troubleshooting in der hplc - agilent · 3 february 10, 2012 hplc probleme lc gc leserumfrage...
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February 10, 2012 1
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Troubleshooting
in der HPLC
Fehler vermeiden
Fehler erkennen
Friedbert Ruppel
Agilent Technologies
February 10, 2012 2
Welche HPLC Probleme haben Sie ?
February 10, 2012 3
HPLC Probleme LC GC Leserumfrage
Column Problem
Percentage of Respondents
Back Pressure, Plugged Frits 24%
Poor Reproducibility 16%
Sample Recovery 14%
Loss of Resolution 13%
Instability 11%
Voids 8.1%
Leaks, Fittings 4.8%
pH Range 2.0%
Low Plate Count 2.0%
Column Overload 2.0%
Cost 1.7%
Miscellaneous 15%
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Vermeidung von Fehlern
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Vermeidung von Fehlern
Lösungsmittel für die RP -Chromatographie
1. Wasser
• hohe Reinheit notwendig (wichtiger als die Reinheit des organischen LM)
• HPLC-reines Wasser oder Reinigung über eine RP-Phase
• Reinheitstest: Anreicherung des Wasser auf RP-18-Saule und linearer Gradient
• Test des Wassers in einem dunklen Raum mit einem Laserpointer
2. Acetonitril
• geringe Viskosität
gute Diffusion (hohe Bodenzahl), geringer Druckabfall (hoher Fluß kleine Partikel möglich)
• sehr gute UV-Durchlässigkeit
Gradienten möglich, sehr niedrige Nachweisgrenzen für Analyten erreichbar
• teuer und toxisch
1.Wahl für die Methodenentwicklung und für schwierige Trennungen
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3. Methanol
• hohe Viskosität, (Viskositätsmaximum !)
• preiswert
• MeOH -Wasser -Mischungen lösen oft Salze besser als Mischungen mit Acetonitril
für einfacheTrennungen, hohe Salzkonzentrationen, Erreichen bestimmter Selektivitäten
4. Tetrahydrofuran
• hohe Viskosität, (Viskositätsmaximum !)
• Peroxidbildner
• sehr gutes Löseverhalten (z.B. Polymere)
• mischt sich mit jedem anderen Lösungsmittel
für schwerlösliche Proben und zum Umspülen der Anlage von Alkanen/Chloroform ect. auf wässrige Lösungsmittel und umgekehrt, für das Erreichen bestimmter Selektivitäten
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Viskosität unterschiedlicher LM
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Vermeidung von Fehlern - LM
• HPLC-reine LM verwenden → Test über Leergradient - Wasser !!!
• LM über Fritten ansaugen
• Fritten regelmäßig reinigen
• Entgasen (bes. bei Gradienten)
• 1<pH<8 bei Säulen auf Kieselgelbasis
• Mischbarkeit der LM beachten
• Haltbarkeit der LM beachten
• LM unter Helium stehen lassen (THF,Dioxan)
• Probe im Eluenten lösen (besser in einem schwächeren LM)
• bei isokratischen Versuchen LM im Kreislauf fahren
• besonders empfohlen: bei NP-Trennung auf Kieselgel (konstanter Wassergehalt)
• bei der Mischung Volumenkontraktion beachten (MeOH / Wasser) 500ml Wasser mit 500 ml
• MeOH mischen und nicht ein LM vorlegen und auf 1 l auffüllen
• Verhindern von Algenwachstum in Pufferlösungen
a) Natriumazid dem Puffer zufügen (0.005 %)
b) 2..5% Acetonitril dem Puffer zufügen
c) Umspülen der Anlage, wenn sie längere Zeit steht
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Gradient zum Wassertest
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Geister-Peaks
20% - 100%
MeOH Gradient
No Sample Injected
Geisterpeaks = Peaks die erscheinen, wenn keine Probe
injiziert wurde
Problem – Verunreinigungen der mobilen Phase
60
15
30
15
0 3 7 15 17
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Ursache
n Absorbtion der Probe ist geringer als das LM
n Brechungindexunterschiede LM-Probe im RI Detektor
Normal Negativ
Negative Peaks
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Gradientenelution
Mobile Phase ist nicht im Gleichgewicht
Driftende Baselinie
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Probe filtern
• Probe filtern
• mobile Phase filtern
• In-line filter verwenden
• Vorsäulen verwenden
• Sample clean-up (i.e. SPE)
• Regelmäßiges Spülen der Säule
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Lösungsmittel Elutionsmittel
Lösungsmittel Elution Bodenzahl
Phenol Diphenyl
100% THF 60% THF 5167 8012
80% THF 60% THF 6912 12551
60% THF 60% THF 8982 15463
40% THF 60% THF 9970 16528
70 % ACN 70% ACN 12616 20796
Probe in möglichst schwachem Lösungsmittel injizieren (Löslichkeit ?)
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Probe filtern
Regenerierte Zellulose (RC) Empfohlen
• Universielle hydrophile Membran,
• Kompatibel mit den meisten LM
• hochrein (wenig extrahierbare Bestandteile)
• Hohe Wiederfindungsrate
• Einheitliche Oberfläche
In-line Filters
Fritten mit 0.2,0.5 und 2.0µ Porosität
Mini-UniPrep Vials
UniPrep vials mit integrierten Filter
(PTFE, PP, RC, Nylon - 0.2 or 0.45µm
Porosität)
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Säulenpackung
Partikelgröße
Fläche
(µm2)
Durchmesser
(µm)
Porosität der
Fritte (µm)
5.0 2.7 0.9 2.0
3.5 1.3 0.6 2.0
3.0 1.0 0.6 0.5
2.5 0.7 0.5
1.8 0.4 0.4 0.2
1.7 0.3 0.3
Puffersalze enthalten unlösliche Bestandteile– Filtern
Löslichkeit der Puffer nimmt mit steigenden % organic*
ab – vermeiden von 100%B mit Puffern
*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)
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Degasser • Ansaugfritten regelmäßig reinigen
Schwankende Retentionszeiten bei partiell blockierten Ansaugfritten / Degasserkanal
Falsche Zusammensetzung des Eluenten beim Niederdruckgradienten
Pumpe • Raum hinter den Kolbendichtringen regelmäßig spülen
• Fritten im Purgeventil regelmäßig tauschen
Injektionsventil / Autosampler • nur HPLC-Spritzen verwenden
• Richtigen“ Gradienten für den ALS fahren
• Jeden Gradienten mit der Ausgangsmischung der nächsten Analyse beenden
• nach Ende der Arbeiten mit Puffern reines Wasser/ACN injizieren
Detektor • Restriktor am Detektorausgang (leichtflüchtige Verbindungen)
• Referenz spülen (RI), Temperaturkonstanz (RI,ECD,Leitfähigkeit)
• Richtige Datenrate
Kapillaren und Fittings • Kapillaren gerade schneiden und entgraten
• passende Schneidringe verwenden (Valco, Rheodyne)
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Quaternäre Pump
Vacuum chamber
Proportioning valve
Inlet valve
Waste
Damper Purge valve
Solvent bottles
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Autosampler
From pump
To column
Metering device
6-port valve
Sampling
unit
To waste
Vial gripper
Standard loop volume 300 µl
Total delay volume 300 µl + Vinj
Minimal (bypass) delay volume 6.2 µl
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Autosampler
Metering device
6-port valve
Sampling
unit
From pump
To column
To waste
Bypass Position
Aufziehen der Probe
Main pass und Injektion
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Data
Rate
Peak
Width
Resolution Peak
Capacity
80 Hz 0.300 2.25 60
40 Hz 0.329 2.05 55
20 Hz 0.416 1.71 45
10 Hz 0.666 1.17 29
5 Hz 1.236 0.67 16
min 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0
80Hz
PW=0.30sec
40Hz
PW=0.33sec
20Hz
PW=0.42sec
10Hz PW=0.67sec
5Hz PW=1.24sec
Sample: Phenones Test Mix
Column: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um
Gradient:: 50-100%ACN in 0.3min
Flow Rate: 5ml/min
80Hz versus 10Hz (20Hz) Data Rate
• Peak Width: – 55% (– 30%)
• Resolution: + 90% (+ 30%)
• Peak Capacity: + 120% (+ 40%)
• App. Column Eff.: + 260% (+ 70%)
Richtige Datenrate für schnelle Trennungen
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n Kurze Kapillaren mit kleinem Durchmesser verwenden
(insbesondere zwischen Injektor und Detektor)
n Geeignete Verbinder (Ferrules und Fittings verwenden
n Detektorzelle mit kleinem Volumen.
n Kleines Probenvolumen in einem schwachen LM injizieren
n .
steigendes Extra-Column Volume
Bandenverbreiterung außerhalb der Säule
minimieren
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Ferrules und Fittings
0.090
in.
0.130
in.
0.090
in.
0.170
in.
Swagelok Waters
Parker Rheodyne
Valco Uptight
0.090
in. 0.080
in.
Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988)
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Fehlermöglichkeiten
Zu lang – undicht !
Zu Kurz -
Totvolumen
X
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Blau 0.25 mm
Farbe i.d.
Rot 0.12 mm
Grün 0.17 mm
Agilent Kapillar Farbcode
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Säule
• Säuleneinlassfilter ( 0.2μm) verwenden
• Sättigersäule bei alkalischen Eluenten
• zwischen Pumpe und Injektor Eluent sättigt sich mit Kieselgel
• Vorsäule
• vor Trennsäule, identisches Material wie Trennsäule verwenden
• mechanisches Filter, irreversible Adsorption, Sättigung mit Kieselgel, preiswert
• Druckstöße vermeiden - schnelle Injektion, langsames Anfahren der Pumpe
• Proben filtern
• Säule täglich spülen
• 10 Säulenvolumen mit einem starken Eluenten
• Säulenlagerung gut verschlossen kein Austrocknen, keine Puffersalze
• RP-Säulen in MeOH oder ACN, Silica in Hexan, Ionenaustauscher in Wasser 0.01% NaN3
• Konstante Säulentemperatur (< 60 C)
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Fehler erkennen
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Test der Anlage
Test des Systems mit einer Testmischung
a) Typische Stoffklassen im Labor
b) Uracil (C3H4N2O2), Phenol (C6H6O), p-Methylaminobenzen (C7H9N - p-Toluidin),
Diphenyl (C12H10),
c) Uracil, Acetophenon, Benzen, Toluen
d) Test nach Herstellerangaben
Buchführung über Belastung der Säule, Bodenzahlen Retentionszeiten, Druck
Test analog OQ Prozeduren der Hersteller
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Test der Anlage
Uracil: Eluiert in den meisten RP-
Systemen zur Totzeit Hinweis auf
Flußprobleme
Phenol: sauer, zeigt Tailing bei basischen
Gruppen auf der stationären Phase
p-Toluidin: basisch, zeigt Tailing bei
sauren Silanolgruppen
Diphenyl: neutral, Bestimmung der
Bodenzahl, gibt Hinweise auf
Bandenverbreiterung innerhalb und
außerhalb der Säule (schlechte
Packung, Anschlüsse)
wird in den meisten RP-Systemen getrennt
effektiver Schnelltest für die Säule
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Totzeit
Zeit für ein Molekül, das in die Poren des Trennmaterials eindringen kann und nicht zurückgehalten wird
Arten der Totzeitbestimmung
Näherungsberechnung
D Säulendurchmesser
L Säulenlänge
F Fluss
Porositätsfaktor ε ≈ 0.7 . . 0.8
Solvenspeak
Referenzsubstanzen z. B. Uracil, Thioharnstoff
Können Peaks vor der Totzeit kommen?
F
Ldt
4
2
0
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Totzeit - t0
Fluss: 1.0 ml/min Fluss: 0.5 ml/min
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Wann wurde der Peak injiziert?
Theoretische Bodenzahl
Mass für die Qualität der Säule
N = Bodenzahl
tr = Retentionszeit
W0,5 = Peakbreite in halber Höhe
Retentionszeit
2
5,0
2
54,5w
tN r
54,55,0
Nwtr
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Druckprobleme
Durch Überlagerung der Druckkurve in das Chromatogramm
werden Probleme während der Analyse sichtbar und
helfen bei der Fehlersuche.
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bar
min
50
150
Drucktest
Verschliessen des Pumpenausgangs
mit Metallstopfen.
Flow 1.0 ml/min. Pumpe schaltet bei
Erreichen des maximalen Druckes
( 400 bar meist) ab.
Druckabfall sollte nicht größer als
2 bar/min. sein
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Leaktest
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Rauschende Baselines
Ursachen:
n Schmutzige Meßzelle
n Alte Lampe
n Pulsation der Pumpe
n Luftblasen im Detektor
Zei t ( mi n. )
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Intensitätstest
Limits:
190-220nm > 2000
221-350nm > 5000
351-500nm > 2000
501-950nm > 4000
Mögliche Fehlerquellen:
- Absorbierendes Lösemittel oder Luftblasen in der Zelle
- Schmutzige oder kontaminierte Flusszelle
- Kontaminierte optische Komponenten
- Alte Lampe
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Detektionsprobleme - Wellenlängengenauigkeit
Kalibrierung der Wellenlänge mit den Alpha- und Beta-Emissionslinien 656,1 und
486,0nm
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Column Problems
A. Pressure
B. Peak shape
C. Retention
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Determining the Cause and Correcting High Back Pressure
Many pressure problems relate to blockages in the system.
Check system pressure with / without column
If column pressure is high:
• Back flush column (care regarding future performance)
• Clear blocked frit (reverse flush with strong solvent)
• Wash column
Eliminate column contamination and clear blocked packing
Remove high Mw / adsorbed compounds
Clear precipitate introduced from the sample or buffer
Correcting Overpressure
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Column Cleaning
Use at least 25 mL of each solvent for analytical
columns
Flush with stronger solvents than
your mobile phase. Reversed-Phase Solvent Choices
in Order of Increasing Strength
• Mobile phase without buffer salts
• 100% Methanol
• 100% Acetonitrile
• 75% Acetonitrile:25%
Isopropanol
• 100% Isopropanol
• 100% Methylene Chloride*
• 100% Hexane*
*Tip: When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flushed
with Isopropanol before returning to your reversed-phase mobile phase.
Must Reverse
to
Re-Equilibrate
This Is Time Consuming
Often Performed Offline
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Use at least 50mL or 20 30 column volume changes for analytical columns
• Typical normal phase solvent choices in order of increasing strength:
Solvent Composition
Methanol:Chloroform 50:50%
Ethyl Acetate 100%
Column Cleaning – Normal Phase
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What Are Common Peak Shape Issues?
1. Split peaks
2. Peak tailing
3. Broad peaks
• Many peak shape issues are also combinations - i.e. broad and tailing
or tailing with increased retention
•Symptoms do not necessarily affect all peaks in the chromatogram
•Each of these problems can have multiple causes
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Peak Splitting Caused By Disrupted Sample Path
Split or Double Peaks
Normal Double
Peaks
Tip: Similar Effect Can be Caused by Partially Plugged Frit
•Flow Path Disrupted by Void
•Sample Allowed to Follow Different Paths
Through Column
•Poorly Packed Bed Settles in Use
•High pH Dissolves Silica
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Split Peaks from Injection Solvent Effects
Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase: 82% H2O : 18% ACN
Injection Volume: 30 L Sample: 1. Caffeine 2. Salicylamide
A. Injection Solvent
100% Acetonitrile
B. Injection Solvent
Mobile Phase
Tip: Injecting in a solvent stronger than the mobile phase can cause peak shape
problems such as peak splitting or broadening
Trick: Keep Organic Concentration in Sample Solvent < Mobile Phase
0 10Time (min)
1
2
0 10Time (min)
1
2
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Peak Tailing, Broadening
and Loss of Efficiency
May be caused by:
• Column “secondary interactions”
• Column contamination
• Column aging
• Column loading
• Extra-column effects
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Normal Tailing
Normal Tailing
Symmetry > 1.2
All Peaks Tail:
Extra-Column Effects.
Build up of Contamination on Column
Inlet.
Heavy Metals.
Bad Column.
Causes
Some Peaks Tail:
Secondary - Retention Effects.
Residual Silanol Interactions.
Small Peak Eluting on Tail of Larger Peak.
Peak Shape: Tailing Peaks
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Causes:
Column Overload
Normal Fronting
Symmetry < 0.9
2000
1500
1000
500
0
0 5 10 15 20 25
Time (min)
mA
U
Peak Shape: Fronting Peaks
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Peak Tailing/Broadening
Sample Load Effects Columns: 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flow Rate: 1.5 mL/min
Temperature: 40°C Sample: 1. Desipramine 2. Nortriptyline 3. Doxepin 4. Imipramine 5. Amitriptyline 6. Trimipramine
Broadening
Competitive C8
Plates
A.
B.
C.
D.
High Load
x10
Low Load
C D
1. 850 5941
2. 815 7842
3. 2776 6231
4. 2539 8359
5. 2735 10022
6. 5189 10725
Tailing
Eclpse XDB-C8
USP TF (5%) i
A B
1. 1.60 1.70
2. 2.00 1.90
3. 1.56 1.56
4. 2.13 1.70
5. 2.15 1.86
6. 1.25 1.25
0 5 10Time (min)
0 5 10Time (min)
0 5T im e (m in )
0 5T im e (m in )
Tip: Evaluate Both Volume and Mass Loading
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Peak Shape: Broad Peaks
All Peaks Broadened:
• Loss of Column Efficiency.
• Column Void.
• Large Injection Volume.
Some Peaks Broadened:
• Late Elution from Previous Sample
(Ghost Peak).
– High Molecular Weight.
– Sample - Protein or Polymer.
February 10, 2012 54
Page 54
Time (min)
3
1
2
0 5 10 15
Unknown “Phantom” Peaks
Column: Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase: 40% 10 mM TEA, pH 11 : 60% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min
Temperature: R.T. Detection: UV 254 Sample: 1. Maleate 2. Pseudoephedrine 3. Chlorpheniramine
Plates
1. 5922
2. 9879
3. 779
Tip: The extremely low plates for moderately retained peaks are an indication of a
very late eluting peak from a preceding run.
Time (min)
1
0 5 10
Sample 1: Chlorpheniramine maleate
Peak 1: maleate
Sample 2 : Chlorpheniramine
maleate
and Pseudoephedrine
Peak 1: maleate
Peak 2: pseudoephedrine
Peak 3: chlorpheniramine (from 1st
injection)
“Phantom” peak from
first injection
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Page 55
Changes in Retention Can Be Chemical or Physical
May be caused by:
• Column aging
• Column contamination
• Insufficient equilibration
• Poor column/mobile phase combination
• Change in mobile phase
• Change in flow rate
• Different Gradient Delay Volumes
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Page 60
Mobile Phase pH and pH Buffers
Why Are These So Important in HPLC?
•pH Effects Ionization
– Silica Surface of Column
– Sample Components of Interest
• Buffers
– Resist Changes in pH and Maintain Retention
– Improve Peak Shape for Ionizable Compounds
• Effects Column Life
– Low pH strips Bonded Phase
– High pH Dissolves Silica
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Page 63
Effect of pH on Peak Shape at or
Near the Sample pKa
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min) Time (min)
Column: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Mobile Phase: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN
Flow Rate: 1.0 mL/min. Temperature: RT
pH 4.4 pH 3.0
Ibuprofen
pKa = 4.4
CH3CHCOOH
CH2CH(CH3)2
• Inconsistent and tailing peaks may occur when operating close to an analyte
pKa and should be avoided.
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Page 64
Why Worry About pH? pH, pKa and Weak Bases
At pH 9 – the sample exists as protonated and unprotonated diphenhydramine
in a ratio of 1:1. Peak shape can be poor.
At pH 10 – 91% of the sample exists as unprotonated diphenhydramine.
At pH 8 – 91% of the sample exists as protonated diphenhydramine.
Ka = [R3N][H+]
[R3NH+]
Ka = 1 x 10-9
pKa = 9
R3NH+ R3N + H+
CHOCH CH N2 2
CH3
CH3
+
HCH
3
CH3
CHOCH CH N2 2 + H+
February 10, 2012 65
Page 65
pH vs. Selectivity for Acids and Bases
5
SCD
+
+
2 +
1
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
log
k«
3 4 5 6 7 8 pH
A B C
2
4
5
3
3 5 7 9
ELUENT pH
40
30
20
10
10
Ret
entio
n
+++
3
17,12 - OC
UDC
SOC4
6
C12-OC
J.C. 268(1983) 1
J.C. 111(1975) 149
Column: Nucleosil-C18
Mobile Phase: 45% ACN/55% phosphate buffer
Sample: Bile Acids
Column: mBondapak-C18
Mobile Phase: 60% 25 mM phosphate buffer
40% Methanol
1. Salicylic acid
2. Phenobarbital
3. Phenacetin
4. Nicotine
5. Methamphetamine
• Retention and selectivity can change dramatically when pH is changed.
February 10, 2012 66
Page 66
Importance of pH and Buffers
A Practical Example
•Why the Sample Dictates Use
•What Happens When Buffer Used Effectively
•What Happens When Buffer Ignored or Used Improperly
February 10, 2012 67
Page 67
Importance of pH and Buffers - A Practical
Example Optimized Isocratic Conditions for
Cardiac Drugs
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time (min)
5
4
32
1
0 1 2 3 4 5 6Time (min)
5
4
32
1Column: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Mobile Phase: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 55% MeOH Flow Rate: 2.0 mL/min.
Temperature: 35 C
Detection: UV 254 nm
Sample: Cardiac Drugs 1. Diltiazem 2. Dipyridamole 3. Nifedipine 4. Lidoflazine 5. Flunarizine
February 10, 2012 70
Commonly Used Buffers for Reversed
Phase HPLC Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)
Phosphate 2.1 1.1-3.1 200
7.2 6.2-8.2
12.3 11.3-13.3
Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210
Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210
Citrate 3.1 2.1-4.1 230
4.7 3.7-5.7
5.4 4.4-6.4
Tris 8.3 7.3-9.3 205
Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200
Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200
* Volatile buffers for LC/MS applications
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Optimum buffering capacity occurs at a pH equal to the pKa of the buffer. Most buffers provide
adequate buffering capacity for controlling mobile phase pH only within ±1 unit of their pKa
February 10, 2012 72
Fehlersuche nach Problembildern
Nur ein Problem, das mindestens zweimal auftritt ist ein HPLC-Problem
Durchführung von Wiederholungsmessungen
Test der Anlage mit Testmischungen
Vergleich mit Tests der Einzelkomponenten der Anlage
U Ursache
D Diagnose
L Lösung
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I) Druckprobleme
a) Druck zu niedrig aber konstant
U Lecks
D Test mit Filterpapier an allen Verbindungsteilen
Dichtheit nach Geruch (z.B. Acetatpuffer)
Nadelsitz am Autosampler prüfen
U Ansaugleitungen sind verstopft (Fritten, Degasser..)
D Entfernen von Degasser und Ansaugfritten
L Reinigung der Ansaugfritten im Ultraschallbad
U Kolbendichtringe der Pumpe undicht
L Auswechseln
U Säule hat sich im alkalischem Medium aufgelöst
L Sättigersäule verwenden
February 10, 2012 74
b) Druck zu hoch
U Kapillare "zugedrückt"
D Vom Detektor beginnend alle Komponenten von
der Anlage trennen
L Kapillare auswechseln, finger tighten – Anschlüsse verwenden
U Abrieb aus dem Packungsbett der Säule
L Säule drehen und ohne Detektor spülen
U Mikrobiologische Verunreinigungen
L der mobilen Phase 5% ACN zusetzen oder
0.005% NaN3 (bedingt für Gradientenelution geeignet)
February 10, 2012 75
b) Druck zu hoch
U ausgefallene Probenbestandteile
L Probe filtern
Säuleneinlassfilter verwenden
Vorsäule wechseln
Säule nach Regenerierungsvorschrift spülen
U Eluentenbestandteile (Puffersalze) fallen aus
D Leergradient
L Wechsel von ACN zu MeOH,
Pufferkonzentration ↓
U Viskosität des Eluenten ist zu hoch
L Wechsel zu niederviskosen Eluenten (ACN)
Temperatur ↑
February 10, 2012 76
Druck zu niedrig aber konstant
U Lecks
D Test mit Filterpapier an allen Verbindungsteilen
Dichtheit nach Geruch (z.B. Acetatpuffer)
Nadelsitz am Autosampler prüfen
U Ansaugleitungen sind verstopft (Fritten, Degasser..)
D Entfernen von Degasser und Ansaugfritten
L Reinigung der Ansaugfritten im Ultraschallbad
U Kolbendichtringe der Pumpe undicht
L Auswechseln
U Säule hat sich im alkalischem Medium aufgelöst
L Sättigersäule verwenden
February 10, 2012 77
c) Druck schwankend
innerhalb von Sekunden
U Ventile der Pumpe schließen nicht richtig
L Luft aus der Pumpe entfernen (Purgen)
Lösungsmittel sorgfältig entgasen
U Unterdruck in einem Kanal des Ansaugsystems (LM-Filter, Degasser)
D LM-Filter / Degasser entfernen
L LM Filter reinigen (THF / Wasser im Ultraschallbad)
U flüchtige Eluenten (Ether..) erzeugen Dampfblasen
L höhersiedende Eluenten (z.B. Methyl-tert. Butylether) verwenden
mit jedem Versuch
U Viskositätsunterschiede im Gradienten
Viskositätsmaximum bei Alkoholen und THF bei mittlerer Zusammensetzung
February 10, 2012 78
c) Druck schwankend
am Tage
U Temperaturunterschiede
L Säule temperieren
U Probenbestandteile lösen sich auf
D p ↓
L Säule regenerieren
U Packungsbett setzt sich
D p ↑
L Säule drehen
U Säule löst sich auf
D p ↓
L Sättigersäule verwenden
2 < pH < 8
U Probenbestandteile fallen aus
D p ↑
L Säule regenerieren
February 10, 2012 79
II) Basislinienprobleme
Rauschen der Basislinie
Rauschen bei Flow =0
U alte Deuteriumlampe
L nach ca. 2000 h muß die Lampe ausgewechselt werden
Rauschen bei Flow <>0 kein Rauschen bei Flow =0
U Luftblasen im Detektor
D Prüfung ob Signal sich stark ändert, wenn Auslaß des Detektors
kurz verschlossen wird (Vorsicht Druckbelastbarkeit der Detektorzelle
beachten -besonders RI / FLD)
L Entgasen, Restriktor am Detektorausgang
U späteluierende Analyten
L Säule spülen
→ siehe Systemeignungstest und IIIc Geisterpeaks
February 10, 2012 80
Rauschen der Basislinie
U Eluent verdampft
L hochsiedende Eluenten verwenden
L Eluent nach der Säule kühlen
U Temperaturunterschiede
L Zwischen Säule und Detektor der Eluent temperieren
bes. bei höheren Säulentemperaturen
February 10, 2012 81
Drift
Zyklisch in jedem Chromatogramm
U Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase ( < 230 nm)
L UV-inaktive Eluenten verwenden
↑
Zyklisch an jedem Tag
U Temperatur ändert sich
L Detektor warmlaufen lassen,
Säule thermostatisieren
February 10, 2012 82
Störungen der Basislinie zur Totzeit
U Lösungsmittel ≠ Elutionsmittel
Brechungsindexunterschiede zwischen Elutionsmittel und Lösungsmittel der Probe
U Zusätze zur Stabilisierung der Proben im LM (z.B. NaN3)
L Methodenentwicklung: keine Stabilisatoren einsetzen
Routine: Analyten 1 < k' < 5
February 10, 2012 83
III) Peakprobleme
keine Peaks
kein Injektionspeak sichtbar
U keine Probe injiziert
L Vial und Sampler prüfen
U Gerät misst zu unempfindlich
L Geräteeinstellungen prüfen
U Lampe des Detektors defekt
D Software - Fehlermeldung
L Wellenlänge ändern
Injektionspeak sichtbar
U Probe ist noch auf der Säule
L anderes Lösungsmittel
U kein Fluss durch den Detektor
D Druck prüfen
Fluss am Detektorausgang prüfen
February 10, 2012 84
b) sehr kleine Peaks
U zu geringe Konzentration der Probe
U Empfindlichkeit des Detektors verstellt
D Testmischung analysieren
U Detektorzelle ist verschmutzt
L Reinigen mit warmen Wasser, THF,
U Probe hat sich zersetzt
February 10, 2012 85
c) Geisterpeaks
U Luftblasen
D Sichtkontrolle
meist mit Pulsation der Pumpe verbunden (Niederdruckgradient)
L Lösungsmittel sorgfältig entgasen
Undichtigkeiten vor dem Hochdruckkolben prüfen
U Pulsation der Pumpe
L → Druckschwankungen im Sekundenbereich
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c) Geisterpeaks
U ungenügende Reinheit des Wassers
→ Anreicherung der Verunreinigung im Gradienten
D Test mit Leergradient
(20 min A, 20min 0 → 100 %B, 10min 100%B = klein (215nm)
bei Verdopplung der Anreicherungszeit 40 min müssten doppelt so hohe Peaks erscheinen
L HPLC -Wasser verwenden
Wasserbereitungsanlage warten
Wasser nachreinigen über eine aktivierte (MeOH) C18 Kartusche
U Zusätze in der mobilen Phase
D Test mit Leergradient
L Wechsel zu UV-inaktiven Additiven
Veränderung der Trennbedingungen, um Geisterpeaks in einen leeren Bereich des Chromatogrammes zu bringen
February 10, 2012 87
c) Geisterpeaks
U spät eluierende Komponenten aus vorhergehender Probe
D Peakbreite !
N = 5,54 (tR / w0,5)2 → tR = N0,5 w0,5 / 2,35
→ Abschätzung aus welcher Probe der Analyt kommt
U Bestandteile des Septum
D Peaks erscheinen vor oder in der Nähe der Totzeit
L Vial stets nach 20 Injektionen erneuern
Alle Analyten sollte im Bereich 1< k' < 20 liegen
U Bestandteile der Probenmatrix
L Verbesserung der Probenvorbereitung
U sterischer Ausschluss einzelner Analyten
D tr < t0
L Partikel mit größerem Porenvolumen verwenden
February 10, 2012 88
d) negative Peaks
U Analyten haben geringere UV-Absorption als Eluent (UV-Detektor)
L Änderung der Wellenlänge
Auswertung negativer Peaks ("Detect Negative Peaks on")
U Analyten haben geringeren Brechungsindex als Eluent (RI-Detektor)
L Auswertung negativer Peaks ("Detect Negative Peaks on")
February 10, 2012 89
e) Tailing
alle Komponenten einschließlich Inertpeak zeigen Tailing
U Totvolumen
schlechte Anschlüsse zwischen Injektor und Detektor
zu große / lange Kapillaren
falsche Schneidringe
unsauber bearbeitete Kapillarenden
U Totvolumen
beschädigtes Säulenbett
L Probe filtern
Säuleneinlassfilter verwenden
Vorsäule wechseln
Säule nach Regenerierungsvorschrift spülen
February 10, 2012 90
e) Tailing
inerte Komponente zeigt kein Tailing
U Wechselwirkung der Analyten mit Restsilanolgruppen
L Änderung des pH-Wertes, damit Analyten undissoziiert vorliegen
Einsatz von Additiven wie Acetat oder Triethylamin (50 mmol/l)
Säulen mit endcapping benutzen
polymere Phasen benutzen
U Dissoziation sauer Silanolgruppen
L pH↓
Konzentration Puffer ↑
U andere chemische Ursachen
L Probe filtern
Säuleneinlassfilter verwenden
Vorsäule wechseln
Säule nach Regenerierungsvorschrift spülen
February 10, 2012 91
e) Tailing
die früh eluierenden Analyten tailen, die spät eluierenden Analyten nicht
U zu starke Lösungsmittel im Vergleich zum Eluenten
L Probe im Eluenten lösen
U in der Probenschleife ist noch starker Eluent vom vorhergehenden Versuch (meist bei
Gradientenversuchen !)
L Gradientenversuch immer mit der mindestens 2 min Equilibrierung auf die
Ausgangsbedingungen für den nächsten Versuch beenden
February 10, 2012 92
e) Tailing
Einige Komponenten zeigen Tailing
U falscher Puffer
U falscher pH-Wert,
U zu geringe Konzentration des Puffers
U Nicht getrennte Analyten
D Peakreinheitstest
L Änderung der Trennbedingungen
Peakunterdrückung durch Änderung der Detektionsbedingungen
February 10, 2012 93
f) Fronting
U Überladung der Säule
L Reduktion der Probenmenge
Abtrennung von Matrix durch Probenvorbereitung
Säulendurchmesser ↑
Trennmaterial mit höherer Kapazität verwenden
February 10, 2012 94
g) Doppelpeaks
alle Peaks
U Verschmutzung der Säule, Einlassfritte
L Vorsäule wechseln
Säule nach Regenerierungsvorschrift spülen
U Probenvolumen zu hoch
L max. 1/6 Säulenvolumen injizieren
ein Peak
U Nicht getrennte Analyten
D Peakreinheitstest (Ratio Plot, Peak Purity Analysis, Spectra Plot)
L Änderung der Trennbedingungen
Peakunterdrückung durch Änderung der Detektionsbedingungen
U vorhergehende Analyse
D Peakbreite !
N = 5,54 (tR / b0,5)2 → tR = N0,5 b0,5 / 2,35
→ Abschätzung aus welcher Probe der Analyt kommt
→ siehe Geisterpeaks
February 10, 2012 95
h) breite Peaks
U Überladung der Säule
L Reduktion der Probenmenge
U Probenkonzentration zu hoch
U Injektionsvolumen zu groß
L schwächere Eluenten
Gradient
U Detektor ist nicht mehr im linearen Bereich
L Ändern der Wellenlänge
February 10, 2012 96
h) breite Peaks
U Anlage nicht optimal aufgebaut
Detektorzelle zu groß
Kapillaren zu lang, zu dick, schlecht bearbeitet
Injektionsvolumen zu groß
D → Beispiele zur Berechnung der Bandenverbreiterung außerhalb der Säule
U lange Retentionszeiten
D 1< k' < 20
L stärkere Eluenten
Gradient
U Viskosität der Eluenten zu hoch
L Übergang zu niedrigviskosen Eluenten (ACN)
February 10, 2012 97
h) breite Peaks
U Bodenzahl der Säule zu gering
D Analyse Testmischung und Vergleich mit Herstellerangaben
L andere Säule
längere Säule
kleinere Partikel
U Zeitkonstante am Detektor zu groß
February 10, 2012 98
IV) Probleme mit der qualitativen und quantitativen
Bewertung der Peaks
a) schwankende Retentionszeiten
Retention des Totzeitpeaks hat sich geändert
U Fluss hat sich geändert
D Flusskontrolle
Retention des Totzeitpeaks hat sich nicht geändert
U Säule nicht ausreichend äquilibriert
L mindestens 20 Säulenvolumen äquilibrieren
February 10, 2012 99
a) schwankende Retentionszeiten
U keine reproduzierbare Herstellung der mobilen Phase
L Volumenkontraktion beachten
pH in der wässrigen Phase messen
U Komponenten verdunsten beim Entgasen
L separat entgasen und dann mischen
U Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase
- Reaktion (Peroxide, Algenwachstum)
- Verdampfung
D pH-Wert prüfen
U keine korrekte Gradientenmischung
Ansaugleitungen sind verstopft (Fritten, Degasser..)
Unterdruck entsteht
D Entfernen von Degasser und Ansaugfritten
February 10, 2012 100
a) schwankende Retentionszeiten
U Proportionierventil defekt
D → Anlagentest
U Temperatur ist nicht konstant
Retentionszeit schwankt um 1..2% je °C
U Pufferkapazität zu gering
L Pufferkonzentration ≥ 20 mM
U Säule hat sich verändert
D Säulentest
L Vorsäule wechseln
Regenerierung der Säule
February 10, 2012 101
a) schwankende Retentionszeiten
U Matrixpeaks wurden an den aktivsten Zentren adsorbiert
D tr ↓
L "Konditionierung" der Säule mit Matrixproben
U Säule wurde überladen
D tr ↓
L Probenmenge ↓
Säulenvolumen ↑
Trennmaterial höherer Kapazität
U Verlust an gebundener stationärer Phase
D tr ↑
L 2 < pH < 8
endgecapptes Material
Material mit hohem C-Gehalt
February 10, 2012 102
b) schwankende Peakhöhen
alle Peaks schwanken
U keine reproduzierbare Injektion
- Luft in der Dosierspritze
- nicht ausreichend Probe vorhanden
- Analyt ist zu viskos
- Septum in der Autosampler- Nadel
February 10, 2012 103
Peakhöhen schwanken nur bei manueller Injektion
U Dosierschleife wird überfüllt (≈ 3 x Schleifenvolumen)
wenn Analyt in einem zu schwachen LM gelöst ist, dann adsorbiert Analyt am Injektionsventil
D Problem tritt nicht auf bei partiell gefüllten Schleifen (z.B. Autosampler)
U Lecks
D → siehe Druck zu niedrig
U Zersetzung der Probenkomponenten
D Test mit Mischungen aus Säulentest
U Fehlzuordnung der Peaks
D Spectra Library Search,
Analyse unter anderen Bedingungen
U Beladung und irreversible Adsorption bei neuer Säule
U Verlust bei der Probenvorbereitung
L interne Standards
February 10, 2012 104
c) schwankende Peakflächen
U → schwankende Peakhöhen
U → kein konstanter Fluß
U falsche Basislinienführung
U nicht aufgelöste Matrixpeaks
February 10, 2012 105
Übungen zur Fehlererkennung
a) Die Packung am Kopf der Säule hat sich zugesetzt
b) Die Flußgeschwindigkeit hat sich verringert
c) Die Säule war nicht im Gleichgewicht
d) Die Zusammensetzung der mobilen Phase hat sich geändert
February 10, 2012 106
C 18 Säule, ACN/Wasser,
Was muß man tun um das rechte Chromatogramm zu erhalten ?
a) Den Wasseranteil der mobilen Phase erhöhen
b) Eine C8 -Säule verwenden
c) Methanol anstelle von Acetonitril verwenden
d) Eine geanz andere stationäre Phase verwenden (Diol ?)
February 10, 2012 107
Beide Chromatogramme wurden mit demselben System aufgenommen.
Worauf beruht der Unterschied?
a) Auf einem Leck im Injektor
b) Auf einer Erhöhung der Säulentemperatur
c) Auf einer Verringerung der Säulentemperatur
d) Auf einem Leck in der Detektorzelle
February 10, 2012 108
rechts: Normalzustand, Was ist die Ursache für das linke Chromatogramm?
a) Die Injektion einer Mischung aus 4 Komponenten
b) Die Setzung des Packungsbettes am Kopf der Säule
c) Die ungleichmäßige Packung der Säule
d) Die schlechte Konstruktion der Detektorzelle
February 10, 2012 109
Analyse einer Lösung mit 2 verschiedenen Säulen, Was ist die Ursache für
diese unterschiedlichen Chromatogramme?
a) Der Injektor wurde zwischen beiden Analysen verschmutzt
b) Die Mischung enthielt 3 Komponenten, die Bedingungen waren für die
linke Säule nicht optimal
c) Eine Verbindung lag in sehr geringer Konzentration vor
d) Die HPLC Pumpe ist ausgefallen
February 10, 2012 110
Was ist Ursache für Drift (RI-Detektor) ?
a) Eine Luftblase in der Meßzelle
b) Temperaturänderung
c) Das System war noch nicht im Gleichgewicht
d) Verschmutzung der mobilen Phase
February 10, 2012 111
Ionenpaarchromatographie auf einer RP-Säule, Wie erreicht man das
rechte Chromatogramm ?
a) Konzentration des Ionenpaarreagenz
b) Fluß
c) C-Kette des Ionenpaarreagenz
February 10, 2012 112
Chromatogramm wurde mit UV-Detektor aufgenommen, Was gilt ?
a) Beide Komponenten habe ähnlich Konzentrationen
b) Die 2. Komponente hat eine höhere Konzentration
c) Es ist keine derartige Aussage möglich
February 10, 2012 113
RP-Säule, oben reines Wasser, Wie erhält man das untere Chromatogramm?
a) pH -Wert
b) pH-Wert
c) Ionenpaarreagenz zufügen
February 10, 2012 114
RI-Detektor, Warum wurde kein Peak gefunden ?
a) Komponenten absorbieren das Licht
c) Die Lösung ist nicht konzentriert genug
c) Am Injektor ist ein Leck
d) Der Brechungsindex der mobilen Phase ist zu hoch
February 10, 2012 115
Welche Lösungsansätze für Ihre HPLC
Probleme haben Sie jetzt ?