This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

umsatz in der durch das Licht induzierten Dunkel-reaktion und der Energieumsatz im vollständigen Kreisprozeß. Von einer vierten Art von Energie-umsatz, dem ökonomischen, wollen wir hier absehen, weil er von unübersehbaren äußeren Faktoren ab-hängt.

Offenbar fehlen zur Zeit die Unterlagen, um den Energieumsatz in der Lichtreaktion oder in der

Dunkelreaktion zu berechnen; ja man wird sogar nunmehr alle früheren Berechnungen von photo-synthetischen Energieumsätzen — sowohl unsere eigenen wie die anderer — revidieren müssen.

Am ehesten wird man den Energieumsatz für den vollständigen Kreisprozeß berechnen können, näm-lich dann, wenn der Quantenbedarf pro Molekül entwickelten Sauerstoffs genauer bestimmt worden ist.

Über die Rolle des Wasserstoffperoxyds bei der Inhibition nach Dold, III: Die quantitative Bestimmung des Wasserstoffperoxyds im Speichel; Wasserstoffperoxyd als Ursache

der Hemmung des Bakterienwachstums

V o n R U D O L F TSCHESCHE, F R I E D H E L M K Ö R T E u n d JÖRN B E T H G E

Aus der Biochemischen Abteilung des Chemischen Staatsinstituts der Universität Hamburg und der Chirurgischen Klinik des Universitätskrankenhauses Eppendorf

(Z. Naturforschg. 6 b, 22- 24 [1951]; eingegangen am 5. Januar 1951)

Es wird die Menge des durch Mundstreptokokken im Speichel gebildeten Wasserstoffperoxyds größenordnungsmäßig bestimmt. Die Ursache der guten Extrahierbarkeit des H2Oa mit Äther wird zu klären versucht und auf ätherlösliche Speichelbestandteile zurückgeführt. In diesen ist wahrscheinlich auch die Ursache der Restinhibition zu suchen, die auftritt, wenn man Speichel auf Blut-Agar-Platten gegen geeignete Testbakterien untersucht. Sie bewirken, daß ein kleiner Teil des H 20 2 der Zerstörung durch die Blutkatalase entgeht, weil es an die Begleitstoffe chemisch gebunden wird unter Erhaltung der antibakteriellen Wirkung. Dieser gebundene Anteil des H 20 2 wird von dem Titanylsulfatreagens bei der quantitativen Bestimmung mit erfaßt.

In den vorangegangenen Mitteilungen1 haben wir über das Vorkommen von Wasserstoffperoxyd im

menschlichen Speichel berichtet, das seine Entstehung biochemischen Oxydationsprozessen verdankt, die von Mundstreptokokken wahrscheinlich mit Hilfe gelber Fermente ausgelöst werden. Die Zurückführung der antibiotischen Wirkung des Speichels auf Wasserstoff-peroxyd wurde neuerdings auch von F. H e g e m a n 2

erkannt. Es war nun wünschenswert, festzustellen, ob hierin die einzige Ursache der Speichelinhibition zu suchen sei, oder ob noch andere Faktoren daran An-

1 I.Mitt.: J . B e t h g e , K l . S o c h r i n g u. R . T s c h e s c h e , Z. Naturforschg. 2 b, 12 [1947]; II. Mitt.: dieselben, Z. Na-turforschg. 3 b, 330 [1948],

2 F. H e g e m a n n , Z. Hyg. Infekt.-Krankh. 131, 355 [1950]; Klin. Wschr. 28, 717 [1950]. — Während der Druck-legung erreichte uns eine Mitteilung von U. B e r g e r , Fri-bourg, daß er ebenfalls die antibiotische Wirkung des Spei-chels auf H2O2 hätte zurückführen können. Die Arbeit ist in der Z. Hyg. Infekt.-Krankh. im Druck. Gleichzeitig machte er uns auf eine Arbeit von R. T h o m p s o n u. A . J o h n s o n (J. Bacteriol. 54,53 [1947], aufmerksam, die zu gleicher Zeit wie wir zu entsprechenden Ergebnis-sen gelangt sind.

teil haben. Das Lysozym kann hierbei außer Betracht bleiben, da es vorwiegend gegen Luftkeime wirkt, deren Polysaccharidhüllen zerlegt werden, die aus N-Acetylglucosamin und einer Ketohexose aufgebaut sein sollen 3. Wir haben uns nur mit solchen Bakterien befaßt, die von Lysozym nicht beeinflußt werden. Zunächst haben wir versucht, die Frage in der Weise zu klären, daß wir die Hemmwirkung von Speichel in Agarplatten und Blutagarplatten gegen Testbakterien miteinander verglichen, in der Hoffnung, daß in den letzteren die Katalase das vorhandene H 2 0 2 zersetzen würde und dann keine Inhibition mehr feststellbar wäre. Es zeigte sich zwar, daß dann der größte Teil der antibiotischen Wirkung verschwand, aber häufig eine gewisse Restinhibition verblieb, deren Ursache zu klären war.

Zur Lösung dieses Problems lag uns zunächst daran, das im menschlichen Speichel v o r h a n d e n e Wasserstoff-peroxyd möglichst quantitativ zu bestimmen. Wir

3 M. E. E p s t e i n u. E. C h a i n , Brit. J. exp. Pa-thol. 21, 339 [1940].

wählten dazu die kolorimetrische Bestimmung mit Titanylsulfat4, die, wie wir fanden, mit wäßrigen H2Oä-Lösungen brauchbare Werte liefert. Die Mes-sung wurde im Beckman - Spektrophotometer vor-genommen durch Bestimmung der Extinktion beim Maximum der Absorption bei 410 m/u. Die H 2 0 2 -Be-stimmung mit Permanganat5 erwies sich als nicht so günstig, da in den Äther aus dem Speichel bei der Extraktion Begleitsubstanzen hineingelangten, die ebenfalls Permanganat verbrauchten. Man kann zwar die Geschwindigkeit der Entfärbung des K M n 0 4 als Maß für die H2Oä-Konzentration benutzen, die Werte mit Titanylsulfat sind jedoch besser reproduzierbar. Bemerkenswerterweise ließ sich das Verfahren mit Titanylsulfat nicht direkt auf Speichel anwenden, es trat keine Gelbfärbung auf, sondern erst dann, wenn das H 2 0 2 mit Äther dem Speichel entzogen worden war. Sechsmaliges Ausschütteln mit der 6-fachen Menge peroxydfreiem Äther genügte, um die anti-biotisch wirksame Komponente aus der wäßrigen Phase zu entfernen. Danach war keine Hemmwirkung auf Bakterien mit der Restlösung mehr festzustellen. Das H 2 0 2 ließ sich nunmehr mit Titanylsulfat nach dem Abdampfen des Äthers im Vakuum bei 5—10° quantitativ bestimmen. In mehreren Versuchen zeigte sich, daß es unter den angegebenen Bedingungen keine wesentliche Zersetzung erleidet. Von 65 mg H 2 0 2 wurden 64 mg nach dem Ausschütteln von 100 ccm 0,1-proz. wäßr. Lösung mit 6-mal 100 cm3

Äther in beiden Phasen zusammen nachgewiesen. Wurde die ätherische Lösung mit Ferrosulfat behan-delt, so war die antibiotische Wirkung des Äther-extraktes nach dem Eindampfen verschwunden. Wir bestimmten so die H202-Konzentration in dem von uns gewonnenen Speichel zu etwa 0 ,03%.

Da der Speichel direkt keine Färbung mit Titanyl-sulfat liefert, muß in ihm das H 2 0 2 in irgendeiner Bindung vorliegen, durch die es einerseits stabilisiert und aus der es andererseits durch Äther noch extra-hierbar ist. Stabilisatoren des H 2 0 2 sind in größerer Zahl bekannt6, ohne daß über die Art der Bindung im einzelnen schon genaue Vorstellungen vorzuliegen scheinen. Auf die Assoziation an Speichelbestandteile dürften auch zum Teil die widersprechenden Ergeb-nisse zurückzuführen sein, die die zahlreichen Arbei-ten zum Antibioseproblem des Speichels aufweisen. Wir haben auch versucht, aus rein wäßrigen Lösungen

4 K. F e i s t , Dtsch. Apothekerzeitung 51, 1110 [1936]. 5 N. A l l e n , Ind. Engng. Chem., Analyt. Edit. 2, 55

[1930].

das H 2 0 2 mit Äther zu extrahieren, mußten dabei aber feststellen, daß die Extraktion hier viel lang-samer erfolgt als bei Speichel. So ließen sich aus 100 ccm einer 0,1-proz. wäßr. H202-Lösung mit 6-mal 100 ccm peroxydfreiem Äther nur 18% in Äther brin-gen. Setzt man jedoch der H202-Lösung vorher 3 % Essigsäure hinzu, so erhöht sich der Anteil des H 2 0 2

im Äther auf 38%, mit 3 % Buttersäure auf 4 6 % , dgl. mit Caprylsäure. Fügt man zu der H2Oä-Lösung eine Suspension an Lecithin oder Cholesterin, so daß deren Menge etwa 0,1% ausmacht, so wandern nun-mehr 5 6 % des H 2 0 2 in den Äther. Wir möchten daher annehmen, daß im Speichel Begleitstoffe enthalten sind, die eine schnellere Aufnahme des H 2 0 2 in den Äther bewirken. Darauf weist auch die Tatsache hin, daß Ätherextrakte aus Speichel nach dem Abdampfen des Äthers und Aufnehmen mit Wasser eine ölige Trübung ergeben. Die Öltröpfchen sind jedoch nach Waschen mit Wasser antibakteriell unwirksam.

Während so die relativ schnelle Wanderung des biogenen H 2 0 2 aus dem Speichel in Äther eine plau-sible Erklärung findet, war weiter die Frage zu prü-fen, ob die ermittelte Menge H 2 0 2 ausreicht, um den antibiotischen Effekt des Speichels zu erklären. Wir haben daher Wasserstoffperoxydlösungen von etwa gleichem Gehalt, wie wir ihn im Speichel bestimmten, hergestellt und haben sie auf ihre hemmenden Wir-kungen gegen folgende Testbakterien untersucht: Staphylococcus aureus (Oxford), Pseudomonas pyo-cyaneus, Bac. mesentericus ruber und B. coli commune. Es zeigte sich auf Agarplatten eine Wachstumshem-mung von der gleichen Größenordnung wie bei Spei-chel, den Hjsmmeffekt dieser Lösungen gibt die nach-folgende Tabelle wieder.

Danach blieb nur noch die Frage der Restinhibition zu klären, warum auf Blutagarplatten die Blutkatalase nicht das gesamte H 2 0 2 des Speichels zersetzte und häufig eine geringe Bakterienhemmung erhalten blieb. Eine Deutung dieser Feststellung wäre dann gefun-den, wenn ein kleiner Teil des H 2 0 2 durch Bindung an einen ätherlöslichen Bestandteil des Speichels der zersetzenden Wirkung des Ferments entzogen würde. Eine solche Bindung anzunehmen, ergab sich ja schon aus der guten Extrahierbarkeit mit Äther. Sie müßte dann aber durch das Titanylsulfatreagens wieder ge-sprengt werden, da mit ihm offenbar das gesamte H 2 0 2 erfaßt wird. Bei der Durchsicht der Literatur

6 Ulimanns Enzyklopädie d. Techn. Wiss., Bd. 10, S.432 [1932]; I. M. K o l t h o f f u. A. I. M e d a l l a , J. Amer. chem. Soc. 71, 3789 [1949].

H2O2 1% 0,5% 0,1 °/o 0,05 % 0,01 °/o 0,005 °/o Kontrolle (Nährlösung)

Staphylococcus aureus 0 0 0 ( + ) + + + + + Bac. mesentericus ruber 0 ( + ) ( + ) ( + ) + + + + + + + + Pseudomonas pyocyaneus 0 ( + ) ( + ) + (+) + + + + + B. coli commune 0 0 ( + ) ( + ) (+) ( + ) + +

Zeichenerklärung: 0 Totale Hemmung, ( + ) einzelne Kolonien am Bande, + + . . . Wachstum

fanden wir die Angabe von C h a n c e 7 , daß Alkyl-peroxyde von Katalase nur sehr langsam gespalten werden, ferner wird von S w e r n 8 angegeben, daß Peressigsäure baktericid ist und Percaprylsäure die Titanylsulfatreaktion liefert. Da die Isolierung des ätherlöslichen Speichelbestandteils, der das H 2 0 2 vor der Katalase stabilisiert und vermutlich auch für die gute Extrahierbarkeit aus wäßriger Phase verantwort-lich ist, nur bei der Aufarbeitung größerer Speichel-mengen aussichtsreich erscheint, haben wir versucht, die Frage noch anderweitig zu prüfen. Es wurde eine 0,1-proz. HoOo-Lösung mit 3 % Essigsäure, Butter-säure und Caprylsäure sowie 0,1% Cholesterin und Lecithin in Suspension in Blutagarplatten gegen unsere Testbakterien untersucht. Dabei zeigte sich, daß wenigstens gegen Bac. mesentericus eine deut-liche Restinhibition festzustellen war.

Wir möchten daher glauben, daß zum mindesten bei den von uns gewählten Keimen die Inhibition allein oder zum ganz übertviegenden Teil auf Wasser-stoffperoxyd zurückgeht, das seine Bildung den Mund-

7 B. C h a n c e , J. biol. Chemistry 179, 1328, 1341 [1949].

8 D. S w e r n , Chem. Reviews 45, 7 [1949].

Streptokokken verdankt. Da die Mundhöhle die Ein-gangspforte zahlreicher Infektionen ist, dürfte diese Feststellung für die Infektionsabwehr nicht unwichtig sein.

Beschreibung der Versuche

Das verwendete Titanreagens wurde auf folgende Art hergestellt: 100 mgTiO, werden in 25 ccm konz. Schwefel-säure 30 Min. erhitzt. Unter schwacher Rauchentwicklung geht das TiOa in Lösung. Man füllt auf 100 ccm auf und filtriert eine geringe Trübung ab. Von der so erhaltenen Lösung setzen wir zu je 10 ccm der zu untersuchenden H202-Lösung 2 ccm hinzu und messen die Extinktion im Beckman-Spektrometer.

Abb. 1 zeigt, daß man am besten in einem Konzentra-tionsbereich von etwa 50-10-4% H 2 0 2 mißt. Abb. 2 gibt das Absorptionsspektrum der gefärbten H202-Lösung nadi Zugabe des Reagens wieder. Man erhält reproduzierbare Werte, wenn man jeweils vor dem Zusatz der Titanlösung' so weit verdünnt, daß ungefähr eine 50 • 10—4-proz. Lösung vorliegt. Dann setzt man zu 10 ccm 2 ccm Titanreagens und mißt die Extinktion bei 410 m,u.

Der Speichel wurde von Patienten mit nicht infektiösen, chirurgischen Erkrankungen gesammelt, die auch keine Sulfonamide oder Antibiotika erhalten hatten. Da größere Mengen Speichel benötigt wurden, sammelten wir diesen in sterilen Gefäßen täglich und bewahrten ihn im Eis-schrank auf. Nach 3—4 Tagen wurde er im allgemeinen der Untersuchung zugeführt.

Konz, in %

J_l gl 1 .1 | | | | | | | | | | | | | 500*10 320 360 WO 150 500

A. in m/t Abb. 1. Zur kolorimetrischen Bestimmung von Wasserstoffperoxyd mit Titanylsulfat. I: Abhängigkeit der Extinktion

von der Konzentration an H 2 0 2 . II: Absorptionsspektrum der H^O^-Lösung nach Zugabe des Reagens.