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Extraccin acuosa de corteza de Galipea longifora y su actividadleishmanicida

Aqueousextraction from bark of Galipea longiforaand theirleishmanicidal activity

Fabiola Llanos Medina1, Boris Espinoza Cruz1, Efran Salamanca Capusiri1, Rogelio Chuqui2, Ninoska FloresQuisbert 1, Alberto Gimnez Turba1

1Unidad de Productos Naturales, Instituto de Investigaciones Frmaco-Bioqumicas, Facultad de CienciasFarmacuticas y Bioqumicas, Universidad Mayor de San Andrs. La Paz, Bolivia.

2Comunidad Tacana de Santa Rosa de Maravilla, Prov. Abel Iturralde. La Paz, Bolivia.

Direccin para correspondencia: Alberto Gimnez Turba Ph.D. Instituto de Investigaciones Frmaco Bioqumicas,

Facultad de Ciencias Farmacuticas y Bioqumicas, Universidad Mayor de San Andrs. Av. Saavedra # 2224, 2 Piso,Miraores. La Paz, Bolivia.Telf. : 2229021E mail: agimenez@megalink.com

Recibido para publicacin en 31/07/09Aceptado en 15/12/09

RESUMEN

En el presente trabajo describimos los primeros estudiossobre el extracto acuoso obtenido a partir de la corteza de Evanta (Galipea longiora), cuya decoccin es utilizadatradicionalmente en el tratamiento de diarreas con sangrey leishmaniasis. Los extractos acuosos de Evanta, fueron

preparados por: Coccin en un sistema cerrado (1); Reujo

(2) y Coccin en un sistema abierto (3). Los clculos delrendimiento de cada extracto se han determinado medianteliolizacin (L). La cuanticacin de los principios activos

(CAT), se ha determinado mediante una extraccin directadel extracto acuoso (D) y una extraccin ajustando a pH 3(P), utilizando CH2Cl2como solvente. De esta manera seobtuvieron nueve extractos: L1-L3, D1-D3 y P1-P3. Todoslos extractos fueron evaluados por su actividad leishmanicidafrente a promastigotes deL.amazonensis yL. braziliensis.

El mayor porcentaje de rendimiento se obtuvo con L2(37,2%) y el mayor rendimiento de los alcaloides totales

(CAT) se obtuvo con los extractos P1 (0,38%) y D1

(0,36%). Los niveles de actividad leishmanicida de todos

los extractos derivados de D y P fueron evaluados frentea L. amazonensis y L. braziliensis. La mejor actividadse encontr en el extracto D1 para L. amazonensis[CI50=47,710,7] y D2 paraL. braziliensis[CI50=29,56,5].Las actividades que se reportan tienen valores muy

parecidos entre s, sin embargo estos estn ligeramente pordebajo a los valores obtenidos con nuestro patrn CAT(extrado con CH2Cl2) [CI50=30,50,4 yCI50=24,72g/ml

respectivamente] Mientras que extractos liolizados L1-

L3, no presentaron actividad (CI50>100g/ml), indicandoclaramente que durante la concentracin por liolizacin se

perdieron los principios activos dada su naturaleza voltil.Palabras claves: Extracto acuoso, Evanta, Galipealongiora, actividad leishmanicida, liolizacin,

Leishmania amazonensis y L. braziliensis.

ABSTRACT

The present work describes the rst studies on the aqueous

extract obtained from Evantas bark (Galipea longiora),which is a decoction traditionally used for the treatmentof diarrhoea with blood and leishmaniasis. The aqueousextracts were obtained by: decoction in a closed system(1), reux (2) and decoction in an open system (3). The

yield of the extraction was calculated by freeze drying

(L). The quantication of the active principles (QAP) wasdetermined by direct extraction of the aqueous extract (D),and by previous adjustment to pH 3 (P), using CHCH

2Cl

2

as the organic solvent. Nine extracts were obtained: L1-L3, D1-D3 and P1-P3. All extracts were evaluated forAll extracts were evaluated forleishmanicidal activity against promastigote forms of

Leishmaniaamazonensis andL. braziliensis.The highestchemical yield was obtained with L2 (37.2%) and theL2 (37.2%) and the

highest yield for QAP was obtained with extracts P1(0. 38%) and D1 (0.36%). The leishmanicidal activity

of all the D and P extracts against L. amazonensis [D1IC

50=47.710.7; D2 IC

50=53.212.1; P1 IC

50=48.57.5;

P2 IC50

=50.38.62 y P3 IC50

=56.717.7g/ml] and L.braziliensis [D1 IC50=31.36.15; D2 IC50=29.56.5; P1.IC

50=29.63.3; P2 IC

50=34.20.6 y P3 IC

50=36.32.4g/

ml], were very similar but somewhat lower than the valuesobtained for a reference QAP sample [IC

50=30.50.4 and

IC50=24.72g/ml, respectively]. The freeze dry extractsL1-L3, did not show biological activity (IC

50>100g/

ml), showing that during the freeze drying process, theactive principles are lost due to their volatile nature.Key words: Aqueous extract, Evanta, GGalipealongiora, leishmanicidal activity, freeze drying,

Leishmania amazonensis and L. braziliensis

INTRODUCCIN

Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades parasitariasde distribucin mundial transmitidas al ser humano por

la picadura de alrededor de 30 especies de ebtomosinfectados por protozoos del genero Leishmania. Estaenfermedad, es manifestada por sus formas: cutnea,mucocutnea, y visceral, siendo adems resultado dela compleja interaccin entre la especie del parsitoinvolucrado y la respuesta inmunolgica del paciente 1.Segn la Organizacin Mundial de la Salud se estimaque se presentan cada ao 2 millones de casos nuevos entodo el mundo, de los cuales 1,5 millones correspondena leishmaniasis cutnea. Se estima que el nmero de

personas infectadas sobrepasa los 12 millones. Sinembargo, los datos ociales subestiman la realidad de la

afeccin humana por estos protozoarios debido a que granparte de los datos ociales se obtienen exclusivamente

a partir de la deteccin pasiva, numerosos casos no sondiagnosticados, y existen un gran nmero de casosasintomticos. Por otra parte las polticas gubernamentales

para los casos de leishmaniasis son declaracin obligatoriaen solo 32 pases de los 88 clasicados como endmicos1.La leishmaniasis en Bolivia se encuentra geogrcamente

distribuida en el rea rural de las zonas tropicales ysubtropicales de los departamentos de La Paz, Beni,Pando, Santa Cruz, Cochabamba, Tarija y Chuquisaca.En el ao 2006 en Bolivia se ha noticado en el

departamento de La Paz 1.502 casos (48%), en el Beni

con 889 casos (28%) y en Pando 416 casos (13%)2.La especie medicinal Galipea longiora K. (sinnimo

Angostura longiora (Krause) Kallunki) tiene diversosnombres comunes, pero es conocida ampliamente porel nombre vernacular de Evanta. Pertenece a la familiaRutaceae, es un rbol que crece hasta 12 metros de altura,

presenta hojas trifoliadas alternas o superpuestas sobre lamisma rama con un pecolo frecuentemente alado y sus ores

aparecen en forma de racimos. En Bolivia se la encuentraen los bosques tropicales de los ltimos contrafuertesandinos en los departamentos de Beni y La Paz3.Esta especie se encuentra registrada en farmacopeas

tradicionales, como planta medicinal en la culepra blanca, como tambin se conoce a la lei

o problemas digestivos. Esta sintomatologser interpretada por la medicina occidentaantiparasitaria (leishmanicida). Esta planta es manera tradicional por las etnias Tacana, MoTsimane. El uso tradicional ms frecuente sTacanas es en forma de coccin para el trade diarreas causadas por parsitos intestinalesforticante para nios y adultos; para el tratamie

leishmaniasis, la corteza fresca o seca es molida ydirectamente en forma de cataplasma sobre las lcveces al da hasta que sane, adems de beber la deEntre los aos 1985-1991, en el Instituto BoliBiologa de la Altura (IBBA) dependiente de la FaMedicina de la Universidad Mayor de San Andrs un grupo de investigadores Franco-Boliviano e

la actividad antiparasitaria de los extractos de lalongiora (Evanta), hojas, races y corteza, aislidenticando 15 alcaloides quinolicos5,6,7. Alestos alcaloides presentes en hojas resultaron e

con baja toxicidad in vivo, por lo que fueron pa(Chimaninas A, B, C y D US4209519/15/04En la actualidad el Instituto de InvestiFrmaco-Bioqumicas (IIFB), de la FacuCiencias Farmacuticas y Bioqumicas de laforma parte de un equipo multidisciplinario llevando adelante estudios clnicos sobre la e

formulaciones farmacuticas, a base de los pactivos de Evanta, frente a la leishmaniasis ccontinua en sus trabajos de investigacin sobralternativas para el tratamiento de la leishmaniasde extractos vegetales. El objetivo del presentsobre Galipea longiora, se enfoca en la estandde nuevos mtodos de extraccin y el anliscinco alcaloides quinolicos principales aisladcorteza Galipea longiora: 2-fenilquinolina; quinolina; 4metoxi-2-fenil-quinolina; 2-propil-y 2-(3,4-metilendioxifeniletil)-quinolina. Estas mrepresentan cerca del 90% del total de los al

las estructuras de los mismos han sido detepor tcnicas espectroscpicas de RNM de 1H y2D) y espectrofotometra de masas de alta resEn esta investigacin, presentamos los resullos estudios realizados del extracto acuoso de lde Galipea longiora, colectada en la comuVencedores Provincia Sud Yungas del Depade La Paz. Los extractos acuosos de corteza delongiora fueron obtenidospor tres mtodos dLos extractos obtenidos fueron evaluados actividad leishmanicida sobre formas promutilizando el mtodo colorimtrico (XTT) frentede Leishmania amazonensis y Leishmania. bra

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MATERIAL Y MTODOS

Los equipos utilizados para las diferentes extraccionesfueron; liolizador (FINN AQUA mod. LYOVAC GT2), rotaevaporador (Heidolph Laborota-400) con bombaal vaco (Diaphragm Vacuum Puma DC-4). Para lacomparacin se utiliz placas cromatogrcas slice

gel con uorescencia UV 254nm (MachereyNagel)

de 25m de espesor con base de aluminio y reveladascon una cmara uorescente de 254nm y 356nm

(Spectroline Mod; CM-10). Los solventes utilizados en losprocesos de extraccin y anlisis fueron: agua destilada,diclorometano p.a., metanol p.a. Merck y HCL 1N.El anlisis de datos y obtencin de los CI

50de los extractos

acuosos frentes a las dos cepas de Leishmania fuerealizado en programa Excel 2000, previamente descrito

por Cornelly et.al.12Las placas fueron ledas en un lectorELISA (Modelo 2100 series-Plate Reader) a 450nm 13,14.Coleccin del material vegetal. La corteza de Galipealongiora fue colectada por el Dr. Alberto Gimenez y elequipo del Instituto de Investigaciones Farmaco Boquimicas(IIFB), en la comunidad de Vencedores (HernndezS1521110 y W 8720342) a una altura de 469 m.s.n.m,en la provincia Sud Yungas de Departamento de La Paz,Bolivia. Su identicacin taxonmica se realiz mediante

comparacin, con muestras Vaucher (AS49 mayo de 1996y SD17 septiembre de 1994) depositadas en el Herbario

Nacional de Bolivia. Fue secado a temperatura ambientefuera del alcance de los rayos del sol y de la humedad.Mtodos de extraccin. La corteza de Galipealongiora secada y molida, fue extrada por tres tiposde cocciones acuosas: (1) Coccin en sistema cerrado,corteza (100gr) en agua (2L) durante1h; (2) a reujo,

corteza (100gr) en agua (1L) durante1h; (3) coccinen un sistema abierto corteza (100gr) en agua (2L)durante1h. Posteriormente cada una de las muestras fueltrada en caliente y se tom una alcuota de 100 ml para

extraccin directa con diclorometano (D); extraccin a pH3 (P) y liolizado (L), como se describe a continuacin.

El extracto acuso D fue extrado directamente con

CH2CL2 (ext. liq.-liq.), la fase orgnica de la acuosa,la cual fue deshidratada con sulfato de sodio anhidro,ltrada y nalmente concentrada al vaco hasta peso

constante, obtenindose: D1, D2 y D3de la fase orgnica.(lq-lq) El extracto acuoso P fue acidicado

con HCl 1N hasta pH3, y extrado con CH2Cl

2,

posteriormente la fase orgnica fue deshidratada consulfato de sodio anhidro, ltrada, y se secada al vaco

hasta peso constante, obtenindose: P1, P2 y P3.El extracto acuoso L fue congelado a 80C y

posteriormente liolizado obtenindose: L1, L2 y L3.

Estudios cromatogrcos. Las diferentes muestrasobtenidas P1-P3, D1-D3 y L1-L3 fueron analizadas porcromatografa en capa na (CCF), utilizando placas

cromatogrcas de gel de slice con uorescencia UV

254nm de 25m de espesor con base de aluminio;utilizando como sistema de elusin CH

2

CL2

: MeOH al0.1%. Los productos puros fueron obtenidos del extracto

de diclorometano del G. longioradespus de sucesivascromatografas e identicadas por RMN y EM, por el

Dr.Alberto Gimenez en la Universidad de Lund, Suecia3.Evaluacin antiparasitaria in vitro por el mtodocolorimtrico (XTT) sobre promastigotes deLeishmania. Se realiz la evaluacin antiparasitaria detodos los extractos obtenidos por mtodo colorimtrico(XTT)15sobre promastigotes dedos especies deleishmania(L. braziliensis M2903 MHOM/BR/75/M2903) y L.

amazonensis (MHOM/BR/76/LTB-012), utilizando comoblancos para cada concentracin de los extractos acuosos,un control de parsitos y DMSO al 1%, un control de

parsitos con Anfotericina B y otro con una muestra patrnde alcaloides totales de corteza de Evanta (CAT). Las placasse incubaron durante 72hrs. Para determinar la CI

50se utiliz

una solucin de XTT con Fenasin metosulfato (PMS)13.

RESULTADOS

Los porcentajes de rendimiento obtenidos despusde las extracciones por los distintos mtodos,son los que se muestran en las Figuras 1 y 2

Figura 1. Porcentaje en gramos de CAT por extraccin directa con CH2 Cl2 (D1-D3) yextraccin a pH cido (P1-P3) de los extractos acuosos.

Figura 2. Porcentaje en gramos de rendimiento qumico delos extractos acuosos liolizado

De los tres mtodos de extraccin se pudo observarclaramente que el mayor rendimiento se obtuvo con L2(37.2%). Por otra parte, las extracciones de CAT con

CH2Cl

2presentaron los mayores porcentajes de rendimiento

para D1 (0.35%), y P1 (0.38%), indicando que no hay una

variacin signicativa al ajustar el pH del extracto antes de

la extraccin con el solvente orgnico.Los nueve extractos obtenidos fueron analizados mediante

cromatografa en capa na (CCF) para denir locromatogrcos de cada muestra y se com

dichos perles con los de las sustancias puras ai

alcaloides totales de corteza de Galipea longio2-fenil-quinolina (Rf =0.61), 2-fenil-4-metoxi-(Rf=0.24), 2-n-pentilquinolina (Rf=0.28), metilendioxifeniletil)-quinolina (Rf=0.20), e(Rf=0.17) y Skimanina (Rf=0.12).

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N

N CH3 2-fenil-quinolina 2-n-pentilquinolina

ICIC90

= 100g/mL (a,b) IC90

= 100g/mL (a,b)

N CH3

N

O CH3

2-n-propilquinoleina 2-fenil-4-mrtoxi-quinolina IC90= 50g/mL (a,b) IC90= 50g/mL (a,b)

N

O

O N

O CH3

CH3

2-(3,4-metilendioxifeniletil)quinolina 4-metoxi-2-n-pentilquinolina IC

90= 100g/mL (a,b) IC

90= 100g/mL (a,b)

Figura 3. Estructuras qumicas de 6 alcaloides quinolnicos aislados de Galipea longiforay su actividad leishmanicida in vitro

frente: a)L. braziliensis(2903), b) L. amazonensis(PH8) (Fournet,1994) 16

Los cromatogramas obtenidos permitieron determinar queen todos los extractos de D1-D3 y de P1-P3 se encontraba

presente la 2-fenilquinolina como alcaloide mayoritario,acompaada de los otros 4 alcaloides. En los extractosde L1-L3 se observ la presencia de pequeas cantidadesde 2-fenilquinolina y algo de evolitrina, conrmndose

la prdida de las sustancias activas durante el proceso deliolizacin al vaco.

Todos los extractos D, P y L fueron evaluados pos suactividad leishmanicida in vitro, sobre formas promastigotesdeL. amazonensisy L. braziliensis, mediante el mtodocolorimtrico con XTT.

Los resultados obtenidos de la actividad biolgica delos extractos liolizados L1, L2 y L3 mostraron una

CI50>100g/ml, indicando que stos no presentaronactividad leishmanicida. Los extractos D1-D2,

y P1-P3

presentaron actividades con valores de CI50 semejantes,frente a cada una de las cepas de leishmania evaluadas,

pero estos valores fueron algo menores que los obtenidoscon muestras patrn de CAT que se manejan en el IIFB(Tabla 1).

Tabla 1. Evaluacin de la actividad leishmanicida in vitro de losextractos acuosos de Galipea longiforafrente a dos cepas de Leishmania

CdigoIC50 g/ml

L. braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)

IC50 g/mlL. amazonensis(MHOM/BR/76/LTB-

012)L1 >100 >100L2 >100 >100L3 >100 >100D1 31,36,15 47,710,7D2 29,56,5 53,212,1D3 NE NEP1 29,63,3 48,57,5P2 34,20,6 50,38,62P3 36,32,4 56,717,7

CAT 24,72 30,50,4AFO-B 0,2 1,1

NE: No Evaluados

DISCUSIN

De acuerdo a los extractos obtenidos, se observa un mayorrendimiento en el extracto liolizado L2, con un 37.2%

debido a que ste contiene diferentes compuestos polarespresentes en el extracto al igual que todos los liolizados

y L2 en especial por provenir de una decoccin al reujo

con relacin al peso seco de corteza y con un valorsignicativamente mayor al obtenido por extraccin con

solventes orgnicos que est en el orden del 4%. E n cuanto

al rendimiento de la extraccin de los principios activos losextractos D1 y P1, ellos proporcionaron rendimientos del0,36 y 0,38% respectivamente, que es considerablemente

ms bajo que el 2% de CAT que se obtiene de un extracto

orgnico3, 11. Estos resultados sugieren la importanciade realizar estudios ms profundos sobre los niveles deecacia de los extractos acuosos que son los utilizados por

la medicina tradicional.En el anlisis del perl cromatogrco en placa na de

los nueve extractos frente a patrones de referencia, seobserva que todos los extractos acuosos tienen alcaloidesquinolicos en proporciones semejantes. Entre D1-D3y P1-P3 se puede apreciar sustancias con Rf idnticosmuestras patrn de 2-fenil-quinolina, 2-fenil-4-metoxi-quinolina, 2-(3,4-metilen-dioxi-fenil-etil)-quinolina,2n-pentil-quinolina y evolitrina16, pero sin embargo enlos extractos L1-L3 slo se observa la presencia de la 2-n-fenilquinolina y evolitrina en mucho menor proporcinque los observados para los extractos D y P. Esto se debefundamentalmente al bajo contenido de alcaloides en losextractos acuosos o a su naturaleza voltil, es decir quelos alcaloides se pierden al ser sometidos a alto vacio porvarios das mientras se logra la liolizacin completa.

En cuanto a la actividad leishmanicida podemos concluirque no existen diferencias signicativas entre los valores de

CI50

entre los extractos D y P frente a L.amazonCI50=47,710,7 y P1 CI50=48,57,5; D2 CI50=5y P2 CI

50=50,38,62] y frente a L. brazilie

CI50=31,36,15; P1CI50=29,63,3 y D2 CI50=29,CI

50=34,20,6] por lo que no existe diferencia sig

al ajustar el pH antes de extraer el extractoPodemos indicar que los valores de actividad de los CAT obtenidos de los extractos acuosos ms bajos que los valores de los obtenidos para C24,72 y 30,50,4 g/ml, respectivamente) de orgnicos. Estos resultados sugieren que se debe reestudio ms detallado y cuantitativo sobre la comy porcentajes relativos de las molculas que confCAT en extractos acuosos. (Tabla 1).

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido nanciado parcialmente por el

Evanta UMSA-IDH-2007, el proyecto EnferInfecciosas ASDI/SAREC. A la fundacin AlexaHumboldt Stiftung y la OEA por la donacin deAl proyecto y campamento OSCAR por la infraeslas comunidades de Vencedores-Hernndez de la Sud Yungas del Departamento de La Paz.

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