TESTI UTILI

GENETICA MOLECOLARE•Strachan T., Read A.P Genetica Umana Molecolare (UTET)

(Human Molecular Genetics 3, Gardland Science)

GENETICA STATISTICA•Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage. Johns Hopkins University Press, Baltimore

•Sham P (1997) Statistics in human genetics. Arnold; Wiley, London, New York

VARIABILITA’ DEL GENOMA E MUTAZIONI•Replicazione del DNA -> errori -> meccanismi di riparo (non effic. al 100%)Tasso di mutazione per nucleotide nell’ordine di 1/109

•Agenti esterni (mutageni, radiazioni etc)

MUTAZIONIcambiamenti stabili (ereditabili) nella sequenza del DNASe una mutazione insorge in una porzione del DNA codificante o funzionalmente importante può avere un effetto sul fenotipo.

variabilità -> evoluzioneMutazioni patogeniche -> malattie genetiche

Possono insorgere a livello di:• cellule somatiche (-> cancro, invecchiamento)• cellule germinali

POLIMORFISMIpresenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche, con una frequenza significativamente alta (> 1%)

MUTAZIONI SEMPLICI (puntiformi)causate per lo più da errori spontanei nella replicazione del DNA e riparo

EFFETTI PATOGENI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI

Nella regione codificante di un gene

Sostituzioni sinonime (silenti) La > parte sono neutrali. Talvolta possono creare degli errori di splicingSostituzioni non sinonime (missense) Spesso deleterie. Nonsense: quasi sempre deleterie.

proteina troncatamRNA instabile (nonsense-mediated mRNA decay)exon skipping (raro)

Inserzioni/delezioni -> Framshift -> in genere introducono un codone di stop

Introni• mutazioni di splicing

• assenza di splicing dell’introne• uso di un sito di splicing illegittimo (criptico)• exon skipping

Mutaz nel 5’ o 3’ non tradottoes: nel segnale di poliadenilazione AAUAA siti target di microRNA

Mutazioni in regioni regolatorie

Riarrangiamenti mediati dalla presenza di SEQUENZE RIPETUTE

• Slipped strand mispairing

• Crossing-over ineguale

SEQUENZE RIPETUTE

DNA CODIFICANTE:•Famiglie multigeniche•Motivi strutturali conservati•Ripetizioni in tandem di geni per rRNA e istoni

DNA NON CODIFICANTE•In tandem•Sequenze ripetute intersperse

1) Famiglie geniche• duplicazione e divergenza da un gene ancestralees. geni globinici• Famiglie di geni con regioni conservate che codificano per domini funzionaliEs fattori di trascrizione (Homeobox, Zinc-finger etc)

PSEUDOGENI copie non funzionaliNon-processati (espressi/non espressi)Processati

2) Sequenze ripetute extrageniche•Ripetizioni in tandem

1)Altamente ripetuto -> DNA satellite2) Polimorfiche:minisatellitimicrosatelliti

•Seq ripetute intersperse

Alu

DNA SATELLITE

LINEs (L1)

LINEs> 5 kb104

Kpn o L1- 6.1kb, molte sono forme troncate al 5’2 ORF, ORF1 = RNA binding prot, ORF2 = RT e endonucleasi

SINEs <500 bp105

Alu - 2 ripetizioni di una seq di ~120 bp~ ogni 4 kbomologia con 7SL RNA-> propagate tramite retrotrasposizione

Propagazione delle LINEs e SINEs tramite retrotrasposizione

1)SLIPPED STRAND MISPAIRINGAppaiamento sfasato di corte sequenze ripetute in tandemCausa piccole delezioni/inserzioni (che possono essere patogene o generare polimorfismi STR )

Crossing-over ineguale (NAHR: non-allelic homologous recombination)

Direct repeats :deletion and/or duplication

Inverted repeats :inversion

Segmental duplicationsLCR (low copy repeat)Sequenziamento del genoma -> presenza di duplicazioni di sequenze 10-400Kb, con alta similarità (>95-97%).Rappresentano almeno il 5% genoma Inter-cromosomiche (soprattutto in reg pericentrom e subtelomeriche Intra-cromosomiche (cromosoma specifiche)

Causa di riarrangiamenti genomici associati a malattie geneticheSmith Magenis Syndrome, Charcot-Marie-Tooth (crom 17) Prader-Willi/Angelman Syndrome (crom 15).

•Regioni pericentromeriche e subtelomeriche contengono alto num di segmental duplications

1) Membri di famiglie geniche/peudogeni ripetuti in tandemEs: Talassemia alfa-globina Daltonismo pigmenti rosso/verde dei coni

2) Sequenze ripetute che fiancheggiano geniCharcot Marie Tooth (CMT-1A) PMP22Ittiosi X-linked STSSmith MagenisWilliams Syndrome

3) Sequenze ripetute inverseEmofilia A Fattore VIII

Genomic DisordersPatologie che derivano da riarrangiamenti di una regione di DNA, causati da ricombinazione omologa ineguale tra LCR-> delezione o duplicazione di 1 o + geni sensibili al dosaggio, o inattivazione di uno specifico gene

Polimorfismi•Presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche di un gene o una determinata sequenza di DNA•Allele più raro frequenza maggiore 1%•La > parte di polimorfismi sono neutrali, non hanno un effetto sul fenotipo

TIPI DI POLIMORFISMI PIU’ COMUNI•Cambiamenti di una singola base (SNPs)•Inserzioni o delezioni di piccole dimensioni•Variazione nel numero di sequenze ripetute in tandem •microsatelliti (Short Tandem Repeats)•minisatelliti (VNTR)

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

•Differenze di singola base•Biallelici•Più frequenti varianti di DNA (circa 1/300 bp) •Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in larga scala•Basso tasso di mutazione in confronto ai microsatelliti

VariantiSeq DNA

Variabilità fenotipica

Predisposizione a malattieCaratteristiche fisicheRisposta a influenze ambientaliRisposta a farmaci

DbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

SNP variation in humansNumber of SNPs in dbSNP

~ 10 million common SNPs in the human

genome

double hit

validated by genotyping

total non-redundant SNPs

Nature 437:1299 (2005)

•Microsatelliti (STR Short Tandem Repeats)

Classe di sequenze ripetute, costituite da ripetizioni in tandem di 2-3-4 pbFiancheggiate da sequenze uniche

Es: Ripetiz di dinucleotidi CA/GT CT/AG

Molto polimorfici e uniformemente distribuiti nel genoma (1/50-100 Kb)-> utili come marcatori genetici •Minisatelliti •ripetizioni in tandem di una corta sequenza (10-100 bp)•distribuzione non omogenea (vicino ai telomeri)•sequenza comune (core) GGGCAGGAXG + seq specifiche

Molto polimorfici : utili come marcatori per mappe genetiche ma distribuz non omogeneaUtilizzati in passato per DNA FINGERPRINTING(descritti da Jeffreys)

Genetic variation in the human genome

Tecniche citogenetiche -> anomalie cromosomiche (> 3 Mb)Tecniche molecolari (sequenziamento) -> varianti del DNA di piccole dimensioni (< 1-10 Kb)

Nuove tecnologie hanno recentemente permesso di individuare varianti del DNA di dimensioni intermedie:

Varianti strutturali submicroscopiche•Copy Number Variants (CNVs) (inserzioni, duplicazioni, delezioni)•Inversioni

ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization)

Rivela le differenze tra 2 genomiArrays: BAC

Oligonucleotidi (60-100 bp)

ROMA (representational oligonuclotide microarray analysis)

AGTGGGTCGAGCTGATCGATCGGTCG

AGTGGGTCGAGCCGATCGATCGGTCG

AGTGGGTCGAGCAGATCGATCGGTCG

AGTGGGTCGAGCGGATCGATCGGTCG

Allele AAllele B PM-A

MM-APM-BMM-B

mismatch

Affymetrix SNP arraysAB BB AA

mismatch

analisi su 270 individui 1400 CNVs 12% (360 Mb) genoma

Effetti delle varianti strutturali sul fenotipo:• dosaggio genico• position effect

•285 geni in OMIM morbid map -> overlap con CNVs•Alta densità di CNVs vicino ai breakpoint di genomic disorders•Difficoltà nel risolvere le correlazioni genotipo-fenotipo

Database of genomic variantshttp://projects.tcag.ca/variation