two-dimensional hplc determination of water-soluble
TRANSCRIPT
Two-Dimensional HPLC Determination of Water-Soluble Vitamins in a Nutritional Drink Dai Zhenyu,1 Chen Jing,1 Xu Qun,1 and Jeffrey Rohrer2 1Thermo Fisher Scientific, Shanghai, People’s Republic of China; 2Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA
Ap
plica
tion
No
te 1
06
9
Key WordsFood Analysis, Food Quality, Acclaim PolarAdvantage Column, Acclaim 120 C18 Column, Hypersil GOLD Phenyl Column
GoalTo develop an efficient high-performance liquid chromatography (HPLC) method for simple and sensitive determination of water-soluble vitamins in a complex multivitamin/mineral drink. Target analytes are B group vitamins, including thiamine (VB1), riboflavin (VB2), nicotinamide (VB3), pantothenic acid (VB5), pyridoxine (VB6), biotin (VB7), and cyanocobalamin (VB12); and ascorbic acid (VC).
IntroductionVitamins are a well-known group of compounds that are essential for human health. They can be classified into two main groups: water- and fat-soluble. With the exception of VB6 and VB12, water-soluble vitamins are not stored in the body. Thus, if one’s dietary vitamin intake is insufficient, a vitamin supplement should be added to the diet.
The vitamin supplement can be in tablet form, a clear vitamin-enhanced functional drink, vitamin-enhanced milk, or a nontransparent multivitamin/mineral nutritional drink with additions of other substances (e.g., fruit extracts) that make it more complex than clear products. To ensure that these products contain the labeled amounts of vitamins, a number of reliable quality control assays are available.1-3 For a vitamin tablet or a clear functional drink, the analysis is relatively simple and a routine HPLC method (e.g., a C18 column with UV detection) is satisfactory for quantifying the vitamins.4
Some samples, however, have too many additional compo- nents to allow a routine HPLC vitamin-quantification method. Vitamin-enhanced milk and a nontransparent multivitamin/mineral nutritional drink—referred to as a multivitamin nutritional drink throughout the rest of this study—are two such samples. In addition to vitamins, these samples also supply amino acids, minerals, coenzyme Q10, the compounds contained in grape extracts, and more. These additional compounds interfere with the separation of vitamins, making quantification difficult.
Therefore, a simple and sensitive two-dimensional HPLC (2D-HPLC) method is needed to quantify vitamins in these complex samples.
Equipment and Software• Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000 x2 Dual
HPLC system, including:
− DGP-3600RS Dual-Gradient Rapid Separation Pump System with SRD-3600 Integrated Solvent and Degasser Rack
− WPS-3000TRS Rapid Separation Wellplate Sampler, Thermostatted, with a 100 μL sample loop and a 100 μL syringe
− TCC-3000RS Rapid Separation Thermostatted Column Compartment equipped with two 2p–6p valves
− DAD-3000RS Rapid Separation Diode Array Detector with 13 μL flow cell
− Mixer for 800 μL Mixing Volume (P/N 6040.5750)
• Thermo Scientific™ Dionex™ Chromeleon™ Chromatog-raphy Data System (CDS) software version 7.1
• Thermo Scientific™ Orion™ 2-Star pH Benchtop Meter
二维高效液相色谱法测定营养饮料中的
水溶性维生素
戴振宇 1、陈静 1、许群 1、梁立娜 1、Jeffrey Rohrer2
1 中华人民共和国 上海；2 美国加利福尼亚州森尼韦尔市
赛默飞世尔科技（中国）有限公司
关键词
食品分析，食品质量， Acclaim PolarAdvantage 色谱柱，
Acclaim LC C18 色谱柱，Hypersil Gold Phenyl 色谱柱
目标
建立更简便、灵敏、有效的测定多种维生素矿物质复合
饮料中的水溶性维生素的高效液相色谱法 (HPLC)。目标分
析物是 B 族维生素包括硫胺素 (VB1)、核黄素 (VB2)、烟酰胺
(VB3)、泛酸 (VB5)、吡哆醇 (VB6)、生物素 (VB7)、氰钴胺素 (VB12)、
抗坏血酸 (VC)。
引言
众所周知，维生素是一组化合物，对人体健康非常重要。
维生素可分为两大类，水溶性和脂溶性维生素。除吡哆
醇（VB6）和氰钴胺素（VB12）以外，人体无法储存水溶性
维生素。因此如果膳食维生素摄入量不足，应在饮食中
添加维生素补充剂。
维生素补充剂可制成片剂、单种维生素强化功能饮料、
维生素强化牛奶，或通过添加其他成分（如水果提取物）
制成不透明的多种维生素矿物质营养饮料，使其具有更
多的复合功能。为了确保这些产品中含有所标示量的维
生素，许多公开的论文已经介绍了可靠的质量控制方法 1-3。
对于某种维生素片剂或功能确切的饮料，分析相对简单，
常规的 HPLC 方法即能达到定量分析维生素的要求 4。有些
样品如维生素强化牛奶和不透明多种维生素矿物质营养
饮料，除维生素外，还含有氨基酸、矿物质、辅酶 Q-10，
葡萄提取物等。这些添加的化合物会干扰维生素的测定。
因此，我们开发出简便、灵敏的二维高效液相色谱法 (2-D
HPLC)，以实现此类样品中维生素的简便、灵敏、有效的
测定。
仪器
● Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000×2 双高效液相
色谱系统，包括：
配置 SRD-3600 集成溶剂和脱气机机架的 DGP 3600RS 双三
元快速分离泵系统
配置 100 μL 样品环和 100 μL 注射器的 WPS 3000TRS 自动
进样器
带 2 个 2 位 -6 孔切换阀的 TCC 3000RS 柱温箱
配置 13 µL 流动池的 DAD-3000RS 二极管阵列检测器
750 μL 静态混合器
● Thermo ScientificTM DionexTM ChromeleonTM 色谱数据系统 (CDS)
软件 7.1 版。
● Thermo Scientific Orion 2-Star 台式 pH 计
试剂和标准品
● 去离子水 (DI)，电阻率为 18.2MΩ-cm
● 乙腈 (CH3CN)，高效液相色谱级，Fisher Scientific
● 磷酸二氢钾 (KH2PO4) (C/N P286-1)，Fisher Chemical 公司
● 磷酸，85％ (H3PO4), (C/N A260-500)，Fisher Chemical 公司
Application Note 1069
2
● 硫胺 (VB1)、核黄素 (VB2)、烟酰胺 (VB3)、泛酸 (VB5)、吡哆醇
(VB6)、生物素 (VB7)、氰钴胺 (VB12)、抗坏血酸 (VC)，中国国
家药品生物制品检定所（简称 NICPBP）。
标准溶液的配制
标准水溶性维生素溶液的制备方式是，分别称取 10 mg 的
VB1、VB3、VB5、VB6、VB7、VB12 和 VC 维生素粉，置于容量瓶，
用去离子水定容至 10 mL，配制成每种维生素浓度均为 1.0
mg/mL 的储备溶液。由于 VC 不稳定，应即用即配制。此外，
由于VB2在水中不够稳定，VB2 储备溶液的浓度应降低到 0.03
mg/mL。
向 1 毫升的样品瓶中加入 500 μL VB2 储备溶液、VB5 和 VB7
储备溶液各 100 μL、以及 VB1、VB3、VB6、VB12 和 VC 储备
溶液各 50 μL。加入 50 μL 的去离子水最后定容至 1 mL。
在此混合标准储备液中，VB2 的浓度为 15 μg/mL,，VB5
和 VB7 的浓度均为 100 μg/mL，而其他维生素的浓度为
50 μg/mL。
为了制备用于校准的混合标准工作溶液，向 10 mL 的玻
璃小瓶中加入适量的混合标准储备溶液，并用去离子水
定容至 10 mL。有关详细信息，请参阅表 1。
混合标准工作液 1 2 3 4 5 6
用于制备 10 mL 的混合标准储备溶液体积 (mL) 0.02 0.1 0.2 1.0 2.0 10
每 种维生素的浓度 (mg/L)
VB2 0.03 0.15 0.3 1.5 3.0 15
VB5, VB7 0.2 1.0 2.0 10 20 100
VB1, VB3, VB6, VB12, VC 0.1 0.5 1.0 5.0 10 50
表 1. 水溶性维生素的混合标准工作液的制备
表 2. 多种维生素营养饮料的标识值
样品的制备
由客户提供添加 VB1、VB2、VB3、VB5、VB6、VB7、VB12 和 VC 的
多种维生素矿物质营养饮料。该饮料还含有一些脂溶性
维生素、矿物质、氨基酸复合物、葡萄籽提取物、辅酶
Q-10，并添加了其他成分，以满足日常营养需要。表 2 列
出了样品组分。
成分 每份分量 * 成分 每份分量
总碳水化合物 9 g 锌（葡萄糖酸锌） 15 mg
维生素 A 10000 IU 硒（L- 硒蛋氨酸） 100 mcg
维生素 C 1000 mg 铜（葡萄糖酸铜） 1 mg
维生素 D3 200 IU 锰（葡萄糖酸锰） 5 mg
维生素 E 200 IU 铬（氨基酸螯合物） 200 mcg
维生素 K1 300 mcg 钾（柠檬酸） 100 mg
维生素 B1 30 mg 胆碱（酒石酸） 30 mg
维生素 B2 30 mg 肌醇 30 mg
维生素 B3 30 mg 硼（氨基酸螯合物） 1 mg
维生素 B5 150 mg 氨基酸复合物（专有配方） 125 mg
维生素 B6 30 mg 葡萄籽提取物 25 mg
维生素 B7 300 mcg 辅酶 Q-10 5 mg
维生素 B12 500 mcg 二甲基甘氨酸 25 mg
叶酸 400 mcg 帕巴 30 mg
钙 600 mg 柑橘生物类黄酮 13 mg
磷 80 mg GDL 150 mg
铁（葡萄糖酸铁） 4 mg 植物中提取的矿物质 600 mg
镁（柠檬酸镁、葡萄糖酸镁） 300 mg
3
必要时，用去离子水稀释饮料，并用 0.45 µm 滤膜过滤。
将标识值与本应用说明中的校准范围比较，判断是否需
要稀释样品。样品在分析之前保存在 4℃条件下的棕色
瓶中。
色谱条件
一维
色谱柱：除 VB12 之外的水溶性维生素，Thermo Scientific
Acc la im Po larAdvantage (PA1) , 5 μm, 120 Ǻ ,
4.6×250 mm
二维
色谱柱：Acclaim C18, 5 μm, 120 Ǻ, 4.6×150 mm
柱温：25℃
流动相：与第一维中使用的相同
流速：0.8 mL/ min
紫外检测：在 210nm、245nm、268nm 和 291 nm 处的吸
光度
结果与讨论
测定维生素的传统高效液相色谱法
目前，《美国药典》中尚没有关于八种水溶性维生素混
合物的分离方法。《美国药典》中对个别维生素的测定
方法较为复杂（例如，测定生物素需要用到高氯酸钠、
磷酸、二甲亚砜、乙腈和水），并要利用离子对试剂，
以保留亲水性维生素 5。由于离子对试剂对色谱柱性能会
产生不可逆转的影响，故研究人员作了大量研究，旨在
找到不使用离子对试剂而采用更为简单流动相的方法。
最近，据报导有研究者采用酸性或中性磷酸盐缓冲液 / 有
机溶剂流动相，分离多种维生素片提取物和维生素强化
功能性饮料中的维生素，但前述两种产品没有本文研究
的饮料复杂 1。对于某些多种维生素营养饮料等复杂的样
品，其中添加物会干扰维生素的分离并最终干扰到紫外
光谱对维生素的测定。图 1 中的色谱图显示多种维生素
营养饮料采用常规 HPLC 测定，由于出现大量紫外吸收干
对于 VB12，Thermo Scientific Hypersil Gold Phenyl, 5 μm,
4.6×150 mm
柱温：25℃
流动相：A：25 mM 磷酸盐缓冲液（取约 3.4 g KH2PO4 溶解
于 1 L 水中，并用 H3PO4 调节 PH 值至 3.0）
B：CH3CN
梯度洗脱（见表 3）
流速：0.8 mL/min
进样量：10 μL
紫外检测：在 210nm 和 254 nm 处的吸光度
表 3. 梯度程序和阀切换
* 食用份量：1 fl. Oz.
一维（右泵） 阀切换 二维（左泵）
时间 (min) 流速 (mL/min)
%A （25 mM 磷酸盐缓冲液 ,
pH3.0）
%B (CH3CN) 时间 (min) 右阀位 左阀位 时间 (min) 流速 (mL/min)
% A （25 mM 酸盐缓冲液 , pH3.0）
%B (CH3CN)
0 0.8 100 0 0 6-1 1-2 0 0.8 100 0
14 0.8 100 0 3.94 1-2 6-1 5 0.8 100 0
23.5 0.8 50 50 4.3 6-1 1-2 12.5 0.8 65.0 35.0
24 0.8 0 0 5.32 1-2 6-1 13.0 0.8 20.0 80.0
30 0.8 0 0 5.89 6-1 1-2 21.0 0.8 20.0 80.0
_ _ _ _ 7.8 1-2 1-2 21.5 0.8 100 0
_ _ _ _ 8.35 6-1 6-1 30 0.8 100 0
_ _ _ _ 13.12 1-2 1-2 _ _ _ _
_ _ _ _ 13.28 6-1 6-1 _ _ _ _
_ _ _ _ 14.61 1-2 1-2 _ _ _ _
_ _ _ _ 14.82 6-1 6-1 _ _ _ _
_ _ _ _ 15.42 1-2 1-2 _ _ _ _
_ _ _ _ 15.60 6-1 6-1 _ _ _ _
_ _ _ _ 15.97 1-2 1-2 _ _ _ _
_ _ _ _ 16.12 6-1 6-1 _ _ _ _
_ _ _ _ 28.5 6-1 1-2 _ _ _ _
4
扰峰，因此很难甚至不可能对水溶性维生素峰进行量化
分析。显然，色谱峰 1-3 不能量化分析。真实的样品中可
3 Proprietary & Confidential
图2.二维高效液相色谱系统的配置
双梯度泵
自动进样器
第1个柱
第1个检测器
废物
混合器
废物
第2个检测器 第2个柱
专有且机密
图 2. 二维高效液相色谱系统的配置
2 Proprietary & Confidential
图1. 采用传统的高效液相色谱法(HPLC)，标准混合物与多维营养饮料样品的色谱图
分析柱: Thermo Scientific Acclaim PolarAdvantage (PA1), 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 250 mm 流动相 A: 25 mM 磷酸盐缓冲液 (将约3.4克KH2PO4溶解在1L 的 水中，使用 H3PO4调节pH值至 3.0） B: CH3CN 梯度: CH3CN, 0 - 14 min, 0%; 14 - 23.5 min, 0 - 50 %; 23.5 - 24 min, 50 - 0%. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 进样量: 10 μL 检测: 在210 nm处UV 的吸光度 色谱图: (a)标准混合物 (b) 多种维生素营养饮料样品 峰值: mg/L 1- VB1 50 2- VC 50 3- VB3 50 4- VB6 50 5- VB5 100 6- VB12 50 7- VB2 15 8- VB7 100
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 -50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
min
mAU
1 2
3 4
5
6
7 8 a
b
专有且机密
图 1. 采用传统的高效液相色谱法 (HPLC)，标准混合物与多维营养饮料样品的色谱图
检测到光谱峰 5-8，但由于出现了多个干扰峰，无法进行
精确定量。
2-D-HPLC 的说明
2-D-HPLC 法已被用于实现复杂样品的高效分离。采用不同
的双色谱柱不但能提供更强大的分离能力，而且采用在
线 2-D-HPLC 中的 Heart-Cut 能够简化第二维的分离。图 2 显
示了用于本应用说明中二维高效液相色谱仪的配置。经
过简单的样品制备（必要时，过滤样品后，用去离子水
稀释），进样后在第一维使用 Acclaim PA 1 色谱柱进行部
分分离。紫外检测器可在线监测目标物在何处洗脱。通
过进样混合标准工作溶液，测定每种维生素出峰开始和
结束时间。根据这些值切换阀。右边阀切换到 1-2 位时，
可将维生素色谱峰单独输送到第二维流路。对于早期洗
脱维生素峰，左边的阀切换到 1-6 位，使这些维生素组分
直接转移到第二个色谱柱。对于后期洗脱维生素光谱峰，
左阀切换到 1-2 位，使 750 μL 混合器在线。在此配置中，
第二维中的水流动相可稀释第一维流动相中的乙腈，以
此确保维生素在第一维色谱柱得到保留。
* 注意
当右阀切换到 1-2 位时，紫外检测器 1 将把两个色谱柱连
接起来。第二维色谱柱的背压会超过紫外检测器 1 流动
池的压力极限。因此，选择适当的颗粒大小和第二色谱
柱长度，以确保背压低于流动池的压力极限。也可以在
仪器方法中设置压力极限指令，以便当背压过高时可随
时停止流动。
5
2-D-HPLC 法的优化
阀切换
为了实现 2-D-HPLC 法应用中的最佳分辨率和峰形，方法的
关键是将在第一维上得到初步分离的色谱峰完整地转送
到第二维上。实际上，第一维和第二维上使用的两个流
动相通常是有差异的，有时会导致“峰丢失”。如图 3A
所示，当峰 5、7 和 8 直接转移到第二维时会消失，这是
由于第一维流动相梯度后期含有高浓度乙腈，使它们在
第二维上难以保留。解决这个问题的常用方法是被测物
到达第二维中的色谱柱之前，使用第三个泵注入水以稀
释流动相中高比例的乙腈 1。在赛默飞世尔科技公司 最近
的应用说明 (AN1023) 中，采用了另外一种方式解决这一问
题 7。将一个 750 μL 混合器切入第二维流路，在第二维分
离之前，使第一维后期含有高比例乙腈的流动相与第二
维初始含有高比例水的流动相充分混合。最初，我们把
这个想法应用到所有的被测物上。发现在第二维上，后
期洗脱峰峰形良好，但早期洗脱峰峰形加宽（图 3B）。
经过多次实验，修改了设置，当后期洗脱色谱峰转移到
750 μL 混合器但未到达第二维色谱柱时，将早期洗脱色谱
峰直接转移到第二维色谱柱上。图 3C 显示此设置使所有
8 种水溶性维生素的峰形良好。
色谱柱的选择及对分离的影响
测试了几种色谱柱的组合。先前的研究结果表明，大多
数水溶性维生素采用 Acclaim PA 和 C18 色谱柱分别作为第
一维柱和第二维柱达到良好的分离度；但在饮料样品中，
VB12 与杂质共同洗脱，因而无法对 VB12 进行定量分析 8。当
图 3. 具有不同配置的标准混合物的二维色谱图
4 Proprietary & Confidential
图3.具有不同配置的标准混合物的二维色谱图
第一维度
分析柱: Thermo Scientific Acclaim PolarAdvantage (PA1), 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 250 mm 流动相: A: 25 mM 磷酸盐缓冲液 (将约3.4克KH2PO4溶解在1L 的 水中，使用 H3PO4调节pH值至3.0） B: CH3CN 梯度: B: 0 ~ 14 min, 0%; 14 ~ 23.5 min, 0 ~ 50 %; 23.5 ~ 24min, 50 ~ 0%. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 进样量: 10 µL
第二维度 分析柱: Thermo Scientific Acclaim C18, 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 150 mm 流动相: 与第一维度相同 梯度: B: 0 ~ 5 min, 0%; 5~ 12.5 min, 0 ~ 5%; 12.5 ~ 13 min, 35 ~ 80 %; 13 ~ 21 min, 80%; 21 ~ 21.5 min, 80~ 0 %. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 检测: 在210 nm处UV 的吸光度 阀位: 请参阅表3 色谱图: (A) 750 μL混合器始终脱机 (B) 750 μL 混合器始终联机 (C) 750 μL混合器在第1-3峰值时脱机，在第 4-8峰值时联机峰值mg/L。 1- VB1 50 2- VC 50 3- VB3 50 4- VB6 50 5- VB5 100 6- VB12 50 7- VB2 15 8- VB7 100
专有且机密
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 -50
0
100
200
250
min
mAU
0
50
100
150
200
min
mAU
0
100
200
300
min
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1
1
2
2
3
3
4
4
4
5
5
6
6
6
7
7
8
8
A
B
C
1 3 2
图 4. 在第一维度使用 Acclaim PA 1 分析柱条件下，标准混
合物与多维营养饮料样品的色谱图
5 Proprietary & Confidential
图4.在第一维度使用Acclaim PA 1分析柱条件下，标准混合物与多维营养饮料样品的色谱图 UV_VIS_1
第一维度
分析柱: Thermo Scientific Acclaim PolarAdvantage (PA1), 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 250 mm 流动相: A: 25 mM 磷酸盐缓冲液(将大约 3.4 克 KH2PO4 溶解在1 L 水中 ，并使用 H3PO4调节pH 至3.0 ) B: CH3CN 梯度: B: 0 ~ 14 min, 0%; 14 ~ 23.5 min, 0 ~ 50 %; 23.5 ~ 24min, 50 ~ 0%. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 进样量: 10 µL
第二维度 分析柱: Thermo Scientific Acclaim C18, 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 150 mm 流动相: 与第一维度相同 梯度: B: 0 ~ 5 min, 0%; 5~ 12.5 min, 0 ~ 5%; 12.5 ~ 13 min, 35 ~ 80 %; 13 ~ 21 min, 80%; 21 ~ 21.5 min, 80~ 0 %. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 检测: 在245 nm处的吸光度 阀位: 请参阅表3 色谱图: (a) 标准混合物 (b) 多维营养饮料样品 峰值: mg/L 1- VB1 50 2- VC 50 3- VB3 50 4- VB6 50 5- VB12 50 6- VB2 15
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 -50 -40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
min
mAU
1 2 3
4
5 6
mAU
min
5 6
b
a
专有且机密
使用 Hypersil Gold Phenyl 色谱柱作为第一维柱时，可满足这
一需求。如图 4 所示，采用 PA 色谱柱作为第一维时，在
色谱图上的 245 nm 处无法检测到 VB12。当采用 Hypersil Gold
Phenyl 色谱柱作为第一维时，可检测到 VB12（图 5）。
6
图 5. 在第一维度使用 Hypersil Gold Phenyl 分析柱，VB12 标准品和 b）多维营养饮料样品的色谱图
图 6. 连续八次注射标准水溶性维生素混合物色谱图的叠加
6 Proprietary & Confidential
UV_VIS_1
图5.在第一维度使用Hypersil Gold Phenyl分析柱，VB12标准品和 b）多维营养饮料样品的色谱图
第一维度
分析柱: Thermo Scientific Hypersil Gold Phenyl column 5 μm, 4.6 × 150 mm 流动相: A: 25 mM 磷酸盐缓冲液(将约3.4 克 KH2PO4 溶解在 1 L 水中, 并使用H3PO4
调节PH值至 3.0) B: CH3CN 梯度: B: 0 ~ 14 min, 0%; 14 ~ 23.5 min, 0 ~ 50 %; 23.5 ~ 24min, 50 ~ 0%. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 进样量: 10 µL
第二维度 分析柱: Thermo Scientific Acclaim C18, 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 150 mm 流动相: 与第一维度相同 梯度: B: 0 ~ 5 min, 0%; 5~ 12.5 min, 0 ~ 5%; 12.5 ~ 13 min, 35 ~ 80 %; 13 ~ 21 min, 80%; 21 ~ 21.5 min, 80~ 0 %. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 检测: 在245 nm处UV 的吸光度 阀位: 请参阅表3 色谱图: (a) VB12 标准 (20 mg/L) (b)多维营养饮料样品 峰值: 1- VB12
20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 -25.0 -20.0
-10.0
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
mAU
a
b 1
专有且机密
方法的重现性、线性关系和检测限
连续 8 次进样水溶性维生素，估算保留时间和峰面积的相
对标准偏差 (RSD)，结果见表 4 示。图 6 则显示了 8 次进
样的叠加色谱图。
通过三次连续进样不同浓度的混合标准溶液，采用外标
法得到线性工作校准曲线，用于定量样品中的水溶性维
生素，结果见表 5。采用置信度为 99% 时的 single-sided
Student’s test 方法，估算方法检测限 (MDL)，结果见表 5。
表 4. 水溶性维生素的保留时间和峰面积的重现性
水溶性维生素 保留时间相对标准偏差 峰面积相对标准偏差
VB1 0.05 1.08
VB2 0.02 0.32
VB3 0.11 0.62
VB5 0.03 0.36
VB6 0.03 0.45
VB7 0.02 0.87
VB12 0.02 0.48
VC 0.1 3.44
7 Proprietary & Confidential
图6.连续八次注射标准水溶性维生素混合物色谱图的叠加 UV_VIS_1
第一维度
分析柱: Thermo Scientific Acclaim PolarAdvantage (PA1), 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 250 mm 流动相: A: 25 mM 磷酸盐缓冲液(将约3.4 克 KH2PO4 溶解在 1 L 水中, 并使用H3PO4调节PH值至 3.0) B: CH3CN 梯度: B: 0 ~ 14 min, 0%; 14 ~ 23.5 min, 0 ~ 50 %; 23.5 ~ 24min, 50 ~ 0%. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 进样量: 10 µL
第二维度 分析柱: Thermo Scientific Acclaim C18, 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 150 mm 流动相: 与第一维度相同 梯度: B: 0 ~ 5 min, 0%; 5~ 12.5 min, 0 ~ 5%; 12.5 ~ 13 min, 35 ~ 80 %; 13 ~ 21 min, 80%; 21 ~ 21.5 min, 80~ 0 %. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 检测: 在210 nm处UV 的吸光度 阀位: 请参阅表 3 色谱图: (a) ~ (h), 连续进样1~ 8次 峰值: mg/L 1- VB1 50 2- VC 50 3- VB3 50 4- VB6 50 5- VB5 100 6- VB12 50 7- VB2 15 8- VB7 100
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 -40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
min
mAU
1
2
4
5
6
7 8
3
e
a b c d
f
g h
专有且机密
7
图 7. 多维营养饮料样品（稀释 100 倍）的第二维色谱图
表 5. 校准数据和水溶性维生素的方法检出限 (MDL)
水溶性维生素 检测波长 (nm) 范围 (µg/mL) 回归方程 r 相对标准偏差 方法检测限 (µg/mL)
VB1 245 0.5-10 A= 0.1755c-0.1080 0.9978 5.5700 0.30
VB3 268 0.5-50 A=0.2385c+0.0276 0.9999 0.6985 0.23
VB6 291 0.5-50 A=0.2918c+0.1237 0.9999 0.6012 0.18
VB5 210 1.0-100 A=0.0462c+0.0161 0.9999 1.5145 0.26
VB12 245 0.5-50 A=0.1026c+0.0153 0.9999 1.3333 0.20
VB2 268 0.1-15 A=0.9618c-0.0423 0.9995 3.5503 0.03
VB7 210 2-100 A=0.0101c 0.9994 3.1306 1.5
VC 245 / / / / /
表 6. 多种维生素营养饮料样品中水溶性维生素的分析结果
* 在分析前取样品稀释 1000 倍；从而 1 mg/mL 应被检测为 1 µg/mL。
被分析物 标示 mg/mL* 检定 µg/mL 加入 µg/mL 发现 µg/mL 回收率 %
VB1 1 1.03 1 1.98 95
VB3 1 不适用 1 0.96 96
VB6 1 1.1 1 2.2 110
VB5 5 4.51 2 6.03 76
VB12 0.015 不适用 1 0.83 83
VB2 1 1.03 0.3 1.34 103
VB7 0.01 不适用 2 2.30 115
VC 35 检测到 / / /
样品分析
可能由于在样品中的浓度较低，在多种维生素的营养饮
料中未检测到 VB7 和 VB12，VB3 亦未检出。当按标识值 VB3
到样品中时，其回收率达到 96%。因此，本方法能够测定
VB3。检测到其它水溶性维生素接近其标识值。虽然 VC 在
标准工作溶液中不稳定，但在多种维生素营养饮料中相
对稳定。正如图 7 中所示，VC 是样品色谱图中的主要峰。
样品测定结果见表 6。
8 Proprietary & Confidential
图7. 多维营养饮料样品（稀释100倍）的第二维色谱图 UV_VIS_1
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 -10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240 250
min
mAU
1
2
3
4
5
6
第一维度
分析柱: Thermo Scientific Acclaim PolarAdvantage (PA1), 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 250 mm 流动相: A: 25 mM 磷酸盐缓冲液(将约3.4 克 KH2PO4 溶解在 1 L 水中, 并使用H3PO4
调节PH值至3.0) B: CH3CN 梯度: B: 0 ~ 14 min, 0%; 14 ~ 23.5 min, 0 ~ 50 %; 23.5 ~ 24min, 50 ~ 0%. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 进样量: 10 µL
第二维度 分析柱: Thermo Scientific Acclaim C18, 5 μm, 120 Ǻ, 4.6 × 150 mm 流动相: 与第一维度相同 梯度: B: 0 ~ 5 min, 0%; 5~ 12.5 min, 0 ~ 5%; 12.5 ~ 13 min, 35 ~ 80 %; 13 ~ 21 min, 80%; 21 ~ 21.5 min, 80~ 0 %. 柱温: 25 °C 流率: 0.8 mL/min 检测: 在 245 nm处UV 的吸光度 阀位: 请参阅表 3 色谱图: (a) 标准混合物 (b) 多维营养饮料样品 峰值: 1- VB1 2- VC
3- VB6 4- VB5 5- 未知
6- VB2
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Application Note 1069
结论
本研究描述了一种能够简化复杂样品如多种维生素营养
饮料中维生素含量测定的二维高效液相色谱法。方法由
变色龙软件控制的 UltiMate 3000 HPLC 双泵系统进行测定，
简单，快速和有效。
参考文献
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AN 1069