Ubiquitin: Ein regulatorisches Wunderwerk

[1]

Victoria VaaßenDrug research (M.Sc.)11.07.2018

Breaking news: One protein to rule them all

Häufigste Todesursachen in 2015 (Stat. Bundesamt)

[2]

Ubiquitin: The one to rule them all

[3]

Ubiquitin markiert Zielproteine auf verschiedene Wege

Zielprotein

Ub

Zielprotein

Mono-Ubiquitinierung

Multiple mono-Ubiquitinierung

Poly-Ubiquitinierung

Ub Ub

Ub

UbUb

Zielprotein

UbUb

UbUb

Ub

UbUb

Ub UbUb

UbUb

Ub

Ub

Ub

Ub

UbUb

Ub

Diverse zelluläre

und physiologische

Folgen

(Grice & Nathan, 2016)

Ubiquitin Struktur

o 76 Aminosäuren (~ 8,5 kDa)

o Hoch konserviert in Eukaryoten

o Kompaktes, globuläres Protein

o Stabile �-Faltblatt Struktur

o Verknüpfung an Zielprotein über flexiblen C-Terminus (rot)

o Bildung einer Isopeptid-Bindung zwischen C-terminalem Glycin

und der �-Aminogruppe eines Lysin-Restes am Zielprotein[1]

(Schreiber & Peter, 2014), (Berg, Stryer & Tymoczko, 2013)

Ubiquitin-Ketten Topologie

o Bildung von Ubiquitin-Ketten über Lysin-Reste im Ubiquitin-

Molekül

o Ubiquitin mit 7 Lysin-Resten + N-terminales Methionin

8 mögliche Verbindungsarten

o Verschiedene lineare sowie verzweigte Ketten-Arten möglich

[1]

(Schreiber & Peter, 2014), (Kleiger & Mayor, 2014)

Zielprotein

K 48(PDB ID: 1AAR)

K 63(PDB ID: 2JF5)

N-terminal(PDB ID: 2W9N)

Verknüpfungsart bestimmt Konformation der Ub-Kette und dadurch die Funktion.

Ubiquitin-Ketten Topologie - Beispiele

[3]

[3]

Ubiquitin: The one to rule them all

Wie erfolgt Ubiquitinierung am Zielprotein?

o Ubiquitinierung erfolgt über katalytische Kaskade von 3 Enzymen:• E1 = Ub-aktivierendes Enzym• E2= Ub-konjugierendes Enzym• E3= Ubiquitin-Protein-Ligase

[4]

(Berg, Stryer & Tymoczko, 2013)

Letzter Schritt der katalytischen Kaskade

Zielprotein

Ubiquitin

Glycin

Carboxylgruppe

Lysin

�-Aminogruppe

Ubiquitin

Zielprotein

Isopeptid-Bindung

E3

Ubiquitinierung erfolgt durch katalytische Kaskade

Wichtige Eigenschaften der Enzyme:

o Große Unterschiede in der Spezifität:

E1 < E2 < E3

o Große konformationelle Änderungen während der Katalyse

o Meist kein klar definiertes katalytisches Zentrum

2 E1 Enzyme

~ 40 E2 Enzyme

~ 700 E3 Enzyme

Spe

zifität

(Huang & Dixit, 2016), (Kleiger & Mayor, 2014)

Entscheidende Aufgabe von Ubiquitin: Markierung von alten/fehlgefalteten Proteinen für den proteasomalen Abbau

o In Eukaryoten: Abbau über 26S-Proteasom

Ubiquitin-Proteasom-System

o 26S Proteasom = Makromolekulare Protease

o Komplex aus 2 Komponenten:

- Katalytische 20S Untereinheit (2 �- & 2 proteolytische �-Ringe)

- Regulatorische 19S Untereinheit („Cap“)

o Fassartige Struktur

o Abbau der Proteine in Peptide von ca. 3-25 AS Länge

o Ubiquitin wird recycled [5]

(Schreiber & Peter, 2014), (Gadhave et al., 2016), (Ciechanover & Kwon, 2015), (Kleiger & Mayor, 2014)

Proteasomaler Abbau im Überblick

[6]

K 48(PDB ID: 1AAR)

K 63(PDB ID: 2JF5)

Hohe Affinität zu

Ub-Rezeptoren

Niedrige Affinität

zu Ub-Rezeptoren

Abgebautes Protein

Abgebautes Protein

Selektivität des proteolytischen Abbaus

(Grice & Nathan, 2016), (Schreiber & Peter, 2014)

• Proteasom gewährleistet stetige Qualitätskontrolle in der Zelle:

o Ermöglicht den ordnungsgemäßen Abbau gemäß der Halbwertszeit

cytosolischer Proteine

o Bewirkt den Abbau von fehlgefaltetem Protein & verhindert die

Bildung toxischer Aggregate

• Ca 30% der neu synthetisierten Proteine einer Zelle werden aufgrund von

Fehlfaltung über UPS abgebaut

• Insgesamt werden über 80% der normalen oder abnormalen

cytosolischen Proteine über UPS abgebaut

Wozu die ganze Mühe?

[8]

(Zheng et al., 2016), (Gadhave et al., 2016), (Berg, Stryer & Tymoczko, 2013), (Kleiger & Mayor, 2014)

Wie wird differenziert, welche Proteine abgebaut werden?

Normal gefaltete Proteine:

o Halbwertszeit cytoplasmatischer Proteine größtenteils durch

aminoterminalen Rest bestimmt: N-terminales Degron

Es gibt stabilisierende Reste & destabilisierende Reste

- Destabilisierende N-Termini wie z.B. Arginin & Lysin werden von E3

Enzymen erkannt & Proteine schnell mit Ubiquitin für den Abbau markiert

Fehlgefaltete Proteine:

o Erkennung der Fehlfaltung durch Chaperone (Faltungshelfer) anhand von

freiliegenden hydrophoben Ketten

Arg

Arg

(Amm, Sommer & Wolf, 2014), (Berg, Stryer & Tymoczko, 2013)

(Fehl-)Faltung von Proteinen

o Vorgesehene Faltung eines Proteins ist

determiniert durch AS-Abfolge

o Richtige Faltung ist unter physiologischen

Bedingungen thermodynamisch bevorzugt

o Ein ungefaltetes Protein kann theoretisch

unzählige Konformationen einnehmen

Chaperone helfen dem Protein, die richtige Konformation zu finden [9]

(Berg, Stryer & Tymoczko, 2013), (Amm, Sommer & Wolf, 2014)

Kann ein Protein endgültig nicht richtig gefaltet werden, kommt es zur Korrespondenz zwischen Chaperonen und UPS

Was passiert, wenn die Aktivität des UPS nachlässt?

(Fehl-)Faltung von Proteinen

ProteinSynthese

Ungefaltet/Fehlgefaltet

Chaperon Chaperon

Aggregat

Endgültig fehlgefaltet

Ubiquitin Proteasom System

Ubiquitin-Proteasom-System wird aktiviert

Fehlgefaltete Proteine werden abgebaut & zelluläre Schäden durch Protein-Aggregate werden verhindert

[10]

(Amm, Sommer & Wolf, 2014)

Dysregulation von UPS Charakteristikum vieler pathogener Veränderungen

[11]

Gemeinsamkeiten vieler neurodegenerativer Erkrankungen

o Protein-Fehlfaltungs-Störungen

o Native oder mutierte Proteine aggregieren leicht zu Oligomeren

• Hoher Anteil an �-Faltblättern

• (Oftmals) resistent gegen proteolytische Abbauwege

• Formen Einschlüsse/extrazelluläre Plaques, mit hochgradig

geordneten und fibrillären Strukturen

o Auslösen von Kaskade neurodegenerativer Prozesse die zum

neuronalen Tod führen

o Pathogene Protein-Aggregate hemmen zunehmend die Funktion

des UPS Teufelskreis [12]

(Zheng et al., 2016), (Gadhave et al., 2016), (Ciechanover & Kwon, 2015)

Beispiele neurodegenerativer Krankheiten

Wodurch kommt es zur Aggregation dieser Proteine?

o Mutationen stören bei der Proteinfaltungo Spontane Fehlfaltungen durch

1) posttranslationale Modifikationen (z.B. Hyperphosphorylierung von Tau)2) Endoproteolytische Spaltung (z.B. Aβ)

Erkrankung Klinisches BildHauptverantwortliches

Protein+ viele weitere

Proteine

verantwortlich ,

oftmals wichtige

Komponenten der

Protein-Qualitäts-

sicherung

Parkinson Beeinträchtigung der bewussten Bewegungs-

steuerung

Mutiertes α-Synuclein

Huntington Abbau von motorischen & kognitiven

Fähigkeiten, Verlust von Selbstwahrnehmung,

Depression, Ängstlichkeit

Mutiertes Huntingtin

(>35 polyQ)

ALS Paralytische Erkrankung mit Gang-, Sprech-, und

Schluckstörungen

Mutiertes SOD-1 & TDP-43

Alzheimer Gedächtnisverlust, Demenz, Veränderungen in

Verhalten und Sprache

β-Amyloid, Tau

(Amm, Sommer & Wolf, 2014), (Zheng et al., 2016), (Ciechanover & Kwon, 2015)

Neuronen sind besonders betroffen

Gründe für die hohe Anfälligkeit für Anhäufung von cytotoxischen Proteinen:

1) Neuronen = Postmitotische Zellen

2) Neuronen besitzen einzigartige Struktur

Menge an toxischen Aggregaten innerhalb der Zellen kann nicht durch Zellteilung gemindert werden

Keine „Verteilung“ der Aggregate auf Tochterzellen möglich

Zellausläufer wie Axone & Dendriten können sehr weit reichen

Weg der Aggregate, von den Zellfortsätzen zum Proteasom-haltigen Centrosom, z.T. sehr weit

Protein-Aggregationen sind wahrscheinlicher

[13]

[14]

(Amm, Sommer & Wolf, 2014), (Dahlmann, 2007), (Ciechanover & Kwon, 2015)

− Therapie neurodegenerativer Erkrankungen:

o Bisher: Symptomatische Besserung der Beschwerdeno Abbau von neurotoxischen Aggregaten & Verhindern des

Fortschreiten der Krankheit noch nicht möglich

− Ubiquitin als universelles System zum Abbau beliebiger, unerwünschter Proteine

− „The sky is the limit“: Ubiquitin-System theoretisch ein attraktives drug target zur Behandlung unzähliger Erkrankungen

− Kausative Behandlung statt nur symptomatischer Behandlung möglich

Ubiquitin – Eine therapeutische Goldgrube?

[15]

(Huang & Dixit, 2016), (Gadhave et al., 2016)

Therapieansätze für das UPS

− PROTAC-System:o PROTAC = Protein-targeting chimeric molecules

Nachteile:• Schwierigkeiten im Finden von spezifischen Bindepartnern für das adressierte Protein & die E3 Ligase• Mutationen im Zielprotein könnten Bindung von PROTACs verhindern• Sehr große und komplexe Moleküle notwendig Komplexe Synthesen, schlechte Bioverfügbarkeit und

Membranpermeabilität • Schwierige Pharmakokinetik durch Hook-Effekt

[16]

(Huang & Dixit, 2016)

Therapieansätze für das UPS

− Hydrophobic tagging:

Vorteil:• Es muss nur spezifischer Bindepartner für Zielprotein gefunden werden, nicht zusätzlich für E3 Ligase

Nachteile:• Große Molekülgröße, schlechte Pharmakokinetik & Bioverfügbarkeit

[16]

(Huang & Dixit, 2016)

Fazit: Ubiquitin – Eine therapeutische Goldgrube?

[15]

Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit!

Quellenverzeichnis:

Amm, I., Sommer, T., & Wolf, D. (2014). Protein quality control and elimination of protein waste: The role of the ubiquitin–proteasome system. Biochimica

Et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1843(1), 182-196. doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.06.031Ciechanover, A., & Kwon, Y. (2015). Degradation of misfolded proteins in neurodegenerative diseases: therapeutic targets and strategies. Experimental &

Molecular Medicine, 47(3), e147-e147. doi: 10.1038/emm.2014.117

Dahlmann, B. (2007). Role of proteasomes in disease. BMC Biochemistry, 8(Suppl 1), S3. doi: 10.1186/1471-2091-8-s1-s3Gadhave, K., Bolshette, N., Ahire, A., Pardeshi, R., Thakur, K., & Trandafir, C. et al. (2016). The ubiquitin proteasomal system: a potential target for the

management of Alzheimer's disease. Journal Of Cellular And Molecular Medicine, 20(7), 1392-1407. doi: 10.1111/jcmm.12817

Grice, G., & Nathan, J. (2016). The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular And Molecular Life Sciences, 73(18), 3497-3506. doi:

10.1007/s00018-016-2255-5Huang, X., & Dixit, V. (2016). Drugging the undruggables: exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research, 26(4), 484-498. doi:

10.1038/cr.2016.31

Kleiger, G., & Mayor, T. (2014). Perilous journey: a tour of the ubiquitin–proteasome system. Trends In Cell Biology, 24(6), 352-359. doi:

10.1016/j.tcb.2013.12.003Schreiber, A., & Peter, M. (2014). Substrate recognition in selective autophagy and the ubiquitin–proteasome system. Biochimica Et Biophysica Acta (BBA)

- Molecular Cell Research, 1843(1), 163-181. doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.03.019

Zheng, Q., Huang, T., Zhang, L., Zhou, Y., Luo, H., Xu, H., & Wang, X. (2016). Dysregulation of Ubiquitin-Proteasome System in Neurodegenerative Diseases.

Frontiers In Aging Neuroscience, 8. doi: 10.3389/fnagi.2016.00303Berg, J., Stryer, L., & Tymoczko, J. (2013). Biochemie. Berlin [u.a.]: Springer Spektrum.

Abbildungsverzeichnis:

[1] PDB ID: 1UBQ

[2] https://www.destatis.de/DE/ZahlenFakten/GesellschaftStaat/Gesundheit/Todesursachen/Todesursachen.html (03.07.18)

[3] Dr. Sonja Lorenz: Ubiquitin & autophagy, 2016

[4] Jeremy M. Berg: Stryer Biochemie. Springer Spektrum, 7. Auflage, S. 684

[5] https://www.researchgate.net/publication/279828511_Impact_of_proteasomal_immune_adaptation_on_the_early_immune_response_to_viral_

infection?_sg=tpPYj6nzcmXTkDHgwe6BiRvW-kgV2lq4kl6iiBYbEWH-CmJQdfJYs9iFlJjW5q1UyGUVzUGjNQ (03.07.18)

[6] Adaptiert von Marteijn, J., van der Meer, L., Smit, J., Noordermeer, S., Wissink, W., & Jansen, P. et al. (2009). The ubiquitin ligase Triad1 inhibits

myelopoiesis through UbcH7 and Ubc13 interacting domains. Leukemia, 23(8), 1480-1489. doi: 10.1038/leu.2009.57

[7] Gadhave, K., Bolshette, N., Ahire, A., Pardeshi, R., Thakur, K., & Trandafir, C. et al. (2016). The ubiquitin proteasomal system: a potential target for themanagement of Alzheimer's disease. Journal Of Cellular And Molecular Medicine, 20(7), 1392-1407. doi: 10.1111/jcmm.12817

[8] https://de.123rf.com/photo_39596278_qualitätskontrolle-umfrage-business-produkte-und-kunden-service-checkliste-mit-ausgezeichneten-wort-

mi.html (04.07.18)

[9] Amm, I., Sommer, T., & Wolf, D. (2014). Protein quality control and elimination of protein waste: The role of the ubiquitin–proteasome system. Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1843(1), 182-196. doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.06.031

[10] Modifiziert von http://www.physicallensonthecell.org/molecular-machinery/chaperone-aided-protein-folding (04.07.18)

[11] Dahlmann, B. (2007). Role of proteasomes in disease. BMC Biochemistry, 8(Suppl 1), S3. doi: 10.1186/1471-2091-8-s1-s3

[12] https://www.alz.org/brain_german/09.asp (05.07.18)[13] https://autoimmunbuch.de/?tag=alu-sequenzen (05.07.18)

[14] https://www.medizin-kompakt.de/neuron-nervenzelle- (05.07.18)

[15] https://de.stockfresh.com/image/2527155/treasure-chest (05.07.18)

[16] Huang, X., & Dixit, V. (2016). Drugging the undruggables: exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research, 26(4), 484-498. doi: 10.1038/cr.2016.31