universidad autÓnoma de baja california sur Área de ...biblio.uabcs.mx/tesis/te3182.pdf · con...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTO CIENCIAS AGROPECUARIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE ZOOTECNIA
TESIS
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL
PATOGENO PARA OSTREIDOS
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE
MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
PRESENTA:
Daniel Israel Higuera Sandoval
Directora de Tesis:
Dra. Maurilia Rojas Contreras
Director externo:
Dr. José Manuel Mazón Suastegui
CD. UNIVERSITARIA, LA PAZ, B.C.S SEPTIEMBRE DEL 2014
i
DEDICATORIA
La presente tesis está dedicada a mis padres Enf. Armando Higuera y Arcelia Sandoval Cazares por
ser el pilar y motor, que gracias a su apoyo y sustento estoy subiendo un escalón más en mi vida
profesional.
A mi hermano Dr. Armando Higuera Sandoval por su grandioso ejemplo que me ha transmitido, el
deseo de superación en la vida profesional y aspiración de alcanzar un sueño.
A mi hermosa hermana Aimeé Karina Higuera Sandoval también por estos maravillosos años
viviendo juntos, solos, apoyándonos incondicionalmente en este arduo camino.
A mi maravilloso sobrino Daniel Armando que ha causado en mi corazón una revolución de
sentimientos como el nuevo integrante de la familia.
A esta frase de mi padre que es una herencia más para mí vida diaria.
“Si callamos la verdad siempre seremos sordos y ciegos”
ii
AGRADECIMIENTOS
Las instituciones en apoyo al conocimiento científico son las herramientas para el desarrollo de un
buen profesionista. Por tanto agradezco todo el apoyo brindado por la Universidad Autónoma de
Baja California Sur (UABCS), por permitirme ser parte de ella y proporcionarme el espacio para la
realización de este ideal.
Al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR) y al Consejo Nacional de Ciencia
y Tecnología (CONACYT) por admitirme en este grandioso proyecto así como por la beca otorgada
para desarrollar mi tesis.
Al CIBNOR Unidad Guerrero Negro así como al personal que labora, el cual nos dio un excelente
trato y buena compañía.
A mis directores de tesis Dra. Maurilia Rojas Contreras y Dr. José Manuel Mazón Suastegui por la
confianza, oportunidad y el aprendizaje que han dejado en mí.
A la Ing. Alejandra Cosío Castro por su enseñanza, paciencia, tolerancia y tiempo dedicado a mí en
esas mañanas y tardes de arduo trabajo, con esa alegría que siempre transmitía.
Al Ing. Gaspar a. Petitt Higuera por su colaboración en este proyecto, por el apoyo brindado en la
identificación de bacterias.
Al Dr. Ricardo Vázquez Juárez por su apoyo en el trabajo realizado en Guerrero Negro.
Sin olvidar y no menos importantes al Dr. Alfredo Guevara Franco y Dr. Marco Antonio Cadena
Roa que también forman parte de este círculo de conocimiento.
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Ing.
Adriana Ramírez Arroyo, Ing. Macario Savín Amador que somos parte del mismo proyecto y un
complemento para mi tesis.
A la Dra. Emilia Rosas Lliteras Martínez por el último impulso y futuras oportunidades en el
ámbito profesional en la Habana, Cuba. A todos mis docentes que han formado parte de mi
educación aportando su granito de arena.
iii
INDICE GENERAL
Dedicatoria I
Agradecimientos. II
Índice general. III
Lista de tablas V
Lista de figuras VII
Resumen VIII
1. Introducción. 1
2. Justificación 7
3. Objetivos. 8
3.1. Objetivo general 8
3.2. Objetivos particulares 8
4. Hipótesis. 8
5. Antecedentes. 9
5.1 Moluscos bivalvos en el contexto mundial 9
5.2 Ostricultura en México 10
5.3 Ostricultura en Baja California Sur. 10
5.4 Riesgo sanitario asociado al cultivo y consumo de moluscos bivalvos 15
6. Materiales y Métodos. 16
6.1 Colecta y transporte de organismos 16
6.2 Sitios de muestreo 16
6.3 Análisis microbiológico. 20
6.4 Aislamiento y purificación de bacterias 21
6.5 Morfología celular de las cepas 21
6.6 Tinción de Gram y prueba de la catalasa 22
iv
6.7 Ensayo de adhesión a moco de ostión. 22
6.7.1 Preparación del cultivo. 22
6.7.2 Preparación de la membrana. 22
6.7.3 Ensayo de adhesión. 23
6.8 Identificación molecular de bacterias potencialmente patógenas 23
6.8.1 Extracción del ADN genómico de cepas 23
6.8.2 Visualización del ADN genómico. 24
6.8.3 Amplificación del gen 16S DNA para identificación molecular
de bacterias
25
6.8.4 Visualización de los productos del PCR en geles de agarosa 26
6.8.5 Secuenciación y análisis bioinformático. 26
7. Resultados. 27
7.1 Análisis microbiológico 28
7.2 Aislamiento y purificación de bacterias 32
7.3 Caracterización de cepas aisladas de ostiones 33
7.4 Ensayo de adhesión 34
7.5 Identificación molecular de bacterias potencialmente patógenas 37
8. Discusiones. 41
9. Conclusiones. 52
10. Bibliografía. 53
11. ANEXOS 71
v
LISTA DE TABLAS
Tabla Titulo Pagina
Tabla 1 Ubicación geográfica de las granjas de moluscos en Baja California
Sur, Zona Pacifico Norte.
12
Tabla 2 Ubicación geográfica de las granjas de moluscos en Baja California
Sur, Zona Pacifico Sur.
13
Tabla 3 Producción ostrícola por municipio en B.C.S. en el año 2010. 14
Tabla 4 Medios de Cultivo utilizados 21
Tabla 5 Mezcla de reacción usada para la amplificación del gen 16S ARN. 25
Tabla 6 Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacterias
con potencial patógeno para ostión
27
Tabla 7 Análisis microbiológico de los ostiones de C. gigas tomados de
diferentes zonas de Guerrero Negro.
28
Tabla 8 Análisis microbiológico de los ostiones de C. gigas tomados de
Región de Bahía Magdalena (San Buto y Paredones)
29
Tabla 9 Análisis microbiológico de los ostiones de C. gigas tomados de
Santo Domingo (Las Botellas)
30
Tabla 10 ANOVA del log UFC en Agar Marino de los tres muestreos 30
Tabla 11 ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos 31
Tabla 12 .Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1,
2 y 3
31
Tabla 13 ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2
y 3
31
Tabla 14 ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2
y 3
32
Tabla 15 Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre
muestreos
32
Tabla 16 Tipo y número de microorganismos con potencial patógeno,
aisladas en diferentes medios de cultivo selectivos.
32
Tabla 17 Caracterización de las cepas con potencial patógeno aisladas de
ostiones
33
Tabla 18 Características de adhesión de las cepas aisladas de ostiones en
diferentes medios de cultivo
35
vi
Tabla 19 Cepas con potencial patógeno aisladas de diferentes especies de
ostión y seleccionadas por su perfil de adhesión para identificarse
molecularmente
37
Tabla 20 Género y especie de las cepas con potencial patógeno aisladas de
ostión y seleccionadas por su capacidad de adherirse a moco de
ostión.
39
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura Titulo Pagina
Figura 1 Crassostrea gigas 17
Figura 2 Crassostrea gigas 17
Figura 3 Crassostrea gigas 18
Figura 4 Crassostrea gigas 18
Figura 5 Crassostrea gigas 18
Figura 6 S. palmula. 19
Figura 7 C. gigas 19
Figura 8 C. gigas 19
Figura 9 S. palmula 19
Figura 10 S. palmula 19
Figura 11 C. palmula 19
Figura 12 C. gigas 19
Figura 13 C. gigas 19
Figura 14
Mapa de lugares de muestreo de ostiones en BCS. 20
Figura 15
Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genómico de las cepas
de ostión: Carril 1. Lambda DNA, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4.
Cepa 06, 5. Cepa 011, 6. Cepa 012, 7. Cepa 024, 8. Cepa 062, 9.
Cepa 065, 10. Cepa 018, 11. Cepa 072.
38
Figura 16 Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA y
pH* y con ADN genómico de las cepas: Carril 1. Marcador de
peso molecular, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011,
6 . Cepa 024, 7. Cepa 062, 8. Cepa 065, 9. Cepa 018, 10. Cepa
072.
38
viii
RESUMEN
La producción mundial de moluscos se ha visto adversamente afectada por numerosas
enfermedades y debido a su severo impacto en el desarrollo económico y socioeconómico en
muchos países, algunas de estas enfermedades se han convertido en una restricción primaria para el
desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de moluscos. En esta investigación se cuantificó la
microbiota en diferentes medios de cultivo para bacterias con potencial patógeno y se aislaron las
bacterias predominantes en diferentes especies de ostiones que se cultivan o se encuentran en el
medio natural a lo largo de las costas del Océano Pacífico en Baja California Sur. Se caracterizaron
de acuerdo a su patrón de adhesión a extractos crudos de moco de ostión, asumiendo que los
microorganismos que se adhieren a moco tienen la capacidad de colonizar el tracto digestivo y
demás órganos que secretan mucosas en los ostiones. Se identificaron molecularmente diez cepas
con potencial patógeno que se adhirieron a moco de ostión. Los resultados mostraron que de las 80
cepas que se aislaron el 30% de las cepas presentaron la capacidad de adherirse a moco de ostión.
De las cepas aisladas en ABP el 47% presentaron adhesión fuerte, de AM el 23%, de AXLD el
80% y de ATCBS, el 22%. Las cepas con potencial patógeno, predominantes en organismos de
Crassostrea gigas, C. cortiziensis y C. sikamea, y Saccostrea palmula identificadas fueron: La cepa
01 presento un 100% de identidad con Enterococcus sp. C213. La cepa 011 presentó un 99% de
identidad con Enterococcus faecalis partial strain ZG7-15 y la cepa 062 también un 99% de
identidad con Enterococcus faecium strain FMC59. La cepas 03, 06 y 018, presentaron un 99% de
identidad con Escherichia coli cepa FUA1242 y la cepa 072 presentó un 100% de identidad con E.
coli cepa PMV-1. La cepa 012 tuvo también un 99% de similitud con Staphylococcus pasteuri cepa
87. La cepa 065 presentó también un 99% de similitud con Enterobacter cloacae strain AB2. De
acuerdo a la bibliografía, estos microorganismos con potencial patógeno han estado implicados en
brotes de enfermedades transmitidas por alimentos causando diferentes tipos de infecciones por lo
que de acuerdo a los resultados obtenidos, la prevalencia de estas bacterias en los ostiones, refleja
un riesgo para la salud del consumidor. Sin embargo, para saber si estas bacterias son también
patógenas para los ostiones en sus diferentes estadios de crecimiento, se requiere desarrollar otros
ensayos.
1
1. INTRODUCCION
Los productos marinos, incluyendo los moluscos ostreidos, representan una proporción
muy importante de los alimentos a escala mundial, y forman parte importante y esencial de
la dieta del hombre en muchos países. Los moluscos son, después de los insectos, el grupo
de animales más extendido sobre el planeta; se han clasificado aproximadamente 200 mil
especies. Se les encuentra lo mismo en la copa de los árboles que en las profundidades
marinas y su estudio ha ofrecido a los científicos temas por demás interesantes, por lo que
constituyen uno de los grupos mejor entendidos en la actualidad. Los moluscos bivalvos
son las ostras, mejillones, almejas, vieiras siendo estos de gran importancia económica para
la alimentación. En cuanto a la contribución de alimentos los moluscos ocupan el 3er lugar
junto a los peces diádromos, las plantas y peces de agua dulce. En el panorama mundial las
ostras ocupan el segundo lugar más importante después de los Cyprinidos o carpas (Helm et
al., 2006).
Los moluscos bivalvos, son organismos filtro-alimentadores y se ubican en la base de la
cadena alimenticia; crecen rápido, especialmente en los trópicos, y son ampliamente
demandados como alimentos gourmet en los mercados globales. Por lo anterior son
candidatos ideales para la acuacultura, además, en los proyectos comerciales no se
requieren inversiones grandes ni equipos sofisticados. A pesar de ser importante, la
acuacultura de moluscos no se ha consolidado como una actividad dominante en México,
debido a que no se ha considerado una conjunción de elementos técnicos, económicos y
sociales (Helm et al., 2006).
Entre los moluscos de la familia Ostreidae se incluye a un gran número de especies
comestibles; su distribución está confinada a una franja de aguas costeras dentro de las
latitudes 64° N y 44° S. Su distribución vertical se extiende desde un nivel
aproximadamente medio desde la zona intermareal, hasta profundidades de 32 m sin
embargo, las especies comerciales rara vez se encuentran en profundidades mayores de 12
m (Helmet al., 2006).
2
Los ostreidos en particular incluyen las ostras u ostiones, que son indudablemente los
moluscos preferidos del hombre, tanto por las cantidades que pueden extraerse como por su
calidad nutricional, generalmente aceptada y que con el tiempo se han incluido al comercio
y al cultivo. Los ostiones son un alimento altamente nutritivo; su contenido en proteína es
totalmente digerible y representa el 50 % de la materia seca.. Además, el ostión tiene un
contenido relativamente alto de carbohidratos (28 % de la materia seca) y relativamente
bajo de lípidos bajo (11 % de la materia seca). Contiene además vitaminas (A, riboflavina,
tiamina, niacina) y minerales (hierro, yodo, magnesio, fósforo, cobre, calcio), por lo cual se
considera un alimento equilibrado para el consumo humano (León, 1999).
Los ostiones son organismos bentónicos que se distribuyen en zonas fango-arenosas,
aunque pueden invadir sustratos sólidos y duros como las rocas, e incluso se desarrollan
fijándose a las raíces aéreas del mangle, en los estuarios, desembocaduras de ríos y lagunas
costeras, donde generalmente existen condiciones del medio favorables para su desarrollo y
prosperidad. En condiciones controladas de cultivo, pueden desarrollarse en otro tipo de
sustratos. Se alimentan principalmente de fitoplancton y son altamente gregarios, por lo que
se les encuentra formando agrupaciones compactas o islotes, denominados bancos. Se
distribuyen en las zonas tropicales y templadas, desde el nivel de las mareas hasta
profundidades de 40 m y sin embargo, prosperan principalmente en aguas poco profundas
(SEPESCA/INP, 1994).
Al género Crassostrea pertenecen numerosas especies que habitan en medio marino y/o
estuárico. Las que presentan un mayor interés y han sido objeto de cultivo o explotación
son C. gigas, llamada ostra japonesa o del Pacífico, que ha sido importada, entre otros
países occidentales, por Francia, en donde ha reemplazado totalmente a la ostra portuguesa
C. angulata; C. virginica u ostra americana, que es objeto de importantes cultivos en las
provincias marítimas del Canadá y sobre la costa oriental de los Estados Unidos,
cultivándose en concurrencia con otras especies en la costa del Pacifico. C. angulata u ostra
portuguesa, se distribuía por Portugal, España, Marruecos y en las costas del Adriático.
Otras especies pertenecientes a este género son C. margaritacea, que es la especie más
3
común en África del Sur, C. glomerata es la ostra de Nueva Zelanda, siendo objeto de
cultivo en las zonas intertidales; C. rhizophorae que vive fija sobre los manglares en el mar
del Caribe y se cultiva en Venezuela, Martinica y Guadalupe; C. guyanensis, que se
encuentra fijada sobre rocas en la costa Atlántica de América del Sur, desde Trinidad hasta
Brasil. C. gasar puebla los mangles de las riveras del oeste africano desde Senegal a
Angola. C. commercialis es la especie de Australia, llamándose ostra de roca o de
mangrove y siendo objeto de un fuerte cultivo. Otras especies que se pueden citar son C.
nippona y C. rivularis en Japón y en Extremo Oriente, C. cuscullata en la región
indopacífica y en las costas americanas desde Perú a California, así como en África desde
Cabo Verde al Cabo de Buena Esperanza y C. lacerata como especie cosmopolita. (Torres,
2001).
Las especies pertenecientes al género Ostrea que presentan un mayor interés son O. edulis
u ostra plana europea que junto a C. gigas son el objeto de este estudio; O. sinuata, que
puebla las costas de Nueva Zelanda; O. lurida, indígena de la costa pacífica de América del
Norte desde la baja California hasta Alaska, aunque en la actualidad el cultivo de esta
especie ha sido suplantado por el de C. gigas, al igual que sucede con O. denselamellosa de
las costas de China, Corea y Japón, que fue objeto de un cultivo intensivo desde 1918 hasta
1939 pero que actualmente se sustituye por el de C. gigas; O. chilensis, es la especie de
Nueva Zelanda, si bien se han encontrado poblaciones de estas en Perú y Chile, dicha
localización es un ejemplo claro de dispersión de especies a causa de las corrientes. O.
puelchana, habita las riberas de Brasil hasta el golfo de San Matías al sur del Mar del Plata
en Argentina; O. stentina se localiza en el Cantábrico y el Mediterráneo, siendo abundante
en Marruecos. O. atherstonei existe en pequeñas cantidades en África del Sur y O. stentina
que está distribuida por las costas atlánticas, las riberas del Mediterráneo y la región
indopacífica, así como O. folium, O. sandwichensis y O. crista-galli que habitan en la
región indopacífica, O. lima es típica de isla Mauricio, Filipinas y Hawái; O. megodon del
golfo de California, las islas Galápagos, Perú y Australia y O. frons que es cosmopolita
(Torres, 2001).
4
México ocupa el sexto lugar en la producción promedio mundial de ostión. El 96% de la
producción es principalmente de origen pesquero y proviene del Golfo de México. El 4%
restante proviene del Pacífico, e incluye la producción acuícola de ostión Japónes
Crassostrea gigas en sistemas tecnificados e intensivos, a partir de semillas producidas en
laboratorio. En términos de volumen de producción, la pesquería de este molusco está
considerada en la quinta posición, aunque no ocupa igual posición en términos de valor
económico (Cruz, 1996). En el Golfo de México el ostión es una de las especies de mayor
importancia comercial. Su explotación se centra en los estados de Campeche, Tabasco,
Veracruz y Tamaulipas. La mayor producción se registra en Veracruz, ocupando el primer
lugar con un 60%. Tabasco se encuentra en segundo lugar con un 28%, seguido por
Tamaulipas en tercer lugar con un 8% y Campeche en cuarto lugar con un 4% (Avilés y
Eusebio, 1991).
El impacto de los patógenos es variable y depende de la edad de los animales. La salinidad,
temperatura, cantidad de nutrientes, radiación solar son algunos de los factores que pueden
influir en la supervivencia y la proliferación de agentes patógenos que afectan el
crecimiento de los ostreidos y en muchos casos los llevan hasta la muerte. Las altas
densidades en cultivos de moluscos generan estrés y favorecen la aparición de patógenos
oportunistas siendo las bacterias las que causan mayor índice de mortalidad en ostreidos.
Además de que afectan tanto a larvas como juveniles y adultos (Granier et al., 2007;
Lafferty et al., 2004).
En organismos marinos y particularmente en aquellos que son objeto de cultivo intensivo,
la distinción entre la biota residente y transitoria es crucial porque debido a su forma de
alimentación mediante filtrado, constantemente están acumulando microorganismos que no
necesariamente se asientan en los tejidos y conductos de su tracto digestivo gastrointestinal
(TGI), sino que son digeridos y asimilados, mientras que otros más, pueden convertirse en
parte de su microbiota residente Moriarty 1990 en Jorquera et al., 2002). Durante los
estadios larvarios de bivalvos, una parte de la biota transitoria se vuelve rápidamente
microbiota residente (Jorquera et al., 2002). Por lo tanto, conocer la composición de esta en
5
el ostión permitirá entender mejor el mecanismo de acción de los microorganismos, tanto
patógenos como benéficos. Algunas enfermedades infecciosas solo afectan a los moluscos
en un estadio específico de su desarrollo, de manera que parece razonable suponer que la
mayor susceptibilidad podría estar relacionada en parte con la falta de una barrera
inmunológica otorgada por la microbiota residente, que cumple una función
fundamentalmente protectora contra la colonización por potenciales patógenos (Jorquera et
al., 2002; Kue y Chang, 1985).
La microbiota normal del TGI es muy diversa y juega un papel muy importante en la salud
y nutrición de los animales (Dumoneceaux et al., 2006, Navarrete et al., 2009; Romero y
Navarrete, 2006). El TGI de los animales y en particular de las ostras, es el hábitat natural
de una gran diversidad de microorganismos y un amplio rango de ellos pueden ser
bacterias patógenas para el organismo, y/o para el consumidor (Schulze et al., 2006, Spite
et al., 2000). Este puede ser el caso de algunos microorganismos comúnmente asociados
con el sedimento marino que son patógenos entéricos (Grimes et al., 1986), Vibrio,
Aeromonas (Dumontet et al., 2000), Listeria (Colburn et al., 1990) y Clostridium (Huss,
1980) y se han encontrado albergados en estos animales.
Por otro lado entre los moluscos, las ostras ocupan el 1er lugar en transmisión de
enfermedades o agentes infecciosos. Además de que causan muerte, generan cuantiosas
pérdidas económicas en la ostricultura (Thompson et al, 2005 en Witman y Flick 1995). La
acumulación de microorganismos en el sistema digestivo de los moluscos bivalvos incluido
el ostión es muy difícil de eliminar, si no se aplican procesos cuidadosos y estrictos de
limpieza y depuración. Existen diferentes agentes etiológicos que han provocado brotes
epidémicos de gastroenteritis, cólera y hepatitis A, dentro de los que podemos mencionar
los siguientes: Vibrio cholerae (Thompson et al, 2004), Vibrio vulnificus (Chatzidaki-
Livanis et al, 2006), Vibrio parahemolyticus (Zimmerman et al., 2007), Shewanella
(Richards et al., 2008) E. coli enteropatogénica (Ruchaud-Sparagno et al., 2007),
Norovirus (Le Guyader et al., 2008. También se han reportado casos de enfermedades
6
causadas por organismos no patógenos en personas inmunocomprometidas o desnutridas,
ancianos y niños (Avendaño-Capitan, 1986).
Los moluscos son los organismos más impactados por la contaminación ambiental debido a
su condición de organismos filtradores que acumulan gran cantidad de bacterias patógenas,
toxinas marinas y trazas de metales. Su microbiota guarda relación con la calidad del medio
ambiente en donde se encuentran. En términos generales son vehículos de transmisión de
toxiinfecciones alimentarías. La incidencia de brotes sigue constituyendo uno de los
problemas de salud pública más extendidos y permanecen como una de las causas
principales de morbilidad. Se ha estimado que una de cada dos mil comidas de moluscos
crudos origina enfermedades. Hoy día el riesgo de contraer una enfermedad de origen
entérico es mayor si se toma en consideración la contaminación de las aguas costeras por
desechos urbanos de alto contenido fecal. Dichos alimentos pueden poner a la gente en
riesgo de enfermedades peligrosas o la muerte por lo que no se recomienda comer ostiones
crudos. Diferentes especies de Vibrio, en particular Vibrio vulnificus es una bacteria que se
encuentra en aguas marinas, no es una amenaza para la gente sana, pero V. vulnificus puede
causar un frio repentino, fiebre, nausea, vomito, envenenamiento de la sangre y muerte en
pocos días en personas con ciertas condiciones médicas. La presencia de esta bacteria no es
el resultado de contaminación o de una inadecuada manipulación del producto. Comer
ostiones de aguas limpias o en restaurantes de alta calidad no provee protección. Comer
ostiones crudos con salsa picante o mientras se toma alcohol no mata la bacteria. Solamente
cocinando completamente los ostiones se mata la bacteria. Especies consideradas como
procedentes de heces fecales son reconocidas como contaminantes de estos animales
marinos filtro-alimentadores y como una causa importante de los brotes de enfermedades
asociadas al consumo de dichos organismos procedentes de la extracción o el cultivo. Sin
embargo algunas especies como Salmonella (Asakura et al, 2002) y Campylobacter (Endtz
et al., 1997; Cappelier et al., 1999) han sido detectadas en ambientes donde no existe
actividad ni contaminación humana, por lo que se sugiere considerarlos como parte de la
microbiota normal de molusco
7
2. JUSTIFICACION
El ostión por su carácter filtrador es propenso a la acumulación de patógenos causantes de
enfermedades (Sanidad) y su transmisión al humano (Inocuidad), principalmente
infecciones bacterianas y parasitarias. El cultivo de ostión es una industria en crecimiento
en el Estado y requiere de estrategias para incrementar la supervivencia en la producción de
semilla y el crecimiento en la engorda. Uno de los principales problemas que enfrenta el
cultivo de ostión en el Estado, es la falta de semilla en mayor cantidad y de buena calidad
que garantice cultivos exitosos. Para lograr este reto es importante conocer cuál es la
problemática actual en los diferentes laboratorios y granjas de ostión del estado, resolverla
y evitar cuantiosas pérdidas económicas en las granjas que se dedican a su explotación.
Otro problema serio es la contaminación por aguas residuales y desechos industriales. El
ostión es un alimento altamente nutritivo, con buena digestibilidad pero al consumirlo
crudo o ligeramente tratado, existe el riesgo de transmisión de una serie de enfermedades.
En este proyecto se propone investigar la microbiota predominante y con potencial
patógeno en ostiones de las granjas ostrícolas del estado con el objetivo de aislar e
identificar los microorganismos con potencial patógenos y analizar su capacidad de
adherirse a mucosas de ostión.
8
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Aislamiento y caracterización de bacterias predominantes y con potencial patógeno, que
puedan afectar la sanidad del ostión como especie objeto de cultivo y la inocuidad del
producto cultivado.
3.2 OBJETIVOS PARTICULARES.
Aislar en medios selectivos para microorganismos patógenos, las bacterias
predominantes en ostiones nativos y ostiones cultivados procedentes de diferentes
granjas ostrícolas de Baja California Sur.
Determinar experimentalmente, en condiciones de laboratorio, la capacidad de
adhesión de las bacterias aisladas, a mucosas del ostión.
Identificar molecularmente, a nivel de género y especie, las bacterias
potencialmente patógenas aisladas de ostiones, que pudieran representar un riesgo
desde el punto de la sanidad del organismo cultivado y de la inocuidad del producto
para el consumidor.
4. HIPOTESIS DE TRABAJO
Tomando en cuenta que las técnicas y metodologías de trabajo propuestas para la
investigación son eficientes para el aislamiento y caracterización de bacterias del
ostión, al menos una de esas bacterias presentará la capacidad de colonizar a
mucosas de ostión y habrá sido previamente reportada como potencialmente
patógena para moluscos ostreidos.
9
5. ANTECEDENTES
5.1 MOLUSCOS BIVALVOS EN EL CONTEXTO MUNDIAL
De acuerdo con la Organización Mundial de Epizootias (OIE), durante las últimas décadas,
la producción mundial de moluscos se ha visto adversamente afectada debido al severo
impacto de enfermedades infecciosas. La detección, seguimiento y medidas de mitigación y
control de patógenos certificables y/o notificables se ha convertido en un requerimiento
primario para el desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de moluscos. La transferencia de
agentes infecciosos vía el transporte de moluscos vivos, ha sido la principal causa de
difusión de enfermedades y epizootias. La dinámica actual de libre comercio y el legítimo
derecho de los países acuicultores de buscar nuevas alternativas para la producción de
alimentos y su distribución en los mercados mundiales, con generación de desarrollo
económico y social, a menudo han propiciado se minimicen o se pasen por alto algunos
factores sanitarios esenciales que, de no considerarse en su justo contexto, pueden hacer
fracasar los cultivos de moluscos y demeritar la calidad de sus productos.
Entre los requerimientos básicos de manejo para una mejor distribución de dichos
organismos, se incluye el conocimiento de la condición sanitaria de los moluscos bivalvos
a transferir, cuáles problemas sanitarios les afectan, qué riesgo hay de que esos problemas
se transfieran a otras poblaciones naturales o cultivadas de moluscos bivalvos en la zona
receptora, y qué problemas sanitarios propios de los moluscos bivalvos de la zona receptora
pueden afectar al molusco bivalvo transferido. El conocimiento de ésta información
proporciona una mayor garantía de éxito para las empresas acuícolas, ayuda a proteger la
biodiversidad de moluscos y otras especies en el ambiente y protege al consumidor.
La experiencia, que en materia sanitaria, han desarrollado algunos de los países líderes en la
producción de moluscos y otros organismos acuáticos a niel mundial, ha permitido contar
con lineamientos relativamente precisos para evitar la transferencia de enfermedades,
mismos que se han agrupado en el Código Sanitario para los Animales Acuáticos y en el
Manual de Pruebas de Diagnóstico para los Animales Acuáticos de la OIE.
10
Adicionalmente, muchos países han desarrollado lineamientos sanitarios propios que
vienen a fortalecer las medidas generales para evitar la transferencia de enfermedades. La
mayor información científica sobre los agentes patógenos de moluscos bivalvos que
conocemos, se refiere fundamentalmente, a las especies mayormente cultivadas y
dispersadas alrededor del mundo o nativas de países desarrollados, tales como C. gigas, C.
virginica, Ostrea edulis, Mytilus edulis, M. galloprovincialis, Ruditapes philippinarum,
Saccostrea glomerata, entre otras (http://www.oie.int/).
5.2 LA OSTRICULTURA EN MEXICO
México ocupa el cuarto lugar en cultivo de moluscos bivalvos en América Latina y se
realiza en mayor parte en las costas del Pacífico de Baja California y Golfo de California.
La ostricultura comercial de México se basa prácticamente en el cultivo intensivo de la
ostra del Pacífico C. gigas con semilla producida en el laboratorio. El 95.6 % de las
empresas dedicadas a la producción intensiva de moluscos bivalvos, se dedican al cultivo
de la especie C. gigas en la Península de Baja California y Mar de Cortez en el estado de
Sonora y en menor proporción al cultivo del ostión americano C. virginica en los estados
del Golfo de Méxicos. En Nayarit se realiza la acuicultura del ostión de Placer C.
corteziensis por medio de colecta de semilla del medio natural. En Sinaloa el futuro de esa
especie nativa es incierto, ya que existen problemas en la producción de juveniles en el
laboratorio y al parecer hay un agente patógeno que limita la maduración de los
reproductores (PMSMB, 2008).
5.3 OSTRICULTURA EN BAJA CALIFORNIA SUR
El Estado de Baja California Sur tiene características inigualables para el desarrollo de una
acuacultura sostenible y sustentada en elementos de sanidad e inocuidad, que podrían
impactar considerablemente en la economía local si se respetan estas bases. La
característica de aislamiento geográfico peninsular a pesar que puede verse como una
desventaja, es considerada como la principal característica favorable para la industria
ostrícola local, ya que la adecuada aplicación de restricciones a la libre movilización de
11
semillas podría ser favorable para el adecuado control de enfermedades y parásitos que
afectan los cultivos en los estados vecinos del Noroeste de México. Para tal efecto, el
Comité de Sanidad Acuícola de B.C.S. tiene como funciones detectar, prevenir y
reducir/controlar la aparición y dispersión de enfermedades en los cultivos acuícolas del
Estado, con el fin de reducir riesgos a la inversión, impulsando normas que coadyuven en
el crecimiento ordenado y sustentable de ésta actividad respetando los ecosistemas, base
fundamental de la sanidad e inocuidad del producto destinado al consumidor.
Al respecto, durante el 2008, se supervisaron 12 localidades del Estado donde se tienen
establecidos grupos de cultivo principalmente de ostión y mano de león, así como, 2
laboratorios de producción de abulón y uno de bivalvos en la Zona Pacifico Norte y 2
laboratorios de producción de bivalvos en La Paz, B.C.S. Paralelamente se realizan análisis
a los organismos en cultivo para detectar y prevenir posibles infecciones por enfermedades
certificables de la OIE, (Organización Mundial de Epizootias), así como, parásitos y para la
detección de herpes virus.
Estos parásitos, en general, causan daños en los tejidos, desarrollándose principalmente en
el tejido epitelial del estómago y de la glándula digestiva y están asociados con bajas
condiciones de vida, enflaquecimiento de la ostra y agotamiento de sus reservas de energía
(glicógeno), decoloración de la glándula digestiva, interrupción del crecimiento,
reabsorción de las gónadas y desorganización total del epitelio de la glándula digestiva,
causando inanición (Caceres et al., 2008).
La mortalidad por estos parásitos parece estar relacionada con la esporulación de los
mismos ya que ésta se produce en el epitelio de los palpos, del estómago, del conducto
digestivo y probablemente de las branquias (Caceres et al., 2008). Es de destacar que la
variación en la producción de ostiones en 2005 cuando se produjeron 250,081 docenas, su
reducción para 2006 a 129,520 docenas, y el incremento para el año 2007 a 346,466
docenas y finalmente una nueva reducción en el 2008 a 245,915 docenas, se puede explicar
principalmente en función de la inconstancia en la producción de semillas y la
consecuente limitación en la siembra de los productores. El cultivo de moluscos en Baja
12
California Sur es una actividad dinámica en constante desarrollo, tanto en sus aspectos
técnicos como en el impacto social y económico que genera. El cultivo de esta especie, se
lleva a cabo exclusivamente en cuerpos de agua del pacifico sudcaliforniano, desde el
estero Rancho Bueno al sur del complejo lagunar Bahía Magdalena, hasta la Laguna de
Guerrero Negro al norte del estado. El alto contenido de alimento natural, temperatura
adecuada casi todo el año y su excelente nivel de limpieza hacen de estos cuerpos de agua
sitios de privilegiados para la actividad ostrícola
(http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf). En el Pacífico norte de Baja
California Sur se encuentran ubicadas la mayoría de las granjas ostrícolas del Estado (Tabla
1).
Tabla 1.- Ubicación geográfica de granjas ostrícolas en la zona Pacífico Norte de Baja
California Sur (Fuente:http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf )
NOMBRE DE
LA EMPRESA
UBICACIÓN LOCALIDAD MUNICIPIO COORDENADAS
SCPP Y A La
Perla de Guerrero
Negro SC de RL
Campo Chupa-
Lodo. Laguna
Guerrero Negro
BCS
Guerrero Negro
BCS
Mulegé 27° 59’ 40.50´´ N
114° 4’17.65´´ O
Comité Pesquero
Social y Privado
Laguna Ojo de
Liebre
Guerrero negro
BCS
Mulegé 27° 55’10.09´´ N
11°10’ 53.50´´ O
SCPP Bahía
Tortugas SC de
RL
El Rincón Bahía
Tortugas
Bahía Tortugas
BCS
Mulegé 27° 39’ 46.52´´ N
114° 51’ 56.08´´ O
Sol Azul SA de
CV
Estero el Cardón
BCS
El Cardón BCS Mulegé 26° 47’ 25.81´´ N
113° 8’ 58.20´´ O
13
SCPP Punta
Abreojos SC DE
RL
Estero El Coyote
BCS
Punta Abreojos
BCS
Mulegé 26° 47’ 25.81´´ N
113° 26’ 4.57´´ O
SC El Progreso de
Producción
Pesquera SCde RL
Estero La Bocana
BCS
La Bocana BCS Mulegé 26° 47’ 14.75´´ N
113° 41’ 24.67´´ O
Sin embargo también podemos encontrar algunas granjas ostrícolas en el centro sur de Baja
California Sur, cuya ubicación geográfica se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2.- Ubicación geográfica de granjas de moluscos en la zona Pacífico Sur de Baja
California Sur (Fuente: http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)
NOMBRE DE LA
EMPRESA
UBICACIÓN LOCALIDAD MUNICIPIO COORDENADAS
SCPP Santo
Domingo SCL
Campo El
Pailebote
Santo Domingo Comondú 23° 32’ 44.94’’ N
112° 4’ 5.98’’ O
Moluscos Bahía
Magdalena SPR de
RL
Campo Las
Botellas
Puerto Adolfo
López Mateos
Comondú 25°18´ 9.05’’ N
112° 4’ 59.76’’ O
Sistema de
Maricultura y Pesca
S de RL de CV
Campo Los
Islotes
Estero San Buto Comondú 24° 46’ 28.40’’ N
112° 2’ 51.59’’ O
Argos Acuicultores
SA de CV
Campo 13 Estero San Buto Comondú 24° 46’ 14.65’’ N
112° 2’ 11.69’’ O
14
La producción ostrícola en Baja California Sur, en el 2010 fue de 504,432, con una mayor
producción en el Municipio de Mulegé, Tabla 3.
Tabla 3. Producción ostrícola por municipio en B.C.S. en el año 2010.
(Fuente: http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)
Productor Municipio Localidad Cantidad (Dz)
La Perla Mulegé Guerrero Negro 200
Sol Azul Mulegé El Cardón 294,177
Verde Mar Acuícola Mulegé El Cardón 41,666
Bahía Tortugas Mulegé Bahía Tortugas 819
Punta Abreojos Mulegé Punta Abreojos 67,000
El Progreso Mulegé La Bocana 47,000
Total municipal: Mulegé 450,862
Molusco Bahía
Magdalena
Comondú Pto. Adolfo López
Mateos
NR
Santo Domingo Comondú Santo Domingo 48,879
Acuacultura El Paraíso Comondú Santo Domingo 4,691
Sistemar Comondú Estero San Buto NR
Argos Acuacultores Comondú Estero San Buto 0
Total municipal: Comondú 53,570
Cultemar La Paz Rancho Bueno 0
Total estatal 504, 432
15
5.4 RIESGO SANITARIO ASOCIADO AL CULTIVO Y CONSUMO DE
MOLUSCOS BIVALVOS.
En años recientes se ha incrementado la preocupación del sector público por asegurar la
inocuidad de diversos alimentos de origen marino, pesquero y acuícola, para el consumo
humano directo. Esto se debe en parte, a que se han detectado casos de envenenamiento y
de enfermedades infecciosas (Martínez y Montoya, 2003; Thompson et al., 2005). Los
aspectos de salud pública relacionados con el consumo de productos provenientes de la
ostricultura, se enfocan principalmente a evitar la presencia de peligros biológicos (ej.
parásitos, bacterias y virus) y químicos (ej. plaguicidas, metales pesados y biotoxinas)
(Martínez y Montoya, 2003).
Los moluscos bivalvos son sedentarios y filtradores; sus branquias cubiertas de mucus y
cilios vibrátiles, además de cumplir con la función respiratoria, retienen fitoplancton,
materia orgánica particulada y diversos microorganismos como bacterias, virus y protistas
planctónicos. (Di Girolamo et al., 1977). El riesgo en el consumo de ostiones es debido a
que son propensos a acumular y en consecuencia, a transmitir microorganismos patógenos
al consumidor. Por otro lado, también pueden acumular biotoxinas y productos químicos
como fertilizantes, metales pesados, compuestos organoclorados y medicamentos
veterinarios como antibióticos que pueden ser nocivos para la salud humana. Una buena
parte de los brotes epidémicos causados por la intoxicación o infección alimentaria
provienen de moluscos bivalvos provenientes de la pesca o de la acuacultura, cuando han
sido contaminados con virus y/o bacterias debido a que las aguas en las que crecen, pueden
en algunos casos contaminarse con materia fecal de aguas residuales, e incluso por
infecciones que tiene la persona que manipula dichos alimentos (Metcalf et al., 1979,
Rippey, 1994).
16
6. MATERIALES Y METODOS.
6.1 COLECTA Y TRANSPORTE DE ORGANISMOS
Se viajó a cada lugar de muestreo, en las costas del Océano Pacífico a lo largo de Baja
California Sur, Figura 14. En el caso de granjas se hizo previa cita con los responsables.
De cada lugar se tomaron al azar al menos tres organismos. Cada organismo colectado, se
escurrió, se colocó en una bolsa de papel estéril y se cubrió con otra bolsa de plástico
debidamente higienizada y se guardaron en un ambiente fresco en una hielera para
transportarse hasta el laboratorio y analizarse inmediatamente.
Los organismos colectados en el municipio de Mulegé se analizaron microbiológicamente
el mismo día en la Unidad del CIBNOR que se encuentra en Guerrero Negro. Los
organismos que se colectaron en los municipios de Comondú y la Paz se analizaron en el
Laboratorio de Ciencia y Tecnología de Alimentos.
6.2 SITIOS DE MUESTREO.
1ER MUESTREO. FECHA: 19 ENERO 2012
En el primer muestreo llevado a cabo en las Zonas 1, 2 y 3 del municipio de Mulegé, solo
se colectaron organismos de C. gigas, como se observa en las figuras 1, 2, 3, 4 y 5.
Zona 1
Municipio: Mulegé. Localidad: Gro. Negro. Ubicación: La Salinera. Coordenadas:
Latitud 27 ° 53´ 19.34 ¨ N Longitud 114 ° 08´ 34.76 ¨ O. No. Mestras: 3. Analizadas: 2
17
Zona 2
Municipio: Mulegé. Localidad: Gro. Negro. Ubicación: Granja Ostión del Pacifico.
Laguna de Gro. Negro. Coordenadas: Latitud 27° 59´40.50 ¨ N Longitud 114° 4´17.65 ¨
O. No. Muestras: 3. Analizadas: 3
Fig. 2. Crassostrea gigas
Fig 1. Crassostrea gigas
18
Zona 3
Municipio: Mulegé. Localidad: Gro. Negro. Ubicación: Granja Intermareal
Coordenadas: Latitud 28° 02´ 26.34¨ N Longitud 114° 06 ´36.32 ¨ O. No. Muestras:
6. Analizadas: 6
2DO. MUESTREO FECHA: 26 ABRIL 2012
Municipio: Comondú. Localidad: San Buto. Ubicación: Bahía Magdalena.
Coordenadas: Latitud 24º48´0´´N y Longitud 112º3´0´´ O. No. Muestras: 8.
Fig 3. Crassostrea gigas
Fig 4. Crassostrea gigas
Fig 5. Crassostrea gigas
19
3ER. MUESTREO FECHA: 4 MAYO 2012
3er. MUESTREO FECHA: 4 MAYO 2012
Municipio: Comondú. Localidad: Santo Domingo. Ubicación: Las Botellas.
Coordenadas: Latitud 25º17´32´´ N y Longitud 11º56´08´´ O. No. Muestras: 13
En este muestreo se colectaron 3 organismos de las especies C. corteziensis, 3 de C.
rhizophorae, 3 de S. palmula y 4 de C. gigas.
Fig. 6. S. palmula Fig 7. C. gigas Fig 8. C. gigas Fig 9. S. palmula
Fig 10. S. palmula Fig 11. S. palmula Fig 12. C. gigas Fig 13. . C. gigas
20
Fuente:http://cesabcs.org/pdf/UbicacionTermografosMoluscos2010%282%29.pdf
6.3 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Se analizaron todos los organismos colectados de cada especie y de cada punto de
muestreo. Los ostiones recién llegados al laboratorio se lavaron con agua corriente, la
superficie se cepilló hasta observarla limpia, se enjuagaron con agua estéril y
posteriormente se realizó la disección en una charola con un punzón, pinzas y tijeras
estériles. Se colocaron en tubos falcón de 40 ml previamente estériles; se homogenizaron
con un homogenizador de tejidos y se realizaron diluciones decimales para llevar a cabo
cuentas viables por la técnica de extensión en superficie de mesófilos aerobios y en medios
Fig 14. Mapa de lugares de muestreo de ostiones en BCS.
21
selectivos para los géneros Vibrio, Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococcus,
hongos y levaduras.
6.4 AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE BACTERIAS (Marvin, 1976)
Del crecimiento obtenido en las diluciones más altas sembradas en los medios de cultivo de
la Tabla 4, se seleccionaron colonias predominantes aisladas y se resembraron
individualmente por estría cruzada en cajas de petri con los mismos medios de cultivo.
Tabla 4: Medios de Cultivo utilizados
Agar marino Agar Baird Parker Agar Papa Dextrosa
Agar TCBS Agar XLD Agar y Caldo EC
Caldo Selenito Cistina
Caldo Vassiliadis-Rappaport Caldo lactosado
De las siembras por estría cruzada se seleccionaron colonias aisladas y se resembraron en
Caldo TSB. Se incubaron de 12 a 18 horas a 30ºC para su crecimiento. Posteriormente
alícuotas de 250 µl se adicionaron con igual cantidad de glicerol al 80% en tubos eppendorf
de 1.5 ml, se etiquetaron y se guardaron en ultracongelación, hasta su análisis.
6.5 MORFOLOGÍA CELULAR DE LAS CEPAS
Del crecimiento obtenido en el punto anterior, se hicieron preparaciones en fresco para
observar las características morfológicas de cada bacteria en el microscopio de contraste de
fases.
22
6.6 TINCIÓN DE GRAM Y PRUEBA DE LA CATALASA (Marvin 1976).
Todas las cepas seleccionadas de los diferentes medios fueron resembradas en caldo TSB
por 12 horas. Se llevaran a cabo frotis en portaobjetos de cada cepa y se les realizó la
tinción de Gram, posteriormente se observaron en un microscopio de contraste de fases. La
prueba de la catalasa se llevó a cabo poniendo una gota de cultivo fresco sobre el
portaobjetos y se le agregó una gota de peróxido de hidrógeno, se observo la formación de
burbujas para determinar si la prueba fue positiva.
6.7 ENSAYO DE ADHESIÓN A MOCO DE OSTION
Para el ensayo de adhesión de las cepas con potencial patógeno a moco de ostión se utilizo
el método reportado por Rojas and Conway 2001, el cual se describe a continuación.
6.7.1 Preparación del cultivo.
Cada cepa de bacteria con potencial patógeno se reactivó en agar TSA, se inoculó al 1% en
3-5 ml del medio TSB y se incubó a 37°C hasta que el cultivo alcanzo la fase de
crecimiento logarítmica máxima. Se centrifugó a 3500 rpm durante 5 min, se lavó el pellet
con 3 ml de buffer H-H, se centrifugó otra vez a 3500 rpm durante 5 minutos.
Posteriormente se suspendió en 1 ml del mismo buffer, ajustando la densidad óptica a 0.9 a
una longitud de onda de 600 nm en un espectrofotómetro Bio-Rad SmartSpectm 3000.
6.7.2 Preparación de la membrana.
Se cortó un trozo suficiente de membrana Immobilon-P (PVDF: Polyvinilidene difluoride
microporous membrane marca Millipore), de acuerdo al número de cepas y por triplicado.
Se dividió la membrana en cuadros de 1 cm2. Se colocó la membrana en metanol por 2
segundos y se enjuagó con agua destilada por 5 min. Se equilibró en Buffer H-H y se
colocó sobre el papel filtro previamente humedecido con el Buffer H-H, con el fin de
mantenerla húmeda todo el tiempo. Se utilizó como control positivo la cepa L. fermentum
86 (Macías Rodríguez M. E., 2008) a la cual se le dió el mismo tratamiento que al cultivo.
El ensayo se realizó por triplicado, usando como control negativo H-H.
23
6.7.3 Ensayo de adhesión.
Sobre cada cm2 de la membrana colocada sobre la cama de papel filtro húmedo con H-H se
depositaron 20 µL de cada suspensión celular hasta que se absorbió el líquido. Se incubó la
membrana en una solución al 3% de albumina de suero bovino (BSA) preparada con Buffer
H-H y se mantuvo por 20 min a temperatura ambiente para bloquear sitios no específicos.
Se desechó la albumina y se lavó la membrana 2 veces con H-H. Posteriormente se incubó
la membrana en una solución que contenía 300 µL de extracto crudo de moco de ostión
marcado enzimáticamente (HRP-Moco en 10 ml de Buffer H-H y se dejó incubando por 2
horas a temperatura ambiente. Se desechó el moco marcado y se lavó la membrana 2 veces
con buffer H-H 10 min cada vez, se desechó el Buffer y se enjuagó con una solución de
acetato de sodio 0.1 M pH=5.0 para enseguida desarrollar color con el sustrato de la enzima
y un cromógeno (3.5 mg de diamino bencidina, 2.5 µL de peróxido de hidrogeno y 10 ml
de acetato de sodio 0.1 M) Cuando se desarrolló el color, la membrana se enjuago con
metabisulfito de sodio 0.1 M por 3 min para detener la reacción.
Por último la membrana se secó a temperatura ambiente y fue llevada a un documentador
de geles (Bio Rad) para posteriormente analizar los resultados en forma cualitativa.
6.8 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS POTENCIALMENTE
PATÓGENAS
6.8.1 Extracción del ADN genómico de cepas
Las cepas guardadas con glicerol a -85ºC se reactivaron por estría cruzada en agar TSA,
incubándose por 18-24h a 30°C. Se tomó una colonia aislada de cada cepa y se inocularon
al 1% en caldo TSB y se incubaron por 12 h a 30°C, una vez pasando este tiempo los
cultivos se pusieron (1.5 ml) en tubos eppendorf de 1.5 ml. Se centrifugó por 5 minutos a
6000 rpm a 4°C, y se desechó el sobrante. A partir de este punto se utilizó el Kit Wizard®
Genomic DNA Purification Kit Part # TM050, protocolo 3.G. para el aislamiento de ADN
genómico de bacterias Gram negativas. Brevemente. Se suspendieron las células agitando
vigorosamente en 480μl de 50mM EDTA y se agregaron 600 µl de la Solución de Lysis
24
Nuclei. Se resuspendió con la micropipeta subiendo y bajando la suspensión y se incubó a
80°C por 5 minutos para terminar de lisar las células y entonces enfriar a temperatura
ambiente. Se agregaron 3 µl de la solución RNasa al lisado de células, se Invirtió el tubo de
2 a 5 veces para mezclar y se incubó a 37°C por 15-60 minutos. La muestra se enfrió a
temperatura ambiente y se agregaron 200µl de la solución para precipitar proteínas al lisado
de células tratado RNasa. Se agitó vigorosamente por 20 seg para mezclar y se incubó la
muestra en hielo por 5 minutos, se centrifugó a 13,000-16,000 x g por 3 minutos y se
transfirió el sobrenadante que contiene el DNA a un tubo para centrífuga limpio de 1.5 ml
conteniendo 600µl de isopropanol a temperatura ambiente. Se mezcló vigorosamente por
inversión del tubo hasta que La red de hebras de DNA formó una masa visible. Se
centrifugó a 13,000-16,000 x g por 2 minutos y se decantó cuidadosamente el sobrenadante.
Se drenó el tubo con un papel absorbente y se agregaron 600µl de etanol al 70% a
temperatura ambiente, se invirtió el tubo varias veces para lavar el pellet de ADN, se
centrifugó a 13,000-16,000 x g por 2 minutos. Se aspiró cuidadosamente el etanol y se
drenó el tubo sobre un papel absorbente limpio para permitir que el pellet se seque al aire
por 10-15 min. Se agregaron 100 µl de solución de rehidratación de ADN al tubo y se dejó
rehidratar el DNA incubando a 65°C por una hora. Periódicamente se mezcló la solución
invirtiendo el tubo. Alternativamente, para rehidratar el DNA se incubó la solución toda la
noche a temperatura ambiente o a 4°C. El DNA se almacenó a 2-8°C.
6.8.2 Visualización del ADN genómico.
La medición de la concentración de ADN se llevó a cabo comparándolo con diferentes
concentraciones de lambda (λ) DNA Para visualizar el ADN se prepararon geles de agarosa
al 1% en buffer TAE (tris 40 mM, pH 7.6, ácido acético 20mM y EDTA 1mM) y en
presencia de bromuro de etidio 1 µl. (10mg/ml EtBr). Se prepararon 5 µl de muestra
mezclados con 5µl (una gota) del buffer de la muestra (10X stlc, 50% glicerol, 0.25%
bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF en 1X buffer TAE). Se colocaron las muestras
en los carriles del gel de agarosa acomodado en la cámara. El gel se corrió en una cámara
de electroforesis horizontal (Bio-Rad) conectada a una fuente de poder (Bio Rad) a 50
25
Volts. Después de correr el gel por 45 minutos se procedió a analizarlo en una cámara de
luz UV.
6.8.3 Amplificación del gen 16S DNA para identificación molecular de bacterias (Broda et
al,. 1999).
Una vez purificado el ADN genómico de cada cepa, se llevó a cabo la reacción de
amplificación de los genes ribosomales 16sRNA por PCR en la que se utilizaron los
oligonucleótidos pA y PH*, Broda et al., 1999.
pA: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
pH*: 5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.
La composición de la mezcla de reacción se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. Mezcla de reacción usada para la amplificación del gen 16S ARN.
Componente (Concentración
stock)
Concentración final Volumen por 50 µl
de reacción (en
µl)***
Buffer de enzima Taq(10X) 1.5X 5
MgCl2 (50mM) 0.15mM 3
dNTP´S 0.20mM 1
Oligo pA(100 mM) 0.5 µM 0.25
Oligo PH*(100 µM) 0.5 µM 0.25
Taq polimerasa (5U/ µl) 0.01 u/ µl 0.25
ADN genómico (0.5 µg/ µl) 5ng/ µl 2
H2O bi-destilada libre de
DNAsas
38.3
Volumen final 50
26
***Cantidades estandarizadas para el kit de PCR de Invitrogen™, deben considerarse las
concentraciones stock indicadas para kits de otras marcas.
Una vez mezclados los componentes, se llevó a cabo la siguiente reacción colocando los
tubos que contienen la mezcla en un termociclador (Perkin Elmer).
El programa consistió de 35 ciclos, 95°C por 4 minutos, 94°C por 45 seg y 72°C por 1
minutos. El programa terminó con 5 minutos de incubación a 72°C. Finalmente se bajó la
temperatura a 4°C.
Una vez concluida la reacción se observó el producto de la amplificación en un gel de
agarosa al 1.5%.
6.8.4 Visualización de los productos del PCR en geles de agarosa
Para observar los productos de PCR se preparó un gel de agarosa al 1.5%. Cada producto 5
µl se mezcló con 1 µl de buffer para la muestra (Tris-HCl 0.5 M, Glicerol, SDS 10%,2-
Mercapto-etanol, Bromofenol azul 1%) y se corrió una electroforesis a 70 Volts durante 40
minutos, se utilizó un marcador de peso molecular (PCR Markers, Promega), un control
positivo (Lactobacillus fermentum) y un blanco (agua libre de nucleasas). Los productos de
PCR se enviaron a la empresa Macrogen (Korea) para su purificación y secuenciación.
6.8.5 Secuenciación y análisis bioinformático.
Las secuencias obtenidas y sus cromatogramas fueron editados en Chromas, se quitaron los
extremos que no tenían buena resolución y se alinearon (forward and reverse) con el
software Align de Blast. Las secuencias resultantes fueron comparadas en la base de
secuencias de NCBI con la herramienta Blast.
27
7. RESULTADOS
Se hicieron tres muestreos de campo a lo largo del Estado de Baja California Sur,
colectando ostiones cultivados y organismos silvestres (Tabla 6). Se colectaron más
muestras de ostión Japonés C. gigas que de las otras especies, debido a que es la especie
más cultivada en el estado. En una granja ostrícola de la región de Santo Domingo (Las
Botellas), se colectaron ejemplares de ostión de placer C. corteziensis y ostión Kumamoto
C. sikamea
El ostión de mangle Saccostrea palmula, una especie nativa que generalmente crece en
forma silvestre, pegada a los mangles y otros objetos presentes en la zona intermareal, fue
incluido en los muestreos 2 y 3, como fuente potencial de bacterias patógenas y punto de
referencia para los resultados con las especies de cultivo no-nativas.
Tabla 6. Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacterias con
potencial patógeno para ostión.
No.
Muestreo
Ubicación Organismos
analizados
Cepas
aisladas
Observaciones
1 G. Negro
Zona 1
Zona 2
Zona 3
2
3
6
25
Aisladas de C. gigas
2 Región de
Bahía
Magdalena
8
25
Aisladas de C. gigas y S.
palmula
3
Las Botellas
13
30
8 Aisladas de C. gigas, 13 de C.
corteziensis, 5 de C. sikamea, 4
S. palmula (ostión de mangle)
28
7.1.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.
Los análisis microbiológicos se realizaron a todas las especies de ostiones traídos al
laboratorio. Estos análisis se hicieron por cuenta viable usando la técnica de diluciones en
diferentes medios de cultivo selectivos para diferentes microorganismos patógenos. Para
cuantificar la microbiota predominante se usó agar marino, un medio de cultivo rico en
nutrientes donde pueden crecer todos los microorganismos cultivables del ambiente marino.
En general las cuentas más altas de bacterias en agar marino se encontraron en los ostiones
colectados en Guerrero Negro (Tabla 7), sin embargo, en esta misma región se presentaron
cuentas bajas de microorganismos con potencial patógeno.
Tabla 7. Análisis microbiológico de los ostiones (C. gigas) procedentes de diferentes
zonas de Guerrero Negro, B.C.S.
Medio
de
cultivo
Muestreo 1. Log UFC/g de OSTIONES, C gigas
ZONA 1 ZONA 2 ZONA 3
Ostión O1 02 O3 O4 O5 O6 O7 O8 09 010 011
AM 6.2 7.0 6.3 <3 <3 7.0 7.9 7.3 5.2 6.1 5.7
TCBS <2 <2 <2 <2 <2 4.0 3.3 5.0 5.3 <2 4.1
APD <1 <1 3.3 3.8 <1 <1 3.3 <1 <1 <1 <1
ABP <1 1.0 <1 <1 <1 1.0 3.0 3.8 1.0 <1 2.0
MRS <1 <1 3.6 3.6 <1 <1 4.9 4.8 2.3 4.4 2.0
Los ostiones de Bahía Magdalena fueron los que presentaron en lo general las cuentas más
bajas de los tres muestreos, Tabla 8: En los medios AM (Agar Marino), en TCBS selectivo
29
para microorganismos del Género Vibrio, en APD (Agar Papa Dextrosa) donde crecen
hongos y levaduras y en ABP (Agar Baird Parker), donde crece Staphylococcus sp.
Con respecto a los tipos de microorganismos, la cuenta viable total en agar marino (AM)
estuvo en un rango de 3.0 a 7.9 Log UFC, Tabla 8.
Tabla 8.- Análisis microbiológico de los ostiones (C. gigas) colectados en Bahía
Magdalena B.C.S. (San Buto y Paredones).
Medio de cultivo Muestreo 2. Log UFC/g de OSTIONES
Ostión O12 013 O14 O15 O16 O17 O18 O19
AM
3.6
3.0
5.8
3.5
3.3
3.9
4.8
5.2
TCBS <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2
APD <1 <1 1.3 <1 <1 <1 <1 <1
ABP
1.6
<1
<1
<1
<1
1.0
1.5
1.3
Las bacterias del género Staphylococcus y otras relacionadas que crecen en medio ABP,
también se observaron en bajas concentraciones, en un rango de <1 a 4.2 Log UFC/g. Sin
embargo, la mayoría de las muestras presentaron más de 1 Log UFC/g, lo cual significa que
esta bacteria es común en los ostiones, aunque no se encuentre en altas concentraciones.
En la región de Santo Domingo se encontraron las cuentas más altas de bacterias con
potencial patógeno, específicamente en los ostiones de una granja ubicada en la localidad
de Las Botellas (Tabla 9).
30
Tabla 9. Análisis microbiológico de los ostiones (C. gigas) colectados en Santo
Domingo B.C.S. (Las Botellas).
Medio de
cultivo
Muestreo 3. Log UFC/g de OSTIONES
Ostión O21 022 O23 O24 O25 O26 O27 O28 O29 030 O31 O32 O33
AM
3.3
6.6
6.0
4.6
6.9
5.5
4.2
5.1
5.5
5.2
5.5
5.2
4.9
TCBS
4.6
3.5
3.8
3.1
3.55
2.8
2.9
1.9
3.9
3.3
3.4
4.0
3.0
APD
ND
ND
1.0
1.7
ND
3.6
1.0
ND
1.3
ND
ND
ND
ND
ABP
1.3
2.6
2.0
1.3
1.8
3.5
4.2
ND
1.7
1.3
ND
3.0
ND
ND. No Determinado
De acuerdo con los resultados del análisis microbiológico, en general los ostiones
analizados tienen bajas concentraciones de hongos y levaduras (detectables en medio
APD); se observaron en un rango de <1 a 3.8 Log UFC/g, sin embargo la mayoría presento
<1 Log UFC/g (Tabla 7, 8 y 9). Estos resultados confirman que estos microorganismos
eucariontes no son predominantes en los ostiones.
A pesar de las diferencias que se observaron en el log de UFC en los diferentes muestreos,
al hacer el análisis estadístico del log UFC en Agar marino de los tres muestreos, se
observó que no hubo diferencia significativa, ya que p es mayor que α= 0.05.
Tabla 10. ANOVA del log UFC en Agar Marino de los tres muestreos de ostiones
SS Degr. of MS F p
Intercept 779.3314 1 779.3314 396.3181 0.000000
Numero de Muestreo 11.7057 2 5.8529 2.9764 0.066724
31
Error 57.0264 29 1.9664
Sin embargo, en el análisis estadístico del log UFC de bacterias crecidas en Agar TCBS, se
observó que hubo diferencias significativas entre los tres muestresos y la prueba de Tukkey
confirmó que en el muestreo 2 presentó diferente log de UFC que los muestreos 1 y 3.
Tabla 11. ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos de ostiones
SS Degr. of MS F p
Intercept 161.8111 1 161.8111 122.2543 0.000000
Numero de Muestreo 27.7298 2 13.8649 10.4754 0.000377
Error 38.3833 29 1.3236
Tabla 12. Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1, 2 y 3
Con respecto al análisis estadístico realizado para el log UFC en Agar Papa Dextrosa, se
observó que tampoco hubo diferencias significativas, Tabla 13.
Tabla 13. ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2 y 3
En el análisis estadístico del log de UFC en Agar Baird Parker si hubo diferencias
significativas entre los diferentes muestreos de ostiones, como se muestra en la Tabla 14.
La Prueba de Tukkey confirmó que el muestreo 3 fue diferente a los muestreos 1 y 2. En la
Numero de MuestreoUnidades Logaritmicas 1 2
2 2 1.000000 ****
1 1 2.518182 ****
3 3 3.365385 ****
SS Degr. of MS F p
Intercept 19.22855 1 19.22855 12.38116 0.002040
Numero de Muestreo 7.66556 2 3.83278 2.46791 0.108982
Error 32.61402 21 1.55305
32
gráfica de medias en Anexo 3, se observó que el log de UFC de Staphyilococcus fue mayor
que en el 1 y 2.
Tabla 14. ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2 y 3
Tabla 15. Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos
7.2. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE BACTERIAS.
El aislamiento de bacterias con potencial patógeno se hizo resembrando colonias de las
cajas de petri sembradas con las diluciones más altas durante las cuentas viables. El mayor
número de cepas aisladas se obtuvieron de cajas Petri con Agar Marino debido a que en
este medio se observó en lo general, mayor crecimiento bacteriano. A partir de cajas Petri
con agar TCBS, un medio de cultivo selectivo para vibrios, se aislaron un mayor número de
cepas, lo cual es congruente tomando en cuenta que el Género Vibrio tiene varias especies
reportadas en la bibliografía como patógenas para moluscos. procedentes de cajas Petri con
Agar Baird Parker se aislaron 15 cepas de colonias con características morfológicas típicas.
El material biológico resultante del primer muestreo se sembró también en Caldo Selenito
Cistina y en Agar XLD, de donde se aislaron 5 cepas de enterobacterias, Tabla 16.
Tabla 16. Tipo y número de microorganismos con potencial patógeno, aislados en
diferentes medios de cultivo selectivos.
SS Degr. of MS F p
Intercept 51.09740 1 51.09740 42.91428 0.000001
Numero de Muestreo 12.93529 2 6.46764 5.43187 0.010687
Error 30.95782 26 1.19069
Numero de MuestreoUnidades Logaritmicas 1 2
2 2 0.675000 ****
1 1 1.072727 ****
3 3 2.270000 ****
33
MEDIO DE CULTIVO No. DE CEPAS AISLADAS TIPO DE MICROORGANISMOS
AGAR MARINO 35 Mesófilos aerobios
AGAR BAIRD PARKER 15 Staphylococcus
AGAR PAPA DEXTROSA 2 Hongos y levaduras
AGAR TCBS 23 Vibrio
CALDO SELENITO
CISTINA/AXLD
5 Enter.obacterias, ej Salmonella
7.3 CARACTERIZACIÓN DE CEPAS AISLADAS DE OSTIONES.
Las cepas aisladas fueron sometidas a diferentes pruebas bioquímicas y microscópicas, con
el propósito de caracterizarlas. Como se puede observar en la Tabla 17, de 34 cepas 17
fueron Gram+ y 17 Gram-, 18 fueron bacilos y 16 cocos.
Tabla 17. Caracterización de cepas con potencial patógeno aisladas de ostiones.
CEPA Medio
de
Cultivo
Tinción
Gram
Prueba
Catalasa
Morfología
cellular
Origen
O1 ABP + + Coco C. gigas
O2 ABP + + Coco C. gigas
O3 ABP - + Bacilo C. gigas
O4 ABP + + Coco C. gigas
O5 ABP + + Coco C. gigas
O6 ABP - + Bacilo C. gigas
O7 XLD - - Coco C. gigas
O8 XLD - - Bacilo C. gigas
O9 XLD - + Bacilo C. gigas
O10 XLD - + Coco C. gigas
34
O11 XLD + - Coco C. gigas
O12 AM - + Coco C. gigas
O13 AM - + Bacilo C. gigas
O14 AM + + Coco C. gigas
O15 AM + + Coco C. gigas
O16 AM + - Coco C. gigas
O17 AM + - Bacilo C. gigas
O18 AM + + Bacilo C. gigas
O19 AM - + Bacilo C. gigas
O20 AM - + Bacilo C. gigas
O21 TCBS - + Bacilo C. gigas
O22 TCBS - + Bacilo C. gigas
O23 TCBS - + Bacilo C. gigas
O24 TCBS - - Bacilo C. gigas
O25 TCBS - + Bacilo C. gigas
O62 TCBS - - Cocos C. sikamea
O65 TCBS - + Bacilo C. sikamea
O26 AM - + Coco C. gigas
O27 AM - + Coco C. palmula.
O28 AM + + Bacilo C. gigas
O29 AM + + Bacilo C. palmula
O30 AM + + Coco C. gigas
O31 AM + + Coco C.gigas
O72 AM - + Bacilo C. corteziensis.
7.4 ENSAYO DE ADHESIÓN
35
El factor más significativo que afecta los cultivos de importancia acuícola es la incidencia
de patologías microbianas, principalmente de origen bacteriano. La adhesión bacteriana a
superficies y a tejidos es el paso inicial esencial en la colonización del tejido del hospedero
y subsecuente ocurrencia de infección en sistemas patogénicos (Montgomery et al., 1994),
involucrando diferentes estructuras llamadas adhesinas (Hacker 1992 y Hoepelman et al.,
1992). Se ha reportado que la capa de moco está involucrada en la prevención de la
colonización microbiana de patógenos por un mecanismo de competición con la microbiota
presente en el moco (Westerdahl et al., 1991). Sin embargo el papel que juega el moco en
moluscos como la primera capa involucrada en la adhesión microbiana o como un
mecanismo de defensa en contra de la invasión por patógenos no ha sido completamente
elucidado. Los resultados del ensayo de adhesión realizado usando el método de dot blot de
las bacterias con potencial patógeno a estracto crudo de moco de ostión marcado
enzimáticamente, se muestra en la Tabla 18, donde se observan las características de
adhesión cualitativa a extracto crudo de moco de ostión de cepas con potencial patógeno
aisladas de ostiones. Las figuras del ensayo de adhesión se encuentran en el anexo 1.
Tabla 18.- Características de adhesión de las cepas aisladas de ostiones en diferentes
medios de cultivo.
Medio CEPA ADH
1 ABP O1 +
2 ABP O2 -
3 ABP O3 +
4 ABP O4 +
5 ABP O5 +
6 ABP O6 +
7 AXLD O7 +
8 AXLD O8 +
9 AXLD O9 +
10 AXLD O10 -
11 AXLD O11 +
12 AM O12 +
13 AM O13 +
14 AM O14 +
15 AM O15 -
16 AM O16 -
17 AM O17 -
18 AM O18 +
19 AM O19 +
20 AM 020 -
21 TCBS O21 -
22 TCBS O22 -
23 TCBS O23 -
24 TCBS O24 +
25 TCBS O25 -
36
26 TCBS O25-A -
27 APD O26 -
28 TCBS O27 +
29 ABP O28 +
30 AM O29 +
31 AM O30 -
32 AM O31 -
33 AM 032 +
34 ABP O33 -
35 APD O34 -
36 ABP O35 -
37 AM O36 -
38 AM O37 -
39 AM O38 -
40 ABP O39 -
41 ABP O40 -
42 TCBS O41 -
43 ABP O42 -
44 AM O43 -
45 AM O44 -
46 AM O45 -
47 AM O46 -
48 AM O48 -
49 TCBS O49 -
50 AM O50 -
51 AM O51 -
52 AM O52 -
53 AM O53 -
54 TCBS O54 -
55 ABP O55 -
56 AM O56 -
57 TCBS O57 -
58 ABP O58 -
59 AM O59 -
60 TCBS O60 -
61 ABP 061 -
62 TCBS O62 +
63 TCBS O63 -
64 AM O64 -
65 TCBS O65 +
66 AM O66 -
67 TCBS O67 -
68 AM 068 -
69 TCBS O69 +
70 AM O70 -
71 AM O71 -
72 AM O72 +
73 TCBS O73 -
74 TCBS O74 -
75 AM O75 -
76 AM O76 -
77 TCBS O77 -
78 TCBS O78 -
79 TCBS O79 -
80 AM 080 -
Como puede observarse en esta Tabla 19, el 30% de las cepas aisladas en los diferentes
medios de cultivo presentaron la capacidad de adherirse más fuertemente a moco de ostión
que las demás, De las 15 cepas que se aislaron en ABP, el 47% tuvieron una adhesión
fuerte. De las 35 cepas aisladas en AM, el 23% se adhirieron más. De las 5 cepas aisladas
37
de AXLD el 80% se adhirieron fuerte y de las 23 cepas aisladas en ATCBS, solo el 22%
presentaron adhesión fuerte. Tomando en cuenta que la adhesión a moco intestinal es un
prerequisito para la colonización, las cepas con adhesión fuerte tienen la capacidad de
colonizar los ostiones y si son patógenas tendrán la capacidad de infectar.
7.5 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE BACTERIAS POTENCIALMENTE
PATÓGENAS.
Además de las pruebas anteriores realizadas a las cepas que más se adhirieron, se llevó a
cabo su identificación molecular. Las cepas seleccionadas para la identificación molecular se
observan en la Tabla 13, donde se observa la morfología y el medio de cultivo donde fue
aislada.
Tabla 19. Cepas con potencial patógeno aisladas de diferentes especies de ostión y
seleccionadas por su perfil de adhesión para identificarse molecularmente
No. Cepa Morfologia /Medio de cultivo
1 012 Cocos, diplococos, Agar Marino
2 018 Bacilos cortos móviles , Agar Marino
3 072 Bacilos cortos móviles, Agar Marino
4 01 Coco, diplococos Agar Baird Parker
5 03 Coco, diplococos Agar Baird Parker
6 06 Bacilos cortos móviles, Agar Baird Parker
7 024 Cocos y diplococos, Agar TCBS
8 062 Cocos y diplococos, Agar TCBS
9 065 Bacilos cortos y medianos, Agar TCBS
10 011 Coco, Agar XLD
38
La calidad del ADN genómico purificado se observó en un gel de agarosa al 1%, Figura 15.
En algunos carriles se observa mayor cantidad de ADN y en otro el ADN se observa un
poco degradado, sin embargo fue suficiente para llevar a cabo las reacciones de PCR.
Los productos de PCR también se corrieron en un gel de agarosa y se observan en la Figura
16, donde se observa una banda de alrededor de 1,500 pares de bases.
Los productos de PCR se enviaron a la empresa Macrogen para su limpieza y
secuenciación.
1000
pb
Figura 15. Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genómico de las cepas de ostión: Carril 1. Lambda
DNA, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011, 6. Cepa 012, 7. Cepa 024, 8. Cepa 062, 9. Cepa
065, 10. Cepa 018, 11. Cepa 072.
Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA y pH* y con ADN genómico de las
cepas: Carril 1. Marcador de peso molecular, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011, 6 . Cepa
024, 7. Cepa 062, 8. Cepa 065, 9. Cepa 018, 10. Cepa 072.
39
Las secuencias recibidas se editaron, se alinearon y las secuencias consenso resultantes se
compararon con las bases de secuencias de NCBI usando la herramienta BLASTn, donde se
encontró la mayoría de los géneros y especies de las bacterias en estudio Tabla 20. La
mayoría de estos géneros y especies de bacterias son consideradas como patógenos
oportunistas.
Tabla 20. Género y especie de las cepas con potencial patógeno aisladas de ostión y
seleccionadas por su capacidad de adherirse a moco de ostión.
Description Max
score
Total
score
Query
cover
E
value
Ident
Numero de
acceso a
NCBI
CEPA Morfología/Medio
cultivo/especie
Enterococcus sp. C213 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence
1126 1126 100% 0.0 100% FJ513910.1
O1
Coco
ABP
C.gigas
Escherichia coli strain FUA1242
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2583 2583 100% 0.0 99% HQ169124.1
O3
Coco-bacilo
ABP
C.gigas
Escherichia coli strain FUA1242
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2583 2583 100% 0.0 99% HQ169124.1 O6
Coco-bacilo
ABP
C.gigas
Enterococcus faecalis partial 16S
rRNA gene, strain ZG7-15 1202 1623 98% 0.0 99% HE646431.1 O11
Coco
XLD
C.gigas
Staphylococcus pasteuri strain 87
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2578 2578 99% 0.0 99% KF735653.1 012
Coco
AM
C.gigas
Escherichia coli strain FUA1242
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2634 2634 100% 0.0 99% HQ169124.1 018
Bacilo
AM
C.gigas
Bacterium PJ-38 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence 1146 1403 99% 0.0 98% KF146333.1 024
Bacilo
TCBS
C.gigas
Enterococcus faecium strain FMC59 2547 2547 100% 0.0 99% KF358453.1 O62 Coco
40
Description Max
score
Total
score
Query
cover
E
value
Ident
Numero de
acceso a
NCBI
CEPA Morfología/Medio
cultivo/especie
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
TCBS
C. sikamea
Enterobacter cloacae strain AB2
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2502 2942 99% 0.0 99% JX188069.1 O65
Bacilo
TCBS
C. sikamea
Escherichia coli PMV-1 main
chromosome, complete genome 1768 12349 100% 0.0 100% HG428755.1 O72
Bacilo
AM
C.corteziensis
Como se observa en la Tabla 20, se identificaron molecularmente 10 cepas bacterianas
predominantes en ostiones adultos de las costas de Baja California Sur, aisladas en
diferentes medios de cultivos de diferentes especies de ostiones, con una adhesión fuerte a
extracto crudo de moco de ostión y con una interacción antagónica determinada contra
cepas con potencial probiótico para ostiones. De acuerdo a la comparación en las bases de
datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov), las
cepas 01, 011 y 062 se identificaron como Enterococcus. la cepa 011 tuvo un porcentaje de
similitud de 99% con E. faecalis y la 062 con E. faecium. Las cepas 03, 06, 018 y 072, son
Escherichia coli. Las cepa 024 presentó un 98% de identidad con una bacteria identificada
en las bases de datos como Bacterium PJ-38. La cepa 012 tuvo un porcentaje de similitud
de 99% con Staphylococcus pasteuri, mientras que la cepa 065 tuvo un porcentaje de
similitud de 99% con Enterbacter cloacae.
41
8. DISCUSION
Todos los organismos están rodeados por microorganismos no peligrosos y peligrosos
(Virgin, 2007) y durante su co-evolución se han establecido interacciones recíprocas que
han dado lugar a la homeóstasis entre el hospedero y su microbiota comensal o patogénica.
Sin embargo otros microorganismos son oportunistas y pueden modificar su estatus
dependiendo de la capacidad inmune del hospedero, por lo que la homeostasis es dinámica.
En C. gigas han sido encontradas algunas especies de bacterias comensales, no solo en el
sistema digestivo, sino en la hemolinfa y en otros tejidos suaves, probablemente debido a
que se alimentan por filtración y a que su sistema circulatorio es abierto (Olafsen et al.,
1993; Colwell. 1960).
La respuesta inmune en ostreidos, es mediada por vía celular, en virtud de las propiedades
fagocíticas de los hemocitos y por medio de factores humorales, los cuales varían de
acuerdo a las diferentes especies bacterianas y cepas probadas, incluyendo algunas especies
relacionadas con la salud humana (Pruzzo et al., 2005). Se ha demostrado que bacterias de
origen fecal como Escherichia coli y Vibrio cholerae, fueron destruidos por fagocitosis en
hemolinfa de ostreidos, mientras que algunos patógenos de alimentos que producen una
cápsula externa de polisacáridos, como ciertas cepas de V. vulnificus, persistieron más
tiempo en la hemolinfa y fueron resistentes a la digestión en fagolisosomas (Pruzzo et
al.,2005).
E ostión Japonés o del Pacífico C. gigas, está expuesto a comunidades microbianas
abundantes y variables en su entorno lagunar y estuarino. Los ostreidos son habitados por
comunidades microbianas abundantes que varían con las condiciones ambientales y
coexisten con células inmunocompetentes de su sistema circulatorio. En algunas regiones
del mundo, la microbiota asociada a ostiones incluye cepas patógenas para los humanos, y
ha sido estudiada esencialmente para propósitos de bioseguridad e inocuidad en alimentos.
Aunque las comunidades microbianas asociadas a ostiones sanos ha sido poco estudiada, se
sabe que es abundante y variable de acuerdo a las condiciones ambientales..
42
Parece ser que la respuesta antimicrobiana en C. gigas, controla a comensales y patógenos,
y se relaciona con las reacciones dependientes de oxígeno potente y de péptidos
antimicrobianos producidos a baja concentración por células epiteliales o por hemocitos
circulantes. Por ejemplo, en ostiones no enfermos, los hemocitos expresan niveles basales
de defensinas y péptidos ricos en prolina. Sin embargo, cuando la carga microbiana se
incrementa dramáticamente en los tejidos del ostión enfermo, son llevadas por los
hemocitos a los sitios de infección, junto con proteínas que incrementan la permeabilidad
bactericida y grandes defensinas con formas específicas, cuya expresión en hemocitos es
inducida por la infección (Schmitt et al., 2012).
Durante el desarrollo de la presente investigación, se aisló, se caracterizó y se identificó
molecularmente la microbiota con potencial patógeno cultivable y predominante en adultos
de C. gigas, C. corteziensis, C. sikamea y S. palmula, colectados en diferentes localidades
de la costa Pacífico de Baja California Sur. Los resultados mostraron una comunidad
microbiana abundante cuando se cuantificó en agar marino y su abundancia estuvo
relacionada con el lugar de colecta, ya que el log UFC/g encontrado en los ostiones de un
mismo sitio de muestreo fue similar. Sin embargo no se observó diferencia en abundancia
con respecto a la especie de ostión analizada tal como previamente se mostró en las tablas
6, 7 y 8.
Con respecto al análisis en medios de cultivos selectivos, se observó que en Agar TCBS,
que es selectivo para especies del Genero Vibrio, las cuentas fueron bajas, excepto en el
muestreo 3 donde se observaron cuentas arriba de 4 ordenes logarítmicos de UFC/g de
organismo. Estos resultados coinciden con lo reportado por Pruzzo, et al., (2005), quien
menciona que las especies de Vibrio son muy abundantes en las aguas costeras, que son
comúnmente aisladas del tejido de bivalvos para consumo, que pueden persistirahí después
del proceso de depuración en aguas controladas. Este mismo autor comenta que Vibrio es
un componente regular de la microbiota de bivalvos y que los moluscos pueden representar
un nicho ecológico importante para esta bacteria.
43
Para cuantificar la presencia del género Staphylococcus en la microbiota de los ostiones, se
hicieron cuentas viables en agar Baird Parker (ABP), encontrando cuentas bajas, excepto en
el muestreo 3, donde se contaron hasta 4 órdenes logarítmicos de UFC. Otros
investigadores encontraron que este género de bacterias está presente en aguas marinas a la
misma frecuencia que coliformes y enterococos fecales (Gunnt et al., 1983).
También se cuantificó la presencia de hongos y levaduras en Agar Papa Dextrosa,
encontrado muy pocas colonias, lo cual sugiere que no son predominantes en la microbiota
cultivable de estos ostiones. Un reporte reciente ha mostrado la composición taxonómica de
los hongos asociados con C. gigas, incluyendo 22 especies de hongos filamentosos, de los
cuales 17 especies fueron identificadas como pertenecientes a 6 géneros: Alternaria,
Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Penicillium, and Trichoderma (Borzykh y Zvereva, 2012).
Las cepas predominantes en cada medio de cultivo se aislaron y se purificaron (Tabla 9),
que en total fueron 80 y fueron sometidas a un ensayo de adhesión a extracto crudo de
moco de ostión previamente marcado enzimáticamente con la enzima HRP.
Se ha reportado que la colonización del sistema digestivo de ostreidos por bacterias, tiene
una dependencia particular del ambiente externo debido al flujo de agua que pasa a través
del tracto digestivo (Harris 1993, Prieur 1990) y se ha considerado que las condiciones
ambientales y la variación estacional alteran la comunidad bacteriana del sistema digestivo
en algunos invertebrados acuáticos y que es probable que el hábitat pueda influir las
condiciones en el tracto digestivo y pueda por lo tanto ser un factor importante en la
composición de la microbiota del mismo.
En el presente estudio, se encontró que el 30% de las cepas probadas se adhiere al moco de
ostión y tiene la capacidad de colonizar al ostión, por lo que se asume que pueden
permanecer en el organismo independientemente de las condiciones ambientales (Tablas
17, 18 y 19).
Hay pocos estudios sobre los cambios de la microbiota bajo diferentes condiciones
ambientales. LaValley et al., (2009) reportó diferencias significativas en los perfiles de la
44
comunidad microbiana asociada a ostreidos y a agua de mar, indicando un grupo diverso de
bacterias especializadas que habitan y son capaces de proliferar dentro de los ostreidos. Sin
embargo no se encontraron reportes donde se haya estudiado la adhesión de la bacteria a las
superficies mucosas del ostión, como un mecanismo de colonización de la microbiota
comensal y la infección de patógenos. En diferentes modelos animales se ha comprobado
que las mucosas de los organismos actúan como una barrera en contra de invasores
microbianos, donde las bacterias invasoras foráneas y las comensales interactúan
íntimamente con el epitelio y ejercen cierta influencia sobre los sistemas inmune y celular
del hospedador. Así mismo, la barrera epitelial sirve como una posición segura que provee
una base para un avance adicional de muchas bacterias patógenas y como una puerta de
entrada para que los patógenos se diseminen hacia los tejidos más profundos. Por ejemplo,
los patógenos bacterianos entéricos pueden eficientemente infectar la mucosa
gastrointestinal del hospedero, usando mecanismos de virulencia altamente sofisticados que
les permiten sobrepasar las barreras de defensa del tracto gastrointestinal (Ashida, 2011).
Por otro lado, en muchos procesos fisiológicos de invertebrados, el moco tiene varias
funciones y también tiene influencia en la estructura de la comunidad y del ecosistema. El
moco de moluscos contiene principalmente agua y otros componentes como proteínas,
carbohidratos y lípidos. El moco funcional esta probablemente formado por una mezcla de
mucinas producidas por diferentes tipos de glándulas secretoras (Davies y Hawkins, 1998).
El moco hidratado es un sólido visco-elástico, capaz de funcionar como una cubierta
eficiente, pero se va haciendo líquido conforme el estrés se incrementa y retorna al estado
sólido una vez que el estado de estrés se elimina o es reducido de manera importante. El
moco juega un papel importante en la alimentación de los bivalvos que se alimentan por
filtración, ya que ayuda al atrapamiento y transporte de las partículas alimenticiasde las
branquias a la boca y es también utilizado para limpiar la cavidad del manto del exceso de
partículas que son rechazadas por los palpos labiales. La secreción abundante de moco
epitelial es usada para aislar moluscos de su ambiente, pudiendo servir además como un
ionoregulador. El moco de moluscos marinos puede contener aglutininas, lisozyma y otros
45
productos específicos de defensa tales como venenos producidos por el animal, y sustancias
que resultan desagradables o irritantes para sus enemigos o depredadores (Davies y
Hawkins, 1998).
Durante el ensayo de adhesión a extractos crudos de moco de ostión realizado en la
presente investigación, se observó que solo el 30% de las cepas ensayadas se adhieren, lo
cual sugiere que tienen la capacidad de colonizar in-vivo el tracto digestivo y demás tejidos
mucosales del ostión.
De las cepas más abundantes, que presentaron mayor adhesión, que fueron aisladas en los
diferentes medios de cultivos selectivos y que en estudios previos habían sido sometidas a
ensayos de interacción antagónica con cepas probióticas (Savin-Amador, 2013), se
seleccionaron 10 con el propósito de identificarlas molecularmente. Como se mostró
previamente en la tabla 20, 3 de estas cepas se aislaron en Agar Baird Parker, 1 en XLD, 3
en Agar marino y 3 en TCBS. Estos medios son selectivos para Staphylococcus,
Enterobacterias, Bacterias heterótrofas del ambiente marino y Vibrio spp respectivamente.
Sin embargo al analizar las secuencias de los genes 16S amplificados, encontramos que el
género y especie de estas bacterias no corresponden a los géneros que debieran crecer en
estos medios. Esto pudo deberse a que estas especies estaban presentes en mayor
abundancia y a que no fueron afectadas por los agentes selectivos que contiene cada medio
de cultivo.
La cepa 01 presentó un 100% de identidad con Enterococcus sp. C213. La cepa 011
presentó un 99% de identidad con Enterococcus faecalis (partial strain ZG7-15) y la cepa
062 también un 99% de identidad con Enterococcus faecium (strain FMC59). El género
Enterococcus es caracterizado por cocos solos, en pares o en cadenas, Gram positivos y
catalasa negativos. Las especies pertenecientes a este género han sido primeramente
asociadas con la microbiota indígena del tracto gastrointestinal de animales y humanos y
están ampliamente distribuidas en el aire, agua, suelo, vegetación (Lukasova y Sustackova,
2003). A pesar de que ciertos enterococos ha sido asociados a infecciones nosocomiales
(Murray, 1998), una gran variedad de estas cepas están siendo usadas como probióticos
46
para humanos, e incluso han sido incluidas en alimentos animales argumentando su
contribución a la salud de animales de granja y como agentes de control biológico en
acuacultura (Calo-Mata et al., 2007).
Se sabe que los enterococos son naturalmente resistentes a la mayoría de los antibióticos
usados en la práctica clínica, que adquieren fácilmente dicha resistencia y que tienen la
habilidad de dispersar genes de resistencia a otras especies (Kuhn et al., 2000). Algunas
cepas resistentes a multidrogas y vancomicina son aislados comúnmente de fuentes
animales, humanas, hábitats acuáticos y productos de la agricultura, lo cual indica su
habilidad para entrar en la cadena alimenticia humana (Rice et al., 1995). Estas bacterias
son resistentes en forma natural a cefalosporinas, aminoglicosidos y clindamicina, pueden
también ser resistentes a tetraciclinas y eritromicina y poco sensibles a penicilina,
ampicilina y glicopéptidos. Las cepas que producen β-lactamasa son raras y las cepas
resistentes a Vancomicina (VRE) están emergiendo como un problema global de salud
pública. La resistencia a antibióticos extremadamente alta observada en este género de
bacterias ha hecho que se les tema como agentes infecciosos en salas de cuidado intensivo,
ya que se han descrito probables factores de patogenicidad como hemolisinas (Rice et al.,
1995).
Las especies de enterococos más importantes son E. faecalis y E. faecium; La primera es
más común en enfermedades humanas, la segunda puede poseer mecanismos de resistencia
superiores (Huycke et al., 1998). E. faecalis ha sido reportada como responsable de la
transferencia de plásmidos que llevan características de resistencia a antibióticos a otros
enterococos y a Listeria monocytogenes en plantas de tratamiento de agua (Marcinek et al.,
1998). E. faecalis tiene transposones conjugativos que pueden ser transferidos de bacterias
animales a humanas. Tales transposones pueden también transferir resistencia a
vancomicina a Staphylococcus aureus, estreptococos y lactobacilos. En ambas especies, el
desarrollo evolutivo de resistencia ha sido atribuido a que tiene un rango amplio de
hospederos y elementos genéticos extremadamente móviles como son los transposones y
los plasmidos. Por lo tanto la resistencia a antibióticos, principalmente a vancomicina, y la
47
presencia de hemolisinas, deben ser evaluadas antes de utilizar estas especies como
probióticos o aditivos ((Marcinek et al., 1998).
El espectro antimicrobiano observado para las especies de enterococos, incluye varios
géneros de bacterias contaminantes y patógenas Gram positivas y Gram negativas. Algunas
cepas de origen marino producen sustancias inhibitorias contra patógenos en los sistemas
acuícolas (Chahad et al., 2007) Y su uso para inhibir patógenos ha ganado importancia en
granjas de peces como una manera más efectiva que administrar antibióticos para mantener
la salud de los organismos (Vijayan et al., 2006). Recientemente fueron secuenciados los
genomas de 51 cepas de Enterococcus aisladas de varios ambientes ecológicos, para
entender cómo es que E. faecium emergió como un patógeno de hospitales, y debido a la
diversidad de las cepas estudiadas, se propuso que se midieran las distancias evolutivas
entre grupos, del linaje responsable de infecciones humanas, resistente a multidrogas y de
epidemias(Lebreton et al., 2013).
Por lo anteriormente expuesto, se consideran indispensables estudios adicionales de las
cepas del género Enterococcus aisladas de ostión, para conocer con mas detalle y precisión
el grado de patogenicidad o de beneficio para el cultivo de estos organismos.
La cepas 03, 06 y 018, presentaron un 99% de identidad con Escherichia coli (cepa
FUA1242) y la cepa 072 presentó un 100% de identidad con E. coli (cepa PMV-1).E. coli
es una bacteria comensal cuyo nicho es la cubierta de mucosa del colon de mamíferos y es
el bacilo anaerobio o facultativo más abundante en la microbiota intestinal humana (Kipper,
et al., 2004), Así mismo, E. coli está ampliamente distribuida en el tracto intestinal de
animales de sangre caliente (Ishii y Sadowsky, 2008); es a menudo no patogénica, aunque
diferentes cepas pueden causar enfermedades en los sistemas digestivo, urinario o nervioso
central (Nataro, 1998). Se conocen comúnmente seis categorías de E. coli que producen
diarreaenterotoxigenica (ETEC) (Dalton et al., 1999), enteropatogénica (EPEC) (Ruchaud-
Sparagano, 2007), enteroinvasiva (EIEC) (Levine, 1987), enterohemorrágica (EHEC),
productora de la toxina shiga (STEC) (Takeda, 2011), enteroagregativa (EAEC ó EAggEc)
(Beauchamp y Sofos, 2010) y difusivamente adherente (DAEC) (Scaletsky et al., 2002).
48
Existe gran diversidad filogenética dentro de cada patotipo y los miembros de cada uno son
derivados de los grupos filogenéticos A, B1 o D o de otros linajes misceláneos.
También son comunes las infecciones extraintestinales debido a E. coli y pueden involucrar
casi cualquier órgano o sitio anatómico. Las típicas infecciones extraintestinales incluyen
las del tracto urinario, meningitis, intraabdominal, pneumonia, en dispositivos
intravasculares, osteomielitis e infección en tejido suave, lo cual ocurre comúnmente
cuando el tejido es comprometido (Russo y Johnson, 2000).
La alta similitud de las cepas 03, 06 y 018 con la cepa de E. coli FUA1242, la cual ha sido
reportada como EHEC (yoo et al., 2012), sugiere que los aislados obtenidos del ostión
podrían pertenecer a esta categoría (EHEC). Sin embargo, se requiere analizar los
diferentes factores de virulencia típicos de este grupo para confirmarlo. La cepa cepa
O157:H7 enterohemorrágica de E. coli fue reportada en camarones en la India (Surendraraj
et al., 2010) y a pesar de no ser muy común el aislamiento de E. coli que produce diarrea de
mariscos, E. coli STEC ha sido reportada en pescado y almejas en el mercado Indú y fue
más común que el serotipo O157 (Kumar et al., 2001). En Brasil, se aisló una cepa de
STEC de moluscos y se evidenció que las medidas preventivas, especialmente durante la
cosecha y postcosecha, son muy importantes para evitar contaminación de cualquier
naturaleza (Ayulo et al., 1994). La ocurrencia de E. coli en mariscos ha sido estudiada en
diferentes partes del mundo (Baer et al., 1976; Hood et al., 1983; Watkinson et al., 2007;
Teophilo et al., 2002). Se ha sugerido que los moluscos colectados en ambientes costeros
pueden ser vehículos de transmisión de E. coli productora de toxina Shiga ya que se
aislaron cepas ETEC stx1d en muestras de moluscos incluyendo C. gigas en Francia
(Gourmelon et al., 2006). En un análisis de los moluscos bivalvos de nueve estados de
Estados Unidos, se reportó que los más altos niveles promedio de E. coli, fueron
encontrados en ostiones de la región del Golfo de México durante el verano (De Paola et
al., 2010).
La cepa 072 presentó un 100% de identidad con E. coli cepa PMV-1, que pertenece al
serotipo O18:K1 y e al grupo de E. coli patógena extraintestinal (ExPEC). Un amplio rango
49
de infecciones extraintestinales en humanos y animales vertebrados son causadas por cepas
de E. coli que pertenecen a este gran grupo ExPEC y son categorizadas frecuentemente en
patotipos de acuerdo a los síntomas clínicos de los hospederos. Los patotipos incluyen E.
coli uropatogénica (UPEC), aislada de humanos y animales con infecciones del tracto
urinario, E. coli de meningitis neonatal (NMEC), aislada de neonatos humanos, E. coli
septicémica, aislada de humanos y animales con casos de septicemia de varios orígenes y E.
coli patógena para aves (APEC), responsable de colibacilosis en aves. Las cepas APEC de
serotipos O1:K1, O2:K1 y O18:KI pertenecen al mismo grupo clonal altamente patogénico,
como las cepas de E. coli humanas de los mismos serotipos aisladas de casos de meningitis
neonatal, infecciones del tracto urinario y septicemia. Estas cepas APEC constituyen un
riesgo zoonótico potencial (Moulin-Schouleur et al., 2007). La cepa de E. coli PMV-1 ha
sido propuesta como un modelo para estudiar las interacciones patógeno hospedero, debido
a que ha sido probado que es altamente virulenta después de ser administrada
peritonealmente en ratones modelo (van Westerloo et al., 2005). El genoma completo de
esta cepa fue secuenciado con una cobertura de 40 de profundidad usando
pirosecuenciación (Peris-Bondia et al., 2013). Esta cepa ha sido identificada como causante
de peritonitis y permanece como uno de los patógenos más comunes (arriba de 60%) en
infecciones intraperitoneales.La peritonitis continúa siendo una de las emergencias
abdominales que causa mayores tasas de mortalidad y morbilidad, por arriba del 38%
(Sewnath et al., 2001). No se encontraron reportes previos de este patotipo ExPEC de E.
coli en moluscos.
La cepa 012 tuvo también un 99% de similitud con la cepa Staphylococcus pasteuri (strain
87), que es una bacteria Gram positiva, coagulasa negativa, que está emergiendo como
agente de infecciones nosocomiales y un contaminante derivativo de sangre, aunque su
papel como causante de enfermedades humanas sigue siendo controversial. A pesar de la
pequeña cantidad de aislamientos recuperados, esta bacteria, recientemente, parece expresar
resistencia a algunas clases de compuestos antibióticos, tales como methicillin/osacillin,
macrolides, lincosamides, streptogramins, tetraciclinas y cloranfenicol, streptomicina,
fosfomicina, asi como compuestos de amonio cuaternario (Savini et al., 2009). Se ha
50
reportado que los estafilococos están presentes en aguas marinas a una mayor frecuencia
que los coliformes y los estreptococos (Gunnt y Colwell, 1983). En particular, S. pasteuri
ha sido aislado e identificado a partir de micro capas superficiales del mar (Agogué et al.,
2005), del intestino de salmón del Atlántico alimentado con una dieta suplementada con 5%
de quitina, y recientemente fue encontrado asociado a anemonas (Zongjun et al., 2010). Sin
embargo no se encontraron reportes previos asociados a moluscos bivalvos.
La cepa 065 presentó también un 99% de similitud con Enterobacter cloacae (strain AB2).
Las especies del complejo Enterobacter cloacae están ampliamente dispersas en la
naturaleza, a pesar de que pueden actuar como patógenos. Los estudios bioquímicos y
moleculares en este complejo han mostrado heterogeneidad genómica y comprenden 6
especies: Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei,
Enterobacter kobei, Enterobacter ludwigii y Enterobacter nimipressuralis. E. cloacae y E.
hormaechei, que son los más frecuentemente aislados de especímenes clínicos de humanos.
La identificación fenotípica de todas las especies pertenecientes a este taxón es usualmente
difícil y no siempre confiable, por lo tanto, los métodos moléculares son usados más
frecuentemente. Aunque el complejo de cepas de E. cloacae está entre los Enterobacter spp
más comunes que causan infecciones nosocomiales del torrente sanguíneo en las últimas
décadas, se sabe poco de sus propiedades asociadas a virulencia. En contraste, existen
muchos reportes publicados sobre las características de resistencia a antibióticos de estas
bacterias, que son capaces de sobreproducir AmpC β-lactamasas por represión de un gen
cromosomal, o por la adquisición de un gen ampC transferible en plásmidos que le confiere
resistencia a diversos antibióticos. Muchas otras determinantes de resistencia que son
capaces de hacer inefectivas casi todas las familias de antibióticos han sido recientemente
adquiridas. La mayoría de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana están enfocados en
E. cloacae, E. hormaechei y E. asburiae. Estos estudios reportaron pequeñas variaciones
entre las especies y la única diferencia significativa no tuvo características discriminantes
(Mezzatesta et al., 2012). En un estudio de la microbiota y metales pesados en ostiones
cultivados (Crassostrea iredalei) en Setiu Wetland, Terengganu, en la Costa Este de
Malaysia, se observó que los ostiones contienen predominantemente la especie Shewanella
51
putrifaciens seguida por Vibrio parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, Enterobacter
cloacae, Escherichia coli y Chromobacterium violaceum (Najiah, 2008). En un estudio
realizado en ostión de mangle Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828), se evaluó la
calidad microbiológica de organismos procedentes de tres estaciones del banco natural
Laguna Grande del Obispo, estado Sucre, Venezuela, Las enterobacterias más abundantes y
frecuentes en C. rhizophorae fueron Escherichia coli (34%), Proteus mirabilis (12%) y
Enterobacter cloacae (12%) (Gonzalez et al., 2011).
52
9. CONCLUSIÓN
Los microorganismos predominantes y con potencial patógeno y aislados y caracterizados
molecularmente, de adultos de Crassostrea gigas, C. corteziensis, C. sikamea y Saccostrea
palmula, colectados en diferentes localidades de la costa Pacífico de Baja California Sur,
tienen gran similitud con especies y cepas que han estado implicados en brotes de
enfermedades transmitidas por alimentos, que causan diferentes tipos de infecciones, lo
cual compromete la inocuidad de estos organismos cultivados. De acuerdo con los
resultados obtenidos, la prevalencia de estas bacterias en los ostiones, refleja un potencial
riesgo para la salud del consumidor. Sin embargo, para determinar si estas bacterias son
también patógenas para los ostiones en sus diferentes estadios de crecimiento, se requiere
desarrollar nuevas investigaciones y otros ensayos..
53
10. BIBLIOGRAFIA
Agogué, H., Joux,F., Obernosterer, I., y Lebaron, P. 2005, Resistance of Marine
Bacterioneuston to solar radiation. Appl. Environ. Microbiol. 71(9):5282. DOI:
10.1128/AEM.71.9.5282-5289.2005.
Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., y Sasakawa, C. 2011. Bacteria and host
interactions in the gut epithelial barrier. Nature chemical biology. doi:
10.1038/nchembio.741
Avilés, D. y Eusebio, M. 1991. Investigación de Salmonella en alimentos. Manual de
laboratorio de microbiología sanitaria. Editores; Amador, R. y Fernández, E. Instituto
Politécnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias biológicas. Departamento de
Microbiología. México. D.F. Cap. 11. Pp 126-140.
Ayulo, A.M., Machado, R.A. and Scussel, V.M. (1994) Enterotoxigenic Escherichia coli
and Staphylococcus aureus in fish and seafood from the southern region of Brazil.
International Journal of Food Microbiology, 24, 171-178. doi:10.1016/0168-
1605(94)90116-3
Asakura H, Watarai M, Shirahata T, Makino S. 2002. Viable but nonculturable Salmonella
species recovery and systemic infection in morphine treated mice. J Infect Dis. 186: 1526-
1529.
Baer, E.F., Duran, A.P., Leininger, H.V., Read Jr., R.B., Schwab, A.H. and Swartzentruber,
A. (1976) Microbiological quality of frozen breaded fish and shellfish products. Applied
and Environmental Microbiology, 31, 337-341.
Baer et al., 1976, Hood et al., 1983, Van et al., 2008, Wang et al., 2011
Beauchamp, C.S. and Sofos, J.N. (2010) Diarrheagenic Escherichia coli. In: Juneja, V.K.
and Sofos, J.N. Eds., Pathogens and Toxins in Foods, ASM Press, Washington DC, 71-94.
Borzykh, O. G., Zvereva, L.V. 2012. Mycobiota of the giant oyster Crassostrea gigas
(Thunberg, 1787) (Bivalvia) from the Peter the Great Bay of the Sea of Japan.
Microbiology. Volume 81, Issue 1, pp 109-111.
Calo-Mata, P.; Arlindo, S.; Boehm. K. ; De Miguel, T. Pascoal A. & Barros-Velazquez, J.
(2007). Current application and future trends of lactic acid bacteria and their bacteriocins
for biopreservation of aquatic food products. Food Bioprocess Technology, Vol.1(1), pp.43-
63
54
Cappelier J M, Magras C, Jouve J L, Federighi M. 1999. Recovery of viable but
nonculturable Campylobacter jejuni cells in two animal models. Food Microbiol. 16: 375–
383.
Caceres‑Martinez, J., Vasquez‑Yeomans, R., Padilla‑Lardizabal, G., and Portilla, M. A. R.
2008. Perkinsus marinus in pleasure oyster Crassostrea corteziensis from Nayarit, Pacific
coast of Mexico. Journal of Invertebrate Pathology, 99: 66–73.
Chahad Ouissal, B.; El Bour, M.; Mraouna, R.; Abdennaceur, H. & Boudabous, A. (2007).
Preliminary selection study of potential probiotic bacteria from aquacultural areas in
Tunisia. Annals of Microbiology, Vol.57 (2), pp.185-190
Colburn K G, Kaysner C A, Abeyta C, Wekell M M. 1990. Listeria species in a California
coast estuarine environment. Appl Environ Microbiol. 56: 2007–2011.
Colwell R R, Liston J. Microbiology of shellfish. Bacteriological study of the natural flora
of Pacific oysters (Crassostrea gigas). Appl Microbiol 1960;8: 104e9.
Colwell, R. R. 1983. Numerical Taxonomy of Staphylococci Isolated from the Marine
Environment. Int. Journal of Systematic Bacteriology. Vol 33, 4 p. 751-759.
Cruz, A.R. 1996. Evaluación general de la captura del ostión en las lagunas de Tamaulipas
de 1988 a 1994. Boletín Informativo. SEMARNAP/INP/CRIP. Tampico.
Dalton, C.B., Mintz, E.D., Wells, J.G., Bopp, C.A. and Tauxe, R.V. (1999) Outbreaks of
enterotoxigenic Escherichia coli infection in American adults: A clinical and epidemiologic
profile. Epidemiology and Infection, 123, 9-16. doi:10.1017/S0950268899002526
Davies,, M.S. y Hawkins, J. 1998. Mucus from Marine Molluscs. Advances in Marine
Biology. Volume 34, , Pages 1–71
De Paola, A., Jones, J.L., Woods, J., Burkhardt III, W., Calci, K.R., Krantz, J.A., Bowers,
J.C., Kasturi, K., Byars, R.H., Jacobs, E., Williams-Hill, D. and Nabe, K. (2010) Bacterial
and viral pathogens in live oysters: 2007 United States market survey. Applied and
Environmental Micro-biology, 76, 2754-2768. doi:10.1128/AEM.02590-09
Di Girolamo R, Liston J, Matches J. 1977. Ion bonding, the mechanism of viral uptake by
shellfish mucus. Appl Environ Microbiol. 33: 19-25.
Dumontet, S., Krovacek, K., Svenson, S.B., Pasquale,V., Baloda, S.B.,&Figliuolo, G.
(2000). Prevalence and diversity of Aeromonas and Vibrio spp. in coastal waters of
southern Italy. Comp Immunol, Microbiol Infect Dis. 23: 53–72.
55
Endtz H P, Vliegenthart J S, Vandamme P, Weverink H W, VandenBraak N P, Verbrugh H
A, vanBelkum A. 1997. Genotypic diversity of Campylobacter lari isolated from mussels
and oysters in The Netherlands. Int J Food Microbiol 34, 79–88.
Garnier M, Labreuche Y1, Garcia C, Robert M, Nicolas J-L. 2007. Evidence for the
Involvement of Pathogenic Bacteria in Summer Mortalities of the Pacific Oyster
Crassostrea gigas. Microbial Ecology. 53: 187-196.
González, M., Villalobos, L. B., Vásquez-Suárez, A., Graü, C. y Gil, H. 2011.
Enumeración de Aeróbios Mesófilos, Coliformes Fecales y Clostridium Perfringens en ia
Ostra Crassostrea rhizophorae Procedente de Laguna Grande del Obispo, Estado Sucre,
Venezuela. Revista Científica, FCV-LUZ/ Vol. XXI, No. 1, 80-87.
Gourmelon, M., Montet, M.P., Lozach, S., Le Mennec, C., Pommepuy, M., Beutin, L. and
Vernozy-Rozand, C. (2006) First isolation of Shiga toxin 1d producing Escherichia coli
variant strains in shellfish from coastal areas in France. Journal of Applied Microbiology,
100, 85-97. doi:10.1111/j.1365-2672.2005.02753.x
Grimes D J, Atwell R W, Brayton P R, Palmer L M, Rollins D M, Roszak D B, Singleton F
L, Tamplin M L, Colwell R R. 1986. The Fate of Enteric Pathogenic Bacteria in Estuarine
and Marine Environments. Microbiological Sciences. 3. 324–329.
Gunnt, B.A., y Colwell, R. R. 1983. Numerical Taxonomy of Staphylococci Isolated from
the Marine Environment. International Journal Of Systematic bacteriology, Col. 33 No. 4,
p.751-759
Hacker, J. 1992. Role of fimbrial adhesins in the pathogenesis of Escherichia coli
infections. Can. J. Microbiol. 38:720–727.
Harris JM (1993) The presence nature, and role of gut microflora in aquatic invertebrates: a
synthesis. Microb Ecol 25:195–231.
Helm M M, Bourne N, Lovatelli A. 2006. Cultivo de Bivalvos en Criadero. Un manual
Práctico. FAO Documento Técnico de Pesca. No. 471. Roma, Italia, FAO. 184 pp.
Hoepelman, A. I. M., and E. I. Tuomanen. 1992. Consequences of microbial attachment:
directing host cell functions with adhesins. Infect. Immun. 60: 1729–1733.
Hood, M.A., Ness, G.E. and Blake, N.J. (1983) Relationship among fecal coliforms,
Escherichia coli, and Salmonella spp. in shellfish. Applied and Environmental
Microbiology, 45, 122-126.
56
Huss H H. 1980. Distribution of Clostridium botulinum. Appl Environ Microbiol. 39: 764-
769.
Huycke, MM.; Sahm, DF. & Gilmore, MS. (1998). Multiple-drug resistant enterococci: the
nature of the problem and an agenda for the future. Emerging Infectious Diseases, Vol.4(2),
pp.239-249
Ishii, S. and Sadowsky, M.J. (2008) Escherichia coli in the environmental: Implications for
water quality and human health. Microbes and Environments, 23, 101-108.
doi:10.1264/jsme2.23.101
Jorquera M A, Silva F R, Riquelme C E. 2002. Bacteria in the culture of the scallop
Argopecten purpuratus (Lamarck, 1819). Aquaculture International. 9: 285–303
Kipper, J.B., Nataro, J.P. and Mobley, H.L.T. (2004) Pathogenic Escherichia coli. Nature
Reviews, 2, 123-140. doi:10.1038/nrmicro818
Kueh C, Chan K. 1985. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oysters. J
Appl Bacteriol. 59:41– 47.
Kuhn, I.; Iversen, A.; Burman, L.G.; Olsson-Liljequist, B.; Franklin, A.; Finn, M.;
Aarestrup, F.; Seyfarth, A.M.; Blanch, A.R., Taylor, H.; Caplin, J.; Moreno, M.A.;
Dominguez, L. & Mollby, R. (2000). Epidemiology and ecology of enterococci, with
special reference to antibiotic resistant strains, in animals, humans and the environment.
Kumar, H.S., Otta, S.K., Karunasagar, I. and Karunasagar, I. (2001) Detection of Shiga-
toxigenic Escherichia coli (STEC) in fresh seafood and meat marketed in Mangalore, India
by PCR. Letters in Applied Microbiology, 33, 334- 338. doi:10.1046/j.1472-
765X.2001.01007.x
Lafferty K D, Porter J W, Ford S E. 2004. Are diseases increasing in the ocean? Annu Rev
Ecol Evol Syst. 35:31–54.
LaValley KJ, Steve Jones LA, Gómez-Chiarri M, Dealteris J, Rice M (2009) Bacterial
community profiling of the eastern oyster (Crassostrea virginica): comparison of culture-
dependent and culture-independent outcomes. J Shellfish Res 28:827–835.
Gunnt, B. A. y Lebreton, F., van Schaik, W., Manson McGuire, A., Godfrey, P., Griggs, A.,
Mazumdar, V., Corander, J., Cheng, L., Saif, S., Young, S., Zeng, Q., Wortman, J., Birren,
B., Willems, Levine, M.M. (1987) Escherichia coli that cause diarrhea: Enterotoxigenic,
57
enteropathogenic, enteroinvasive, entero- hemorrhagic, and enteroadherent. The Journal of
Infec-tious Diseases, 155, 377-389. doi:10.1093/infdis/155.3.377
Lukàsova, J. & Sustàckovà, A. (2003). Enterococci and Antibiotic Resistance: Review
Article. Acta. Veterinaria Brno., Vol.72, pp.315-323
Macias Rodriguez, M.E., Zagorec, M., Ascencio, F., Rojas, M. 2008. Potential
probiotic Lactobacillus strains for piglets from an arid coast. Annals of
Microbiology. Vol 58 No. 4. P.641-648.
Marcinek, H.; Wirth, R.; Muscholl-Silberhorn, A. & Gauer, M. (1998). Enterococcus
faecalis gene transfer under natural conditions in municipal sewage water treatment plants.
Applied and Environmental Microbiology, Vol.64, pp.626-632
Martínez O C, Montoya Rodríguez J. 2003. Manual de Buenas Prácticas de Producción
Acuícola de Moluscos Bivalvos para la Inocuidad Alimentaria. Mazatlán, Sinaloa, México:
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Mazatlán en
Acuicultura y Manejo Ambiental y el Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria, SAGARPA., 2003.
Marvin, L. Speek. 1976. Compedium of methods for the microbiological examination of
foods. Impreso en the United States of America. Segunda impresión.
Mezzatesta, M. L., Gona, F., Stefani, S. 2012. Enterobacter cloacae complex: clinical
impact and emerging antibiotic resistance. Future Microbiol. 7(7):887-902. doi:
10.2217/fmb.12.61.
Montgomery, M. T., and D.L. Kirchman. 1994. Induction of chitin-binding proteins during
the specific attachment of the marine bacterium Vibrio harveyi to chitin. Appl. Environ.
Microbiol. 60:4284–4288.
Moriarty D.J.W. 1997. The role of microorganisms in aquaculture ponds. Aquaculture. 151:
333–349.
Moulin-Schouleur, M., Reperant, M., Laurent,S., Bree,A., Mignon-Grasteau, S., Germon,
P., Rasschaert, D., and Schouler, C. 2007. Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli
Strains of Avian and Human Origin: Link between Phylogenetic Relationships and
Common Virulence Patterns. Journal of Clinical Microbiology, Vol. 45, No. 10, p. 3366–
3376. doi:10.1128/JCM.00037-07
58
Murray, BE. (1998). Diversity among multidrug-resistant enterococci. Emerging Infectious
Diseases, Vol. 4, pp.37–47
Najiah, M, Nadirah, M, Lee, KL, Lee, SW, Wendy, W, Ruhil, HH, Nurul, FA. 2008.
Bacteria Flora and Heavy Metals In Cultivated Oysters Crassostrea Iredalei Of Setiu
Wetland, East Coast Peninsular Malaysia. Vet Res Commun. 32(5):377-81. doi:
10.1007/s11259-008-9045-y
Nataro, J.P. and Kaper, J.B. (1998) Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology
Reviews, 11, 142-201.
NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov)
Olafsen JA, Mikkelsen HV, Giæver HM, Høvik Hansen G. Indigenous bacteria in
hemolymph and tissues of marine bivalves at low temperatures. Appl Environ Microbiol
1993;59:1848e54.
Peris-Bondia F, Muraille E, Van Melderen L. 2013. Complete genome sequence of the
Escherichia coli PMV-1 strain, a model extraintestinal pathogenic E. coli strain used for
host-pathogen interaction studies. Genome Announc. 1(5):e00913-13.
doi:10.1128/genomeA.00913-13.
Prieur D, Mvel G, Nicolas J-L, Plusquellec A, Vigneulle M (1990) Interactions between
bivalve molluscs and bacteria in the marine environment. Oceanogr Mar Biol Annu Rev
28:277–352
Pruzzo C, Gallo G, Canesi L. Persistence of vibrios in marine bivalves: the role of
interactions with haemolymphcomponents. Environ Microbiol 2005;7:761e72.
R.J.L., Earl, A.M., Gilmorea, M.S. 2013. Emergence of Epidemic Multidrug-Resistant
Enterococcus faecium from Animal and Commensal Strains . mBio 4(4):
doi:10.1128/mBio.00534-13
Rippey S R. 1994. Infectious diseases associated with molluscan shellfish consumption.
Clin Microbiol Rev. 7:419–425.
Rojas, M. and Conway, P. L. 2001. A dot blot assay for adhesive components relative to
probiotics in Microbial Growth in biofilms. Methods in Enzimology. Edited by Ron J.
Doyle. Vol. 336. p.389-402
59
Romero J, Navarrete P. 2006. 16S rDNA-Based Analysis of Dominant Bacterial
Populations Associated with Early Life Stages of Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch).
Microb Ecol. 51:422–430.
Ruchaud-Sparagano, M.-H., Maresca, M. and Kenny, B. (2007) Enteropathogenic
Escherichia coli (EPEC) inactivate innate immune responses prior to compromising
epithelial barrier function. Cellular Microbiology, 9, 1909- 1921. doi:10.1111/j.1462-
5822.2007.00923.x
Russo, T. A., and J. R. Johnson. 2000. Proposal for a new inclusive designation for
extraintestinal pathogenic isolates of Escherichia coli: ExPEC. J. Infect. Dis. 181:1753–
1754.
Savini, V., Catavitello, C., Bianco, A., Balbinot, A., y D’Antonio, D.. 2009, Epidemiology,
Pathogenicity And Emerging Resistances In Staphylococcus Pasteuri: From Mammals And
Lampreys, To Man. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 4, 123-129
Scaletsky, I.C.A., Fabbricotti, S.H., Carvalho, R.L.B., Nunes, C.R., Maranhão, H.S.,
Morais, M.B. and Fagundes-Neto, U. (2002) Diffusely adherent Escherichia coli as a cause
of acute diarrhea in young children in Northeast Brazil: A case-control study. Journal of
Clinical Microbiology, 40, 645-648. doi:10.1128/JCM.40.2.645-648.2002
Schmitt. P. †, Rosa,R.D., Duperthuy, M,†, Lorgeril, J., Bachère, E. and Destoumieux-
Garzón, D. 2012. The antimicrobial defense of the Pacific oyster, Crassostrea gigas. How
diversity may compensate for scarcity in the regulation of resident/pathogenic microflora.
Frontiers in microbiology. doi: 10.3389/fmicb.2012.00160
Schulze A D, Alabi A O, Tattersall-Sheldrake A R, Miller K M. 2006. Bacterial diversity in
marine hatchery: Balance between pathogenic and potentially probiotic bacterial strains.
Aquaculture. 256: 50-73.
SEPESCA/INP. 1994. Cultivo de ostión americano. Secretaría de Pesca, México, D.F.
Sewnath, M.E., Olszyna, D:P:, Birjmohun, R., ten Kate, F.J.W., Gouma, D.J. y van der
Poll, T. 2001. IL-10-Deficient Mice Demonstrate Multiple Organ Failure and Increased
Mortality During Escherichia coli Peritonitis Despite an Accelerated Bacterial Clearance. J
Immunol. 166:6323-6331. doi: 10.4049/jimmunol.166.10.6323
60
Spite A R, Wilbur A E, Cary C. 2000. Bacterial Symbiont Transmission in the Wood-
Boring Shipworm Bankia setacea (Bivalvia: Teredinidae). Appl Environ Microbiol. 66.
1685-1691.
Surendraraj, A., Thampuran, N. and Joseph, T.C. (2010) Molecular screening, isolation,
and characterization of en- terohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 from retail shrimp.
Journal of Food Protection, 73, 97-103.
Takeda, Y. (2011) Vibrio parahaemolyticus, enterotoxigenic Escherichia coli,
enterohemorrhagic Escherichia coli and Vibrio choleare. Proceedings of the Japan
Academy, Series B, Physical and Biological Sciences, 87, 1- 12. doi:10.2183/pjab.87.1
Teophilo, G.N.D., Vieira, R.H.S.F., Rodrigues, D.P. and Menezes, F.G.R. (2002)
Escherichia coli isolated from seafood: Toxicity and plasmid profiles. International Mi-
crobiology, 5, 11-14. doi:10.1007/s10123-002-0052-5
Thompson J R, Marcelino L A, Polz M F. 2005. Diversity, Sources, and Detection of
Human Bacterial Pathogens in the Marine Environment. Oceans and Health: Pathogens in
the Marine Environment. Edited by Belkin and Colwell, Springer, New York. Cap.2, Pp:
29-68.
Trabal, N., Mazón-Suástegui J.M., Vázquez-Juárez R., Asencio-Valle, F., Enrique Morales-
Bojórquez E. y Romero, J. 2011. Molecular Analysis of Bacterial Microbiota Associated
with Oysters (Crassostrea gigas and Crassostrea corteziensis) in Different Growth Phases
at Two Cultivation Sites. Microb Ecol. 64:555–569 DOI 10.1007/s00248-012-0039-5
Van Westerloo, D.I., Giebelen, I.A.J., Florquin, S., Daalhuisen, J., Bruno, M.J., de Vos,
A.F., Tracey, K.J., van der Poll, T. 2005. The cholinergic anti-inflammatory pathway
regulates the host response during septic peritonitis. J Infect Dis. 191(12):2138-48
Virgin HWS. In vivo veritas: pathogenesis of infection as it actually happens. Nat Immunol
2007;8:1143.
Watkinson, A.J., Micalizzi, G.B., Graham, G.M., Bates, J.B. and Costanzo, S.D. (2007)
Antibiotic-resistant Escherichia coli in wastewaters, surface waters, and oysters from an
urban riverine system. Applied and Environ-mental Microbiology, 73, 5667-5670.
doi:10.1128/AEM.00763-07 .
61
Westerdahl, A., J. C. Olsson, S. Kjelleberg, and P. L. Conway. 1991. Isolation and
characterization of turbot (Scophtalmus maximus)-associated bacteria with inhibitory
effects against Vibrio anguillarum. Appl. Environ. Microbiol. 57:2223–2228.
Wittman R J, Flick G J. 1995. Microbial contamination of shellfish: Prevalence, Risk to
Human Health, and Control Strategies. Annu Rev Public Health. 16:123-40.
Yoo, S.J., Sun, Sunwoo1, S.Y., Seo, S., Hun Hyun, B.H., S. Lyoo, Y.S. 2012. Identification
of Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) isolated from wild pig feces in Korea. 22nd
INTERNATIONAL PIG VETERINARY SOCIETY CONGRESS.
Zongjun, D., Wanyi, Z., Hongjie, X., Guoqiang, L., Guanjun, C. 2010. Isolation and
diversity analysis of heterotrophic bacteria associated with sea anemones. Acta Oceanol.
Sin. Vol. 29, No. 2, P. 62-69. DOI: 10.1007/s13131-010-0023-1
http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf
62
ANEXO 1.
Figura A.- Perfil de adhesión de cepas con potencial patógeno a extracto crudo de
moco de ostión.
63
Figura B.- Perfil de adhesión de cepas con potencial patógeno a extracto crudo de
moco de ostión.
64
ANEXO 2.
Análisis estadístico
AGAR MARINO
Num. De Muestreo Medio de Cultivo Unidades Log.1 Agar Marino 6.2 6.2
1 Agar Marino 7 7
1 Agar Marino 6.3 6.3
1 Agar Marino <3 2
1 Agar Marino <3 2
1 Agar Marino 7 7
1 Agar Marino 7.9 7.9
1 Agar Marino 7.3 7.3
1 Agar Marino 5.2 5.2
1 Agar Marino 6.1 6.1
1 Agar Marino 5.7 5.7
2 Agar Marino 3.6 3.6
2 Agar Marino 3 3
2 Agar Marino 5.8 5.8
2 Agar Marino 3.5 3.5
2 Agar Marino 3.3 3.3
2 Agar Marino 3.9 3.9
2 Agar Marino 4.8 4.8
2 Agar Marino 5.2 5.2
3 Agar Marino 3.3 3.3
3 Agar Marino 6.6 6.6
3 Agar Marino 6 6
3 Agar Marino 4.6 4.6
3 Agar Marino 6.9 6.9
3 Agar Marino 5.5 5.5
3 Agar Marino 4.2 4.2
3 Agar Marino 5.1 5.1
3 Agar Marino 5.5 5.5
3 Agar Marino 5.2 5.2
3 Agar Marino 5.5 5.5
3 Agar Marino 5.2 5.2
3 Agar Marino 4.9 4.9
65
AGAR Papa Dextrosa
Num. De Muestreo Medio de Cultivo Unidades Log.1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa 3.3 3.3
1 Agar Papa Dextrosa 3.8 3.8
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa 3.3 3.3
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
1 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa 1.3 1.3
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
2 Agar Papa Dextrosa <1 0
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa 1 1
3 Agar Papa Dextrosa 1.7 1.7
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa 3.6 3.6
3 Agar Papa Dextrosa 1 1
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa 1.3 1.3
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa ND
3 Agar Papa Dextrosa ND
66
AGAR TCBS
Num. De Muestreo Medio de Cultivo Unidades Log.1 Agar TCBS <2 1
1 Agar TCBS <2 1
1 Agar TCBS <2 1
1 Agar TCBS <2 1
1 Agar TCBS <2 1
1 Agar TCBS 4 4
1 Agar TCBS 3.3 3.3
1 Agar TCBS 5 5
1 Agar TCBS 5.3 5.3
1 Agar TCBS <2 1
1 Agar TCBS 4.1 4.1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
2 Agar TCBS <2 1
3 Agar TCBS 4.6 4.6
3 Agar TCBS 3.5 3.5
3 Agar TCBS 3.8 3.8
3 Agar TCBS 3.1 3.1
3 Agar TCBS 3.55 3.55
3 Agar TCBS 2.8 2.8
3 Agar TCBS 2.9 2.9
3 Agar TCBS 1.9 1.9
3 Agar TCBS 3.9 3.9
3 Agar TCBS 3.3 3.3
3 Agar TCBS 3.4 3.4
3 Agar TCBS 4 4
3 Agar TCBS 3 3
67
AGAR Bair Parker
Num. De Muestreo Medio de Cultivo Unidades Log.1 Agar Bair Parker <1 0
1 Agar Bair Parker 1 1
1 Agar Bair Parker <1 0
1 Agar Bair Parker <1 0
1 Agar Bair Parker <1 0
1 Agar Bair Parker 1 1
1 Agar Bair Parker 3 3
1 Agar Bair Parker 3.8 3.8
1 Agar Bair Parker 1 1
1 Agar Bair Parker <1 0
1 Agar Bair Parker 2 2
2 Agar Bair Parker 1.6 1.6
2 Agar Bair Parker <1 0
2 Agar Bair Parker <1 0
2 Agar Bair Parker <1 0
2 Agar Bair Parker <1 0
2 Agar Bair Parker 1 1
2 Agar Bair Parker 1.5 1.5
2 Agar Bair Parker 1.3 1.3
3 Agar Bair Parker 1.3 1.3
3 Agar Bair Parker 2.6 2.6
3 Agar Bair Parker 2 2
3 Agar Bair Parker 1.3 1.3
3 Agar Bair Parker 1.8 1.8
3 Agar Bair Parker 3.5 3.5
3 Agar Bair Parker 4.2 4.2
3 Agar Bair Parker ND
3 Agar Bair Parker 1.7 1.7
3 Agar Bair Parker 1.3 1.3
3 Agar Bair Parker ND
3 Agar Bair Parker 3 3
3 Agar Bair Parker ND
68
ANEXO 3
Grafica de medias y Prueba de Tukkey para el Log UFC en AGAR MARINO EN LOS TRES MUESTREOS
Numero de MuestreoUnidades Logaritmicas 1
2 2 4.137500 ****
3 3 5.269231 ****
1 1 5.700000 ****
Prueba de tukkey
69
Grafica de medias para el Log UFC en AGAR TCBS EN LOS TRES MUESTREOS
Grafica de medias y Prueba de Tukkey para el Log UFC en agar papa dextrosa entre los tres
muestreos.
70
Grafica de medias para el Log UFC en agar Baird Parker entre los tres muestreos.
Numero de MuestreoUnidades Logaritmicas 1
2 2 0.162500 ****
1 1 0.945455 ****
3 3 1.720000 ****