tierärztliche hochschule hannover...cancellous bone and bone marrow (ß-tcp b/bm/cb) for mandibular...
TRANSCRIPT
1
Tierärztliche Hochschule Hannover
Primäre Rekonstruktion mandibulärer Kontinuitätsdefekte durch
eine ß-Trikalziumphosphat-Matrix beim Schaf
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Mirja Christine Nolff
Neuss
Hannover 2009
2
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Univ. Prof. Dr. M. Fehr
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Univ. Prof. Dr. Dr. N.-C. Gellrich
Medizinische Hochschule Hannover
3. Dr. G. Hauschild
Universitätsklinikum Münster
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Fehr
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H. Gasse
Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2009
3
Meinen Eltern
4
5
Inhaltsverzeichnis
Diese Dissertation basiert auf zwei Veröffentlichungen in international anerkannten
Fachzeitschriften mit Gutachtersystem (peer review).
1 Einleitung 12
2 Manuskript I 17
‘Comparison of two ß-TCP composite grafts used for reconstruction
of mandibular critical size bone defects.’
2.1 Summary 18
2.2 Introduction 19
2.3 Material and Methods 21
2.4 Results 27
2.5 Discussion 35
2.6 Footnotes 39
2.7 References 40
3 Manuskript II 45
‘Comparison of Computed Tomography and Microradiography
for Graft Evaluation after Reconstruction of Critical Size
Bone Defects using ß-Tricalcium-Phosphate.’
6
Summary 46
Introduction 47
Material and Methods 50
Results 57
Discussion 65
Conclusion 70
Footnotes 71
References 72
4 Diskussion 80
4.1 Methode 80
4.1.1 Tiermodell 80
4.1.2 Defektmodell 83
4.1.3Wahl des chirurgischen Modells 84
4.1.4 Versuchsstruktur 85
4.1.5 Wahl der Auswertungsmethoden 86
4.2 Diskussion der Ergebnisse 89
4.2.1. OP verlauf und Heilungsphase 89
4.2.2. Ergebnisse der feingeweblichen Untersuchungen 91
4.2.3. Ergebnisse der Validierung des diagnostischen Wertes
der Computer Tomographie 95
4.2.4. Praktische Bedeutung der Ergebnisse der durchgeführten
Studie 100
7
5 Zusammenfassung 101
6 Summary 104
7 Literaturübersicht 107
8 Anhang 114
8.1 Bestätigungen der Verlage 114
8.1.1. Bestätigung Manuskript I 114
8.1.2. Bestätigung Manuskript II 115
8.2 Erklärungen über die erbrachten Eigenleistungen gemäß § 8 Promotions 116
Ordnung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
8.3 Tabellarische Darstellungen der Original-Daten 118
8.3.1 Messungen Histomorphometrie 118
8.3.2 Messungen CT und µ-Radiografie 120
9 Danksagung 124
8
9
Abkürzungsverzeichnis
BA/TA Bone Area / Tissue Area
BSE Bovine Sponigiforme Encephalopathie
CA/TA Cartilage Area / Tissue Area
°C Grad Celsius
cm Zentimeter
CT Computer Tomographie ; Computer Tomography
FA/TA Fibrous Tissue Area / Tissue Area
HA Hydroxylapatit
HIV Humanes Immunudefizienz Virus
HU Hounsfield Units
IM intramuskulär
IV intravenös
Kg Kilogramm
l Liter
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
MMA Methylmethacrylate, Methylmethacrylat
MSC Mesenchymal Stem Cell
SA/TA Scaffold Area /Tissue Area
SC subcutan
10
std Standardabweichung
stdgeo geometrische Standardabweichung
q24h alle 24 Stunden
q48h alle 48 Stunden
ß-TCP ß-Trikalziumphosphat
ß-TCPB ß- Trikalziumphosphat mit Blut
ß-TCPB/BM/CB ß-Trikalziumphosphat mit Blut, Knochenmark und Spongiosa
µg Mikrogramm
µm Mikrometer
x Standardabweichung
x geo geometrische Standardabweichung
% Prozent
11
Die vorläufigen Ergebnisse der zugrunde liegenden Studie wurden im Rahmen
folgender Kongresse präsentiert:
10th International Symposium / Biomaterials NRW 2008: Fundamentals and Clinical
Applications im März 2008 in Essen.
Vortrag unter dem Titel: ‚Comparison of Conventional Computed Tomography and
Microradiography for ß-TCP Graft Evaluation.’
14th Swiss Conference on Biomaterials (Swiss Society for Biomaterials 2008)
im Mai 2008 in Basel.
Posterpräsentation unter dem Titel:
‚Comparison of two Different ß-TCP Composites for Reconstruction of Ovine
Mandibular Continuity Defects.’ , EUR CELL MATER, Vol. 16, Supplement 1, 2008,
p.16
Vortragspräsentation unter dem Titel:
‘Comparison of Computed Tomography and Microradiography for ß-TCP Graft
Evaluation after Mandibular Reconstruction.’
EUR CELL MATER, VOL 16, SUPPLEMENT 1,2008, p.42
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biomaterialien
Im November 2008 in Hamburg.
Posterpräsentationen unter dem Titel:
‚Comparison of two Different ß-TCP Composites for Reconstruction of Ovine
Mandibular Continuity Defects.’
‚Comparison of Computed Tomography and Microradiography for ß-TCP Graft
Evaluation after Mandibular Reconstruction.’
12
13
1 Einleitung
Die adäquate Versorgung ausgedehnter Knochendefekte nach Trauma, ablativer
Tumorchirurgie oder ausgedehnten Entzündungen stellt auch heute noch weltweit
eine große Herausforderung für die rekonstruktive Chirurgie dar. Der Ersatz von
Knochengewebe kann in jeder Lokalisation notwendig werden und betrifft damit
verschiedenste chirurgische Disziplinen. Die Rekonstruktion von mandibulären
Defekten stellt hierbei aufgrund der funktionellen Beteiligung, die der Mandibel an
Vokalisation, Mastikation und Abschluckvorgang zukommt, sowie der komplexen
Bewegung und der damit verbundenen Kraftverteilung innerhalb des Knochens eine
besondere Schwierigkeit dar (DECHAMPLAIN 1973; STRONG et al. 2003).
Trotz jahrzehntelanger Forschung auf dem Gebiet des Knochenersatzes gelten freie,
autogene, corticospongiöse Transplantate oder gestielte, osteomusculocutane
Plastiken nach wie vor als Goldstandard (STEVENSON 1999).
Autogener, corticospongiöser Knochen unterstützt die Defektheilung sowohl passiv
als auch aktiv. Mit einem autogenen Transplantat werden ein dreidimensionales,
osteokonduktives Gerüst, vitale osteogene Zellen und osteoinduktive
Wachstumsfaktoren der organischen Matrix übertragen (RODRIGUEZ-MERCHAN u.
FORRIOL 2004; KRAUS u. KIRKER-HEAD 2006). Ein gestieltes Transplantat bietet
zusätzlich den Vorteil eines vitalen Weichteilmantels, der mit intakter Vaskularisation
transplantiert werden kann und insbesondere bei stark geschädigtem
Transplantatlager eine adäquate nutritive Versorgung des übertragenen Knochens
gewährleistet (PELEG u. LOPEZ 2006).
14
Allerdings ist die Entnahme autogener Transplantate mit einer erheblichen Morbidität
assoziiert. Der betroffene Patient wird einem zusätzlichen Eingriff ausgesetzt, der mit
Schmerzen und Einschränkungen verbunden ist, und muss Risiken wie
Frakturgefahr und Nervenschädigung in Kauf nehmen (YOUNGER u. CHAPMAN
1989; BANWART et al. 1995; KLINE u. WOLFE 1995). Zudem ist die Menge des zur
Verfügung stehenden Knochens, insbesondere bei Kindern, begrenzt. Bei
Transplantatabstoßung kann die Prozedur daher nur in begrenztem Umfang
wiederholt werden (DELLOYE et al. 1992).
In der Vergangenheit wurden vielfältige Alternativen zum autogenen Knochen auf
ihre Eignung als Ersatzmaterial untersucht, die sich grob wie folgt gruppieren lassen:
allogener Knochen, xenogener Knochen sowie die große Gruppe der synthetischen
Knochenersatzmaterialien (RUEGER 1998; CORNELL 1999; BAUER u. MUSCHLER
2000).
Der Einsatz von allo- und xenogenem Knochen wird aufgrund potentieller
Übertragungsgefahr bestimmter Virus- oder Prionenerkrankungen (HIV,BSE) in den
letzten Jahren kontrovers diskutiert (TOMFORD 1995; BOYCE et al. 1999;
TOMFORD u. MANKIN 1999, HAUSCHILD u. BADER 2004), obwohl in
verschiedenen Studien bestätigt wurde, dass nach adäquater Vorbehandlung des
Knochenmaterials kein klinisch relevantes Risiko einer Virusübertragung besteht
(WENZ et al. 2001). Ein weiterer erheblicher Nachteil von allogenen und xenogenen
Transplantaten ist in der Tatsache begründet, dass hierbei im Gegensatz zu
autogenem Knochen totes Gewebe transplantiert wird. Dieses tote Gerüst kann
insbesondere bei großen, corticospongiösen Transplantaten nicht vollständig
erschlossen und umgebaut werden und verbleibt somit letztendlich ganz oder
15
teilweise als Fremdkörper im Knochen. Verglichen mit autogenen Transplantaten
besteht insgesamt ein höheres Risiko von Transplantatabstoßung oder Fraktur
(WHEELER u. ENNEKING 2005).
Innerhalb der großen Gruppe der synthetischen Ersatzmaterialien erscheinen
keramische Werkstoffe besonders geeignet. Insbesondere die beiden Hauptvertreter
dieser Gruppe, Hydroxylapatit (HA) und ß-Trikalziumphosphat (ß-TCP), zeichnen
sich durch eine hervorragende Biokompatibilität aus. Sie sind osteokonduktiv und
ihre chemische Zusammensetzung ähnelt nativem Knochen (JOHNSON et al. 1996;
JENSEN et al. 2006). Optimale Gesamtporosität, Porengröße sowie
Interkonnektivität wurden in zahlreichen Studien bestimmt und moderne
Produktionsverfahren ermöglichen die Herstellung von keramischen Implantaten mit
optimalen strukturellen Eigenschaften in jeder gewünschten drei-dimensionalen Form
(EGGLI et al. 1988; LU et al. 1999; HUTMACHER 2001; BLOEMERS 2002; HING
2005). Zusätzlich zu den genannten Vorteilen zeichnet sich ß-TCP außerdem durch
seine Biodegradierbarkeit aus. Biodegradierbare Materialien dienen zunächst dem
strukturellen Ersatz verlorenen Knochenmaterials und werden im Rahmen der
Heilung fortschreitend abgebaut. Der Degradationsprozess ermöglicht ein natürliches
Remodelling, an dessen Ende kein Fremdmaterial mehr im Regenerat verbleibt, das
potentielle adverse Reaktionen verursachen könnte oder die mechanische Integrität
des Regenerates negativ beeinflussen würde (RENOOIJ et al. 1985; HING 2005).
Als Nachteile dieser Materialien sind im Wesentlichen mangelnde mechanische
Belastbarkeit und die hohe Röntgendichte zu nennen.
Ein keramisches Knochenersatzmaterial, unabhängig ob HA oder ß-TCP, ist struktur-
wie materialbedingt initial nicht in der Lage, die mechanische Belastung im Bereich
16
der Defektzone zu tragen (CHU et al. 2002; BIGNON et al. 2003). Daher ist in der
überwiegenden Zahl der Fälle eine stabile Osteosynthese notwendig, um die
Kraftübertragung auf das Transplantat so stark wie möglich zu minimieren. Generell
gilt, dass ein keramischer Ersatzstoff stabil genug sein muss, um den Vorgang der
Implantation zu überstehen und die eigene Micro- und Makrostruktur zu erhalten.
Mechanische Stabilität des betroffenen Knochenbereiches wird im weiteren Verlauf
der Heilung durch Remodelling des neu gebildeten Knochens erreicht (HING 2005).
Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von ß-TCP, HA und spongiösem Knochen
haben alle Materialien eine ähnliche Röntgendichte. Eine zuverlässige Überwachung
von Integration, Osteoneogenese und Degradation innerhalb einer implantierten
keramischen Matrix auf Basis der bislang klinisch eingesetzten bildbgebenden
Verfahren erscheint daher fragwürdig. Obwohl verschiedenste Autoren dieses
Problem benennen und fordern, dass die Genauigkeit radiologischer Methoden bei
der Beurteilung der genannten Parameter bestimmt wird, fehlen derartige Studien in
der Literatur weitgehend (JOHNSON et al. 1996; RUEGER et al. 1998; BLOEMERS
2002; GOLDSTEIN 2002). Es mangelt allerdings nicht an Veröffentlichungen, die den
Erfolg verschiedener keramischer Knochenersatzstoffe radiologisch beurteilen, ohne
zuvor eine entsprechende Validierung durchgeführt zu haben.
Keramische Knochenersatzstoffe bieten im Gegensatz zu autogenem Knochen
lediglich ein osteokonduktives Gerüst; per se liefern sie weder osteogene Zellen
noch osteoinduktive Wachstumsfaktoren (JOHNSON et al. 1996; BLOKHUIS et al.
2000; HING 2005). Beide Komponenten können allerdings einem keramischen
Transplantat zugesetzt werden (FLEMING et al. 2000; SEEHERMAN 2001). Die in-
vitro-Besiedelung von ß-TCP-Matrices ist allerdings kosten- und zeitaufwendig
17
(BRUDER u. FOX 1999; TAY et al. 1999). Zudem kann ab einer kritischen
Implantatgröße eine ausreichende nutritive Versorgung der Zellen im Kern des
Gerüstes nach Implantation nicht mehr gewährleistet werden (SIPE et al. 2002). Es
erscheint zum derzeitigen Standpunkt sinnvoll, nach Alternativen zu suchen, die eine
möglichst einfache, kostengünstige Kombination von passiver Trägermatrix und
aktiven Komponenten wie osteogenen Zellen und osteoinduktiven Faktoren ad
tabulam ermöglichen.
Ziel dieser Studie war es, die Eignung von zwei verschiedenen, perioperativ ad
tabulam hergestellten ß-TCP-Komposit-Matrices zur Rekonstruktion von
mandibulären Kontinuitätsdefekten kritischer Größe zu testen. Hierzu wurden
insbesondere Osteointegration, Osteoneogenese sowie Transplantatdegradation
bestimmt. Des Weiteren wurde ein objektiver Vergleich von CT - Messungen des
Regenerates mit in-vitro bestimmten Werten vorgenommen, um die Genauigkeit des
CT als repräsentative Diagnostik-Methode zur Evaluierung des
Regenerationsfortschrittes in vivo zu bestimmen.
18
2 Manuskript I
Eingereicht am 20.04.2008 und akzeptiert zur Veröffentlichung am 24.06.2008 (siehe
Seite 114) in ‘Veterinary Comparative Orthopedics and Trauma’, Impact Factor 0,777
(2007). Erschienen in V.C.O.T. 22 (2): 96-102. 2009.
Comparison of two different ß-TCP composite grafts used
for reconstruction of mandibular critical size bone defects.
Mirja Christine Nolff 1,2,*, Dr. Dr. Horst Kokemueller 1, Dr. Gregor Hauschild 2,3, Prof. Dr.
Michael Fehr 2, Dr. Dr. Kai- Hendrick Bormann 1, Dr. Karl Rohn 4, Simon Spalthoff 1, Prof. Dr.
Dr. Martin Rücker 1 , Prof. Dr. Dr. Nils -Claudius Gellrich1
1 Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hannover Medical School, 30625
Hannover, Germany
2 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, 30173,
Germany
3 Department of Orthopedics, University of Münster, 48149 Münster , Germany
4 Department of Biometry, Epidemiology and Information Processing; University of
Veterinary Medicine Hannover, 30559 Hannover, Germany
* Corresponding author
Key words: Mandibular continuity resection, ß-Tricalcium Phosphate Composite,
Bone Marrow, bone graft substitute, sheep
19
Summary.
Objective: To compare osseointegration of blood perfused ß-Tricalcium Phosphate
cylinders (ß-TCPB) with similar composites that were additionally loaded with
cancellous bone and bone marrow (ß-TCPB/BM/CB) for mandibular reconstruction.
Methods: Twelve German Black-Headed Sheep with an average weight of 72.5 +/-
10 kg underwent segmental resection of the right hemi-mandible. Animals assigned
to group A (n=6) were reconstructed using ß-TCPB while sheep assigned to group B
received ß-TCPB/BM/CB grafts. Tissue quality was histologically assessed and bone-,
scaffold-, cartilage- and fibrous-tissue area were estimated using semiautomated
histomorphometrical software.
Results: ß-TCPB/BM/CB grafts exhibited significant (p<0.01) higher amounts of bone
formation than ß-TCPB. Animals assigned to group B achieved defect union and a
high grade of bone maturation. Residual ceramic remnants were rare and
disconnected. Bone maturity within group A was inferior and none of the specimens
showed defect union. The defect center was still occupied by a ceramic core.
Clinical Significance: TCPB/BM/CB composites may qualify as a promising alternative to
autograft bone for mandibular reconstruction in human and veterinary medicine.
20
Introduction.
Increased understanding of the main reasons for impaired bone healing resulted in
continuous improvement of different bone graft substitutes in order to overcome the
shortcomings of the current gold standard autogenous cancellous bone (1-4).
Autograft bone is limited regarding its availability and harvesting is associated with
considerable donor side morbidity and prolonged surgery time (5, 6). Based on the
composition of trabecular bone, alternative methods for bone substitution were
divided into cellular-, factor- and matrix-based approaches (7-10). The high impact of
osteogenic cells on healing of large or otherwise compromised bone defects has led
to the development of techniques that combine osteogenic cells and appropriate
scaffolds (9, 11, 12). One of the first approaches to utilize osteoprecursor cells to
increase bone formation was the use of unfractioned bone marrow aspirate over a
century ago. Since then the usage of bone marrow proved efficient in numerous trials
(13, 14), but recent approaches mainly concentrate on in vitro methods for cell
purification and expansion for scaffold loading (11, 15-17). Unfortunately, these in
vitro tissue engineered constructs have exhibited problems with physical properties,
maintenance of cell prototype and host immune response (18-22). Additionally,
according to Tay et al. (23), in an environment where cost containment becomes an
issue in patient care, the use of this powerful compound in any significant amount
may become prohibitive. Bone marrow represents an easily accessible and cost
effective source for osteogenic cells that can be combined with appropriate
osteoconductive carriers. Among the various investigated scaffold materials,
21
ceramics have proven to be especially attractive regarding osteoconduction and
biocompatibility (1, 15, 24, 25). The current study was designed to compare
osseointegration and degradation of a blood loaded ß-TCP composite (ß-TCPB) with
a similar composite that was additionally loaded with bone marrow and cancellous
bone positioned within a through-bore-hole along the central line (ß-TCPB/BM/CB) after
reconstruction of critical size mandibular defects. We assumed that osseointegration
of the ß-TCPB/BM/CB composite would quantitatively and qualitatively exceed the result
of the ß-TCPB composite.
22
Materials and Methods.
Experimental Design.
Animal experiments were conducted under an ethic committee approved protocol in
accordance with German federal animal welfare legislation. Twelve healthy skeletally
mature (age 2-4 years, mean age 3.75 ± 0,59 years) female German Black-headed
Sheep with an average weight of 72.5 +/- 7,4 kg were included in the study. Animals
were randomly divided into two groups, each animal receiving partial resection and
restoration of the right hemi-mandible. Animals assigned to group A (n=6) were
grafted with ß-TCPB while defects in group B (n=6) were reconstructed using
predrilled ß-TCPB/BM/CB composites (Fig. 1). All animals were sacrificed 12 weeks
after surgery and bone-, ceramic-, soft tissue- as well as cartilage area was
assessed.
Fig.1. ß-TCPB cylinders after blood aspiration prior to implantation (A) and pre-drilled
ß-TCPB/BM/CB composites after blood aspiration and loading with morselized bone and bone
marrow (B).
23
Surgical Procedure.
After intravenous induction (1 ml midazolam, 5 mg/kg propofol) anesthesia was
maintained with isoflurane delivered in 100% oxygen (1l/min) and all animals
received buprenorphine (10 µg/kg, IM) and carprofen (4 mg/kg, ½ IV, ½ SC) for peri-
operative analgesia. During surgery animals received additional fentanyl boluses
(0,005 mg/kg, IV). Systolic, diastolic and mean blood pressure, electrocardiogram as
well as rectal temperature and hemoglobin oxygen saturation were continuously
monitored. After aseptical preparation of the surgical field the lateral and medial
aspect of the right mandibular body and angle were exposed by a subangular
incision. Before resection two Compact 2.4 UniLOCK a mandibular reconstruction
plates were pre-positioned in order to maintain correct position of the mandible. A
retromolar segmental resection of the right mandible was performed in order to
create a triangular defect, measuring 2.7cm at the lower border and 1.5 cm at the
retromolar area. The intervening segment was removed and the titanium plates were
reapplied to fixate the proximal and distal segments before reconstruction. Defects
were reconstructed using either a ß-TCPB cylinder of 2.5 cm length and 2 cm
diameter (group A) or a similar ß-TCPB/BM/CB cylinder (group B) with a central
passage of 0.7 cm diameter (Fig. 2).
24
Fig. 2. Osteotomy and reconstruction of the mandibular critical size defect. (A) Removal of the
osteotomized segment and (B) reconstruction of the defect with the bone graft substitute.
Blood was aspirated through the cylindrical ß-TCP blocks using special syringes
included in the ß-TCP kit. The cancellous bone material used for group B was
harvested from the iliac crest by the use of two bone biopsies (0.5 cm diameter),
morselized by an electrical bone mill b, mixed with amorphous marrow aspirated from
the depth of the biopsy areas and loaded into the central passage of the predrilled
blood soaked cylinders. All cylinders were fitted into the basal aspect of the defect
and secured to the plate using resorbable Vicryl 0 cerclages. The soft tissue wounds
were closed in layers using resorbable Vicryl 2.0 sutures.
Post-operative Care
An additional bolus of buprenorphine (10 µg/kg IM) was given before recovery to
maintain analgesia. All sheep were allowed unlimited activity as well as access to
food and water immediately after surgery. Pre-operative prophylactic penicillin (0.04
ml/kg, IM, q48h) as well as peri-operative analgesia (carprofen, 2 mg/kg, SC, q24h /
buprenorphine 10 µg/kg, IM, q24h) was continued for four respectively three
25
(buprenorphin) days. The healing process was assessed by daily physical
examinations, daily pain scoring based on observation of behavioral changes and
changes in ruminating patterns as well as repeated weight controls during the first
three weeks. Physical examinations and weight controls were continued until
sacrifice. Twelve weeks after surgery all animals were euthanized after deep
sedation (Midazolam 1 mg/kg, IM, Propofol 5 mg/kg, IV, pentobarbital 80 mg/kg, IV)
and mandibular segments were retrieved for histological evaluation.
Specimen Processing
Mandibular segments were fixated in 3.5% neutral buffered formalin for a week. After
rinsing and dehydration using increasing concentrations of ethanol followed by
acetone specimens were infiltrated and embedded in methylmethacrylate (MMA)
under vacuum. Slow polymerization was completed in a drying-chamber at 37°C.
MMA embedded defects where sectioned along the dorsal plane using a modified
inner-hole diamond saw c. Undecalcified slices of 30 µm were surface stained with
alizarine-methylene blue for standard light microscopy and histomorphometric
analyses.
Histological and histomorphometrical evaluation
Five slides per animal including the central slide, the two slides next to the initial
ceramic borders marked by the remaining suture material and two intermediate slides
positioned between central slide and surface were used for further evaluation. Digital
26
images of each slide were obtained using a Zeiss AxioImager MI Microscope fitted
with an AxioCam MRc digital camera and AxioVision 4.5 software d. The AxioVision
module MosaiX was used to scan the total specimen (4x3 cm per slide).
Electronically created images of the entire defect area provided the basis for further
analysis. A region of interest measuring 2.5 x 1.5 cm was marked orienting at the
remaining cortices rostral and caudal of the defect. Total bone area (BA/TA), ceramic
area (SA/TA), cartilage area (CA/TA) as well as fibrous tissue area (FA/TA) were
quantified using the image-analysis software Analysis 3.0 e. Additionally all slides
were blinded and randomly reviewed for qualitative histological evaluation.
Statistical Analysis
Serial slides retrieved from ten animals were included in histomorphometric
evaluation and statistical analysis. Goodness of fit for normal distribution of model
residuals of BA/TA, CA/TA, FA/TA and SA/TA was assessed using Q-Q-plots and
Kolmogorov-Smirnov test. Arithmetic means ( x ) and standard deviation (std) were
calculated for normal distributed parameters. For lognormal distributed parameters
such as SA/TA or CA/TA logarithmic transformation was performed prior to analysis
and geometric mean ( x geo) as well as geometric standard deviation (stdgeo) were
calculated. The impact of the different graft types (TCPB vs. TCPB/BM/CB) and slide
position (surface, intermediate, central) was examined using two-way analysis of
variance with post hoc t-test for five pair wise comparisons between corresponding
slides. A probability level of adjusted p was considered statistically significant for p <
0.01. The statistical software SAS, version 9.1f was used for analyses of all data.
27
Results.
Soft tissue swelling resolved within a week enabling palpation of the defect area.
None of the animals developed signs of instability or increased pain at the surgical
site. All animals started sufficient ingestion and rumination immediately after recovery
and continuously gained weight during the maintenance time. At sacrifice
inflammation of the grafted area resulting in sequestration of the ceramic became
obvious in two cases [group A (n=1) and b (n=1)]. Data from these animals were
excluded from further evaluation. Fracture of the reconstruction plates resulting in
increased callus formation at the defect area without further impairment of
mandibular contour occurred in two animals of each group leaving three sheep per
group that underwent bone healing under stable conditions. Statistical analysis
revealed no significant difference in the amount of tissue types between specimens
retrieved from stable and unstable defects in each group, thus the mechanical
unstable animals were not separated and five specimens per group were included in
further evaluation.
28
29
Fig. 3. Histological overview sections of defects grafted with ß-TCPB (A) and ß-TCPB/BM/CB (B). Bone is
developing around the cut ends and along the enveloping fibrous tissue at the lateral graft surface
after reconstruction with a TCPB composite (A). The specimen retrieved from an animal that underwent
reconstruction with ß-TCPB/BM/CB displays bony union of the defect, residual ceramic is mainly
osseointegrated. Alizarin-red Methylene-blue stain, cc: cis cortex, tc: trans cortex, s:residual ß-TCP
scaffold,c:cartilage, OS: osteosynthetic material , red arrows:sections within the scaffold with direct
bone ceramic interface.
Descriptive Histology.
Bone in growth into the defect was rare within group A. New bone deposition mainly
occurred close to the borders of the osteotomy site and bony organization varied
from mature lamellar bone at the junction to the intact cortex to highly immature bone
at the periphery of the bony outgrowths. Following the outer surface of the ceramic
new bone started to envelope the scaffold. Osteogenic activity was evident due to the
presence of osteoid seams and osteoblasts aligned along the mineralized surfaces
but direct bone to scaffold contact was rare due to an intervening layer of fibrous
tissue (Fig. 3).
Bone apposition within the pores could only be seen in areas of direct bone-scaffold
contact and was proceeded by in- growth of fibrous or chondroid tissue (Fig. 4.A).
The core of the ceramic graft was intact and the void pore spaces were completely
filled by highly cellular vascularized fibrous tissue. None of the specimens included in
group A achieved defect union.
Dense lamellar bone bridged the defect in group B (Fig. 3.B). Similar to group A,
osteoid deposition by aligning osteoblasts indicated ongoing bone formation. Main
parts of the ß-TCP graft had been replaced by new bone leaving only small,
30
extracellular remnants of the initially grafted material. In contrast to group A, ceramic
surfaces had intimate contact with the newly formed bone (Fig. 4.B).
Porous bone patterns similar to the scaffold architecture and matrix remnants within
the woven bone could be seen in close contact to remaining scaffold borders (Fig. 5).
Residual ceramic granules were often accompanied by a moderate amount of
histiozytes but no multinucleated giant cells or other histological evidence of a foreign
body reaction could be seen.
31
Fig. 4. Bone-ceramic interface after a healing period of twelve weeks in ß-TCPB composites (A). Bone
deposition within the scaffold was rare and the graft was enveloped in fibrous tissue. In contrast, the
main parts of the residual ceramic were integrated within newly formed bone when ß-TCPB/BM/CB
composite was used (B).Alizarin-red Methylene-blue stain,s: ß-TCP scaffold, b: mineralized bone
c:cartilage ft: fibrous tissue, red arrows: ongoing enchondral ossification.
32
Fig. 5. Newly formed woven bone within the defect of an animal grafted with ß-TCP bone marrow
composite, red arrows mark incorporated residual ß-TCP within the mineralized bone matrix.
Alizarin-red Methylene-blue stain.
Histomorphometry
Results of the histomorphometric analysis are illustrated in Figure 6 and Table 1.
The distribution of newly formed bone and remaining scaffold area across the defect
was variable. Bone deposition within group A was most prominent at the two
marginal sections and declined with increasing proximity to the defect center where
higher amounts of residual ceramic were present. Average BA/TA calculation for the
33
two specimens that underwent healing under instable conditions was slightly, but not
significantly higher at each position than for the rest of the group.
Total Bone Area a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5
Slide Number
%TA/BA Group A
TA/BA Group B
Ceramic Area b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5
Slide Number
%SA/TA Group A
SA/TA Group B
Connective Tissue
Area a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5
Slide Number
%FA/TA Group A
FA/TA Group B
Cartilage Area b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5
Slide Number
%CA/TA Group A
CA/TA Group B
Figure 6. Histomorphometrical evaluation of mean area fractions of bone (a), residual ß-TCP
(b), cartilage (c) and fibrous tissue (d) at the five positions within the defect.
a means and standard deviation
b geometric means and geometric standard deviation
Group B presented comparable amounts of BA/TA as well as SA/TA among all
slides. The two specimens that underwent healing without rigid fixation due to plate
fractures had lower estimates for BA/TA and SA/TA within group B, but still exceeded
average estimates within group A. Osteointegration and degradation of the ceramic
34
graft in group B exceeded group A, showing significant (p<0.01) higher amounts of
bone formation and less residual graft material within the three central slides while no
significant difference could be estimated for the two marginal slides regarding these
two parameters between the groups. Estimates for cartilage area (CA/TA) as well as
fibrous tissue area (FA/TA), including blood vessels, did not significantly differ
between the two groups (Table 1).
Table Significance of pair-wise comparisons between group A and B.
Probability Values
BA/TA
SA/TA FA/TA CA/TA
Slide 1 0.2350 0.06 0.1559 0.1295
Slide 2 0.0005* 0.0013* 0.2844 0.0321
Slide 3 0.0007* 0.0034* 0.0384 0.2947
Slide 4 0.0002* 0.0005* 0.081 0.0099*
Slide 5 0.2762 0.071 0.105 0.1660
BA/TA: Total Bone Area, SA/TA: residual Ceramic Area, FA/TA: Fibrous Tissue Area, CA/TA:
Cartilage Area
* Significant difference between the two groups (p<0.01)
35
Discussion.
In this study we compared the ability of ß-TCP scaffolds, either used in combination
with autogenous blood or with autogenous bone marrow and cancellous bone, to
support osteoregeneration after mandibular reconstruction in adult sheep. The
chosen critical size defect model, described by Ayoub et al. (26), mimicked the
clinical setting after sectional bone loss and permitted evaluation of the material in a
functional area where it may be used in human and veterinary medicine (8, 19, 27).
Implant failure of the fixation devices, presumably caused by the rumination process,
led to decreased mechanical stability at the defect site in four cases resulting in a
high deviation of average estimates for BA/TA without statistically significant impact.
As anticipated, defects that were grafted with ß-TCPB showed significantly less bone
formation than defects grafted with ß-TCPB/BM/CB, which yielded good results. Since
no osteogenic cells or inductive substances were added in group A, osseointegration
solely relied on new bone formation arising from local osteogenic cells. Specimens
developed a bony collar around the osteotomized ends of the mandible and along the
outer surface of the scaffold with an intervening soft tissue layer inhibiting direct bone
apposition upon the ß-TCP surface. A ß-TCP core that was invaded by fibroblasts
and vascular sprouts occupied the central part of the defect. In-growth of invading
fibrovascular tissue within the porous structure could be accompanied by invasion of
osteoprogenitor cells providing a source for new bone deposition within the scaffold
(1, 28) but we had no possibility of evaluating the amount of osteoprogenitors within
our graft. We consider it unlikely that any of the defects in group A would have
36
achieved homogeneous union after a longer healing period but since we have no
comparable results the further bone development within the defects remains
speculative.
In group B we introduced osteogenic cells and osteoinductive factors into the defect
by the use of bone marrow and morselized bone delivered within the central passage
of the scaffolds. Regardless of the individual contribution of osteogenic cells or
natural growth factors, we could provoke a sufficient osseous healing response
without the need of expensive in vitro techniques or addition of synthetic growth
factors that might generate unexpected sequalae (12, 22). The required amount of
bone marrow and cancellous bone was low and could be easily obtained prior to
reconstruction. Cancellous bone chips that were milled and added to the marrow
were solely contained from core biopsies that were taken to obtain the bone marrow.
In contrast to the considerable morbidity that is associated with harvesting bulk
cortico-cancellous autografts in humans (5, 6) and less frequently seen in veterinary
patients (19), this method does not require massive manipulation of soft tissues or
bone in the iliac region. All animals that received cancellous bone marrow-ß-TCP
composites presented substantial ossification of the defect with osteogenic activity
and enchondral ossification of the remaining cartilagineous replacement tissue.
Minimal amounts of residual ß-TCP were present on the lateral and medial surfaces
of the bony bridge within the defect and osseointegration of the residual material
indicated further conversion. Ceramic degradation was uniform throughout the entire
defect and higher compared to group A (after correction considering the initial
difference). The central passage within the cylinders allowed better penetration of in -
growing bone and increased the surface to volume ratio of the scaffold. In addition,
37
the added cancellous bone and bone marrow served as a source for osteogenic cells
and osteoinductive factors (12, 29). The osteogenic potential of unfractioned bone
marrow has been known for more than a century (14, 30), but the limited number of
mesenchymal stem cells (MSC) contained in an bone marrow aspirate and individual
variations led to the development of in vitro alternatives that focus purifying and
expanding of MSC’s or osteoblasts prior to transplantation (9, 15, 17, 31, 32). In vitro
manipulation of MSC’s relies on complex, time-consuming and expensive techniques
(15, 33, 34). These limitations and the proven osteogenic potential of bone marrow
led to the conclusion that bone marrow may be clinically underused (28). Our study
strengthens this hypothesis and, in accordance with similar approaches, proved the
good healing support of bone marrow when delivered in a ß-TCP carrier. In contrast
to other substitution materials, ß-TCP scaffolds are biodegradable, thus no foreign
material remains to interfere with normal bone remodeling and restoration of
mechanical strength (34). Different authors have voiced concern that degradation
may occur faster than osseointegration and inhibit healing (1, 35). We could neither
confirm this concern nor identify the exact degradation mechanism of the used
material. Our findings imply that ß-TCP degradation and new bone formation parallel
each other. The amount of ceramic degradation in group A, which had minor bone
formation, seemed to be lower than in group B. Furthermore it seemed as if the
matrix did not only degrade but may have been incorporated during the
mineralization process to serve as a substrate for bone matrix deposition. It is
currently assumed that increased Ca2+ levels may lead to initiation of
biomineralization, increased osteogenic phenotype commitment, stimulation of local
osteoclasts or a combination of these mechanisms (28, 36, 37). We could not confirm
38
earlier observations that reported osteoclasts in close proximity to ß-TCP remnants
(38, 39) but osteoclastic stimulation leading to increased osteoblast activation could
explain the apparent synchronization of bone formation and matrix degradation.
Since we did not use tartrate-resistant acid phosphatase stain to identify osteoclasts
it may be possible that multinucleated cells were present but could not be identified.
The ß-TCPB/BM/CB composite used in this study could sufficiently heal a mandibular
critical size defect. Although our findings cannot be transferred to clinical situations
where the host bed is frequently compromised by infection or irradiation, they
strongly encourage additional investigation of the ß-TCPB/BM/CB composite to verify
our results. The described method offers the advantage of manufacturing an efficient
bone graft substitute table-side during surgery using the patient’s own cells,
circumventing the need for cell culture, expansion, or preservation. Degradation of
the material presumably supported matrix mineralization by means of a process that
resembled physiologic bone remodeling. The osteoregenerative capabilities of the
TCPB/BM/CB composite indicate a promising potential for various clinical indications
including mandibular reconstruction.
39
Footnotes.
a Synthes Europe GmbH, Oberdorf, Switzerland
b Aesculap AG & CO. KG, Tuttlingen, Germany
c Leitz, Wetzlar, Germany
d Carl Zeiss AG, Obernkochen, Germany
e Olympus Soft Imaging Solutions, Münster, Germany
f SAS Institute, Cary, NC
40
References.
1. Cornell CN. Osteoconductive materials and their role as substitutes for
autogenous bone grafts. Orthop Clin North Am. 1999 Oct;30(4):591-8.
2. Den Boer FC, Patka, P., Bakker, F. C., Haarman, J. T. Current concepts of
fracture healing, delayed unions, and nonunions. Osteo Trauma Care.
2002;10:1-7.
3. Rodriguez-Merchan EC, Forriol F. Nonunion: general principles and
experimental data. Clin Orthop Relat Res. 2004 Feb(419):4-12.
4. Rueger JM. [Bone substitution materials. Current status and prospects].
Orthopade. 1998 Feb;27(2):72-9.
5. Banwart JC, Asher MA, Hassanein RS. Iliac crest bone graft harvest donor site
morbidity. A statistical evaluation. Spine. 1995 May 1;20(9):1055-60.
6. Younger EM, Chapman MW. Morbidity at bone graft donor sites. J Orthop
Trauma. 1989;3(3):192-5.
7. Bauer TW, Muschler GF. Bone graft materials. An overview of the basic
science. Clin Orthop Relat Res. 2000 Feb(371):10-27.
8. Einhorn TA. Clinically applied models of bone regeneration in tissue
engineering research. Clin Orthop Relat Res. 1999 Oct(367 Suppl):S59-67.
9. Caplan AI, Bruder SP. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular
medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 2001 Jun;7(6):259-64.
10. Khan SN, Bostrom MP, Lane JM. Bone growth factors. Orthop Clin North Am.
2000 Jul;31(3):375-88.
41
11. Vacanti CA, Vacanti JP. The science of tissue engineering. Orthop Clin North
Am. 2000 Jul;31(3):351-6.
12. Bruder SP, Fox BS. Tissue engineering of bone. Cell based strategies. Clin
Orthop Relat Res. 1999 Oct(367 Suppl):S68-83.
13. Connolly JF, Guse R, Tiedeman J, Dehne R. Autologous marrow injection as a
substitute for operative grafting of tibial nonunions. Clin Orthop Relat Res.
1991 May(266):259-70.
14. Muschler GF, Nitto H, Matsukura Y, Boehm C, Valdevit A, Kambic H, et al.
Spine fusion using cell matrix composites enriched in bone marrow-derived
cells. Clin Orthop Relat Res. 2003 Feb(407):102-18.
15. Kon E, Muraglia A, Corsi A, Bianco P, Marcacci M, Martin I, et al. Autologous
bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic
accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. J Biomed
Mater Res. 2000 Mar 5;49(3):328-37.
16. Bruder SP, Kurth AA, Shea M, Hayes WC, Jaiswal N, Kadiyala S. Bone
regeneration by implantation of purified, culture-expanded human
mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1998 Mar;16(2):155-62.
17. Ohgushi H, Kitamura S, Kotobuki N, Hirose M, Machida H, Muraki K, et al.
Clinical application of marrow mesenchymal stem cells for hard tissue repair.
Yonsei Med J. 2004 Jun 30;45 Suppl:61-7.
18. Lane JM, Tomin E, Bostrom MP. Biosynthetic bone grafting. Clin Orthop Relat
Res. 1999 Oct(367 Suppl):S107-17.
42
19. Kirker-Head CA, Gerhart TN, Schelling SH, Hennig GE, Wang E, Holtrop ME.
Long-term healing of bone using recombinant human bone morphogenetic
protein 2. Clin Orthop Relat Res. 1995 Sep(318):222-30.
20. Sipe JD, Kelley CA, McNicol LA, National Institutes of Health (U.S.).
Bioengineering Consortium. Reparative medicine : growing tissues and
organs. New York: New York Academy of Sciences; 2002.
21. Harlan DM, Karp CL, Matzinger P, Munn DH, Ransohoff RM, Metzger DW.
Immunological concerns with bioengineering approaches. Ann N Y Acad Sci.
2002 Jun;961:323-30.
22. Seeherman H. The influence of delivery vehicles and their properties on the
repair of segmental defects and fractures with osteogenic factors. J Bone Joint
Surg Am. 2001;83-A Suppl 1(Pt 2):S79-81.
23. Tay BK, Patel VV, Bradford DS. Calcium sulfate- and calcium phosphate-
based bone substitutes. Mimicry of the mineral phase of bone. Orthop Clin
North Am. 1999 Oct;30(4):615-23.
24. Perry CR. Bone repair techniques, bone graft, and bone graft substitutes. Clin
Orthop Relat Res. 1999 Mar(360):71-86.
25. Bloemers FW, Patka, P., Bakker, F.C., Haarman,H. J. T. M. The use of
calcium phosphates as a bone substitute material in trauma surgery. Osteo
Trauma Care. 2002;10:33-7.
26. Ayoub AF, Richardson W, Koppel D, Thompson H, Lucas M, Schwarz T, et al.
Segmental mandibular reconstruction by microincremental automatic
distraction osteogenesis: an animal study. Br J Oral Maxillofac Surg. 2001
Oct;39(5):356-64.
43
27. Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for
craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Relat Res. 1986 Apr(205):299-
308.
28. Fleming JE, Jr., Cornell CN, Muschler GF. Bone cells and matrices in
orthopedic tissue engineering. Orthop Clin North Am. 2000 Jul;31(3):357-74.
29. Goldstein SA. Tissue engineering: functional assessment and clinical
outcome. Ann N Y Acad Sci. 2002 Jun;961:183-92.
30. Connolly JF, Guse R, Tiedeman J, Dehne R. Autologous marrow injection for
delayed unions of the tibia: a preliminary report. J Orthop Trauma.
1989;3(4):276-82.
31. Caplan AI. Tissue engineering designs for the future: new logics, old
molecules. Tissue Eng. 2000 Feb;6(1):1-8.
32. Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, Bruder SP. Osteogenic differentiation
of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell
Biochem. 1997 Feb;64(2):295-312.
33. Bruder SP, Jaiswal N, Ricalton NS, Mosca JD, Kraus KH, Kadiyala S.
Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration. Clin
Orthop Relat Res. 1998 Oct(355 Suppl):S247-56.
34. Bucholz RW. Clinical experience with bone graft substitutes. J Orthop Trauma.
1987;1(3):260-2.
35. Cornell CN, Lane JM. Current understanding of osteoconduction in bone
regeneration. Clin Orthop Relat Res. 1998 Oct(355 Suppl):S267-73.
44
36. Damien CJ, Ricci JL, Christel P, Alexander H, Patat JL. Formation of a calcium
phosphate-rich layer on absorbable calcium carbonate bone graft substitutes.
Calcif Tissue Int. 1994 Aug;55(2):151-8.
37. Delloye C, Verhelpen M, d'Hemricourt J, Govaerts B, Bourgois R.
Morphometric and physical investigations of segmental cortical bone
autografts and allografts in canine ulnar defects. Clin Orthop Relat Res. 1992
Sep(282):273-92.
38. Eggli PS, Muller W, Schenk RK. Porous hydroxyapatite and tricalcium
phosphate cylinders with two different pore size ranges implanted in the
cancellous bone of rabbits. A comparative histomorphometric and histologic
study of bony ingrowth and implant substitution. Clin Orthop Relat Res. 1988
Jul(232):127-38.
39. Jensen SS, Broggini N, Hjorting-Hansen E, Schenk R, Buser D. Bone healing
and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium
phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of
minipigs. Clin Oral Implants Res. 2006 Jun;17(3):237-43
45
3 Manuskript II
Eingereicht am 20.08.2008 und akzeptiert zur Veröffentlichung am 24.0.2008 (siehe
Seite xx) im ‘Journal of Cranio- and Maxillofacial Surgery, Impact Factor (2007).
Comparison of Computed Tomography and
Microradiography for Graft Evaluation after Reconstruction
of Critical Size Bone Defects using ß-Tricalcium-
Phosphate.
M.C. Nolff 1,2,*, Dr. Dr. H. Kokemueller 1, Dr. G. Hauschild 2,3, Prof. Dr. M. Fehr 2, Dr. Dr. K.-
H. Bormann 1, S. Spalthoff 1, Dr. K. Rohn 4 , Prof. Dr. Dr. M. Ruecker 1 , Prof. Dr. Dr. N.- C.
Gellrich 1
1 Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hannover Medical School, 30625
Hannover, Germany
2 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation,
Bischofsholer Damm 15,Germany
3 Department of Orthopedics, University of Münster, Münster, Germany 4 Institute for Biometry, Epidemiology and Information Processing; University of
Veterinary Medicine Hannover; Foundation, Bünteweg 2, 30559 Hannover, Germany
*Corresponding author
Key words: Mandibular reconstruction, ß-TCP, bone graft substitute, radiological
evaluation, Computed Tomography
46
Summary.
Introduction: The Aim of the study was to evaluate accuracy of CT for in-vivo patient
follow up after mandibular reconstruction.
Material and Methods: Unilateral mandibular defects were surgically created in ten
sheep and either reconstructed using blood soaked ß-TCP cylinders (group A, n=5)
or blood soaked ß-TCP cylinders that were additionally loaded with autologous bone
marrow (group B, n=5). The two graft designs resulted in different stages of graft
ossification representative for different stages of healing. CT Datasets were fused
with microradiographs and measurements of ceramic area based on both methods
were compared.
Results: Two animals (group A (n=1) and B (n=1)) presented infection and graft
dislocation that was visible on CT and were excluded from statistical evaluation.
Group A grafts underwent moderate degradation (53.55% ± 9.7) and incomplete
bony incorporation representing an indermediate state of healing while ceramic grafts
within group B developed a high grade of osseointegration and degradation (94.2% ±
3.3) consistent with progressed healing. Statistical comparison of measurements
based on both methods revealed a significant bias (p<0.05) and a non-significant
variance for group A and a significant variance (p<0.05) and non-significant bias for
group B.
Conclusion: Our results indicate that conventional CT is not eligible to objectively
evaluate ossification and degradation of a ß-TCP graft in vivo and further attempts to
improve clinical visualization of ß-TCP need to be undertaken.
47
Introduction.
The core techniques of bone grafting established over a century ago have remained
largely unchanged until today. Despite its known shortcomings, mainly limited
availability and donor side morbidity, autologous cancellous bone is still considered
the gold standard to fill bone defects and stimulate fracture healing in a variety of
clinical settings covering indications in reconstructive-, orthopedic-,
craniomandibulofacial- and spinal-surgery (Banwart et al., 1995, Wippermann et al.,
1997, Rodriguez-Merchan and Forriol, 2004).
Among these indications, the reconstruction of mandibular defects remains to be a
special challenge, even for experienced surgeons. Restoration of form and function is
of paramount importance in this context since the mandible is crucial for fixation of
the tongue and floor of the mouth-and by that for deglutition, speech formation and
prevention of airway obstruction (Knoll et al., 2006, Chen et al., 2008). Due to this
challenging need for optimized tissue reconstruction numerous approaches have
been developed and published in the current literature (Kimura et al.,2006, Knoll et
al., 2006, Chen et al., 2008, Li et al., 2008). Autogenous bone grafts as well as
osteomyocutaneous flaps are still considered the gold standard, but unfortunately
their harvest is associated with considerable donor side morbidity and their supply is
limited. Modern biologic graft materials, such as allo- and xenografts, represent one
alternative, especially since they were able to overcome some of the limitations of
autologous bone, but healing remained difficult to anticipate and the safety of allo-
and xenograft bone has been controversially discussed (Stevenson 1999, Wheeler
and Ennekin 2005, Wenz et al., 2001). Consequently, an increasing demand for
48
synthetic bone graft substitutes free from the limitations of supply, consistency and
disease has led to intense research during the past decades (Cornell 1999, Lane
1999, Bauer and Muschler, 2000, Den Boer et al., 2002). Among the variety of
osteoconductive materials that have been investigated, calcium phosphate
compounds have been considered especially effective (Tay et al., 1999, Bloemers et
al., 2002, Mastrogiacomo et al., 2005). The main representatives of this group,
Hydroxyapatite (HA; [Ca5(PO4)3OH]) and beta-Tricalcium Phosphate (ß-TCP;
[Ca3(PO4)2]), have been investigated in numerous experimental studies and clinical
trials during the past 30 years (Hulbert et al., 1970, Hoogendorn et al., 1984, Jensen
et al.,2006). Both substitutes yielded promising results in terms of osteoconduction,
osseointegration and biocompatibility (Johnson et al., 1996, Wheeler et al. 2005) and
modern manufacturing techniques allow prefabrication of ceramic scaffolds that meet
the known demands regarding macro-pore size, interconnectivity, porosity,
biocompatibility and biodegradability (Eggli et al., 1988, Lu et al., 1999, Blockhuis et
al., 2000, Hutmacher 2001). Unfortunately the beneficial composition of ceramics
also accounts for a major disadvantage - the radiodensity of the material
overshadows bone healing and remodeling within the implant (Johnson et al., 1996,
Rueger et al., 1998, Mankani et al,. 2004). Thus, the precision of in vivo radiologic
evaluation remains questionable. As the clinical usage of ceramic materials
increases, the need for reliable in vivo diagnostic evaluation becomes inevitable. This
problem has been addressed by several authors and led to the conclusion that
preclinical studies should include outcome measures similar to those anticipated to
be utilized in clinical settings (Goldstein 2002, Bloemers 2002). In order to guarantee
49
reliability, in vivo diagnostic methods need to be correlated to established
investigative methods for graft evaluation to determine their accuracy. The aim of this
study was to objectively compare the results retrieved from CT scans and
microradiographs for evaluation of a previously grafted bone defect in order to
assess reliability of CT Data for clinical evaluation of ß-TCP grafted bone defects.
50
Material and Methods.
Graft Material.
The used material (ChronOs®a) has been described by the manufacturer as a radio-
opaque porous beta-TCP ceramic, which will be degraded and replaced by bone in
6-18 months during the healing process. Material performance and biocompatibility
have been well documented in preclinical and clinical trials and the manufacturer
recommends usage as a bone-void-filler for trauma-, spinal- and cranio-
mandibulofacial indications. For the purpose of this study, ten pre-shaped cylinders
of standardized diameter and height (14mm x 24 mm) were provided by Synthes
Europe GmbH. Five cylinders were unpacked, prepared with a through-bore-hole (7
mm diameter) along the central-line and sterilized by gamma-irradiation after
repacking into surgical kits, while the other five cylinders were used as delivered.
Experimental Design.
Animal experiments were approved by the local governmental animal care committee
and conducted in accordance with German legislation on protection of animals, which
is in compliance with the NIH Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals
(NIH Publication no. 85-23 Rev. 1985). Ten healthy adult female German Black-
Headed Sheep with an average weight of 72.5 +/- 7.4 kg were either grafted with bulk
blood soaked ß-TCP cylinders (Group A; n=5) or predrilled ceramics which were
loaded with bone marrow aspirate and morselized cancellous bone received during
surgery (Group B; n=5). Animals were housed in groups of two to four animals at the
Central Animal Laboratory of the Hannover Medical School and received a standard
51
sheep diet as well as water ad libitum at all times during the maintenance time. All
sheep underwent partial mandibulectomy (25 mm segment) of the right mandible
followed by reconstruction (Compact 2.4 UniLOCK Recostruction Plate) using a ß-
TCP graft under general anesthesia. In animals that received graft type B, bone
marrow was harvested from the iliac crest during surgery after removal of three
standard core biopsies. The cancellous bone material contained in the biopsies was
morselized, mixed with the attained amorphous marrow and loaded into the central
passage of the predrilled cylinders. Finally, the cylinders were fitted into the basal
aspect of the defect and secured to the distal plate in both groups. The soft tissue
wounds were closed in layers using resorbable Vicryl 2.0 sutures. Pre-operative
prophylactic penicillin (0.04 ml/kg, IM, q48h) as well as peri-operative analgesia
(carprofen, initial dose: 4mg/kg followed by 2mg/kg, SC, q24h / buprenorphine 10
µg/kg, IM, q24h) was continued for four (carprofen) respectively three (buprenorphin)
days. All sheep were allowed unlimited activity as well as access to food and water
ad libitum immediately after surgery. All animals were euthanized twelve weeks post
surgery after deep sedation with an overdose of pentobarbital (80 mg/kg IV). After
decapitation, CT scans of the cranium were performed and following the scans,
mandibular segments were retrieved for µ-radiological evaluation.
CT Scan.
After sacrifice and decapitation each head was scanned in a multi-slice spiral
computer-tomographb. Reconstruction plates and screws remained in situ. Scanning
was performed at 120 kV, 150 mAs with a table speed of 6.25 mm per rotation. Slice-
thickness was set 0.6 mm with a reconstruction interval of 0.625 mm. The raw data
52
was processed by the use of a special bone algorithm that improved visualization of
the bony structures for evaluation. The datasets were stored for further evaluation
using Dicom 3.0 as a medical image file format.
Microradiography.
After retrieval, mandibular segments were fixated in 3.5% neutral buffered formalin
for a week. After rinsing and dehydration all specimens were embedded in
methylmethacrylate (MMA) under vacuum. Slow polymerization was completed in a
drying-chamber at 37°C. The exact defect position was radiologically accessed to
enable precise trimming of the MMA blocks and plastic embedded defects were then
sectioned into serial sagittal slices using a modified inner hole diamond saw. Every
fourth section (90 µm thickness) was selected for radiologic evaluation and fine-detail
contact microradiography (15 kV, 7 sec) was performed in a Faxitronc cabinet using
Kodak dental filmd. All radiographs were developed in an automated processor and
digitalized.
Image Processing and Image Fusion.
To objectively verify subjective CT results ceramic area was measured at ten
locations within the defect for each animal using both methods. To ensure
comparison of corresponding areas the CT and microradiographic images were
fused and aligned. To enable synchronization of the two different data sources, a
scientific beta version of VoXim eosteo was provided by IVS Solutions. The
software feature was especially developed for scientific issues and included an
Image Import module that allowed conversion of single JPG or TIFF files into a serial
53
dicom dataset. The digitized microradiographs (7-11 images per mandibular
segment) were imported, manually aligned and converted (Figure 1) into a serial
dataset. In order to enable conversion into a serial dataset the distance between
single images (dorsal plane, 1.17 cm) was manually set resulting from the number of
slices between two specimens (3), slice thickness (90µm) and loss associated with
processing of each slide (300µm).
Figure 1: Three-dimensional defect reconstruction after alignment and conversion ofmicroradiographic
images. Blue: ChronOs® remnants; Red: Reconstruction plate; Green: tooth
54
Additionally the pixel size was adjusted in order to synchronize the voxel size of
microradiographic and CT datasets. The adjusted serial microradiographic datasets
were fused and manually aligned to the corresponding CT data using the Image
Fusion module of the same software (Figure 2). The ceramic area was measured at
ten different images of the CT dataset and re-estimated at the same locations after
superimposing the microragiographs to determine the accuracy of the first
measurement. Hounsfield-Units (HU) of ceramic and bone within the defect were
measured on two random positions of each image per parameter within the defect. In
order to ensure correct measurement this procedure was performed as well under
superimposed microradiographic control.
Figure 2: Corresponding microradiographic (A) and CT images (B) after matching and fusion (C) of
both datasets. Due to the low grade of mineralization fresh callus, which is clearly visible in the
microradiographic image, is only partly visible in the CT image.
Finally the fused dataset was used to determine residual graft volume and to enable
three-dimensional visualization of residual ceramic material. Degradation was
55
determined by comparing initial graft volume of both groups with the residual volume.
We assumed that the more precise in vitro method, microradiography, presented the
gold standard.
Statistical Analysis.
The data retrieved from eight animals by CT and microradiography were included in
statistical analysis to determine comparability of the two diagnostic methods.
The objective of the study was to examine accuracy, reliability and validity of CT scan
measured area to show agreement or disagreement between the two methods of
measurement. The t-test for paired observations was used to detect significant bias
between the two methods. Reliability of CT measurements was estimated by the chi-
square test for variance. The tested null hypothesis assumed a variance of the
difference of CT values against microradiography (gold standard) equal to a standard
deviation from differences against the gold standard of one hundred percent.
Outcomes were considered statistically significant for p < 0.05.
Matched data of both methods were examined graphically with the Blant-Altmann-
Diagram modified in abscissa (microradiography as reference value) and linear
regression with calculating coefficient of determination. Because values of
microradiography in x- coordinate were truly reference values, variance was only
accounted for y-coordinate (ct-scan). The statistical software SAS version 9.1 was
used for analysis of all data.
56
Results.
Two sheep (one of each group) presented inflammation of the graft side associated
with graft displacement and sequestration as well as necrotic lysis of the mandibular
bone at the time of sacrifice. Those two animals represented total graft failure.
Figure 3: Microradiographs show graft dislocation in two animals (A). In animals assigned to group A
the remnants of the grafted ß-TCP cylinders were enveloped by an intervening layer of radiolucient
tissue and newly deposited bone (B). Defects retrieved from animals assigned two group B presented
bony healing of the defect with full integration of ceramic remnants (C).
Microradiography showed that the scaffold had rotated around the osteosyntheses
plates leaving an unbridged defect with minimal callus formation around the cut ends.
The ceramic was surrounded by radiolucent tissue and gas. Bony contact did not
occur and there were no signs indicating degradation of the ß-TCP scaffolds (Figure
3.A). CT images also revealed displacement of hyperdense ceramic material towards
the reconstruction plate. The residual scaffold was delineated by hypodense
structures that enabled identification of the artificial graft material. Hounsfield Units
57
measured within the scaffold area (445-1142 HU) corresponded with estimates
retrieved from bony structures (599-1108 HU). Thus identification of trabecular bone
and ceramic based on the HU estimates proved inefficient. There were no signs of
bridging ossification along the ceramic surface or within the defect (Figure 4) and
major alterations of the three-dimensional graft shape were not visible. Since graft
dislocation was evident irrespective of the mode of evaluation, image fusion and
objective evaluation of ceramic area was considered non-relevant.
Figure 4: Coronar (A) and transversal (B) view of a specimen that developed graft
dislocation. Bordering radiolucient tissue enables graft identification.
In a case like this representing graft failure the resuming ceramic volume is of
secondary import. Additionally, a comparison of two different specimens would not
allow satisfactory statistical comparison.
58
Group A: Represetative for incomplete healing.
Microradiography revealed that blood loaded ß-TCP grafts developed incomplete
osseointegration of the ceramic material that mainly occurred in close proximity to the
cut ends of the mandible. The remaining graft surface was enveloped by woven bone
with an intervening layer of radiolucent soft tissue while the center of the defect was
occupied by moderate degraded ceramic material (Figure 3.B). Thus, healing of graft
types used in group A was representative for incomplete healing. Three-dimensional
reconstruction of the residual cylinders based on the superimposed microradiographs
showed a mean scaffold degradation of 53.55% ± 9.7 (Figure 5.A).
Figure 5: Three- dimensional reconstruction of ceramic remnants based on the fused datasets. While
degradation was moderate and mainly restricted to the superficial areas in group A (A), ceramic
specimens in group B (B) were highly degraded with an associated loss of continuity
59
CT images showed that the defects were bridged by radiodense material. Substantial
parts of the ceramic were surrounded by hypodense tissue that contrasted major
parts of the remaining hyperdense ceramic. Because of these contrasting hypodense
structures, the outer cylinder borders could be detected (Figure 6). Due to similar
radiodensity of the newly formed bone (HU range 436-1269) and ceramic (HU range
384-1336) it was impossible to identify the exact anterior or posterior graft borders in
locations where union had occurred.
Figure 6: Coronar (A) and transversal (B) view of a specimen assigned to group A. Different grades of
tissue mineralization and delineating hypodense structures (soft tissue) allow approximate graft
identification.
Student t-test for paired observations revealed a significant bias (p < 0.05) for area
estimates measured with and without microradiographic control. The outcome of the
chi-square test for variance did not significantly exceed the equivalent to a standard
60
deviation from differences against gold standard of one hundred percent. Thus for
this group CT measurements were biased but precise (Figure 7.A).
61
Figure 7: Blant-Altmann Diagramm representing bias and variance of area values measured by the
two different methods. Notice the deviation of bias from cero as well as the variance of differences
obtained for group A (A) and B (B).
62
Group B: Representative for progressed healing
Complete bony union was achieved for defects grafted with Graft Type B. The main
parts of the ceramic scaffolds were degraded and the residual material was
integrated within the newly formed bone (Figure 3.C). Three-dimensional
reconstruction of the residual cylinders based on the superimposed microradiographs
showed extensive scaffold degradation of 94.2% ± 3.3 on average (Figure 5.B) and
fragmentation of the ceramic material.
CT images showed consolidation of the defects. Residual scaffold parts were not
contrasted by intervening hypodense tissue. Thus determination of residual graft
material was speculative and oriented at alterations of the lateral and medial surface
of the hyperdense tissue bridging the initial defect (Figure 8). Radiodensity of
ceramic material (HU range 231-981) equaled the density of bony structures within
the defect (HU range 168-1356).
Figure 8: Coronar (A) and transversal (B) view of a specimen assigned to group B. Full integration of
the graft material prohibits definite identification of graft material.
63
The student t-test for area measurements with and without microradiological control
showed no significant bias (p > 0.05). The outcome of chi- square test for variance
against a hypothesized value exceeded the equivalent to a standard deviation from
differences against a gold standard of one hundred percent high significant
(p<0.001). Therefore, for this group CT measurements were un-biased but imprecise
(Figure 7.B).
64
Discussion.
The development of degradable ceramic scaffolds for bone reconstruction provides
clinicians with a powerful tool to encourage healing of large bone defects. However,
non-invasive techniques to determine the amount of degradation have not been
tested regarding their precision and accuracy (Mankani et al., 2004). Unfortunately,
the current lack of reliable noninvasive modalities for the evaluation of new bone
formation in the presence of mineral-containing matrices such as ß- TCP or HA
impedes the determination of new bone deposition within such transplants in vivo
(Hoogendoorn et al., 1984, Waite et al., 1989, Weissman et al., 1996). There is a
need to correlate non-invasive in vivo diagnostic methods of evaluation and the more
precise in vitro methods that have been standardized during decades of research on
this topic (Goldstein 2002).
The preliminary study represents an attempt to objectively compare data retrieved by
conventional CT and corresponding results of microradiography. A standard multi-
slice CT scanner was used instead of a unit for investigational purposes since it was
our goal to mimic clinical settings as closely as possible. The established evaluation
method, microradiography, represented our gold standard.
After digital processing we were able to measure the equivalent areas using both
methods. Two specimens represented total graft failure that was clearly visible on CT
images. Thus we opted not to estimate ceramic area in these two cases. Clinically,
graft displacement presents a major complication were residual ceramic volume is of
no special interest since the dislocation itself represents a situation that would need
revision. Additionally, a sample size of two impedes reliable statistical interpretation.
65
Specimens in group A presented incomplete healing. Ceramic area estimation based
on CT data was dependent on intervening non-calcified tissue that delineated the
residual graft. The surrounding hypodense structures allowed an approximate
identification of the outer ceramic surface. Since the density of the grafted ceramic
equaled the newly formed bone tissue (similar HU range) identification of bone and
ceramic became speculative in any position where direct bone-ceramic contact was
present. Conventional CT did not offer a sufficient resolution to differentiate materials
based on their microstructure (trabecular vs. porous) and evaluate the bone-graft-
interface or amount of new bone deposition within the ceramic material. An
approximate three-dimensional reconstruction of the residual ceramic based on CT
alone was possible but inferior compared to microradiographic assisted three-
dimensional reconstruction. Statistical comparison of area measurements based on
CT and microradiography revealed a significant bias combined with a low variance of
estimates. Therefore measurements based on CT data were precise but inaccurate.
Ceramic area was frequently underestimated on CT. Nevertheless, CT data allowed
subjective identification of incomplete healing.
Group B presented a high level of healing that made a determination of residual ß-
TCP area on CT images impossible since bone-ceramic contact occurred along the
graft surface. A reconstruction of the three-dimensional shape of the ceramic was not
possible without microradiographic control since, as in group A, density of newly
formed bone equaled ceramic density (similar HU range). Therefore, a direct
differentiation of these structures proved impossible. Statistical evaluation revealed
significant variance and no significant bias between CT estimates and the
corresponding results for microradiography. Estimates obtained by CT were accurate
66
but imprecise. In contrast to group A no delineated ceramic core remained as a
landmark that could be used to approximate the residual ceramic area.
Measurements were highly speculative leading to over- and underestimation of the ß-
TCP area and a high variance of estimates compared to values obtained from
microradiography. CT data was inappropriate for ceramic area evaluation.
The statistical differences between group A and B were probably due to the disability
to differentiate ß-TCP from trabecular bone. The rough delineation of the implant
seen within group A offered a template for area measurements. Inaccuracy of area
measurements only occurred at positions of direct contact, which were seldom for
group A, thus variance of measurements was limited. Within group B residual
ceramic matrix was mainly integrated within the newly formed bone leaving no
template for identification. Over- and underestimation resulted in no significant
difference of mean estimates and a high variance. Our sample size was small (n=4 in
both groups, 10 measurements per specimen) and further attempts to verify these
results need to be undertaken.
Our results affirm earlier findings of other authors who doubted the reliability of
radiological methods for ceramic graft evaluation (Johnson et al., 1996, Rueger 1998,
Bloemers et al., 2002). Mankani et al. (2004) already found that standard CT- images
of HA-TCP transplants without new bone formation were not distinguishable from
images of HA-TCP transplants with associated bone formation. These authors also
determined the average bone mass density of HA-TCP transplants that had been
loaded with human marrow stromal cells and grafted into muscle pouches of
immunodeficient mice using quantitative computed tomography. They compared the
results with the results of a histological semiquantitative score for new bone
67
deposition. To our knowledge, Mankani et al. (2004) were the first and up to today
the only authors who tried to correlate results of CT measurements and ex vitam
derived semi quantitative scores for bone formation within HA-TCP transplants. They
found out that a bone mass density of 600 mg/cm3 K2 HPO4 and above was
correlated with considerable new bone formation and concluded that quantitative CT
offered a practicable approach for noninvasive determination of new bone formation
in HA-TCP transplants. Unfortunately the technique described by these authors relies
on the mineral density of an implant. If the initial implant material does not degrade
as HA does, the initial density remains relatively stable and additional bone formation
increases the overall mineral density. So-called slow or non-resorbable ceramics like
HA present a major drawback- the remaining scaffold material weakens the strength
of the bone ceramic construct (Renooij et al., 1985, Fleming et al., 2000). After
serving as an initial osteoconductive scaffold the ideal bone graft substitute should be
resorbed or integrated within the newly formed bone (Colnot et al., 2005). A
degradable ceramic such as ß-TCP most probably offers this advantage (Renooij et
al., 1985, Jensen et al., 2006). None or only very small amounts of foreign material
remain to compromise the strength of the new regenerate. Unfortunately, the
biodegradation process of these ceramics is unpredictable (Hollinger et al., 1996).
This makes an evaluation of new bone deposition within a degradable transplant
based on the mineral density impossible since alterations in mineral density are, in
contrast to the so-called slow degradable ceramics, not only dependent on increasing
mineralization due to bone deposition, but also on alterations of mineralization due to
the degradation process of the ceramic itself. Therefore, evaluation of healing based
68
on mineral density will most certainly not work if a degradable implant was used.
However, this remains to be proved.
Due to the proven potential to facilitate bone healing, numerous ceramic scaffolds,
granules and cements have been licensed and used for clinical indications and tissue
engineering approaches (Hing 2005, Habraken et al., 2007, Nair et al., 2007) but until
today, we have to use them in vivo without knowing the accuracy of our diagnostic
evaluation.
The results of our study affirm earlier assumptions that even CT, which is known as
the gold standard in clinical evaluation of bone healing in the craniomaxillofacial area,
does not allow differentiation between ceramic material and newly formed callus due
to the comparable material properties of ceramic and bone and the relatively low
resolution of conventional CT.
Schaaf et al. published a trial in 2008 were they estimated the performance of a new
diagnostic technique- the prototype flat panel volumetric computed tomograph
(FpvCT). This tumograph reached a significant (8-16 fold) higher resolution than
conventional CT and thus enabled visualization of bony microstructure. This
technique is currently restricted to a maximum object size of 33 x 33 x 21 cm, but the
described prototype may potentially offer a promising step towards improved patient
follow up after calcium phosphate bone grafting.
In order to improve in vivo diagnostics, further attempts to correlate ex vivo results
and clinical diagnostic methods need to be undertaken to standardize in vivo
evaluation of the various ceramic materials that have been licensed for clinical
usage, thus enabling clinicians around the world to assess the healing process of
their patients.
69
Concusion.
Ceramic bone graft substitutes such as ß-TCP represent a promising solution for
reconstruction of large bone defects. However, when used in an ortopic side,
computed tomography only allows subjective classification of the healing progress on
which the surgeon has to rely. Objective estimation of ceramic degradation and
ossification within the graft are not possible based on CT datasets.
70
Acknowledgements.
The authors wish to thank IVS Solutions AG, especially Mr. Albrecht Schnappauf for
supporting the study with the needed software configurations and their aid in image
processing.
71
Footnotes.
a ChronOs®, Synthes Europe
b GE LightSpeed VFX; GE Healthcare, Munich, Germany
c Faxitron 8050; Field Emission. Corp., McMinnville, Oregon, USA
d Kodak InSight Dental Film; Kodak Dental Systems, Stuttgard, Germany
e Voximosteo; IVS Solutions AG, Chemnitz, Germany
72
References.
Banwart JC, Asher MA, Hassanein RS: Iliac crest bone graft harvest donor site
morbidity. A statistical evaluation. Spine 20(9):1055-60, 1995
Bauer TW, Muschler GF: Bone graft materials. An overview of the basic science. Clin
Orthop Relat Res 371:10-27, 2000
Blokhuis TJ, Termaat MF, den Boer FC, Patka P, Bakker FC, Haarman HJ:
Properties of calcium phosphate ceramics in relation to their in vivo behavior. J
Trauma 48(1):179-86, 2000
Bloemers FW, Patka, P., Bakker, F.C., Haarman,H. J. T. M: The use of calcium
phosphates as a bone substitute material in trauma surgery. Osteo. Trauma Care
10:33-37, 2002
Cheng WL, Cheng ZW, Yang ZH, Huang ZQ, Zhang B, Wang JG: The trapezius
osteomyocutaneous island flap for reconstructing hemimandibular and oral defects
following the ablation of advanced oral malignant tumors. J Craniomaxillofac Surg.,
37, 91-95, 2008.
Colnot C, Romero DM, Huang S, Helms JA: Mechanisms of action of demineralized
Bone matrix in the repair of cortical bone defects. Clin Orthop Relat Res 435:69-78,
73
2005
Cornell CN: Osteoconductive materials and their role as substitutes for autogenous
Bone grafts. Orthop Clin North Am 30(4):591-8, 1999
Den Boer FC, Patka, P., Bakker, F. C., Haarman, J. T: Current concepts of fracture
healing, delayed unions, and nonunions. Osteo. Trauma Care 10:1-7, 2002
Eggli PS, Muller W, Schenk RK: Porous hydroxyapatite and tricalcium phosphate
Cylinders with two different pore size ranges implanted in the cancellous bone of
rabbits. A comparative histomorphometric and histologic study of bony ingrowth and
implant substitution. Clin Orthop Relat Res 232:127-38, 1988
Fleming JE, Jr., Cornell CN, Muschler GF: Bone cells and matrices in orthopedic
Tissue engineering. Orthop Clin North Am 31(3):357-74, 2000
Goldstein SA. Tissue engineering: functional assessment and clinical outcome. Ann
N Y Acad Sci 961:183-92, 2002
Habraken WJ, Wolke JG, Jansen JA: Ceramic composites as matrices and scaffolds
for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev 59(4-5):234-48, 2007
Hing KA. Bioceramic Bone Graft Substitutes: Influence of Porosity and Chemistry.
Int. J. Appl. Ceram. Technol. 2(3):184-199, 2005
74
Hollinger JO, Brekke J, Gruskin E, Lee D: Role of bone substitutes. Clin Orthop Relat
Res 324:55-65, 1996
Hoogendoorn HA, Renooji, W., Ackermans, L. M. A., Visser, v. ,Wittebol, P: Long
Term study of ceramic implants (porous hydroxyapatite) in dog femora. Clin Orthop
187:281-294, 1984
Hulbert SF, Young FA, Mathews RS, Klawitter JJ, Talbert CD, Stelling FH: Potential
Of ceramic materials as permanently implantable skeletal prostheses. J Biomed
Mater Res 4(3):433-56, 1970
Hutmacher DW: Scaffold design and fabrication technologies for engineering tissues
-state of the art and future perspectives. J Biomater Sci Polym Ed 12(1):107-24, 2001
Jensen SS, Broggini N, Hjorting-Hansen E, Schenk R, Buser D: Bone healing and
Graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate.
A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clin Oral
Implants Res 17(3):237 43, 2006
Johnson KD, Frierson KE, Keller TS, Cook C, Scheinberg R, Zerwekh J, Meyers L,
Sciadini MF: Porous ceramics as bone graft substitutes in long bone defects: a
biomechanical, histological, and radiographic analysis. J Orthop Res 14(3):351-69,
1996
75
Kimura A, Nagasao T, Kaneko T, Tamaki T, Miyamoto J, Nakajima T: Adequate
fixation of plates for stability during mandibular reconstruction. J Craniomaxillofac
Surg., 34, 193-200, 2006.
Knoll WD, Gaida A, Maurer P: Analysisi of mechanical stress in reconstruction plates
For bridging mandibular angle defects. J Craniomaxillofac Surg 34, 201-209, 2006.
Lane JM, Tomin E, Bostrom MP: Biosynthetic bone grafting. Clin Orthop Relat Res
367 Suppl:S107-17, 1999
Li L, Blake F, Gbara A, Gudewer E, Schmelzle R: Distraction osteogenesis in
Secondary microsurgical mandible reconstruction: Report of seven cases. J
Craniomaxillofac Surg. 36, 273-278, 2008
Lu JX, Flautre B, Anselme K, Hardouin P, Gallur A, Descamps M, Thierry B: Role of
interconnections in porous bioceramics on bone recolonization in vitro and in vivo. J
Mater Sci Mater Med 10(2):111-20, 1999
Mankani MH, Kuznetsov SA, Avila NA, Kingman A, Robey PG: Bone formation in
transplants of human bone marrow stromal cells and hydroxyapatite-tricalcium
phosphate: prediction with quantitative CT in mice. Radiology 230(2):369-76, 2004
Mastrogiacomo M, Muraglia A, Komlev V, Peyrin F, Rustichelli F, Crovace A,
76
Cancedda R: Tissue engineering of bone: search for a better scaffold. Orthod
Craniofac Res 8(4):277-84, 2005
Muschik M, Ludwig R, Halbhubner S, Bursche K, Stoll T: Beta-tricalcium phosphate
as a bone substitute for dorsal spinal fusion in adolescent idiopathic scoliosis:
preliminary results of a prospective clinical study. Eur Spine J 10 Suppl 2:S178-84,
2001
Nair MB, Suresh Babu S, Varma HK, John A: A triphasic ceramic-coated porous
hydroxyapatite for tissue engineering application. Acta Biomater 2007.
Renooij W, Hoogendoorn HA, Visser WJ, Lentferink RH, Schmitz MG, Van IeperenH,
Oldenburg SJ, Janssen WM, Akkermans LM, Wittebol P: Bioresorption of ceramic
Strontium 85-labeled calcium phosphate implants in dog femora. A pilot study to
Quantitate bioresorption of ceramic implants of hydroxyapatite and tricalcium
orthophosphate in vivo. Clin Orthop Relat Res 197:272-85, 1985
Rodriguez-Merchan EC, Forriol F. Nonunion: general principles and experimental
data. Clin Orthop Relat Res 419:4-12, 2004
Rueger JM, Linhart W, Sommerfeldt D: [Biologic reactions to calcium phosphate
Ceramic implantations. Results of animal experiments]. Orthopade 27(2):89-95, 1998
Schaaf H, Streckbein P, Obert M, Goertz B, Christophis P, Howald HP, Traupe H:
77
High Resolution imaging of craniofacial bone specimens by flat-panel volumetric
Computed Tomography. J Craniomaxillofac Surg. 36, 234-238, 2008
Stevenson S. Biology of bone grafts: Orthop Clin North Am 30(4):543-52, 1999
Tay BK, Patel VV, Bradford DS: Calcium sulfate- and calcium phosphate-based bone
substitutes. Mimicry of the mineral phase of bone. Orthop Clin North Am 30(4):615
23,1999
Wenz B, Oesch B, Horst M: Analysis of the risk of transmitting bovine spongiform
encephalopathy through bone grafts derived from bovine bone. Biomaterials
22(12):1599 606, 2001
Waite PD, Morawetz RB, Zeiger HE, Pincock JL: Reconstruction of cranial defects
With porous hydroxylapatite blocks. Neurosurgery 25(2):214-7, 1989
Weissman JL, Snyderman CH, Hirsch BE: Hydroxyapatite cement to repair skull
Base defects: radiologic appearance. AJNR Am J Neuroradiol 17(8):1569-74, 1996
Wheeler DL, Enneking WF: Allograft bone decreases in strength in vivo over time.
Clin Orthop Relat Res 435:36-42,2005
Wheeler DL, Cross AR, Eschbach EJ, Rose AT, Gallogly PM, Lewis DD, Vander
Griend RA: Grafting of massive tibial subchondral bone defects in a caprine model
78
using beta-tricalcium phosphate versus autograft. J Orthop Trauma 19(2):85-91,
2005
Wippermann BW, Schratt HE, Steeg S, Tscherne H: Complications of Spongiosa
Harvesting of the iliac crest. A retrospective analysis of 1,191 cases. Chirurg
68(12):1286-91, 1997
79
4 Diskussion
4.1 Diskussion der Methode
Ziel der vorliegenden Studie war es, die Eignung von zwei verschiedenen ß-TCP -
Zylindern in Kombination mit autogenem Blut oder autogenem Blut-Knochenmark-
Gemisch zur Rekonstruktion mandibulärer Knochendefekte zu untersuchen.
Die ossäre Heilung bei Anwendung eines Knochenersatzstoffes unter optimalen
experimentellen Umständen ist, abgesehen von den Eigenschaften des implantierten
Materials, im Wesentlichen von fünf Punkten abhängig: der Versuchstierart, dem
Alter der Versuchstiere, der anatomischen Lokalisation des Defektes, der Größe des
Defektes und dem Zustand des Periostes (EINHORN 1999; SCHLEGEL et al. 2006).
4.1.1 Wahl des Tiermodells
In der vorliegenden Studie wurde bei adulten (3,75 ± 0,59 Jahre)
Schwarzkopfschafen einseitig ein mandibulärer Kontinuitätsdefekt von kritischer
Größe erzeugt und rekonstruiert. Das Periost wurde hierbei im Defektbereich
vollständig entfernt. Das Schafmodell wurde für die vorliegende Arbeit ausgewählt,
da es ein etabliertes Großtiermodell für die experimentelle Untersuchung ossärer
Regeneration ist und die anatomischen Gegebenheiten beim Schaf es ermöglichen,
einen nicht nur veterinärmedizinisch sondern auch humanmedizinisch relevanten
80
Defekt zu erzeugen und zu untersuchen (GLOWACKI 1998; FENNIS et al. 2004).
Dimension und mechanische Eigenschaften des Schafknochens kommen den
humanen Verhältnissen sehr nahe, obwohl die Knochenstruktur, verglichen mit
anderen Tiermodellen, wie beispielsweise dem Hund, weniger Übereinstimmungen
aufweist (EITEL et al. 1981). Die Knochenneubildungsrate des Schafes übertrifft die
des Menschen in etwa um das Zwei- bis Zweieinhalbfache. Dennoch konnte
Wippermann zeigen, dass die Knochenheilung bei dieser Spezies durchaus
Rückschlüsse auf die menschliche Situation erlaubt (WIPPERMANN 1993). Speziell
für den kraniofazialen Bereich wird in der Literatur wiederholt die gute Eignung des
Schafmodells für die Untersuchung humanmedizinischer Fragestellungen der
Knochenchirurgie betont (RACHMIEL et al. 1993). Darüber hinaus bieten Schafe
aufgrund ihrer Spezies-spezifischen Umgänglichkeit die Möglichkeit, sich auch im
adulten Stadium soweit trainieren zu lassen, dass tägliche eingehende
Untersuchungen des Wundbereiches oral wie exoral möglich sind.
Ein wesentlicher Nachteil der gewählten Spezies ist das physiologische
Wiederkäuen, das in der gewählten Defektlokalisation mit einer starken, zyklischen
Belastung der verwendeten Osteosynthesematerialien einhergeht. Obwohl in der
vorliegenden Studie zur Rekonstruktion zwei spezielle, aboral lokalisierte,
mandibuläre Rekonstruktionsplatten der Firma Synthes (Compact 2.4 UniLOCK
System) eingesetzt wurden, um eine stabile Versorgung zu gewährleisten, kam es
bei acht von zwölf Tieren (66,7%) zum Versagen der verwendeten Platten : fünf Tiere
(41,7%) mit Fraktur beider Platten, drei Tiere (25%) mit Fraktur einer der Platte.
Im Rahmen des gewählten Versuchsaufbaus war es nicht möglich, nachträglich den
Zeitpunkt des Versagens zu bestimmen. Röntgenologische Verlaufskontrollen
81
wurden nicht durchgeführt und keines der betroffenen Tiere zeigte klinische
Symptome. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass im Falle der fünf
Tiere, bei denen beide Platten frakturierten, eine Heilung unter mechanisch stabilen
Umständen nicht stattfinden konnte. Bei Tieren, bei denen noch eine der zwei Platten
erhalten blieb, kann im Gegensatz dazu eine mechanische Stabilität des Defektes
während der Heilungsphase angenommen werden. Die Bedeutung mechanischer
Stabilität für die Heilung eines Knochendefektes ist hinreichend bekannt
(STEVENSON 1998; RODRIGUEZ-MERCHAN u. FORRIOL 2004). Die hohe
Belastung der Osteosynthesematerialien durch den Ruminationsvorgang stellt damit
einen erheblichen Nachteil des gewählten Modells dar. Ein Einbringen von mehr als
zwei Platten, zur Vermeidung des Problems, ist aufgrund der anatomischen
Gegebenheiten der Mandibel nicht möglich. Darüber hinaus würden weitere
Implantate die mechanischen Eigenschaften des Knochens zunehmend
beeinträchtigen, so dass bei einer Mehrversorgung die Gefahr einer Fraktur der
Mandibel bestünde. Aufgrund der aufgeführten Schwierigkeiten erscheint das
gewählte Tiermodell retrospektiv als ungeeignet für weiterführende Versuche und es
empfiehlt sich, bei vergleichbaren Versuchsaufbauten andere Tiermodelle
einzusetzen. Als alternative Tiermodelle werden in der Literatur für Untersuchungen
von Knochendefekten der Mandibel vor allem der Hund, das Schwein und
nichthumane Primaten empfohlen (SCHMITZ u. HOLLINGER 1986; EINHORN
1999).
82
4.1.2. Wahl des Defektmodells
Bezüglich des gewählten Defektmodells gilt, dass das ausgewählte Modell die
klinische Situation so realistisch wie möglich widerspiegeln muss. Für die
angestrebte klinische Indikation - die Rekonstruktion ausgedehnter Knochendefekte
– wird der Critical-Size-Defect (CSD) als Defektmodell der Wahl angegeben
(EINHORN 1999). Prinzip ist es, einen Defekt zu erzeugen, der durch seine Größe
die natürliche Heilungskapazität des Körpers überfordert und damit ohne Einsatz des
zu untersuchenden Ersatzmaterials im Laufe eines Lebens nicht heilen würde
(SCHMITZ u. HOLLINGER 1986). Die Dimension eines CSD ist hierbei spezifisch für
Spezies- und Defekt-Lokalisation. CSD - Dimensionen wurden für verschiedenste
Lokalisationen in einer Reihe von Versuchstierspezies beschrieben, allerdings sind
Angaben für die Mandibel selten und teilweise widersprüchlich. Schmitz und
Hollinger geben für die Mandibel von Mischlingshunden eine kritische Defektgröße
zwischen 20 und 40 mm an (SCHMITZ u. HOLLINGER 1986). Ayoub et al.
beschreiben eine Defektgröße von 25 mm an der Mandibel beim Schaf als kritisch
(AYOUB et al. 2001); diese wurde in unserer Studie gewählt.
Aufgrund mangelnder Literaturangaben zu diesem Aspekt erscheint es
empfehlenswert, einen Kontrolldefekt anzulegen, um zu gewährleisten, dass
tatsächlich eine kritische Größe erreicht wird. In dieser Studie wurde ausschließlich
der basale Anteil der Mandibel rekonstruiert; der proximale unrekonstruierte Anteil
des Defektes diente als Kontrolldefekt. Die CT-Aufnahmen zeigten bei allen Tieren,
dass der proximale Anteil des resezierten Defektes, der nicht mit Chronos®
83
Composites rekonstruiert wurde, nicht knöchern durchbaut wurde. Die Ergebnisse
unserer Arbeit bestätigen somit die Aussage von Ayoub et al., dass eine
Ausdehnung von 25 mm an der Mandibel des Schafes als kritische Defektgröße
angenommen werden kann (AYOUB et al. 2001).
4.1.3. Wahl des chirurgischen Modells
Im Gegensatz zu anderen Protokollen, bei denen die Zähne in dem betroffenen
Gebiet Wochen vor dem Eingriff entfernt werden, um eine Kontamination des OP-
Bereiches entlang der Alveolartasche zu vermeiden (STRONG et al. 2003), wurde in
dem präsentierten Versuchsaufbau auf eine solche Maßnahme verzichtet, um
mögliche Einschränkungen der Futteraufnahme der Tiere zu vermeiden. Um einer
Kontamination durch das orale Milieu dennoch vorzubeugen, wurde der Zugang von
aboral gewählt und ein retromolarer Defekt angelegt. Trotz dieser Maßnahme war es
aufgrund individueller Unterschiede der Längenverhältnisse des retromolaren
Bereiches nicht bei allen Tieren möglich, die Eröffnung des letzten Alveolarfaches zu
umgehen, da bei einem Teil der Tiere Anteile der Wurzel des letzten Molaren weit
caudal in den Bereich des Angulus mandibulae und damit in den Defektbereich
hineinreichten. Bei diesen Tieren (n=4) war es nicht möglich, einen ausreichend
großen Defekt zu erzeugen, ohne Teile der Zahnwurzel des M3 zu resezieren und
damit das Alveolarfach zu eröffnen. Nach Versuchsende wurde post mortem bei zwei
von zwölf Tieren eine Infektion des Defektbereiches sowie des angrenzenden
Weichteilmantels mit Verlagerung des ß-TCP - Zylinders festgestellt. Keines der
84
betroffenen Schafe war vor Euthanasie klinisch auffällig geworden. Bei beiden Tieren
wurde intraoperativ die Wurzel des letzten Molaren teilreseziert. Die mikrobiologische
Untersuchung von Wundtupfern aus den infizierten Arealen bestätigte eine Infektion
mit aeroben und anaeroben Keimen, die zum typischen oralen Milieu des Schafes
zählen, so dass eine absteigende Infektion entlang der Alveolartasche
wahrscheinlich erscheint. Beide Tiere wurden aus der weiteren Beurteilung
ausgeschlossen.
Um derartige Kontaminationen zu vermeiden, erscheint es sinnvoll, bei
entsprechender Defektlokalisation zumindest den letzten Molaren (M3 beim Schaf)
der betroffenen Kieferseite zu entfernen und die versuchsrelevante Operation erst
nach Abheilung des Zahnfaches (etwa 10-14 Tage nach Extraktion) durchzuführen.
Ein entsprechendes Vorgehen erscheint – wenn möglich, auch klinisch sinnvoll.
4.1.4 Versuchsstruktur
Der durchgeführte Versuch wurde als Endpunktstudie konzipiert. Alle Tiere wurden
zeitgleich nach einer Versuchsdauer von 14 Wochen getötet. Die in dieser Arbeit
verarbeiteten Daten beziehen sich demnach bei allen Tieren ausschließlich auf einen
fixen Zeitpunkt, 14 Wochen post operationem. Eine Aussage über die Dynamik der
Knochenneubildung und den Ursprung des neu gebildeten Knochens (residente
differenzierte osteogene Zellen versus Osteoprogenitorzellen) kann in der
vorliegenden Versuchskonzeption daher nicht gemacht werden. Um das
Versuchsprotokoll dahingehend sinnvoll zu ergänzen, wurde zusätzlich bei allen
85
Tieren an drei verschiedenen Zeitpunkten post operationem (Woche 2, Woche 4,
Woche 8) eine intravitale Fluoreszenzmarkierung durchgeführt. Die Daten dieser
zusätzlichen Maßnahme erlauben es, Rückschlüsse auf den zeitlichen Verlauf der
Knochenneubildung zu ziehen und sind Teil einer dritten Veröffentlichung, die im
Rahmen dieser Arbeit nicht diskutiert wird.
Intravitale röntgenologische Verlaufsuntersuchungen wurden nicht durchgeführt, da
die Aussagekraft der Röntgenbilder bezüglich der Knochenregeneration nach
eigenen Vorerfahrungen und Beobachtungen verschiedener anderer Autoren
aufgrund von Überlagerungsartefakten und ähnlicher Röntgendichte von Knochen
und Transplantat anzuzweifeln war (JOHNSON et al. 1996; RUEGER et al. 1998).
Retrospektiv muss allerdings festgehalten werden, dass radiologische
Verlaufskontrollen in jedem Fall sinnvoll gewesen wären, um die vorher
beschriebenen Implantatkomplikationen (Plattenbrüche) frühzeitig zu erfassen.
Intravitale CT-Untersuchungen wurden aus tier- und seuchenschutzrechtlichen
Gründen ebenfalls nicht durchgeführt.
4.1.5. Wahl der Auswertungsmethoden
Für die Anfertigung der mikroskopischen Präparate wurde ein etabliertes Verfahren
verwendet, das es erlaubt, unentkalkte Schnitte des gesamten Defektbereiches
(Schnittgröße 4 x 3 cm) mit geringen Schrumpfartefakten herzustellen. Wesentliche
Vorteile der gewählten Einbettungsmethode in Methylmethacrylat sind neben der
geringen Schrumpfung der Gewebe vor allem eine gute Erhaltung der
Weichteilstrukturen und das Erhalten der Lagebeziehungen sowie der
86
Transplantatresiduen durch Vermeidung von Entkalkungssäuren bei der Präparation.
Die Schnittherstellung erfolgte mit den Osteosynthesematerialien in situ, um eine
Beschädigung des Defektbereiches durch Implantatentfernung zu vermeiden.
Augrund der verbliebenen Titanimplantate und der Dichte des kalzifizierten
Knochens war eine Bearbeitung der Schnitte mit einem herkömmlichen Mikrotom
nicht möglich, so dass die Schnitte für Lichtmikroskopie und Mikroradiographie
mittels eines Sägemikrotoms (Fa. Leitz, Wetzlar, Deutschland) hergestellt werden
mussten. Nachteil dieser Methode ist der relativ hohe Schnittverlust durch die
Eigendicke des Sägeblattes (300 µm pro Schnitt) und die begrenzte limitierte
Schnittdicke von minimal 30 µm. Die Dicke der angefertigten Schnitte erlaubte die
Zuordnung der einzelnen Gewebe sowie eine begrenzte Identifizierung der Zellen.
Eine genauere Untersuchung der einzelnen Zellbestandteile oder genaue
Zellzählungen waren aufgrund der Gewebemenge und der daraus resultierenden
Zell-Überlagerungen nicht durchführbar.
Bei der verwendeten Alizarin-Methylenblau-Färbung handelt es sich um eine
dichrome Oberflächenfärbung, die eine anschauliche Differenzierung von
anorganischer Knochenmatrix, Osteoid und umgebendem Weichteilgewebe
ermöglicht. Die Aussagekraft der verwendeten Färbung bleibt auf eine Diagnose von
Knochen, Weichgewebe und auf eine rudimentäre Zelldiagnostik beschränkt. Eine
selektive Anfärbung von bestimmten Zelltypen wie Osteoklasten oder Osteoblasten
findet nicht statt. Da keine spezielle Osteoklastenfärbung durchgeführt wurde, muss
in Betracht gezogen werden, dass das geringe Auftreten von Osteoklasten unter
Umständen auf die mangelnde Sensitivität bzw. Eignung des Verfahrens zurück zu
führen ist. Um eine genaue Erfassung des relativ großen Defektbereiches zu
87
ermöglichen und histomorphometrische Fehlmessungen durch Überlagerung
manuell gewählter Gesichtsfelder zu minimieren, wurden die Übersichtsbilder für die
Flächenbestimmung der einzelnen Materialbereiche computergesteuert erstellt und
mittels einer histomorphometrischen Software semiautomatisch ausgewertet.
Um einen exakten Vergleich korrespondierender Defektbereiche mittels CT und
Mikroradiographie zu ermöglichen, wurden die Datensätze beider
Auswertungsmethoden fusioniert und aneinander ausgerichtet. Dazu wurde zunächst
jeder dritte Sägeschnitt eines Präparates verwendet, um in einem Faxitron eine
mikroradiografische Aufnahme zu erstellen. Diese Mikroradiografien wurden dann
digitalisiert und zu einem seriellen Datensatz konvertiert. Im Anschluss wurde die
Voxelgröße angepasst, um die Größenrelationen der neu erstellten Datensätze mit
den CT-Daten vergleichen zu können. Nach Fusion war so ein direkter Vergleich von
Flächenmessungen und Hounsfield-Units- (HU) - Bestimmungen auf der Basis beider
Methoden möglich. Aufgrund der manuellen Anpassung und der Tatsache, dass eine
vergleichbare Methode in der Literatur bisher nicht etabliert oder beschrieben ist,
können geringgradige Abweichungen der Größenanpassung und Achsenausrichtung
bestehen. Die beschriebene Methode bietet unter dem Vorbehalt noch notwendiger
Verbesserungen dessen ungeachtet eine weit objektivere Vergleichsmöglichkeit als
rein visuelle Beurteilungen von radiologischen Untersuchungen.
88
4.2 Diskussion der Ergebnisse
4.2.1 OP-Verlauf und Heilungsphase
Die verwendeten ß-TCP-Zylinder konnten nach Herstellerangaben ohne
Schwierigkeit in der mitgelieferten Aspirationsvorrichtung mit autogenem Blut
durchtränkt und im Defektbereich eingesetzt werden. Der leicht zugängliche
Beckenkamm diente hierbei als adäquates Donor-Areal für die Gewinnung von
spongiösem Knochen und Knochenmark. Insgesamt kam es durch den notwendigen
Zweiteingriff, die Beschickung der Zylinder sowie deren Implantation in den Defekt zu
einer geringfügigen Verlängerung der Operationszeit von etwa einer halben Stunde.
Die intraoperative Handhabung der verwendeten ß-TCP-Zylinder sowie der
zugehörigen Aspirationsvorrichtungen erwies sich als unkompliziert. Als Nachteil des
Materials muss generell jedoch die hohe mechanische Instabilität genannt werden,
die einen vorsichtigen Umgang insbesondere mit den hohlgebohrten Zylindern
notwendig macht. Bei umsichtiger Arbeitsweise lassen sich Materialverluste durch
Beschädigung bei der Beschickung oder der Implantation vermeiden. In dieser
Studie wurde keiner der Zylinder während der chirurgischen Manipulation
beschädigt. Es bleibt allerdings zu berücksichtigen, dass entsprechende Ersatzstoffe
initial keinerlei mechanische Belastung übernehmen und nicht über Schrauben oder
Pins in die Osteosynthese einbezogen werden können. Während der Heilungsphase
muss die Kraftübertragung ausschließlich von den verwendeten
89
Osteosynthesematerialien übernommen werden, so dass der eigentliche
Defektbereich bis zur vollständigen ossären Erschließung ruhig gestellt wird.
Alle Tiere begannen direkt nach der Operation noch vor Erreichen der Stehfähigkeit
wieder mit der Nahrungsaufnahme. Intensive Beobachtung während der ersten zwei
Wochen post operationem bestätigte ein physiologisches Ruminationsverhalten, das
über die Versuchszeit in einer stetigen Gewichtszunahme der Tiere resultierte. Die
Wundheilung am Kiefer verlief komplikationslos, die postoperative Schwellung ging
innerhalb einer Woche merklich zurück. Palpatorisch konnten bei keinem der Tiere in
der nachfolgenden Standzeit Schmerzreaktionen ausgelöst oder abnorme
Schwellungen des Operationsbereiches festgestellt werden.
Nach Euthanasie 12 Wochen post operationem musste allerdings festgestellt
werden, dass zwei Tiere, bei denen das Zahnfach eröffnet worden war, eine
ausgeprägte Infektion des Defektbereiches mit Gasbildung, Verlagerung des
Zylinders nach aboral und Nekrose des angrenzenden Knochens entwickelt hatten.
Mikrobiologische Untersuchungen von Proben aus dem infizierten Bereich
bestätigten eine Infektion mit speziestypischen oralen Keimen, die wahrscheinlich
absteigend entlang des Zahnfaches den Defektbereich besiedelt hatten. Kommt es
im Rahmen eines chirurgischen Eingriffes innerhalb der Maulhöhle zu einer
Eröffnung der Kieferhöhle, gilt der Operationsbereich grundsätzlich als kontaminiert
und steht somit unter einem besonders hohen Infektionsrisiko (SLATTER 2003). Um
derartige Komplikationen im Vorfeld auszuschließen, ist bei vergleichbaren
Versuchskonzeptionen wie bereits unter 4.1.3. diskutiert eine vorherige Extraktion
der letzten Molaren anzuraten.
90
Die übrigen Defekte zeigten eine weitgehende Konsolidierung. Allerdings war es bei
einigen Tieren zu Plattenfrakturen gekommen, so dass bei fünf Schafen von einer
Heilung unter mechanisch instabilen Umständen mit entsprechenden Auswirkungen
auf den Konsolidierungsprozess ausgegangen werden muss (RODRIGUEZ-
MERCHAN u. FORRIOL 2004)( siehe 4.1.1).
4.2.2 Ergebnisse der feingeweblichen Untersuchungen
Die histologischen und histomorphometrischen Untersuchungen der Defektbereiche
bestätigten die Vermutung, dass ein hohlgebohrter Zylinder, der zusätzlich zu
autogenem Blut auch mit autogener Spongiosa und Knochenmark beladen wurde,
nach 12 Wochen einen höheren Ossifikationsgrad erreicht als ein vergleichbares ß-
TCP-Implantat ohne entsprechende Aufwertung.
Defekte in Gruppe A, in der ein solider, mit autogenem Blut perfundierter ß-TCP-
Zylinder verwendet wurde, waren nach 12 Wochen nur unvollständig von Knochen
durchbaut. Der Hauptanteil des ursprünglichen Defektes war ausgefüllt von der
bindegewebig durchbauten ß-TCP-Matrix. Die poröse Struktur des Materials war
weitgehend intakt. Die Hohlräume der Poren waren bis ins Zentrum des implantierten
Zylinders durch lockeres Bindegewebe und einsprossende Venolen sowie Arteriolen
erschlossen. Direkter Kontakt von Knochen und ß-TCP-Matrix war selten und im
Wesentlichen auf die Oberfläche der Matrix beschränkt, wobei die
Knochenneubildung ihren Ursprung an den stumpfnahen Defekträndern nahm und
von dort aus entlang der äußeren Oberfläche der keramischen Matrix verlief. Bei
Tieren dieser Gruppe, bei denen es zu einem Versagen der Osteosynthese
91
gekommen war, wurde generell mehr ungerichteter Kallus ausgebildet als bei
osteosynthetisch stabilen Tieren dieser Gruppe. Eine vollständige Überbrückung der
Defektzone wurde aber auch hier nicht erreicht. Histomorphometrische
Untersuchungen zeigten, dass in dieser Gruppe A insbesondere in den äußeren
Schnittebenen mehr Knochen gebildet wurde. Zum Zentrum des Defektes hin kam es
zu einer Abnahme der Gesamtknochenfläche, was einer dreidimensionalen
Fortsetzung der bereits beschriebenen ossären Einscheidung des ß-TCP-Zylinders
gleichkommt. Eine tatsächliche Erschliessung der Matrix im Sinne einer ossären
Durchbauung konnte in der Gruppe A nicht festgestellt werden. Dem soliden ß-TCP-
Block waren keine weiteren osteogenen Zellen oder Osteoprogenitoren zugesetzt
worden. Die Ossifikation des Defektes war somit zunächst vollständig von dem
Potential der residenten osteogenen Zellen der Defektränder abhängig, weshalb in
diesen Bereichen wahrscheinlich die meiste Knochenmasse gebildet wurde. Da der
Zylinder relativ massiv war, kam es vermutlich zunächst nur zu einer Ablagerung von
osteogenen Zellen entlang der äußeren Strukturen, während die inneren
Matrixbereiche durch schneller wachsendes Bindegewebe erschlossen wurden. Eine
ossäre Durchbauung von Innen heraus konnte nicht stattfinden. Inwieweit eine
vollständige Heilung im Sinne einer funktionellen ossären Überbrückung nach
längerer Standzeit erreicht werden kann, ist in dem vorliegenden Versuchsaufbau
nicht abzusehen; ein solcher Verlauf erscheint aber unwahrscheinlich.
Im Gegensatz zu Gruppe A fand in Gruppe B eine vollständige ossäre Durchbauung
des Defektbereiches statt. In einigen zentralen Bereichen waren kleine Knorpelinseln
gebildet worden, die höchstwahrscheinlich ein Übergangsgewebe an den Stellen
darstellen, an denen initial die Sauerstoffspannung zu niedrig zur direkten
92
Ausbildung ossären Gewebes gewesen war. In allen Fällen waren die beschriebenen
Knorpelzellen blasig aufgetrieben und die Knorpelzone ging in knöcherne Strukturen
im Sinne einer Enchondralen Ossifikation über. Die vollständige Erschliessung der
Defekte in Gruppe B ist im Wesentlichen zwei Faktoren zuzuschreiben, wobei der
individuelle Stellenwert des einen in dieser Versuchskonzeption nicht von dem
anderen unterschieden werden kann: zum einen bietet ein hohlgebohrter Zylinder
allein durch seine vergrößerte Oberfläche in Relation zum Volumen von vorneherein
erhebliche Vorteile. Neu gebildetes Knochengewebe kann ohne Widerstand nicht nur
entlang der äußeren Kontur, sondern auch zentral in die verwendete Matrix
einwachsen. Hierdurch wird eine Erschliessung von allen Seiten ermöglicht.
Verglichen mit Gruppe A wurde der ß-TCP-Zylinder in Gruppe B zusätzlich zu der
beschriebenen geometrischen Variation mit zerkleinerter Spongiosa und
Knochenmark befüllt, so dass davon auszugehen ist, dass im Zentrum des
Implantats bereits zu Beginn der Heilungsphase zusätzliche lebensfähige osteogene
Zellen, Osteoprogenitorzellen und induktive Faktoren vorhanden waren, die die
lokalen Ressourcen des Implantatlagers ergänzten. Durch den in dieser Arbeit
veröffentlichten Versuchsaufbau ist es nicht möglich, den individuellen Anteil der mit
der Spongiosa übertragenen, bereits differenzierten osteogenen Zellen von den
potentiell mit dem Knochenmark übertragenen induktiven Faktoren und
Ostoprogenitorpopulationen an der Regeneration abzugrenzen. Bisher in diesem
Rahmen nicht veröffentlichte eigene Ergebnisse aus der polychromen
Fluoreszenzmarkierung weisen allerdings darauf hin, dass die Rolle von
Vorläuferzellen in diesem Kontext weit bedeutender ist als die der bereits
differenzierten Zellen, die mit der zerkleinerten Spongiosa übertragen wurden. Das
93
unterstützende Potential von Knochenmark bei der Heilung ossärer Defekte und
Pseudarthrosen ist hinreichend beschrieben (CONNOLLY et al. 1991; BRUDER et
al. 1998a; BRUDER et al. 1998b; BRUDER u. FOX 1999; KRAUS u. KIRKER-HEAD
2006). Dennoch wird in der Literatur mehrfach darauf hingewiesen, dass diese
einfach zugängliche Ressource für induktive Faktoren und Ostoprogenitorzellen zu
wenig eingesetzt wird (FLEMING et al. 2000). Im Gegensatz zu den aufwendigen
Verfahren, mit denen in vitro Osteoprogenitorpopulationen kultiviert und expandiert
werden müssen, steht die einfache Gewinnung von nicht weiter prozessiertem
Knochenmark. Dieses kann ad tabulam von dem betroffenen Patienten gewonnen
und ohne weiteren Zeit– oder Kostenaufwand verwendet werden (BRUDER et al.
1998b; KON et al. 2000; MUSCHLER et al. 2003).
In beiden Gruppen konnten residuale, kristalline ß-TCP-Trümmer innerhalb der
bereits neu mineralisierten Knochenmatrix gefunden werden. Dieses Phänomen
könnte ein Hinweis dafür sein, dass die verwendete ß-TCP-Matrix über die rein
passive osteokonduktiven Funktion hinaus als Substrat für die Bildung neuer
Knochenmatrix dient. Ein ähnliches Phänomen ist bei der Verwendung einer anderen
Kalziumphosphat-Matrix beobachtet worden (RENOOIJ et al. 1985). Um diese
Spekulation weiter zu erhärten, wären vergeichbare weitere Untersuchungen mit
zuvor markierten Kalziumphosphat-Molekülen notwendig. So ließe sich
möglicherweise belegen, dass Kalziumphosphat-Moleküle aus der Matrix in dem
neugebildeten Knochen integriert wurden.
4.2.3 Ergebnisse der Validierung des diagnostischen Wertes der Computer-
Tomographie
94
Obwohl in den letzten 100 Jahren der Bereich des Knochenersatzes wissenschaftlich
intensiv bearbeitet wurde, blieben wichtige Aspekte wie die Vergleichbarkeit von
experimentellen und klinischen Ergebnissen weitgehend unberücksichtigt. So wurden
Keramiken, insbesondere deren Hauptvertreter ß-TCP und HA, zwar in zahlreichen
Studien auf ihre Eignung als Knochenersatzstoff hin untersucht. Eine Validierung
klinischer diagnostischer Verfahren steht aber in der überwiegenden Zahl der Fälle
aus.
Unglücklicherweise haben die vorteilhaften Materialeigenschaften von HA und TCP
auch zur Folge, dass die verwendeten Keramiken radiologisch nativem Knochen
stark ähneln, so dass eine sichere diagnostische Darstellung eines solchen Materials
nach erfolgter ossärer Erschliessung in vivo fraglich erscheint. In der Vergangenheit
wurde dieses Problem mehrfach von verschiedenen Autoren erkannt und adressiert
(JOHNSON et al. 1996; WEISSMAN et al. 1996; RUEGER et al. 1998). Einige
Autoren gehen sogar soweit zu sagen, dass eine zuverlässige Beurteilung des
Heilungsverlaufes innerhalb eines keramischen Transplantates auf Basis
radiologischer Befunderhebung nicht möglich ist. So bleibt man klinisch darauf
angewiesen, Biopsien der betroffenen Stellen zu entnehmen, um den Verlauf von
Ossifikation und Degradation sicher objektiv zu verfolgen (MANKANI et al. 2004).
Diese Manipulation ist allerdings hochrisikoreich; insbesondere in einem Bereich, in
dem es zu umfangreichen Knochenverlusten gekommen ist, besteht Frakturgefahr,
so dass Biopsien im Anschluss an knöcherne Rekonstruktionen in der Regel nicht
durchgeführt werden.
95
Um die Genauigkeit aktueller klinischer Diagnostik-Verfahren objektiv zu erfassen
und gegebenenfalls eine Entwicklung hin zu leistungsfähigeren Untersuchungen
nach knöcherner Rekonstruktion zu ermöglichen, ist zu fordern, dass Studien, die die
Eignung verschiedener Ersatzmaterialien untersuchen, parallel auch einen objektiven
Vergleich der etablierten feingeweblichen Verfahren mit aktuellen klinischen
Verfahrensweisen anstreben sollten. Obwohl entsprechende Forderungen in der
Literatur auftauchen (GOLDSTEIN 2002), sind entsprechende Studien kaum
durchgeführt worden. Klinisch bleibt man weiterhin auf eine subjektiv begründete
Beurteilung des Heilungsverlaufes angewiesen ohne sicher zu wissen, wie genau die
Darstellung der Ossifikation und Degradation entsprechender Implantate tatsächlich
ist.
Im Rahmen der Literaturrecherche für diese Arbeit konnte lediglich eine
veröffentlichte Studie gefunden werden, in der ein objektiver Vergleich von CT und
semiquantitativer histologischer Auswertung angestrebt wurde. MANKANI et al.
(2004) verglichen die Ergebnisse eines semiquantitativen histologischen Score-
Systems für Knochenneubildung innerhalb eines mit humanen mesenchymalen
Zellen beladenen HA-Transplantates nach ektopischer Implantation in die Muskulatur
von immundefizienten Mäusen mit durch quantitative CT-Untersuchungen
gemessenen Dichtewerten (bezogen auf einen Referenzkörper mit der Dichte 0 und
200 mg/cm3 K2HPO4). Sie kamen zu dem Schluss, dass eine Dichte von 600 mg/cm3
K2HPO4 und mehr mit einem hohen histologischen Knochenscore korrelierte
(MANKANI et al. 2004). Für die Erfassung der Ossifikation innerhalb eines HA-
Zylinders erscheint die Methodik der Dichtemessung mittels CT also nach den
Ergebnissen dieser Studie als geeignet. Die auf der Dichte basierende Beurteilung
96
von Knochenneubildung innerhalb eines keramischen Transplantates erscheint
nachvollziehbar, wenn man beachtet, dass ein nicht degradierbares Material wie HA
verwendet wurde. In diesem Fall ist eine zusätzliche Mineralisierung innerhalb des
Transplantates mit einer Zunahme der Dichte korreliert, da die zusätzliche
mineralisierte Matrix ergänzend zu der vorhandenen HA-Matrix wirkt. Nicht-
degradierbare Keramiken haben aber den Nachteil, dass sie als Fremdmaterial im
Knochen verbleiben. Ein Remodelling ist nicht möglich, so dass der betroffene
Abschnitt immer als Schwachstelle im Knochen erhalten bleibt (HOOGENDOORN
1984; RENOOIJ et al. 1985; FLEMING et al. 2000). Bei einer degradierbaren
Keramik wie ß-TCP erscheint eine auf der Dichte basierende Beurteilung der
Knochenneubildung innerhalb des Transplantates weniger sinnvoll, da hier, im
Gegensatz zu HA, eine Abnahme der Ausgangsdichte des Materials durch
Degradation möglich ist, die im Zweifelsfall eine parallel aufgetretene Zunahme der
Knochendichte maskieren würde. Entsprechende Untersuchungen für ß-TCP fehlen
bislang.
In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützt CT-Datensätze der mit ß-TCP
rekonstruierten Defektbereiche mit ex vivo angefertigten Mikroradiografien derselben
Bereiche verglichen. Dafür wurden beide Datensätze zunächst miteinander fusioniert
und so ausgerichtet, dass eine parallele Darstellung desselben Bereiches innerhalb
des Defektes möglich wurde. Bei den Tieren, bei denen es zu einer Infektion mit
Verlagerung des ß-TCP-Zylinders gekommen war, wurde diese Fusion nicht
durchgeführt. Die Dislokation der Zylinder aus dem Defektbereich sowie die
Gasbildung waren in beiden Fällen im CT offensichtlich.
97
Die Gruppen A und B repräsentieren zwei verschiedene Heilungsverläufe. Während
es in Gruppe A nur zu einer unvollständigen ossären Durchbauung der Zylinder kam,
bei der ein Großteil der Implantatoberfläche durch Bindegewebe von neu gebildetem
Knochen abgegrenzt wurde, ist in Gruppe B überwiegend eine vollständige ossäre
Überbrückung des Defektes bei erfolgter weitreichender Degradation der Matrix
erreicht worden. Residuale ß-TCP-Partikel wurden überwiegend direkt, ohne
abgrenzende bindegewebige Strukturen in den neu gebildeten Knochen
eingebunden. Für die Beurteilung der Genauigkeit der computertomographischen
Darstellung wurde deshalb die Gruppeneinteilung beibehalten. Nach Bestimmung
der residualen Keramikfläche in CT und Mikroradiografie wurde für jede Gruppe,
respektive für jeden Heilungsverlauf, statistisch untersucht, ob signifikante
Abweichungen der Mittelwerte oder signifikante Varianzen zwischen den bestimmten
Flächenmessungen bestehen. Für beide Gruppen wurden vergleichbare Graustufen,
und damit vergleichbare HU für Knochen und Restmatrix bestimmt. Eine
zuverlässige Zuordnung eines Grauwertes zu Knochen oder ß-TCP, und damit eine
optische Unterscheidung, waren somit im CT nicht möglich. In Gruppe A konnte
aufgrund des interponierten Weichteilgewebes zwischen Knochen und ChronOs®
eine ungefähre Bestimmung der äußeren Grenzen des Restmaterials vorgenommen
werden. An Stellen, an denen ein direkter Knochen-ß-TCP-Kontakt vorlag, war
hingegen eine sichere Abgrenzung der ß-TCP-Matrix gegen den trabekulären
Knochen nicht möglich. Der statistische Vergleich von Flächenmessungen beider
Methoden zeigte ein signifikantes Abweichen der Mittelwerte bei einer nicht
signifikanten Varianz der Werte. Insgesamt wurde die residuale ChronOs® Fläche,
basierend auf den CT-Daten, im Vergleich zu den Ergebnissen der etablierten
98
Methode der Mikroradiografie weitgehend unterschätzt. In Gruppe B, respektive der
Gruppe mit fortgeschrittener ß-TCP-Integration und -Degradation, war kein
interponiertes Weichteilgewebe zwischen Knochen und ß-TCP-Matrix eingelagert.
Da eine Unterscheidung, basierend auf den Graustufen, auch in dieser Gruppe nicht
möglich war, gelang eine sichere Abgrenzung gegen den Knochen nicht. Die
Bestimmung der ChronOs®-Restfläche im CT resultierte in Werten, die eine
signifikante Varianz im Vergleich zum Goldstandard Mikroradiographie zeigten. Eine
signifikante Abweichung der Mittelwerte trat in dieser Gruppe nicht auf.
Insgesamt lässt sich als Ergebnis dieses Vergleiches feststellen, dass eine sichere
Unterscheidung von verwendeter ß-TCP-Keramik und trabekulärem Knochen nach
begonnener Integration der Matrix mittels CT nicht möglich ist. Eine genaue
Diagnostik des Heilungsfortschrittes kann somit in vivo nicht erfolgen. Unter
klinischen Bedingungen sind nach unseren Ergebnissen für eine Beurteilung des
Heilungsverlaufes innerhalb der Matrix durch das CT nur begrenzt objektive
Informationen zu erhalten. Deutliche Fehlentwicklungen wie Implantat-Dislokation
oder Fraktur können allerdings mit dem CT detektiert werden. Die vorliegenden
Ergebnisse bestätigen die in der Literatur beschriebenen Bedenken (JOHNSON et
al. 1996; RUEGER 1998; BLOEMERS 2002). Allerdings handelt es sich bei diesem
Methodenvergleich um ein Pilotprojekt mit geringer Tierzahl. Vergleichbare Studien
sind in der Literatur nicht vorhanden und weiterführende eigene Erfahrungen mit der
Methode fehlen, so dass die Schwächen der Methode der computergestützten
Fusion unterschiedlich generierter Datensätze bislang nicht vollständig bekannt sind.
Als wesentlicher Schwachpunkt ist sicherlich die manuelle Ausrichtung der
Datensätze vor der Fusion zu sehen, bei denen eine vollkommene Übereinstimmung
99
der Flächen in allen Ebenen nie ganz erreicht werden kann. Dennoch bietet die
Methode weitaus objektivere Werte als ein Vergleich der Methoden mit dem bloßen
Auge, ohne Kontrolle.
4.2.4 Praktische Bedeutung der Ergebnisse der durchgeführten Studie
Die vorliegende Studie diente der näheren Untersuchung von ß-TCP-Zylindern
hinsichtlich ihrer Eignung als Knochenersatzmaterial zur Rekonstruktion von
ausgedehnten Defekten der Mandibel. Die Ergebnisse bestätigen das bekannte
osteokonduktive Potential sowie die Biokompatibilität des verwendeten Materials. Als
wichtiger praxisrelevanter Aspekt konnte gezeigt werden, dass für beide Implantat-
Typen eine vollständige Vaskularisation erfolgt. Um eine zuverlässige ossäre
Erschliessung eines geometrischen Körpers von klinisch relevanter Größe zu
gewährleisten, ist es allerdings notwendig, die angreifbare Implantatoberfläche zu
maximieren und eine Kombination des verwendeten Materials mit osteogenen Zellen
(präformiert sowie undifferenziert) und osteoinduktiven Faktoren vorzunehmen.
100
5 Zusammenfassung
Primäre Rekonstruktion mandibulärer Kontinuitätsdefekte durch
eine ß-Trikalziumphosphat – Matrix beim Schaf
Mirja Christine Nolff
Studienziel: Ziel der vorliegenden tierexperimentellen Arbeit war es, die
Osseointegration eines mit autogenem Blut durchtränkten ß-Trikalzium-Phosphat (ß-
TCPa)-Zylinders mit einer vergleichbaren ß-TCP-Komposit-Matrix, die zusätzlich zur
Perfusion mit autogenem Blut auch mit autogener Spongiosa und autogenem
Knochenmark befüllt wurde (ß-TCPb), zu vergleichen. Zusätzlich wurde am Beispiel
der Computertomografie untersucht, inwiefern in vivo mittels aktueller bildgebender
Untersuchungsverfahren eine Unterscheidung von keramischer Matrix und neu
gebildetem Knochen und damit eine zuverlässige Patientennachsorge nach
Rekonstruktion mit dem verwendeten Material möglich ist.
Material und Methode: Insgesamt wurde bei zwölf adulten Deutschen
Schwarzkopfschafen (mittleres Gewicht 72,5 +/- 10 kg) per Osteotomie ein
segmentaler Kontinuitätsdefekt von kritischer Größe an der rechten Mandibel
hergestellt. Die Tiere wurden zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt, wobei der Defekt
bei Tieren der Gruppe A (n=6) mit einem ß-TCPa -Implantat versorgt wurde, während
die Rekonstruktion bei Tieren der Gruppe B unter Verwendung eines ß-TCPb-
Zylinders erfolgte. Aus diesen Gruppen dienten zwei Schafe als Pilottiere, um die
Praktikabilität des Eingriffes beim Wiederkäuer zu bestimmen. Diese beiden Tiere
101
wurden euthanasiert, bevor die Eingriffe an den restlichen Schafen (n=10)
durchgeführt wurden. Mit Ausnahme dieser beiden Pilottiere wurde bei allen anderen
Schafen (n=10) direkt im Anschluss an die Euthanasie eine CT-Untersuchung des
Schädels durchgeführt, bevor der Defektbereich inkl. der Grenzflächen zur weiteren
feingeweblichen Aufarbeitung entnommen wurde. Die Qualität des neu gebildeten
Gewebes innerhalb des ursprünglichen Defektes wurde histologisch beurteilt und die
Knochen-, Restmatrix-, Knorpel- sowie Bindegewebsfläche durch eine
semiautomatische histomorphometrische Aufarbeitung erfasst. Um einen objektiven
Vergleich von CT und Mikroradiografie zu ermöglichen, wurden die Mikroradiografien
zu einem seriellen Datensatz konvertiert und mit dem korrespondierenden CT-
Datensatz fusioniert. Anschließend wurde die residuale Keramikfläche mithilfe beider
Methoden gemessen und verglichen. Im Kontext des Methodenvergleiches ist
Gruppe A repräsentativ für unvollständige Heilung, während bei Tieren in Gruppe B
ein fortgeschrittener Heilungsverlauf angenommen wurde. Über die Bestimmung der
Sensitivität der Computertomographie hinaus wurden die fusionierten Datensätze
benutzt, um die Degradation der Zylinder zu kalkulieren.
Ergebnisse: Zwei Tiere (n=1 Gruppe A, n=1 Gruppe B) entwickelten eine Infektion im
Defektbereich mit Dislokation des ß-TCP-Zylinders, die erst post mortem festgestellt
werden konnte. Beide Tiere wurden aus der Studie herausgenommen. Die
histomorphometrische Bestimmung zeigte für ß-TCPb-Implantate eine signifikant
(p<0.01) höhere Knochenneubildung als für den Implantattyp ß-TCPa. Eine
knöcherne Überbrückung des Defektes mit fortgeschrittener Organisation des neu
gebildeten Knochens wurde bei allen Tieren in Gruppe B erreicht. Residuale ß-TCP-
Partikel waren selten und zusammenhangslos im Defektbereich verteilt. Im
102
Gegensatz dazu war das neu gebildete Knochengewebe in Gruppe A nur wenig
organisiert. Keines der Tiere in dieser Gruppe erreichte eine ossäre Überbrückung
des Defektes, der bei allen Tieren dieser Gruppe zentral von einem ß-TCP-Kern
ausgefüllt wurde. Die mittels CT ermittelte Degradation der Matrix bestätigte die
Ergebnisse von Histologie und Histomorphometrie und übertraf mit 94,2 ± 3,3 % in
Gruppe B die Degradation in Gruppe A (53,55 ± 9,7 %) deutlich.
Ein statistischer Vergleich der Flächenbestimmung mittels CT und Mikroradiografie
zeigte in Gruppe A einen signifikanten Unterschied (p<0.05) ohne signifikante
Varianz der Werte. Für Gruppe B konnte keine signifikante Abweichung der
Mittelwerte festgestellt werden, allerdings war in dieser Gruppe eine signifikante
Varianz (p<0.05) der Werte zu verzeichnen.
Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Studie dokumentieren, dass das
verwendete ß-TCPB/BM/CB-Komposit als vielversprechende Alternative zu autogenem
Knochen für die Rekonstruktion mandibulärer Defekte in Tier- und Humanmedizin
angesehen werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie belegen jedoch
auch, dass mittels CT eine objektive Bestimmung von Degradation und Ossifikation
innerhalb eines ß-TCP-Konstruktes in vivo, und damit eine sichere Überwachung des
Heilungsverlaufes über die gesamte Heilungsphase, nicht möglich ist. Es erscheint
notwendig, weitere Untersuchungen durchzuführen, um die klinisch einsetzbaren
bildgebenden Verfahren dahingehend zu verbessern.
103
6 Summary
Primary Reconstruction of Mandibular Continuity Defects in Sheep
using ß-Tricalcium-Phosphate Scaffolds.
Mirja Christine Nolff
Objective: The aim of this study was to compare osseointegration of blood soaked ß-
Tricalcium Phosphate cylinders (ß-TCPB) with similar composites that were
additionally loaded with cancellous bone and bone marrow (ß-TCPB/BM/CB) for
mandibular reconstruction. Additionally accuracy of CT for in-vivo patient follow up
after mandibular reconstruction using ß-TCP was assessed by comparing CT
measurements of residual graft area with estimates based on microradiography.
Material and Methods: Twelve German Black-Headed Sheep with an average weight
of 72.5 +/- 10 kg underwent segmental resection of the right hemi-mandible. Animals
assigned to group A (n=6) were reconstructed using ß-TCPB while sheep assigned to
group B (n=6) received ß-TCPB/BM/CB grafts. Two sheep served as pilot animals to
determine the feasibility of the surgical intervention in a ruminating species and were
euthanized before the other animals underwent surgery. With exception of these
two, all animals (n=10) had CT scans of the cranium performed prior to harvesting of
the defect area for histological and microradiographic evaluation. Tissue quality was
histological assessed and bone-, scaffold-, cartilage- and fibrous-tissue area were
estimated using semiautomated histomorphometrical software. In order to allow
evaluation of CT accuracy the microradiographic images were converted into serial
104
datasets and fused with the corresponding CT data. Finally, measurements of
ceramic area based on both methods were compared. We anticipated a different
degree of healing associated with the graft type, thus the assignment into the two
groups (A and B) was adopted for validation of CT accuracy. Group A was
considered representative for incomplete healing while group B represented a further
stage of healing. Additionally the fused Datasets were used to estimate the degree of
graft degradation corrected to initial graft volume.
Results: Two animals (group A (n=1) and B (n=1)) presented infection and graft
dislocation that became evident at necropsy and was visible on CT. These animals
were excluded from histological evaluation and comparison of CT and
microradiography. Histomorphometric estimation revealed that ß-TCPB/BM/CB grafts
exhibited significant (p<0.01) higher amounts of bone formation than ß-TCPB.
Animals assigned to group B achieved defect union and a high grade of bone
maturation; residual ceramic remnants were rare and disconnected. Bone maturity
within group A was inferior and none of the specimens showed defect union while the
defect center was still occupied by a ceramic core. Fusion of CT and
Microradiography revealed that, as anticipated, ceramic grafts of group A underwent
moderate degradation (53.55% ± 9.7) and incomplete bony incorporation
representing an indermediate state of healing while ceramic grafts within group B
developed a high grade of osseointegration and degradation (94.2% ± 3.3)
representing progressed healing. Statistical comparison of area estimates based on
both methods showed a significant bias (p<0.05) and a non-significant variance for
group A and a significant variance (p<0.05) and non-significant bias for group B.
105
Conclusion: TCPB/BM/CB composites may qualify as a promising alternative to
autograft bone for mandibular reconstruction in human and veterinary medicine, but
the results of our study indicate that conventional CT is not eligible to objectively
evaluate new bone formation or graft degradation within a ß-TCP graft in vivo.
Further attempts to improve clinical visualization of healing within ß-TCP grafted
defects need to be undertaken.
106
7. Literaturverzeichnis
AYOUB, A. F., W. RICHARDSON, D. KOPPEL, H. THOMPSON, M. LUCAS, T. SCHWARZ, L. SMITH u. J. BOYD (2001): Segmental mandibular reconstruction by microincremental automatic distraction osteogenesis: an animal study. Br. J. Oral. Maxillofac. Surg. 39, 356-364 BANWART, J. C., M. A. ASHER u. R. S. HASSANEIN (1995): Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity. A statistical evaluation. Spine 20, 1055-1060 BAUER, T. W. u. G. F. MUSCHLER (2000): Bone graft materials. An overview of the basic science. Clin. Orthop. Relat. Res. 10-27 BIGNON, A., J. CHOUTEAU, J. CHEVALIER, G. FANTOZZI, J. P. CARRET, P. CHAVASSIEUX, G. BOIVIN, M. MELIN u. D. HARTMANN (2003): Effect of micro- and macroporosity of bone substitutes on their mechanical properties and cellular response. J. Mater. Sci. Mater. Med. 14, 1089-1097 BLOEMERS, F. W., PATKA, P., BAKKER, F.C., HAARMAN,H. J. T. M. (2002): The use of calcium phosphates as a bone substitute material in trauma surgery. Osteo. Trauma. Care. 10, 33-37 BLOKHUIS, T. J., M. F. TERMAAT, F. C. DEN BOER, P. PATKA, F. C. BAKKER u. H. J. HAARMAN (2000): Properties of calcium phosphate ceramics in relation to their in vivo behavior. J. Trauma 48, 179-186 BOYCE, T., J. EDWARDS u. N. SCARBOROUGH (1999): Allograft bone. The influence of processing on safety and performance. Orthop. Clin. North. Am. 30, 571-581 BRUDER, S. P. u. B. S. FOX (1999): Tissue engineering of bone. Cell based strategies. Clin. Orthop. Relat. Res. S68-83 BRUDER, S. P., N. JAISWAL, N. S. RICALTON, J. D. MOSCA, K. H. KRAUS u. S. KADIYALA (1998a): Mesenchymal stem cells in osteobiology and applied bone regeneration. Clin. Orthop. Relat. Res. S247-256 BRUDER, S. P., K. H. KRAUS, V. M. GOLDBERG u. S. KADIYALA (1998b):
107
The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J. Bone. Joint. Surg. Am. 80, 985-996 CHU, T. M., D. G. ORTON, S. J. HOLLISTER, S. E. FEINBERG u. J. W. HALLORAN (2002): Mechanical and in vivo performance of hydroxyapatite implants with controlled architectures. Biomaterials 23, 1283-1293 CONNOLLY, J. F., R. GUSE, J. TIEDEMAN u. R. DEHNE (1991): Autologous marrow injection as a substitute for operative grafting of tibial nonunions. Clin. Orthop. Relat. Res. 259-270 CORNELL, C. N. (1999): Osteoconductive materials and their role as substitutes for autogenous bone grafts. Orthop. Clin. North. Am. 30, 591-598 DECHAMPLAIN, R. W. (1973): Mandibular reconstruction. J. Oral. Surg. 31, 448-462 DELLOYE, C., M. VERHELPEN, J. D'HEMRICOURT, B. GOVAERTS u. R. BOURGOIS (1992): Morphometric and physical investigations of segmental cortical bone autografts and allografts in canine ulnar defects. Clin. Orthop. Relat. Res. 273-292 EGGLI, P. S., W. MULLER u. R. K. SCHENK (1988): Porous hydroxyapatite and tricalcium phosphate cylinders with two different pore size ranges implanted in the cancellous bone of rabbits. A comparative histomorphometric and histologic study of bony ingrowth and implant substitution. Clin. Orthop. Relat. Res. 127-138 EINHORN, T. A. (1999): Clinically applied models of bone regeneration in tissue engineering research. Clin. Orthop. Relat. Res. S59-67 EITEL, F., F. KLAPP, W. JACOBSON u. L. SCHWEIBERER (1981): Bone regeneration in animals and in man. A contribution to understanding the relative value of animal experiments to human pathophysiology. Arch. Orthop. Trauma Surg. 99, 59-64 FENNIS, J. P., P. J. STOELINGA u. J. A. JANSEN (2004): Mandibular reconstruction: a histological and histomorphometric study on the use of autogenous scaffolds, particulate cortico-cancellous bone grafts and platelet rich plasma in goats.
108
Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 33, 48-55 FLEMING, J. E., JR., C. N. CORNELL u. G. F. MUSCHLER (2000): Bone cells and matrices in orthopedic tissue engineering. Orthop. Clin. North. Am. 31, 357-374 GLOWACKI, J. (1998): Angiogenesis in fracture repair. Clin. Orthop. Relat. Res. S82-89 GOLDSTEIN, S. A. (2002): Tissue engineering: functional assessment and clinical outcome. Ann. N. Y. Acad. Sci. 961, 183-192 HABRAKEN, W. J., J. G. WOLKE u. J. A. JANSEN (2007): Ceramic composites as matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv. Drug. Deliv. Rev 59, 234-248 HAUSCHILD, G. u. BADER, A. (2004): Vor- und Nachteile synthetischer versus xenogener Knochenersatzmaterialien. Tierärztl Prax; 32 (K): 67-70 HING, K. A. (2005): Bioceramic Bone Graft Substitutes: Influence of Porosity and Chemistry. Int. J. Appl. Ceram. Technol. 2, 184-199 HOOGENDOORN, H. A., RENOOJI, W., ACKERMANS, L. M. A., VISSER, V. ,WITTEBOL, P. (1984): Long term study of ceramic implants (porous hydroxyapatite) in dog femora. Clin. Orthop. 187, 281-294 HUTMACHER, D. W. (2001): Scaffold design and fabrication technologies for engineering tissues--state of the art and future perspectives. J. Biomater. Sci. Polym. Ed 12, 107-124 JENSEN, S. S., N. BROGGINI, E. HJORTING-HANSEN, R. SCHENK u. D. BUSER (2006): Bone healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clin. Oral. Implants. Res. 17, 237-243 JOHNSON, K. D., K. E. FRIERSON, T. S. KELLER, C. COOK, R. SCHEINBERG, J. ZERWEKH, L. MEYERS u. M. F. SCIADINI (1996):
109
Porous ceramics as bone graft substitutes in long bone defects: a biomechanical, histological, and radiographic analysis. J Orthop. Res. 14, 351-369 KLINE, R. M., JR. u. S. A. WOLFE (1995): Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast. Reconstr. Surg. 95, 5-13; Discussion 14-20 KON, E., A. MURAGLIA, A. CORSI, P. BIANCO, M. MARCACCI, I. MARTIN, A. BOYDE, I. RUSPANTINI, P. CHISTOLINI, M. ROCCA, R. GIARDINO, R. CANCEDDA u. R. QUARTO (2000): Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. J. Biomed. Mater. Res. 49, 328-337 KRAUS, K. H. u. C. KIRKER-HEAD (2006): Mesenchymal stem cells and bone regeneration. Vet. Surg. 35, 232-242 LU, J. X., B. FLAUTRE, K. ANSELME, P. HARDOUIN, A. GALLUR, M. DESCAMPS u. B. THIERRY (1999): Role of interconnections in porous bioceramics on bone recolonization in vitro and in vivo. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 111-120 MANKANI, M. H., S. A. KUZNETSOV, N. A. AVILA, A. KINGMAN u. P. G. ROBEY (2004): Bone formation in transplants of human bone marrow stromal cells and hydroxyapatite-tricalcium phosphate: prediction with quantitative CT in mice. Radiology 230, 369-376 MASTROGIACOMO, M., A. MURAGLIA, V. KOMLEV, F. PEYRIN, F. RUSTICHELLI, A. CROVACE u. R. CANCEDDA (2005): Tissue engineering of bone: search for a better scaffold. Orthod. Craniofac. Res. 8, 277-284 MUSCHLER, G. F., H. NITTO, Y. MATSUKURA, C. BOEHM, A. VALDEVIT, H. KAMBIC, W. DAVROS, K. POWELL u. K. EASLEY (2003): Spine fusion using cell matrix composites enriched in bone marrow-derived cells. Clin. Orthop. Relat. Res. 102-118 NAIR, M. B., S. SURESH BABU, H. K. VARMA u. A. JOHN (2007): A triphasic ceramic-coated porous hydroxyapatite for tissue engineering application. Acta. Biomater. PELEG, M. u. E. A. LOPEZ (2006):
110
The treatment of osteoradionecrosis of the mandible: the case for hyperbaric oxygen and bone graft reconstruction. J. Oral. Maxillofac. Surg. 64, 956-960 RACHMIEL, A., Z. POTPARIC, I. T. JACKSON, T. SUGIHARA, L. CLAYMAN, J. S. TOPF u. R. A. FORTE (1993): Midface advancement by gradual distraction. Br. J. Plast. Surg. 46, 201-207 RENOOIJ, W., H. A. HOOGENDOORN, W. J. VISSER, R. H. LENTFERINK, M. G. SCHMITZ, H. VAN IEPEREN, S. J. OLDENBURG, W. M. JANSSEN, L. M. AKKERMANS u. P. WITTEBOL (1985): Bioresorption of ceramic strontium-85-labeled calcium phosphate implants in dog femora. A pilot study to quantitate bioresorption of ceramic implants of hydroxyapatite and tricalcium orthophosphate in vivo. Clin. Orthop. Relat. Res. S. 272-285 RODRIGUEZ-MERCHAN, E. C. u. F. FORRIOL (2004): Nonunion: general principles and experimental data. Clin. Orthop. Relat. Res. S. 4-12 RUEGER, J. M. (1998): [Bone substitution materials. Current status and prospects]. Orthopäde 27, S. 72-79 RUEGER, J. M., W. LINHART u. D. SOMMERFELDT (1998): [Biologic reactions to calcium phosphate ceramic implantations. Results of animal experiments]. Orthopäde 27, S. 89-95 SCHLEGEL, K. A., F. J. LANG, K. DONATH, J. T. KULOW u. J. WILTFANG (2006): The monocortical critical size bone defect as an alternative experimental model in testing bone substitute materials. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 102, S. 7-13 SCHMITZ, J. P. u. J. O. HOLLINGER (1986): The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin.Orthop.Relat.Res. S. 299-308 SEEHERMAN, H. (2001): The influence of delivery vehicles and their properties on the repair of segmental defects and fractures with osteogenic factors. J.Bone.Joint.Surg.Am.83-A Suppl 1, S. 79-81 SIPE, J. D., C. A. KELLEY, L. A. MCNICOL u. NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (U.S.). BIOENGINEERING CONSORTIUM. (2002):
111
Reparative medicine : growing tissues and organs. New York Academy of Sciences, New York SLATTER,D. (2003) In: Textbook of Small Animal Surgery. Third Edition. Saunders (USA), S. 553 STEVENSON, S. (1998): Enhancement of fracture healing with autogenous and allogeneic bone grafts. Clin.Orthop.Relat.Res.S239-246 STEVENSON, S. (1999): Biology of bone grafts. Orthop.Clin.North.Am.30, 543-552 STRONG, E. B., B. RUBINSTEIN, N. PAHLAVAN, B. MARTIN, H. KUNTSI-VAATTOVAARA u. F. J. VERSTRAETE (2003): Mandibular reconstruction with an alloplastic bone tray in dogs. Otolaryngol.Head Neck Surg.129, 417-426 TAY, B. K., V. V. PATEL u. D. S. BRADFORD (1999): Calcium sulfate- and calcium phosphate-based bone substitutes. Mimicry of the mineral phase of bone. Orthop.Clin.North.Am.30, 615-623 TOMFORD, W. W. (1995): Transmission of disease through transplantation of musculoskeletal allografts. J.Bone.Joint.Surg.Am.77, 1742-1754 TOMFORD, W. W. u. H. J. MANKIN (1999): Bone banking. Update on methods and materials. Orthop.Clin.North.Am.30, 565-570 WEISSMAN, J. L., C. H. SNYDERMAN u. B. E. HIRSCH (1996): Hydroxyapatite cement to repair skull base defects: radiologic appearance. Am.J.Neuroradiol.17, 1569-1574 WENZ, B., B. OESCH u. M. HORST (2001): Analysis of the risk of transmitting bovine spongiform encephalopathy through bone grafts derived from bovine bone. Biomaterials 22, 1599-1606 WHEELER, D. L. u. W. F. ENNEKING (2005): Allograft bone decreases in strength in vivo over time. Clin.Orthop.Relat.Res.36-42
112
WIPPERMANN, B. W. (1993) Der Einfluß von „Fibroblast Growth Factor“ und autologem Knochenmark auf die Einheilung einer Hydroxylapatit-Keramik in einem diaphysärem Segmentdefekt. Eine experimetelle Studie an der Schaftibia. Medizinische Hochschule Hannover, Habil.-Schr. YOUNGER, E. M. u. M. W. CHAPMAN (1989): Morbidity at bone graft donor sites. J.Orthop.Trauma 3, S. 192-195
113
8 Anhang
8.1 Bestätigung der Verlage
8.1.1 Bestätigung Manuskript I
24-Jun-2008
Dear Miss Nolff,
We are pleased to inform you that your revised manuscript entitled "Qualitative and
quantitative evaluation of two different ß-TCP composite grafts used for
reconstruction of mandibular critical size bone defects in an ovine model." has been
ACCEPTED for publication in VCOT. The comments of the reviewer(s) who
reviewed your manuscript are included at the foot of this letter.
As soon as the paper has been formated by the Publisher it will appear under "
PrePrint Online VCOT-First" and can be accessed via www.vcot-online.com.
Many thanks for submitting your work to VCOT, and we look forward to your
continued contributions to the Journal.
Kind regards,
Prof. Geoff. Sumner-Smith
Editor-in-Chief
Referee(s)' Comments to Author:
Referee: 1 Nil
114
8.1.2 Bestätigung Manuskript II
Ms. Ref. No.: JCMS-D-08-00172
Title: Comparison of Computed Tomography and Microradiography for Graft
Evaluation after Reconstruction of Critical Size Bone Defects using ß-Tricalcium-
Phosphate.
Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery
27.09.08
Dear Ms. Mirja Christine Nolff,
Your submission "Comparison of Computed Tomography and Microradiography for
Graft Evaluation after Reconstruction of Critical Size Bone Defects using ß-
Tricalcium-Phosphate." will be handled by Editor-in-Chief Joerg Wiltfang.
You may check the progress of your paper by logging into the Elsevier Editorial
System as an author at http://ees.elsevier.com/jcms/.
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Elsevier Editorial System
Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery
115
Journal title: Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery
Corresponding author: Ms. Mirja Christine Nolff
Article title: Comparison of Computed Tomography and Microradiography for Graft
Evaluation after Reconstruction of Critical Size Bone Defects using ß-Tricalcium-
Phosphate.
Manuscript number: JCMS-D-08-00172R1
24.03.09
Dear Author,
This is to inform you that your paper was been sent to the language and technical
editor. We will inform you when we have received it.
With kindest regards
Prof.Dr.Dr. Jörg Wiltfang
Editor-in-Chief
116
8.2 Erklärungen über die erbrachten Eigenleistungen gemäß § 8 Promotions
Ordnung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Gemäß § 8 Absatz 3 der Promotionsordnung der Tierärztlichen Hochschule
Hannover hat der Promovent bei einer Dissertation die auf Veröffentlichungen basiert
(kumulative Dissertation) an denen mehrere Autoren beteilgt waren den
selbstständigen Anteil an den vorgelegten Publikationen darzulegen.
Der eigene Anteil an der vorliegenden Arbeit besteht in folgenden Beiträgen:
- prä- und postoperative Betreuung und Beurteilung der Versuchstiere inklusive
Medikation
- Operations Assistenz
- Überwachung der Aufwachphase
- Euthanasie und Präperat-Gewinnung (in Zusammenarbeit mit Dr. Dr.
Kokemüller und S.Spalthoff)
- Fixation, Dehydratation, Einbettung, Schnittherstellung und Färbung der
Präparate
- Auswahl der Histomorphometrischen und radiologischen Auswertungs
Parameter
- Anfertigung der Übersichtsbilder
- Anfertigung der Mikroradiographien
- Beurteilung der qualitativen Histologischen Ergebnisse
- Erfassung und Auswertung der Histomorphometrischen Parameter
- Konvertierung der Mikroradiografischen Einzelbilder in serielle Datensätze
117
- Fusion der Mikroradiographischen und Computertomographischen Datensätze
- Auswertung der fusionierten Datensätze und dreidimensionale
Rekonstruktion der keramischen Residualkörper
- Statistische Bearbeitung der erhobenen Parameter (in Zusammenarbeit mit
Dr. K. Rohn)
- Auswahl der Publikations Themen
- Anfertigung der Publikationen
118
8.3 Tabellarische Darstellung der Originaldaten
8.3.1 Messungen Histomorphometrie
Gruppe Tier Schnitt Zustand A_ROI BA/TA µm BA/TA % FA/TA µm FA/TA % CA/TA µm CA/TA % SA/TA µm SA/TA %
1 1 1 stabil 375,00 46,74 11,20 242,73 58,19 0,000 0,00 16,26 3,90
1 1 2 stabil 375,00 18,10 4,83 244,89 65,31 0,000 0,00 33,64 8,97
1 1 3 stabil 375,00 12,52 3,35 152,90 40,90 0,000 0,00 573,77 15,35
1 1 4 stabil 375,00 32,57 7,59 331,41 77,28 0,000 0,00 19,88 4,64
1 1 5 stabil 375,00 71,78 17,03 207,42 49,22 0,000 0,00 25,88 6,14
1 3 1 stabil 375,00 46,10 12,32 183,65 49,07 3,661 0,98 70,84 18,93
1 3 2 stabil 375,00 9,90 2,65 266,50 71,24 1,460 0,39 73,27 19,59
1 3 3 stabil 375,00 10,00 2,67 231,20 61,82 1,719 0,46 108,90 29,12
1 3 4 stabil 375,00 4,98 2,06 171,06 70,68 0,259 0,11 51,91 21,45
1 3 5 stabil 375,00 23,28 6,26 316,74 85,15 1,064 0,29 11,04 2,97
1 5 1 stabil 375,00 64,37 17,18 250,95 66,99 28,246 7,53 3,68 0,98
1 5 2 stabil 375,00 32,40 8,63 219,13 58,35 15,597 4,16 78,04 20,81
1 5 3 stabil 375,00 29,71 7,92 238,33 63,51 9,417 2,51 70,32 18,75
1 5 4 stabil 375,00 10,45 3,47 197,52 65,67 10,021 2,67 77,83 25,88
1 5 5 stabil 375,00 67,49 18,05 212,44 56,80 14,634 3,90 58,14 15,50
1 4 1 instabil 375,00 49,04 13,11 243,24 65,04 2,699 0,72 50,11 13,40
1 4 2 instabil 375,00 29,26 7,85 237,65 63,76 0,499 0,13 68,83 18,47
1 4 3 instabil 375,00 50,89 13,51 267,07 70,90 5,575 1,49 36,32 9,69
1 4 4 instabil 375,00 40,68 10,84 252,97 67,42 0,330 0,09 57,42 15,30
1 4 5 instabil 375,00 43,59 14,72 213,83 72,20 25,737 6,86 0,00 0,00
1 7 1 instabil 375,00 63,21 16,97 76,53 20,55 15,110 4,06 138,58 36,96
1 7 2 instabil 375,00 41,91 11,18 91,17 24,32 6,403 1,71 156,78 41,81
1 7 3 instabil 375,00 63,99 17,15 52,58 14,09 10,226 2,74 151,63 40,63
1 7 4 instabil 375,00 49,44 13,15 114,37 30,41 12,108 3,22 93,71 24,92
119
1 7 5 instabil 375,00 43,08 11,59 174,19 46,87 4,786 1,29 82,37 22,16
2 2 1 stabil 375,00 55,18 14,75 256,08 68,46 7,498 2,00 8,42 2,25
2 2 2 stabil 375,00 58,64 15,71 219,49 58,82 23,750 6,33 33,69 8,98
2 2 3 stabil 375,00 54,05 14,50 118,15 31,70 31,369 8,36 19,52 5,20
Gruppe Tier Schnitt Zustand A_ROI BA/TA µm BA/TA % FA/TA µm FA/TA % CA/TA µm CA/TA % SA/TA µm SA/TA %
2 2 4 stabil 375,00 79,22 21,19 170,63 45,63 28,101 7,49 2,25 0,60
2 2 5 stabil 375,00 29,08 7,77 221,97 59,28 67,938 18,12 27,54 7,34
2 9 1 stabil 375,00 98,08 26,15 121,20 32,28 19,780 5,27 11,15 2,97
2 9 2 stabil 375,00 111,75 29,80 147,96 39,36 9,761 2,60 7,19 1,92
2 9 3 stabil 375,00 125,93 33,58 116,77 31,18 1,172 0,31 7,73 2,06
2 9 4 stabil 375,00 111,21 29,66 181,92 48,85 6,302 1,69 4,64 1,24
2 9 5 stabil 375,00 129,79 34,61 134,37 36,12 9,485 2,53 5,70 1,52
2 11 1 stabil 375,00 65,10 17,48 104,91 28,17 31,388 8,43 13,10 3,52
2 11 2 stabil 375,00 105,89 28,24 82,77 22,08 14,796 3,95 11,64 3,11
2 11 3 stabil 375,00 135,90 35,88 34,76 9,18 16,652 4,40 11,89 3,14
2 11 4 stabil 375,00 121,04 32,34 85,41 22,82 22,507 6,01 8,81 2,36
2 11 5 stabil 375,00 74,59 19,98 134,84 36,13 33,285 8,92 7,17 1,92
2 6 1 instabil 375,00 96,58 25,78 36,75 9,81 49,479 13,19 37,38 9,97
2 6 2 instabil 375,00 67,29 18,03 192,61 51,60 7,112 1,91 23,77 6,37
2 6 3 instabil 375,00 68,75 18,48 89,56 24,07 8,507 2,29 20,24 5,40
2 6 4 instabil 375,00 74,74 20,02 208,85 55,95 58,939 1,58 50,81 13,61
2 6 5 instabil 375,00 57,34 15,46 135,90 36,64 4,952 1,34 23,28 6,21
2 12 1 instabil 375,00 56,87 15,17 183,54 48,97 32,932 8,79 4,74 1,26
2 12 2 instabil 375,00 45,00 12,07 212,75 57,06 21,312 5,72 5,03 1,35
2 12 3 instabil 375,00 15,17 4,04 179,80 47,87 396,852 10,57 27,84 7,42
2 12 4 instabil 375,00 49,99 13,35 182,52 48,76 19,228 5,14 0,00 0,00
2 12 5 instabil 375,00 45,54 12,16 221,97 59,26 16,420 4,38 0,00 0,00
120
8.3.2. Messungen CT und µ-Radiographie
Tier Gruppe Messung A_cm²_CT A_cm² µrad HU1_Chronos HU2_Chronos HU1_Knochen HU2_Knochen Chronos ml Chronos Original ml Degradation_%
3 solide 1 1,28 1,5 981 1075 1148 666
3 solide 2 1,29 1,56 880 1242 552 626
3 solide 3 1,49 1,83 988 1028 847 901
3 solide 4 1,46 1,91 1148 1041 962 814
3 solide 5 1,54 1,9 961 927 927 552
3 solide 6 1,74 1,9 988 927 880 1088
3 solide 7 1,68 2,15 860 914 1014 1048
3 solide 8 1,32 2,2 1336 1128 814 867
3 solide 9 1,35 2,04 967 1188 1269 914
3 solide 10 1,32 2,15 934 1048 1101 1021 1,63 3,848451001 57,64529678
4 solide 1 1,11 1,85 814 1153 660 921
4 solide 2 1,48 1,91 800 1168 894 914
4 solide 3 1,6 1,88 1034 184 1028 814
4 solide 4 1,32 1,65 941 807 666 961
4 solide 5 1,51 1,49 867 1008 947 1262
4 solide 6 1,5 1,37 1075 994 880 713
4 solide 7 1,61 1,51 994 1041 921 981
4 solide 8 1,03 1,54 727 1014 713 780
4 solide 9 0,51 1,31 914 840 740 807
4 solide 10 0,31 0,89 666 740 1075 660 1,35 3,848451001 64,92095132
5 solide 1 1,48 2,05 880 941 954 465
5 solide 2 1,58 2,14 1148 907 573 894
5 solide 3 1,55 2,21 974 967 894 706
5 solide 4 1,58 2,2 1063 1075 967 1061
121
5 solide 5 1,65 2,2 854 1229 847 780
5 solide 6 1,95 2,25 974 961 874 1001
5 solide 7 1,65 2,27 981 867 740 847
5 solide 8 1,48 2,01 1075 901 840 901
Tier Gruppe Messung A_cm²_CT A_cm² µrad HU1_Chronos HU2_Chronos HU1_Knochen HU2_Knochen Chronos ml Chronos Original ml Degradation_%
5 solide 9 1,48 1,89 894 924 807 941
5 solide 10 1,55 1,96 1168 753 1001 1108 1,8 3,848451001 53,2279351
7 solide 1 2,44 2,95 840 706 680 927
7 solide 2 2,66 2,94 720 258 678 1095
7 solide 3 2,56 2,65 860 606 800 1061
7 solide 4 2,36 2,32 941 700 532 566
7 solide 5 2,54 2,4 827 666 465 465
7 solide 6 2,61 2,58 586 734 439 941
7 solide 7 2,2 2,23 653 706 436 967
7 solide 8 1,94 1,91 840 680 479 593
7 solide 9 2,15 1,69 573 834 606 613
7 solide 10 1,8 1,86 927 412 907 800 2,37 3,848451001 38,41678121
8 Infiziert 1 713 445 793 747
8 Infiziert 2 539 840 1021 639
8 Infiziert 3 653 880 1008 660
8 Infiziert 4 472 907 807 773
8 Infiziert 5 593 921 867 713
8 Infiziert 6 492 1001 767 807
8 Infiziert 7 646 914 599 867
8 Infiziert 8 639 907 807 854
8 Infiziert 9 773 1142 860 740
8 Infiziert 10 1055 814 934 680 1,72 55,30669354
9 hohl 1 0,2 0,18 921 961 773 630
9 hohl 2 0,16 0,29 633 920 954 780
122
9 hohl 3 0,08 0,1 526 707 1061 1356
9 hohl 4 0 0,24 519 412 559 1095
9 hohl 5 0 0,15 834 967 988 914
9 hohl 6 0 0,28 613 324 1080 1308
9 hohl 7 0,38 0,25 566 653 518 168
9 hohl 8 0,1 0,14 626 824 753 613
9 hohl 9 0 0 532 524 840 934
Tier Gruppe Messung A_cm²_CT A_cm² µrad HU1_Chronos HU2_Chronos HU1_Knochen HU2_Knochen Chronos ml Chronos Original ml Degradation_%
9 hohl 10 0 0 358 365 678 867 0,15 2,88633825 94,8031039
10 Infiziert 1 573 673 867 760
10 Infiziert 2 673 512 840 1021
10 Infiziert 3 559 713 693 1001
10 Infiziert 4 653 713 753 1028
10 Infiziert 5 599 760 666 941
10 Infiziert 6 680 706 1048 740
10 Infiziert 7 720 619 1068 1061
10 Infiziert 8 593 727 1075 947
10 Infiziert 9 800 740 1108 1008
10 Infiziert 10 747 767 686 1081 1,86 2,88633825 35,55848834
11 hohl 1 0,26 0,2 465 345 1135 425
11 hohl 2 0,27 0,35 586 633 653 1182
11 hohl 3 0,19 0,39 512 305 258 954
11 hohl 4 0,17 0,02 472 506 720 606
11 hohl 5 0,06 0,24 231 439 713 291
11 hohl 6 0 0,17 981 613 586 713
11 hohl 7 0,27 0,19 n.e. n.e. 1045 506
11 hohl 8 0,57 0,36 720 635 1235 660
11 hohl 9 0,26 0,32 773 459 1081 680
11 hohl 10 0,11 0,25 666 740 994 613 0,19 2,88633825 93,41726494
12 hohl 1 0,07 0,13 740 405 506 700
123
12 hohl 2 0 0,03 566 780 639 773
12 hohl 3 0 0 0 0 954 1055
12 hohl 4 0 0 0 0 760 820
12 hohl 5 0,03 0 0 0 539 720
12 hohl 6 0 0,1 432 593 780 599
12 hohl 7 0 0,21 546 459 499 499
12 hohl 8 0 0,05 452 429 626 800
12 hohl 9 0 0 0 0 673 646
12 hohl 10 0 0 0 0 727 981 0,05 2,88633825 98,2677013
6 hohl 1 0,86 0,8 506 559 954 706
Tier Gruppe Messung A_cm²_CT A_cm² µrad HU1_Chronos HU2_Chronos HU1_Knochen HU2_Knochen Chronos ml Chronos Original ml Degradation_%
6 hohl 2 0,59 0,46 552 700 988 720
6 hohl 3 0,62 0,3 626 593 990 914
6 hohl 4 0,59 0,46 706 633 747 874
6 hohl 5 0,8 0,25 579 419 747 914
6 hohl 6 n.e. 0,16 392 398 573 787
6 hohl 7 n.e. 0,23 432 465 827 1048
6 hohl 8 0,35 0,22 345 425 579 860
6 hohl 9 0,23 0,2 579 733 880 887
6 hohl 10 n.e. 0,08 626 352 660 733 0,28 2,88633825 90,29912728
124
9 Danksagung
Herrn Professor Dr. med. vet. Michael Fehr danke ich für die Übernahme der Arbeit
und die freundliche und konstruktive Unterstützung bei der Anfertigung.
Herrn Professor Dr. med. Dr. med. dent. Nils-Claudius Gellrich gilt mein Dank für die
Überlassung des interessanten Themas und das Vertrauen dass er in mich gesetzt
hat als er mir diese Arbeit anvertraut hat. Außerdem möchte ich mich herzlich für die
Möglichkeit bedanken, die Ergebnisse der Arbeit publizieren zu dürfen, durch die ein
erscheinen dieser Dissertation in der vorliegenden Form erst möglich gemacht
wurde.
Herrn Dr. med Dr. med. dent. Horst Kokemüller möchte ich für die Durchführung der
Operationen und seine Hilfe in Publikationsfragen danken.
Außerdem bedanke ich mich bei Herrn Dr. med Dr. med. dent. Kai-Hendrik Bormann
für die Finanzierung des Projektes und bei Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Martin
Rücker für die konstruktive Kritik während der Durchführung der Arbeit.
Ganz besonders möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Zentralen Tierlabors der
Medizinischen Hochschule Hannover für die fabelhafte Betreuung meiner Schafe, die
stetige Unterstützung und die wertvollen Hilfestellungen während der Operations-
und Genesungsphase bedanken. Neben vielen anderen sind an dieser Stelle vor
allem Herr Prof. Dr. med. vet. Klaus Otto, Herr Karl-Heinz Napierski, Herr Paul Zerbe
sowie Frau Katharina Miehl zu nennen.
Für die Betreuung im Labor und die Ratschläge zu allen Themenbereichen der
Herstellung Histologischer Präparate sowie die freundschaftliche Betreuung möchte
ich mich besonders bei Frau Marie-Louise Jenzer und Herrn Andreas Kampmann
bedanken.
125
Herrn Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte möchte ich für die vielen wertvollen Ratschläge
und ebenso wie Frau Prof. med. vet. Andrea Meyer-Lindenberg für die Bereitstellung
der benötigten Soft- und Hardware für die Herstellung der Histologischen
Übersichtsbilder bedanken.
Des weiteren gilt mein Dank der Firma Synthes, die die benötigten Materialien für
diese Arbeit zur Verfügung gestellt hat sowie der Firma IVS Solutions, insbesondere
Herrn Albrecht Schnappauf, für die Bereitstellung einer modifizierten Version von
Voxim®Osteo und die freundliche Hilfestellung bei der Umsetzung meiner Ideen.
Mein ganz besonderer Dank jedoch gilt meiner Familie - insbesondere meinen
Eltern- dafür dass Sie immer an mich geglaubt haben und mich stets moralisch und
finanziell unterstützten, und dafür das sie mir immer das Gefühl gegeben haben, das
alles zu schaffen ist. Meinem Bruder, Magnus Ryner, möchte ich für seine
aufmunternden Worte während der schwereren Phasen dieser Arbeit danken- du
weißt es vielleicht nicht, aber du hast mir sehr damit geholfen.
Schlussendlich möchte ich mich von ganzem Herzen bei Dr. med. vet. Gregor
Hauschild bedanken, der diese Arbeit vom Beginn bis zum letzten Wort begleitet hat.
Ich danke dir für deinen Rat, deine Aufmunterung und dafür, dass du die ganze Zeit
in allen Höhen und Tiefen dieser Arbeit für mich da warst um mir zu helfen und den
Dingen die richtige Perspektive zu geben.