universidad central del ecuador · composición del agar mueller-hinton (*g/l de agua...
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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
CARRERA ODONTOLOGÍA
“EFECTIVIDAD DE INHIBICION DEL EXTRACTO DE
TOMILLO Y DE ROMERO ( AL 10%) FRENTE AL
STREPTOCOCCUS MUTANS EN 20 MUESTRAS”
Trabajo de Titulación previo la obtención del grado Académico
de Odontología
Eliana Jacqueline Ortega Salazar
TUTOR:
DR. Héctor Eduardo Estévez Echanique
QUITO, ABRIL 2016
ii
DEDICATORIA
A la persona más importante compañera fiel en mi vida quien me ha dado dones y con
su misericordia me ha llenado de su presencia, quien me ha regalado los mejores Padres
Jorge y Jaqueline; hermanos y me permitió compartir esta experiencia universitaria con
personas maravillosas compañeros y docentes.
Me ha dado a los mejores hijos y al mejor Esposo.
Al Espíritu Santo de Dios por todo lo que me ha dado por lo que me da cada día y por
lo que vendrá mi dedicación fiel a su presencia en mi vida.
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios creador de todo el universo todo lo que soy y tengo es gracias a Él, a su amor
infinito y su compañía fiel cada día de mi vida.
A mi Padre por hacer siempre su mejor esfuerzo para que su hija llegue a esta meta
anhelada.
A mi mejor amiga mi mamita Jaque, por su esfuerzo íntegro y un gran ejemplo de mujer.
A mis hermanos por su compañía, su afecto hacia mí y Damián.
A cada persona de una u otra manera dio su granito de arena para llegar a lo que un día
empezamos.
iv
v
vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ ii
DEDICATORIA .......................................................................................................... ii
ÍNDICE DE ANEXOS .................................................................................................xi
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................. xii
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................... xiii
ÍNDICE DE GRÁFICOS ............................................................................................ xiv
ÍNDICE DE IMÁGENES ............................................................................................ xv
RESUMEN ................................................................................................................ xvi
ABSTRACT ..............................................................................................................xvii
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
CAPÍTULO I ................................................................................................................ 2
1.1 Planteamiento del problema..............................................................................2
1.1.1 Definición del problema ............................................................................2
1.2 Objetivos ..........................................................................................................2
1.2.1 General .....................................................................................................2
1.2.2 Específicos ................................................................................................2
1.3 Justificación e importancia ...............................................................................3
1.4 Hipótesis ..........................................................................................................3
CAPÍTULO II ............................................................................................................... 4
MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 4
viii
2.1 Caries dental ........................................................................................................4
2.1.1 Etiología .......................................................................................................5
2.2 Género Streptococcus mutans ..............................................................................6
2.2.1 Definición .....................................................................................................7
2.2.2 Taxonomía ....................................................................................................8
2.2.3 Estructura ......................................................................................................8
2.2.4 Características ...............................................................................................9
2.2.5 Factores de virulencia ................................................................................. 11
2.3 Uso de plantas medicinales en Odontología ....................................................... 12
2.3.1 Tomillo ....................................................................................................... 17
2.3.1.1 Taxonomía ........................................................................................... 18
2.3.1.2 Características ...................................................................................... 19
2.3.1.3 Composición química ........................................................................... 20
2.3.1.4 Mecanismo de acción ........................................................................... 20
2.3.1.5 De las propiedades a los usos................................................................ 21
2.3.2 Romero ....................................................................................................... 22
2.3.2.1 Taxonomía ........................................................................................... 22
2.3.2.2 Características ...................................................................................... 23
2.3.2.3 Composición química ........................................................................... 24
2.3.2.4 Mecanismo de acción ........................................................................... 25
2.3.2.5 De las propiedades a los usos................................................................ 25
ix
2.4 Medios de cultivo .............................................................................................. 28
2.4.1 Mueller Hinton (Escala de McFARLAND) ................................................. 30
CAPÍTULO III ............................................................................................................ 33
METODOLOGÍA ....................................................................................................... 33
3.1 Enfoque de la investigación ............................................................................... 33
3.2 Alcance de la investigación científica ............................................................. 33
3.3 Diseño de investigación ..................................................................................... 33
3.4 Universo y muestra ............................................................................................ 34
3.4.1 Criterios de inclusión .................................................................................. 34
3.4.2 Criterios de exclusión .................................................................................. 34
3.5 Operacionalización de las variables .................................................................... 34
3.5.1 Dependientes .............................................................................................. 34
3.5.2 Independientes ............................................................................................ 35
3.6 Aspectos éticos .................................................................................................. 35
3.7 Identificación de equipos y materiales ................................................................ 37
3.8 Procedimiento .................................................................................................... 43
3.8.1 Preparación de los extractos ........................................................................ 43
3.8.2 Medios de cultivo ........................................................................................ 44
3.8.3 Microorganismo en estudio ......................................................................... 45
3.8.4 Evaluación del efecto antimicrobiano por difusión con disco ....................... 46
3.8.6 Medición del efecto antimicrobiano ............................................................ 48
x
CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 49
RESULTADOS ........................................................................................................... 49
4.1 Metodología para la interpretación de los resultados .......................................... 49
4.2 Análisis estadístico ............................................................................................ 50
4.2.1 Análisis de Varianza y Prueba de Tukey ..................................................... 50
4.2.2 Evaluación del efecto inhibidor de los extractos de Tomillo y Romero ........ 55
4.3 Discusión ........................................................................................................... 58
CAPÍTULO V ............................................................................................................. 61
5.1 Conclusiones ..................................................................................................... 61
5.2 Recomendaciones .............................................................................................. 61
Bibliografía ................................................................................................................. 62
ANEXOS .................................................................................................................... 71
xi
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Balanza Electrónica ...................................................................................... 71
Anexo 2. Calibrador .................................................................................................... 72
Anexo 3. Maquina reguladora de volumen .................................................................. 73
Anexo 4. Incubadora con CO2 .................................................................................... 74
Anexo 5. Nevera e incubadora ..................................................................................... 75
Anexo 6. Esterilizador ................................................................................................. 76
Anexo 7. Balanza digital ............................................................................................. 77
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Streptococcus mutans aislado en laboratorio ..................................................9
Figura 2. Esquema de los principales factores de virulencia de Streptococcus mutans . 11
Figura 3. Vínculo entre odontología y Naturaleza ....................................................... 13
Figura 4. Hojas de tomillo pulverizadas, luego de su secado ....................................... 18
Figura 5. Estructura química del timol, uno de los aceites esenciales del Tomillo ....... 20
Figura 6. Planta de Romero en estado fresco............................................................... 23
Figura 7. Partes de la planta de Romero: tallo, hojas, flores ........................................ 24
Figura 8. Estructura general de los flavonoides en el Romero ..................................... 25
Figura 9. Forma comercial del Romero ....................................................................... 26
Figura 10. Extracto de Tomillo .................................................................................. 43
Figura 11. Extracto de Romero ................................................................................... 44
Figura 12. Agar Mueller Hinton ................................................................................. 45
Figura 13. Inóculo del cultivo ..................................................................................... 46
Figura 14. Pipetear los discos ..................................................................................... 47
xiii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales especies de bacterias que intervienen en la formación de caries
dental .................................................................................................................................6
Tabla 2. Clasificación de Streptococcus del grupo viridans más aceptada en la
actualidad...........................................................................................................................7
Tabla 3. Taxonomía del Streptococcus mutans..............................................................8
Tabla 4. Clases de plantas con susceptibilidad antimicrobiana .................................... 14
Tabla 5. Afecciones de la cavidad bucal y plantas medicinales para tratarlas............... 15
Tabla 6. Preparación y empleo de plantas ................................................................... 17
Tabla 7. Taxonomía del Tomillo ................................................................................. 19
Tabla 8. Taxonomía del Romero ................................................................................. 22
Tabla 9. Indicaciones por grupos de microorganismos ................................................ 30
Tabla 10. Composición del Agar Mueller-Hinton (*g/l de agua destilada)................... 30
Tabla 11. Condicionantes para el medio de cultivo Agar M-H .................................... 32
Tabla 12. Equipos, funciones y aplicaciones específicas ............................................. 37
Tabla 13. Grupos de estudio ....................................................................................... 48
Tabla 14. Resultados................................................................................................... 50
Tabla 15. ANOVA...................................................................................................... 51
Tabla 16. Comparaciones múltiples de Tukey ............................................................. 52
Tabla 17. Distribución de los promedios ..................................................................... 54
Tabla 18. Estadísticos descriptivos............................................................................. 56
Tabla 19. Escala de Duraffourd................................................................................... 58
xiv
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Medias del halo de inhibición por sustancias .............................................. 55
Gráfico 2. Diagrama de cajas ...................................................................................... 57
xv
ÍNDICE DE IMÁGENES
Imagen 1. Extracto de Tomillo .................................................................................................... 43
Imagen 2. Extracto de Romero .................................................................................................... 44
Imagen 3. Agar Mueller Hinton ................................................................................................... 45
Imagen 4. Inóculo del cultivo ...................................................................................................... 46
Imagen 5. Pipetear los discos....................................................................................................... 47
xvi
TEMA: “Efectividad de inhibición del extracto de tomillo y de romero (10%) frente al
streptococcus mutans en 20 muestras”
Autora: Eliana Jacqueline Ortega Salazar
Tutor: Dr. Héctor Eduardo Estévez Echanique
RESUMEN
El trabajo de investigación presentado en estas páginas pretendió comprobar la efectividad
de inhibición de los extractos de Tomillo y Romero (al 10%) frente al Streptococcus mutans,
principal agente causante de caries dental. Para ello, se realizó el análisis in vitro de 20 muestras, al
interior del Laboratorio SAFEM –ubicado en el Barrio 6 de Diciembre, Caccha N3-257 y Princesa
Toa, de la ciudad de Quito. Bajo un diseño experimental, se midieron los halos de inhibición
formados por ambas soluciones acuosas, además de la clorhexidina al 2% y agua destilada, en
cultivo Mueller Hinton. Sobre la base fundamental del análisis estadístico –a partir del Análisis de
Varianza de un factor (ANOVA) y la Prueba de Tukey–, en contraste con los resultados de estudios
precedentes, se refutó la hipótesis planteada inicialmente. Se concluyó entonces que ninguno de los
extractos de las mencionadas plantas, al menos al 10% –equivalente a la concentración lograda en
preparados caseros–, consigue prevenir o detener la aparición e incidencia de la bacteria en
cuestión.
PALABRAS CLAVE: EFECTIVIDAD DE INHIBICIÓN, EXTRACTOS, TOMILLO,
ROMERO, STREPTOCOCCUS MUTANS, CARIES DENTAL, CULTIVO MUELLER HINTON
xvii
1
INTRODUCCIÓN
Con el paso de los años, la medicina natural igual ha devenido centro de los estudios
científicos en beneficio de los seres humanos. En la actualidad, conscientes de la necesidad de
investigación y de la diversidad de plantas existentes también en el Ecuador, dichas indagaciones
se han centrado en disímiles aspectos para coadyuvar, particularmente, al mantenimiento de la
salud bucal.
En pos de ello, no pocos estudios han puesto énfasis en semejar, al interior del laboratorio,
las características y condiciones inherentes a la cavidad oral. ¿Finalidad?... En esencia, lograr que
los resultados sean cada vez más óptimos, para lo cual se han tenido en cuenta elementos o factores
como la temperatura, el pH, entre otros.
Partiendo de los resultados arrojados por investigaciones que han tomado en consideración
lo anteriormente señalado, la presente pretendió verificar la inefectividad antimicrobiana de los
extractos de Tomillo y Romero –en específico– frente al Streptococcus mutans, a bajas
concentraciones (10%), tal cual se prepararían en los hogares como parte de remedios caseros.
2
CAPÍTULO I
1.1 Planteamiento del problema
1.1.1 Definición del problema
Desde la Antigüedad hasta el presente, exponentes de la flora han sido utilizados en
función del tratamiento y erradicación de múltiples enfermedades que han aquejado a los seres
humanos. Todo ello, a partir de sus comprobadas propiedades curativas.
En el Ecuador, un 10 por ciento del total de las especies de plantas se encuentra en la
Cordillera de los Andes, específicamente en la zona noroccidental. Sin embargo, sobre buena parte
de esas 10 mil especies no existen estudios asociados en lo fundamental a su uso en Odontología y
a partir de la llamada medicina natural; y los que sí pueden citarse han insistido en que, para lograr
su efectividad, se requieren altas concentraciones.
De ahí que, con la actual investigación, se pretendió desmitificar cualquier creencia popular
entre las familias ecuatorianas, respecto a que los extractos de Tomillo y Romero, utilizados como
remedios caseros, poseen un valor terapéutico, capaz de prevenir la caries dental en particular, una
enfermedad que afecta a la mayoría de la población.
Se consideraron el Tomillo y el Romero por su efectividad en colutorios –sobre todo ante
la gingivitis– y los resultados de estudios con base en las propiedades antimicrobianas frente a
microorganismos anaerobios, respectivamente. Partiendo de ahí, y de las concentraciones
empleadas en dichos estudios, se desestimó la posibilidad real de obtención de un compuesto que
sirviese como medicina alternativa.
1.2 Objetivos
1.2.1 General
Comprobar la inefectividad de inhibición de los extractos de Tomillo y Romero (al 10%)
frente al Streptococcus mutans, en 20 muestras.
1.2.2 Específicos
Identificar la inefectividad de inhibición del extracto de Tomillo (al 10%) frente al
Streptococcus mutans, en 20 muestras.
Identificar la inefectividad de inhibición del extracto de Romero (al 10%) frente al
Streptococcus mutans, en 20 muestras.
3
1.3 Justificación e importancia
La denominada medicina natural ha sido utilizada como tratamiento alternativo desde
épocas pasadas. Sin embargo, dentro del campo de la Odontología su uso se ha considerado
insuficiente; ¡todavía más en el Ecuador, teniendo en cuenta la diversidad de plantas aquí existente!
Algunos estudios científicos se han centrado en el comportamiento de ciertos compuestos
de origen vegetal ante el Streptococcus mutans. Mas, la importancia y aporte del expuesto en estas
páginas, radicó en la consideración, particularmente, del Romero y el Tomillo (en extractos al
10%), dada la cierta creencia de que, preparados dentro del ámbito hogareño, podrían contrarrestar
la aparición y desarrollo del referido agente causante de la caries dental.
Entonces, la presente investigación buscó desde el inicio contribuir al enriquecimiento de
la también llamada medicina alternativa y el saber colectivo. Pretendió desmitificar la mencionada
alternativa terapéutica, considerada de bajo costo y fácil adquisición.
1.4 Hipótesis
Los extractos de Tomillo y Romero (al 10%) no tienen acción inhibitoria efectiva frente al
Streptococcus mutans.
4
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1 Caries dental
Desde siempre, el ser humano ha mantenido un instinto básico inherente a la especie: el de
supervivencia. Le ha instado a buscar en la naturaleza los recursos para satisfacer necesidades
elementales: alimentarse, dormir, resguardarse ante las inclemencias del tiempo… ¡y cuidar su
salud!
Sin embargo, paradójicamente, el propio desarrollo social ha motivado cambios en los
estilos de vida. Estos, a la vez, han determinado un incremento respecto a la incidencia de disímiles
enfermedades. ¿Un ejemplo concreto? La caries dental.
Figura esta entre los padecimientos más prevalentes en el orbe. González, Martínez,
Alfonzo, Rodríguez & Morales (2009) se remiten al OMS-WORLD Health Report (2003) para
citar que afecta al 80 por ciento de la población del mundo. Después acotan cifras más
actualizadas: 96 en el planeta y 99 en América Latina. Pese a no comprometer la vida, la entidad
“constituye una de las patologías actuales más frecuentes y costosas, con una duración de por vida”
(Gamboa, 2006; citado por Cruz, 2010, p.30).
Al incorporar a su dieta mayor cantidad de alimentos blandos –constituidos por hidratos de
carbono como la sacarosa1– y descuidar su higiene bucal, en combinación con terceros factores
2, el
Hombre ha potenciado el surgimiento y proliferación de las mencionadas lesiones dentarias, al
decir de Torres (1995) y Sales (2001), tan antiguas como su propio portador.
Llama la atención que dichas afecciones bucales3 no son privativas de algún grupo sexual,
étnico o etario (De Estrada, Pérez, & Hidalgo, 2006). No obstante, suelen presentarse desde las
primeras edades4 y progresar con el paso del tiempo. La Organización Mundial de la Salud (OMS,
1987), especifica que “se inicia después de la erupción dentaria, determinando el reblandecimiento
1 Más que de su cantidad, en virtud de su textura, consistencia y adhesión, unido a las circunstancias en que son ingeridos, los alimentos azucarados poseen un alto potencial cariogénico. La sacarosa es el de mayor entre todos los
hidratos de carbono: cinco veces más que el almidón, sobre todo al actuar sobre superficies lisas (Silva, 1986). 2 Entre los predictores de riesgo también están una experiencia anterior de caries, historia médica, saliva, las pruebas bacteriales, suposiciones del odontólogo, profundas fosas y fisuras, los tratamientos de prótesis y ortodoncia, el control de placa, apiñamiento dentario, hábito de fumar y estado sociodemográfico de la persona. 3 Además de las maloclusiones y periodontopatías. 4 A juicio de Oliveira (1990), al emerger los dientes, la cavidad bucal se torna más susceptible a la colonización. Especifican luego Sayde et al. (2002) que el primer elemento de la dentición permanente en salir, el primer molar, resulta el más atacado por caries. La prevalencia de esta enfermedad desde entonces, se relaciona hoy con su actividad futura y
repercusión negativa en el desarrollo maxilofacial.
5
del tejido duro del diente, y evoluciona hasta la formación de una cavidad” (Sayde, Gutiérrez, Soto,
Vallejos & Casanova, 2002).
Se suma el hecho de que tienen un mecanismo de transmisión natural5: de padres a hijos
(Linossier, Vargas, Zillmann, Arriaga, Rojas, & Villegas, 2003). Y así continúa siendo aunque, de
acuerdo con Sayde et al. (2002), numerosos estudios han demostrado que tienden a disminuir los
índices en la medida en que aumenta el desarrollado económico de los países.
A partir de lo anterior, la caries dental se cataloga como una patología infecciosa,
transmisible, multifactorial, compleja, agresiva y crónica.
Debido, en lo fundamental, a que la también la llamada infección basal consta entre las
causas esenciales de pérdida6
de los dientes o coronas –en 9 de cada 10 personas– y, de no tratarse
de manera oportuna, afecta la calidad de vida y salud de cualquier individuo (De Estrada,
Rodríguez, Coutin, & Riverón, 2003), no pocos investigadores se han dado a la tarea de examinarla
(Mattos & Melgar, 2004). Insisten en predecir su aparición para contrarrestar semejante problema
de salud a escala pública, cuyas consecuencias van desde la función estética a la digestiva.
Ello explica el examen minucioso de cuanto le da origen. Destacan, en primer lugar, los
agentes microbianos. Se trata, tal cual exponen Sayde et al. (2002), de bacterias específicas
identificadas y cuantificadas mediante las pruebas de Snyder, Fosdick, Dewar y Rickles (Mattos &
Melgar, 2004).
2.1.1 Etiología
Si se percibe en la pieza una mancha reversible, color blanco-tiza, puede afirmarse: hay
caries. Constituye la manifestación inicial de la enfermedad, revela Azevedo (1994). Por
consiguiente, evidencia la existencia de ciertos microorganismos.
¿Cuáles? Miller (citado por Saltos, 2011), logró hacia 1990 advertir los fundamentos de la
etiología correspondiente al referido padecimiento. Con posterioridad, trascendió que:
La cavidad bucal contiene una de las series más variadas y concentradas de las poblaciones
microbianas del organismo. Se estima que en ella habitan más de mil especies, cada una de
ellas representada por una gran variedad de cepas. (p.23)
5 Torres (1999) ha verificado que el genotipo del Estreptococo mutans en los pequeños, por ejemplo, se equipara en un 70 por ciento al de sus madres. 6 Se produce un desequilibrio bioquímico que conlleva a alteraciones en el complejo dentino-pulpar (De Estrada et al.,
2006).
6
Sobresalen tres grandes grupos7:
Tabla 1. Principales especies de bacterias que intervienen en la formación de caries dental
Fuente: (Saltos, 2011)
2.2 Género Streptococcus mutans
Entre los agentes causantes de caries –tanto en el esmalte como a nivel de superficie en la
raíz del diente– resalta el Streptococcus mutans. Chasteen (1986), Escobar (1991) y McDonald &
Avery (1995) lo califican de “el más virulento”.
7 Dentro de estos, el género Lactobacillus incluye especies como L. casei, L. acidophilus, L. plantarum y L. salivarius, homofermentativas, “con un rol más determinante en la progresión que en la instalación de la caries dental” (De Estrada
et al., 2006, p.73).
7
Integra el grupo mayor de los viridans8:
Tabla 2. Clasificación de Streptococcus del grupo viridans más aceptada en la actualidad
Fuente: (Fernández, 2008; citado por Cruz, 2010)
Según relata Liébana (1995), desde hace siglos el Streptococcus mutans deviene
constituyente de la flora bacteriana oral del ser humano. De modo que su hábitat permanente, ya
tras la erupción dental9, es la cavidad oral.
2.2.1 Definición
El término científico: Streptococcus mutans alude inicialmente a una bacteria. Fernández
(2008; citado por Cruz, 2010), deja en claro que es esta Gram positiva10.
Puede identificarse
asimismo dadas sus características.
8 Vocablo procedente del latín viridis, cuyo significado es “verde”. Tal denominación responde a que, por lo general,
estas bacterias originan pequeñas colonias en agar sangre, a cuyo alrededor se forma “un halo de hemólisis verde debido a una destrucción incompleta de los eritrocitos” (Gamboa, 2006; citado por Cruz, 2010, p.28). 9 Para colonizar, necesita el tejido duro no descamativo. Así que, con la primera dentición, se forma la placa bacteriana
(Gamboa, 2006; citado por Cruz, 2010).
8
2.2.2 Taxonomía
La taxonomía de esta bacteria puede sintetizarse del siguiente modo:
Tabla 3. Taxonomía del Streptococcus mutans
Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilos
Orden: Lactobacillales
Familia: Streptococcaceae
Género: Streptococcus
Especie: Streptococcus mutans
Fuente: (Rhiete, 2003)
2.2.3 Estructura
La observación bajo lupa de esta bacteria alfa hemolítico ha llevado a confirmar que no
posee un núcleo definido por membrana nuclear. Especialistas como Bojanich (2006) manifiestan
que el material genético del Streptococcus mutans aparece en forma de cadenas bien simples, pues
crece así o en parejas.
A raíz de los avances científico-técnicos, expertos de la Universidad de Oklahoma (Estados
Unidos) han descifrado el genoma. Un 85 por ciento está compuesto por un cromosoma circular,
que incluye mil 963 genes capaces de revelar la codificación para proteínas. “Este descubrimiento,
sin dudas, abre las puertas a tratamientos muchos más efectivos contra la caries” (De Estrada et al.,
2006).
10 Significa que reacciona de manera positiva a la coloración de Gram.
9
2.2.4 Características
Así se observa bajo el microscopio:
Figura 1. Streptococcus mutans aislado en laboratorio
Fuente: (Facklan, 2015)
Justamente debe el nombre a su tendencia a variar de forma, oscilante entre aquella
semejante a un coco, esférica; o a un bacilo, cuando aparece más alargada (Azevedo, 1985). De ahí
el calificativo de cocacea.
Bibliografía especializada refiere que dicha clase de gérmenes no tiene movimiento ni
genera esporas. Fernández (2008; citado por Cruz, 2010) distingue otras propiedades:
Capacidad de adherencia a la sustancia dura dental
Sistema de transporte de azúcares
Producción de ácido láctico a partir del azúcar
Producción de polisacáridos intracelulares y extracelulares
Tolerancia de un medio ácido (p.31)
Para comprender las implicaciones de cada una, apremia una descripción más profunda en
igual orden:
10
Individualmente, y mientras están en equilibrio, los microorganismos que habitan en la
cavidad oral no actúan en detrimento de la misma. Ello sí sucede cuando las distintas poblaciones
conforman una comunidad, al darse condiciones propicias. Se impone entonces su potencial
infeccioso (Fernández et al., 2004). ¿Resultado? Enfermedad: caries dental.
Como parte del proceso, los microorganismos se adhieren a la placa bacteriana11
o biofilm
dental. Forman así una película12
. Gracias a sus receptores especiales y a la pegajosa matriz que
produce –denominada dextrán–, el Streptococcus mutans es uno de los primeros en hacerlo, con lo
cual gana en cohesión y se multiplica (Castro, 2005).
No extraña luego saber que “un elevado consumo de azúcar, en combinación con un valor-
pH frecuentemente bajo, contribuye al aumento de los Streptococcus mutans, en la cavidad bucal”
(Fernández, 2008; citado por Cruz, 2010, p.31).
Una vez allí, en virtud de su flexibilidad genética (Nelson, 1996) protagoniza el
movimiento y la degradación de las partículas de hidratos de carbono presentes en la dieta. Según
Souza (1992), rompe moléculas para producir glucanos, lo mismo solubles que insolubles. Al
fermentarlos, provoca un descenso del pH y este llega a ser inferior a 4. Y como modifica así la
glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa, galactosa, ribulosa, rafinosa, melibiosa y el almidón en ácidos,
se cataloga de acidogénica.
Detalla Jawets (2002) que “metaboliza la sacarosa para producir polisacáridos
intracelulares y extracelulares (sustancia laxa que facilita su adhesión a las caras libres de las piezas
dentarias)”, transformados en ácido láctico cuando no dispone de sustrato exógeno.
Insiste Sieber (2012) en el calificativo de “anaeróbica facultativa”; mientras Bojanich
(2006) acota que lo adquiere por obligación, en tanto obtiene la energía gracias a que sintetiza el
ácido láctico. De ahí que, de modo general, aparece en el grupo de las acidolácticas y se considera
acidúrico. Resalta además cómo requiere un medio bajo en pH para vivir, lo cual habla de su
condición acidófila.
Al fin y al cabo, el resultado de los mecanismos expuestos puede advertirse en la
desmineralización del esmalte (Reyes, 2015) y descalcificación de la estructura correspondiente a
la pieza dentaria. Acaece la fase inicial de la formación de la caries (Sayde et al., 2002).
11 Ecosistemas conformados por estructuras microbianas, productos microbianos extracelulares, glucoproteínas salivales insolubles, detritus alimentarios y epiteliales. Se agrupan y adhieren con firmeza a la superficie dentaria (De Estrada et al., 2006). 12 Aquí interactúan una proteína del microorganismo (PAc), varias de la saliva –que el esmalte dental adsorbe– (Souza,
1992).
11
2.2.5 Factores de virulencia
¿Cuánto puede determinar, más que la aparición, la proliferación del Streptococcus
mutans?... Grosso modo, De Estrada et al. (2006) y Sieber (2012) advierten unos seis factores
capaces de validar el daño que produce este microorganismo. Quedan ilustrados como sigue:
Figura 2. Esquema de los principales factores de virulencia de Streptococcus mutans
Fuente: (De Estrada et al., 2006)
Primeramente, ambos autores advierten la “acidogenicidad”. Está ligada al hecho de que la
mencionada bacteria fermenta los azúcares y, como resultado último de su metabolismo, produce
sobre todo ácido láctico. Interviene a continuación la “aciduricidad”, término ligado a la capacidad
de generar ácido en un medio de por sí bajo en pH.
A los anteriores se encuentran estrechamente conectados otros dos elementos: la
“acidofilicidad” –relativa al poder de resistencia a la acidez, lo cual logra el Streptococcus mutans
tras bombear protones (H+) al exterior de la célula–; y la “síntesis de glucanos y fructanos”
13 a
partir de la sacarosa –polímeros que viabilizan la adherencia al diente.
13 Ocurre gracias a la intervención de las enzimas glucosil (GTF) y fructosiltransferasas (FTF) (De Estrada et al., 2006).
12
Se añade la “síntesis de polisacáridos intracelulares”. De Estrada et al. (2006) convienen en
que sustancias como el glucógeno pasan a ser una importante reserva alimenticia. Luego, incluso si
el huésped14
no consume azúcar, sostiene la producción de ácido por lapsos temporales extensos.
No por última supone menor relevancia la “producción de dextranasa”. Dicha enzima
incide en la regulación de las glucosiltranferasas y de la energía.
Sin lugar a dudas, cada uno de dichos factores se convierte en garantía de supervivencia
para la bacteria. Viabiliza la aparición de caries.
2.3 Uso de plantas medicinales en Odontología
La modernidad y el progreso han traído consigo una visión a veces reduccionista de
múltiples aspectos de la vida. Ha ocurrido así en relación con las posibilidades de curación de las
enfermedades. Como tendencia, coincide Martínez (2008), han imperado los métodos clínicos. La
farmacología, estiman otros autores, ha desatado una lucha frontal entre lo que se considera
“ciencia” y mera “creencia”.
Pero, ¿dónde queda la tan defendida interdisciplinariedad? ¿Por qué el antagonismo,
cuando vale más la complementariedad si de salud se trata?
Afortunadamente, por diversas razones –que van desde el miedo a las consultas
odontológicas hasta el bajo nivel de acceso a dicho servicio y el mantenimiento de prácticas
ancestrales15
, sobre todo en comunidades indígenas–, persisten no obstante los llamados
tratamientos no convencionales. Así se verifica en un informe firmado por Pedersen (1987) y
publicado por la Organización Panamericana de la Salud bajo el título: Evaluación de servicios de
salud: el punto de vista de la gente.
Recuerdan García, Castro & González (2008) que, hacia la década del ‘60 del pasado siglo,
resurge el interés por el uso de las plantas –que en realidad se remonta a la antigüedad16
. Pese a la
abierta oposición de transnacionales farmacéuticas, se concretan intenciones durante la Asamblea
de la OMS celebrada en 1976, con miras a la aplicación de la medicina natural y tradicional en la
Atención Primaria de naciones en desarrollo.
De entonces a la fecha, se han escuchado voces a favor. Parecen haber tenido efecto.
14 Relativo al ser humano, portador del Streptococcus mutans. 15 A través de redes sociales, de la oralidad, se han transmitido de generación en generación. En la actualidad, uno de los personajes que contribuye a difundir ese saber es el yerbatero o “médico herbolario”, quien recolecta, vende, receta y utiliza las plantas medicinales. 16 “Por ejemplo, en el papiro de Ebers (2278 a.C.) y el de Smith (2263 a.C.) se citan una serie de drogas, cómo
prepararlas y su cultivo, como el de la adormidera” (Muñoz, 2002, p.22).
13
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que más del 80 por ciento de la
población mundial utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus
necesidades de Atención Primaria de Salud, y que gran parte de los tratamientos
tradicionales implican el uso de extractos de plantas o sus principios activos. (Reyes, 2014,
p.60)
En el ámbito de la estomatología, el uso de la medicina herbal podría representarse por
medio de este esquema:
Figura 3. Vínculo entre odontología y Naturaleza
Fuente: (Crellin, s.f.; citado por Morillo et al, 2006)
La aceptación, opinan investigadores como Luján & Pérez (2008), hoy va más allá de los
profesionales que prescriben determinadas medicinas naturales. Se percibe en el aprovechamiento
superior de la biodiversidad floral, sobre la base de exámenes de la composición química y acción
antimicrobiana de las plantas. Así, se ha comprobado la utilidad17
de numerosas especies para la
elaboración de fitofármacos18
, aplaudidos también dado su bajo costo (Moreno, Cañada, Antúnez,
Díaz, & Pineda, 2011):
17 Refiere Reyes (2015) que, de acuerdo con estimaciones, más o menos el 25 por ciento de los medicamentos modernos derivan de plantas medicinales. 18 Palabra compuesta por “fito” (del griego öéôün = planta) y “terapia” (del griego èåñáðåßá = cura), cuyo significado es “curarse con las plantas”. Según García, Castro, & González (2008), los fitofármacos se obtienen a partir de secciones
cortadas o pulverizadas, líquidos naturales, jugos, resinas, maceraciones alcohólicas u otras formas de un vegetal.
14
Tabla 4. Clases de plantas con susceptibilidad antimicrobiana
Fuente: (Muñoz, 2002)
Annan & Houghton (2007; citados por García, Ramírez, Robles, Zañudo, Salcedo, &
García, 2012) certifican que existen unas 35 mil especies vegetales con potencial medicinal.
Específicamente para el manejo de dolencias en la cavidad oral, aparecen:
15
Tabla 5. Afecciones de la cavidad bucal y plantas medicinales para tratarlas
16
Fuente: (Ramírez, Herrera, & García, 2004)
En la tabla constan hierbas que igual toman forma de remedios caseros. A partir de los
frutos, las flores, hojas, cortezas, tallos, cogollos, raíces, semillas, aceites o demás partes y
compuestos, suelen elaborarse decocciones, infusiones, tés, jarabes, enjuagues, tinturas, tópicos…
Se emplean para combatir patologías como las caries, odontalgias, coloración anormal en las
piezas… (Ramírez, Herrera, & García, 2004). Con certeza, “han reportado beneficios a la
población, tanto en el aspecto terapéutico como económico” (Reyes, 2015, p.74).
17
Se cuentan, por citar:
Tabla 6. Preparación y empleo de plantas
Fuente: (Jaramillo, Gaviria, Gómez, Gutiérrez, Molina, & Pinedo, 2007)
Ciertamente, las plantas constituyen un valioso recurso. Mas, no debe olvidarse: “la
medicina herbaria a nivel casero no elimina la necesidad de consultar al médico cuando aparece
una enfermedad seria” (Hernández & Gally, 1981).
2.3.1 Tomillo
Cuenta Stranburger (2009) que antes de que fuese considerada una planta medicinal, el
Tomillo sobresalía solo por su carácter aromático. En la antigua Roma se aprovechaba para
perfumar quesos y vinos.
Indagaciones llevadas a cabo por López (2006) y Gerdens (2010) han constatado que su
nombre genérico, Thymus, proviene del vocablo thymon, con el cual los griegos reconocieron a esta
18
planta. A juicio del autora, podría derivar a su vez de la palabra thyein, cuyo significado es “aroma,
olor”, en alusión directa a una de las características más distintivas de la especie.
Figura 4. Hojas de tomillo pulverizadas, luego de su secado
Fuente: (Botica Natural, 2014)
Su potencial medicinal se remite al mismo Egipto. Estrada (2010; citado por Guasgua,
2014) comenta que dicha civilización notó bien pronto sus beneficios, de modo que no solo devino
parte de los rituales. Se aplicó en la momificación, al embalsamar los cuerpos de los ciudadanos
fallecidos.
En el presente, su uso va más allá de la cocina o la belleza. En virtud de las tantas otras
propiedades que se le atribuyen, despunta por el aporte a la salud del Hombre.
2.3.1.1 Taxonomía
Su clasificación puede resumirse así:
19
Tabla 7. Taxonomía del Tomillo
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Lamiales
Familia: Lamiaceae
Género: Thymus
Especie: T. vulgaris
Nombre común: Tomillo
Fuente: (Gardens, 2010)
2.3.1.2 Características
La descripción botánica del Tomillo suele partir, como es lógico, de la generalidad: arbusto
significativamente aromático. Ramírez, Herrera & García (2004) y Maistro (2010) se encargan
luego de particularizar. Para ello, señalan que puede alcanzar una altura de hasta 40 centímetros.
Guasgua (2014), sobre la base del parecer de Botanical (1999), Lizcano (2007), Aspurz
(2011), Burri & Piarpuezán (2013), indica que presenta tallos rectos, grisáceos y leñosos. Sus hojas
opuestas –enfatiza–, de tamaño pequeño, ovaladas, se enroscan hacia el interior –de modo que
quedan a la vista las vellosidades de la parte posterior. Las flores, blancas o de un púrpura tenue,
diminutas, conforman tupidos racimos a partir del mes de marzo; muestran “la corola del labio
superior escotada y el labio inferior dividido en tres lóbulos con cuatro estambres que sobresalen”
(p.8). Da por fruto un tetraquenio color marrón.
Esta planta polimorfa, nativa del Mediterráneo, es capaz de sobrevivir por temporadas y
reproducirse mediante semillas o de modo vegetativo. Para ello, requiere un suelo seco y calcáreo;
así como un clima templado-cálido y de montaña. “Resiste bien a las sequías y heladas, pero no al
encharcamiento con exceso de humedad” (Solís, 2011; citado por Guasgua, 2014, p.10).
20
2.3.1.3 Composición química
Entre los compuestos del Tomillo están las vitaminas C y B1, el manganeso, saponinas,
serpilina, los taninos, triterpenoides, terpenos (cimeno, terpineno), flavonoides (que derivan del
lutelol y apigenol), ácidos fenoles (como el cafeico y el rosmarínico), alcoholes (linalol, borneol), y
aceite esencial (Hala, Ebtisam, & Ghita, 2010).
Este último, abarca entre el 1,0 y 2,5 por ciento de cuantas sustancias constituyen la planta.
Contiene fenoles monoterpénicos –dígase timol19
, equivalente a cerca del 70 por ciento; carvacrol,
en un 35 por ciento aproximadamente; y otros en proporción inferior: linalol, borneol y cimeno
(López, 2006).
Coinciden los especialistas al denotar que la composición del aceite puede variar. Depende
de las características del suelo, la etapa de cosecha, la altura a la que esté el cultivo, y demás
aspectos.
La estructura del timol, por ejemplo, se representa químicamente como muestra la figura:
Figura 5. Estructura química del timol, uno de los aceites esenciales del Tomillo
Fuente: (IQB, 2015)
El Tomillo también contiene p-cimeno, terpinenos, linalol, borneol y ésteres acéticos,
cineol, geraniol, cariofileno (Muñoz, 2002).
2.3.1.4 Mecanismo de acción
¿Cómo actúa?... Según Nolkemper (2008), logra desintegrar la membrana externa
perteneciente a las bacterias Gram negativas. Ocurre porque, gracias a la elevada hidrogenación
19 Posee una actividad fungicida y antibacteriana superior al fenol, y una toxicidad menor (De Souza, 2008; citado por
Guasgua, 2014).
21
que adquiere por el timol, llega a formar sal y separa los lípidos inherentes a la membrana celular.
Al alterar su estructura, facilita que se filtren iones potasio y se torne esta permeable.
2.3.1.5 De las propiedades a los usos
Con sustento en numerosas investigaciones, Maistro (2010) sostiene que la utilidad de la
citada planta reside en sus hojas y florecidas sumidades. Ambas, dice, poseen propiedades
bactericidas.
Jarran (2010) recalca las cualidades como antibiótico y antiespasmódico. A ello asocia su
frecuente utilización en tratamientos frente a la digestión lenta, dolor estomacal, cólico abdominal,
ventosidades y otros trastornos de similar índole. Puede sugerirse igual, en su opinión, cuando se
compruebe la incidencia de tenia, áscaris u oxiuros, pues, asegura, es discretamente parasiticida.
El mismo autor le confiere además valor en calidad de desinfectante, antiséptico y
cicatrizante. En consecuencia, estima apropiado el empleo del Tomillo en casos de heridas. Para
ello, recomienda hervirlo y después aplicarlo con una gasa esterilizada, de manera asidua, hasta la
total sanación.
A la antigüedad se remite Jarran (2010) para hacer valer la efectividad del conocido dentro
del ámbito científico por el nombre de Thymus, en afecciones de la piel. Narra que, ya incluso por
esa época, se usaba al presentarse estomatitis e inflamaciones. Sobre la base de tal referencia
histórica, indica el alcohol del Tomillo para fortificar la piel en general y como antiinflamatorio
ante úlceras, aplicado con cataplasmas. Puesto que la considera también sedante, reconoce que la
especie resulta beneficiosa para aplacar la psoriasis, en forma de pomadas y lociones. Y la sugiere
lo mismo con el fin de regular la secreción de grasa que provoca acné, que para contrarrestar la
halitosis o mal aliento.
Si bien no niegan los aportes a la medicina, Folcarà & Vanaclocha (2000) y López (2006)
instan a prestar atención a efectos secundarios y contraindicaciones. Los primeros, porque están
convencidos de que, sobre todo durante el embarazo, la lactancia, las primeras edades o entre
quienes padezcan insuficiencia cardíaca o renal, no debería suministrarse vía oral el aceite de
Tomillo. El segundo, porque cree que ciertos componentes en los preparados pueden generar
hipersensibilidad.
Ante Gram positivas y Gram negativas, el aceite de la planta evidencia actividad
antimicrobiana. El timol y carvacrol inciden sobre la membrana de los microorganismos (Guasgua,
2014).
22
Por tanto, su empleo en el área odontológica resulta bastante amplio: en compresas, con el
fin de aplacar el dolor de muelas; a través de colutorios con infusión, lo mismo para atacar
infecciones buco-faríngeas, que con el objetivo de garantizar el cuidado de dientes y encías.
Entonces el Tomillo previene la caries dental (Solís, 2011).
2.3.2 Romero
Narra Peña (2013) que en el antiguo Egipto, los faraones solían dar indicaciones precisas
de que colocasen sobre sus tumbas un ramillete de esta planta. Confiaban en que así perfumarían
“su viaje al país de los muertos” (p.23). Poco más adelante en el tiempo, a sus cualidades
aromáticas se han añadido las medicinales.
2.3.2.1 Taxonomía
La clasificación de esta especie de planta se corresponde con las denominaciones acá
compartidas:
Tabla 8. Taxonomía del Romero
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Lamiales
Familia: Lamiaceae
Género: Rosmarinus
Especie: Rosmarinus officinalis
Nombre vulgar: Romero
Fuente: (Gardens, 2010)
23
2.3.2.2 Características
Tal cual luce el Romero:
Figura 6. Planta de Romero en estado fresco
Fuente: (Fernández, 2015)
En el Catálogo de Plantas Medicinales publicado en 2009, se lee que se trata de un arbusto
leñoso cuya altura puede tiende a ser 1 metro. La descripción botánica incluye referencias a sus
hojas –pequeñas, abundantes, ramificadas, con bordes hacia abajo y vellosas por el revés,
“aromáticas, finas como agujas, pero flexibles, de color oscuro en la parte superior, grisáceo en la
inferior” (Corrales, Reyes, & Piña, 2014, p.93)–; y tallos rojizos, jóvenes, con corteza agrietada.
Justo en la zona donde coinciden ambos elementos, brotan las flores en ramilletes. Las
mismas, irregulares, con cerca de 5 centímetros de largo, melíferas, presentes casi todo el año, “se
reúnen en verticilastros paucifloros axilares. Corola de color azul-blanquecina con manchas
violáceas en su interior y dos estambres largos que sobresalen de la corola (didínamia)” (Cano &
Martínez, 2009, p.318).
Denota Peña (2013) que el fruto, localizado en el fondo del cáliz, comprende cuatro nueces
de un tono parduzco, en tetraquenio.
24
Figura 7. Partes de la planta de Romero: tallo, hojas, flores
Fuente: (Fernández, 2015)
El hábitat de la referida especie queda develado al conocer el origen de su nombre
científico. La palabra R. officinalis proviene del griego “rhops y myrinos” que quiere decir “arbusto
marino”. Ocurre que crece cerca de las costas. Cano & Martínez (2009) insisten en que se localiza
a lo largo de los matorrales del Mediterráneo.
Su desarrollo está a merced de climas húmedos, tropicales y subtropicales; así como de
“suelos áridos, secos, ligeros, algo arenosos, muy permeables, bien drenados, calcáreos o pobres,
pero no se adapta a las tierras arcillosas compactas” (Peña, 2013, p.25).
2.3.2.3 Composición química
El Romero tiene en su composición una proporción equivalente al 2 por ciento de aceite
esencial –rico en cineol, alcanfor, borneol, pineno, canfeno y limoneno. Se suman algunos ácidos
fenólicos –dígase el rosmarínico, el clorogénico, carnosólico, etcétera– y triterpénicos –el ursólico,
por ejemplo–, diterpenos –entre los cuales figuran el rosmanol, el rosmadial, las saponinas,
los taninos y flavonoides –derivados del epigenol– (Gardens, 2010), con la siguiente estructura
química:
25
Figura 8. Estructura general de los flavonoides en el Romero
Fuente: (Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos, 2015)
2.3.2.4 Mecanismo de acción
El Romero tiene el poder de degradar la membrana citoplasmática de las bacterias. Al decir
de Gardens (2010), cuando la planta interviene, estas pierden iones de potasio. Por consiguiente, se
incrementa la permeabilidad inherente a la membrana y los polifenoles –que además retrasan el
crecimiento de agentes patógenos, pues cambian las condiciones del medio– pueden penetrarla,
provocando lisis en la célula. Desaparece entonces su potencial; las bacterias dejan de tener la
capacidad de motilidad, transporte de membrana y síntesis de ATP. En fin: se tornan más
vulnerables a un ataque inmunológico.
2.3.2.5 De las propiedades a los usos
Tras disímiles ensayos y análisis científicos, el Romero se ha incluido en la actividad
farmacológica. Suele indicarse ante problemas en los procesos de digestión. Se ha comprobado que
es digestivo y antiespasmódico.
Stranburger (2009) da cuenta de las múltiples aplicaciones. Asevera que, a partir de sus
propiedades antisépticas, luego de la decocción se recomienda untarlo sobre llagas y heridas para
alcanzar una rápida cicatrización. Por otro lado, el humo que emerge al quemar la planta ha
devenido tratamiento contra el asma. En infusión, preparada con las hojas e ingerida antes o
después de comer, puede cumplir una triple función: aliviar la tos, atacar afecciones del hígado y
prevenir espasmos intestinales. Ya como alcanfor se le atribuye efecto hipertensor, por lo cual llega
a subir la tensión y tonificar la circulación de sangre.
26
Figura 9. Forma comercial del Romero
Fuente: (Herdibel, 2015)
Alonso (2004) defiende que, según han revelado experimentos con animales, determinados
extractos, aceites esenciales y componentes aislados de esta planta consiguen relajar. Actúan de tal
modo sobre los músculos lisos traqueales, vasculares e intestinales.
A propósito, al examinar los efectos favorables de varias sustancias constituyentes,
sobresale que los flavonoides califican en calidad de antioxidantes, de manera que coadyuvan a la
eliminación de los radicales libres y frenan el desarrollo de las células precancerosas (Gardens,
2010). De conjunto con los anteriores, inciden los taninos. Ya el ácido rosmarínico, al pasar bien al
tracto gastrointestinal y la piel, acrecienta la producción de prostaglandina E2 y disminuye la de
leucotrieno B4 en los leucocitos polimorfonucleares humanos (Alonso, 2004).
Semejante al Tomillo, el Romero puede presentar efectos secundarios y contraindicaciones.
El criterio de Gardens (2010) al respecto se sustenta en que no debe anularse la probabilidad de que
provoque reacciones alérgicas –en mayor medida, dermatitis por contacto– en personas sensibles.
Tampoco lo recomienda (sobre todo, sus aceites esenciales) sin previa consulta médica, a aquellas
con alergias respiratorias, cálculos biliares, gastritis, úlceras gastroduodenales, embarazadas,
lactantes o niños pequeños.
En varios de los textos y materiales consultados a lo largo de la actual investigación, se han
constatado referencias directas a la actividad antibacteriana de la especie de marras: Rosmarinus
officinalis. Llaman la atención, a partir de dicha peculiaridad, los estudios realizados en el campo
de la odontología.
Alves & Col (2008), por ejemplo, analizan en qué medida el extracto hidroalcóholico de la
citada planta incide sobre microorganismos concurrentes en el biofilm supragingival: Streptococcus
mutans (ATCC 25175) y Streptococcus mitis (ATCC 9811). Y aunque observan halos de
27
inhibición20
del crecimiento bacteriano, de 11 a 20 mm, estos no parecen ser los únicos; también la
clorhexidina al 0,12 por ciento (control positivo) los muestra, en el orden de 11 a 18 mm.
Estudios difundidos por Stranburger hacia el año 2009 develan que el aceite esencial del
Romero actúa frente a bacterias que atacan no solo el tracto gastrointestinal; también la cavidad
oral. De igual forma, los extractos hidroalcohólicos como el que se obtiene específicamente de la
hoja de la planta en cuestión, capaz de afectar la membrana celular durante la etapa mitótica de las
Gram negativas y Gram positivas.
Wilhen (2010) menciona algunas bacterias susceptibles: S. aureus, Escherichia coli,
Salmonella spp. y Listeria monocytogenes. Jarrar (2010) da a conocer la incidencia fungicida y
fungiostática sobre cepas clínicas de C. glabrata, C. albicans y C. tropicalis, aisladas de la cavidad
oral de pacientes tratados con antibióticos por un tiempo prolongado.
En el caso particular del Streptococcus mutans, afirman otros expertos que ha quedado
asimismo demostrado. Abreu & Col (2012) informan acerca de la evaluación “in vitro” de la
actividad bactericida y bacteriostática de tinturas de Romero, frente a cepas estandarizadas del
mencionado microorganismo y del Streptococcus oralis. Puntualizan que la Concentración Mínima
Inhibitoria (MIC) se ha determinado a través de la técnica de microdilución. 24 horas después de
utilizar tinturas entre 100 y 0,78 mg/ml, y un 0,12 por ciento de clorhexidina, la lectura por el
método visual revela ante ellos que las primeras sí actúan en calidad de bactericidas y
bacteriostáticas a una MIC de 0,78 mg/ml. No obstante, la acción de la segunda es superior.
Un resultado casi idéntico han obtenido Pinheiro & Col (2012). Han demostrado, alegan, la
actividad antimicrobiana de la Rosmarinus officinalis –al igual que de la Mikania glomerata y
Calendula officinalis– a concentraciones bajas, frente al Streptococcus mutans y Streptococcus
oralis. Pero, otra vez, la acción bactericida y bacteriostática de la clorhexidina ha rebasado la
exhibida por las tinturas.
Por su parte, Teixeira (2012) comparte lo arrojado por una investigación con once
voluntarios sometidos a un enjuague bucal21
con placebo, clorhexidina al 0,12 y extracto de
Rosmarinus officinalis. Luego de tres fases de catorce días, advierte él que, con el uso de la tercera
solución, el 54 por ciento de las personas presenta buena higiene –lo cual dice de la acción
antimicrobiana del Romero, al menos “in vivo”, sobre bacterias orales presentes en la biopelícula.
20 No así frente al Streptococcus sanguis (ATCC 10557). 21 Para poder determinar el grado de acción de las soluciones en la biopelícula, se recurre aquí al índice de higiene oral
simplificado (Texeira, 2012).
28
No obstante, nuevamente aparece un valor mayor ligado a la utilización de la clorhexidina: el 64
por ciento evidencia una buena higiene, y poco menos del 36, una limpieza de carácter regular.
2.4 Medios de cultivo
La etnofarmacología ha permitido contar en el presente con un registro significativo de
medicamentos elaborados a partir de hierbas. Pero el uso tradicional de estas no basta cuando se
trata de validar la eficacia de las plantas –consideradas medicinales por la población–, en la
prevención o el tratamiento de enfermedades. También se requiere cientificidad.
A propósito, en el ámbito de la terapéutica estomatológica se busca probar igual, por
ejemplo, la actividad antimicrobiana de los productos naturales22
. Según Reyes (2015), con el
ánimo de conseguir medicamentos más potentes, se han tenido en cuenta no pocas especies23
al
investigar la acción microbiológica en patógenos orales como las bacterias del biofilm, causantes
de infecciones.
En síntesis, se trata de “determinar los principios activos de las plantas medicinales y
estudiar su actividad en el organismo para después aislarlos, obtenerlos y avalar los usos que la
medicina popular le atribuye a diversas especies vegetales” (Reyes, 2015, p.74).
Ahora… ¿cómo se hace? Para empezar, a través de métodos/técnicas microbiológicas –
dígase cuantitativos(as) y semicuantitativos(as)24
. Se lleva a cabo el desarrollo25
in vitro o in vivo.
Explican Casado, Torrico & Medina (2012) que “el material alimenticio en el que crecen
los microorganismos es el medio de cultivo26
” (p.3). De acuerdo con su consistencia, puede
clasificarse en sólido o líquido (caldos). El primero, se recomienda cuando urge detectar las
diversas clases de bacterias que se encuentran en una muestra amplia a analizar. El segundo, si lo
que se requiere es aislar una bacteria que se halla en una concentración muy baja.
22 Incluye fracciones, extractos y sustancias aisladas. 23 Tras una revisión bibliográfica, Reyes (2015) asevera que 66 especies –pertenecientes a 38 familias, sobre todo las de Anacardiaceae, Lamiaceae y Myrtaceae– muestran, sobre patógenos orales, actividad antimicrobiana in vitro de extractos de plantas. 24
Para Linossier, Vargas, Zillmann, Arriaga, Rojas, & Villegas (2003), su mayor utilidad radica en que posibilita dar
seguimiento al grado de infección salival de Streptococci mutans antes y después de tratamientos odontológicos. Asimismo, garantizar la prevención de caries dentales, pues permite realizar tamizajes poblacionales más extensos. 25 Toma en consideración si aparecen cepas bacterianas resistentes (Reyes, 2015). 26 En palabras de Casado, Torrico & Medina (2012), “se han preparado más de 10 000 medios de cultivo diferentes”
(p.3).
29
En cualquier caso, este preparado artificial en el laboratorio incluye agar27
, gelatina28
u otro
elemento solidificante; así como colorantes29
.
Bibliografía especializada puntualiza, además, que los referidos microorganismos requieren
condiciones óptimas para crecer de forma adecuada en un entorno artificial, o sea, para que se dé el
cultivo. Intervienen: la luz ambiental, temperatura, humedad, oxígeno, acidez (pH), esterilidad,
ciertos factores de crecimiento y nutrientes –hidratos de carbono30
, suero y sangre31
…, cuya
composición semeja la de los líquidos orgánicos humanos.
Autores como Westergreen & Krasse (1978); Köhler & Bratthall (1979); Van Palenstein,
Helderman, & Ijsseldijk (1983); Jensen & Bratthall (1989); Dasanayake, Caufield, Cutter,
Roseman, & Köhler (1995); Linossier, Vargas, Villegas, & Chimenos (2002) han descrito en
detalle los medios de cultivo realizados en saliva y placa bacteriana. Así también se determina el
nivel de infección por Streptococcus mutans y se vincula con la proliferación de caries dental
(Krasse, 1988).
Figuran, dentro del método semicuantitativo, por mencionar, el Cariescreen â y el
Dentocult â. Entre los medios de cultivo, los de tipo líquido TYCBS32
y mitis salivarius33
(Cruz,
2010).
La evaluación34
de fracciones, extractos y sustancias, tiene lugar entonces mediante
microdiluciones en caldo, ante aislados de los microorganismos. Se conoce, en general, como
método de difusión o dilución en pozos de agar nutritivo –a juicio de Reyes (2015), el más
conocido para analizar la actividad antimicrobiana de las plantas.
27 Modo de preparación: Se licúa a la temperatura de ebullición del agua. Luego se solidifica, cuando se enfría a 40 grados. Salvo en mínimos casos, no repercute en el crecimiento de las bacterias, y estas no lo atacan (Casado, Torrico, & Medina, 2012). 28 Menos utilizada, pues disímiles bacterias ocasionan su licuación (Casado, Torrico, & Medina, 2012). 29 Devienen indicadores –cuando permiten detectar, por citar, la formación de ácido– o inhibidores –cuando frenan el crecimiento de ciertas bacterias. ¿Ejemplos? Rojo Fenol y Violeta de Genciana, respectivamente (Casado, Torrico, & Medina, 2012). 30 Su empleo se debe a que logran acrecentar el valor nutritivo del medio y facilitar la detección de reacciones de
fermentación de los microorganismos (Casado, Torrico, & Medina, 2012). 31 Casado, Torrico & Medina (2012) señalan que tanto el suero como la sangre fomentan el crecimiento de los microorganismos que revelan menor resistencia. 32 T= casitone; Y= extracto de levadura; C= cistina; S= sacarosa; B= bacitracina. 33 Van Palenstein, Helderman & Ijsseldijk (1983) establecen una comparación entre el TYCSB y el mitis salivarius como medios selectivos. Opinan entonces que el primero resulta más sensible que el segundo para cuantificar el Streptococci mutans. 34 Reyes (2015) se remite a cuantiosas investigaciones para asegurar que los extractos de Psidium guajava L, Anacardium
occidentale L, Lippia Cham; los aceites esenciales de Lippia Cham, Lippia alba, Mentha L., Mentha piperita L y C. sylvestris Sw; y 58 productos químicos –entre flavonoides, fenoles, ácidos fenólicos, quinonas, cumarinas, terpenos y compuestos aromáticos policíclicos– aislados de 19 plantas, inhiben el crecimiento del Streptococcus mutans.
30
2.4.1 Mueller Hinton (Escala de McFARLAND)
En las pruebas de sensibilidad antimicrobiana con métodos de difusión o dilución en agar,
uno de los medios nutritivos de aislamiento utilizados es el Agar Mueller-Hinton (Agar M-H).
Permite “determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) de los microorganismos frente a
los antimicrobianos” (Laboratorios Britania S.A., s.f., p.1): en el caso de determinadas especies de
Estreptococoss u otras exigentes nutricionalmente, con agregado de sangre (de carnero, al 5 por
ciento); y para evaluar Pseudomonas, con el de ciertos cationes.
En general, se orienta:
Tabla 9. Indicaciones por grupos de microorganismos
Fuente: (Laboratorios Britania S.A., s.f.)
Expertos lo recomiendan a nivel global. No en vano, lo reconoce la Organización Mundial
de la Salud (OMS) y suele recurrir a él el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), antes
National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).
Casado, Torrico & Medina (2012) exponen como argumentos “su alta reproducibilidad35
,
su bajo contenido de substancias inhibidoras36
y el crecimiento satisfactorio que presentan la
mayoría de los patógenos no fastidiosos” (p.21). También dados los datos extra que provee y su
composición –en coherencia con la fórmula que designada por la OMS:
Tabla 10. Composición del Agar Mueller-Hinton (*g/l de agua destilada)
35 Tanto en forma de agar como en medio sólido para la realización de antibiograma, pues igual manifiesta reproductibilidad lote a lote (Laboratorios Britania S.A., s.f.). 36 En lo fundamental, para trimetoprima, tetraciclinas y sulfamidas (Laboratorios Britania S.A., s.f.).
31
Fuente: (Laboratorios Britania S.A., s.f.)
Así, es posible advertir las etapas que cursa el medio de cultivo, a partir de las
características que adquiere el producto: deshidratado –homogéneo, color beige, libre
deslizamiento–; preparado –color ámbar claro–; suplemento con sangre –color rojo con tono
cereza– (Laboratorios Britania S.A., s.f.).
Según explican Casado, Torrico & Medina (2012), “en este medio la infusión de carne y la
peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas, carbón y aminoácidos. El almidón es
agregado para absorber cualquier metabolito tóxico y el agar es adicionado como agente
solidificante” (p.21).
Queda especificado en varios textos que, en pos de resultados verídicos, es preciso
estandarizar la composición del Agar M-F. Ello, aportando concentraciones establecidas de MgCl2,
CaCl2 y ZnCl2. Ocurre que al variar el número de cationes Mg2+ y Ca2+, se ve afectada la CIM
para Pseudomonas aeruginosa, en presencia de aminoglucósidos; y para Staphylococci, con
tetraciclina.
El proceso ha de darse bajo las siguientes condicionantes:
32
Tabla 11. Condicionantes para el medio de cultivo Agar M-
H
Fuente: (Laboratorios Britania S.A., s.f.)
A propósito, es necesario aclarar que “los patrones de McFarland se utilizan como patrones
de turbidez en la preparación de suspensiones de microorganismos. El patrón 0,5 de McFarland
tiene una aplicación especial en la preparación de inóculos bacterianos para la realización de
pruebas de sensibilidad antimicrobianas” (BD, 2005, p.1).
Apremia tener en cuenta asimismo que este medio de cultivo tiene limitaciones. Exige la
realización de controles con asiduidad, para velar por sus propiedades fisicoquímicas y su
desempeño a nivel microbiológico.
33
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
La metodología de la investigación se puede conceptualizar como el conjunto de
procedimientos, métodos, técnicas, principios, categorías… que permiten organizar las actividades
del proceso investigativo, con la finalidad de enfocar los problemas y definir las respuestas
(Hernández & Coello, 2011).
3.1 Enfoque de la investigación
En función de los objetivos planteados, el actual estudio adquirió un enfoque cuantitativo,
pues recurrió a “la recolección de datos para probar hipótesis, con base en la medición numérica y
el análisis estadístico” (Hernández, Fernández, & Baptista, 2010, p.4). Se pretendió identificar,
mediante la información estadística arrojada, la efectividad de inhibición de los extractos de
Tomillo y Romero (al 10%) frente al Streptococcus mutans.
3.2 Alcance de la investigación científica
Según Hernández et. al. (2010), los alcances “resultan de la revisión de la literatura y de la
perspectiva del estudio”. De igual forma, “dependen de los objetivos del investigador para
combinar los elementos en el estudio” (p.77), que puede ser exploratorio, descriptivo, correlacional
o explicativo.
En función de lo expuesto anteriormente, este trabajo tuvo un alcance correlacional, toda
vez que su finalidad radicó en “conocer la relación o grado de asociación (…) entre dos o más
conceptos, categorías o variables, en un contexto en particular” (Hernández et. al., 2010, p.8. En el
presente caso, se analizó el vínculo entre la efectividad de inhibición de los extractos de Tomillo y
Romero y el Streptococcus mutans.
3.3 Diseño de investigación
El diseño de investigación es el “plan o estrategia que se desarrolla para obtener la
información que se requiere en una investigación” (Hernández, et. al., 2010, p.120). Existen dos
tipos: experimental y no experimental.
En el estudio aquí expuesto aplicó la primera clasificación: experimental; entendiendo por
experimento aquella “situación de control en la cual se manipulan, de manera intencional, una o
más variables independientes (causas) para analizar las consecuencias de tal manipulación sobre
34
una o más variables dependientes (efectos)” (Hernández et. al., 2010, p.123). El correspondiente a
esta investigación se realizó en un laboratorio, donde se manipularon las variables de forma tal que
se aprobara o rechazara la hipótesis en función de los resultados obtenidos.
3.4 Universo y muestra
Fueron evaluadas, a partir de una unidad de sedimento liofilizado de Streptococcus mutans
con referencia ATCC 35668, 20 unidades experimentales (cajas Petri con Agar Mueller Hinton
suplementado con 5% de sangre de cordero).
3.4.1 Criterios de inclusión
Se tuvieron en consideración cultivos del género Streptococcus y especie mutans sin
contaminación, así como extractos de Tomillo y Romero (al 10%) sin contaminación de otro tipo
de plantas.
3.4.2 Criterios de exclusión
No se tuvieron en cuenta cultivos contaminados o que contuviesen otro tipo de
microorganismos fuera del que se pretendió estudiar, bajo condiciones anormales que no
conviniesen a la investigación. Tampoco, otro tipo de agar que no fuese Mueller Hinton; o
extractos diferentes a los requeridos.
3.5 Operacionalización de las variables
3.5.1 Dependientes
VARIABLE CONCEPTO INDICADOR ESCALA FUENTE
EFECTIVIDAD DE
INHIBICIÓN DEL
TOMILLO
La inhibición es
el resultado de inhibir; y
este verbo, derivado del
latín inhibere, significa
suspender o impedir.
Halo de
inhibición
Milímetros
(mm)
Actividad
antimicrobiana
EFECTIVIDAD DE
INHIBICIÓN DEL
ROMERO
La inhibición es
el resultado de inhibir; y
este verbo, derivado del
latín inhibere, significa
suspender o impedir.
Halo de
inhibición
Milímetros
(mm)
Actividad
antimicrobiana
35
3.5.2 Independientes
VARIABLE CONCEPTO INDICADOR ESCALA FUENTE
PORCENTAJE
DEL
EXTRACTO DE
TOMILLO
Sustancia que se extrae de o
tra por varios
procedimientos, y que,
en forma
concentrada, posee su
virtud característica.
Solución acuosa Milígramos
por mililitro
(mg/ml)
Hojas de
Tomillo con
500ml de agua
destilada
PORCENTAJE
DEL
EXTRACTO DE
ROMERO
Sustancia que se extrae de o
tra por varios
procedimientos, y que,
en forma
concentrada, posee su
virtud característica.
Solución acuosa mg/ml Hojas de
Romero con
500 ml de
agua destilada
3.6 Aspectos éticos
Para poder llevar a cabo esta investigación, resultó imprescindible la aprobación de los
comités de ética tanto de la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador como
de la propia institución de Educación Superior.
37
3.7 Identificación de equipos y materiales
Tabla 12. Equipos, funciones y aplicaciones específicas
Equipo Función Aplicación específica
Balanza analítica RADWAG
AS 310/C/2. Detección máxima
310g. Precisión 0.1mg
Medir masa con una preción de 0,1mg Peso de hojas de Tomillo, Romero, agar base de sangre y
Mueller Hinton
Cabina de seguridad
biológica IIA ESCO,
AIRSTREAM Sentinel Gold
Equipo con sistema de filtros HEPA para mantener y
controlar la esterilidad del aire y del ambiente dentro de la
superficie de la cabina. Protege de la contaminacion
microbiana ambiental los elementos que se trabajan dentro
de la cabina por el sistema de filtración de aire y flujo
laminar
Filtración de extractos acuosos de Tomillo y Romero, e
impregnación de estos y los controles en discos de papel
filtro estériles
Bomba peristàltica BT100
Langer Instruments
Instrumento de gran utilidad en la distribución a
repetición de volúmenes constantes de líquido de un
recipiente a otro
Preparación de medio de cultivo Mueller Hinton
suplementado con 5% de sangre desfibrinada de cordero.
Establece homogeneidad en el volumen de vertido en cada
caja Petri, correspondiente a 25ml cada una
Hornilla eléctrica Instrumento de calentamiento a partir de energía
eléctrica sobre una resistencia. Facilita la ebullición de
Ebullición de Tomillo y Romero en agua destilada estéril
para obtención de los extractos acuosos
38
soluciones acuosas siempre que estén en un recipiente
resistente al calor
Mechero de bunsen
Instrumento de ignición controlada de combustible gas
licuado de petróleo, útil para mantener áreas
proporcionales al alto de la llama de combustión completa
libres de microorganismos contamiantes
Mantenimiento de ambiente estéril en el proceso de
preparación de medios de cultivo, preparación de extractos
acuosos de Tomillo y Romero; y ejecución del protocolo del
experimento: siembra del microorganismo en la superficie
del agar Mueller Hinton suplementado con 5% de sangre
desfibrinada de cordero, colocación de los discos de papel
filtro y lectura de los halos de inhibición
Autoclave Tuttnauer M2040
semiautomático
Instumento de esterilización en base a calor húmedo.
Logra un incremento de temperatura interna de 121C, 1
atmósfera de presión por 20 minutos
Esterilización de materiales de vidrio, agua destilada,
agar base de sangre y agar Mueller Hinton a 121 grados
centígrados durante 15 minutos, pinzas y discos de papel
filtro
Incubadorade CO2 ESCO
Intrumento de calentamiento controlado, mantiene un
ambiente interno a 36-37 grados centígrados y 5% de CO2.
Tiene un sistema de conexión y control de ingreso de gas
CO2 y oxígeno interno
Incubación del microorganismo de prueba en ambiente
del 5% de CO2 una vez inoculado en la superficie de las
placas Petri con agar base de sangre o agar Mueller Hinton
suplementado con 5% de sangre de cordero y ubicados los
discos de papel filtro, impregnación con las soluciones de
39
prueba
Pipeta semiautomática 20-
200ml
Intrumento de medición de volumen con alta precisión Medida de 20ml de solución de prueba y controles para
dispensar sobre cada disco de papel filtro aisgnado para el
experimento
Plancha magnética caliente
Instrumento para incremento de temperatura controlada
y agitación magnética al mismo tiempo
Preparación del medio de cultivo agar Mueller Hinton y
agar base de sangre. Una vez pesado, se agrega el agua
destilada y se lleva a calentamiento hasta que el soluto se
haya disuelto completamente. El agitador magnético es de
gran ayuda dado que facilita la homogenización de la
solución y evita que el agar se queme en el fondo del frasco
Vaso de precipitación
1000ml, 500ml
Recipiente cilíndrico de borosilicato pyrex (resistente a
cambio de temperatura sobre todo calor)
Preparación de extractos de Romero y Tomillo
Erlenmeyer 1000ml Recipiente de forma troncónica de borosilicato Pyrex Preparación de extractos de Romero y Tomillo
Cuchara plástica desechable Utensillo de cabeza cóncava en el extremo Pesaje de las hojas de Romero y Tomillo, agar base de
sangre y agar Mueller Hinton deshidratados
Probeta de vidrio de 500ml Instrumento de vidrio cilíndrico, útil en la medición
precisa de volúmenes
Medición de volumen del agua destilada para los
extractos y para la preparación del agar
40
Botella tapa rosa azul 500ml Recipiente cilíndrico de borosilicato Pyrex con tapa
rosca
Almacenamiento de los extractos en refrigeración para la
maceración y dispocisión final del filtrado
Caja Petri de vidiro de
90mm de diámetro x 15mm de
alto
Recipiente redondo de borosilicato con una cubierta de
la misma forma y de mayor diámetro
Preparación del medio de cultivo sólido, agar sangre de
cordero 5% y Mueller Hinton suplementado con 5% de
sangre de cordero
Embudo de borosilicato de
90mm de diámetro
Instrumento de borosilicato de forma cónica Filtración de los extractos de Tomillo y Romero
Papel filtro Papel hecho de derivados de celulosa cortado de forma
circular con porosidad
Eliminación de partículas sólidas de los extractos
macerados de Romero y Tomillo
Hisopos estériles
Instumento con forma de bastoncillo de madera y punta
de algodón
Inoculación de una solución McFarland 0.5 del
microorganismo de prueba en la superficie del agar sangre
de cordero
Discos de papel filtro de
6mm de diámetro
Discos de papel derivado de la celulosa de color
blanco con un diámetro de 6,00 mm y un peso de 30mg +/-
4 por centimetro cuadrado. Sin agentes inhibidores del
crecimiento microbiano
Impregnación de extractos de Romero y Tomillo y
controles agua destilada y clorhexidina para la prueba de
evaluación de actividad antimicrobiana con técnica de
difusión de disco
41
Cinta de autoclave
Cinta autoadhesiva de papel semicrepado de celulosa,
con un indicador químico impregando de forma diagonal,
que cambia de color ha negro cuando a pasado un proceso
de esterilización con vapor
Control químico del proceso de esterilización de
materiales y agares
Puntas de pipeta plásticas
desechables 20-100ml
Dispositivos plásticos cónicos estériles Utilizado en la punta de la pipeta sirve para tomar el
volumen requerido de extractos y controles, y dispensarlo
luego sobre los discos de papel filtro
Pinzas metálicas Instrumento para sujetar cosas, compuesto de diez
piezas alargadas
Colocación de discos de papel filtro sobre la superficie
del agar
Agar base de sangre
Medio de cultivo complejo deshidratado, basado en
extractos de proteínas y azúcares
Revitalización y cultivo inicial del microorganismo de
prueba (Streptococcus mutans). Una vez eesterilizado, se
suplemnta con 5% de sangre de cordero
Agua destilada estéril Agua libre de sales que ha pasado por un proceso de
esterilización en autoclave
Hidratación de medios de cultivo y preparación de
extractos. Control negativo de la inhibición del crecimiento
Sangre desfibrinada de
cordero
Sangre fresca de corderos sanos sin tratamiento
antimicrobiano o aniparasitarios recién desfibrindada con
mezcla continua con perlas de vidrio durante dos horas
Suplemento de agar base de sangre y Mueller Hinton
agar, requerimietno nutricional específico de
microorganismos exigentes como los Streptococcus
42
Clorexidina 2% Solución con efecto antimicrobiano conocido, de uso
común en procesos odontológicos
Control de inhibición del crecimiento del microorganimo
de prueba en el ensayo
Calibrador o pie de rey Instrumento destinado a la medida de pequeñas
longitudes y espesores, profundidades y diámetros
Medida de halos de inhibición del crecimiento
microbiano alrededor del disco de papel filtro
43
3.8 Procedimiento
3.8.1 Preparación de los extractos
Se prepararon dos extractos acuosos de las plantas objeto de estudio: Thymus vulgaris
(Tomillo) y Rosmarinus officinalis (Romero), al 10%. La elección de dicho valor obedeció a los
resultados compartidos por Dávila (2013), junto a su estimación de que dicha concentración es la
equivalente a los preparados o remedios caseros.
Luego se pesaron 50g de las hojas de dichas plantas secas y pulverizadas, en 500 ml de
agua destilada estéril. La preparación fue calentada en constante agitación durante 30 minutos.
Seguidamente, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se maceró a lo largo de 12 horas en
temperatura de refrigeración (entre 2 y 8 grados centígrados). Concluida la maceración, se procedió
a filtrar los extractos con papel filtro número 4. El sobrenadante fue envasado en frascos de vidrio
estériles, y mantenidos bajo refrigeración hasta el día del ensayo (Dávila B, 2013).
Figura 10. Extracto de Tomillo
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor(a): Eliana Ortega Salazar
44
Figura 11. Extracto de Romero
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
3.8.2 Medios de cultivo
Se preparó el medio de cultivo agar Sangre de Cordero 5% y Mueller Hinton en placas
Petri de vidrio de 90mm. El agar Sangre de Cordero obtuvo diluyendo 40g de medio deshidratado
por litro de agua destilada, y fue utilizado en el mantenimiento de la cepa microbiana; mientras
que, para la preparación de Mueller Hinton (28g/l), se consideró el espesor de 4mm más menos
0.5mm, y se midió el pH a 25°C, consiguiendo uno de 7.39 –apto para hacer antibiogramas.
Mueller Hinton fue suplementado con 5% de sangre liofilizada de cordero, de acuerdo con el
requerimiento nutricional del microorganismo en estudio: Streptococcus mutans ATCC 35668.
45
Figura 12. Agar Mueller Hinton
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
3.8.3 Microorganismo en estudio
El inóculo microbiano consistió en una elución de dos o tres colonias aisladas de
Streptococcus mutans ATCC 35668, que previamente se mantuvo en incubación a 37°C durante 24
horas, con pases sucesivos en agar Sangre de Cordero al 5%. La elución se preparó en solución
salina 0.85% estéril, hasta alcanzar una turbidez del 0,5 de la escala de McFarland (1-2x108
UFC/ml). Así quedó en las placas de Mueller Hnlton, a partir de la utilización de hisopos estériles.
Con las mismas se ejecutó el ensayo de Kirby Bauer (difusión de disco) para evaluar el probable
efecto antimicrobiano de las sustancias en estudio.
Se contó con el calor generado por la combustión completa de un mechero a gas. Ello
impidió la contaminación de los inóculos, es decir, que constituyó una estrategia de esterilización
en el proceso realizado.
Se evaluó finalmente la susceptibilidad del Streptococcus mutans ATCC 35668 mediante el
análisis de halos de inhibición en el medio de cultivo.
46
Figura 13. Inóculo del cultivo
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
3.8.4 Evaluación del efecto antimicrobiano por difusión con disco
Se prepararon discos de papel filtro de 6mm de diámetro estériles, los cuales fueron
impregnados con 20 microlitros de las soluciones de prueba correspondientes a los extractos de
Tomillo y Romero, así como también de los controles: clorhexidina 2% y agua destilada estéril.
Resultó necesario acondicionar todo 48 horas previas al análisis los discos de papel filtro en un
número de 80, cada uno con un diámetro de 6mm. Sumaron 20 los papeles embebidos con 20 ml de
cada sustancia analizada.
Tratamiento 1.- Agua destilada estéril
Tratamiento 2.- Solución de clorhexidina 2% como control positivo
Tratamiento 3.- Extracto de Tomillo
Tratamiento 4.- Extracto de Romero
Con otro hisopo estéril se introdujo en el tubo de ensayo con la elución del microorganismo
y agua destilada –analizada según la escala de McFarland. Posteriormente, se distribuyó con
uniformidad, de manera que se sembrara la misma concentración en toda la superficie del medio
Mueller Hinton.
Cada cuatro inóculos, se volvió a remojar el hisopo para evitar su desecación. Y se
procedió de la misma forma en todas las cajas.
47
Con una pieza de acero inoxidable, flameada, estéril, se colocaron los discos impregnados
con las soluciones de prueba y control, preparados en los lugares asignados con la rotulación en
cada caja Petri. Las unidades experimentales así preparadas, fueron incubadas a 37°C por 48 horas
en un ambiente microaerofílico para favorecer el crecimiento del microorganismo en estudio.
Una vez cumplido el tiempo de incubación, se midieron los halos de inhibición del
crecimiento microbiano alrededor del disco, con un calibrador.
Figura 14. Pipetear los discos
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
48
3.8.5 Grupos de estudio
Tabla 13. Grupos de estudio
Soluciones Agua destilada
estéril
Solución de
clorhexidina al
2%
Extracto de
Tomillo
Extracto de
Romero
Bacteria:
Streptococcus
mutans
G1 G2 G3 G4
3.8.6 Medición del efecto antimicrobiano
La medición del efecto antimicrobiano sobre el Streptococcus mutans se determinó a través
de la técnica de halos de inhibición que se formaron alrededor de los discos colocados en las
placas, impregnados con las sustancias sometidas a estudio. Estos se midieron en milímetros con la
ayuda de una regla.
49
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
En el presente capítulo se ubicó el análisis del efecto inhibidor de los extractos de Tomillo
y Romero frente a la bacteria Streptococcus mutans, usando un medio de cultivo que podría
semejar las condiciones de la boca.
Aunque las interpretaciones se basaron en un análisis estadístico de los datos en torno al
tamaño de los halos de inhibición, fue preciso tener en cuenta que existen varios factores capaces
de influir sobre su valor. Por citar: “el medio de cultivo en que se realiza la prueba, capacidad de
difusión del compuesto, cantidad de inóculo, el tiempo de generación del microorganismo,
sensibilidad al antibiótico, y el período de incubación” (Stella & Castaño, 2009, p.264).
Se consideró entonces la importancia de desarrollar siempre un proceso estándar respecto
al uso de dichos factores, pues la aplicación incorrecta de cualquiera de estos podría afectar los
resultados del experimento.
4.1 Metodología para la interpretación de los resultados
Para examinar el efecto inhibidor de los extractos de Tomillo y Romero se llevó a cabo un
análisis estadístico sobre la base del tamaño promedio del diámetro del halo de inhibición. Ello
implicó, en primer término, la realización del Análisis de Varianza de un factor (ANOVA).
Consistió en “una prueba estadística para analizar si más de dos grupos difieren significativamente
entre sí en cuanto a sus medias y varianzas” (Hernández et. al., 2010, p.322).
Así, se indagó acerca de la existencia de diferencias significativas entre los promedios de
los valores de los halos de inhibición obtenidos con las sustancias utilizadas: agua destilada,
clorhexidina al 2%, extractos de Tomillo y Romero.
Luego se aplicó la Prueba de Tukey para determinar cuál o cuáles sustancias
proporcionaron valores promedios de halos de inhibición estadísticamente distintos de los demás,
ya que dicho test permite estudiar “entre qué medias hay diferencias estadísticamente
significativas” (Álvarez, 2007, p.558).
Por último, se midió el efecto inhibitorio de los extractos de Tomillo y Romero sobre la
bacteria Streptococcus mutans, teniendo en cuenta la comparación de los resultados obtenidos en el
experimento con lo expresado en la escala de Duraffourd (1983; citada por Lagos, 2012), que
consiste en “determinar cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según el diámetro de los
halos de inhibición” (p.55).
50
4.2 Análisis estadístico
A continuación aparecen los resultados obtenidos tras la medición de los halos de
inhibición del crecimiento microbiano alrededor de cada disco de prueba, en mm, una vez
cumplido el tiempo de incubación.
Tabla 14. Resultados
Repetición H2O Clorhexidina Tomillo Romero
1 6 16 6 6 2 6 15 6 6
3 6 16 6 6
4 6 20 6 6 5 6 20 6 6
6 6 20 6 6
7 6 19 6 6 8 6 17 6 6
9 6 17 6 6
10 6 20 6 6
11 6 14 6 6 12 6 22 6 6
13 6 16 6 6
14 6 17 6 6 15 6 15 6 6
16 6 15 6 6
17 6 17 6 6
18 6 17 6 6 19 6 17 6 6
20 6 16 6 6
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
A partir de la información precedente, se aplicó el Análisis de Varianza de un factor para
examinar si las sustancias ocasionaban resultados estadísticamente iguales, o si al menos uno de
estos arrojaba resultados diferentes, en cuyo caso se consideró la aplicación de la Prueba de Tukey.
El procesamiento de los datos se efectúo con el Software SPSS 23, herramienta estadística
que facilita el análisis de datos.
4.2.1 Análisis de Varianza y Prueba de Tukey
Para la aplicación del Análisis de Varianza de un factor, se establecieron las siguientes
hipótesis:
H0: No existen diferencias significativas entre las medias de los valores del halo de
inhibición (todas las sustancias utilizadas producen el mismo efecto en el crecimiento microbiano).
51
H1: Existen diferencias significativas entre las medias de los valores del halo de inhibición
(ninguna de las sustancias utilizadas produce el mismo efecto en el crecimiento microbiano).
En este caso, el factor estuvo relacionado con el “tipo de sustancia”; y el “diámetro del halo
de inhibición” constituyó la variable respuesta.
Se planteó que, si la significación de la prueba era menor que 0,05, entonces se rechazaba
la hipótesis nula (H0) y, por tanto, se aceptaba la alternativa (H1).
Tabla 15. ANOVA
Suma de
cuadrados gl
Media
cuadrática F Sig.
Entre grupos 1915,350 3 638,450 550,138 ,000
Dentro de grupos 88,200 76 1,161
Total 2003,550 79
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
De acuerdo con los resultados arrojados por el SPSS, la significación fue de 0,00 –menor
que 0,05. En coherencia, se rechazó la hipótesis nula y se constató que existen diferencias
significativas. Lo anterior dejó ver que no todas las sustancias utilizadas produjeron el mismo
efecto en el crecimiento microbiano; al menos una de estas mostró valores distintos.
Para identificar entonces dónde radicaban las diferencias, se aplicó la Prueba de Tukey.
Con dicho test se lograron observar las comparaciones múltiples que permitieron comprobar si el
efecto de una sustancia específica difería del de la otra, en cuyo caso el valor de la significación
sería menor de 0,05 –criterio establecido para arribar a tal conclusión.
52
Tabla 16. Comparaciones múltiples de Tukey
Variable dependiente: Halo de inhibición
HSD Tukey
(I)
Tipo
de
Susta
ncia
(J) Tipo de Sustancia
Diferencia de
medias (I-J)
Error
estándar Sig.
95% de intervalo de
confianza
Límite
inferior
Límite
superior
Agua
destil
ada
estéri
l
Solución de Clorhexidina
(2%) -11,30000
* ,34066 ,000 -12,1949 -10,4051
Extracto de Tomillo ,00000 ,34066 1,000 -,8949 ,8949
Extracto de Romero ,00000 ,34066 1,000 -,8949 ,8949
Soluc
ión
de
Clorh
exidi
na
(2%)
Agua destilada estéril 11,30000* ,34066 ,000 10,4051 12,1949
Extracto de Tomillo 11,30000* ,34066 ,000 10,4051 12,1949
Extracto de Romero
11,30000* ,34066 ,000 10,4051 12,1949
Extra
cto
de
Tomi
Agua destilada estéril ,00000 ,34066 1,000 -,8949 ,8949
Solución de Clorhexidina
(2%) -11,30000
* ,34066 ,000 -12,1949 -10,4051
53
llo Extracto de Romero ,00000 ,34066 1,000 -,8949 ,8949
Extra
cto
de
Rom
ero
Agua destilada estéril ,00000 ,34066 1,000 -,8949 ,8949
Solución de Clorhexidina
(2%) -11,30000
* ,34066 ,000 -12,1949 -10,4051
Extracto de Tomillo ,00000 ,34066 1,000 -,8949 ,8949
*La diferencia de medias fue significativa en el nivel 0.05.
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
Teniendo en cuenta la información reflejada en la tabla de las comparaciones múltiples de
Tukey, se pudo apreciar que el efecto provocado por la aplicación de la solución de clorhexidina
fue estadísticamente diferente respecto al ocasionado por los extractos Tomillo y Romero, y el agua
destilada.
En la siguiente se incluyó la agrupación por subconjuntos. Así se dejó constancia de qué
sustancias produjeron los promedios del halo de inhibición estadísticamente iguales, y cuál generó
resultado distinto.
54
Tabla 17. Distribución de los promedios
HSD Tukeya
Tipo de Sustancia N
Subconjunto para alfa = 0.05
1 2
Agua destilada estéril 20 6,0000
Extracto de Tomillo 20 6,0000
Extracto de Romero 20 6,0000
Solución de Clorhexidina
(2%) 20 17,3000
Sig. 1,000 1,000
*Se visualizaron las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
Según se apreció, el subconjunto 1 lo conformaron las sustancias cuyos efectos fueron
estadísticamente iguales: extractos de Tomillo y de Romero, y agua destilada estéril. El
subconjunto 2, estuvo representado solamente por la solución de clorhexidina al 2%.
Para entender mejor semejante comportamiento, se diseñó el gráfico de medias. Dentro del
mismo, en el eje “X”, se ubicaron los cuatro tratamientos utilizados; en el “Y”, los promedios
alcanzados para cada uno.
55
Gráfico 1. Medias del halo de inhibición por sustancias
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
De tal forma, se comprobó que el único tratamiento con un comportamiento diferente fue la
solución de clorhexidina al 2%. Los extractos de Tomillo y Romero, al 10%, tuvieron igual
comportamiento respecto al promedio del tamaño del halo de inhibición de crecimiento
microbiano, así como el agua destilada.
4.2.2 Evaluación del efecto inhibidor de los extractos de Tomillo y Romero
El análisis expuesto en estas páginas se centró, específicamente, en el comportamiento de
los extractos de Tomillo y Romero. Tras las demostraciones estadísticas, se verificó que ambos
presentaron el mismo comportamiento respecto al efecto sobre los halos de inhibición del
crecimiento microbiano.
Pero, para llegar a ello, también fue necesaria la interpretación de la variación de los
resultados de ambos extractos en las 20 muestras tomadas de este experimento. Asimismo, la
comparación de los promedios de las dos sustancias en relación con los valores estándares
utilizados para este tipo de estudios.
56
Tabla 18. Estadísticos descriptivos
N Mínimo Máximo Media
Desviación
estándar
Agua destilada estéril 20 6,00 6,00 6,0000 ,00000
Clorhexidina al 2% 20 14,00 22,00 17,3000 2,15455
Extracto de Tomillo 20 6,00 6,00 6,0000 ,00000
Extracto de Romero 20 6,00 6,00 6,0000 ,00000
N válido (por lista) 20
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
Tal cual se puede contemplar en la tabla de estadísticos descriptivos, la media del tamaño
de los halos de inhibición producidos tras la aplicación de los extractos de Tomillo y Romero fue
de 6mm. Los valores mínimos y máximos de los efectos de ambos igual alcanzaron esa cifra.
Entonces quedó demostrado que ninguno de los mencionados extractos produjo variaciones
en el tamaño del diámetro de los halos de inhibición. Su comportamiento devino constante en las
20 muestras tomadas; de ahí que la desviación típica de los datos fuese 0,00 mm.
Todo ello condujo a la primera conclusión sobre la inexistencia de un efecto inhibitorio de
estas sustancias al 10% sobre el crecimiento de la bacteria Streptococcus mutans.
En un diagrama de cajas se visualizaron las variaciones en el comportamiento de los
tratamientos como resultado de las 20 muestras tomadas.
57
Gráfico 2. Diagrama de cajas
Fuente: (Laboratorio SAFEM LAB)
Elaborado por: Autora
Como se pudo advertir, los extractos de Tomillo y Romero no evidenciaron variaciones en
cuanto al diámetro del halo de inhibición que producen una vez que han sido impregnados. El
tamaño permaneció constante e invariable para las 20 muestras tomadas.
Al comparar tales datos con los de la clorhexidina al 2%, se apreció que la referida
sustancia sí arrojó resultados diferentes. Oscilaron entre 14mm y 22mm de diámetro de halo, con
más del 50% de los valores por encima de los 16mm –lo que supuso un efecto inhibidor sobre la
bacteria investigada.
Para proporcionar una mayor solidez a la interpretación de tales resultados, se consideró lo
expresado por Duraffourd (1983; citado por Lagos, 2012) y sintetizado a continuación:
58
Tabla 19. Escala de Duraffourd
Promedio de diámetro del halo de
inhibición
Efecto inhibitorio
D ≤ 8 mm Sensibilidad nula (no hay efecto
inhibidor)
9 mm ≤ D ≤ 14mm Sensible (efecto inhibidor intermedio)
15mm ≤ D ≤ 19 mm Muy sensible
D≥20 mm Sumamente sensible
Fuente: (Lagos, 2012, p.55)
Elaborado por: Autora
La media del diámetro del halo de inhibición provocado con el extracto de Tomillo fue de
6mm. Este valor se encontró por debajo de 8mm; por tanto, la sensibilidad de la bacteria ante esta
sustancia fue nula.
De igual forma se analizó el resultado del extracto de Romero, cuyo valor (6 mm) igual
estuvo por debajo de 8mm. Por consiguiente, resultó nula la sensibilidad de la bacteria ante este
tratamiento.
Hechos todos los razonamientos anteriores, se determinó que ni el extracto de Tomillo ni el
de Romero al 10% tuvieron tienen un efecto inhibitorio de la bacteria Streptococcus mutans,
usando un medio de cultivo que podría semejar las condiciones de la cavidad oral.
4.3 Discusión
Tal cual se expuso ya, en todo el orbe se han investigado por siglos disímiles plantas con
vistas a contribuir al cuidado de la salud bucal entre los seres humanos. En particular, las
denominadas científicamente Thymus vulgaris y Rosmarinus officinalis han sido examinadas en
diferente condición: extracto alcohólico, oleoso y acuoso –como en el actual estudio.
De acuerdo con la presentación y concentración del principio activo inherente a tales
ejemplares del reino vegetal, estos han mostrado diversos resultados. En el primero de los tres
casos mencionados antes, durante exámenes a bajas concentraciones.
La indagación emprendida por Gonzalves, Bottaro, & Nilson (s.f.), por ejemplo, demostró
que el Tomillo, en solución oleosa, sí fue efectivo al menor nivel de concentración analizado (1%)
como antibacteriano frente al Streptococcus mutans, específicamente. Incluso, el experto dejó ver
que resultaría permisible su utilización en pastas dentales, dada su estabilidad en la formulación.
59
Por otro lado, Rasooli, Shayegh, Taghizadeh, Darvish, & Astaneh (2008), luego de un
estudio desarrollado tanto en laboratorio como en pacientes, afirmaron a partir de las cifras
obtenidas que la preparación de Romero (al igual que la de Menta) tuvo mayor acción inhibitoria
en comparación con la clorhexidina sobre la placa dentobacteriana, en lo fundamental, sobre la
bacteria investigada aquí.
Sin embargo, en relación con el tercero de los estadios –acuoso–, se han considerado
históricamente mayores concentraciones. Tras una minuciosa revisión y consulta bibliográfica, se
verificó que, en sentido general, estas se han asociado a una efectiva acción inhibitoria ante el
Streptococcus mutans.
Hammad, Sallal, & Darmani (2007) revelaron que la efectividad antimicrobiana del
Thymus vulgaris en estadio acuoso variaba en función de la concentración. Dichos autores
realizaron su indagación con pacientes a los cuales les proporcionaron enjuagatorios bucales con el
extracto, aplicados en más de una ocasión al día. Al término de los muestreos, comprobaron que se
dio una menor concentración del germen y su menor efecto adhesivo en la cavidad bucal. La acción
inhibitoria fue del 98%.
Por otra parte, Ahmad, Mabood, Maheshwari, & Zahin, M. (s.f.) dieron por cierto el efecto
inhibitorio del Rosmarinus officinalis sobre la formación de placa dentobacteriana y, por ende,
frente al Streptococcus mutans. La concentración tenida en cuenta entonces fue del 50%.
Mostacero, Bustamante, Carranza, & Ruiz (s.f.) analizaron asimismo el extracto acuoso de
Romero en concentraciones del 20 al 40%. Al obtener una inhibición del germen variable entre el
8,33 y hasta el 95,35%, demostraron no solo el potencial inhibitorio de la citada planta; también,
que según aumenta o disminuye la concentración del principio activo, aumenta o disminuye su
acción en una relación proporcional.
También insistió García (1995) en que al extracto acuoso del Rosmarinus officinalis al 30 y
50% puede atribuírsele un efecto de inhibición significativo sobre los agentes causales de la caries
dental más estudiados; entre estos, el Streptococcus mutans.
Más adelante en el tiempo, Silva, Higino, Vieira, & Carvalho (2008) validaron
científicamente el hecho de que el extracto de Romero en solución acuosa, a concentraciones por
encima del 40%, fue capaz de limitar la adhesión de diversos gérmenes a la cavidad bucal. ¿Un
ejemplo? El Streptococcus mutans.
En coherencia con lo planteado hasta esta línea, se pudo corroborar que los extractos
acuosos de Tomillo y Romero sí arrojaron antes valores positivos y, de ahí, su acción inhibitoria
60
frente a la bacteria en cuestión. Mas, se dio así al designar concentraciones del principio activo
superiores a la estimada en la presente investigación.
Por ende, tanto estadísticamente como a partir de la comparación con estudios precedentes,
quedó demostrado que, en soluciones preparadas al 10% –similares al procesamiento casero–
dichas plantas carecieron de actividad antibacterial ante el Streptococcus mutans.
Con ello no se instó a desestimar la tradición popular asociada al empleo de las llamadas
plantas medicinales; solo trascendió que, en cuanto al Thymus vulgaris y el Rosmarinus officinalis,
se requirieron y requerirán concentraciones más elevadas de sus extractos acuosos que las
comúnmente obtenidas en los hogares, cuando la pretensión sea combatir el principal agente
determinante de la aparición y proliferación de caries dental.
61
CAPÍTULO V
5.1 Conclusiones
Los extractos acuosos de Tomillo y Romero al 10% no poseen un efecto inhibidor
in-vitro de la bacteria Streptococcus mutans, al recurrir a un medio de cultivo que
podría semejar las condiciones de la boca.
Así constó tras validar las condiciones de la experimentación, para lo cual se
tomaron en cuenta varios factores: humedad, temperatura, sustrato, CO2 y pH. En
condiciones similares a la cavidad oral, y con la presencia del Streptococcus
mutans en cantidades promedio de 1 o 2 x 108 unidades formadoras de colonias,
semejan condiciones favorables.
Solo la clorhexidina al 2% resultó inhibitoria del crecimiento de la mencionada
bacteria.
5.2 Recomendaciones
Estudiar científicamente el efecto inhibitorio de otros extractos de plantas, en pos
de aportar todavía más a la llamada medicina natural y tradicional, o alternativa.
Como solo la clorhexidina al 2% resultó inhibitoria del crecimiento de la
mencionada bacteria, se sigue recomendando su uso.
62
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71
ANEXOS
Anexo 1. Balanza Electrónica
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
72
Anexo 2. Calibrador
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
73
Anexo 3. Maquina reguladora de volumen
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
74
Anexo 4. Incubadora con CO2
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
75
Anexo 5. Nevera e incubadora
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
76
Anexo 6. Esterilizador
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar
77
Anexo 7. Balanza digital
Fuente: (Laboratorio SAFEM, Quito, 2015)
Autor: Eliana Ortega Salazar