U�IVERSIDAD �ACIO�AL DE ASU�CIO�

FACULTAD DE CIE�CIAS EXACTAS Y �ATURALES

DEPARTAME�TO DE BIOLOGIA

ARTICULO CIE�TIFICO CODIGO DEL PROYECTO: FACEN/02/09

�OMBRE DEL PROYECTO: Morfología y micrografía del ka’a he’e, Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, provenientes de diferentes cultivares del país.

I�VESTIGADOR PRI�CIPAL: Lic. Bonifacia Benítez de Bertoni

CO-I�VESTIGADORES: Lic. Claudia Pereira S., Lic. Fidelina González, Ing. For. Siemens Bertoni, Lic. Carlos Molinas

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TITULO: Análisis cuantitativo foliar de Stevia rebaudiana (Bertoni)Bertoni, determinación del índice de empalizada y de estoma de especimenes cultivados en Caacupé, Cordillera.1

Bonifacia Benítez de Bertoni2, Claudia Pereira S3., Fidelina González4, Siemens Bertoni5, Carlos Molinas6

1 Investigación realizada en el Herbario FACEN-Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. 2 Lic. Ciencias, Biología-Prof. Titular del Área de Botánica,DITCODE-Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 3 Lic. Ciencias, Biología-Auxiliar de enseñanza-Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. 4 Lic. Ciencias, Biología-Auxiliar de enseñanza-Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. 5 Ing. Agrónomo y Forestal-Prof. Titular de Botánica-Facultad de Ciencias Agrarias.

6 Lic. Ciencias-Matemática Estadística-Prof. Titular de Estadística, DITCODE-Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

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RESUME� Stevia rebaudiana (Bertoni), es una especie perteneciente a la familia Asteraceae, cuyo

epicentro de origen es Paraguay, la parte aprovechada es principalmente la hoja. El objeto de

este trabajo es determinar índices estomáticos y de empalizada en muestras foliares de

muestras provenientes de cultivares de un vivero localizado en Caacupé, Departamento de

Cordillera, como parámetro para el control de calidad de muestras comerciales. Las hojas son

anfiestomáticas, con estomas anomociticos rodeados de 4-5 células epidérmicas, las paredes

anticlinales de la epidermis son de contorno ondulado. Los valores obtenidos son: índice de

empalizada = 3.0 (3.65) 4.5 y el índice de estomas = 10.0 (16.58) 26.0. Estas magnitudes

constituyen una herramienta complementaria para verificar la autenticidad de la especie en las

muestras comerciales.

Palabras claves: Stevia rebaudiana-Indice empalizada-Indice estomas ABSTRACT Stevia rebaudiana (Bertoni) is a species of the Asteraceae family, whose origin is the

epicenter of Paraguay, the leaf is mainly exploited. The purpose of this study is to determine

stomatal index and palisade leaf samples of cultivars samples from a nursery located in

Caacupe, Cordillera Department, as a parameter for quality control of commercial samples.

The leaves are amphistomatic; anomiocytic stomata surrounded with 4-5 epidermal cells,

anticlinal walls of epidermis are wavy edge. It was found that the lattice index = 3.0 (3.65) 4.5

and the stomatal index = 10.0 (16.58) 26.0. These figures are a complementary tool to verify

the authenticity of the species.

Key words: Stevia rebaudiana-lattice index-stomatal index

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1. I�TRODUCCIÓ�:

Stevia rebaudiana (Bertoni), es una especie perteneciente a la familia Asteraceae, cuyo

epicentro de origen es Paraguay.

Numerosos trabajos han sido realizados sobre S. rebaudiana (Bertoni) Bertoni,

abarcándose desde aspectos químicos, morfológicos, taxonómicos, genéticos, moleculares,

entre otros tipos de estudios. La mencionada especie es utilizada a nivel mundial por sus

propiedades edulcorantes.

Según la revisión taxonómica realizada por Cabrera, Colmes & Mc Daniel (1996) la

especie objeto de este trabajo de investigación, tiene como zona de distribución, Brasil y

Paraguay, en localidades específicas como Concepción y Amambay, según los registros de

colecta mencionados en el trabajo.

La parte aprovechada de la planta es principalmente la hoja, en consecuencia varios

son los estudios realizados sobre esta parte vegetativa. En otros países, se ha analizado en

trabajos llevados a cabo sobre la estructura foliar, características propias como la presencia de

estomas anomocíticos (Dematei Gregio & Moscheta, 2006), así como estudios sobre patrones

de distribución de la superficie foliar, para evaluar el desarrollo y el crecimiento de la planta

(Ramesch, Ramawat & Sing, 2007). Igualmente se realizó la descripción del desarrollo de los

trichomas glandulares por Rossi Monteiro et al (2001).

En el país, la realización de los trabajos se han focalizado sobre temas vinculados a la

producción, características del suelo, la siembra y plantación, los cuidados culturales, las

plagas y enfermedades, la cosecha, rendimiento y el almacenamiento (Bertoni, 1991). Así

mismo, el Ministerio de Agricultura y Ganadería (1996), hace referencia muy superficial a los

cultivares, mencionando la diversidad fenotípica y además menciona los métodos de

producción de muda y a la instalación del cultivo.

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Cabe mencionar, que no existen estudios realizados en el país, epicentro de origen de

la especie, sobre la morfología y anatomía de las partes vegetativas de cultivares, que son las

utilizadas para el aprovechamiento de S. rebaudiana (Bertoni)Bertoni,

El trabajo de investigación, tuvo como objetivo determinar Indices estomáticos y de

empalizada en muestras foliares de muestras provenientes de cultivares de un vivero

localizado en Caacupé, Departamento de Cordillera.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Diseño de Trabajo:

El diseño corresponde a un modelo de investigación descriptiva, con análisis e

interpretaciones de caracteres micrográficos de la epidermis foliar.

2.2. Sitio de procedencia del material estudiado:

Las muestras obtenidas y utilizadas para el estudio son provenientes de especimenes

obtenidos de un vivero de la Ciudad de Caacupé, Departamento de Cordillera.

2.3. Descripción de la especie:

La descripción se realizó teniendo en cuenta caracteres morfológicos de las partes

vegetativas y reproductivas de material colectado y herborizado.

2.4. Estudio morfo-anatómico:

Fueron utilizados ejemplares adultos para el análisis de las estructuras, al mismo

tiempo se procesó un especimen testigo, del ejemplar que ha sido utilizado para el análisis

histológico.

Para la observación de la epidermis foliar, los fragmentos de hoja fresca se diafanizó

con hipoclorito de sodio durante 24 hs, se lavó con agua destilada y se llevó al microscopio.

La diafanización de las epidermis foliares, la eliminación de cutina se realizó según la

técnica de Carpano & al (1994).

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Se elaboró láminas permanentes que están depositadas en el Herbario FACEN del

Departamento de Biología.

Las observaciones fueron realizados con Microscopio Óptico Compuesto Binocular

Olympus Serie BH2, objetivo aumento de 4x, 10x y 20x, y las imágenes se obtuvieron con

una Cámara Digital Moticam 352, con aumento de 30x, Software Motic Images Plus 2.0 ML.

(2006)

2.5. Determinación de parámetros cuantitativos:

2.5.1. Determinación de los Indices de empalizada y estomático:

Se enfoco el parénquima empalizado, localizado por debajo de la epidermis adaxial, y

se procedió al conteo de células en empalizada dentro de cuatro células epidérmicas.

-Determinación del Índice de empalizada = Nº células en empalizada/4

Se utilizó la epidermis abaxial de la hoja, para el conteo de estomas y células

epidérmicas.

-Determinación del Índice estomático: Nº de estomas x 100 Nº estomas + Nº de células epidérmicas

Toda la información obtenida se registró en planillas de cálculo.

2.6. Análisis estadístico:

Para el análisis estadístico de los valores de indices de empalizada y estomático, se

utilizó un tipo de análisis descriptivo univariado, con aplicación de pruebas de normalidad

Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk, contraste de hipótesis con Prueba de Levene y

Análisis de varianza (ANOVA).

Se utilizó el paquete estadístico SPSS versión 10,5 (Nie, 2000), junto con el manual de

Técnicas de análisis multivariante de Datos: Aplicaciones con SPSS (Pérez, 2004).

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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓ�:

3.1. Procedencia de las muestras:

Los especimenes corresponden a ejemplares cultivados en viveros, localizado en

Caacupé, Departamento de Cordillera (S 25º 22’ 33’’ WO 57º 10’ 46’’)

3.2. Descripción morfológica:

Hábito: Planta arbustiva, cultivadas alcanzan aproximadamente 0.60 m de altura. Ver

Fig. 1.

Hoja: simple, sésil, oblonga-lanceolada, aproximadamente el 50% de la longitud de la

hoja es dentada hacia el ápice y lisa hacia la base. Nervadura pinnada, reticulada, prominente

en el envés, ligeramente marcada en el haz, densamente pubescente en ambas caras. 3 nervios

nacen desde la base. Se observan pelos persistentes en todo el margen de la hoja y a lo largo

de todas las nervaduras, en especial de la principal. Borde de la hoja engrosada.

Tallo: ramificación lateral como en las espermatófitas, en el extremo y en los distintos

niveles, simpódico. Pubescente. En sus primeras fases de desarrollo presenta un tallo único, en

su fase final puede presentar numerosos tallos que salen de un mismo sistema radicular. Su

raíz es muy ramificada y fibrosa.

Flor: blanca a color crema, pentámera, tubular, pubescencia densa en el cáliz. Pétalos

blanquecinos. Inflorescencia en capítulo, con pedicelos cortos.

Fruto: aquenio

Hábitat: cultivado en suelo de tipo arenoso, a pleno sol.

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Fig. 1. Stevia rebaudiana cultivada. Hábito

3.3. Descripción anatómica de la epidermis:

3.3.1. Epidermis superior o adaxial:

Uniestratificado, paredes anticlinales, cutícula gruesa y lisa. Células de contorno

ondulados con menor número de estomas en esta cara.

3.3.1. Epidermis inferior o abaxial:

Uniestratificado, células de menor tamaño que las de la epidermis superior. Las

paredes anticlinales de la epidermis presentan ondulaciones, siendo estas mas pronunciadas en

la cara abaxial. Es una hoja anfiestomática, con estomas del tipo anomocítico en ambas caras,

rodeados por 4 a 5 células epidérmicas.

En Asteraceae, familia a la que pertenece la especie estudiada, generalmente los tipos

estomáticos son anomocíticos y anisocíticos, predominando el primer tipo (Metcalfe & Chalk,

1950), y se encuentra en ambas caras epidérmicas, siendo mayor en la abaxial clasificándose

las hojas como anfiestomática (Esau, 1974).

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Fig. 2. Epidermis adaxial Fig. 3. Epidermis abaxial

El Índice de estomas, es uno de los métodos más utilizados, a través de él, se obtienen

valores constantes, característicos para una especie; fue ideado por Salisbury (1927) y se

relaciona el número de estomas y células epidérmicas.

Mientras que el Índice de empalizada fue propuesto por Zornig y Weiss (1925), es de

utilización muy frecuente. Representa el número medio de células de empalizada que hay

debajo de cada célula de la epidermis superior.

En el Cuadro 1, se señala el tamaño de la muestra, la desviación típica, el valor

promedio y el rango mínimo y máximo de los valores obtenidos del análisis de los dos índices.

Cuadro 1. Descriptivos univariados para Cordillera y Concepción. TAMAÑO DE

MUESTRA DESVIACION

TIPICA VALOR

PROMEDIO RANGO

Índice Empalizada-Cordillera

50 0,398 3,65 3,0-4,5

Índice Estomático-Cordillera

50 3,703 16,58 10,0-26,0

Para los índices de empalizadas y estomáticos, los valores se muestran en el Cuadro 2

y 3. Se puede afirmar que el índice de empalizada tiene un promedio de 3.6, el índice

estomático es 16,58, con un coeficiente de variación bajo, su distribución es normal (Figs. 6 y

7), y la varianza constante para ambos índices, no presentan diferencias significativas.

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Cuadro 2. Desviación estandar, Coeficiente de variación, pruebas de normalidad y significancia de I. de empalizada N Media Mediana Mínimo Máximo Desviación

Estándar CV Normalidad

(Probabilidad) Significación (Probabilidad)

Indice de Empalizadas

50

3.65

3.7

3

4.5

0.3977

10.8

0.015

0.953

Indice de estomas

50 16.58 16.7 10 26 3.703 22.3 0.2 0.989

Cuadro 3. Pruebas de normalidad

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk

Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig. Indice de empalizada ,141 50 ,015 ,943 50 ,017 Indice de estomas ,067 50 ,200(*) ,978 50 ,478

* Límite inferior de la significación verdadera.

La Frecuencia de los valores del Índice de empalizada y estomático se encuentra

representadas en las Figs. 4 y 5

Indice de empalizada

4,54,03,53,0

Fre

cue

nci

a

12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0

Histograma

Localidad= Caacupe

Media =3,65 Desviación típica =0,398

N =50

Fig. 4. Histograma de frecuencia de Índice de empalizada.

10

Indice de estomas

25201510

Fre

cuen

cia

8

6

4

2

0

Histograma

Localidad= Caacupe

Media =16,58 Desviación típica =3,703

N =50

Fig. 5. Histograma de frecuencia de Índice estomático.

Valor observado4,54,03,53,02,5

Nor

mal

esp

erad

o

2

1

0

-1

-2

Gráfico Q-Q normal de Indice de empalizada

Localidad= Caacupe

Fig. 6. Q-Q normal de Indice de empalizada

11

Valor observado

25201510

No

rmal

esp

erad

o

3

2

1

0

-1

-2

Gráfico Q-Q normal de Indice de estomas

Localidad= Caacupe

Fig. 7. Q-Q normal de Indice estomático

En cuanto a la distribución de los valores del Indice de empalizada y estomático con

respecto a la media, se observa que existe una mayor dispersión de datos por debajo de la

mediana, se observa mayor concentración de valores en los intervalos comprendidos entre el

50 y 75 %. Por otra parte, se observa que el 25% de los valores menores están más

concentrados que los 25 % de los valores mayores. Ver Figs. 8 y 9

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Indice de empalizada

4,4

4,2

4,0

3,8

3,6

3,4

3,2

3,0

Localidad: Caacupe

Fig. 8. Boxplots de valores de índice de empalizada.

Indice de estomas

30

25

20

15

10

Localidad: Caacupe

Fig. 9. Boxplots de valores de índice estomático.

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Con la realización de la Prueba de Levene, se observa que p ≥0,05, se afirma que la

varianzas son homogéneas para ambos índices. Ver Cuadro 4.

Cuadro 4. Prueba de Levene Estadístico de

Levene gl1 gl2 Sig.

Indice de empalizada 1,436 1 98 ,234

Indice de estomas 1,521 1 98 ,220

6. CO�CLUSIO�ES: Con ésta investigación, se puede enumerar la siguiente conclusión: Teniendo en cuenta, los resultados obtenidos del estudio morfológico así como el

micrográfico, se puede concluir, que los índices de empalizada y estomáticos, pueden ser

utilizados como elemento de apoyo para identificar la autenticidad de hojas de Stevia,

comercializadas actualmente en diferentes centros de venta del Paraguay, además de la

caracterización propia del tejido epidérmico, tanto adaxial como abaxial, tipos y ubicación de

estomas.

Los valores obtenidos son: índice de empalizada = 3.0 (3.65) 4.5 y el índice de estomas

= 10.0 (16.58) 26.0.

7. AGRADECIMIE�TOS:

A la Universidad Nacional de Asunción, a través de la Dirección General de

Investigaciones Científicas y Tecnológicas, por el financiamiento de ésta investigación.

A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, por las facilidades ofrecidas para el

desarrollo del proyecto.

Al Ing. Agr. Porfirio Riquelme, a los señores Faustino Cardozo, Adolfo González y

familia, propietarios de viveros y productores de ka’a he’e, por la donación de plantas para la

realización de los estudios y el aporte de los conocimientos.

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