ULTRAVIOLETSUNSCREENONTHECORALREEF:FROM

CORALTOFISH

ADISSERTATIONSUBMITTEDTOTHEGRADUATEDIVISIONOFTHEUNIVERSITYOFHAWAI`IATMĀNOAINPARTIAL

FULFILLMENTOFTHEREQUIREMENTSFORTHEDEGREEOF

DOCTOROFPHILOSOPHYIN

ZOOLOGY

MAY2012By

FrederiqueL.M.Kandel

DissertationCommittee:

RobertKinzieIII,ChairpersonKimHollandDavidJamesonFlorenceThomasRobertToonen

Keywords:MAA,Mycosporine‐likeAminoAcid,Sunscreen,UltravioletRadiation,Fish,Coral

i  

DEDICATION    

 

 

 

 

 To my wonderfully loving, supportive and quirky family, especially: 

Irene, 

Aimee, 

Jeanne, 

Guy, 

Muriel, 

Olga, 

Georges, 

Christian, 

Annouck, 

Thaleia, 

George 

and the ones still to appear… 

ii  

ACKNOWLEDGEMENTS The work described in this manuscript has benefited from the contributions of many.  

Dr. Robert Kinzie III has offered his mentorship: precious advice, insights, 

support, and a great deal of his time from the inception to the end of this project.  

Dr. Florence Thomas, Dr. Kim Holland, Dr. Robert Toonen, Dr. David Jameson 

have provided very helpful comments, reviews and much appreciated encouragements. 

The field component of the project was made possible by the remarkable work 

ethic, good humor and friendship of Mindy Mizobe (dive buddy and research assistant).  

The laboratory portions of this work took place in several locations and much is 

owed to the expertise and logistical support from: Dr. Ruth Gates and her team, Hawai`i 

Institute of Marine Biology (HIMB)‐ Dr. Kenia Whitehead, University of Washington‐ the 

HIMB core facility team: Mindy Mizobe, Amy Agger, Chris Farrar‐ Dr. Bidigare’s lab at 

HIMB and UH Mānoa: Fenina Butler and Stephanie Christensen‐ Dr. David Jameson, UH 

Mānoa‐ Dr. Rappe’s lab, HIMB. 

Administrative and technical support was given by: the Zoology Department at 

UH Mānoa, HIMB, the UH foundation, the UH Mānoa Environmental Health & Safety 

Office, the University of Hawai`i Diving Safety Program.  

Staff members at HIMB have greatly assisted, especially the Residents and 

Security teams who gave many late nights and holidays boat rides to and from Coconut 

Island. Additionally, Marc Rice from Hawai`i Pacific Academy and Captain Chuck 

graciously offered boat time on the Big Island. 

Funding for this work was provided by: the National Science Foundation Pre‐

doctoral Fellowship program, Seagrant Hawai`i and the Living Ocean foundation.  

Many additional faculty members, colleagues and friends have provided 

inspiration, intellectual stimulation, help and/or moral support, amongst them: Bo 

Alexander, Dr. John Ambrose, Mitra Ahdieh, Dr. Charles and Mrs Birkland, Jessica 

Berryman, James Brown, Dr. Brian Bowen, Dr. Julie Brock, Dr. Pierre and Tania Dutrieux, 

Dr. Megan Donahue, Charlie Ebel, Elin and Fred Farrell, Helen Fujimoto, Dr. Ruth Gates, 

iii  

Dr. John Godwin, Dr. Gordon Grau, Dr. Beth Hawkins, Dr. Tetsuya Hirano, Dr. Jo‐Ann 

Leong, Pricilla Oshiro, Dr. Ernie Reese, Dr. John Stimson, Dr. Andrew Taylor, Dr. Andre 

and Lucia Seale, Dr. Timothy Tricas, Dr. Jill Zamzow.  

Finally, my parents Jeanne Gautrot and Guy Kandel, as well as my sister and 

brother Muriel and George Kandel, and my partner George Losey all have helped in 

more ways than can be recounted here.   

To all, please, receive my heartfelt gratitude. 

 

iv  

ABSTRACT 

Mycosporine‐like amino acids (MAAs) are UVR‐absorbing compounds ubiquitous 

in the aquatic environment. Metazoans appear to obtain them from their diet or from 

symbiotic microorganisms. The study of MAAs has been complicated by the lack of 

commercially available standards. Use of tandem mass spectrometry renders this 

problem tractable.  

My dissertation exploited the availability of previously published MAA 

fragmentation patterns to identify MAAs in the mucus of the corallivorous territorial 

butterflyfish, Chaetodon multicinctus.  

I next adapted both a powerful HPLC separation procedure and a tandem mass 

spectrometry technique to not only identify, but also quantify, MAAs in the absence of 

standards.  

With this method I examined MAAs through the trophic chain in C. multicinctus 

and its coral prey, Pocillopora meandrina, Porites compressa and Porites lobata. 

Specimens from three depths provided non‐overlapping levels of downwelling UVR 

irradiance to investigate if the four species studied modulated their MAA content with 

exposure level. 

I found that the MAAs present in Chaetodon multicinctus epithelial mucus are 

different from the MAAs in their diet: some, like mycosporine‐glycine, abundant in the 

coral diet, are not detectable in fish mucus and some, present in the epidermal mucus 

such as palythene and usujirene, are not found in the diet. These results are consistent 

with prior research on fish eyes, sea urchins, and pteropods. They suggest the possibility 

of selective uptake, translocation and transformation of MAAs by metazoan consumer 

organisms. The details of these processes are unknown.  

MAA concentrations in the three coral species decreased with increasing depth 

and the associated UVR reduction. This pattern was, however, not observed in the fish 

probably due to a ceiling effect. A model is proposed to illustrate this possibility. The 

corals also showed an interesting difference in MAAs diversity perhaps due to 

v  

differences in their Symbiodinium: Porites spp. known to have low diversity of symbionts 

also had a low diversity of MAAs compared to Pocillopora meandrina that harbors a 

greater diversity of zooxanthellae.    

My work also resulted in the addition of several MS2 patterns useful for 

identification. Further, the discovery of up to four new MAAs suggests the value of 

continuing to investigate these intriguing metabolites. 

vi  

TABLEOFCONTENTSDEDICATION ......................................................................................................................... i ACKNOWLEDGEMENTS ........................................................................................................ii ABSTRACT ............................................................................................................................ iv LIST OF TABLES .................................................................................................................. viii LIST OF FIGURES .................................................................................................................. ix CHAPTER 1: GENERAL INTRODUCTION ............................................................................... 1 CHAPTER 2: IDENTIFICATION OF SUNSCREEN COMPOUNDS IN FISH MUCUS. .................. 7 2.1 Introduction .................................................................................................................. 7 2.2 Methods ...................................................................................................................... 11 2.2.1‐Field work, Study species and location ............................................................... 11 2.2.2. Laboratory work .................................................................................................. 11 2.2.2.a‐MAA extraction ............................................................................................. 11 2.2.2.b‐MAA identification ........................................................................................ 12 2.2.2.c‐Relative quantification .................................................................................. 13 

2.3 Results ......................................................................................................................... 14 2.3.1‐MAA identification ............................................................................................... 14 2.3.2 Relative abundance .............................................................................................. 16 

2.4 Discussion .................................................................................................................... 17 CHAPTER 3: METHOD DEVELOPMENT .............................................................................. 20 3.1 Introduction ................................................................................................................ 20 3.2 Background ................................................................................................................. 21 3.3 Approach and Troubleshooting for HPLC Separation, Tandem Mass Spectrometry And Instrument Malfunctions ........................................................................................... 23 3.4 Quantification: Empirical Testing Of An Extension Of Beer‐Lambert Law ................. 36 3.5 Conclusion ................................................................................................................... 43 CHAPTER 4. NATURAL SUNSCREEN COMPOUNDS IN THREE SPECIES OF CORAL AND THEIR FISH PREDATOR ...................................................................................................... 44 4.1 Introduction ................................................................................................................ 44 4.2 Methods ...................................................................................................................... 47 4.2.1 Field work ............................................................................................................. 47 4.2.1.a Study species and location: ........................................................................... 47 4.2.1.b Sampling ........................................................................................................ 48 4.2.1.c Downwelling spectral irradiance measurements ......................................... 48 

4.2.2 Laboratory work: Chemical identity of UVR blocking in fish mucus and their coral prey ............................................................................................................................... 49 4.2.2.a MAA extraction ............................................................................................. 49 4.2.2.b HPLC and tandem mass spectrometry ......................................................... 50 

4.3 RESULTS ....................................................................................................................... 52 4.3.1 Measurements of relative downwelling UVR irradiance. .................................... 52 4.3.2 Coral: Qualitative results for 3 species ................................................................ 53 4.3.2.a Pocillopora meandrina .................................................................................. 53 

vii  

4.3.2.b Porites lobata ................................................................................................ 57 4.3.2.c Porites compressa ......................................................................................... 57 

4.3.3 Fish qualitative results ......................................................................................... 59 4.3.4 Corals quantitative results. .................................................................................. 62 4.3.5 Fish quantitative results ....................................................................................... 65 

4.4 DISCUSSION ................................................................................................................. 66 4.4.1 Qualitative analysis .............................................................................................. 66 4.4.2 Quantitative analysis............................................................................................ 69 4.4.3 Conclusion ............................................................................................................ 72 

CHAPTER 5: CONCLUSIONS ............................................................................................... 73 LIST OF REFERENCES ......................................................................................................... 77             

viii  

 

LISTOFTABLES Table 2.1. HPLC gradient protocol for MAA separation………………………………………  13 

Table 3.1. Gradient protocol for MAA separation as per Carreto et al. 2005….……  23 

Table 3.2. Problems and solutions…………………………………….……………………………….  30 

Table 3.3. Gradient protocol for MAA separation with Kinetex columns……………  31 

Table 3.4. MAAs retention times ………………………………….….……………………….………  32  Table 4.1. Gradient protocol for MAA separation with Kinetex columns ……………  51  Table 4.2. Order of elution and retention times of MAAs…………………………….....  51  Table 4.3. MAAs presence – absence summary…………………………………………………  61    

ix  

LISTOFFIGURES  

Figure 2.1 A. Aminocyclohexenone molecular structure…………………………………….    8 

Figure 2.1 B. Aminocyclohexenimine molecular structure………………………………..    9 

Figure 2.2. Spectrophotometric scan of an extract of C. multicinctus mucus…...  14 

Figure 2.3. Fragmentation patterns for asterina and palythene………………………..  15 

Figure 2.4 A. Relative abundance of MAAs with depth: asterina and palythene   16 

Figure 2.4 B. Relative abundance of MAAs with depth: all ions………………………..   17 

Figure 3.1. Picture of the pooling and boiling solvent ………………………………………  24 

Figure 3.2 A. Chromatograms before addition of an auxiliary pump ………………..  28 

Figure 3.2 B. Chromatograms after addition of an auxiliary pump ……………………  28 

Figure 3.3 A. HPLC separation of a mixture of samples using formic acid 

 instead of TFA ………………………………………………………………………………………  29 

Figure 3.3 B. Separation of the same mixture using TFA……………………………………  29 

Figure 3.4 A. UV absorbance and Mass chromatograms for an extract of  

Coral trout ocular lens Plectropomus leopardus…………….………………………  33 

Figure 3.4 B. Mass of each of the four MAAs…………………………………………………….  33 

Figure 3.4 C. Wavelength maximum of each MAA         …………………………………….  34 

Figure 3.4 D. MS2 fragmentation pattern for (a): palythine……………………………...  34 

Figure 3.4 E. MS2 fragmentation pattern for (b): asterina ……………………………….  35 

Figure 3.4 F. MS2 fragmentation pattern for (c) usujirene…………………………………..  35 

Figure 3.4 G. MS2 fragmentation pattern for (d) palythene ………………………………..  35 

Figure 3.5. Palythine concentration. Comparing values computed from Equation 1 

with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law) ...………………..……………. 38 

Figure 3.6. Palythine concentration. Comparing  values computed from Equation 3  

with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law) …...…….…….………………  39 

Figure 3.7. Porphyra concentration. Comparing  values computed from Equation 1  

with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law) …………………………….….  40 

x  

Figure 3.8. Porphyra concentration. Comparing  values computed from Equation 3 

  with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law)…………………………….  40 

Figure 3.9. Porphyra concentration vs. absorbance …………………………………………..  41 

Figure 4.1. Relative downwelling irradiance….......................................................  53 

Figure 4.2. Typical Chromatogram of Pocillopora meandrina…………………………….  54 

Figure 4.3 Chromatogram for the rare P. meandrina  found in the deep territories………………………………………………………………..  54 

Figure 4.4. MS2 spectrum of mycosporine‐2 glycine……………………………………..….  55 

Figure 4.5. MS2 spectrum of mycosporine glycine…………………………………………….  56 

Figure 4.6. MS2 spectrum of the putative palytine‐serine……………………………….…  56 

Figure 4.7. MS2 spectrum of the putative mycosporine‐glycine‐NMA‐Thr………..  57 

Figure 4.8. Typical chromatogram for Porite lobata………………………………………….  58 

Figure 4.9. Typical chromatogram for Porites compressa ………………………………..  58 

Figure 4.10 A. Chaetodon multicinctus chromatograms: all MAAs……………………  59 

Figure 4.10 B. Chaetodon multicinctus chromatograms: selected MAAs………….  60 

Figure 4.11. MAAs quantitative analyses for Pocillopora meandrina………………..62‐63 

Figure 4.12. MAAs quantification for Porites lobata…………………………………………  64 

Figure 4.13. MAAs quantification for Porites compressa………………………………….  64 

Figure 4.14. MAAs quantification for Chaetodon multicinctus………………………….65‐66 

Figure 4‐15. Model of MAA accumulation in fish mucus……………………………………  71 

 

 

 

 

 

 

 

1  

CHAPTER1:GENERALINTRODUCTION Naturally occurring solar radiation includes short‐wavelength, high‐energy 

Ultraviolet Radiation (UVR, wave lengths <250 ‐ 400nm). The shortest, most energetic 

part of this radiation (UVC <250 – 280nm) is absorbed by Earth's atmosphere, but longer 

wavelength radiation (UVB 280‐320nm, and UVA 320 – 400nm) does reach Earth's 

surface and has long been known to be responsible for an array of chemical and 

biological processes (Jones & Kok 1966, Moss & Smith 1981, Bühlmann et. al 1987, 

Lesser 2000, 2008, Karsten et al. 2009, Dahms & Lee 2010, Dahms et. al. 2011 ) some of 

which are known to affect ecological systems (Jokiel 1980, Worrest et al. 1981, 

Teramura 1983, Hobson & Hartley 1983, Wood 1987, Bothwell et al. 1994, Kinzie et al. 

1998, Banaszak & Neale 2001, Wahl et al. 2004, Hansson & Hylander 2009,  Nahon et al. 

2011). 

Ultraviolet radiation has some beneficial roles in living organisms such as the 

UVB‐mediated conversion of vitamin D in our skin or UVA activation of photolyase, an 

enzyme that repairs DNA damage caused by UVB (Cockell & Knowland 1999). Moreover, 

UVA vision in various species of insects, fish and lizards is essential for processes such as 

foraging and mate recognition (McFarland & Loew 1994, Losey et al. 1999, Losey 2003, 

Cockell 2000, Knuttel & Fiedler 2001, Garcia & de Perera 2002, Smith, E J et al. 2002, 

White et al. 2003, Aviles et al. 2006, Leech & Johnsen 2006, Leech et al. 2009, Rick et al. 

2012).  

However, most known UVR effects on living organisms are detrimental. UVR can 

cause DNA damage, corneal and epithelial inflammation and sunburn (Siebeck 1988, 

Martinez‐Levasseur 2011), as well as immunosuppression (Schwarz & Schwarz 2011). 

These effects are known to promote directly, or indirectly, certain types of cancer such 

as melanomas in humans and other mammals (Garibyan & Fisher, 2010). Ultraviolet 

radiation can also cause inhibition of photosynthetic primary production in plants (Jones 

& Kok 1966, Teramura et al. 1980, Teramura 1983, Gold & Caldwell 1983, Strid et al. 

2  

1990), reduction of microbial motility (Sommaruga et al. 1996, Sommaruga & Buma 

2000) and cell death induction (Godar 1999, Kulms et al. 1999). 

The long‐held belief that UVR attenuates too rapidly in the water column to 

affect aquatic organisms was challenged since the mid‐20th century (Jerlov 1957, 1976). 

Irradiance measurements in clear oceanic water have shown that 1% of the surface UVA 

at 375nm wavelength was still present at depths over 100 meters. The shorter 

wavelength UVB attenuates more rapidly, yet the 1% attenuation depth for wavelengths 

of 290nm was found to be as deep as 20 meters in the same waters (Smith & Baker 

1981).  

The need to cope with UVR has led to the evolution of various protective 

mechanisms in marine organisms. Damage‐prevention strategy can be behavioral such 

as negative phototaxis observed in various species of ciliates, water fleas (Daphnia sp.) 

and copepods (Barcelo & Calkins 1979) or covering behavior in some species of urchins 

(Lenci et al. 1997, Storz & Paul 1998, Adam 2001, Verling 2002). Protection from UVR 

can also be conferred by the use of UVR blocking compounds.  Melanization (sun 

tanning) has been observed in some cartilaginous fishes (Lowe & Goodman‐Lowe 1996) 

as well as Daphnia sp. (Hebert & Emery, 1990). Many cyanobacteria secrete scytonemin, 

a lipid‐soluble protective substance absorbing at 370nm (Garcia‐Pichel & Castenholz 

1991). Additionally, a family of compounds called mycosporine‐like amino acids (MAAs) 

with absorbance maxima from 320nm to 360nm is found ubiquitously in marine 

organisms including cyanobacteria, dinoflagellates, copepods, symbiotic corals and even 

in fish eyes (reviewed in Carreto & Carrignan 2011).  

Recently, while studying UV vision in fish, Zamzow & Losey (2002) discovered 

that the mucus of the reef fish, spotted toby (Canthigaster jactator), absorbed UVR. 

Zamzow & Losey (ibid.) subsequently surveyed 137 species of reef fishes and found that 

the mucus of 90% of the species studied absorbed UVR. Additionally, the mucus 

absorbance correlated with depth of capture in three of species of fish studied. 

Furthermore, the mucus absorbance of Pacific Tidepool Sculpins (Cottidae: Teleostei), 

3  

decreased with higher latitude. Zamzow (2003a, b) hypothesized, but did not chemically 

verify, that the sunscreen properties of the mucus were due to MAAs.   

In addition to their strong UV absorbing properties, the sunscreen role of MAAs 

has been corroborated by various studies. Investigation of three MAAs has confirmed 

that the photo‐excitation of the MAA molecules generates no, or very low, fluorescence 

and the energy is dissipated harmlessly, mainly in form of heat (Conde et al. 2000, 2004, 

2007). The concentration of MAAs decreases with depth and associated UVR exposure 

for several (but not all) species of corals and some macroalgae (Dunlap et al. 1986, Shick 

et al. 1995, Teai et al. 1997, 1998, Karsten et al. 1998a, Banaszak et al. 1998, Kuffner 

1999, Lesser 2000, Corredor et al. 2000, Torregiani & Lesser 2007). The protective role 

of MAAs has been experimentally confirmed for several organisms. Mycosporine‐like 

amino acids defend the dinoflagellate Gyrodinium dorsum against UVB‐induced loss of 

motility and death (Klisch et al. 2001).  Ultraviolet radiation causes a delay in the 

cleavage of the embryo of the sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis, but the 

delay is significantly reduced for embryos rich in MAAs (Adams & Shick 1996, 2001).  

Until recently, metazoans were not believed to be able to synthesize MAAs de 

novo because they lacked the necessary enzymatic pathways (Shikimate pathway, Shick 

et al. 1999, Shick & Dunlap 2002). Instead, symbiotic organisms such as scleractinian 

corals were thought to acquire MAAs from their dinoflagellate symbionts (Banaszak et 

al. 1995, b, 2000, 2006, Ishikura et al. 1997, Schick et al. 1999, Shick & Dunlap 2002, 

Shick 2004). Other consumer organisms such as echinoderms, krill and copepods 

appeared to acquire MAAs from their diet (Caroll & Shick 1996, Bandaranayake 1999, 

Newman et al. 2000, Whitehead et al. 2001). In fish, Mason et al. (1998) showed that 

when medaka, (Oryzias latipes) were given a diet either with or without MAAs, the 

levels of MAAs in their ocular tissues rose or fell, respectively. Additionally, Zamzow 

(2004) showed that if captive coral reef wrasses, Thalassoma duperrey, exposed to UVR 

were fed a man‐made diet either containing or devoid of Acanthophora spicifera, an 

algae rich in MAAs, the absorbance of the mucus increased for the fish given the A. 

spicifera but it decreased for the fish given a diet lacking the algae.  

4  

Traditionally, chemical analysis of MAAs has been achieved by separation of 

methanolic extracts using high precision liquid chromatography (HPLC). Identification 

and quantification is accomplished by comparing time of elution, absorbance maxima 

and peak area with those of MAA standards. This approach has several drawbacks: First, 

some MAAs are difficult to separate, and are similar enough in their absorption maxima, 

that they can be misidentified (Whitehead et al. 2001). More importantly, MAA 

standards are not available commercially and their fabrication is complex and costly 

(Carreto & Carignan 2011). The lack of readily‐available standards for many MAAs has 

impeded progress toward understanding the biology and biochemistry of these 

compounds (Whitehead & Hedges 2002).   

In view of this situation, Whitehead & Hedges (2003) obtained standards of 

seven common MAAs from the marine environment. They used tandem mass 

spectrometry (MS/MS or MS2) to fragment each MAA and record its fragmentation 

pattern (MS2spectrum). They presented the unique fragmentation patterns of these 

seven MAAs as a practical tool to identify them in the absence of standards. Others have 

since published the MS2spectra of several additional MAAs (Volkmann & Gorbushina 

2006, Carignan et al. 2009). 

The purpose of my dissertation was first, to take advantage of the availability of 

this new method to identify UVR‐blocking compounds found in fish mucus. Second, I 

sought to follow each MAA through the trophic chain to determine if fishes sequester 

all, or only some, of the available blockers in their naturally occurring diet and whether 

fish can modulate sequestration according to the ambient UVR regime to which they are 

exposed. Additionally, we do not know if fishes also modify some of the MAAs 

consumed in order to use them as UVR blockers in the mucus. Such transformations are 

thought to occur in coral symbioses where phototrophically‐derived MAAs (called 

primary MAAs) are transformed into secondary MAAs by the animal host (Shick 2004, 

Banaszak et al. 2006).   

In chapter 2, I showed that the mucus of the butterflyfish, Chaetodon 

multicinctus, contained at least two main MAAs: asterina (absorption maximum 330nm) 

5  

and palythene (absorption maximum 360nm). I also examined whether the fish 

decreased the ratio of the longer versus the shorter wavelength MAAs as the UVR 

exposure changed in shallower water and found no evidence of a shift. This first project 

also emphasized the limitation of the initial method and called for methodological 

improvement that could add quantitative capability to MAA analysis. 

Chapter 3 describes the modification and adaptation of an efficient HPLC 

separation technique for use in conjunction with mass spectrometry. This led to a 

broadly‐applicable method that allows researchers to obtain both reliable identification 

and reasonably accurate quantification of MAAs in biological samples in the absence of 

standards. 

Chapter 4 provides the identities and concentrations of MAAs found in the reef 

habitat for an obligate corallivorous butterflyfish, Chaetodon multicinctus, and the three 

species of corals that form its diet: Porites compressa, Porites lobata, Pocillopora 

meandrina. Specimens were sampled from three different depths that provided non‐

overlapping levels of downwelling UVR irradiance levels.  

I found that P. meandrina, a species known to harbor various clades and 

subclades of zooxanthellae symbionts (Stat et al. 2009) presented a greater diversity of 

MAAs than either of the more symbiont‐specific Porites spp. 

Several of the major MAAs present in the coral did not appear at all in the fish 

mucus. Conversely, two long‐wavelength maximum MAAs, usujirene and palythene, not 

observed in the corals, were found in the fish mucus as well as traces of two possible 

unknown MAAs. Additionally, the concentration of the main MAAs detected in the 

corals decreased with depth and the concomitant reduction in UVR irradiance, a trend 

congruent with a sunscreen role for the compounds in coral. Surprisingly, the fish MAAs 

concentration did not show any significant trend with depth. 

As a side‐benefit, the MS2analysis made available the previously‐undescribed 

fragmentation patterns of several MAAs. 

Taken together, these findings lend some support to the theory that the MAA 

make‐up of symbiotic organisms is affected by the diversity of their symbiont 

6  

community. The results also strongly suggest a selective uptake of MAAs by Chaetodon 

multicinctus and the ability to not only translocate, but also to possibly transform the 

dietary MAAs. The mechanisms behind these processes remain unknown at this time. 

With the recent surprising discovery that MAA biosynthesis does not necessarily involve 

shikimate pathway intermediates, the story of these crucial and ubiquitous compounds 

in the marine world has just begun to be told. 

7  

CHAPTER2:IDENTIFICATIONOFSUNSCREENCOMPOUNDSINFISHMUCUS.

2.1Introduction 

The epidermal mucus of bony fishes is thought to serve many functions (reviewed by 

Shephard 1994). These include, but are not limited to:  

Reduction of drag to facilitate swimming by modifying boundary layers,  

Lubrication to protect from abrasion and facilitate escape from predators, 

Ion and water regulation and   

Resistance to diseases by repelling various microorganisms as the mucus 

sheds or by harboring protective compounds. 

More recently while studying vision in fish, Zamzow & Losey (2002) discovered 

that the mucus of the coral reef fish, Canthigaster jactator, absorbed ultraviolet 

radiation (UVR). They went on to survey 137 species of coral reef fish and found that the 

mucus of 90% of these species absorbed UVR. Additionally, the mucus of two of the 

three species analyzed in detail showed a bathymetric effect. In these two species, the 

integrated absorbance of the mucus decreased, and the center of absorbance shifted 

towards longer wavelengths with increasing depth of capture. This follows the 

attenuation of UVR in the marine environment that is known to decrease with depth, 

with shorter wavelength attenuating more rapidly (Jerlov 1956, 1976). Further work on 

captive fishes showed that if the animals were protected from UVR by plastic screens, 

the UV absorbance of their mucus decreased relative to the absorbance immediately 

after capture (Zamzow 2004). 

Results presented by Zamzow & Losey (2002) provided evidence of a previously 

unnoticed function of fish epithelial mucus, sunscreen. They hypothesized, but did not 

verify, that the compounds responsible for the sunscreen properties were likely 

mycosporine‐like amino acids (MAAs).  This is a family of over 25 compounds commonly 

found in cyanobacteria (Sinha & Häder 2008), dinoflagellates (Carreto et al. 1990, Lesser 

8  

1996, Banaszak et al. 2006), phytoplankton (Whitehead & Vernet 2000) and several of 

their invertebrate predators (Whitehead et al. 2001, Riemer et al. 2007, Hylander & 

Jephson 2010), red algae (Hoyer et al. 2002), coral (Shick et al. 1999, Yakovleva et al. 

2004, Ferrier‐Pagés et al. 2007), echinoderm eggs and embryo (Adams & Shick 1996, 

2001, Lesser 2010), and fish eggs and eyes (Mason 1998, Sinha et al. 2007, Carreto & 

Carrignan 2011). Mycosporine‐like amino acids are amino‐cyclohexenimine or amino‐

cyclohexenone rings linked to an amino‐acid or amino‐alcohol group (Bandaranayake 

1998, Karentz 2001, Singh et al. 2008), their basic structure is presented in Figure 2.1.  

The idea that MAAs can serve as UVR filters comes from several lines of 

evidence. It was first inferred because of the environmentally relevant range of their 

absorption maxima, between 320 and 360 nm and their very high extinction coefficient 

(ε up to ~5000 M‐1 cm‐1) (reviews by Bandaranayake 1998, Karentz 2001, Whitehead & 

Hedges 2002). Additional substantiation came from in vitro studies of the MAAs 

shinorine, porphyra and palythine that have shown that after photo‐excitation, the 

energy is mainly dissipated in the form of heat (Conde et al 2000, 2004, 2007).  

 

Figure 2.1 A. Aminocyclohexenone molecular structure. R is methyl sulphonic acid or methanoic acid  

 

OCH3

O H NH

R  

H O 

O 

9  

 

 

Figure 2.1 B. Aminocyclohexenimine molecular structure. R1 can be various alcohols and/or carboxylic acids, R2 can be a hydrogen, methyl group or carboxylic acids, R3 can be a hydrogen or sulphonide hydroxide. 

 

In the field, the concentration of MAAs decreases with depth and associated 

UVR exposure for several species of corals and some macroalgae (Dunlap et al. 1986, 

Shick et al. 1995, Teai et al. 1997, 1998, Karsten et al. 1998, Banaszak et al. 1998, Lesser 

2000, Corredor et al. 2000, Torregiani & Lesser 2007). Other studies have also 

demonstrated experimentally a UVR protective role for MAAs. For instance UVR causes 

a delay in the cleavage of the embryo of the sea urchin Strongylocentrotus 

droebachiensis, but the delay is significantly reduced for embryos rich in MAAs (Adams 

& Shick 2001). Mycosporine‐like amino acids also protect the dinoflagellates Gyrodinium 

dorsum against UVR‐induced damage in the UVB range (280nm to 315nm wavelength) 

(Klisch et al. 2001). Taken together, these observations have firmly established MAAs as 

a major natural sunscreen substance in marine organisms. 

Traditionally these compounds are extracted from samples using methanol and 

then separated using high precision liquid chromatography (HPLC). The identity of each 

compound is determined by comparing the wavelength of maximum absorption and 

elution time of its chromatographic peak, with those of MAA standards. However, this 

method has several drawbacks. First, there are no commercially available standards for 

OCH 3

O H NH

R3 ‐O 

N‐R1

R2 

10  

MAAs (Whitehead & Hedges 2003, Carretto & Carignan 2011). Second, some MAAs are 

difficult to separate with HPLC and have the same or similar wavelength maxima, which 

can lead to identification errors. For instance HPLC indicated the presence of the MAA 

mycosporine‐glycine‐valine (MGV) in a pteropod and its predator, but a more detailed 

analysis revealed that it was not MGV but palythenic acid (Whitehead et al. 2001) 

Having obtained standards for seven common MAAs found in the marine 

environment, Whitehead & Hedges (2003) used electrospray ionization‐mass 

spectrometry (ESI‐MS) and tandem mass spectrometry (MS2) to characterize these 

MAAs. Details of their procedure are given in the methods section of this chapter. They 

published the specific fragmentation pattern (MS2spectrum) of each the following 

MAAs: asterina, palythene, palythenic acid, palythine, palythinol, porphyra, and 

shinorine. They proposed that their published characterizations would allow researchers 

to use tandem mass spectrometry for the identification of these MAAs without the need 

for standards. 

The main goal of the work presented in this chapter was to apply their method 

to establish whether the UVR absorbing compounds observed in the epidermal mucus 

of a reef fish were indeed MAAs and, if so, to identify them. Secondly, if the main 

function of the observed MAAs is UVR protection, one could expect a depth effect for 

fish whose territory covers a narrow depth range since UVR decreases with depth, with 

shorter wavelength attenuated first (Jerlov 1976). This chapter did not seek to provide 

an absolute MAA quantitation. However it allowed testing if the mucus absorbance 

shifted towards longer wavelengths with depth by examining change in the relative 

abundance of MAAs of shorter and longer wavelength maxima. This work sought to test 

two hypotheses: 

Hypothesis one: A methanolic extract of fish mucus will contain a mixture of 

MAAs.  

Hypothesis two: Assuming hypothesis 1 is confirmed, and the MAAs can be 

identified, then there will be a change in the MAA composition of the mucus of the fish 

11  

studied with depth, such that MAAs that absorb shorter wavelengths would be more 

prevalent in shallower water.  

2.2Methods

2.2.1‐Fieldwork,Studyspeciesandlocation 

Our model species is the territorial and obligate corallivorous butterflyfish, Chaetodon 

multicinctus. This study required a location where C. multicinctus was easily accessible 

and abundant. These criteria were met at our study site, Puakō on the Kona coast of 

Hawai`i Island.  Mated pairs of this species live in temporally stable territories averaging 

90m2 (from 75m2 to 207m2, Tricas 1986), and consequently spend their day within a 

limited depth range. We selected pairs of fish in three non‐overlapping bathymetric 

ranges 1.5m to 4.57m (5 to 15 feet), 7.62m to 10.67m (25 to 35 feet) and 15.24m to 

18.29m (50 to 60 feet). 

Each pair was captured by scuba divers using a barrier and hand nets. Fish were 

placed in a bucket and slowly brought to a boat where their mucus was collected using a 

dulled scalpel blade as per Zamzow (2003a, b). The mucus samples were first placed 

immediately in scintillation vials, kept on dry ice, then freeze‐dried in a Labconco freeze 

drier and kept at ‐80°C until extraction. The fish were returned to their territory and 

released, unharmed, within less than an hour of capture.  

2.2.2.Laboratorywork

2.2.2.a‐MAAextraction 

Extraction of fish mucus samples took place directly in the scintillation vials by adding 

0.25ml of 100% aqueous HPLC‐grade methanol to the vial. After sonicating the samples 

on ice for 5 minutes (Fisher Scientific FS60H) the vials were placed in the dark at ‐10C for 

6 hours. The obtained methanolic extracts were then transferred to a 1ml centrifuge 

tube and centrifuged at 5000g for 5 minutes at room temperature, and the supernatant 

was collected and placed in 250μl autosampler vials. 

12  

2.2.2.b‐MAAidentification 

Electrospray ionization‐mass spectrometry (ESI‐MS) has been a valuable tool in 

identification of proteins and polypeptides (Chait & Kent 1992, Aebersold & Goodlett 

2001). Basically, the sample is dissolved in a solvent and passed through a nozzle to 

produce a plume of tiny highly‐charged droplets that are injected into a mass 

spectrometer chamber. For each molecule “M” of interest (here an MAA) the mass 

spectrometer gives the ratio between the mass (m) of the ionized (protonated) 

molecule [M+H]+ by its charge (z) (here for all MAAs z is +1ev). This m/z ratio 

corresponds to the “molecular mass plus one”. In effect, the mass spectrometer 

provides the molecular mass of any molecule of interest. Then with tandem mass 

spectrometry (MS2) an electromagnetic field is applied to isolate the protonated 

molecule (based on its m/z ratio). Collision energy, in presence of a collision gas (helium 

here), fragments the selected molecule. The resulting fragmentation pattern (MS2 

spectrum) is the typical “fingerprint” of the initial protonated MAA (also called parent‐

ion). The MS2 spectrum is unique for each MAA except for the cis‐trans isomers, 

palythene and usujirene, that have the same fragmentation pattern and the E/Z forms 

of palythenic acid (Carreto et al. 2005). 

Whitehead & Hedges (2003) provided the MS2 spectra of seven common marine 

MAAs using two different types of mass spectrometers: a classical triple quadrupole and 

a more recent ion trap model. Dr. Whitehead generously agreed to share her experience 

and to do an initial analysis of some samples at the mass spectrometry facility of the 

University of Washington using their triple quadrupole.  

Although separation is not absolutely critical for identification in a mass 

spectrometer, when analyzing complex natural samples as studied here, it is 

advantageous and customary to use an HPLC system to attempt at least a partial 

separation of the compounds of interest. Dr. Whitehead suggested a gradient 

separation using a narrow‐bore (150 x 21mm), reverse‐phase HPLC column with a 

eluent mixture consisting of a solution A, water:formic acid (99:1) and B, 

13  

methanol:formic acid (99:1) running at 250 µl min‐1. The HPLC gradient protocol is given 

in Table 2.1. 

Table 2.1. HPLC gradient Protocol for MAA separation. 

Time, min Flow, ul/min A, % B, % 0 250 98 21 250 98 25 250 75 257 250 60 40

12 250 45 5514 250 40 60

 

For the mass spectrometry the instrumentation and method are identical to the 

description found in Whitehead & Hedge (2003). The instrumentation at the University 

of Washington included a Shimadzu HPLC system (Kyoto, Japan) with a dual wavelength 

detector, interfaced to a Micromass Quattro II (QHQ) tandem mass spectrometer 

(Micromass Ltd., Manchester, UK) controlled by MassLynx software 4.0. The UV 

wavelengths monitored by the HPLC were 310 and 330nm.  

2.2.2.c‐Relativequantification 

The MassLynx software was used to obtain the mass chromatograms and calculate the 

peak area for each ionized MAA. But, without standards, the area does not give a direct 

estimate of the concentration present in each sample since MAAs differ in their 

ionization coefficient. This could lead to an overestimation of MAAs that are highly 

ionizable relative to those MAAs that are not. However, a measurement of the relative 

peak area of the ionized MAAs in each sample is enough to examine whether the 

relative contribution of each MAA changed with depth. To do so the peak area of each 

of the observed MAA mass chromatograms was divided by the sum of the peak areas of 

all the MAAs and multiplied by 100.  

 

14  

2.3Results

2.3.1‐MAAidentification 

Fish mucus methanolic extracts clearly showed an absorbance in the MAA range (Figure 

2.2) and the MS chromatogram revealed the presence of an ion of m/z 289 and an ion of 

m/z 285. The corresponding MS2 spectra of the protonated molecule 289 and 285 are 

given in Figure 2.3. 

 

Spectrophotometric reading of C. multicinctus extract

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

250 270 290 310 330 350 370 390

wavelength in nm

Ab

sorb

ance

(O

D)

 

Figure 2.2. Spectrophotometric scan of an extract of C. multicinctus mucus. 

The observed MS2 spectra corresponded to the fragmentation pattern of 

asterina and palythene published in Whitehead & Hedges (2003). All samples examined 

contained both of these MAAs. Upon detailed examination of the mass chromatograms, 

an additional ion of m/z 303 seemed to be present at a level slightly above background. 

The presence of this ion in the mass chromatogram also corresponded to a slight 

elevation in absorbance at 330nm as observed in the UVR chromatogram. This could 

indicate the presence of minute amounts of palythinol, an MAA of m/z 303 and 

wavelength maximum 330nm. We also observed a protonated ion of m/z 189. This is 

15  

not the mass of an MAA but could be deoxygadusol, a precursor of MAAs of molecular 

mass 188 amu (Karentz 2001, Shick & Dunlap 2002). Deoxygadusol has a wavelength 

maximum in the UVA range at 268nm and if present would not be detected on the two 

UV channels monitored (310nm and 330nm).  

 

Fragmentation pattern of parent ion (m/z 289), asterina.

Fragmentation pattern of parent ion (m/z 285), palythene.

 

 Figure 2.3. Fragmentation patterns for asterina and palythene. ESI‐MS/MS spectra (MS2 spectra) of the protonated parent molecules 289 and 285. They match the spectra of the MAAs asterina and palythene as described by Whitehead & Hedges (2003).  

  

 

100 110 120  130  140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250  260 270 280 290 300m/z0 

100 

%

    

289274

243

230

199

197

186

167155

137

m/z

 

100 110 120  130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 3000

100

%

   

285 270 

241 

224

205 

197

138

149

m/zRelative

 abundan

ce 

Relative

 abundan

ce 

16  

2.3.2Relativeabundance 

We first calculated the relative peak area of the two main MAAs present, asterina and 

palythene, to evaluate a possible variation in their relative abundance. A change in their 

relative abundance with depth would result in a spectral shifting of the mucus since 

they have very different absorption maxima: 330nm for asterina and 360nm for 

palythene. Surprisingly, I did not find any difference in their ratio with depth           

(Figure 2.4 A). 

I then took into account the amount of the two other ions assuming they were 

indeed palythinol and gadusol. Again the relative abundance remained unchanged with 

depth (Figure 2.4 B). 

Relative abundance profile of MAAs vs Depth

0102030405060708090

100

Ast

erin

a%

Pal

ythe

ne%

Ast

erin

a%

Pal

ythe

ne%

Ast

erin

a%

Pal

ythe

ne%

deep Intermediate shallow

Rel

ativ

e ab

unda

nce

(%)

  Figure 2.4 A. Relative abundance of MAAs with depth: asterina and palythene. The peak area of the mass chromatograms for asterina and palythene. The observed MAA mass chromatogram was divided by the sum of the peak areas of all the MAAs and multiplied by 100. This allowed observing if the relative contribution of each MAA changed with depth. The graphs indicate the mean plus or minus one standard deviation.   

17  

Relative abundance profile of MAAs vs Depth

0102030405060708090

Ast

erin

a%

Gad

usol

%

Pal

ythe

ne%

Pal

ythi

nol%

Ast

erin

a%

Gad

usol

%

Pal

ythe

ne%

Pal

ythi

nol%

Ast

erin

a%

Gad

usol

%

Pal

ythe

ne%

Pal

ythi

nol%

deep Intermediate shallow

Rel

ativ

e ab

unda

nce

(%)

 

Figure 2.4 B. Relative abundance of MAAs with depth: all ions. As per Figure 2.4 A except, In addition to asterina and palythene we included the contribution of the two other ions assuming they were palythinol and gadusol.  

2.4Discussion 

The result of this first MS2 study confirmed Zamzow & Losey’s (2002) hypothesis that 

there were MAAs in fish mucus. This analysis was, at the time, the first positive 

identification of these MAAs. Others have since then corroborated this finding on other 

fish species using standards (Eckes 2008). Our results however raised further questions 

and issues. 

I did not observe the expected change in the ratio of longer versus shorter 

wavelength maximum MAAs with depth. Zamzow’s (2003a) work on the absorbance of 

the mucus of three fish species Thalassoma duperrey, Canthigaster jactator and 

Chaetodon multicinctus showed a statistically significant shift of the center of 

absorbance towards longer wavelength with depth of capture for T. duperrey. A similar 

trend for C. multicinctus was not seen in the original multivariate analysis but became 

significant when considering standard length and depth separately (Zamzow 2003a). 

Fish mucus is a complex matrix of glycoproteins (mucins) (Asakawa 1970, Fletcher et al. 

1976, Shepherd 1994). It is possible that, if present, a spectral shift of the mucus could 

be due to compounds other than MAAs, and consequently would not be detected in the 

18  

present study. However, this is unlikely because the UVR absorption spectra of the 

mucus extract examined here and the spectra of the mucus in the Zamzow study are 

remarkably similar.  Additionally, Shick & Dunlap (2002) argued that attempts to 

correlate underwater irradiance spectra with the presence of MAAs of specific 

absorbance maxima have been unconvincing. In contrast, rather than a qualitative shift 

with depth, a total quantitative change in MAAs with higher concentration in shallow 

water is a more common observation (Dunlap et al. 1986, Shick et al. 1995, Teai et al. 

1997, 1998, Karsten et al. 1998a, Banaszak et al., 1998, Lesser 2000, Corredor et al. 

2000, Torregiani & Lesser 2007).  

In the absence of standards, it is possible to obtain an accurate quantification of 

each MAA using the area of the corresponding UVR peak obtained at its absorption 

maximum. This would require an excellent separation. In the work presented in this first 

study the MAAs did not separate adequately. In order to explore a change of MAA 

concentration in fish mucus with depth further work was needed to combine mass 

spectrometry techniques used here and an effective HPLC separation method as done in 

chapters 3 and 4. 

After demonstrating the presence of MAAs in the fish’s mucus the question of 

dietary origin was considered. At the time of this study, it was believed that animals 

were not able to synthesize MAAs de‐novo (Favre‐Bonvin et al. 1976, 1987, 

Bandaranayake 1998, Shick & Dunlap 2002, Reimer et al. 2007). This belief was based on 

two lines of evidence. First, the precursors of MAA synthesis, gadusol and deoxy‐

gadusol, were thought to be produced from 3‐dehydroquinate (DHQ). DHQ is a 

derivative of the Shikimate pathway and metazoans were believed to lack this pathway 

(Favre‐Bonvin et al. 1976, 1987, Hirata et al. 1979, Cockell & Knowland 1999, Shick & 

Dunlap 2002). Second, several studies demonstrated that animals without MAAs 

producing algal or bacterial symbionts acquired MAAs from their diet and translocated 

them to various tissues. For instance Carefoot et al. (1998) showed that the amount and 

type of MAAs in the tissues of the sea hare Aplysia dactylomela were affected by their 

diet. Adams & Shick (1996) also showed a relationship between dietary MAAs and 

19  

ovarian MAAs in the urchin Strongylocentrotus droebachiensis. In fish, Mason et al. 

(1998) showed that, if given a diet with or without MAAs, levels of MAAs in the ocular 

tissues would rise or fall, respectively. Additionally, Zamzow’s (2004) experimental work 

showed that, for the coral reef wrasse Thalassoma duperrey, both UV exposure and a 

diet rich in MAAs were necessary to maintain or increase a high level of mucus 

absorbance.  

In conclusion, the results of this study raised both ecological and methodological 

questions. I then set out to answer the latter first, so as to be better able to address the 

former. To study the dietary and the bathymetric effect on the absolute concentration 

of MAAs I needed to obtain standards or develop a suitable method for quantification 

without standards. Dr. Michael Lesser kindly provided standards of palythine and 

porphyra. However, these two MAAs were not observed in C. multicinctus in this work 

although they might be present in trace levels. Consequently, the next step after this 

study was to develop a method that would allow both identification and quantification 

of the MAAs without recourse to standards. I set out to adapt an efficient separation 

technique for use on the LC‐MS system currently available at the Hawai`i Institute of 

Marine Biology. Such a method would be very useful as it should render the study of 

MAAs more generally accessible.  

20  

CHAPTER3:METHODDEVELOPMENT

3.1Introduction 

Mycosporine‐like amino acids (MAAs) are a family of over 25 compounds common in 

marine organisms that have been shown to act as very powerful sunscreens with 

absorption maxima between 319nm and 360nm, along with high extinction coefficients 

‐up to ~50,000 M‐1 cm‐1‐ (Dunlap & Shick 1998, Karentz 2001, Singh et al. 2008, Rastogi 

et al. 2010, Carreto & Carignan 2011). The methods commonly used to study them 

involve HPLC separation of methanolic extracts, with identification and quantification 

based on comparing retention times, wavelength of absorption maxima and 

chromatographic peaks with those of standards. However, such analyses are difficult 

because commercially available standards are lacking (Whitehead et al. 2001, 

Whitehead & Hedges 2003, Hylander & Jephson 2010). Also, some MAAs are very 

difficult to separate with classical HPLC protocols (Carreto et al. 2005) which leads to 

misidentification (Whitehead et al. 2001, Carreto & Carignan 2011).  

Whitehead & Hedges (2003) proposed that electrospray ionization tandem‐mass 

spectrometry (ESI‐ MS2) is a suitable method to identify these MAAs in the absence of 

standards. With this technique each MAA is ionized (protonated), isolated, and 

fragmented and the specific fragmentation pattern or MS2 spectrum is used as a 

“fingerprint” to identify the original ion. Whitehead & Hedges (2003) have published the 

MS2 spectra of seven MAAs common in the marine environment. 

In my previous work, described in chapter 2 of this dissertation, I used 

Whitehead and Hedges (2003) methods in collaboration with Dr. Whitehead to 

determine the identity of the ultraviolet absorbing compounds in fish mucus. The results 

presented in chapter 2 have underscored the need to move beyond a strictly qualitative 

study toward a reliable quantitative analysis of MAAs in the fish and their natural food 

source.   

21  

The purpose of the work described here is to provide a dependable method of 

obtaining both qualitative and quantitative analysis of MAAs in biological samples, in the 

absence of standards. This method uses a combination of HPLC and tandem mass 

spectrometry. 

The chapter is organized in 3 parts:  

BACKGROUND.  

CURRENT APPROACH AND TROUBLESHOOTING FOR HPLC SEPARATION,  

                          TANDEM MASS SPECTROMETRY AND POTENTIAL INSTRUMENTAL 

                          PROBLEMS. 

QUANTIFICATION: EMPIRICAL TESTING OF AN EXTENSION OF BEER 

                          LAMBERT LAW. 

3.2Background 

Mass spectrometry and tandem mass spectrometry have proven to be very useful tools 

to positively identify MAAs in biological samples in the absence of standards (Whitehead 

& Hedges 2003, Carignan et al. 2009, Carreto 2011). Another advantage of mass 

spectrometry is that even if some MAAs are not well separated by HPLC it is still possible 

to isolate the peak obtained for each ionized MAA on a mass chromatogram, provided 

that the MAAs have different masses. However, since the ionization coefficient of MAAs 

varies greatly among MAAs and experimental conditions, one cannot simply use the 

mass chromatograms for quantification without standards (Whitehead & Hedges 2002) 

as this would risk a gross over‐estimation of the abundance of easily ionizable MAAs like 

asterina compared with the less ionizable ones like mycosporine‐glycine. Furthermore, 

the biological relevancy of the compounds in my studies and in many others is 

associated with the absorption properties of MAAs in the UVR range. Consequently, it 

would be valuable to separate the various MAAs present in a sample and to observe, on 

a UVR absorption chromatogram, the contribution of each one, individually to the 

absorbance of the mixture.  

An ideal method for MAA analysis would have the following characteristics:  

22  

1‐The liquid chromatography should provide a good separation of all MAAs in 

one pass through the HPLC system  

2‐The mobile phase fed to the mass spectrometer should allow sufficient 

electrospray ionization of the MAAs to provide a good sensitivity of the mass 

spectrometer signal 

3‐The MS2 spectra for all MAAs present should be obtained in one pass.  

If these conditions were met, the identification could be made based on the 

mass and MS2spectra of each compound as well as its absorption maximum and 

established order of elution. Furthermore, MAA quantification in the absence of 

standards can then be made using an extension of the Beer‐Lambert law (Banaszak & 

Trench 1995, Whitehead & Hedges 2003, Tartarotti et al. 2001, Torres et al. 2007.) The 

law allows determination of the concentration of each MAA based on its published 

extinction coefficient and the area of the chromatographic peak obtained at its 

wavelength of maximum absorption. This method requires an HPLC system equipped 

with a UVR capable PDA (photo diode array) since it can capture UVR absorbance data 

on the entire range of wavelengths of any MAA present instead of just one wavelength 

per channel with only two or three channels. For MAAs whose extinction coefficient has 

not yet been published, the coefficient of a structurally similar MAA has been used as a 

good approximation (Whitehead & Hedges 2002, Carreto et al. 2005). 

To achieve the required criteria for the ideal method, I first examined the 

literature to compare MAA separation techniques.  Detailed reviews of most methods 

are given in Carreto et al. (2005) and Carreto & Carignan (2011). In brief, the traditional 

HPLC schemes included isocratic elution using a C8 or a C18 column. These methods 

successfully separated some MAAs but as more compounds were discovered, the 

techniques in use proved unable to separate all of them. In particular, if a sample 

contained a mixture of strongly acidic and weakly acidic MAAs, full separation required 

elution with two different mobile phases. This led to the development of various 

gradient elution methods seeking to improve on the isocratic schemes. Carreto et al. 

(2005) published an original method using a gradient elution and two C18 columns in 

23  

series; this resulted in a good separation of a complex mixture of the 24 most common 

marine MAAs in about 45 minutes. 

I set out to apply and, where needed, to modify their HPLC method for use in 

conjunction with HIMB’s mass spectrometer.  

3.3ApproachandTroubleshootingforHPLCSeparation,TandemMassSpectrometryAndInstrumentMalfunctions

 

The Carreto et al. (2005) HPLC separation method uses a C18 column [Alltec Alltima (5 

μm, 4.6mm i.d., 150mm length)] followed by a CapCell Pak UG [Shisheido (5μm, 4.6mm 

i.d., 250mm length)] protected with a guard column cartridge [Alltima, Alltech (4.6mm 

i.d.,20mm length)] (Carreto et al. 2005). The mobile phase is composed of solvent A: 

water and trifluoroacetic acid (TFA) 0.2% buffered with ammonia to pH=3.15; and 

solvent B: (80:10:10) (water TFA 0.2% with ammonia to a pH=2.2: methanol: 

acetonitrile). The gradient they used is given in table 3.1. 

Table 3.1. Gradient protocol for MAA separation as per Carreto et al. 2005. In practice when running several samples we found necessary to add 6 minutes of 100% eluent A at the end of the run to re‐equilibrate the columns before the next run. This led to a total run time of 56min per sample.  

Time (min)

Percent eluent A

Percent eluent B

Flow rate (ul/min)

0 100 0 1000

2 100 0 1000

15 80 20 1000

30 50 50 1000

50 50 50 1000   

I first intended to try the method “as is” in spite of the fact that formic acid is 

usually preferred to TFA for mass spectrometry analysis since TFA can sometimes 

suppress electrospray ionization (ESI) and reduce sensitivity. As expected, this HPLC 

protocol provided an excellent separation of various samples containing mixtures of 

24  

MAAs (extracts of the coral Pocillopora meandrina mixed with palythine, and porphyra 

standards). However I encountered difficulties with the downstream mass 

spectrometry. The signal‐to‐noise ratio was very low due to an excessively high noise 

level even when running only solvent. Additionally, my highly aqueous solvent appeared 

to pool inside the front chamber of the ESI probe (Figure 3.1).  

 

 

Figure 3.1. Picture of the pooling and boiling solvent in the mass spectrometer front chamber. 

 

After a sample or two, the accumulated solvent would start boiling and the 

system had to be stopped to empty and clean the front chamber. Increasing the 

nitrogen auxiliary gas flow did not resolve this issue.  Our MS system is specified to 

withstand solvent flow rates of up to 2ml min‐1, twice the rate I employed. With my 

highly aqueous solvent, the specification was not met, so I decided to reduce the flow 

rate going into the mass spectrometer.    

25  

The simplest way to reduce the flow to avoid the pooling issue would be to split 

the flow from the HPLC with a T junction. I installed such junction and empirically 

adjusted the length of line going to the MS and the line to the waste bottle until only 

20% of the flow reached the mass spectrometer (equivalent to a 0.2ml min‐1 flow rate). 

This reduced the pooling problem although it did not completely eliminate it. This 

modification has the advantage of being initially inexpensive and simple to set up, but it 

presents some shortcomings. The flow rate reduction lowers the signal intensity to 

some extent, and the separation of close peaks can also be rendered less sharp due to a 

non‐avoidable addition of small dead volumes in the T junction. Another and more 

serious issue is the creation of a large volume of waste since 80% of the solvent goes 

directly to waste from the HPLC. This last issue was critical as my work took place during 

a world shortage of acetonitrile due to a drastically lowered production from the 

primary source, China. The shortage reached such crisis levels that chemists started to 

research and publish new versions of separation methods using alternate solvents (dos 

Santos Pereira et al. 2009, Fritz et al. 2009, Sandman 2009, Desai et al. 2011).  

In this context, I addressed my flow rate problem by adapting the Carreto 

method to smaller diameter columns (2.1mm instead of 4.6mm) of the same type. Such 

adaptation has the advantage of keeping the gradient identical except for a reduction of 

the flow rate according to the following formula:  

Flow Rate for new Column (ml/min) =  

[Diameter of new column (mm)/ Diameter of old column (mm)]2 * Flow Rate for 

old Column (ml min‐1). 

I obtained a flow rate of 190μl min‐1 that significantly reduced solvent use and 

the associated waste production.  

The separation with this new system was identical to that obtained in the 

original Carreto method. However, the signal‐to‐noise ratio in the mass spectrometer 

remained unacceptably low. The excessively high background level masked some of the 

compounds of interest as shown in the total ion concentration (TIC) chromatograms 

(Figure 3.2 A). Various washes of the HPLC and MS systems, as well as a change in the 

26  

brand of solvents as advised by the Thermo technical support team did not solve this 

problem. Further, while the solvent pooling was greatly reduced, it still occurred, 

though not as rapidly.  

I theorized that the spatial configuration of the front chamber was the origin of 

the problem. The auxiliary gas flow (N2), although necessary for desolvation, and the 

spray from the ion source itself, created a Venturi effect that prevented the condensate 

from the spray from evacuating through the exhaust opening. This possibly increased 

background noise levels as some exhaust would re‐circulate in the chamber. At this 

point a Thermo engineer contacted me to report that another client working on 

compounds with a comparable mass range had experienced similar background issues. 

As I had hypothesized, the problem was thought to be linked to a flaw in the design of 

the exhausts of the front chamber of the MS that created a back flow of gas and 

vaporized solvent after it had contacted the plastic exhaust tubing and fitting.  The 

configuration of newer models did successfully address the situation with changes in 

exhaust position and diameter, but I did not have access to a newer instrument. 

However, according to the Thermo engineer the other client had considerably reduced 

the issue by using a small accessory pump to draw out the exhaust gas to reduce 

backflow. I installed a pump and was able to reduce the background to a level 

acceptable for my purpose (Figure 3.2.B). 

I then tested whether the use of formic acid instead of trifluoroacetic acid (TFA) 

in the mobile phase would further improve the signal‐to‐noise ratio.  This proved not to 

be the case. The background ion levels generated with this modification were higher 

(Figure 3.3 A and B). Furthermore the separation was not as satisfactory. Palythine and 

shinorine overlapped and there were some elution orders changed compared to Carreto 

et al. (2005). Subsequently, Carignan et al. (2009) published a work that used formic 

acid in the mobile phase with its corresponding elution order that I could have used as a 

new reference. However I continued using TFA due to the higher quality of the MS signal 

in our instrument. 

27  

At this point the method was adequate to meet my purposes as it allowed 

proper identification as well as an adequate separation of all MAAs observed in my 

typical samples. The only drawback was a lengthy run time: 50 minutes for separation 

plus an additional 6 minutes to re‐equilibrate the column to 100% solvent A.  

Each MS run consisted of a series of pairs of scanning events: a simple MS scan 

giving the mass of any eluting ionized MAA (Molar mass +1 also noted m/z) followed by 

a MS2 scan giving the fragmentation pattern of the most intense ion found in the MS 

scan taken from a list of common marine MAAs. The list I created contains molar mass + 

1= m/z =245, 246, 273, 275, 285, 289, 303, 305, 329, 333, 345, 347. This type of MS2 

scan is called data‐dependent scanning. It is particularly useful when the mixture of 

MAAs in a sample is unknown, as the instrument will isolate, for each scan, the most 

abundant MAA and give its MS2 spectrum. Data‐dependent scanning avoids having to 

run the sample twice: one time to find out the mass of the MAAs present and their 

elution time and a second time to obtain the MS2 spectrum of the mass observed at this 

elution time. While the list I selected for data‐dependant scanning worked very well for 

my purposes, it can be modified to suit the needs of other users as new MAAs with 

masses not yet determined are being discovered.  

Satisfied with this method, I started to work on the quantitative aspect of the 

study. However, it became clear that the quantification was not reproducible as 

replicates would show over 100% variation in chromatographic peak area due to 

malfunctions in the HPLC system. A summary of most issues experienced, the 

instruments affected, solutions and outcomes is given in Table 3.2 as it could be a useful 

troubleshooting guideline for other users.  

 

28  

 

 Figure 3.2 A. Chromatograms before addition of an auxiliary pump, the MS signal is drowned by the noise. The first chromatogram shows the UVR absorption from 280nm to 400nm. The second chromatogram is the mass chromatogram showing the relative abundance of all ions detected by the mass spectrometer (total ion concentration:TIC).  

 

 Figure 3.2 B. Chromatograms after addition of an auxiliary pump, the MS signal to noise ratio is getting better. 

RT: 0.00 - 50.00

0  10 20 30 40 50Time (min)

0

50

100 0

50000

100000

150000  

    

 

   

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

PDA response at 280‐400nm 

MS response Total ion 

concentration 

uAU 

RT: 0.00 - 50.00

0  10 20 30 40 50Time (min)

0

50

100 0

50000

100000uA

U  

  

 

  

  

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

PDA response at 280‐400nm 

MS response Total ion 

concentration 

29  

 

 Figure 3.3 A. HPLC separation of a mixture of samples using formic acid instead of TFA for the mobile phase. The separation is not as good and the signal to noise ratio is not improved. 

   

 Figure 3.3 B. Separation of the same mixture using TFA: this gave the best separation and signal to noise ratio. 

  

 

RT: 0.00 - 56.00

0 10 20 30 40 50Time (min)

0 

50 

1000 

200000 

400000 uA

U 

:   

:   

PDA response at 280‐400nm 

MS response Total ion 

concentration 

RT: 0.00 - 40.14

0 10 20 30 40Time (min)

0 

50

100 0 

100000

200000

    

 

uAU 

PDA response at 280‐400nm 

MS response Total ion 

concentration 

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

R

elat

ive

Ab

un

dan

ce

30  

Table 3.2. Problems and solutions found with the HIMB HPLC‐MS system.  Symptoms Issues Solution Outcome Loss of refrigeration in autosampler tray

Refrigeration unit needs to be replaced (a common issue after a few years)

-Refrigeration unit replaced

-Solved

Recurrent computer freeze during operation of the LC-MS

Thermo suggested to upgrade the Xcalibur software.

-Thermo technician upgraded to Xcalibur 5.0 during the yearly preventative maintenance

-The hard drive failed after upgrade and the computer had to be replaced

PDA unresponsive Incompatibility with the upgrade of the software

-Replacing an electronic component and new firmware.

-Solved

Large pulsations visible on the absorption chromatogram (pressure variation of the HPLC pump).

After weeks of testing we found out the pump was partially blocked (a preventative maintenance engineer stacked a replacement washer over the old one leading to a partial plugging of the pump.)

-Rebuilding of the pump.

-Solved

Lack of reproducibility of quantitation. Malfunction of the autosampler.

An improper part (wrong model tubing) had been placed in the injection system by a preventative maintenance engineer.

-Replacement of the needle assembly

-Solved

Double peaks on the chromatograms while running the autosampler in no waste mode (smallest waste of sample per injection)

This happened after the upgrade but because it also coincided with the installation of a new set of columns we first looked for dead volume in the column or a pH problem in the solution. Ultimately we found out the upgrade had led to an increase in the amount of non-buffered wash solution mixed with the injected sample in no wash mode.

-Switch columns and test. -Make new batches of solution and test. -Use “partial” or “full” loop mode for sample injection. -Empirically change the setting on length of needle assembly tubing to reduce volume of wash solution front. -Place buffered solution in wash bottle (not recommended for long period of time as the acid could corrode the syringe plunger and introduce contaminant.)

-Did not resolve -Did not resolve. -This is the ideal solution if the sample amount is large enough but not applicable with our small fish sample volume. -Adequate result --------------------------------------------------------------------------- -Best solution for small samples requiring the “no waste” mode.

Failure of the Nitrogen generator

An electronic component failed.

-Replacement of electronic component

-Solved

Error message upon starting the Mass spectrometer.

Malfunctioning MS motherboard

-Replacement of motherboard

-Solved

 

31  

After implementing these solutions the instruments were all finally working up 

to specification, my method was able to provide reliable information. However, one last 

hurdle led to another modification. My columns were accidentally damaged. Because 

the order for replacement columns was delayed, a Phenomenex representative offered 

us a no‐risk trial of a new type of column: Kinetex C18, end‐capped, 2μm particle size 

(Phenomenex). They claimed that these columns were able to shorten the separation 

time of most applications.  This would require adapting my method but in view of the 

anticipated long wait for my regular back‐ordered columns I experimented with these 

columns. 

I tested the separation using extracts of fresh Pocillopora meandrina since it 

contained most of the MAAs encountered in my study.  A single Kinetex column did not 

achieve the proper separation; however two columns in series gave satisfactory results. 

The final setup was: Kinetex C18  150 x 2.0mm followed by a Kinetex C18  100 x 2.0mm; 

protected by the corresponding Krudcatcher (all these are Phenomenex products). After 

modifying the pH of solvent A and the gradient, I was able to reproduce the same order 

of elution as the one published in Carreto et al. (2005). 

This new separation method had the advantage of being faster since each run 

took less than 25 minutes instead of 50 minutes. The modified gradient is presented in 

Table 3.3 and the resulting elution times are given in table 3.4. 

 

Table 3.3. Gradient protocol for MAAs separation with Kinetex columns‐Solvent A (water, trifluoroacetic acid (TFA) 2%, ammonia to pH=3.00 (instead of pH:3.15 in Carreto et al. 2005) ‐Solvent B (80:10:10) (water TFA.2% ammonia pH2.2:methanol: acetonitrile)  

Time (min) Percent eluent A Percent eluent B Flow rate (ul/min)

0  100  0  190 

1.25  100  0  190 

9.38  80  20  190 

18.75  50  50  190 

25  50  50  190 

 

32  

Table 3.4. MAAs retention times. The order of elution is consistent with Carreto et al (2005).   

Elution order

Substance Retention time(min)

1 Shinorine 3.5 2 Mycosporine-2-glycine 4 3 Palytine-Serine 4.18 4 Palytine 4.5 5 Asterina 5.3 6 Porphyra-334 6.2 7 Mycosporine-Glycine 6.5 8 Palythine threonine 8.3 9 Palythinol 8.6 10 Mycosporine-methylamine-threonine 11.5 11 Usujirene 18.1 13 Palythene 18.8

  

The MAA identity could be confirmed using the MS2 spectra, the mass, the 

wavelength maximum and the order of elution. Figures 3.4 A to 3.4 G show examples of 

the data gathered to identify the main MAAs found in an extract from the lens of the 

Coral Trout, Plectropomus leopardus, from Australia donated by Maxi Eckes (Australian 

Institute of Marine Science). This extract had been already been titrated against MAA 

standards at AIMS and therefore was deemed to be a useful secondary standard 

containing palythine, asterina and palythene. In addition to these three MAAs, my 

method also identified usujirene, an MAA that had not been differentiated from 

palythene in the original AIMS titration.  

33  

Figure 3.4 A. UV absorbance and mass chromatograms.‐ Data gathered by the LCMS to identify the four main MAAs: a,b,c,d found in Plectropomus leopardus lens extracts using the Kinetex columns separation method.  

 Figure 3.4 B. Mass of each of the four MAAs. This is the ionized mass/charge noted m/z the charge is one so the ionized mass is [M+H]+ (molecular mass plus one.)  

RT: 0.00 - 38.00 

0  10 20 30 Time (min)

0 

50

100 0 

50000 

100000 

uAU 

 

     

  

    

PDA response at 290‐400nm 

MS response.  Total Ion 

Concentration 

Rel

ativ

e A

bund

ance

aa

a

b

cd

b

c

d

   

0 10  20 30Time (min)

0 

1000 

1000 

100 

 

 

 

 

  

m/z= 244.50-245.50   

 m/z= 288.50-289.50   

m/z= 284.50-285.50   

a

b 

cd

34  

Wavelength maximum for a 

300 400wavelength (nm)

0

20000

uA

U

320.00

Wavelength maximum for b 

300 400wavelength (nm)

0

100000

200000

uA

U

330.00

Wavelength maximum for c 

300 400wavelength (nm)

0

10000

uA

U

357.00

Wavelength maximum for d 

300 400wavelength (nm)

0

50000

uA

U

360.00

 Figure 3.4 C. Wavelength maximum of each compound.  

 Figure 3.4 D. MS2 fragmentation pattern for a. Corresponds to published MS2 for palythine (Whitehead & Hedge 2003)   

 

      ms2 245.00 

100 150 200 250m/z

0

2000000

4000000

6000000

8000000

1000000

245230

186 209

197

*

Inte

nsity

35  

 Figure 3.4 E. MS2 fragmentation pattern for b. Corresponds to published MS2 for asterina (Whitehead & Hedges 2003)   

 Figure 3.4 F. MS2 fragmentation pattern for c. Corresponds to published MS2 for palythene (Whitehead & Hedges 2003)  

 

 Figure 3.4 G. MS2fragmentation pattern for d. Corresponds to published MS2 for palythene (Whitehead & Hedges 2003). Note that usujirene and palythene are geometric isomers and have the same fragmentation pattern and mass. To differentiate them it is necessary to separate them to compare their wavelength maximum 357nm and 360nm respectively and their order of elution: usujirene elutes before palythene with the Kinetex method as with the original Carreto et al. (2005) method.   

                   ms2 289.00 

100 150 200 250 300m/z

0

20000000

40000000

60000000

80000000

100000000

120000000289

274

230

271186 212

                  ms2 285.00 

100  150 200 250m/z

0

2000000

4000000

6000000

285

270

226

241197

           :        ms2 285.00 

100  150 200 250m/z

0

1000000

2000000

3000000

4000000

285

270

226197 241

*

*

*

Inte

nsity

Inte

nsity

Inte

nsity

36  

The separation was sufficient to move on to quantification based on the HPLC 

chromatogram with this alternate HPLC method.  

3.4Quantification:EmpiricalTestingOfAnExtensionOfBeer‐LambertLaw

 

It has been suggested that it is possible to quantify each MAA in the absence of 

standards (Banaszak & Trench 1995, Whitehead & Hedges 2003, Tartarotti et al. 2001, 

Torres et al 2007.) This was done using the HPLC chromatogram peak area at the 

wavelength maximum using the published extinction coefficient and an extension of the 

Beer‐Lambert law. However, only one of these papers actually gave the formula used for 

quantification: 

Equation 1: (from Banaszak & Trench 1995) 

C = (a * A * f) * (b* E)-1

Where: 

a= peak area (mV s), 

 A=absorbance (non dimensional absorbance unit, AU), 

f = flow rate (ml s‐l), 

b= path length of flow cell (cm),   

E =molar extinction coefficient (m mol‐1 cm‐1 Banaszak pers. com).  

C= concentration in mmol l‐1 (Banaszak pers. com.) 

Because the published equation contained some typographic errors (Banaszak 

pers. com.) and a dimensional analysis revealed some inconsistencies in units, I decided 

to explore whether this model could be verified empirically, or else modified to provide 

a good quantitative estimate based on HPLC peaks. To do so I used the only two MAA 

primary standards at my disposal, palythine and porphyra. 

Typically in spectrophotometry the “main derivation of Beer‐Lambert law” also 

simply called “Beer’s law” is used to calculate concentration from the absorbance 

reading of a pure standard at its absorption maximum. The well‐known formula is 

shown below. 

37  

Equation 2: 

C=A/(d*ε)  

where C is the concentration of the standard given in mole/liter,  

A is the absorption reading at the wavelength maximum (non‐

dimensional unit of AU: absorbance unit),  

d is the path length of the spectrophotometer in cm, 

ε is the extinction coefficient of the standard in  M−1 cm−1 or L mol−1 cm−1.   

This linear relationship is very accurate with adequately diluted solutions, but 

breaks down at high concentrations as some solute particles in the light path are in the 

“shadow” of others. In practice, for MAAs as for many compounds, a solution with an 

absorbance lower than or equal to 1AU at the wavelength maximum (when measured 

with a 1cm path length spectrophotometer) will fall in the linear portion of the 

relationship (Whitehead pers. com.).  

I prepared a dilution series of the palythine standard and measured the 

absorbance at the palythine absorption maximum: λ=320nm (Badaranayake 1998 and 

ref. therein) in a Nanodrop 2000 spectrophotometer to calculate their concentrations 

using the Beer‐Lambert law. This provided a spectrophotometric‐based concentration 

for each sample in the series. Because the path length of the Nanodrop 2000 is 1mm, I 

started at a maximum absorbance of approximately 0.1AU (equivalent to 1AU for a 1cm 

path length). I then injected 10ul of each of these dilutions in the HPLC using the 

method previously described, and compared the concentration (in mol/L) of palythine 

calculated from the HPLC peak as per Equation 1 (Banaszak & Trench 1995) relative to 

the concentration obtained from the spectrophotometer data using Beer‐Lambert Law 

(Equation 2). My results did not give the expected correspondence between the two 

models (Figure 3.5). The percentage difference between the expected 

(spectrophotometer‐generated) and the observed value from the Banaszak formula 

(HPLC‐generated) varied between 4 and 88 %. 

38  

Palythine concentration calculated from HPLC data using Banaszak 1995 formula vs concentration calculated with Beers Law using the

spectrophotometer

y = 1.64x - 1E-10

R2 = 0.98

0.00E+00

1.00E-05

2.00E-05

3.00E-05

4.00E-05

5.00E-05

6.00E-05

0 5E-06 1E-05 2E-05 2E-05 3E-05 3E-05 4E-05 4E-05

Palythine concentration using the spectrophotometer (mol/L)

Pa

lyth

ine

co

nc

en

tra

tio

n

us

ing

HP

LC

Pe

ak

s (

mo

l/L)

  Figure 3.5. Palythine concentration. Comparing values computed from Equation 1 with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law). In the next four figures the dotted black line represents the expected values if there were perfect correspondence x=y between the statistics plotted.  

I then reasoned that, for a given MAA peak, the HPLC chromatogram at its 

wavelength of maximum absorption represents basically a sum of successive 

spectrophotometer measurements (spectra) of the sample as it passes through the 

HPLC cell over time.  This reasoning led to a modified equation below. 

Equation 3: 

C=a*f/(ε*d) 

Where C is the number of moles injected, given in mmoles (to obtain the 

concentration in mol L−1 it suffices to convert to moles and divide by the 

injection volume );  

a is the calculated area under the absorbance peak in AU.s;  

f is flow rate in ml s−1  

ε is the extinction coefficient in L mol−1 cm−1 and  

d is the path length of the HPLC cell in cm.  (Note that our instrument possesses 

a 5cm flow cell instead of the standard 1cm cell.) 

39  

With this alternate equation, we found the obtained value was a multiple of the 

expected value. In effect use of Equation 3 resulted in a relationship where:  

HPLC‐generated value = 0.8 * Spectrophotometer‐generated value 

The minute Y‐intercept value (1E‐7) is rounded off to zero as, in practice; it represents an 

error smaller than the normal variability of the spectrophotometric reading. 

Palythine concentration derived from HPLC peaks using Equation 3 vs amount calculated with Beers Law using the

spectrophotometer

y = 0.8002x - 1E-07

R2 = 0.9974

0.00E+00

5.00E-06

1.00E-05

1.50E-05

2.00E-05

2.50E-05

3.00E-05

3.50E-05

4.00E-05

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05 3.50E-05 4.00E-05

Palythine concentration from spectrophotometer (mol/L)

Pa

lyth

ine

co

nc

en

tra

tio

n

fro

m H

PL

C p

ea

k (

mo

l/L)

  

Figure 3.6. Palythine concentration. Comparing  values computed from Equation 3 with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law)  

To ascertain if these results held true for other MAAs, I used solutions of my 

second standard: porphyra measured at λ=334 nm (this MAAs’ absorption maximum). I 

obtained similar outcomes (Figure 3.7 and 3.8), an inconsistent relationship using the 

1995 Banaszack & Trench formula (Equation 1) and a good correlation using my 

alternate formula (Equation 3) that led again to the simple linear equation of: 

HPLC‐generated value= 0.8 * Spectrophotometer‐generated value.  

 Again, the Y‐intercept is rounded off to zero.  

 The 20% “signal loss” of the HPLC‐generated value compared to the 

spectrophotometricaly‐derived reference, is assumed to be instrument‐related, possibly 

due to the data acquisition rate of the photo diode array, although I did not try to test 

this hypothesis. The 20% signal loss can be used as a correction factor to adjust the 

40  

HPLC derived amount to the 20% higher “true” spectrophotometer values. In the 

absence of more standards to verify this relationship for all MAAs, I accept that 

equation 3 accurately estimates amounts for all MAAs (after correcting for signal loss).  

Porphyra concentration calculated from HPLC data using Banaszak formula vs amounts calculated from the

spectrophotometer using Beers Law

y = 1.199x - 7E-06

R2 = 0.9626

0.00E+00

5.00E-06

1.00E-05

1.50E-05

2.00E-05

2.50E-05

3.00E-05

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

Porphyra concentration using the spectrophotometer (mol/L)

Po

rph

yra

co

nc

en

tra

tio

n

fro

m H

PL

C p

ea

ks

(m

ol/L

)

  Figure 3.7 Porphyra concentration. Comparing values computed from Equation 1 with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law).   

Porphyra concentration calculated from HPLC data using Equation 3 vs concentration calculated from spectrophotometer using Beers

Law

y = 0.809x - 5E-07

R2 = 0.9984

0.00E+00

5.00E-06

1.00E-05

1.50E-05

2.00E-05

2.50E-05

3.00E-05

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 2.00E-05 2.50E-05 3.00E-05

Porphyra concentration using the spectrophotometer (mol/L)

Po

rph

yra

c

on

ce

ntr

ati

on

fro

m

HP

LC

pe

ak

s (

mo

l/L)

  Figure 3.8 Porphyra concentration. Comparing  values computed from Equation 3 with values obtained from Equation 2 (Beer’s Law). 

41  

  

To check the limits of this relationship with our system at HIMB I added data 

points with more concentrated solutions to observe when the linearity of the 

relationship broke down (Figure 3.9). 

 

Porphyra concentration calculated with HPLC data vs absorbance (measured with a nanodrop)

0.00E+00

1.00E-05

2.00E-05

3.00E-05

4.00E-05

5.00E-05

6.00E-05

7.00E-05

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Absorbance (AU)

Po

rph

yra

co

nc

en

tra

tio

n

ca

lcu

late

d u

sin

g H

PL

C

pe

ak

s (

mo

l/L

)

  Figure 3.9. Porphyra concentration vs. absorbance. The absorbance shown is measured on a 1mm path length nanodrop 2000. When using a more classical 1cm cell cuvette spectrophotometer the values of the x‐axis are multiplied by 10.    Data presented in the previous graph.  

 Added concentrations.   My original estimation of using solutions of absorbance less than or equal to 

1AU in a 1cm path length spectrophotomer (0.1 for a 1mm path length) proved to be 

correct, and even a bit conservative. In practice this means that when analyzing an 

unknown sample it is safe to dilute it until it reaches a total maximum absorbance close 

to 1AU (or 0.1AU for the nanodrop). This will insure that each of the MAAs in the sample 

will be within an appropriate range for quantification using the corresponding HPLC 

peaks.  

42  

As an added precaution, in the absence of standards it is useful to use a mixture 

of samples to build a response curve. The sample mix should be serially diluted so as to 

bracket the absorbance level of all samples analyzed. Replicates of each dilution level 

are run through the HPLC and the graph of the response versus dilution level is 

examined for reproducibility and linearity.   

To sum up, using the Thermo deca XP plus I can now analyze, qualitatively and 

quantitatively, samples containing MAA mixtures in the absence of standards. Here I 

have proposed two equally valuable separation methods. I have found after running my 

samples (chapter 4) that while the Kinetex columns gave more rapid results, their 

lifetime appears shorter than the 5μm columns because they proved not very suited for 

a highly aqueous mobile phase.  Users will have to decide if they are willing to sacrifice 

durability for speed.  

The methods presented here should be usable on the same instrument or easily 

adaptable to similar models of ion trap mass spectrometers. If a different HPLC 

instrument is utilized, it would be prudent to use, as I have done, one or two standards 

to verify or modify the correlation between the spectrophotometer‐generated 

quantitation using Beer‐Lambert law and the extension of the law to the HPLC 

chromatogram proposed here (Equation 3) for quantification.  

This method development did not address the topics of sample extraction and 

cleaning that have been described in detail by other authors (Carreto et al. 2005, 

Banaszak et al. 2006, Torregiani & Lesser 2007, etc.), or by my subsequent work (see 

chapter 4). It is important to note that to obtain the best separation possible, the dried 

extracts of the sample are re‐suspended in “solution A” just before injection, as 

recommended by Carreto et al. (2005).  

I also refer the readers to work on coral and fish to examine how MAA 

concentrations are normalized with soluble protein content or dry weight to compare 

values between samples. (Karentz et al. 1997, Torregiani & Lesser 2007,  Hoyer 2002, 

Yakovleva & Baird 2005, Banaszak et al. 2006, Torres et al. 2007, and chapter 4 herein). 

43  

3.5Conclusion 

Our understanding of UVR protection in reef organisms is rendered even more critical in 

the context of the reduction of the ozone layer and as we enter a period of 

anthropogenic sudden climate change (Farman 1987, Gleason 1993, Smith et al. 1989, 

1992). MAAs are important sunscreen compounds in coral reef organisms and likely 

critical for UVR protection (Dunlap & Shick 1998, Karentz 2001, Adams & Shick  1996, 

Badaranayake 1998, Dunlap et al. 1998, reviews by Rastogi et al. 2010 and Carreto & 

Carignan 2011).  

Until recently MAA research was restricted to the researchers who could 

produce or borrow the non‐commercially available standards they needed. My work 

should contribute to addressing these constraints. Much remains to be discovered and 

understood about mycosporine‐like amino acids. As our body of knowledge increases so 

should the momentum towards the commercial production of standards for all known 

MAAs. But in the meantime we now have tools to overcome this limitation. 

 

44  

CHAPTER4.NATURALSUNSCREENCOMPOUNDSINTHREESPECIESOFCORALANDTHEIRFISHPREDATOR

4.1Introduction 

Although ultraviolet radiation (UVR) has some beneficial roles in living organisms 

including humans, most UVR effects are detrimental (reviews by Cockell & Knowland 

1999 and Gallagher & Lee 2006). The negative effects of UVR include DNA damage, cell 

death induction (Kulms et al. 1999), corneal and epithelial damage (sunburn) (Siebeck 

1988, Martinez‐Levasseur et al. 2011), immunosupression (Schwarz & Schwarz 2011), 

inhibition of photosynthetic primary production in plants (Jones & Kok 1966, Teramura 

1980 & 1983, Gold & Caldwell 1983, Wood 1987, Strid et al. 1990), and reduction of 

microbial motility (Sommaruga et al. 1996, Sommaruga & Buma 2000), to name a few. 

Some organisms exposed to UVR in their environment have developed blocking 

compounds to minimize UVR damage (Garcia‐Pichel & Castenholz 1993, Chalker et al. 

1988, Banaszak et al. 1998, Cockell & Knowland 1999, Moisan & Mitchell 2001, Shick & 

Dunlap 2002, Banaszak & Lesser 2009, Hansson et al. 2007, Hansson & Hylander 2009, 

Rastogi et all. 2010).  

While it had been commonly believed that UVR does not penetrate water, in the 

early 20th century the presence of UVR deep into the sea was documented (Jerlov 1950). 

Harmful effects of UVR on benthic aquatic organisms have been studied since the 1980's 

(Jokiel 1980, Siebeck 1988, Wood 1987). Sessile benthic organisms in shallow water are 

constrained to remain at the same depth and might be expected to experience higher 

UVR exposure than nektonic and planktonic organisms, but evidence has also been 

found for negative impacts of UVR in the open ocean (Smith 1989, Smith et al. 1992, 

Karentz et al. 1991, Neale & Kieber 2000, Bancroft et al. 2007, Meador et al. 2009). 

Fishes from a wide range of habitats are impacted by UVR, and negative impacts 

can occur in several ways (Cullen et al. 1994, Ramos et al. 1994, Lowe & Goodman‐Lowe 

1996, Freitag et al. 1998, Steeger et al. 1999, Hofer 2000, Kelly & Bothwell 2002). The 

DNA of larval Northern Anchovies and Pacific Mackerel (Hunter et al. 1979, Vetter et al. 

45  

1999) and cod (Lesser et al. 2001) is damaged by UVR. Juvenile fish can also be affected 

(Bell & Hoar 1950, Lowe & Goodman‐Lowe 1996, Kelly & Bothwell 2002, Kazerouni & 

Khodabandeh 2010). Adults of several species are impacted by UVR (Crowell 1930, 

Bullock & Coutts 1985, Kelly & Bothwell 2002): fish can get sunburned (Crowell 1930, 

Bullock 1982, McArdle & Bullock 1987, Lowe & Goodman Lowe 1996) and UVR can 

create photosensitivity to various substances. For both sunburn and photosensitivity the 

resulting skin ulcerations are an open path for infection that can lead to death (Bullock 

& Roberts 1981, Bullock & Coutts 1985, McArdle & Bullock 1987, Little & Fabacher 

1994).  

Some cartilaginous fishes such as hammerhead shark use melanization (sun 

tanning) to guard themselves from sunburn (Lowe & Goodman Lowe 1996). In contrast, 

protection from UVR for bony fishes has been shown to be conferred by substances on 

the surface of the fish (Fabacher & Little 1995, Zamzow & Losey 2002, Zamzow 2003a).  

For many marine organisms UVR protection is due to the presence of a family of 

chemicals termed mycosporine‐like amino acids “MAAs” (Adams & Shick 1996, 2001, 

Dunlap & Shick 1998, Neale et al. 1998, Cockell & Knowland 1999, Karentz et al. 1991, 

1997, Karentz 2001, Klisch et al. 2001, Suh et al. 2003, Ferroni et al. 2010, Rastogi et al. 

2010). Until recently it was thought that the biochemical machinery involved in de novo 

syntheses of these compounds was derived from an enzymatic pathway that did not 

occur in animals, the shikimate pathway (Favre‐Bonvin et al. 1987, Shick et al. 1999, 

Shick & Dunlap 2002). In the case of symbiotic host animals such as sea anemones and 

corals, the animal is thought to obtain MAAs from their food and their algal 

endosymbionts, dinoflagelates in the genus Symbiodinium. The Symbiodinium‐produced 

MAAs are called primary MAAs. They can be translocated to the host tissues where 

some are transformed into other MAAs called secondary MAAs (Shick, 2004).  

However, this traditional view has been challenged by the recent discovery of 

some of the genes coding for enzymes of the shikimate pathway in the genome of the 

sea anemone Nematostella vectensis (Starcevic et al. 2008). More recently, Balskus & 

Walsh (2010) combined genetic and molecular techniques to show that de novo 

46  

synthesis of the MAA shinorine in Anabaena variabilis, a cyanobacteria, did not, in fact, 

involve the shikimate pathway, but instead the authors described an entirely different 

and new scheme for MAA synthesis. Their work has revolutionized our understanding of 

the biosynthetic pathway of MAAs. Nevertheless various studies support the idea that 

diet is the source of MAAs in some “non‐symbiotic” metazoans (Carroll & Shick 1996, 

Mason et al. 1998, Newman et al. 2000, Adams et al. 2001, Whitehead et al. 2001).  

In 2002, Zamzow & Losey discovered that many reef fish species could 

incorporate UVR blockers into the mucus that covers their bodies when exposed to UVR. 

Zamzow (2003a, 2004) then showed experimentally that fish exposed to UVR and given 

a synthetic food supplemented with Acanthophora spicifera, an alga rich in MAAs, 

increased the UVR absorbance of their mucus. In contrast, fish exposed to UVR but fed 

the synthetic diet without A. spicifera showed a reduction in UVR absorbance by the 

mucus. Zamzow & Losey (2002) further observed that the absorbance profiles of fish 

mucus are consistent with the profiles of various MAAs or mixtures of MAAs and related 

compounds, although they did not verify this chemically.  

I later followed up their work. In the absence of commercially available 

standards, I used the Whitehead & Hedges (2003) identification method using 

electrospray ionization and mass tandem spectrometry (ESI‐MS/MS) to confirm that 

some of the UVR blockers in reef fish mucus were indeed MAAs. (ASP photobiology 

conference 2006). Eckes et al. (2008) also substantiated this observation using High 

Precision Liquid Chromatography (HPLC) and MAA standards.  

While Zamzow (2003a, 2004) pointed to diet as the source of the UVR blockers in 

reef fish mucus, our preliminary findings led us to investigate the relationship between 

the MAAs in the diet, and those that eventually appear in the mucus. Do fishes 

sequester all or only some of the available MAAs in their diet? Can they modulate 

sequestration to match changes in the ambient UVR level? Furthermore, while there has 

been laboratory study of how the MAAs in a man‐made diet affect UVR protection in 

fish (Mason et al. 1998, Zamzow 2003a, 2004), there has been little direct study of MAA 

acquisition by fish from their normal diet in natural settings. These questions are 

47  

important both in terms of general understanding of evolutionary and biological 

processes in nature and in providing information on the way fish, which may be targets 

of culture or fisheries programs, protect themselves from damage due to UVR exposure. 

In the work presented here I sought to shed light on these points by identifying the 

MAAs found in both an obligate corallivorous fish species and the corals they eat in the 

natural reef setting. To establish if different levels of MAAs correlate with different 

levels of UVR exposure, I quantified the MAAs found in the fish and their coral prey as 

well as the percent of surface downwelling UVR irradiance in three different non‐

overlapping depth ranges.  

I tested four qualitative and two quantitative hypotheses. 

H0‐1 There will be no difference in the identities of the MAAs found among 

species of corals. 

H0‐2 There will be no difference with depth in the identities of the MAAs found 

for each coral species studied. 

H0‐3 There will be no difference with depth in the identities of the MAAs found 

in fish. 

H0‐4 The fish mucus will have the same suite of MAAs as the coral eaten. 

H0‐5 The corals will show no change in MAA concentration with depth. 

H0‐6 The fish mucus will show no change in MAA concentration with depth. 

4.2Methods

4.2.1Fieldwork

4.2.1.aStudyspeciesandlocation: 

Chaetodon multicinctus, a territorial butterflyfish, is a well‐studied obligate corallivore. 

The combination of limited spatial distribution (the fish territory) and restricted food 

source, a few coral species, mainly Pocillopora meandrina, Porites compressa and 

Porites lobata (Tricas 1986, Hourigan 1987) offered a unique opportunity to sample the 

UVR blockers occurring both in the fish and in their scleractinian diet. This study 

48  

required a location where C. multicinctus was easily accessible and abundant at various 

depths. Puakō on the Kona coast of Hawai`i satisfied these requirements and was 

chosen as my study site. 

4.2.1.bSampling 

During the summer of 2005, two divers observed and sampled pairs of C. multicinctus in 

each of three depth ranges: 1.5m to 4.57m ( 5 to 15 feet ), 7.62m to 10.67m ( 25 to 35 

feet) and 15.24m to 18.29m (50 to 60 feet). We focused on one pair of fish at a time in 

their territory for two dives and placed small flagged weights on the coral colonies the 

fish fed from. During the following days (between 11am and 2pm) we captured both fish 

using a barrier and hand nets. Once the two fish were brought onto the boat, we used a 

dulled craft blade to collect epidermal mucus (Zamzow 2003a, b, 2004), that we placed 

in scintillation vials kept on dry ice. The fish were returned to their territory and 

released, unharmed within less than an hour of capture. On a subsequent dive to the 

territory we first verified that the fish were healthy, and then collected small samples of 

the marked corals and removed all the flagged weights.  

Coral samples consisted of the tip (~1cm to 2cm high) of a finger for Porites 

compressa and Pocillopora meandrina and a plug of the apical area of Porites lobata 

(~1.5cm2).  We collected P. meandrina and P. compressa using bone shears and used a 

hammer and small chisel for the P. lobata plugs. In this study we sought to analyze the 

MAAs of the entire coral holobiont (coral host and its symbionts). From here‐on 

whenever the word coral is used it refers to the “holobiont” unless otherwise indicated.   

Once on shore the coral samples were also placed in borosilicate scintillation vials kept 

on dry ice. Both fish mucus and coral samples were then freeze‐dried in a Labconco 

freeze drier and kept at ‐80°C until extraction. 

4.2.1.cDownwellingspectralirradiancemeasurements 

To assess the relationship between the depth of the fish territory and UVR exposure, we 

measured relative downwelling irradiance with a USB 2000 spectrophotometer fitted 

49  

with a battery pack and a palm computer. We placed the entire setup in a custom made 

underwater housing (Will’s camera housing, Australia) and attached a UV transparent 

fiber with a cosine corrected sensor (Ocean Optics ref CC3 UV). 

With this instrument a diver took triplicate downwelling Ultraviolet irradiance 

measurements every 10 feet (~3m) from the water surface to the deepest part of the 

reef to establish percent irradiance relative to the irradiance just below the surface. The 

measurements were taken on a clear day in August around noon while the sun is at its 

zenith for the day. This would provide data during maximum UVR exposure and avoided 

variations due to cloud cover. The wave action was minimal for the area but the water 

surface was not perfectly flat as the locale is typically breezy.  

4.2.2Laboratorywork:ChemicalidentityofUVRblockinginfishmucusandtheircoralprey

4.2.2.aMAAextraction 

Extraction of coral and fish mucus samples took place directly in the scintillation vials by 

adding 100% aqueous HPLC‐grade methanol to the vial (0.25ml for mucus samples 6.0ml 

for coral samples). The samples were then sonicated on ice for 5 minutes (Fisher 

Scientific FS60H) and placed the vials in the dark at ‐14°C for 6 hours. The resulting 

methanolic extracts were then transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 5000g 

for 5 minutes at room temperature. The supernatant was then collected and screened 

for UV absorbing characteristics with spectrophotometric readings (NanoDrop ND‐

1000). A second (serial) extraction was applied to each of the coral samples and the 

second extract was pooled with the first (12ml total). This last step was eliminated for 

the fish samples since the second extraction did not yield any measurable UVR 

absorbance.  The methanolic extracts were then filtered using C18 Sep Pak cartridges 

(Waters). Aliquots (100ul) of the filtered samples were placed in 200ul inserts contained 

in 2ml auto‐sampler vials and dried using a speed vac (Juan RC1022). Lastly I replaced 

the air in the vials with dry nitrogen gas and kept the vials at ‐80°C until LC‐MS analysis.  

50  

4.2.2.bHPLCandtandemmassspectrometry 

I used HPLC followed by Mass Spectrometry to separate and identify MAAs. Carreto et 

al. (2005) devised a gradient chromatography method for MAAs providing better 

separation than the more commonly used isocratic schemes. Because the flow rate in 

their technique (~1ml min‐1) was too high for our mass spectrometer, I modified their 

method using smaller diameter columns, adjusting pH, solvents, gradient, and flow rate 

so as to keep the same order of elution.  

The columns used were: first a Kinetex C18 150 x 2.0mm followed by a Kinetex 

C18 100 x 2.0mm, (Phenomenex), protected by the corresponding Krudcatcher.  

The HPLC separations were performed with the two columns connected in series and 

thermostated at 30°C using a Thermo Surveyor MS pump and Thermo Surveyor PDA 

plus (photodiode array detector) scanning between 250 and 450nm. 

Eluent A was a pH 3.00 solution of aqueous trifluoroacetic acid 0.2% and ammonium 

hydroxide (instead of pH 3.15 in Carreto et al. 2005). Eluent B was a solution containing 

TFA 0.2% and ammonium hydroxide at pH2.20:methanol:acetonitrile (80:10:10,v:v:v) 

(adapted from Carreto et al. 2005). The autosampler automatically reconstituted the 

sample in 100ul of Eluent A just before injection. The modified gradient protocol is 

summarized in Table 4.1.  The resulting retention times are given in Table 4.2.  

Table 4.1. Gradient protocol for MAA. Eluent A: water, trifluoroacetic acid (TFA) 2%, ammonium hydroxide to pH3.00. Eluent B (80:10:10) (water TFA.2% ammonium hydroxide pH2.2:methanol:acetonitrile).   

Time (min)   Percent eluent A   Percent eluent B   Flow rate (ul/min) 

0  100  0  190 

1.25  100  0  190 

9.38  80  20  190 

18.75  50  50  190 

25  50  50  190 

 

 

51  

Table 4.2. MAAs retention times. The order of elution  is consistent with Carreto et al 2005.   

Elution order 

Substance Retention time(min) 

1  Shinorine 3.5 

2  Mycosporine‐2‐glycine 4 

3  Palytine‐Serine 4.2 

4  Palytine 4.5 

5  Asterina 5.3 

6  Porphyra‐334 6.2 

7  Mycosporine‐Glycine 6.5 

8  Unknown in damaged P. meandrina 6.9 

9  Palythine threonine 8.3 

10  Palythinol 8.6 

11  Mycosporine‐methylamine‐threonine 11.5 

12  Unknown a in C. multicinctus 14.4 

13  Unknown b in C. multicinctus 15.9 

14  Usujirene 18.1 

15  Palythene 18.8 

16  Unknown in P meandrina 23.5 

 

I applied Whitehead & Hedges’ (2003) published method and spectra for the 

identification of MAAs using electrospray ionization and tandem mass spectrometry ESI‐

MS/MS with a Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus mass spectrometer system operated 

in the positive electrospray ionization (+ESI‐MS) mode (Whitehead & Hedges 2003).  

This positive‐ion mass spectral fragmentation permitted a precise identification of the 

most common MAAs even in the absence of standards since it allowed us to match the 

obtained MS2 spectra of the MAAs present to the specific published MS2 spectra. Using 

this method I gathered, for each observed MAA, the retention time, the absorbance 

maximum, the mass over charge (m/z) of each protonated molecule [M+H]+ 

(corresponding to the molecular mass of the MAA plus one), and the specific 

fragmentation pattern (MS2 spectrum).  

Injection volume was 5ul for the fish mucus extracts and 3ul for the coral 

extracts. During the HPLC analysis, spectra were continuously collected by the PDA from 

250 – 550nm. 

52  

Except when indicated, each MAA was identified based on matching its 

wavelength maximum, mass, and MS2 spectrum with published data. Co‐elution times 

with pure standards of shinorine, palythine and porphyra graciously donated by Dr. 

Michael Lesser were also used as added confirmation. 

Following identification of individual MAAs, I obtained their concentrations using 

an extension of Beer‐ Lambert Law (modified from Banaszak & Trench 1995) 

and published molar extinction coefficients as described by Bandaranayake (1998). 

For all samples, MAA concentration was normalized to the soluble protein 

content of the filtered extract. I used Bio‐Rad Quick Start Bradford protein assay for the 

coral samples but due to the small volumes of the fish mucus extracts I utilized the more 

sensitive NanoOrange florescent assay (Invitrogen). Both assays were read on a 

Spectramax M2 spectrophotometer (Molecular Devices). 

4.3RESULTS

4.3.1MeasurementsofrelativedownwellingUVRirradiance. Figure 4.1 summarizes the percentage of downwelling irradiance found at various 

depths as compared to the levels found just under the surface of the water. As reported 

in previous work (Jerlov 1976) the relative irradiance decreased with depth with UVB 

diminishing faster than UVA. For clarity the graph only shows the percentage of 

downwelling irradiance for the upper and lower limits of each of the three depth‐ranges 

studied (deep, intermediate, shallow).  Each fish territory is contained within one of the 

three non‐overlapping UVR exposure ranges. Additionally, the data shows that at the 

time of the measurements all territories including the deepest ones were exposed to 

some UVR, especially UVA.  

53  

 

Figure 4.1. Relative downwelling  irradiance. The shaded areas correspond to the three depth ranges of the study territories.  

4.3.2Coral:Qualitativeresultsfor3species

As reported in previous work (e.g., Banaszak et al. 2006), the MAA content of the coral 

samples varies by species.  

4.3.2.aPocilloporameandrina 

Pocillopora meandrina presents the greatest array of MAAs (Figure 4.2): shinorine, 

palythine‐serine, asterina, porphyra, mycosporine glycine, palythine‐threonine, 

mycosporine‐methylamine‐threonine. It also contains traces of an unknown (peak 17) of 

mass and λmax consistent with those of MAAs (316amu and 328nm respectively). 

However, P. meandrina was uncommon in the deepest territories, and when it was 

found colonies were dead or looked unhealthy. Thus, we obtained only two samples of 

this species from 15.24m to 18.29m (50 to 60 feet). The MAAs concentration for these 

deep colonies was very low. Additionally they harbored a different MAA profile as well 

as an unknown UVR absorbing substance at elution time of 6.9 minutes of Mass+1=259 

atomic mass unit (amu) and wavelength maximum λ=327nm not found in P. meandrina 

54  

living in intermediate and shallow territories (Figure 4.3). I did not pursue further 

analysis of this unknown compound.  

Figure 4.2. Typical Chromatogram of Pocillopora meandrina. Notes for all chromatograms in this paper:  a‐  Each MAA  is  given  a  number  corresponding  to  its  order  of  elution  as  seen  in  the summary Table 4.3.  b‐ The absorbance is expressed in the dimensionless unit μAU: micro absorbance unit. c‐ In order to show all MAAs the chromatograms shown are obtained for a wavelength range of 290nm‐400nm unless otherwise indicated.   

 

Figure  4.3.  Chromatogram  for  the  rare  P. meandrina  found  in  the  deep  territories. Mycosporine‐2 ‐glycine (peak 2) and the unknown (peak 8) were not observed at other depth. 

 

0  5  10 15 20 25  30Time (min)

0 

10000 

20000 

30000 

uAU 2

4

7

8

0   10 15 20 25 30Time (min)

0 

100000

200000

300000

uAU 

1 3

5

6 7

9

11

17

55  

Another trace compound only observed in P. meandrina at this depth is 

consistent with mycosporine‐2‐glycine in mass, wavelength maximum and order of 

elution. Since the MS2 spectrum has not yet been published for mycosporine‐2‐glycine, I 

first determined it using our samples.  To further confirm the identity of this MAA I also 

obtained this MS2 spectrum using a previously standardized extract of Anthopleura 

elegantissima graciously provided by Maxi Eckes (AIMS) (Figure 4.4). 

Figure  4.4.  MS2  spectrum  of  mycosporine‐2‐glycine.  Molecular  weight  M=302amu (atomic mass unit) corresponding to a protonated mass of [M+H]+= m/z = 303. 

 

Similarly, the MS2 spectrum of mycosporine‐glycine with our instrument (Figure 

4.5) has not yet been published to our knowledge. Again I obtained it using not only our 

samples but also a previously standardized extract of the zoanthid, Palythoa 

tuberculosa, also provided by Maxi Eckes (AIMS). Mycosporine‐glycine did not appear to 

ionize as easily as the other MAAs observed, resulting in a small MS peak in the total ion 

concentration graph, but enough ions were generated to obtain an MS signal and obtain 

an MS2 spectrum (Figure 4.5).  

The MS2 spectra of palythine‐serine and mycosporine‐methylamine‐threonine 

have also not been published. Without standards, their identification was based on their 

150 200 250  30m/z

0

20 

40 

60 

80 

100 

Rel

ativ

e A

bund

ance

%

303

288

244200267 255 207 228

56  

mass, wavelength maximum and order of elution consistent with Carreto et al. (2005). 

Figures 4.6 and 4.7 respectively show the MS2 spectra of these compounds. 

 

120 140 160 180 200 220 240 260m/z

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e In

tens

ity (

%)

200

198 228210180152146 168136 246186 214

 

Figure 4.5. MS2 spectrum of mycosporine glycine. Molecular weight M=245amu (atomic mass unit) corresponding to a protonated mass of [M+H]+= m/z = 246.    

100 150 200 250m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lativ

e In

ten

sity

(%

)

275

245 260216

207 229172

  Figure 4.6. MS2 spectrum of the putative palytine serine. Molecular weight M=274amu corresponding to a protonated mass of [M+H]+= m/z = 275.   

57  

150 200 250 300m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lativ

e In

ten

sity

(%

)

259

303244

288183 270

Figure 4.7. MS2 spectrum of the putative mycosporine‐glycine‐NMA‐Thr. Molecular weight M=302 corresponding to a protonated mass of [M+H]+= m/z = 303.  

4.3.2.bPoriteslobata 

Porites lobata presents mainly asterina and mycosporine glycine, small amounts of 

palythine‐serine as well as traces of shinorine, and palythine (Figure 4.8). I also observed 

an undetermined UV‐absorbing substance of absorbance maximum ~271nm (too low to 

be an MAA) at elution time ~3.3 minutes. The substance did not appear in the Total Ion 

Concentration MS chromatogram so it might not ionize well or its mass range is below 

or above the target range. I did not attempt to further elucidate the origin of this peak. 

4.3.2.cPoritescompressa  

The Porite compressa chromatogram (Figure 4.9) was very similar to its congener P. 

lobata, it contains mainly asterina, mycosporine‐glycine small amounts of palythine‐

serine, shinorine and palythine. 

 

58  

 

Figure 4.8. Typical chromatogram for Porite lobata.  

 

 

 

Figure 4.9. Typical chromatogram for Porites compressa. 

 

0  5  10 15 20 25 30Time (min)

0 

50000 

100000

150000

200000

250000

uAU 

5

7 4

0  5  10 15 20 25  30Time (min)

0 

20000 

40000 

60000 

80000 uA

U 

5

7

3 4

59  

4.3.3Fishqualitativeresults 

The LC‐MS.MS analysis revealed that the fish mucus extracts contain mainly asterina 

followed by usujirene and palythene (Figure 4.10 A and 4.10 B). Along with these three 

dominant MAAs we also identified traces of palythine, palythinol as well as two possible 

unknown compounds both of mass 284amu and absorption maxima (λmax) at 

wavelengths 330 and 333nm, respectively. 

 

 

 

Figure  4.10 A. Chaetodon multicinctus  chromatograms:  all MAAs.  This  chromatogram uses the PDA in the range 290 to 400nm to show all MAAs.  

0  5 10 15 20 25 30Time (min)

0

200000

400000

600000

800000

1000000  5

14 15

10 4 13

60  

 

Figure 4.10 B. Chaetodon multicinctus chromatograms: selected MAAs. This chromatogram uses the PDA at 360nm only to better show usujirene and palythene at ~18.2 and ~18.8 minutes.  

A summary of the qualitative result for coral and fish is given in Table 4.3. 

 

 

 

 

 

 

0  5  10 15 20 25  30Time (min)

0 

20000 

40000 

60000 

80000 

100000 

120000 

uAU 

14

15

61  

Table 4.3. MAAs presence – absence summary. A MAA  is marked “X”  if  it contributes one  of  the major  absorbance  peaks  of  the  UV  chromatogram,  it  is marked  “+“  if  it contributes  only  a  minor  or  trace  peak.  The  cell  is  left  blank  if  the MAA  was  not detected. The MAAs discovered only in the damaged P. meandrina found in the deeper territories are marked X*.  

Elution order 

Substance  Retention time(min) 

λmax (nm) 

[M+H] +

 Pocilopora meandrina 

Porites lobata 

Porites compressa 

Chaetodon multicinctus 

1  Shinorine  3.5 333 333 X + + 

2  Mycosporine‐2‐glycine 

4  331 303 X*  

3  Palythine‐Serine 

4.18 321 275 X + + 

4  Palythine  4.5 320 245 + + +  +

5  Asterina  5.3 330 289 X X X  X

6  Porphyra‐334  6.2 334 347 X  

7  Mycosporine‐Glycine 

6.5 310 246 X X X 

8  Unknown in damaged P. meandrina 

6.8 327 259 X*  

9  Palythine‐threonine 

8.3 321 289 X  

10  Palythinol  8.6 330 303 + +   +

11  Mycosporine‐methylamine‐threonine 

11.5 327 303 X  

12  Unknown in C. multicinctus 

14.4 330 285   +

13  Unknown in C. multicinctus 

15.86 333 285   +

14  Usujirene  18.1 357 285   X

15  Palythene  18.8 360 285   X

16  Unknown in P. meandrina 

23.5 328 317 +  

62  

4.3.4Coralsquantitativeresults. 

The extracts from the three coral species studied showed a significant decrease in MAA 

concentration with depth. Figure 4.11 to 4.13. 

 

DEPTH

Pm m

yc-N

MA-

thr

nmol

/mg

prot

SID

50000

40000

30000

20000

10000

0

Pm myc-NMA-thr nmol/mg prot vs Depth Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 0.60, p‐value = 0.572   Kruskal‐Wallis on the square root transformed data.  H = 8.59  DF = 2  P‐value: = 0.014   

DEPTHPm p

-ser

ine

nano

mol

es/

mg

prot

SID

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

Pm palythine-serine (nmol/mg prot) vs Depth  Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 2.58, p‐value = 0.137  Kruskal‐Wallis on the square root transformed data.  H = 8.59  DF = 2  P = 0.014   

DEPTH

Pm a

ster

ina

nmol

es/m

g pr

ot

SID

2000

1500

1000

500

0

Pm asterina in nmol/mg prot vs Depth Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 1.01, p‐value = 0.407   Kruskal‐Wallis on the square root transformed data.  H = 8.59  DF = 2  P‐value = 0.014  

  

 Figure 4.11. MAAs quantitative analyses for Pocillopora meandrina. All the tests reported for P. meandrina were performed on square root transformed data to comply with equality of variance assumption.   

63  

DEPTHPm p

al-t

hreo

nine

nm

ol/m

g pr

ot

SID

1200

1000

800

600

400

200

0

Pm palytine-threonine nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 2.57, p‐value = 0.138  Kruskal‐Wallis on the square root transformed data.  H = 7.12  DF = 2  P value: 0.028 

DEPTH

Pm s

hino

rine

nmol

/mg

prot

SID

800700600500400300200100

0

Pm shinorine nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 0.93, p‐value = 0.432   Kruskal‐Wallis on the square root transformed data.  H = 8.59  DF = 2    P value: 0.014  

DEPTH

Pm p

orph

yra

nmol

/mg

prot

SID

700600

500400

300

200100

0

Pm porphyra nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 0.43, p‐value = 0.668  Kruskal‐Wallis on the square root transformed data:  H = 7.81  DF = 2  P = 0.020   

DEPTH

Pm m

yc-g

ly n

mol

/mg

prot

SID

600

500

400

300

200

100

Pm myc-gly in nmol/mg vs Depth  Levene test for equality of variance of the square root transformed data: Test statistic = 1.12, p‐value = 0.372   Kruskal‐Wallis on the square root transformed data:  H = 7.50  DF = 2  P value:  0.024    

 Figure 4.11 (Continued). MAAs quantitative analyses for Pocillopora meandrina. All the tests reported for P. meandrina were performed on square root transformed data to comply with equality of variance assumption. 

64  

DEPTH

Pl a

ster

ina

nmol

/mg

prot

SID

1600140012001000800600400200

0

Pl asterina in nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the Test statistic = 0.61, p‐value = 0.552   Kruskal‐Wallis  H = 14.58  DF = 2  P = 0.001     

 

DEPTH

Pl m

yc-g

ly n

anom

ol/m

g pr

ot

SID

800700600500400300200100

0

Pl myc-gly nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the log transformed data. Test statistic = 2.63, p‐value = 0.094 Kruskal‐Wallis on the log transformed data.  H = 11.01  DF = 2  P = 0.004  

Figure 4.12. MAAs quantification for Porites lobata.  

DEPTH

Pc a

ster

ina

nmol

/mg

prot

SID

5000

4000

3000

2000

1000

0

Pc asterina nmol/ mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the Test statistic = 0.49, p‐value = 0.626  Kruskal‐Wallis  H = 9.54  DF = 2  P = 0.008  

DEPTH

Pc m

yc-g

lyc

nmol

/mg

prot

SID

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

Pc myc-glyc nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the Test statistic = 2.01, p‐value = 0.170  Kruskal‐Wallis  H = 10.08  DF = 2  P = 0.006  

 

Figure 4.13. MAAs quantification for Porites compressa. 

65  

4.3.5Fishquantitativeresults 

In contrast to the coral data, the quantification of each of the main MAAs in fish mucus 

extract, asterina, usujirene and palythene did not show any significant effect of depth 

(Figure 4.14). 

The λmax of palythene and usujirene and asterina are respectively 360nm, 

357nm, 330nm. To test the idea that MAAs that absorb shorter wavelengths would be 

relatively more abundant in the mucus of fish in shallower waters, I also examined the 

ratio [(palythene + usujirene)/asterina] but this ratio also failed to show any pattern of 

change with depth (data not shown). 

 

 

DEPTH

aste

rina

in n

mol

/mg

prot

SID

1400

1200

1000

800

600

400

200

asterina in nmol/mg prot vs Depth  Levene test for equality of variance of the Test statistic = 0.02, p‐value = 0.976  Kruskal‐Wallis  H = 0.70  DF = 2  P = 0.703   

DEPTH

paly

then

e in

nm

ol/m

g pr

ot

SID

181614121086420

palythene in nmol/mg prot vs Depth Levene test for equality of variance of the Test statistic = 1.05, p‐value = 0.369  Kruskal‐Wallis  H = 2.19  DF = 2  P = 0.334  

 

 Figure 4.14. MAAs quantification for Chaetodon multicinctus.  

66  

DEPTH

usuj

irene

nm

ol/m

g pr

ot

SID

6

5

4

3

2

1

0

usujirene nmoles/mg prot vs Depth Levene test for equality of variance of the Test statistic = 1.25, p‐value = 0.308  Kruskal‐Wallis  H = 3.36  DF = 2  P = 0.186  

 

 Figure 4.14 (Continued). MAAs quantification for Chaetodon multicinctus. 

4.4DISCUSSION

4.4.1Qualitativeanalysis 

The MAA profiles of the two Porites species are quite similar in that they both contain 

mainly mycosporine‐glycine and asterina as well as traces of shinorine and palythine‐

serine. In contrast, Pocillopora meandrina presents a greater array of MAAs in addition 

to mycosporine‐glycine and asterina. These MAAs are: 

palythine‐threonine a recently indentified MAA first described in another 

pocilloporid (Carignan et al. 2009),  

mycosporine‐methylamine‐threonine,  

porphyra,  

Traces of an unknown of mass 316amu and λmax 328nm. 

    The greater similarity of MAAs in composition and relative abundance between 

species within the same genus of coral seems reasonable, especially since many Porites 

species appear to be indistinguishable using various genetic markers (Forsman et al. 

2009). Further, the observation is rendered more significant in light of recent findings by 

Stat et al. (2009) who showed that Pocillopora meandrina can simultaneously harbor up 

to 3 different clades of zooxanthellae (A, C and D). In contrast, they found Porites lobata 

only contains clade C (Stat et al. 2009). Porites compressa has also been shown to 

harbor only clade C in other studies (LaJeunesse et al. 2004). Zooxanthellae have been 

67  

characterized using various techniques that possess different merits, limitations and 

levels of resolution (clades, subclades) (e.g., Apprill & Gates 2007, Thornhill et al. 2007, 

Stat et al. 2009). The findings of Stat et al. (2009) were obtained using both the ITS2 

region of nuclear rDNA, and chloroplast 23SrDNA. In both cases they also observed that 

at the sub‐cladal level the symbionts in Pocillopora meandrina were more diverse than 

for Porites lobata. It has long been hypothesized that phylogenetic variation in symbiotic 

dinoflagellates could result in functional difference in the coral holobiont (Buddemeier 

& Fautin 1993). Here, the host species known to harbor a narrow range of symbiodinium 

(Porites lobata and Porites compressa) present an assemblage of MAAs less diverse than 

the species known to contain a greater variety of symbiodinium (Pocillopora 

meandrina). This is intriguing and calls for further studies. 

 For fishes, previous studies have shown that UVR exposure and consumption of 

food rich in MAAs are required to produce UV‐absorbing compounds in the mucus 

(Zamzow 2004). Here, I found that the mucus of Chaetodon multicinctus is rich in 

asterina but the corals consumed, although rich in asterina, contained several other 

MAAs not found in the fish: mainly the primary MAAs, mycosporine‐glycine, shinorine 

and porphyra as well as the secondary MAAs, palythine‐serine, palythine‐threonine and 

mycosporine‐methylamine‐threonine. This could point to a selective sequestration of 

asterina by the fish in its mucus.   

An alternative explanation is that some of the MAAs found in the coral holobiont 

extracts might not be available to the fish if they are confined to zooxanthellae. 

Chaetodon multicinctus does not appear to digest the zooxanthellae from the consumed 

coral, since zooxanthellae are excreted in the fish feces (Dr. Timothy Tricas pers. obs.). 

However, the excretion of some zooxanthellae does not establish that none are 

digested. Furthermore, zooxanthellae leak most of their metabolites into the host 

tissues. In fact mycosporine‐glycine, has been identified in studies of isolated coral 

tissue (Banaszak et al. 2006). Consequently this alternate explanation is unlikely. 

Additionally, another study argues for the selective sequestration hypothesis. 

When Medaka fish (Oryzias latipes) was fed with Mastocarpus stellatus, an algae 

68  

containing shinorine and a small amount of asterina and palythine, the fish did 

accumulate asterina and palythine in their ocular structure but not shinorine (Mason et 

al 1998). The authors concluded that the animal demonstrated a selective absorption.   

More surprisingly in my study, palythene and its isomer usujirene were both 

found in C. multicinctus mucus extract but I did not detect them at all in the three corals 

eaten, Pocillopora meandrina, Porites compressa and Porites lobata. One could 

hypothesize that the fish obtain palythene and usujirene from other possible food 

sources, for instance I found that palythene and usujirene are available in the coral 

Montipora capitata, a species present in the C. multicinctus territories studied. However 

in the field we almost never observed the fish consuming this coral species, thus 

rendering such a scenario unlikely. Consequently the presence of usujirene and 

palythene in the fish mucus is consistent with the possibility that C. multicinctus may 

transform some of the MAAs consumed. Similarly, Whitehead et al. (2001), in their 

study of MAAs in phytoplankton, a phytoplanktivorous pteropod and its predator 

pteropod, found that the herbivorous pteropod harbored some MAAs not contained in 

the phytoplankton they were eating. They concluded that although they could not 

exclude the possibility that the herbivorous pteropods could have accumulated these 

MAAs if they fed on a different type of phytoplankton before sampling, a more plausible 

explanation was that bacteria in the guts of the pteropods transformed some of the 

ingested MAAs. According to our present understanding of MAA biosynthesis (Shick 

2004, Carreto & Carignan 2005, Callone et al. 2006, Singh et al. 2008) usujirene and 

palythene are secondary MAAs that can be generated from porphyra which is 

synthesized from derivatives of mycosporine‐glycine. Mycosporine‐glycine and porphyra 

were clearly present in the consumed coral and may have been transformed by the fish 

into usujirene and palythene. At this point almost nothing is known about the 

mechanisms of translocation of MAAs from the digestive tract to mucus, let alone about 

mechanisms of transformation of consumed MAAs. While our results point towards the 

possibility of this conversion, further research is needed to understand the uptake, 

translocation and possible transformation of MAAs in fishes. We do not know if the fish 

69  

possess any enzymatic machinery able to transform consumed MAAs, or if instead, 

microorganisms such as bacteria present in the fish digestive system or even in its 

epidermal mucus are the origin of the transformation.  

4.4.2Quantitativeanalysis 

The downwelling irradiance data confirm that our three depth ranges received non‐

overlapping levels of UVR irradiance that decreased with increasing depth. I had 

hypothesized that both the coral and the fish would show a decrease in the amount of 

MAAs with increasing depth. As expected, the normalized quantities of the main MAAs 

for each of the three coral species studied clearly decreased with depth/UVR exposure. 

The role of MAAs as a sunscreen compound is well recognized (Böhm et al., 1995, 

Bandaranayake 1998, Neale et al. 1998, Banaszack & Trench 2001, Torres et al. 2006, 

Shick & Dunlap 2002, Karentz 2001, Karsten et al. 2009, Riemer et al. 2007 and others), 

and the coral data presented here add to the body of evidence suggesting an important 

sun screening function of MAAs in corals.  

In contrast, the fish showed no trend of MAAs concentrations with depth (Figure 

4.14). At first glance it seems reasonable to attribute this dissimilarity between the 

corals and the fish to possible differences in their coping mechanisms to UVR. A vagile 

organism like the fish might rely on various methods such as possible behavioral 

mechanisms added to chemical protection; in contrast the totally sessile corals do not 

have such options. Consequently, MAA concentrations in the coral would be more 

responsive to UVR exposure variation than for the fish. However, while we did not 

systematically attempt to describe and quantify behavior in this work, we did not detect 

behavioral differences between fish in the shallow versus deeper territories. 

Additionally, Zamzow’s (2003a, 2004) experimental work on Thalassoma duperrey did 

not find any correlation of any aspect of the fish behavior with UVR dose.  

Another possible source of difference between the coral and fish data might be 

methodological. I used the same LC‐MS method for both types of sample but due to the 

small amount of the fish samples I used a different protein assay for the normalization 

70  

of the fish data. One could argue that this might have affected the quantitative 

measures. However the coral showed the observed trend with depth even before 

normalization whereas the fish samples did not.  

More intriguingly, the absence of change in MAA concentration with depth in 

the fish (figure 4.14) or the lack of change in relative abundance between asterina and 

the two longer wavelength MAAs, palythene and usujirene, with depth (data not shown) 

does not corroborate the observations made using mucus absorbance spectra in this 

fish species at this location by Zamzow (2003a). Zamzow found that mucus absorbance 

clearly decreased with depth of capture and her results also indicated that the spectrum 

of mucus absorbance shifted towards shorter wavelengths at shallower depths. I cannot 

completely exclude the possibility that this apparent contradiction might, in part, be due 

to our different methodologies. I specifically measured the concentration of individual 

MAAs while Zamzow (2003a) measured the total absorbance of the entire mucus which 

contains other substances able to absorb UVR such as various proteins and 

glycoproteins (Asakawa 1970, Fletcher et al. 1976, Shephard 1994).  

However, another difference in between Zamzow (2003a) and this study might 

be of greater significance than methodological variation to explain our contradictory 

findings. The 23 fish in this study were caught during July and August, a time of 

maximum UVR incident irradiance, while the 9 fish examined in the Zamzow study were 

captured in March and April. Kuffner (1999) has shown that UVR irradiance on cloudless 

days in the winter in Hawai`i can be 55‐66% lower than in the summer. Zamzow (2003a) 

has found that the absorbance of the mucus can increase with UVR exposure. It is 

possible that, as exposure increases to very high levels, fish accumulate more MAAs 

until an upper limit is reached beyond which no more MAAs can be added to the mucus 

as shown in the model represented by Figure 4.15. This upper limit is suggested as 

“Emax” in Figure 4.15. 

71  

 

Figure 4‐15. Model of MAA accumulation in fish mucus as a response to UVR exposure.  

The downwelling irradiance measurements showed that, in August, significant 

UVR was present even in the deepest territories (Figure 4.10). If all fish captured in the 

summer had already received irradiance exposure levels at or above Emax then no 

difference would be detected between them. In contrast, the animals captured by 

Zamzow (2003a) could have experienced UVR exposure at or under Emax and would 

show an effect with depth. Both of our divergent findings would be consistent with such 

a model. A possible ceiling effect for MAAs accumulation in the mucus of fish has 

ecological implications as well as practical and economical relevance in the context of 

aquaculture as fish have long been known to sunburn in outdoor pens or clear shallow 

waters (Bullock & Coutts 1985, Berghahn et al. 1993, Ramos et al. 1994, Walter & Ward 

1998, Beveridge 2004). We know that both exposure to UVR and diet affect MAA 

concentrations in fish (Zamzow 2004) but details of the mechanisms modulating MAA 

uptake and translocation in fish are unknown.  

       Emin   Emax

UVR exposure Level 

MAA Accumulation 

72  

4.4.3Conclusion 

This work adds to the body of evidence pointing to an important role for MAAs as a 

natural sunscreen in the marine environment and their presence in, and possible 

transfer to, different levels of the trophic web. My results suggest a selective uptake of 

some MAAs by C. multicinctus and the ability to not only translocate but also to 

transform the consumed MAAs. Additionally, MAAs concentration in fish epidermal 

mucus may well show a ceiling effect. The mechanisms behind these processes are 

unknown and should be investigated.  

In conclusion, much remains to be understood about MAAs. In the past, progress 

in understanding these compounds has often been hampered by the lack of commercial 

standards used for identification. Today, technological advances and collaborations 

between multiple researchers are overcoming this obstacle by providing tools usable by 

all in the research community. The MS2 spectra presented here should prove useful for 

MAA identification by adding to the list previously produced by Whitehead (2003), 

Volkman & Gorbushina (2006) and Carignan et al. (2009).  

73  

CHAPTER5:CONCLUSIONS 

Early life on our planet had to contend with the challenge of ultraviolet radiation (UVR) 

levels much higher than those present today (Cockell 1998, 2000). As a result, living 

organisms developed various strategies to cope with UVR such as avoidance behaviors, 

DNA repair mechanisms and the use of UVR screening compounds. Mycosporine‐like 

amino acids (MAAs) are a family of UVR‐absorbing compounds encountered in many 

marine and fresh water taxa (Sinha et al. 2007) including: 

cyanobacteria (Sinha & Häder 2008),  

dinoflagellates (Carreto et al. 1990, Lesser 1996, Banaszak & Trench 2001, 

Banaszak et al. 2006), 

poriferans (Bandaranayake 1996),  

phytoplankton (Whitehead & Vernet 2000) and several of their invertebrate 

predators (Whitehead et al. 2001, Riemer et al. 2007, Hylander & Jephson 

2010),  

holothurians (Bandaranayake & Des Rocher 1999),  

red algae (Hoyer et al. 2002), 

corals  and other cnidarians (Shick et al. 1999, Yakovleva et al. 2004, Ferrier‐

Pagés et al. 2007, Chapter 4 of this dissertation),  

echinoderms (Adams & Shick 1996, 2001, Lesser 2010) and  

fishes (Mason 1998, Sinha et al. 2007, Eckes et al. 2009, Chapters 2, 3 and 4 

herein).  

The ubiquitous presence of this family of metabolites in aquatic organisms is an 

indication of their long evolutionary history and crucial importance.  

The study of the ecological and physiological functions of MAAs, in some cases, 

preceded their chemical characterization. For example, Shibata (1969), Jokiel & York 

(1982) and Kinzie (1993) examined the presence and levels of a UVR‐absorbing 

substance called S‐320, later shown to be MAAs, in some macroalgae and scleractininan 

corals (Dunlap & Chalker 1986, review by Shick & Dunlap 1993).  

74  

To date, multiple studies, including some of the work presented in this 

dissertation, are consistent with the role of MAAs in marine organisms as natural UVR 

protective compounds (e.g., Bandaranayake 1998, Karentz 2001, Conde et al 2000, 

2004, 2007, Shick et al. 1995, Teai et al. 1997, 1998, Karsten et al. 1998, Banaszak et al., 

1998, Lesser 2000, Corredor et al. 2000, Torregiani & Lesser 2007, Adams & Shick 1996, 

2001, Klisch et al. 2001). Some MAAs have also proven to be powerful antioxidants 

(Dunlap & Yamamoto 1995, Nakayama et al. 1999, Suhn et al. 2003, Yakovleva et al. 

2004). However the identification and quantification of MAAs has been complicated by 

the lack of commercially available standards, and because these standards are still time‐

consuming and expensive to make (Whitehead et al. 2001, Whitehead & Hedges 2003, 

Hylander & Jephson 2010, Carretto & Carignan 2011). In spite of such draw‐backs, this 

family of metabolites has generated a considerable body of research. A recent review of 

the chemical and ecological aspects of MAAs included no less than 289 references to 

research papers concerned with, or related to, their study since 1969 (Carreto and 

Carignan 2011).  

Today, as shown by this dissertation and the work of others, advances in HPLC 

separation methods and the use of LC‐ MS.MS techniques are addressing some of the 

challenges and improving accuracy in the identification and quantification of MAAs 

(Whitehead & Hedges 2002, 2003, Carreto et al. 2005, Volkmann & Gorbushina 2006, 

Chapter 3 herein). These technological advances should help us to gain a better 

understanding of MAAs, since much remains to be understood about them. Indeed, 

some MAAs are still unidentified, as shown by Chapter 4 of this work where a study 

focusing on no more than three coral and one fish species has uncovered up to four 

previously undescribed MAAs. Additionally, the long standing belief and early evidence 

about the requirement of the shikimate pathway for MAAs synthesis (Favre‐Bonvin et al. 

1987, Shick et al. 1999, Shick & Dunlap 2002), has been recently challenged by the 

discovery that in some cyanobacteria some MAAs are synthesized through a completely 

different and novel pathway (Balskus and Walsh 2010).  

75  

Regardless of what pathway is used to synthesize MAAs, there is evidence that 

some metazoans such as fish cannot produce MAAs de novo. Instead, dietary MAAs are 

required for fish to harbor MAAs in their eyes or increase the absorbance of their 

epithelial mucus (Mason et al. 1998, Zamzow 2003a, 2004). Chapter 4 showed that for 

the corallivorous fish, Chaetodon multicinctus, the MAAs found in their epithelial mucus 

are different from the MAAs encountered in their diet in two ways: some MAAs like 

mycosporine‐glycine, abundant in the coral diet, are not detectable in the epidermal 

mucus of the fish, and some MAAs clearly present in the epidermal mucus such as 

palythene and usujirene are not detected in the diet. These results are consistent with 

the findings of other research on fish, sea urchins, and pteropods (Mason et al. 1998, 

Adams & Shick 2001, Whitehead et al. 2001). These studies, together with the findings 

presented here, suggest the possibility of selective uptake, translocation and 

transformation of MAAs by metazoan consumer organisms. Yet almost nothing is known 

about the mechanisms of these three processes and therefore they present an 

interesting avenue for future research. 

Results on the quantification of MAAs with depth, and the associated UVR 

exposure taken in the context of Zamzow’s (2003a) work on C. multicinctus, led to 

generation of a model that relates levels of UVR exposure to MAA accumulation in fish 

epidermal mucus (Chapter 4 herein). The model illustrates a possible ceiling effect for 

MAA accumulation. Such an ecologically‐relevant effect could be especially important in 

the context of global climate change.  

In conclusion, after over 50 years of scientific enquiry, much work is still needed 

to better understand the phylogeny, function, synthesis, uptake, translocation and 

transformation of MAAs. These fascinating metabolites are now being investigated with 

renewed vigor. The interest in MAAs has even reached the general public since the 

commercialization of MAAs. In the skin care industry the sunscreen and antioxidant 

properties of MAAs are being touted as able to prevent “the appearance of lines, 

wrinkles and other signs of photo‐aging” (Mibelle Biochemistry Group website, accessed 

on March 23rd 2012, http://www.mibellebiochemistry.com/products/active‐

76  

protection/helioguard365.php). This characteristic, while attractive, is rather 

paradoxical since the study of MAAs has been shown to increase lines, wrinkles and the 

graying of the hair in, at least, the experience of the author.  

77  

LISTOFREFERENCES

 Adams NL (1999) Effects of ultraviolet radiation and protection by mycosporine‐like 

amino acids in the green sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis. 

Photochemistry and Photobiology 69:92S‐92S 

Adams NL (2001) UV radiation evokes negative phototaxis and covering behavior in the 

sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis. Marine Ecology‐Progress Series 

213:87‐95 

Adams NL, Shick JM, Dunlap WC (2001) Selective accumulation of mycosporine‐like 

amino acids in ovaries of the green sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis 

is not affected by ultraviolet radiation. Marine Biology 138:281‐294 

Adams NL, Shick JM (1996) Mycosporine‐like amino acids provide protection against 

ultraviolet radiation in eggs of the green sea urchin Strongylocentrotus 

droebachiensis. Photochemistry and Photobiology 64:149‐158 

Adams NL, Shick JM (2001) Mycosporine‐like amino acids prevent UVB‐induced 

abnormalities during early development of the green sea urchin 

Strongylocentrotus droebachiensis. Marine Biology 138:267‐280 

Aebersold R, Goodlett DR (2001) Mass spectrometry in proteomics. Chemical Review 

101:269‐295 

Apprill AM, Gates RD (2007) Recognizing diversity in coral symbiotic dinoflagellate 

communities. Molecular Ecology 16:1127–1134 

Asakawa M (1970) Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguilla 

japonica. Bulletin of the Japanese Society for the Science of Fish 36:83‐87 

Aviles JM, Soler JJ, Perez‐Contreras T, Soler M, Moller AP (2006) Ultraviolet reflectance 

of great spotted cuckoo eggs and egg discrimination by magpies. Behavioral 

Ecology 17:310‐314 

Balskus EP, Walsh CT (2010) The Genetic and Molecular Basis for Sunscreen Biosynthesis 

in Cyanobacteria. Science 329:1653‐1656 

78  

Banaszak AT, Barba Santos MG, LaJeunesse TC, Lesser MP (2006) The distribution of 

mycosporine‐like amino acids (MAAs) and the phylogenetic identity of symbiotic 

dinoflagellates in cnidarian hosts from the Mexican Caribbean. Journal of 

Experimental Marine Biology and Ecology 337:131‐146 

Banaszak AT, LaJeunesse TC, Trench RK (2000) The synthesis of mycosporine‐like amino 

acids (MAAs) by cultured, symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental 

Marine Biology and Ecology 249:219‐233 

Banaszak AT, Lesser MP, Kuffner IB, Ondrusek M (1998) Relationship between 

ultraviolet (UV) radiation and mycosporine‐like amino acids (MAAS) in marine 

organisms. Bulletin of Marine Science 63:617‐628 

Banaszak AT, Lesser MP (2009) Effects of solar ultraviolet radiation on coral reef 

organisms. Photochemical & Photobiological Sciences 8:1276‐1294 

Banaszak AT, Neale PJ (2001) Ultraviolet radiation sensitivity of photosynthesis in 

phytoplankton from an estuarine environment. Limnology and Oceanography 

46:592‐603 

Banaszak AT, Trench RK (1995) Effects of ultraviolet (UV) radiation on marine microalgal‐

invertebrate symbioses .2. The synthesis of mycosporine‐like amino acids in 

response to exposure to UV in Anthopleura elegantissima and Cassiopeia 

xamachana. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 194:233‐250 

Banaszak AT, Trench RK (2001) Ultraviolet sunscreens in dinoflagellates. Protist 152:93‐

101 

Bancroft BA, Baker NJ, Blaustein AR (2007) Effect of UVB radiation on marine and 

freshwater organisms: a synthesis through meta‐analysis. Ecological  Letters 

10:332‐345 

Bandaranayake WM (1998) Mycosporines: are they nature’s sunscreens? Natural 

Product Reports 15:159 

Bandaranayake WM, Bemis JE, Bourne DJ (1996) Ultraviolet absorbing pigments from 

the marine sponge Dysidea herbacea: Isolation and structure of a new 

79  

Mycosporine, Comparative Biochemistry and Physiology C‐Pharmacology 

Toxicology & Endocrinology 115:281‐286 

Bandaranayake WM, Des Rocher A (1999) Role of secondary metabolites and pigments 

in the epidermal tissues, ripe ovaries, viscera, gut contents and diet of the sea 

cucumber Holothuria atra. Marine Biology 133:163‐169 

Barcelo JA, Calkins J (1979) Positioning of aquatic microorganisms in response to visible 

light and simulated solar UV‐B irradiation. Photochemistry Photobiology. 29:75. 

Bell GM, Hoar WS (1950) Some effects of ultraviolet radiation on sockeye salmon eggs 

and alevins Canadian Journal of Research 28:35‐43 

Beveridge MCM (2004) Cage Aquaculture, third Edition. Oxford, UK, Blackwell Publishing 

Ltd. Beveridge, M.C.M. & Little, D.C. 2002. 

Berghahn R, Bullock AM, Karakiri M (1993) Effects of solar radiation on the population 

dynamics of juvenile flatfish in the shallows of the Wadden Sea. Journal of Fish 

Biology 42: 329–345. 

Böhm GA, Pfleiderer W, Böger P, Scherer S (1995) Structure of a novel oligosacchride‐

mycosporine‐amino acid ultraviolet A/B sunscreen pigment from the terrestrial 

cyanobacterium Nostoc commune. The Journal of Biological Chemistry 270:8536‐

8539 

Bothwell ML, Sherbot DMJ, Pollock CM (1994) Ecosystem response to solar ultraviolet‐B 

radiation ‐ influence of trophic‐level interactions. Science 265:97‐100 

Buddemeier RW, Fautin DG (1993) Coral bleaching as an adaptive mechanism. 

BioScience 43: 320–326. 

Buhlmann B, Bossard P, Uehlinger U (1987) The influence of longwave ultraviolet‐

radiation (UV‐A) on the photosynthetic activity (C‐14‐assimilation) of 

phytoplankton. Journal of Plankton Research 9:935‐943 

Bullock AM, (1982) The pathological effects of ultraviolet radiation on the epidermis of 

teleost fish with reference to the solar radiation effect in higher animals. 

Proceedings of the Royal Society of Edinburgh 81B:199‐210 

80  

Bullock AM, Coutts R (1985) The impact of solar ultraviolet radiation upon the skin of 

rainbow trout. Salmo gairdneri Richerdson, farmed at high altitude in Bolivia. 

Fish Diseases 8:263‐275 

Bullock AM, Roberts RJ (1981) Sunburn lesions in salmonid fry: a clinical and histological 

report. Journal of Fish Diseases 4:271‐275 

Callone AI, Carignan M, Montoya NG, Carreto JI (2006) Biotransformation of 

mycosporine like amino acids (MAAs) in the toxic dinoflagellate Alexandrium 

tamarense. Journal of Photochemistry and Photobiology B‐Biology 84:204‐212 

Carefoot T, Harris M, Taylor B, Donovan D, Karentz D (1998) Mycosporine‐like amino 

acids: possible UV protection in eggs of the sea hare Aplysia dactylomela. Marine 

Biology 130:389‐396 

Carignan MO, Cardozo KH, Oliveira‐Silva D, Colepicolo P, Carreto JI (2009) Palythine‐

threonine, a major novel mycosporine‐like amino acid (MAA) isolated from the 

hermatypic coral Pocillopora capitata. Journal of Photochemistry and 

Photobiology B‐Biology 94:191‐200 

Carreto JI, Carignan MO (2011) Mycosporine‐Like Amino Acids: Relevant Secondary 

Metabolites. Chemical and Ecological Aspects. Marine Drugs 9:387‐446 

Carreto JI, Carignan MO, Daleo G, Demarco SG (1990) Occurrence of mycosporine‐like 

amino‐acids in the red‐tide dinoflagellate Alexandrium‐excavatum ‐ UV‐

photoprotective compounds. Journal of Plankton Research 12:909‐921 

Carreto JI, Carignan MO, Montoya NG (2005) A high‐resolution reverse‐phase liquid 

chromatography method for the analysis of mycosporine‐like amino acids 

(MAAs) in marine organisms. Marine Biology 146:237‐252 

Carroll AK, Shick JM (1996) Dietary accumulation of UV‐absorbing mycosporine‐like 

amino acids (MAAs) by the green sea urchin (Strongylocentrotus 

droebachiensis). Marine Biology 124:561‐569 

Chait BT, Kent SBH (1992) Weighing Naked Proteins: Practical, High‐Accuracy Mass 

Measurement of Peptides and Proteins. Science 257:1885‐1894 

81  

Chalker BE, Barnes DJ, Dunlap WC, Jokiel PL (1988) Light and reef‐building corals. 

Interdisciplinary Science Reviews 13:222‐237 

Cockell CS (2000) The ultraviolet history of the terrestrial planets ‐ implications for 

biological evolution. Planetary and Space Science 48:203‐214 

Cockell CS, Knowland J (1999) Ultraviolet radiation screening compounds. Biological 

Reviews of the Cambridge Philosophical Society 74:311‐345 

Conde FR, Churio MS, Previtali CM (2000) The photoprotector mechanism of 

mycosporine‐like amino acids. Excited‐state properties and photostability of 

porphyra‐334 in aqueous solution. Journal of Photochemistry and Photobiology 

B‐Biology 56:139‐144 

Conde FR, Churio MS, Previtali CM (2004) The deactivation pathways of the excited‐

states of the mycosporine‐like amino acids shinorine and porphyra‐334 in 

aqueous solution. Photochemical & Photobiological Sciences 3:960‐967 

Conde FR, Churio MS, Previtali CM (2007) Experimental study of the excited‐state 

properties and photostability of the mycosporine‐like amino acid palythine in 

aqueous solution. Photochemical & Photobiological Sciences 6:669‐674 

Corredor JE, Bruckner AW, Muszynski FZ, Armstrong RA, Garcia R, Morell JM (2000) UV‐

absorbing compounds in three species of caribbean zooxanthellate corals: Depth 

distribution and spectral response. Bulletin of Marine Science 67:821‐830 

Crowell MF, McCay CM (1930) The Lethal Dose of Ultra‐Violet Light for Brook Trout 

(Salvelinus fontinalis). Science 72:582‐583 

Cullen AP, Moneith‐McMaster CA, Sivak JG (1994) Lenticular changes in rainbow trout 

following chronic exposure to UV radiation. Current Eye Res 13:731‐737 

Dahms HU, Lee JS (2010) UV radiation in marine ectotherms: Molecular effects and 

responses. Aquatic Toxicology 97:3‐14 

Dahms HU, Dobretsov S, Lee JS (2011) Effects of UV radiation on marine ectotherms in 

polar regions. Comparative Biochemistry and Physiology C‐Toxicology & 

Pharmacology 153:363‐371 

82  

Desai AM, Andreae M, Mullen DG, Banaszak Holl MM, Baker JR (2011) Acetonitrile 

shortage: Use of isopropanol as an alternative elution system for ultra/high 

performance liquid chromatography. Analytical Methods 3:56‐58 

dos Santos Pereira A, David F, Vanhoenacker G, Sandra P (2009) The acetonitrile 

shortage: Is reversed HILIC with water an alternative for the analysis of highly 

polar ionizable solutes? Journal of Separation Science 32:2001‐2007 

Dunlap WC, Chalker BE, Oliver JK (1986) Bathymetric adaptations of reef‐building corals 

at Davies Reef, Great‐Barrier‐Reef, Australia .3. UV‐B absorbing compounds. 

Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 104:239‐248 

Dunlap WC, Chalker BE (1986) Identification and quantitation of near‐UV absorbing 

compounds (S‐320) in a hermatypic scleractinian. Coral Reefs 5:155–159. 

Dunlap WC, Shick JM (1998) Ultraviolet radiation‐absorbing mycosporine‐like amino 

acids in coral reef organisms: A biochemical and environmental perspective. 

Journal of Phycology 34:418‐430 

Dunlap WC, Yamamoto Y. 1995. Small molecule antioxidants in marine organisms: 

antioxidant activity of mycosporine‐glycine. Comparative Biochemistry and 

Physiology 112B:105–14 

Eckes MJ, Siebeck UE, Dove S, Grutter AS (2008) Ultraviolet sunscreens in reef fish 

mucus. Marine Ecology‐Progress Series 353:203‐211 

Fabacher D L, Little EE (1995) Skin component may protect fishes from Ultraviolet‐B 

radiation. Environmental Science and Pollution Research 2:30‐32 

Farman J (1987) What hope for the ozone‐layer now. New Scientist 116:50‐54 

Favre‐Bonvin J, Arpin N, Brevard C (1976) Structure de la mycosporine (P310). Canadian 

Journal of Chemistry 54:1105‐1113 

Favre‐Bonvin J, Bernillon J, Salin N, Arpin N (1987) Biosynthesis of mycosporines: 

mycosporine glutaminol in Trichothecium roseum. Phytochemistry 26:2509‐2514 

Ferrier‐Pages C, Richard C, Forcioli D, Allemand D, Pichon M, Shick JM (2007) Effects of 

temperature and UV radiation increases on the photosynthetic efficiency in four 

scleractinian coral species. Biological Bulletin 213:76‐87 

83  

Ferroni L, Klisch M, Pancaldi S, Hader DP (2010) Complementary UV‐absorption of 

Mycosporine‐like Amino Acids and Scytonemin is Responsible for the UV‐

Insensitivity of Photosynthesis in Nostoc flagelliforme. Marine Drugs 8:106‐121 

Fletcher TC, Jones R, Reid L (1976) Identification of glycoproteins in goblet cells of 

epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), Flounder (Platichthys flesus 

(L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical J 8:597‐608 

Forsman ZH, Barshis DJ, Hunter CL, Toonen RJ (2009) Shape‐shifting corals: molecular 

markers show morphology is evolutionarily plastic in Porites. BMC Evolutionary 

Biology 9:45 

Freitag JF, Steeger HU, Storz UC, Paul RJ (1998) Sublethal impairment of respiratory 

control in plaice (Pleuronectes platessa) larvae induced by UV‐B radiation, 

determined using a novel biocybernetical approach. Marine Biology 132:1‐8 

Fritz R, RuthW, Kragl U (2009) Assessment of acetone as an alternative to acetonitrile in 

peptide analysis by liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid 

Communication in Mass Spectrometry 23:2139‐2145 

Gallagher RP, Lee TK (2006) Adverse effects of ultraviolet radiation: a brief review. 

Progress in Biophysics and Molecular Biology 92:119‐131 

Garcia CM, de Perera TB (2002) Ultraviolet‐based female preferences in a viviparous 

fish. Behavioral Ecology and Sociobiology 52:1‐6 

Garcia‐Pichel F, Castenholz RW (1991) Characterization and biological implications of 

scytonemin, a cyanobacterial sheath pigment. Journal of Phycology 27:395‐409 

Garcia‐Pichel F, Castenholz RW (1993) Occurrence of UV‐absorbing, mycosporine‐like 

compounds among cyanobacterial isolates and an estimate of their screening 

capacity. Applied and Environmental Microbiology 59:163‐169 

Garibyan L, Fisher DE (2010) How Sunlight Causes Melanoma. Current Oncology Reports 

12:319‐326 

Gleason JF, Bhartia PK, Herman JR, McPeters R, Newman P, Stolarski RS, Flynn L, Labow 

G, Larko D, Seftor C, Wellemeyer C, Komhyr WD, Miller AJ, Planet W (1993) 

Record low global ozone in 1992. Science 260:523‐526  

84  

Godar DE (1999) UVA1 radiation triggers two different final apoptotic pathways. Journal 

of Investigative Dermatology 112:3‐12 

Gold WG, Caldwell MM (1983) The effects of ultraviolet‐b radiation on plant 

competition in terrestrial ecosystems. Physiologia Plantarum 58:435‐444 

Grant PT, Plack PA, Thomson RH (1980) Gadusol, a metabolite from fish eggs. 

Tetrahedron Letters 21:4043‐4044 

Hansson LA, Hylander S, Sommaruga R (2007) Escape from UV threats in zooplankton: A 

cocktail of behavior and protective pigmentation. Ecology 88:1932‐1939 

Hansson LA, Hylander S (2009) Effects of ultraviolet radiation on pigmentation, 

photoenzymatic repair, behavior, and community ecology of zooplankton. 

Photochemical & Photobiological Sciences 8:1266‐1275 

Hirata Y, Uemura D, Ueda K, Takano S (1979) Several compounds from Palythoa 

tuberculosa (Coelenterata). Pure Applied Chemistry 51:1875–1883. 

Hebert PDN, Emery CJ (1990) The adaptive significance of cuticular pigmentation in 

daphnia. Functional Ecology 4:703‐710 

Hobson LA, Hartley FA (1983) Ultraviolet irradiance and primary production in a 

Vancouver Island fjord, British‐Columbia, Canada. Journal of Plankton Research 

5:325‐331 

Hofer R (2000) Vulnerability of fish and amphibians to ultraviolet radiation. Research 

Advances in Photochemistry and Photobiolology 1:265‐281 

Hourigan T (1987) The behavioral ecology of three species of butterflyfishes (Family 

Chaetodontidae) PhD, University of Hawai`i at Manoā, Honolulu 

Hoyer K, Karsten U, Wiencke C (2002) Induction of sunscreen compounds in Antarctic 

macroalgae by different radiation conditions. Marine Biology 141:619‐627 

Hunter JR, Kaupp SE, Taylor, JH (1979) Effect of ultraviolet irradiation on eggs and larvae 

of the northern anchovy, Engraulis mordax, and the Pacific mackerel, Scomber 

japonicus, during the embryonic stage. Photochemistry and Photobiology 

29:325‐338 

85  

Hylander S, Jephson T (2010) UV protective compounds transferred from a marine 

dinoflagellate to its copepod predator. Journal of Experimental Marine Biology 

and Ecology 389:38‐44 

Ishikura M, Kato C, Maruyama T (1997) UV‐absorbing substances in zooxanthellate and 

azooxanthellate clams. Marine Biology 128:649‐655 

Jerlov NG (1950) Ultra‐violet radiation in the sea. Nature 166:111‐112 

Jerlov NG, Albatross (1957) Optical studies of ocean waters, Vol. Elanders Boktr, 

Göteborg 

Jerlov NG (1976) Marine optics, Elsevier Scientific Pub. Co., Amsterdam  

Jokiel PL (1980) Solar ultraviolet‐radiation and coral‐reef epifauna. Science 207:1069‐

1071 

Jokiel PL, York RH Jr (1982) Solar ultraviolet photobiology of the reef coral Pocillopora 

damicornis and symbiotic zooxanthellae. Bulletin of Marine Science 32, 301–315. 

Jones LW, Kok B (1966) Photoinhibition of Chloroplast Reactions. I. Kinetics and Action 

Spectra. Plant Physiology 41:1037–1043 

Karentz D (2001) Chemical defenses of marine organisms against solar radiation 

exposure: UVA absorbing mycosporine‐like amino acids and scytonemin. In: Mc‐

Clintock JB, Baker, J., (ed) Marine Chemical Ecology. CRC Press, Boca Raton, FL, 

USA 

Karentz D, Dunlap WC, Bosch I (1997) Temporal and spatial occurrence of UV‐absorbing 

mycosporine‐like amino acids in tissues of the Antarctic sea urchin Sterechinus 

neumayeri during springtime ozone‐depletion. Marine Biology 129:343‐353 

Karentz D, McEuen FS, Land MC, Dunlap WC (1991) Survey of mycosporine‐like amino‐

acid compounds in Antarctic marine organisms ‐ potential protection from 

ultraviolet exposure. Marine Biology 108:157‐166 

Karsten U, Franklin LA, Luning K, Wiencke C (1998) Natural ultraviolet radiation and 

photosynthetically active radiation induce formation of mycosporine‐like amino 

acids in the marine macroalga Chondrus crispus (Rhodophyta). Planta 205:257‐

262 

86  

Karsten U, Sawall T, Hanelt D, Bischof K, Figueroa FL, Flores‐Moya A, Wiencke C (1998) 

An inventory of UV‐absorbing mycosporine‐like amino acids in macroalgae from 

polar to warm‐temperate regions. Botanica Marina 41:443‐453 

Karsten U, Wulff A, Roleda MY, Müller R, Steinhoff FS, Fredersdorf J, Wiencke C (2009) 

Physiological responses of polar benthic algae to ultraviolet radiation. Botanica 

Marina 52:639‐654 

Kazerouni EG, Khodabandeh S (2010) Effects of ultraviolet radiation on skin structure 

and ultrastructure in Caspian Sea Salmon, Salmo trutta caspius, during alevin 

stage. Toxicological & Environmental Chemistry 92:903‐914 

Kelly DJ, Bothwell ML (2002) Avoidance of solar ultraviolet radiation by juvenile coho 

salmon (Oncorhynchus kisutch). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic 

Sciences 59:474‐482 

Kinzie RA, (1993), Effects of ambient levels of solar ultraviolet‐radiation on 

zooxanthellae and photosynthesis of the reef coral Montipora verrucosa. Marine 

Biology 116:319‐327 

Kinzie RA, Banaszak AT, Lesser MP (1998) Effects of ultraviolet radiation on primary 

productivity in a high altitude tropical lake. Hydrobiologia 385:23‐32 

Klisch M, Sinha RP, Richter PR, Häder D‐P (2001) Mycosporine‐like amino acids (MAAs) 

protect against UV‐B‐induced damage in Gyrodinium dorsum Kofoid. Journal of 

Plant Physiology 158:1449‐1454 

Knuttel H, Fiedler K (2001) Host‐plant‐derived variation in ultraviolet wing patterns 

influences mate selection by male butterflies. Journal of Experimental Biology 

204:2447‐2459 

Kuffner IB (1999) The effects of ultraviolet radiation on reef corals and the sun‐

screening role of mycosporine‐like amino acids. Doctor of Philosophy PhD, 

University of Hawaii at Manoā, Ann Arbor, MI 

Kulms D, Poppelmann B, Yarosh D, Luger TA, Krutmann J, Schwarz T (1999) Nuclear and 

cell membrane effects contribute independently to the induction of apoptosis in 

87  

human cells exposed to UVB radiation. Proceedings of the National Academy of 

Sciences of the United States of America 96:7974‐7979 

LaJeunesse TC, Thornhill DJ, Cox EF, Stanton FG, Fitt WK, Schmidt GW (2004) High 

diversity and host specificity observed among symbiotic dinoflagellates in reef 

coral communities from Hawaii. Coral Reefs 23:596–603 

Leech DM, Boeing WJ, Cooke SL, Williamson CE, Torres L (2009) UV‐enhanced fish 

predation and the differential migration of zooplankton in response to UV 

radiation and fish. Limnology and Oceanography 54:1152‐1161 

Leech DM, Johnsen S (2006) Ultraviolet vision and foraging in juvenile bluegill (Lepomis 

macrochirus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 63:2183‐2190 

Lenci F, Checcucci G, Ghetti F, Gioffre D, Sgarbossa A (1997) Sensory perception and 

transduction of UV‐B radiation by the ciliate Blepharisma japonicum. Biochimica 

Et Biophysica Acta‐General Subjects 1336:23‐27 

Lesser MP (1996) Acclimation of phytoplankton to UV‐B radiation: Oxidative stress and 

photoinhibition of photosynthesis are not prevented by UV‐absorbing 

compounds in the dinoflagellate Prorocentrum micans. Marine Ecology‐Progress 

Series 132:287‐297 

Lesser MP (2000) Depth‐dependent photoacclimatization to solar ultraviolet radiation in 

the Caribbean coral Montastraea faveolata. Marine Ecology‐Progress Series 

192:137‐151 

Lesser MP (2008) Effects of ultraviolet radiation on productivity and nitrogen fixation in 

the Cyanobacterium, Anabaena sp (Newton's strain). Hydrobiologia 598:1‐9 

Lesser MP (2010) Depth‐dependent Effects of Ultraviolet Radiation on Survivorship, 

Oxidative Stress and DNA Damage in Sea Urchin (Strongylocentrotus 

droebachiensis) Embryos from the Gulf of Maine. Photochemistry and 

Photobiology 86:382‐388 

Lesser MP, Farrell JH, Walker CW (2001) Oxidative stress, DNA damage and p53 

expression in the larvae of Atlantic cod (Gadus morhua) exposed to ultraviolet 

(290‐400 nm) radiation. Journal of Experimental Biology 204:157‐164 

88  

Little EE, Fabacher DL (1994) Comparative sensitivity of rainbow trout and two 

threatened salmonids, Apache trout and lanhontan cutthroat trout, to 

ultraviolet‐B radiation. Archive fur Hydrobiologie 43:217‐226 

Losey GS (2003) Crypsis and communication functions of UV‐visible coloration in two 

coral reef damselfish, Dascyllus aruanus and D‐reticulatus. Animal Behaviour 

66:299‐307 

Losey GS, Cronin TW, Goldsmith TH, Hyde D, Marshall NJ, McFarland WN (1999) The UV 

visual world of fishes: a review. Journal of Fish Biology 54:921‐943 

Lowe C, Goodman‐Lowe G (1996) Suntanning in hammerhead sharks. Nature 383:677‐

677 

Meador JA, Baldwin AJ, Catala P, Jeffrey WH, Joux F, Moss JA, Pakulski JD, Stevens R, 

Mitchell DL (2009) Sunlight‐induced DNA Damage in Marine Micro‐organisms 

Collected Along a Latitudinal Gradient from 70 degrees N to 68 degrees S. 

Photochemistry and Photobiology 85:412‐421 

Martinez‐Levasseur LM, Gendron D, Knell RJ, O'Toole EA, Singh M, Acevedo‐Whitehouse 

K (2011) Acute sun damage and photoprotective responses in whales. 

Proceedings of the Royal Society B‐Biological Sciences 278:1581‐1586 

Mason DS, Schafer F, Shick JM, Dunlap WC (1998) Ultraviolet radiation‐absorbing 

mycosporine‐like amino acids (MAAs) are acquired from their diet by medaka 

fish (Oryzias latipes) but not by SKH‐1 hairless mice. Comparative Biochemistry 

and Physiology a‐Molecular and Integrative Physiology 120:587‐598 

McArdle J, Bullock AM (1987) Solar ultraviolet radiation as a causal factor of 'summer 

syndrome' in cage‐reared Atlantic salmon, Salmo salar: a clinical and 

histopathological study. Journal of Fish Diseases 10:255‐264 

McFarland WN, Loew ER (1994) Ultraviolet visual pigments in marine fishes of the family 

pomacentridae. Vision Research 34:1393‐1396 

Moisan TA, Mitchell BG (2001) UV absorption by mycosporine‐like amino acids in 

Phaeocystis antarctica Karsten induced by photosynthetically available radiation. 

Marine Biology 138:217‐227 

89  

Moss SH, Smith KC (1981) Membrane damage can be a significant factor in the 

inactivation of escherichia‐coli by near‐ultraviolet radiation. Photochemistry and 

Photobiology 33:203‐210 

Nahon S, Porras VAC, Pruski AM, Charles F (2009) Sensitivity to UV radiation in early life 

stages of the Mediterranean sea urchin Sphaerechinus granularis (Lamarck). 

Science of the Total Environment 407:1892‐1900 

Nahon S, Pruski AM, Duchene JC, Mejanelle L, Vetion G, Desmalades, M, Charles F 

(2011) Can UV radiation affect benthic deposit‐feeders through biochemical 

alteration of food resources? An experimental study with juveniles of the benthic 

polychaete Eupolymnia nebulosa. Marine Environmental Research. 71: 266‐274 

Nakayama R, Tamura Y, Kikuzaki H, Nakatani N (1999) Antioxidant effect of the 

constituents of susabinori (Porphyra yezoensis). Journal of the American Oil 

Chemists' Society 76, 649–653. 

Neale PJ, Banaszak AT, Jarriel CR (1998) Ultraviolet sunscreens in Gymnodinium 

sanguineum (Dinophyceae): Mycosporine‐like amino acids protect against 

inhibition of photosynthesis. Journal of Phycology 34:928‐938 

Neale PJ, Kieber DJ (2000) Assessing biological and chemical effects of UV in the marine 

environment: Spectral weighting functions. In: Hester REH, R. M. (ed) Causes and 

Environmental Implications of Implications of Increased UV‐B radiation Royal 

Society of Chemistry Cambridge 

Newman SJ, Dunlap WC, Nicol S, Ritz D (2000) Antarctic krill (Euphausia superba) acquire 

a UV‐absorbing mycosporine‐like amino acid from dietary algae. Journal of 

Experimental Marine Biology and Ecology 255:93‐110 

Ramos KT, Fries LT, Berkhouse CS, Fries JN (1994) Apparent sunburn of juvenile 

paddlefish. The Progressive Fish‐Culturist 56:214‐216 

Rastogi RP, Richa, Sinha RP, Singh SP, Hader DP (2010) Photoprotective compounds 

from marine organisms. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 

37:537‐558 

90  

Rick IP, Bloemker D, Bakker TCM (2012) Spectral composition and visual foraging in the 

three‐spined stickleback (Gasterosteidae: Gasterosteus aculeatus L.): elucidating 

the role of ultraviolet wavelengths. Biological Journal of the Linnean Society 

105:359‐368 

Riemer U, Lamare M, Peake B (2007) Temporal concentrations of sunscreen compounds 

(Mycosporine‐like Amino Acids) in phytoplankton and in the New Zealand krill, 

Nyctiphanes australis GO Sars. Journal of Plankton Research 29:1077‐1086 

Rowan R, Powers DA (1991) Molecular genetic identification of symbiotic dinoflagellates 

(zooxanthellae). Marine Ecology Progress Series 71:65‐63 

Sandmann G (2009) A nitromethane‐based HPLC system alternative to acetonitrile for 

carotenoid analysis of fruit and vegetables. Rapid Communication in Mass 

Spectrometry 23:2139‐2145. 

Schwarz T, Schwarz A (2011) Molecular mechanisms of ultraviolet radiation‐induced 

immunosuppression. European Journal of Cell Biology 90:560‐564 

Shephard KL (1994) Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries 

4:401‐429 

Shibata K (1969) Pigments and a UV‐absorbing substance in corals and a blue‐green alga 

living in the Great Barrier Reef. Plant Cell Physiology 10:325–335. 

Shick JM (2004) The continuity and intensity of ultraviolet irradiation affect the kinetics 

of biosynthesis, accumulation, and conversion of mycosporine‐like amino acids 

(MAAS) in the coral Stylophora pistillata. Limnology and Oceanography 49:442‐

458 

Shick JM, Dunlap WC (2002) Mycosporine‐like amino acids and related gadusols: 

Biosynthesis, accumulation, and UV‐protective functions in aquatic organisms. 

Annual Review of Physiology 64:223‐262 

Shick JM, Lesser MP, Dunlap WC, Stochaj WR, Chalker BE, Won JW (1995) Depth‐

dependent responses to solar ultraviolet‐radiation and oxidative stress in the 

zooxanthellate coral Acropora‐microphthalma. Marine Biology 122:41‐51 

91  

Shick JM, Romaine‐Lioud S, Ferrier‐Pages C, Gattuso JP (1999) Ultraviolet‐B radiation 

stimulates shikimate pathway‐dependent accumulation of mycosporine‐like 

amino acids in the coral Stylophora pistillata despite decreases in its population 

of symbiotic dinoflagellates. Limnology and Oceanography 44:1667‐1682 

Siebeck O (1988) Experimental investigation of UV tolerance in hermatypic corals 

(scleractinia). Marine Ecology‐Progress Series 43:95‐103 

Singh SP, Kumari S, Rastogi RP, Singh KL, Sinha RP (2008) Mycosporine‐like amino acids 

(MAAS): Chemical structure, biosynthesis and significance as UV‐

absorbing/screening compounds. Indian Journal of Experimental Biology 46:7‐17 

Sinha RP, Hader DP (2008) UV protectants in cyanobacteria. Plant Science 174:278‐289 

Sinha RP, Singh SP, Hader DP (2007) Database on mycosporines and mycosporine‐like 

amino acids (MAAs) in fungi, cyanobacteria, macroalgae, phytoplankton and 

animals. Journal of Photochemistry and Photobiology B‐Biology 89:29‐35 

Smith EJ, Partridge JC, Parsons KN, White EM, Cuthill IC, Bennett ATD, Church SC (2002) 

Ultraviolet vision and mate choice in the guppy (Poecilia reticulata). Behavioral 

Ecology 13:11‐19 

Smith RC (1989) Ozone, middle ultraviolet radiation and the aquatic environment. . 

Photochemistry Photobiology 50:549‐568 

Smith RC, Baker KS (1981) Optical‐properties of the clearest natural‐waters (200‐800 

NM). Applied Optics 20:177‐184 

Smith RC, Préék BB, Baker S, Bidigare RR, Boucher NP, Coley T, Karantz D, MacIntyre S, 

Matlick HA, Menzies D, Ondrusek  M, Wan Z, Waters KL (1992) Ozone depletion 

Ultraviolet radiation and phytoplankton biology in Antarctic waters. Science 

255:952‐959 

Sommaruga R, Buma AGJ (2000) UV‐induced cell damage is species‐specific among 

aquatic phagotrophic protists. Journal of Eukaryotic Microbiology 47:450‐455 

Sommaruga R, Oberleiter A, Psenner R (1996) Effect of UV radiation on the bacterivory 

of a heterotrophic nanoflagellate. Applied and Environmental Microbiology 

62:4395‐4400 

92  

Starcevic A, Akthar S, Dunlap WC, Shick JM, Hranueli D, Cullum J, Long PF (2008) 

Enzymes of the Shikimic Acid Pathway Encoded in the Genome of a Basal 

Metazoan, Nematostella vectensis, Have Microbial Origins. Proceedings of the 

National Academy of Sciences of the United States of America 105:2533‐2537 

Stat M, Pochon X, Cowie ROM, Gates RD (2009) Specificity in communities of 

Symbiodinium in corals from Johnston Atoll. Marine Ecology Progress Series 

386:83‐96 

Steeger H‐U, Wiemer M, Freitag JF, Rϋdiger JP (1999) Vitality of plaice embryos 

(Pleuronectes platessa) at moderate UV‐B exposure. Journal of Sea Research 

42:27–34 

Storz UC, Paul RJ (1998) Phototaxis in water fleas (Daphnia magna) is differently 

influenced by visible and UV light. Journal of Comparative Physiology a‐Sensory 

Neural and Behavioral Physiology 183:709‐717 

Strid A, Chow WS, Anderson JM (1990) Effects of supplementary ultraviolet‐B radiation 

on photosynthesis in pisum‐sativum. Biochimica Et Biophysica Acta 1020:260‐

268 

Suhn HJ, Lee HW, Jung J (2003) Mycosporine glycine protects biological systems against 

photodynamic damage by quenching singlet oxygen with a high efficiency. 

Photochemistry and Photobiology 78:109‐113 

Tartarotti B, Laurion I, Sommaruga R (2001) Large variability in the concentration of 

mycosporine‐like amino acids among zooplankton from lakes located across an 

altitude gradient. Limnology and Oceanography 46:1546‐1552 

Teai T, Drollet J, Bianchini J, Cambon A, Martin P (1997) Widespread occurrence of 

mycosporine‐like amino acid compounds in scleractinians from French Polynesia. 

Coral Reefs 16:169‐176 

Teai T, Drollet JH, Bianchini JP, Cambon A, Martin PMV (1998) Occurrence of ultraviolet 

radiation‐absorbing mycosporine‐like amino acids in coral mucus and whole 

corals of French Polynesia. Marine and Freshwater Research 49:127‐132 

93  

Teramura AH, Biggs RH, Kossuth S (1980) Effects of Ultraviolet‐B Irradiances on Soybean. 

II. Interaction between ultraviolet‐b and photosynthetically active radiation on 

net photosynthesis, dark respiration, and transpiration. Plant Physiology 65:483‐

488 

Teramura AH (1983) Effects of ultraviolet‐b radiation on the growth and yield of crop 

plants. Physiologia Plantarum 58:415‐427 

Thornhill DJ, LaJeunesse TC, Santos SR (2007) Measuring rDNA diversity in eukaryotic 

microbial systems: how intragenomic variation, pseudogenes, and PCR artifacts 

confound biodiversity estimates. Molecular Ecology 16:‐5326–5340 

Torregiani JH, Lesser MP (2007) The effects of short‐term exposures to ultraviolet 

radiation in the Hawaiian coral Montipora verrucosa. Journal of Experimental 

Marine Biology and Ecology 340:194‐203 

Torres A, Enk CD, Hochberg M, Srebnik M (2006) Porphyra‐334, a potential natural 

source for UVA protective sunscreens. Photochemical & Photobiological Sciences 

5:432‐435 

Torres JL, Armstrong RA, Corredor JE, Gillbes F (2007) Physiological responses of 

Acropora cervicornis to increased solar irradiance. Photochemistry and 

Photobiology 83:839‐850 

Tricas TC (1986) Life history, foraging ecology, and territorial behavior of the Hawaiian 

butterflyfish, Chaetodon multicinctus. PhD., University of Hawaii at Manoā 

University Microfilms International, Ann Arbor, MI 

Verling E, Crook AC, Barnes DKA (2002) Covering behaviour in Paracentrotus lividus: is 

light important? Marine Biology 140:391‐396 

Vetter R. D. KA, Mori T. (1999) Diel cycles of DNA damage and repair in eggs and larvae 

of Northern Anchovy, Engraulis mordax, exposed to solar ultraviolet radiation. . 

Photochemistry and Photobiology 69:27‐33 

94  

Volkmann M, Gorbushina AA (2006) A broadly applicable method for extraction and 

characterization of mycosporines and mycosporine‐like amino acids of 

terrestrial, marine and freshwater origin. FEMS Microbiology Letters 255:286‐

295 

Wahl M, Molis M, Davis A, Dobretsov S, Durr ST, Johansson J, Kinley J, Kirugara D, Langer 

M, Lotze HK, Thiel M, Thomason JC, Worm B, Ben‐Yosef DZ (2004) UV effects 

that come and go: a global comparison of marine benthic community level 

impacts. Global Change Biology 10:1962‐1972 

Walters C, Ward B (1998) Is solar ultraviolet radiation responsible for decline in marine 

survival rates of anadromous salmonids that rear in small stream? Canadian 

Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 55:2533–2538. 

White EM, Partridge UC, Church SC (2003) Ultraviolet dermal reflexion and mate choice 

in the guppy, Poecilia reticulata. Animal Behaviour 65:693‐700 

Whitehead K, Hedges JI (2002) Analysis of mycosporine‐like amino acids in plankton by 

liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry. Marine 

Chemistry 80:27‐39 

Whitehead K, Hedges JI (2003) Electrospray ionization tandem mass spectrometric and 

electron impact mass spectrometric characterization of mycosporine‐like amino 

acids. Rapid Communications in Mass Spectrometry 17:2133‐2138 

Whitehead K, Karentz D, Hedges J (2001) Mycosporine‐like amino acids (MAAs) in 

phytoplankton, a herbivorous pteropod (Limacina helicina), and its pteropod 

predator (Clione antarctica) in McMurdo Bay, Antarctica. Marine Biology 

139:1013‐1019 

Whitehead K, Vernet M (2000) Influence of mycosporine‐like amino acids (MAAs) on UV 

absorption by particulate and dissolved organic matter in La Jolla Bay. Limnology 

and Oceanography 45:1788‐1796 

Wood WF (1987) Effect of solar ultra‐violet radiation on the kelp Ecklonia‐radiata. 

Marine Biology 96:143‐150 

95  

Worrest RC, Thomson BE, Vandyke H (1981) Impact of UV‐B radiation upon estuarine 

microcosms. Photochemistry and Photobiology 33:861‐867 

Yakovleva IM, Bhagooli R, Takemura A, Hidaka M (2004) Differential susceptibility to 

oxidative stress of two scleractinian corals: antioxidant functioning of 

mycosporine‐glycine. Comparative Biochemistry and Physiology B‐Biochemistry 

& Molecular Biology 139:721‐730 

Yakovleva IM, Baird AH (2005) Ontogenetic change in the abundance of mycosporine‐

like amino acids in non‐zooxanthellate coral larvae. Coral Reefs 24:443‐452 

Zamzow JP (2003a) The physiological ecology of UV‐absorbing compounds from the 

mucus of marine fishes. Ph D, University of Hawai`i at Manoā,  

Zamzow JP (2003b) Ultraviolet‐absorbing compounds in the mucus of temperate Pacific 

tidepool sculpins: variation over local and geographic scales. Marine Ecology‐

Progress Series 263:169‐175 

Zamzow JP (2004) Effects of diet, ultraviolet exposure, and gender on the ultraviolet 

absorbance of fish mucus and ocular structures. Marine Biology 144:1057‐1064 

Zamzow JP, Losey GS (2002) Ultraviolet radiation absorbance by coral reef fish mucus: 

photo‐protection and visual communication. Environmental Biology of Fishes 

63:41‐47