UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIORCiências

Efeito Neuroprotector de Diferentes Tipos deEfeito Neuroprotector de Diferentes Tipos de Pré-Condicionamento a Insultos IsquémicosPré-Condicionamento a Insultos Isquémicos

Blandina Isabel Oliveira EstevesDissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Bioquímica(2º ciclo de estudos)

Orientador: Prof. Doutor José Francisco da Silva Cascalheira(Faculdade de Ciências, Universidade da Beira Interior)

Covilhã, 27 de Junho de 2011

UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR CENTRO DE INVESTIGAÇÃO EM Ciências CIÊNCIAS DA SAÚDE

Efeito Neuroprotector de Diferentes Tipos deEfeito Neuroprotector de Diferentes Tipos de Pré-Condicionamento a Insultos IsquémicosPré-Condicionamento a Insultos Isquémicos

Blandina Isabel Oliveira EstevesDissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Bioquímica(2º ciclo de estudos)

Orientador: Prof. Doutor José Francisco da Silva Cascalheira(Faculdade de Ciências, Universidade da Beira Interior)

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Covilhã, 27 de Junho de 2011

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O conteúdo desta dissertação é da exclusiva responsabilidade da autora

(Blandina Isabel Oliveira Esteves)

A aprendizagem contínua implica dedicar algum tempo ao seu desenvolvimento, de forma a assegurar o sucesso no trabalho e em outras áreas da vida. Se não gosta de aprender apenas pelo prazer de aprender, pense nisso como um investimento.

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Mark Greener

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Dedicatória

A presente dissertação de mestrado em Bioquímica é dedicada à minha Mãe e ao Prof. Doutor Francisco Cascalheira!

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Agradecimentos

Não há palavras que expressem a enorme gratidão a todos aqueles que ajudaram, incentivaram, apoiaram, contribuíram, quer directa ou indirectamente, para que a realização deste trabalho de investigação fosse possível.

Em primeiro lugar quero agradecer ao Professor Doutor José Francisco da Silva Cascalheira pela orientação científica ao longo do desenvolvimento deste trabalho de investigação, assim como, durante a escrita da dissertação de mestrado. Muito obrigada pela motivação, apoio, companheirismo, seriedade, persistência, compreensão, amabilidade, pelos seus conselhos e disponibilidade demonstrados. O meu muito obrigado!

Quero agradecer aos meus colegas do grupo de investigação do Professor Cascalheira: Cláudia, André e Mónica pelo companheirismo, apoio e amizade, principalmente, pelo espírito de entreajuda que se criou no interior do nosso grupo de investigação. Ao IMM, nomeadamente, ao aluno de doutoramento André Jerónimo e a sua orientadora Profª Drª Maria José Diógenes pela cooperação, ajuda e disponibilidade.

À UBI e nomeadamente ao Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS). Às técnicas de laboratório, Sofia e Margarida, que desde sempre se mostraram disponíveis para ajudar e preocupadas pelo bom funcionamento do CICS. Bem como, as colegas dos laboratórios do CICS, pelo excelente companheirismo, apoio e amizade.

Aos meus colegas de trabalho do TGB e nomeadamente ao meu Patrão Antero Brancal, que desde sempre se mostrou compreensivo face à finalidade da minha estadia na Covilhã, trabalhar para pagar os estudos, nomeadamente o mestrado. Ao Pablito, Fabini, Mara, Dona Zita, Ti Rui, Carina, Susaninha que desde sempre foram amigos e companheiros ao longo de muitas horas de trabalho no TGB.

Quero agradecer aos meus amigos, que desde sempre me incentivar nas minhas decisões, bem como, nunca desistiram de me apoiar face às dificuldades a que estive sujeita durante o decorrer do trabalho de investigação. Em particular ao Boni, Moni, Sónia, Silvia, Fati, Olga e entres outros. Sem eles não teria sido possível manter o optimismo e a coragem necessária para desenvolver o meu trabalho de investigação.

Ao Filipe, que esteve sempre presente e nunca deixou de me apoiar ao longo deste trabalho. Principalmente porque nunca deixou de acreditar em mim. Muito obrigada pelo carinho e amor dedicados!

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E, por último, quero agradecer aos meus pais, que sem eles nada seria possível! Em especial à minha mãe, que só quer o “melhor” para a filha!

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Resumo

O cérebro requer um fornecimento contínuo de oxigénio e glucose para manter a sua função. A actividade neuronal depende principalmente da disponibilidade de oxigénio, pelo que, requer o contínuo aprovisionamento de oxigénio e glucose. Dados experimentais e clínicos sugerem que a privação de oxigénio e/ou glucose (POG) altera a produção de energia no cérebro e gera radicais livres, que podem conduzir a morte neuronal. O acidente vascular cerebral (AVC) isquémico agudo é uma das principais causas de mortalidade e aproximadamente 80% dos AVC são causados por AVC isquémico. O cérebro é particularmente vulnerável à isquémia (POG), particularmente, o cérebro adulto. A lesão celular isquémica tem sido implicada na morte celular após vários tipos de cirurgia. Os procedimentos cirúrgicos, muitas vezes, envolvem a interrupção temporária ou permanente do fornecimento de sangue às células ou tecidos e, assim, induzem dano celular isquémico. O fenómeno de pré-condicionamento a insultos neurotóxicos consiste no facto de a aplicação prévia de um insulto ligeiro, não neurotóxico, prevenir o dano causado por um insulto maior aplicado posteriormente. Estudos anteriores demonstraram que insultos subletais isquémicos podem pré-condicionar e, assim, proteger os tecidos, como coração e cérebro de insultos subsequentes (de maior intensidade).

Estudos anteriores indicam que em culturas de fatias de cérebro, obtidas a partir de ratos recém nascidos, o efeito protector obtido por pré-condicionamento com um insulto isquémico ligeiro (pré-condicionamento isquémico - IPC), é dependente da activação dos receptores A1 da adenosina (A1Rs). Por outro lado, agonistas dos A1R aplicados antes do insulto neurotóxico (pré-condicionamento químico - CPC), diminuem o dano celular causado por este em alguns modelos experimentais. No entanto, o efeito quer do pré-condicionamento isquémico quer do pré-condicionamento químico, com agonistas do A1R, em animais adultos não está esclarecido, apesar da resistência à isquémia ser menor em animais adultos.

No presente trabalho, o efeito do pré-condicionamento a insultos isquémicos neurotóxicos, por aplicação de insultos isquémicos ligeiros foi comparado com o efeito do pré-condicionamento por aplicação de agonistas do A1Rs, em fatias recém

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preparadas de hipocampo de ratos adultos. O efeito neuroprotector do pré-condicionamento foi avaliado por quantificação da sobrevivência celular e da morte celular (apoptose/necrose). A quantificação da tolerância isquémica induzida foi investigada através de diferentes métodos, tais como: método do cloreto de 2,3,5- Trifeniltetrazólio (TTC) e avaliação da actividade da caspase-3.

Com base na avaliação, por quantificação da sobrevivência celular (TTC), do efeito do pré-condicionamento a insultos isquémicos, por aplicação de insultos isquémicos ligeiros não neurotóxicos, observou-se que o pré-condicionamento com dois insultos isquémicos ligeiros (3 minutos de POG) face à aplicação de um insulto isquémico neurotóxico (20 minutos de POG) 3 horas depois, apresentava efeito neuroprotector (22,8% de aumento da sobrevivência neuronal).

Em relação à avaliação, por quantificação da viabilidade celular (TTC), do efeito do pré-condicionamento químico a insultos isquémicos, por aplicação de agonistas do receptor A1 da adenosina, os resultados sugerem que o pré-condicionamento com CPA (10 M durante 20 minutos) poderá ter um efeito neuroprotector (7% de aumento de viabilidade celular) face à aplicação de um insulto isquémico severo (20 minutos de POG). Contudo, a neuroprotecção conferida pelos agonistas dos A1R é apreciavelmente inferior à conferida pelo pré-condicionamento isquémico (7% versus 22,8%). Desta forma, depreende-se que a tolerância isquémica induzida pelo IPC, embora possa ser dependente da activação dos A1Rs, no entanto, eles por si só, não são suficientes para reproduzir o efeito do IPC. Ou seja, a neuroprotecção conferida depende da activação de A1R como sendo parte integrante de um conjunto de vias necessárias para a constituição do processo de neuroprotecção, conferindo tolerância isquémica transitória ou prolongada. Relativamente à duração do efeito promovido pelo pré-condicionamento, não sabemos se se trata de um efeito momentâneo de curta duração (transitório) ou tardio (prolongado).

PALAVRAS-CHAVE: Pré-condicionamento (PC), Privação de oxigénio e glucose (POG), isquémia cerebral, Adenosina, N6-ciclopentiladenosina (CPA), receptores de adenosina do tipo A1 (A1Rs), Neuroprotecção.

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Abstract

The brain requires a continuous supply of oxygen and glucose to maintain their function. The neuronal activity depends mainly on the availability of oxygen, therefore, requires continuous supply of oxygen and glucose. Experimental and clin-ical data suggest that deprivation of oxygen and/ or glucose (OGD) alters the pro-duction of energy in the brain and generates free radicals, which can lead to neu-ronal death. The cerebral vascular accident (CVA) is an acute ischemic major cause of mortality and approximately 80% of strokes are caused by ischemic stroke. The brain is particularly vulnerable to ischaemia (OGD), particularly the adult brain. The cell damage has been implicated in ischemic cell death after various types of surgery. Surgical procedures often involve the temporary or permanent interruption of blood supply to cells or tissues and thereby induce ischemic cell damage. The phenomenon of preconditioning to neurotoxic insult consist in fact that the prior application of a mild insult, not neurotoxic, prevent the damage caused by a greater insult applied later. Previous studies have shown that sublethal ischemic insults may pre-condition and thereby protect tissues such as heart and brain to subse-quent insults (highest intensity).

Previous studies indicate that in cultured brain slices obtained from newborn rats, the protective effect obtained by preconditioning with a mild ischemic insult (ischemic preconditioning - IPC), is dependent on the activation of adenosine A1 re-ceptor (A1R). Moreover, A1Rs agonists applied prior to neurotoxic insult (chemical preconditioning - CPC), reduce cell damage caused by the insult in some experimen-tal models. However, the effect of either ischemic preconditioning or chemical pre-conditioning, with A1R agonist, in adult animals is unclear, despite the less resis-tance to ischemia in adult animals.

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In this study, the effect of preconditioning to ischemic neurotoxic insults by applying mild ischemic insults was compared with the effect of preconditioning by applying A1RS agonists in sliced freshly prepared adult rat hippocampus. The neuro-protective effect of preconditioning was assessed by quantification of cell survival and cell death (apoptosis / necrosis). The quantification of induced ischemic toler-ance was investigated using different methods, such as method of the 2,3,5 - triph-enyltetrazolium chloride (TTC) and assessment of caspase-3 activity.

Studying by quantification of cell survival (TTC), the effect of preconditioning to ischemic insults, by applying mild ischemic non neurotoxic insults, it was ob-served that the preconditioning with two mild ischemic insults (3 minutes POG) showed neuroprotective effect (22.8% increase in neuronal survival) against the application of a severe ischemic insult (20 minutes OGD) 3 hours later.

Studying by quantification of cell viability (TTC), the effect of chemical pre-conditioning to ischemic insults, by applying agonists of adenosine A1 receptor, the results suggest that preconditioning with CPA (10 M for 20 minutes) may have a neuroprotective effect (7% increase in cell viability) against the application of a se-vere ischemic insult (20 minutes OGD). However, the neuroprotection produced by A1R agonists is appreciably lower than that conferred by ischemic preconditioning (7% versus 22.8%). Thus, it appears that the ischemic tolerance induced by IPC, although it may be dependent on the activation of A1RS, however, are not sufficient alone to reproduce the effect of IPC. That is, the neuroprotection afforded depends on the activation of A1R as part of a set of pathways necessary to the process of neuroprotection, producing transient or prolonged ischemic tolerance. About the duration of the effect promoted by preconditioning, we do not know whether it is a momentary effect of short duration (transient) or late (prolonged).

KEY-WORDS: Preconditioning (PC), Oxygen-glucose deprivation (OGD), Cerebral ischemia, Adenosine, N6-cyclopentyladenosine (CPA), A1 adenosine re-ceptor (A1Rs), Neuroprotection.

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Indice

DEDICATÓRIA vi

AGRADECIMENTOS viii

RESUMO x

PALAVRAS-CHAVE xi

ABSTRACT xiii

KEY-WORDS xiii

INDICE xv

LISTA DE FIGURAS xviii

LISTA DE TABELAS xx

LISTA DE ACRÓNIMOS xxii

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. Isquémia Cerebral 1

1.2. Diferentes tipos de pré-condicionamento 3

1.2.1. Pré-condicionamento isquémico (IPC) 3

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1.2.2. Pré-condicionamento químico (CPC) 6

1.2.2.1. Adenosina e o Sistema Nervoso 6

1.2.2.2.1. Origem e Regulação da Adenosina Extracelular 8

1.2.2.2.2. Tipos de receptores de adenosina: A1R, A2AR, A2BR e A3R

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1.2.3. Relação entre IPC e activação dos A1Rs 11

1.2.4. Outros Tipos de Pré-condicionamento 14

1.3. Mecanismos de neuroprotecção (sobrevivência neuronal): Tolerância

Isquémica

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1.4. Metodologias utilizadas no estudo do Pré-Condicionamento 18

1.4.1. Metodologias para avaliar e quantificar a Sobrevivência/Morte

neuronal

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2. OBJECTIVOS 24

3. PARTE EXPERIMENTAL 25

3.1 . Reagentes 25

3.2. Material e Instrumentação 25

3.3. Procedimento Experimental 26

3.3.1. Sistema de perfusão – Implementação e Optimização 26

3.3.2. Preparação de fatias de hipocampo 28

3.3.3. POG in vitro (Privação de oxigénio e glucose) 32

3.3.4. Diferentes tipos de pré-condicionamento 31

3.3.4.1. Pré-condicionamento isquémico (IPC) 32

3.3.4.2. Pré-condicionamento químico 32

3.3.5. Métodos para avaliação e quantificação da sobrevivência/morte neuronal

33

3.3.5.1. TTC (Viabilidade celular através da actividade respiratória mitocondrial)

33

3.3.5.2. Actividade da Caspase-3 (Morte neuronal por apoptose) 35

3.3.5.3. Actividade da LDH libertada (Morte neuronal por necrose)

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xvii

3.4. Análise Estatística 39

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 42

4.1. Efeito neuroprotector do Pré-condicionamento Isquémico 38

4.2. Efeito neuroprotector do Pré-condicionamento Químico: CPA e Adenosina

44

4.3. Discussão sobre as Metodologias Utilizadas 46

4.4. Perspectivas Futuras 48

5. CONCLUSÕES 50

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51

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Lista de Figuras

Fig 1.1. Representação esquemática, de forma simplificada, da isquémia cerebral, e consequente indução da cascata que leva à disfunção sináptica.

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Fig 1.2. Mediadores de neuroprotecção e tolerância. 4Fig 1.3. Metabolismo e transporte da adenosina, com indicação dos locais de acção de vários inibidores de enzimas.

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Fig. 1.4. Distribuição dos receptores de adenosina de elevada afinidade (A1, A2A e A3 humanos) nas principais regiões do sistema nervoso central, onde a adenosina tem sido proposta interferir com disfunções cerebrais e algumas patologias (Adaptado de Ribeiro et al., 2003).

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Fig 1.5. Estruturas moleculares da Adenosina, CPA e DPCPX (Adaptado de Eschke et al., 2001; Feoktistov and Biaggioni, 1997; Jacobson et al., 1999).

11

Fig 1.6 Esquema simplificado que descreve as vias de sinalização básicas envolvidas no IPC e na isquémia em mamíferos.

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Fig. 1.7. Esquema simplificado que resume algumas vias básicas de sinalização envolvidas na neuroprotecção conferida pelo IPC cerebral.

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Fig 3.1. Cell strainer. 25Fig. 3.2. Micrótomo. 26Fig 3.3. Sistema de perfusão. 2

6Fig. 3.4. Circuito de perfusão individual. 26Fig 3.5. Bomba peristáltica. 27Fig. 3.6. Ilustração representativa da constituição de uma câmara de perfusão.

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Fig 3.7. Extracção do cérebro dos ratos. 29Fig 3.8. Extracção do hipocampo de cérebros de ratos. 29Fig 3.9. Pré-condicionamento químico com CPA e adenosina. 32Fig. 3.10. Conversão do TTC em formazan: 1,3,5-trifenillformazan. 33Fig.3.11. Imagem representativa de fatias coradas pelo TTC a 0,05%. 34Fig 3.12. Fluorímetro e placa opaca de 96 poços para fluorescência. 37Fig. 3.13. Gráfico representativo da determinação de proteínas totais de amostras de fatias de cérebro, através do Kit BioRad DC.

38

Fig. 3.14. Recolha e concentração de LDH libertada. 39Fig 3.15. Reacção de conversão do piruvato a lactato, catalisada pela LDH. 39Fig 4.1. Comparação entre a aplicação de um insulto não tóxico (1xIPC) versus aplicação de dois insultos não neurotóxicos (2xIPC) no pré-condicionamento isquémico.

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Fig 4.2. Efeito do IPC no decréscimo da viabilidade celular induzida por um insulto isquémico.

42

Fig. 4.3. Efeito neuroprotector conferido pelo IPC na isquémia cerebral. 43

Fig. 4.4. Efeito do pré-condicionamento com CPA (1-30 µM) no decréscimo da viabilidade celular induzida por um insulto isquémico.

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Fig 4.5. Exemplificação do sistema com reservatórios de incubação. 49

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Lista de Tabelas

Tabela 4.1. Absorvência obtida (a 485nm) após incubação das fatias com TTC (0,05% e 2%, m/v) durante 1hora e 30 minutos em câmaras de perfusão (1mL/min) e em gobelés.

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Lista de Acrónimos

AC Ciclase do adeniloADA Desaminase da adenosinaADO AdenosinaADP Difosfato de adenosina AK Cinase de adenosinaAMP 5´ - monofosfato de adenosinaAOPCP , - metileno ADPApaf-1 Factor de activação de protease associada à apoptose 1A1R Receptores de adenosina do tipo A1

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A2AR Receptores de adenosina do tipo A2A

A2BR Receptores de adenosina do tipo A2B

A3R Receptores de adenosina do tipo A3ATP Trifosfato de adenosinaAVC Acidente vascular cerebralBad Proteína pró-apoptótica da família Bcl-2Bax Bcl- 2– associada à proteína XBcl-2 Proteína anti-apoptótica Bcl-22-CADO 2- CloroadenosinaCPA N6 - ciclopentiladenosinaCCPA 2-Cloro-N6 - ciclopentiladenosinaCKA Cinase activadoraCO2 Dióxido de carbonoCPC Pré-condicionamento QuímicoCREB Proteína de ligação ao elemento reactivo ao AMPcCyt c Citocromo cDAG DiacilglicerolDCF DeoxicoformicinaDMPX 3,7-Dimetil-1-propargilxantinaDPCPX 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantinaDNA Ácido desoxirribonucleicoDTT DitiotreitolEHNA Eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenosinaEcto ATPase Difosfohidrolases ectoATPEcto-PDE EctofosfodiesteraseERO Eritropoietinaei Transportador de nucleósidos equilibrador - insensíveles Transportador de nucleósidos equilibrador - sensívelFADD “Fas Adaptor Death Domain” – Adaptador da FAS com domínio de morte[H+] Concentração de H+

HIF Factor indutor de hipóxiaIAPs Proteínas inibidoras da apoptoseIPC Pré-condicionamento isquémico5-IT IodotubercidinaKATP Canais de potássio dependentes de ATPLDH Desidrogenase do lactatomRNA RNA mensageiroN2 AzotoNAD+ Difosfato de Nicotinamida e adenina

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NFB Factor nuclear BMAPKs Cínases de proteínas activadas por mitogénioMCAO Oclusão da artéria cerebral médiaMnSOD Dismutase do superóxido dependente de manganêsNBMPR NitrobenziltioinosinaNMDA N-metil-D-aspartatoNO Óxido nítricoNOS Síntase do óxido nitricoO2 OxigénioPARP Polimerase da Poli (ADP-ribose)PCO2 Pressão de dióxido de carbonoPDE Fosfodiesterase de AMPc POG Privação de oxigénio e glucosePVC Cloreto de poliviniloRas “RAt Sarcoma protein”ROS Espécies reactivas de oxigénioR-PIA N6- (R) - Fenilisopropiladenosina rTNF Receptores do factor de necrose tumoralSAH S-adenosilhomocisteínaSN Sistema Nervoso STP Via de transdução de sinalTNF Factor de Necrose TumoralTTC Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólioUV UltravioletaVEGF Factor de crescimento endotelial vascularЄPKC Cinase C de proteína do tipo epsilon

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