quetas. La clasificación WHO considera a este síndro-me 5q- como una entidad separada del resto de lasanemias refractarias por su pronóstico que es relativa-mente bueno de curso clínico crónico y una muy raraevolución a leucemia aguda.1,2,4

La del(5q) no está limitada al Síndrome 5q-, tambiénse encuentra en la AREB-t y en los SMD secundarios aradioterapia o agentes alquilantes. En estos casosgeneralmente está acompañada de translocaciones ba-lanceadas o incluso puede haber pérdida completa del

S 94 MG Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003

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cromosoma (monosomía 5). Un 5q- en un cariotipocomplejo es asociado con mal pronóstico. Los puntos deruptura en 5q son altamente variables siendo dos losprincipales: uno en 5q31-q33 y otro en 5q21 que ha sidoreportado en algunos casos de síndrome 5q-. Los genesque se han observado en 5q31 incluyen las interleucinas3,4,5 y 9, el factor 1 de respuesta al interferón, el factorestimulador de colonias granulocito-macrófago, el recep-tor 4 para el factor estimulador de colonias, un gen derespuesta al crecimiento (EGR1) que es un posible factorde transcripcion homólogo al gen tumor supresor WT1.1,2,4,5

La deleción parcial o completa del cromosoma 7 [7q-/-7] está asociada consistentemente con SMD o LAMsecundarios a radioterapia y/o quimioterapia por linfomao tumor sólido. Algunos casos pueden ser translocacionescomo la t(1;7)(q10;p10) o inversiones inv(7)(q22q34)observada en SMD secundarios. El significado biológicode la monosomía 7 no está totalmente definido, pero esun marcador de mal pronóstico en adultos y se asocia conseveras complicaciones infecciosas al parecerocasionado por una alteración en la quimiotaxis. Lospuntos de ruptura en la deleción abarcan una región muygrande de q22 a q33, donde se han mapeado los genesde eritropoyetina y del activador 1 de plasminógeno.Algunos reportes han sugerido que son dos las regionesde ruptura definidas una en 7q22 en un segmento de 2MB(megabases) y la otra más telomérica en 7q32-33.2,4,6

La del(17p) o el isocromosoma (17q) en SMD sonfrecuentemente asociado con disgranulopoyesis, núcleoshipolobulados con pseudo-Pelger-Huet y pequeñasvacuolas en el citoplasma de los neutrófilos y el pronós-tico es generalmente pobre. El evento molecular propues-to es la pérdida del gen p53 en 17p13 como consecuenciadel rearreglo cromosómico.2,4

Las alteraciones estructurales del cromosoma 3 soncomunes en SMD a menudo anemia refractaria conexceso de blastos y se han reportado inv(3), t(1;3), t(3;21)principalmente. Estos rearreglos tienen diferentes puntosde ruptura en el cromosoma 3 pero el blanco común es elgen EVI en 3q26. La del(20q) es un cambio recurrente en

SMD con una incidencia de 20% y se asocia con buenpronóstico. Generalmente es observada en anemia re-fractaria, aunque no es exclusivo de SMD se detectatambién en policitemia vera.1,2,4

La trisomía 8 es un cambio inespecífico frecuente-mente observado en SMD se asocia con un curso clínicovariado que puede ir desde una rápida evolución aleucemia aguda o la completa desaparición de la clonaanormal. Otras alteraciones menos frecuentes son ladel(13q), del(11q), los rearreglos de 1q a menudotranslocaciones y cambios numéricos inespecíficos comohipo e hiperdiploidías que generalmente son catalogadoscomo inestabilidad cromosómica. Existen diversas alte-raciones a nivel molecular como son las mutaciones enRAS, inactivación de p53 e incluso cambios en lametilación de genes reguladores del ciclo celular quetambién contribuyen con el fenotipo neoplásico y quealgunos pueden ser consecuencia o estar asociados conlas alteraciones cromosómicas.2,4

Referencias

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S 95Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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La hemostasia es un sistema complejo que mantiene lasangre en estado líquido bajo condiciones fisiológicas,pero que ante una lesión vascular reacciona rápida, potentey reguladamente formando el coágulo exclusivamente enel sitio afectado, evitando así la hemorragia sin que elcoágulo se disemine del lugar donde es necesario.

La formación del coágulo se divide en dos etapas; lahemostasia primaria o vascular-plaquetaria y lahemostasia secundaria o plasmática. El objetivo de lahemostasia primaria es formar un tapón hemostáticoinicial que está constituido principalmente por plaquetasactivadas y agregadas. El objetivo de la hemostasiasecundaria es generar suficiente trombina para convertiral fibrinógeno en fibrina para formar el coágulo.1 Laspruebas de laboratorio que evalúan la hemostasia primariason el tiempo de hemorragia, cuenta de plaquetas,agregometría plaquetaria, actividad del cofactor deristocetina, actividad de factor VIII (FVIII), cuantificacióndel antígeno del factor de von Willebrand (Ag:FvW) y ladeterminación de los multímeros del factor von Willebrand.

Tiempo de hemorragia. Fue introducida como prueba dela hemostasia primaria en 1910. Esta es la única pruebaque mide in vivo la relación endotelio/plaqueta y refleja lacapacidad hemostática plaquetaria2. El tiempo de hemo-rragia es útil para detectar un defecto cualitativo ó cuanti-tativo de plaquetas y FvW. Existen varios métodos paramedir el tiempo de hemorragia. El método tradicional es elde Ivy que consiste en hacer una pequeña incisión en elantebrazo ejerciendo una presión constante de 40 mmHg,absorbiendo con papel filtro el exceso de sangre cada 30segundos. El tiempo de hemorragia es el tiempo quetranscurre desde la incisión hasta el cese de la hemorragia.El límite normal de la prueba es de 9 minutos. En el métodode Duke se incide en el lóbulo de la oreja; su valor normales de 3 minutos. Otro método es el Template, unamodificación del método de Ivy, en donde utiliza unalanceta estandarizada que realiza uno o dos cortes con unalongitud y profundidad constante lo que hace más precisoel resultado. Algunos medicamentos pueden tambiénafectar los resultados: antiplaquetarios, anticoagulantes,diuréticos, anti-inflamatorios, etc., de tal manera que esimportante suspender estos medicamentos al menos 7días antes del estudio para obtener un resultado confiable.

Cuenta de plaquetas. Se puede realizar manual oautomatizadamente. En la primera se diluyen las plaquetasen oxalato de amonio al 1% y posteriormente se cuentanen la cámara de Neubauer por microscopia de contrastede fase, donde el frotis de sangre periférica es importantepara analizar su morfología. La cuantificación automatizadase puede hacer en un contador electrónico de partículas.La cifra normal de plaquetas oscila entre 150-500x109/L.El volumen plaquetario varía en forma inversa con lacuenta plaquetaria; el valor promedio oscila entre 8-12 fL.3

Agregometría plaquetaria. La agregación plaquetaria esel proceso por el cual las plaquetas se unen unas con otrasante un estímulo físico ó químico para formar el coágulo.Este fenómeno depende de glicoproteínas de membrana,fibrinógeno, calcio, así como de agentes agregantes. Laagregación se realiza en plasma rico en plaquetas (PRP)y sangre total por diversos métodos: 1) óptico, 2)impedancia, 3) luminiscencia y 4) flujo de calcio ionizado.

Método óptico. En 1962, Born diseñó un agregómetroutilizando un espectrofotómetro modificado adaptado aun registrador. La modificación consiste en incubación a37°C y agitación constante del PRP. Posteriormente, seadiciona el agonista (ADP, colágena, ristocetina, trombina,etc.) y se registra el cambio en transmisión de luz alformarse el agregado de plaquetas, teniendo comoreferencia un plasma pobre en plaquetas (PPP).

Método de impedancia. En 1980 se describió estemétodo que mide la agregación en sangre total. Elprincipio es el paso de una pequeña corriente eléctricaentre dos electrodos. Al contacto inicial de la sangre conlos electrodos se forma una monocapa de plaquetas; aladicionar el agonista se agregan las plaquetas y seincrementa la impedancia.4

Método de luminiscencia. Feinman desarrolló el lumi-agregómetro que mide agregación y liberación de ATP,simultáneamente. Utiliza la enzima luciferin-luciferasa(ATPasa). La luminiscencia es directamente proporcionala la concentración de ATP en los gránulos densos. Esmuy útil en el diagnóstico de enfermedades por depósitoen gránulos y en el síndrome de la plaqueta gris.5

Método de flujo de calcio ionizado. En 1985, Johnsondescribió este método que consiste en determinar laconcentración de calcio intraplaquetario durante la activa-

VIII. Hemostasia primaria

Guadalupe Montiel-Manzano*

* Laboratorio de Coagulación Especial. Hospital de Especialidades. Centro Médico Nacional Siglo XXI.

S 96 MG Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003

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ción plaquetaria. Las plaquetas se incuban con dimetilsulfóxido, lo que permite que la enzima bio-luminiscenteaequorin penetre a través de la membrana; al adicionar elagonista, las plaquetas emiten una luz que es directamen-te proporcional a la concentración de calcio intraplaquetario.6

Agregación plaquetaria inducida por ristocetina (RIPA).La ristocetina es un antibiótico que induce in vitro la unióndel FvW a la glicoproteína Ib-IX (GP Ib/IX). Esta pruebautiliza PRP y ristocetina. La agregación está disminuida enel síndrome Bernard-Soulier (SBS) y en la mayoría de lossubtipos de la EvW, excepto en el tipo 2B que se caracterizapor aumento en la respuesta a la ristocetina (hiperagregación),debida a una mayor afinidad del FvW a la GP Ib/IX.7,8

Actividad del cofactor de ristocetina (FvW:RiCof).Refleja la actividad funcional (adhesiva) de la moléculadel FvW. Se basa en la interacción del FvW plasmáticoy el receptor plaquetario GP Ib/IX. Esta prueba es similara RIPA excepto que se utiliza PPP, una concentraciónestándar de ristocetina y plaquetas normales. Esta prue-

ba es útil para diferenciar entre el SBS y la EvW pordeficiencia de la GP Ib/IX y deficiencia del FvW respec-tivamente. En el SBS la actividad del cofactor es normal,debido a que el defecto está localizado en la plaqueta yno en el plasma como sucede en la EvW.7,8

Actividad del factor VIII (FVIII:C). El método de unafase se basa en la determinación del tiempo detromboplastina parcial activado (TTPa), en mezclas 1:1del plasma deficiente en FVIII y plasma estándar oproblema diluido. En estas condiciones el acortamiento deltiempo de coagulación (TTPa) es inversamente proporcio-nal a la actividad del FVIII. El valor de referencia varía entre50-150 U/dl. La actividad del FVIII está disminuida enpacientes con EvW, hemofilia e inhibir a factor VIII.9

Concentración del antígeno del factor von Willebrand(Ag:FvW). Puede ser medido por una variedad de métodosinmunológicos: ELISA, aglutinación en partículas delátex etc., se utiliza el anticuerpo anti-FvW específicopara el Ag:FvW. El 80% de los pacientes con EvW tienendisminuido el Ag:FvW. En personas sanas con gruposanguíneo O puede ser menor de 40 U/dl sin una tendenciahemorrágica. El Ag:FvW no se detecta en la EvW tipo 3.7,8

Análisis de los multímeros del factor von Willebrand porWestern Blott. Esta prueba se considera confirmatoria ypermite clasificar los tipos de la EvW. El estudio de losmultímeros del FvW, evalúa anormalidades cualitativas ycuantitativas por inmunoelectroforesis. Sin embargo, esuna metodología compleja de realizar. Primero se lleva acabo la electroforesis en gel de poliacrilamida-agarosa conSDS (SDS-PAGE), posteriormente se procede a transferirlos multímeros a la membrana de nitrocelulosa, se bloqueay se lava exhaustivamente. La membrana se incuba conel anticuerpo anti-FvW, después se incuba con el anticuerpoanti-IgG conjugado con peroxidasa. Finalmente, se revelapor el sistema de quimioluminiscencia (Figura 1), analizandolas bandas en el equipo STORM 860. La quimioluminiscenciapresenta una sensibilidad similar a la radiactividad paradetectar precisamente las diversas bandas, así comotambién nos permite cuantificar por densitometría lasmismas. La positividad al FvW en sujetos sanos (N) sedetermina por la presencia de bandas de bajo y alto pesomolecular y su ausencia se manifiesta en los diferentestipos de la EvW7,8,10 (Figura 2).

Referencias

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3. Ruíz Argüelles GJ, Ruiz Reyes G. Interpretación de lacitometría hemática. En: Ruiz Argüelles GJ. Fundamentos deHematología. Editorial Panamericana, 2001.

Figura 2.

Figura 1.

S 97Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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4. Carol M. Ingerman-Wojenski. Simultaneous measurement ofplatelet aggregation and the release reaction in platelet-richplasma and in whole blood. Journal of Medical Technology. 1984;1:697-701.

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IX. Utilidad de las pruebas diagnósticasen la práctica clínica

Pedro Gutiérrez-Castrellón*

* Departamento de Metodología de la Investigación. Instituto Nacional de Pediatría, Secretaría de Salud, México.

Generalidades

Las pruebas diagnósticas son un componente importanteen la atención médica moderna. Representan aproximada-mente el 25% de los gastos anuales realizados en saludambulatoria en los Estados Unidos de Norteamérica (EUA)1

y han transformado el tipo de atención clínica proporciona-da en los últimos 20 años.2 Así los médicos solicitan lasdistintas pruebas diagnósticas con la expectativa que ellasles ayuden a esclarecer su pensamiento diagnóstico yseleccionar la mejor terapéutica para el paciente con lafinalidad de mejorar el pronóstico global del mismo. Estasprácticas presuponen que los resultados de las pruebasproveen información confiable acerca de la enfermedad enforma individual en cada paciente.

Contrastando con lo anterior, en realidad la atenciónpuesta a la evaluación de la calidad de estructuración delas investigaciones sobre pruebas diagnósticas es rela-tivamente modesta. De hecho muchas pruebas diagnós-ticas no son evaluadas rigurosamente antes de su aplica-ción general y la mayoría de los reportes existentes sobrepruebas diagnósticas poseen limitantes metodológicosque limitan su capacidad para proporcionar informaciónconfiable sobre el desempeño de la prueba.2,3

Estos factores originan una gran variación en losreportes de las características de las pruebas al mismotiempo que comprometen su credibilidad.4 A menudo elresultado es la amplia utilización de pruebas con eficacialimitada o incierta. Tales prácticas son no sólo costosas

sino que pueden poner a los pacientes en riesgo signifi-cativo particularmente cuando las pruebas no son segu-ras o reproducibles.2

Para evitar un uso inadecuado de las pruebasdiagnósticas, los clínicos deben ser capaces de evaluarcríticamente las pruebas diagnósticas existentes en laliteratura y ser capaces de distinguir entre artículos quecontienen información confiable de aquellos que contieneninformación sesgada y con limitantes. En particulardeben reconocer las potenciales fuentes de sesgo yvariabilidad y cómo estos factores producen estimadosincorrectos de la eficacia de las pruebas.

Escenario clínico

Como clínico se le interconsulta sobre una mujer de 78 añosquien después de 10 días de haberse sometido a cirugíaabdominal inicia con dificultad respiratoria en las últimas 24horas acompañado de dolor torácico el cual empeoraocasionalmente durante las respiraciones profundas. A laexploración física presenta algo de dolor en el abdomen yestertores roncantes escasos en ambas bases pulmonares.La radiografía de tórax revela un derrame pleural derechomínimo (es la única que se ha tomado desde la cirugía). Lagasometría arterial presenta PO

2 de 70 mm Hg, con una

saturación de 92%. El electrocardiograma demuestra sólocambios inespecíficos. Se le indica que la paciente seencuentra recibiendo 5000 U de heparina dos veces al día.

S 98 MG Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003

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A pesar de lo anterior, usted sospecha que la pacientepuede estar cursando con una embolia pulmonar (EP) porlo que se decide solicitar un gammagrama ventilatorio/perfusorio (V/P) el cual reporta “embolia pulmonar probable”.A pesar de dicho reporte usted indica anticoagulacióncompleta. A pesar de que usted ha utilizado en diversasocasiones en el pasado el gammagrama, se admite quemucho del entendimiento está basado sobre la intuición yla práctica local más que en las propiedades de dichaprueba, por lo que en camino a revisar el gammagramadecide pasar primero a consultar la literatura existentesobre la utilidad diagnóstica de la prueba.

La búsqueda

El plan es encontrar un estudio que le diga las propieda-des del gammagrama V/Q y cómo aplicarlo a la prácticaen general y al caso actual. Al consultar la biblioteca através de las palabras clave “embolismo pulmonar” seidentifican un total de 1,749 artículos de 1989 a 1992 porlo que se decide seleccionar sólo aquellos artículos quetengan como subtítulo “imagen con radionúclidos” y quetengan asociado el título de “estudios comparativos” yaque lo que se desea es identificar información quecompare el gammagrama V/P con algún estándar dereferencia. La estrategia permite identificar 32 artículos,de los cuales se excluyen 11 que evalúan nuevas técni-cas diagnósticas, 9 que se relacionan al diagnóstico ytratamiento de trombosis venosa profunda y uno queexamina la historia natural de la embolia pulmonar. De los11 restantes uno es una editorial y cuatro están limitadosen su alcance (evaluación únicamente de gammagramasperfusorios). De los seis restantes el estudio sobre lainvestigación prospectiva del diagnóstico de embolismopulmonar (PIOPED),5 le llama inmediatamente su aten-ción tanto porque está escrito en una revista médicaampliamente conocida y debido a que lo ha visto referidoen muchos de los artículos que fue descartando.

Al revisar el resumen se identifica la siguiente informa-ción: entre personas con resultados del gammagrama deprobable EP, el 33% tuvieron realmente EP. Con lainformación anterior, ¿Cuál sería su conclusión sobre ladecisión tomada con la paciente?

Introducción

La mayoría de los clínicos regularmente confrontan múlti-ples interrogantes cuando solicitan e interpretan pruebasdiagnósticas. La continua proliferación de tecnología mé-dica sobrepasa la capacidad del clínico para evaluar aúnlos artículos más importantes sobre utilidad de las pruebasdiagnósticas. Por lo anterior resulta importante considerar

una sistema lo suficiente práctico que permita evaluar deuna manera eficiente la información existente y permita deesta manera establecer conclusiones que soporten el pesode la evidencia. Este sistema en términos globales se basaprimordialmente en tres preguntas principales.6-8

¿Son los resultados del estudio válidos?

El grado en el cual se aceptan los resultados de unestudio, depende en cierta medida de los métodos utilizadospara llevar a cabo la investigación. El decir que losresultados son válidos implica que la certeza de losresultados de la prueba diagnóstica, como se reportan,son suficientemente cercanos a la realidad. De estamanera se recomienda antes que nada determinar si sepuede creer en los resultados del estudio al considerar lamanera en la cual los autores organizaron a los pacientesy cómo se les aplicó la prueba bajo estudio y el referenteapropiado o “estándar de oro”.

¿Cuáles son los resultados del estudio?

Si se decide que los resultados del estudio son válidos,el siguiente paso es determinar la validez global de laprueba diagnóstica a través de analizar o calcular la razónde verosimilitud de la prueba (a menudo referida como laspropiedades de la prueba).

¿Los resultados obtenidos me ayudarán en la atenciónde mis pacientes?

El tercer paso es decidir cómo utilizar la prueba, tantopara los pacientes en forma individual como para lapráctica en general. ¿Son los resultados del estudiogeneralizables?, ¿Pueden aplicarse a un grupo particularde pacientes, incluyendo a los pacientes que se ven mása menudo?, ¿Qué tan probable es que los resultados dela prueba proporcionen información realmente de utilidad?,¿Los resultados de la prueba proporcionan informaciónadicional más allá de la historia y la exploración física?,¿Es menos cara o está más fácilmente disponible queotras pruebas diagnósticas?, y finalmente ¿Se beneficia-rán los pacientes si se les aplica la prueba?

Utilizaremos el estudio PIOPED para ilustrar la formaen la que se sugiere deben de ser contestadas laspreguntas anteriores.

En dicho estudio, 731 pacientes con sospecha de EPfueron sometidos a gammagrama V/P y angiografía pulmo-nar, la cual fue considerada en el momento del estudio lamejor forma de diagnosticar si un paciente realmente teníaEP (estándar de referencia o estándar de oro). Cada

S 99Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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angiograma fue interpretado con tres posibles resultados:EP presente, EP dudoso o EP ausente. La utilidad delgammagrama se comparó con el angiograma y los resulta-dos del gammagrama se reportaron en cuatro categorías:EP altamente probable, EP con probabilidad intermedia, EPcon baja probabilidad y gammagrama normal o casi normal.

¿Son los resultados del estudio válidos?

Lineamientos primarios

¿Se efectuó una comparación independiente y cegadacon un estándar de referencia?

La validez de una prueba diagnóstica es determinada alcompararla con lo más cercano a la verdad. Por lo anteriores necesario asegurarse que se ha aplicado un estándarde referencia adecuado en cada paciente (biopsia, ciru-gía, autopsia, seguimiento a largo plazo) de maneraconcomitante a la prueba bajo investigación.9 En elestudio PIOPED se utilizó el angiograma pulmonar comoel estándar de referencia.

Si se acepta el estándar de referencia la siguientepregunta es identificar si la aplicación de la prueba bajoestudio y dicho estándar se aplicaron de maneraindependiente (Administración por intérpretes quedesconocían los resultados de la otra prueba). Esto es muyimportante con la finalidad de evitar sesgos de interpretación.Ya que por ejemplo una vez que se ha demostrado un nódulopulmonar en una tomografía si al mismo tiempo observamosnosotros mismos las radiografías de tórax seríamos capa-ces de identificar lesiones que desconociendo los resulta-dos de la tomografía no identificaríamos. Lo más probablees que la interpretación de una nueva prueba podría verseinfluenciada por el conocimiento de los resultados sobre elestándar de referencia.

Incluyó la muestra bajo estudio un espectro adecuadode pacientes en quienes la prueba diagnóstica se aplicaríaen la práctica clínica? Una prueba diagnóstica es realmen-te útil sólo en el grado en el que distingue entre enferme-dades o estados que podrían en otras condiciones confun-dirse. Casi cualquier prueba puede distinguir el sano delgravemente afectado (diferenciar de entre un conjunto decolores, el blanco del negro), pero esto no señala la utilidadclínica de la prueba. El valor verdadero se establece sóloen estudios que se asemejan lo más cercano a la prácticaclínica. Un vívido ejemplo de cómo las esperanzas cifra-das en la introducción de algunas pruebas diagnósticaspuede disminuirse por las investigaciones subsecuentesse observó en la evaluación del antígeno carcinoembriona-rio (ACE) en pacientes con cáncer colorrectal. Cuando elACE fue medido en 36 pacientes conocidos con cánceravanzado del colon o recto, estuvo elevado en 35 de ellos.

Al mismo tiempo niveles mucho más bajos se identificaronen personas sin cáncer y en una variedad de otrascondiciones.10 Los resultados sugirieron que la mediciónde los niveles de ACE podría ser de utilidad para diagnós-tico de cáncer colorrectal o inclusive para el tamizaje deesta patología. En estudios subsecuentes de pacientescon estadios menos avanzados de dicha neoplasia y enpacientes con otros problemas gastrointestinales la vali-dez de dichas mediciones se disminuyó considerablemen-te y su uso para diagnóstico de cáncer se abandonó,quedando limitada su utilidad como un elemento adicionalen el seguimiento de pacientes con cáncer colorrectal.11

Lineamientos secundarios

Una vez que se han identificado los elementos descritospreviamente es necesario considerar los siguientes apar-tados.

¿Los resultados de la prueba bajo evaluación influen-ciaron la decisión para administrar el estándar de refe-rencia ?

Las propiedades de una prueba diagnóstica sedistorsionarán si sus resultados influencian si los pacien-tes se someten a confirmación por la prueba diagnóstica.Esta situación, denominada sesgo de verificación12,13 osesgo de escrutinio,14,15 aplicará por ejemplo cuando lospacientes con la sospecha de enfermedad coronaria yprueba de esfuerzo positiva tuvieron más probabilidad desometerse a angiografía coronaria (estándar de referencia)que aquéllos con prueba de esfuerzo negativa.

El sesgo de verificación fue un problema en el estudioPIOPED, es decir que los pacientes cuyo gammagramaV/Q se interpretó como normal o casi normal o con bajaprobabilidad tuvieron menos probabilidad de someterse aangiografía pulmonar(69%) que aquéllos con gammagra-mas más positivos (92%) (Cuadro I).

Fueron los métodos para realizar la prueba, descritosen suficiente detalle para permitir su reproducción ?

Si los autores concluyen que debes utilizar una deter-minada prueba diagnóstica, deben señalarte de maneracompleta cómo utilizarla. Esta descripción debe cubrirtodos los aspectos que son importantes en la preparacióndel paciente (dieta, medicamentos a evitar, precaucionesdespués de la prueba), la realización de la misma (técnica,posibilidad de daño) y la forma de análisis e interpretaciónde los resultados

¿Cuáles son los resultados?

Se presentan las razones de verosimilitud o los datosnecesarios para calcularlas?

Probabilidad pre-prueba

S 100 MG Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003

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El punto inicial de cualquier proceso diagnóstico es elpaciente, el cual se presenta con una constelación designos y síntomas. Considere el caso de dos pacientes,el primero de ellos la mujer ya conocida de 78 años 10días de cirugía y el segundo un hombre ansioso de 28años, quien ha estado conduciendo su automóvil sindescansar durante 10 horas, ambos con dificultadrespiratoria y dolor torácico inespecífico. Cuando pensa-mos en la probabilidad de que cada uno presente EP y labasamos en los antecedentes y nuestra experienciaclínica, pensamos en las probabilidades preprueba, lascuales como es lógico son muy diferentes entre los dosindividuos (En la mujer de 78 años es alta y en el hombrede 28 años es baja). Por lo tanto a pesar de que ambospudieran tener resultados con probabilidad intermedia enel gammagrama V/Q el manejo subsecuente es muyprobable que sea distinto. Así pues dos conclusionesemergen de esta línea de razonamiento. La primera esque cualquiera que sean los resultados del gammagrama,éste no nos dice cuándo una EP está presente. Lo quesus resultados generan es modificar las probabilidadespreprueba de EP, generando una nueva probabilidadposprueba. La dirección y magnitud de este cambio deprobabilidad preprueba a posprueba está determinada porlas propiedades de la prueba, entre las cuales se encuen-tra la razón de verosimilitud (LR o likelihood ratio). Lasegunda conclusión es que las probabilidades prepruebapresentan una mayor influencia sobre el proceso diagnós-tico. Cada pregunta de la historia y del examen físico esuna prueba diagnóstica que incrementa o reduce laprobabilidad de un problema en cuestión. Así considereal paciente de 28 años. El hecho de que él se presente condificultad respiratoria aumenta la probabilidad de EP. Elhecho de que ha estado inmóvil por 10 horas aumentatambién dicha probabilidad, pero su edad, la ausencia deantecedentes patológicos, la exploración física normal ylos resultados de su gasometría arterial disminuyen laprobabilidad. Por lo tanto si conocemos las propiedadesde cada una de estas piezas de información, nos pode-mos mover secuencial mente a través de ellas, incorpo-

Cuadro I. Propiedades del gammagrama V/P

Resultados del Embolismo Presente Embolismo Ausente Presentes Razón degammagramaV/P No. Proporción No. Proporción /Ausentes Verosimilitud

Alta prob. 102 102/251 14 14/630 .406/.022 18.3Mediana prob. 105 105/251 217 217/630 .418/.344 1.2Baja prob. 39 39/251 273 273/630 .155/.433 .36Normal/Casi nl 5 5/251 126 126/230 .020/.200 .10

Figura 1. Nomograma de Fagan.

S 101Gac Méd Méx Vol.139, Suplemento No. 2, 2003 MG

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rando cada pieza de información y recalculando demanera continua la probabilidad de determinada enferme-dad. Los clínicos frecuentemente realizan estas accio-nes, sólo que como las propiedades de los puntosindividuales de la historia y la exploración física general-mente no están disponibles, terminan basándose única-mente en la experiencia y en la intuición para arribar a lasprobabilidades preprueba que preceden a la solicitud depruebas diagnósticas lo que en ocasiones proporcionaresultados considerablemente distintos.16-21

La utilidad clínica de una prueba diagnóstica estádeterminada en gran medida por la seguridad con la quese identifica al trastorno de interés y la seguridad de lasmediciones nos enfocará en su LR. Si analizamos losresultados del cuadro I observamos que hubo 251 pacien-tes en quienes se comprobó EP por angiografía y 630 enquienes el angiograma o el seguimiento lo descartó. Enseguida observamos que 102 del total de pacientes conEP presente presentaron un gammagrama altamenteprobable (0.406), mientras que sólo 14 de los 630 pacien-tes sin EP presentaron este mismo resultado en elgammagrama (.022). La razón de estas dos probabilida-des se denomina LR y para el caso de gammagrama conalta probabilidad es de .406/.022 o sea de 18.3 (Cuadro I).Dicho en otras palabras un gammagrama con alta proba-bilidad es 18.3 veces más probable que ocurra en sujetoscon EP que en sujetos sin EP.

Un LR de 1 significa que la probabilidad posprueba esexactamente la misma que la probabilidad pre-prueba

LR mayores a uno incrementan la probabilidad de quela enfermedad bajo estudio esté presente

LR menores de uno disminuyen la probabilidad depresencia de enfermedad

Como regla general se acepta que LR mayores de 10 omenores de 0.1 producen cambios grandes y a menudoconcluyentes de las probabilidades preprueba a posprueba,LR de 5 a 10 y de 0.5 a 0.2 generan cambios pequeños,pero aun importantes en la probabilidad, mientras quecambios de 1 a 2 y de 0.5 a 1 alteran la probabilidad engrados muy pequeños y raramente importantes.

Habiendo determinado la magnitud y significancia de losLR, necesitamos combinarlos directamente convirtiendolas probabilidades preprueba a razones, multiplicando elresultado por el LR y convirtiendo la subsecuente razónposprueba en probabilidad posprueba, lo cual puede sertedioso en la práctica clínica. Afortunadamente el nomogramapropuesto por Fagan (22) realiza automáticamente lasconversiones. En esta herramienta la primera columnarepresenta la probabilidad preprueba, la segunda el LR y latercera la probabilidad posprueba. De esta manera seselecciona el punto que representa la probabilidad pre-prueba y el punto del LR y se dibuja una línea que intersecacon la tercera columna para obtener la probabilidad posprueba.

Por ejemplo nuestro paciente de 78 años con probabilidadpre-prueba de 70% y con un gammagrama con alta proba-bilidad el cual tiene asociado un LR de 18.3 al reunir estosdatos en una línea y continuarla a la tercera columna seobtiene una probabilidad posprueba de 97%.

Los resultados del estudio me ayudarán a la atenciónde mis pacientes?

Será la reproducibilidad de los resultados del estudioy su interpretación satisfactorios en nuestro medio?

Los valores de cualquier prueba dependen de sucapacidad para producir los mismos resultados cuando seaplican a pacientes estables. La pobre reproducibilidadpuede resultar de problemas con la prueba misma(variaciones en los reactivos) o de la necesidad deinterpretación. Si la reproducibilidad de la prueba seencuentra reducida y la concordancia entre observadoresse encentra reducida y aún así la prueba discriminaadecuadamente indica que se trata de una muy buenaprueba y que podría ser de utilidad. Si la reproducibilidad esmuy alta y la concordancia significativa la prueba es muysencilla, no ambigua o fácil de interpretar.

¿Son los resultados aplicables a mis pacientes?

El punto aquí es a qué grado la prueba proporcionará losmismos resultados entre los pacientes de mi medio enrelación con lo reportado en el artículo. Hay que recordarque las propiedades de la prueba pueden cambiar cuandola frecuencia y gravedad de la enfermedad varía. Es decirque cuando predominan pacientes con estadios avanzadosde la enfermedad el LR se moverá más allá de la unidad,mientras que si predominan pacientes con estadiostempranos el LR se acercará al 1 o a valores inferiores. Sise da la condición que los pacientes que usted atiendeson similares en los criterios de inclusión y exclusión delos reportados en el estudio bajo análisis, los resultadosson completamente aplicables.23-25

¿Los pacientes se beneficiaran de los resultados de laprueba ?

El último criterio a considerar es en relación con la magnitudde beneficio terapéutico que los pacientes experimentaránposterior al resultado de las pruebas a considerar. El valorde una prueba segura no se discute cuando la enfermedadde interés si se deja sin diagnosticar es peligrosa , la pruebasi tiene riesgos éstos son aceptables y existe un tratamientoefectivo. En otras situaciones clínicas la prueba puede sersegura y el manejo puede cambiar como resultado de suaplicación, pero el impacto sobre el desenlace de lospacientes puede ser incierto.26-28