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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

TEMA: Determinación de residuos de antibióticos, tetraciclinas (oxitetraciclinas), en

muestras de carne de pollo mediante el método de cromatografía liquida de alta eficacia

HPLC.

Trabajo de investigación previo a la obtención del Título de Químico de

Alimentos

Autor: Ayala Navas Sofía Monserrat

Correo electrónico: [email protected]

Tutor: Ing. Irma Elizabeth Gonza Quito

Correo electrónico: [email protected]

DMQ, octubre de 2018

ii




AUTORIZACIÓN DEL DERECHO DE AUTOR

Yo Ayala Navas Sofía Monserrat en calidad de autor(es) del trabajo de investigación:

Determinación de residuos de antibióticos, tetraciclinas (oxitetraciclinas), en muestras

de carne de pollo mediante el método de cromatografía liquida de alta eficacia HPLC,

autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que

me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos

o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y

publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a

lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

Firma:

-------------------------------

Sofía Monserrat Ayala Navas

CC. 1722789482

iii




ACEPTACIÓN DEL TUTOR

Por el presente documento dejo constancia que he participado en la elaboración del

Proyecto de Investigación presentado por la señorita Sofía Monserrat Ayala Navas para

optar por el Título profesional de Químico de Alimentos cuyo tema tentativo es:

“DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS, TETRACICLINAS

(OXITETRACICLINAS), EN MUESTRAS DE CARNE DE POLLO MEDIANTE EL

MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA HPLC”

Dejo constancia, además, que dicho tema no consta en la base de datos de tesis

aprobadas en la Facultad, y en virtud, ACEPTO realizar la asesoría, en calidad de tutor,

durante el proceso de ejecución del presente Proyecto de Investigación, hasta su

presentación y sustentación.

En la ciudad de Quito, el mes de abril de 2018

iv




CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL

TRIBUNAL

El Tribunal constituido por: Ing. Irma Gonza, Dra. Liliana Naranjo, Dr. Klever Parreño,

luego de revisar el trabajo de investigación titulado: “DETERMINACIÓN DE

RESIDUOS DE ANTIBIÓTICOS, TETRACICLINAS (OXITETRACICLINAS), EN

MUESTRAS DE CARNE DE POLLO MEDIANTE EL MÉTODO DE

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA HPLC”, previo a la obtención

del título de Química de Alimentos presentado por la señorita Sofía Monserrat

Ayala Navas, APRUEBA el trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

……………………….. ………………………….

Ing. Irma Gonza Quito Dra. Liliana Naranjo

C.C. 1718820408 C.C. 0601545213

PhD. Klever Parreño

C.C. 0601619984

v

Dedicatoria

A mis cuatro Abuelos, que han cumplido su misión

en el mundo y han sido una gran inspiración y

fortaleza para mí.

A mis Padres Pablo y Monserrat, que son mis

ganas de seguir adelante y mi apoyo en mi vida.

A mi Hermano Pablo, que es mi mayor tesoro y al

cual dedico todas mis metas cumplidas por siempre

estar a mi lado.

vi

Agradecimiento

Agradecer a Dios es lo primordial ya que me dio la oportunidad de concluir esta

etapa de mi vida estudiantil y poder continuar con mis metas.

Gracias a mis padres Pablo y Monserrat por ser el apoyo, ejemplo y fortaleza en

mi vida ya que ellos desde los más pequeños pasos hasta los más grandes han estado

junto a mí para no dejarme desfallecer y no rendirme. Son mi ejemplo y mi superación.

A mi hermano Pablo D., él es la persona que me brindo su ayuda cuando más la

necesitaba tanto estudiantil como personalmente, gracias por ser mi motivación e

inspiración para cumplir esta meta.

Gracias a mis abuelos que descansan en la paz del Señor, Galo y Cecilia, Efraín y

María que fueron y serán mis cuidadores y mis consejeros en la eternidad.

A la Universidad Central del Ecuador por abrirme las puertas para empezar y

culminar mi carrera que tanto esfuerzo conllevo.

A la Facultad de Ciencias Químicas y a sus docentes que fueron el pilar para la

formación profesional y que brindaron su apoyo en la etapa estudiantil. En especial a la

Ing. Irma Gonza, que fue tutora en el trabajo de investigación y aporto grandes

conocimientos y enseñanzas en mi persona y tuvo dedicación y mucha paciencia en el

trayecto, a la Dra. Lorena Goetschel que fue una gran docente y transmitió experiencias

y conocimientos que ayudaron a formar la profesional que hoy día nace.

A la Bioq. Verónica Ramírez que me abrió las puertas de su Laboratorio en

AGROCALIDAD para realizar tanto pasantías como la tesis y me ayudo a solucionar

las dificultades que se presentaron en el transcurso del proceso de elaboración del

proyecto.

A AGROCALIDAD por permitirme concluir mi trabajo de investigación en sus

laboratorios.

A Andrea Mina, mi amiga durante mi etapa Universitaria, ella fue mi gran ayuda

y en los momentos que más necesite ella se encontraba aconsejándome y dándome

aliento para no desfallecer.

A Gabriela H. gran amiga que conocí en la universidad y que se ha convertido en

mi cómplice, confidente y apoyo y que sin ella la vida universitaria no habría sido tan

emocionante, a Gabriela T. mi mejor amiga desde el colegio hasta hoy en día, gracias

por darme grandes consejos y ánimos para continuar, además a Nora y Belén que me

ayudaron brindándome sus conocimientos y siendo solidarios.

A mi familia paterna y materna, que estuvieron ayudándome durante esta etapa y

en muchas más que se preocuparon por mi persona y mis sueños. En especial a mi tía

Rosa A., que siempre estuvo atenta en mí caminar y a mi tío Galo N., que me ayudo a

desenvolverme en ámbitos relacionados a mi carrera.

Y finalmente gracias a cada persona que fue parte de este trayecto en mi vida.

vii

Lugar donde se realizará la investigación

Esta investigación de tema: “DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE

ANTIBIÓTICOS, TETRACICLINAS (OXITETRACICLINAS), EN MUESTRAS DE

CARNES DE POLLO MEDIANTE EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA

LIQUIDA DE ALTA EFICACIA HPLC” se realizará en los Laboratorios de: Química

de Alimentos, laboratorios de la OSP de Alimentos e Instrumental de la Facultad de

Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador y en el Laboratorio de

insumos veterinarios de AGROCALIDAD.

viii

Índice de contenido

Agradecimiento .............................................................................................................. vi

Lugar donde se realizará la investigación .................................................................. vii

Resumen ....................................................................................................................... xiii

Introducción .....................................................................................................................1

Capítulo I ..........................................................................................................................2

Problema de investigación ..............................................................................................2

1.1. Planteamiento del problema de investigación ................................................... 2

1.2. Formulación del problema ................................................................................. 4

1.3. Preguntas directrices .......................................................................................... 4

1.4. Objetivos ............................................................................................................ 4

1.4.1. Objetivo general. ........................................................................................ 4

1.4.2. Objetivos específicos. ................................................................................. 4

1.5. Justificación e importancia ................................................................................ 5

Capítulo II ........................................................................................................................7

Marco teórico ...................................................................................................................7

2.1. Antecedentes de la investigación ....................................................................... 7

2.2. Marco Teórico .................................................................................................... 8

Métodos de cría de aves de corral en Ecuador. .......................................... 8 2.2.1.

Proceso de faenamiento de pollos. ........................................................... 10 2.2.2.

Carne de pollo. .......................................................................................... 10 2.2.3.

Inocuidad de la carne de pollo. ................................................................. 13 2.2.4.

Los antibióticos. ....................................................................................... 14 2.2.5.

Tetraciclinas.............................................................................................. 16 2.2.6.

Oxitetraciclinas. ........................................................................................ 19 2.2.7.

Método HPLC. ......................................................................................... 22 2.2.8.

2.3. Marco Legal ..................................................................................................... 25

2.4. Hipótesis .......................................................................................................... 26

2.5. Sistemas de Variables ...................................................................................... 26

Variable independiente. ............................................................................ 26 2.5.1.

Variable dependiente. ............................................................................... 26 2.5.2.

Capítulo III.....................................................................................................................27

Marco Metodológico ......................................................................................................27

3.1. Diseño de la investigación ............................................................................... 27

ix

3.1.1. Paradigma o enfoque de investigación. .................................................... 27

3.1.2. Nivel de investigación. ............................................................................. 27

3.1.3. Tipos de investigación. ............................................................................. 27

3.2. Población y muestra ......................................................................................... 27

3.3. Métodos y Materiales ....................................................................................... 28

3.3.1. Extracción de muestra. ............................................................................. 29

3.3.2. Preparación de la curva de calibración. .................................................... 30

3.3.3. Recuperación (fortificación de la muestra). ............................................. 31

3.3.4. Análisis de muestras por HPLC. .............................................................. 32

3.4. Operacionalización de variables ...................................................................... 32

3.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos ............................................ 33

3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos .................................................... 33

Capítulo IV .....................................................................................................................35

Análisis de resultados ....................................................................................................35

4.1. Resultados de las curvas de calibración con los estándares ............................. 35

4.2. Resultados de los parámetros del método ........................................................ 37

4.2.1. Linealidad ................................................................................................. 37

4.2.2. Límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LC) y repetibilidad.

37

4.2.3. Rango de trabajo. ...................................................................................... 39

4.2.4. Sesgo (Porcentaje de recuperación del método). ...................................... 39

4.3. Resultados de la fortificación de la muestra blanco ........................................ 40

4.4. Resultados de residuos de oxitetraciclina en las muestras de pollo ................. 42

Capítulo V ......................................................................................................................49

Conclusiones y Recomendaciones ................................................................................49

5.1. Conclusiones .................................................................................................... 49

5.2. Recomendaciones ............................................................................................ 50

Bibliografía .....................................................................................................................52

Anexos .............................................................................................................................56

x

Lista de tablas

Tabla 1 Características organolépticas de la carne de pollo (Bazalar , Cabello, Benites,

Marín, & Saavedra, 2015) .............................................................................................. 10

Tabla 2. Componentes de la carne de pollo por cada 100 gramos de la misma (USDA,

2018) ............................................................................................................................... 11

Tabla 3. Clasificación de las tetraciclinas (Pérez,2009) ................................................ 19

Tabla 4. Materiales, Equipos y reactivos para la extracción de la muestra (Ayala S.,

2018) ............................................................................................................................... 30

Tabla 5. Materiales, Equipos y reactivos para preparación de curvas de calibración

(Ayala S., 2018) .............................................................................................................. 30

Tabla 6. Materiales, Equipos y reactivos para fortificar la muestra y obtener la

recuperación del método (Ayala S., 2018) ..................................................................... 31

Tabla 7. Materiales, Equipos y reactivos para análisis de las muestras de carne de pollo

(Ayala S., 2018) .............................................................................................................. 32

Tabla 8. Matriz de operacionalización de Variables (Ayala S, 2018) ........................... 32

Tabla 9. Pendientes, ordenadas y coeficiente de correlación de cada curva, con el

promedio de cada parámetro (Ayala S. 2018) ................................................................ 36

Tabla 10. Desviación estándar, promedio y coeficiente de variación del estándar uno

utilizado para obtener LOD y LC (AGROCALIDAD,2018) ......................................... 38

Tabla 11. Comparación de recuperación de muestras fortificadas con 0.5 µg/g de

oxitetraciclina (Ayala S., 2018). ..................................................................................... 39

Tabla 12. Área de pico obtenida con estándares de OTC (AGROCALIDAD,2018) .... 41

Tabla 13. Área de pico 2 obtenida con estándares de OTC (AGROCALIDAD,2018) . 41

Tabla 14. Concentración de oxitetraciclina cuantificada en HPLC de las muestras

fortificadas con 0.5ug/g de oxitetraciclina (Ayala S., 2018) .......................................... 42

Tabla 15. Resultados de las muestras de pollo por zona y lugar (Ayala S., 2018). ....... 44

Tabla 16. Contraste de significancia (Ayala S., 2018) .................................................. 48

Lista de Gráficos

Gráfica 1. Procedimiento de faenamiento de pollos (Ayala,2018) .............................. 10

Gráfica 2. Curva de calibración 1 (Ayala S, 2018) ....................................................... 35




Gráfica 6. Intervalo de linealidad del método (Ayala S, 2018) ..................................... 37

Gráfica 7. Curva de calibración obtenida a partir de los estándares de OTC (Ayala S.,

2018) ............................................................................................................................... 41

Gráfica 8. Curva de calibración 2 obtenida a partir de los estándares de OTC (Ayala S.,

2018) ............................................................................................................................... 42

Gráfica 9. Porcentaje de muestras recogidas por superficies en la ciudad de Quito.

(Ayala S. 2018) ............................................................................................................... 43

Gráfica 10. Zonas de muestreo con el 46.88% (15 muestras) en el Sur de Quito y el

53.12 % (17 muestras) en el Norte de Quito. (Ayala S. 2018) ....................................... 43

xi

Gráfica 11. Porcentaje de muestras positivas (5 muestras de 32) (Ayala S. 2018) ....... 45

Gráfica 12. Porcentaje de muestras positivas por superficie de muestreo. (Ayala S.

2018) ............................................................................................................................... 46

Gráfica 13. Porcentaje de muestras positivas por Zonas de muestreo (Sur –Naranja y

Norte- Gris) (Ayala S. 2018) .......................................................................................... 46

Gráfica 14. Carta de control del método para residuos de oxitetraciclinas en muestras

de carne de pollo de la ciudad de Quito (Ayala S, 2018) ............................................... 47

Lista de Figuras

Figura 1. Iluminación apta para crianza de pollos (Agrocalidad, 2013) ......................... 9

Figura 2. Bebederos a la altura adecuada para las aves (Agrocalidad, 2013) ............... 10

Figura 3. Partes comercializadas de pollo para consumo humano (Cocina de inma,

2010) ............................................................................................................................... 11

Figura 4. Formula Estructural de las tetraciclinas (Dupuy, 2016) ................................ 17

Figura 5. Mecanismo de acción de las tetraciclinas. (Plataforma virtual de la Pontificia

Universidad Javeriana de Bogotá,s.f.) ............................................................................ 17

Figura 6. Estructura desglosada de la oxitetraciclina (Dupuy, 2016)............................ 20

Figura 7. Epimirización de la oxitetraciclina a pH 3-5 (Dupuy, 2016) ......................... 20

Figura 8.Esquema de funcionamiento del HPLC (Skoog, Holler, & Niemas, Principios

de Análisis instrumental, 2001) ...................................................................................... 23

Figura 9. Columna de HPLC provista de una precolumna cambiable para retener por

adsorción las impurezas (Harris, 2007) .......................................................................... 23

Figura 10. Detector UV-VIS 2489 Waters .................................................................... 24

Figura 11.Equipo HPLC Waters Alliance 2695 (Sientific Support, 2017) ................... 28

Figura 12. Columna Merck Purospher STAR RP-18 endcapped (5 um) Lichrocart 150-

4.6 HPLC-Cartridge con sus respectivos manucarts. (Merck, 2018) ............................. 29

Lista de Ecuaciones

Ecuación 1.Ecuación de la recta .................................................................................... 33

Ecuación 2. Linealidad .................................................................................................. 33

Ecuación 3.Límite de cuantificación ............................................................................. 33

Ecuación 4.Límite de detección ..................................................................................... 33

Ecuación 5.Rango de trabajo ......................................................................................... 33

Ecuación 6. Porcentaje de recuperación ........................................................................ 33

Lista de Anexos

Anexo A. Árbol de problemas ...................................................................................... 56

Anexo B. Categorización de variables: Variable independiente ................................... 57

Anexo C. Categorización de variables: Variable dependiente ...................................... 57

Anexo D. Formato de recolección de datos de la parte experimental ........................... 58

xii

Anexo E. Especificaciones de las muestras analizadas en el estudio (UNIETAR,2018)

........................................................................................................................................ 60

Anexo F. Fotografías del proceso de extracción y lectura de las muestras en HPLC... 62

Anexo G. Cromatogramas de los estándares.................................................................. 64

Anexo H. Cromatogramas de las muestras de carne de pollo m1 a m32 ...................... 75

Anexo I. Cromatogramas del blanco ............................................................................. 87

Anexo J. Cromatogramas de muestras fortificadas 1 y 2.............................................. 88

Anexo K. Resultados obtenidos del análisis de oxitetraciclina en carne de pollo ........ 90

Anexo L. Certificado del estándar USP ...................................................................... 103

Anexo M. Manual AOAC 2012 Método oficial 995.09 “Chlortetracilina, tetraciclina y

oxitetraciclina en tejidos animales por cromatografía líquida” .................................... 106

xiii

Determinación de residuos de antibióticos, tetraciclinas (oxitetraciclina), en

muestras de carne de pollo mediante el método de cromatografía liquida de alta

eficacia HPLC.

Autor: Ayala N. Sofía

Tutor: Gonza Irma

Resumen

El objetivo del presente trabajo fue la determinación de residuos de oxitetraciclinas en

muestras de pollo destinadas al consumo humano, las muestras fueron donadas por la

UNIETAR de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Central del

Ecuador, las muestras se tomaron en mercados, supermercados y tiendas de la ciudad de

Quito-Ecuador. El método utilizado para la determinación, fue el método oficial AOAC

995.09: “Clortetraciclina, Oxitetraciclina y Tetraciclina en tejidos animales por

cromatografía liquida (HPLC)”, para desarrollarlo se utilizó un equipo de cromatografía

liquida HPLC de marca Water Alliance 2695, cuyas condiciones cromatográficas para

la identificación de oxitetraciclina fueron: columna Columna Purospher STAR RP-18

endcapped (5um) LiChro CART 150-4.6 HPLC- Cartridge , fase móvil: ácido oxálico

0.001 M: Acetonitrilo: Metanol (65:15:20), flujo de 1,5 mL/min, temperatura: 20ºC;

detector: UV a 350 nm en un Detector UV-VIS Waters 2489 y un volumen de inyección

de 15 uL. El proceso de extracción de la muestra consistió en: tomar 5g de muestra

homogeneizada a la que se añadió una solución buffer McIlvaine como extractante y se

sometió a diferentes ciclos de centrifugación además de lavados con metanol y acido

oxálico metanólico y agua tipo uno, para finalmente filtrar el extracto a través de

microfibras de 0.22 mm. De 32 muestras analizadas, 5 (15.63%) presentaron residuos

de oxitetraciclina, estos residuos no superan el límite máximo establecido por el

CODEX (200 ppb), pero si se encuentran por encima del límite establecido por la Unión

Europea (100 ppb), el porcentaje de recuperación obtenido fue del 34%.

Palabras clave: HPLC, OXITETRACICLINAS, LMR, POLLO, INOCUIDAD

xiv

Determination of residues of antibiotics, tetracyclines (oxitetracycline), in chicken

samples by high precision liquid chromatography method (HPLC).

Autor: Ayala N. Sofía

Tutor: Gonza Irma

ABSTRACT

The aim of this work was the determination of oxytetracycline residues in chicken

samples for human consumption, the samples were donated by the UNIETAR from the

Veterinary School of Central University of Ecuador, which were taken in markets,

supermarkets and stores from the city of Quito-Ecuador. The method used for the

determination was the official method AOAC 995.09: "Chlortetracycline,

Oxytetracycline and Tetracycline in animal tissues by liquid chromatography (HPLC)",

to develop the method a liquid chromatography HPLC team Water Alliance 2695 was

used, the chromatographic conditions to identify oxytetracycline were: Column

Purospher STAR RP-18 endcapped column (5um) LiChro CART 150-4.6 HPLC-

Cartridge, mobile phase: oxalic acid 0.001 M: Acetonitrile: Methanol (65:15:20), flow

1.5 mL / min, temperature: 20 ° C; detector: UV at 350 nm on a UV-VIS Waters 2489

detector and an injection volume of 15 uL. The sample extraction process consisted of:

taking 5g of homogenized sample to which McIlvaine buffer solution was added as

extractant and subjected to different centrifugation cycles in addition to washing with

methanol and methanolic oxalic acid and water type one, the extract was filtered

through 0.22mm microfibers. The results shows that from 32 samples 6 (19%) of them

has oxytetracycline residues, which are within the maximum limit of CODEX (200

ppb), but exceed the limit established by the European Union (100 ppb), a recovery of

34% was obtained.

Keywords: HPLC, OXYTETRACICLINES, MRL, CHICKEN, FOOD SAFETY

1

Introducción

El presente documento tiene como fin determinar si hay presencia de residuos de

antibióticos tipo oxitetraciclinas en muestras de carne de pollo de consumo diario de

cientos de ecuatorianos, mediante el método de HPLC con el fin de establecer si los

límites establecidos por los entes reguladores de referencia, como el Codex

Alimentarius, la Unión Europea y el Instituto Ecuatoriano de Normalización, son

respetados.

Según la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición, la carne de pollo es la segunda

fuente de proteína de consumo en el Ecuador, después del arroz con 18.2 % de consumo

y aportando 18.6 g de proteína por cada 100 g de pollo. Con el fin de garantizar el

abastecimiento y evitar pérdidas a nivel comercial, los productores utilizan antibióticos

para tratar o prevenir enfermedades en los animales de abasto. Las tetraciclinas son

administradas con frecuencia en animales de granja como las aves, ya sea con uso

terapéutico o como promotor del crecimiento; cuando las dosis o el tiempo de retiro no

son respetados, se puede dar una residualidad de los medicamentos que puede llegar al

hombre a través de la cadena alimentaria pudiendo fomentar el desarrollo de resistencias

microbianas, lo que se ha convertido en un problema de salud a nivel mundial.

El proyecto utiliza cómo método de análisis el recomendado por la Association

of Official Agricultural Chemists (AOAC) que son métodos validados para alimentos y

que se reconocen como oficiales.

El documento consta de cinco capítulos, en los cuales se detallan las distintas

fases del proceso a seguir en la investigación y cuyo contenido principal es el siguiente:

- Capítulo uno: define el problema de investigación, la formulación del problema,

los objetivos establecidos en el proyecto y la justificación e importancia que

tiene el trabajo.

- Capitulo dos: contiene los antecedentes de la investigación, las variables

claramente detalladas, el marco teórico revisado para el estudio y las hipótesis

planteadas.

- Capítulo tres: se refiere al marco metodológico del proyecto donde se explica el

diseño de la investigación, métodos y materiales, operacionalización de las

variables, se define las técnicas e instrumentos de recolección de datos, el diseño

experimental y las técnicas de procesamiento y análisis de datos.

- Capitulo cuatro: aquí se presentan los resultados obtenidos durante el desarrollo

del proyecto los cuales se analizan, interpretan y contrastan con datos relevantes

de estudios anteriores.

- Capitulo cinco: se exponen las principales conclusiones y recomendaciones

derivadas de los resultados obtenidos en la investigación.

2

Capítulo I

Problema de investigación

1.1.Planteamiento del problema de investigación

La disponibilidad y el uso de medicamentos antimicrobianos en animales

terrestres y acuáticos y en la producción de cultivos son fundamentales para la salud y la

productividad. Éstos contribuyen a la seguridad alimentaria, la inocuidad de los

alimentos y el bienestar animal, al tiempo que protegen los medios de vida y la

sostenibilidad de la producción animal y agrícola. Sin embargo, existe una preocupación

creciente a nivel mundial por el incremento de la resistencia a la acción de los

medicamentos antimicrobianos (RAM), entre los que se incluyen los antibióticos. En los

seres humanos, la RAM amenaza también con revertir décadas de mejoras en los

resultados sanitarios, lo que repercutiría directamente en la capacidad de las personas de

llevar una vida plena y productiva. (FAO, 2016)

La RAM se refiere a los microorganismos –bacterias, hongos, virus y parásitos–

que se han vuelto resistentes a sustancias antimicrobianas. Este fenómeno, aunque

puede ocurrir de manera natural a través de la adaptación de los microbios al medio

ambiente, se ha visto exacerbado por el uso inadecuado y excesivo de antimicrobianos.

Varios factores han contribuido a esto, entre ellos: i) la falta de normas y fiscalización

del uso; ii) el cumplimiento deficiente del tratamiento; iii) el uso no terapéutico; iv) las

ventas sin receta o a través de Internet, y v) la disponibilidad de antimicrobianos

falsificados o de mala calidad. Entre las consecuencias de la RAM figura la incapacidad

de tratar las infecciones con buenos resultados, lo que conlleva una mayor mortandad; el

aumento de la gravedad o la duración de las enfermedades; las pérdidas de

productividad, y la reducción de los medios de vida y la seguridad alimentaria. Los

efectos indirectos de la RAM incluyen el aumento de los costos de los tratamientos y la

atención de salud. Las consecuencias sanitarias y los costos económicos de la RAM se

estiman en 10 millones de muertes humanas anuales y una disminución de entre el 2% y

el 3,5% del Producto Interno Bruto (PIB) mundial, o 100 billones de USD, para 2050.

(FAO, 2016)

Con el fin de precautelar la salud de los consumidores y siendo conscientes de la

necesidad del uso de sustancias antimicrobianas en algunos casos, las entidades de

control han establecido valores límites para la presencia de antibióticos en productos de

origen animal destinados al consumo humano. En el Ecuador, tanto la normativa como

los controles oficiales enfocados en determinar los niveles de contaminación por

residuos de antibióticos son relativamente recientes. La norma NTE INEN 1338:2012

“Carne y Productos cárnicos. Productos cárnicos crudos, productos cárnicos curados -

madurados y productos cárnicos precocidos - cocidos. Requisitos” en su apartado

número 6: requisitos, en la sección 6.1.6 dice “El producto no debe contener residuos de

3

plaguicidas CAC/LMR 1, contaminantes Codex Stan 193 y residuos de medicamentos

veterinarios CAC/LMR 2, en cantidades superiores a los límites máximos establecidos

por el Codex Alimentarius.” (INEN, 2012). Por otro lado, la Agencia de Regulación y

Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD) que es la entidad encargada del control

de calidad e inocuidad de los alimentos en su etapa primaria, en 2017 a través de la

Resolución 0064 estableció el Programa Nacional de Vigilancia y Control de Residuos

de Medicamentos Veterinarios en productos pecuarios por medio de la cual se

estableció un plan de muestreo para determinados alimentos como la miel o carne

bovina pero no para carne de pollo; uno de los principales limites es el elevado costo

que pueden tener este tipo de análisis para la identificación de antibióticos, razón por la

cual la aplicación de buenas prácticas en el suministro de estas sustancias cobra una

importancia determinante para garantizar la inocuidad de los productos.

Sin embargo, es necesario la realización de ciertos análisis que nos permitan tener

una idea de los niveles de contaminación existentes para con base en esto tomar las

medidas de control necesarias; es bien sabido que los antibióticos en cantidades

elevadas pueden causar el desarrollo de resistencias bacterianas a las personas que

ingieran de cualquier manera estas carnes debido a que estos medicamentos no

desaparecen por acción del calor, bajas temperaturas, o al añadir algún aceite o ácido.

Los datos a nivel de Latinoamérica muestran que existe presencia de residuos de

antibióticos en carne, por ejemplo, en un estudio realizado en Colombia de 149

muestras de carne bovina, el 49% de las mismas presentó residuos de Oxitetraciclinas y

el 8% de las muestras tuvo residuos en cantidades superiores a los límites máximos de

residuos (LMR) que son de 100 ppb. (Acosta , Romero , & Taborda, 2014).

Los medios de comunicación mediante artículos como de la HealthDay Nes,

2013, han difundido que los antibióticos suministrados a pollos ya no son efectivos y

que, al realizar un estudio en Estados Unidos, con una muestra de 316 pechugas se

encontró que el 17% tenía contaminación lo que indica que no se hace un adecuado

hincapié en la inocuidad del alimento para venta al público. Por tanto, conocer si hay

una residualidad del antibiótico oxitetraciclina es de gran importancia en vista de que se

incrementa el riesgo de desarrollar resistencia bacteriana y que en un futuro no muy

lejano este antibiótico de amplio espectro ya no tenga ningún efecto sobre los animales

o sobre el ser humano.

De acuerdo a la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición (ENSANUT) realizada

por el Ministerio de Salud del Ecuador en 2012 se concluyó que el arroz y el pollo son

la principal fuente de aporte de proteínas en la dieta de los ecuatorianos, representando

el consumo de pollo un 18,2 % del consumo diario de proteínas. Las proteínas

provenientes de la carne de pollo se caracterizan por tener un alto valor biológico; de

cada 100g de carne, aproximadamente 19 g son proteínas, por tanto, es de vital

importancia que este tipo de productos sea inocuo para la población que los consume y

de esta forma poder aprovechar todos los nutrientes que aporta. (Freire, y otros, 2014)

4

Esta investigación permitirá obtener datos sobre los niveles de contaminación por

residuos de oxitetraciclina de la carne de pollo comercializada en Quito, identificando si

el producto es inocuo o no desde el punto de vista de la contaminación química y

servirá de referencia para que las entidades reguladoras orienten los planes de vigilancia

y control sobre este tipo de productos que son de gran consumo en la población

ecuatoriana.

1.2.Formulación del problema

¿Existen residuos de oxitetraciclina en la carne de pollo recolectada en la ciudad

de Quito por encima de los límites máximos establecidos por el Codex que puedan

comprometer la inocuidad del producto?

1.3.Preguntas directrices

Las preguntas planteadas que guiaron esta investigación fueron las siguientes:

¿Qué método de extracción es el más adecuado para la determinación de residuos de

antibióticos en muestras de carne de pollo?

¿Cuáles son las condiciones analíticas óptimas para la determinación de oxitetraciclina

por HPLC?

¿Existe presencia de residuos de oxitetraciclina en la carne de pollo recolectada en la

ciudad de Quito?

¿Se superan los límites máximos de residuos establecidos por el Codex Alimentarius o

por la Unión Europea para oxitetraciclina en músculo de pollo?

1.4.Objetivos

1.4.1. Objetivo general.

Determinar los residuos de oxitetraciclina en muestras de carne de pollo recolectadas en

la ciudad de Quito mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

1.4.2. Objetivos específicos.

o Establecer el procedimiento de extracción del antibiótico más adecuado

para las muestras de pollo.

o Definir las condiciones óptimas del método de análisis y afianzar

conocimientos en el estudio de cromatografía liquida de alta precisión

(HPLC).

o Establecer los parámetros del método de análisis.

o Identificar si hay presencia de oxitetraciclina en las muestras de carne de

pollo determinando la concentración del antibiótico.

5

o Comparar los resultados obtenidos en el análisis de tetraciclina

(oxitetraciclina) con los límites máximos establecidos por el CODEX

ALIMENTARIUS y la UNIÓN EUROPEA.

1.5.Justificación e importancia

El uso de antibióticos en veterinaria ha sido de gran ayuda ya que se ha logrado

combatir grandes enfermedades bacterianas en aves de corral. El consumo de carne de

este tipo de animales a nivel nacional es enorme porque es uno de los platos diarios en

la mesa de muchos hogares ecuatorianos y a nivel mundial, por tanto, es importante

saber que se debe tener una regulación de calidad en este tipo de alimento. (Freire, y

otros, 2014).

Los antibióticos como las tetraciclinas son utilizados para este tipo de animales de

granja para la prevención de diferentes enfermedades entre las que destacan: cólera

aviar, colibacilosis, salmonelosis, enfermedad crónica respiratoria, coriza infecciosa,

estreptococosis, estafilococosis (Veterinarios, 2011), por tanto el uso de estos se ha

convertido en cotidiano ya sea con fin antimicrobiano o como promotor del crecimiento.

Las tetraciclinas son productos de venta normalizada por AGROCALIDAD, esta

institución clasifica los medicamentos veterinarios en tres grupos diferentes para su

expendio (grupo I, II y III), la oxitetraciclina se encuentra en el grupo III lo que

significa que para poder adquirirla es necesario contar con una receta médica emitida

por un médico veterinario; pero aun con esta regulación existe la posibilidad de aplicar

los tratamientos de forma inadecuada, porque no se respeten las dosis de administración

o los tiempos de retiro por ende podría darse una residualidad en los productos

destinados al consumo humano. (Salguero, Cornejo, & Zuñiga, 2016).

En el Ecuador, de acuerdo con los datos del Instituto Nacional de Estadísticas y

Censos (INEC, 2014), la cantidad total de aves de corral que existe 10,63 millones de

gallinas criadas en planteles avícolas; mientras que, en campo se registraron 5,25

millones, la región sierra tiene la mayor producción de pollos/ as con el 63.33% de la

producción nacional que equivale a alrededor de 32.067.865 aves, el destino de estos

animales criados en planteles avícolas es principalmente autoconsumo (505.184

pollos) y venta (46.815.222 pollos) mientras que las aves que se crían en el campo son

de consumo directo para las personas que se encargan de sus crianza.

El proyecto se desarrolla por la necesidad de la industria alimentaria de producir

alimentos inocuos, es decir que no causen daños a la salud al consumirlos, entonces lo

que se busca es que desde la materia prima el alimento no contenga ningún tipo de

bacteria patógena, residuo de medicamento veterinario o toxina que pueda alterar la

salud pública y es por esa razón que los análisis son indispensables para que en el caso

que se encuentre alguna de estas irregularidades se puedan establecer las medidas

correctoras pertinentes.

Con esta investigación se pretende obtener información acerca del nivel de calidad

que tiene la carne de pollo comercializada en la ciudad de Quito de forma que los

consumidores, los productores, los médicos veterinarios y las entidades de control sean

6

conscientes de la importancia que tiene el adecuado uso de los antibióticos en los

animales de abasto.

7

Capítulo II

Marco teórico

2.1. Antecedentes de la investigación

En los últimos años se ha encontrado la necesidad de cuantificar la cantidad de

antibióticos que están presentes en los productos de origen animal destinados al

consumo humano, entre estos productos se encuentra la carne de pollo ; diversos

estudios han mencionado que los consumos de carne con concentraciones importantes

de sustancias antimicrobianas representan riesgos para la salud del consumidor,

contribuyendo de forma destacable al desarrollo de resistencias bacterianas en los

microorganismos que frecuentemente atacan al ser humano. Por tanto, la comisión del

Codex Alimentarius y diversas Academias Microbiológicas han normalizado límites

máximos de residuos que pueden contener dichas carnes, para seguir considerando un

producto como inocuo, estos límites varían dependiendo de la matriz analizada y

también pueden ser distintos para una misma matriz y sustancia en función de la entidad

reguladora, en el caso de los residuos de oxitetraciclina en músculo de pollo el límite

establecido por el Codex es de 200 ug/kg mientras que el límite máximo impuesto por la

Unión Europea para la misma matriz es de 100 ug/kg . (Alimentarius, 2015)

En los últimos años se han realizado varios estudios enfocados en la

determinación de residuos de antibióticos en productos de origen animal que han

servido de base y guía para el presente proyecto de investigación. A continuación, se

detallan los puntos principales de algunos de ellos:

En Colombia por ejemplo, el estudio: “DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE

OXITETRACICLINA EN MUESTRAS DE CARNE BOVINA”, realizado en

Antioquia tuvo como objetivo determinar la presencia de oxitetraciclina en 149

muestras de músculo diafragmático de carne de res, obteniendo que el 49% de las

muestras contienen residuos del antibiótico por debajo del Límite Máximo de Residuos

(LMR > 100 ppb) y el 8% con cantidades superiores al LMR, en este caso la

metodología usada para la cuantificación fue HPLC (Acosta , Romero , & Taborda,

2014).

Izquierdo y otros (2010) en un estudio realizado en la ciudad de Maracaibo

buscaban mejorar la extracción de oxitetraciclina del músculo de pollo mediante el

incremento de la fase polar en el solvente de extracción, para ello se ensayó con mezclas

de acetonitrilo / hexano en diferentes proporciones (5:4 y 2:1) Para ello se utilizaron 24

porciones de 1 g de tejido muscular perteneciente al muslo de 3 pollos libres de

antibióticos, las cuales se fortificaron con soluciones estándares de OTC de 0,1; 0,2; 0,5

y 1 µg/g y se halló que tanto para la proporción 5:4 como 2:1, la concentración de 0,2

µg/g presentó la mayor recuperación, siendo 91,5 y 92,5%, respectivamente;

8

adicionalmente se observó que al aumentar la concentración de OTC disminuyó la

recuperación y el límite de detección fue de 0.09 µg/g.

Existen varios trabajos publicados enfocados en el desarrollo y optimización de

metodologías experimentales para la determinación de oxitetraciclina en carne y que se

han utilizado como base en la presente investigación, por mencionar alguno de esos

trabajos podemos destacar:

El desarrollo de un método para la determinación de tetraciclina en productos de

origen animal donde se consigue mejorar la recuperación de la molécula en estudio,

utilizando la capacidad de formación de quelatos de la tetraciclina con posterior

determinación por cromatografía líquida de alto rendimiento (Cooper, y otros, 1998).

En el estudio “Validation of a high-performance liquid chromatography method

for the determination of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline

in bovine milk and muscle” se utiliza HPLC con un detector de diodos a 365 nm,

usando una fase de móvil de ácido oxálico-acetonitrilo-metanol (60:25:15 V/V/V)

obteniendo una recuperación de 83.2% de tetraciclinas en el musculo bovino y con un

límite de detección de 114.9-133.1 mg/Kg en tejido. (Cinquina, Longo, Anastasi,

Giannetti, & Cozzani, 2003)

Se realizó una revisión de las distintas metodologías utilizadas para la preparación

de muestras de alimentos en la determinación de residuos de tetraciclina

proporcionando una idea general de los reactivos y las proporciones utilizadas, las

diferentes matrices de ensayo, los equipos utilizados y los rendimientos y moléculas de

tetraciclinas analizadas en cada caso (Pérez Rodríguez, Pellerano, Pezza, & Redidolo

Pezza, 2018).

2.2. Marco Teórico

Métodos de cría de aves de corral en Ecuador. 2.2.1.

Para iniciar con el proceso de crianza de los pollos, éstos se separan en:

- Pollos de engorde

- Ponedoras

En pollos de engorde que serán destinados para carne se comienza desde la

primera semana de nacido hasta la séptima o hasta que alcancen un peso promedio de 2

kg.

Con el fin de garantizar el bienestar animal y de esta manera obtener una carne de

buena calidad, las granjas avícolas deben cumplir unas condiciones mínimas en cuanto a

requisitos como la localización (disponibilidad de agua, libres de humo, sin focos de

9

contaminación) o infraestructura (cerraduras y cercas, separación de zonas limpias y

sucias, puerta de ingreso con acceso restringido, señalización clara). (Agrocalidad,

2013)

Se debe contar también con el asesoramiento de un médico veterinario quien debe

elaborar y cumplir calendarios de vacunación, diseñar programas de prevención y

vigilancia, realizar toma y análisis de muestras para posibles acciones correctivas.

(Agrocalidad, 2013)

Se deben aplicar medidas higiénicas, como limpieza y desinfección, control de

plagas y aves silvestres, manejo adecuado de desechos, control de calidad del alimento.

(Agrocalidad, 2013)

Las condiciones en cuanto al lugar donde se desarrollarán los pollos son:

Galpones: techos de material aislante (zinc, aluminio, acero aluminado) y con

caídas para aguas lluvias dirigidas a drenajes, piso con limpieza fácil (concreto),

ventanales con malla plástica o de alambre, paredes de concreto.

Equipos: comederos, bebederos, mallas divisoras, calentadores, ventiladores,

nidales deben ser de material no toxico e inofensivos. La iluminación de preferencia

debe ser fluorescente. (Agrocalidad, 2013)

Figura 1. Iluminación apta para crianza de pollos (Agrocalidad, 2013)

10

Figura 2. Bebederos a la altura adecuada para las aves (Agrocalidad, 2013)

Una vez los pollos han alcanzado el peso mínimo o han cumplido con el tiempo

de crecimiento necesario pasan a la etapa de faenamiento, donde se obtendrá la carne

que será comercializada para el consumo humano.

Proceso de faenamiento de pollos. 2.2.2.

Un proceso de sacrificio y desplume eficaz tiene una gran influencia en la calidad,

la vida útil, el aspecto y el color de sus productos finales. A continuación, se muestra el

proceso industrial que se sigue para el faenamiento de estos animales. (Marel, 2016)

Gráfica 1. Procedimiento de faenamiento de pollos (Ayala,2018)

Carne de pollo. 2.2.3.

La normativa Ecuatoriana INEN en su norma NTE-1217 define a la carne

como “Tejido muscular estriado en fase posterior a su rigidez cadavérica (post-rigor),

comestible, sano, y limpio e inocuo de animales de abasto que mediante la inspección

veterinaria oficial antes y después del faenamiento son declarados aptos para consumo

humano” (INEN, 2013). En la tabla 1 se detalla las condiciones óptimas para la

distribución de carne de pollo.

Tabla 1 Características organolépticas de la carne de pollo (Bazalar , Cabello, Benites,

Marín, & Saavedra, 2015)

Parámetro Acepta Rechaza

Color Blanco, ligeramente

amarillento uniforme y

brillante

Con manchas violetas,

verdosas o algún tipo

de decoloración

(negruzca,

sanguinolenta o pálida)

•Se realiza por baño de agua de alta frecuencia o por sistema multifase de aturdido en atmósfera controlada.

aturdido

• Se pesa y se etiqueta el producto a fin de tener una trazabilidad.

pesaje

•Se hace con el pollo de cabeza , se corta el cuello, se deja desangrar rapidamente

sacrificio

•Escaldado por inmersión a contracorriente: los productos se escaldan por inmersión en agua caliente que se agita por aire.

escaldado

•Se realiza a traves de una desplumadora

desplumado

•se cortan las patas y se separan

procesado de patas

• las aves se vuelven a reenganchar en la linea de producción para ser eviscerados

reenganche

11

Textura Lisa, tersa y firme Babosa y hematomas

Apariencia Cuello firme, muslos

lisos y redondeados,

pechuga ancha

Olor Característico Fétido, generalmente a

agrio

En la figura 3. Se observa las partes de un pollo faenado que se comercializan en

mercados, tiendas, supermercados, etc.

Figura 3. Partes comercializadas de pollo para consumo humano (Cocina de inma,

2010)

Composición química y calidad nutricional de la carne de 2.2.3.1.

pollo.

La carne se compone de agua, proteínas y aminoácidos, minerales, grasas y ácidos

grasos, vitaminas y otros componentes bioactivos, así como pequeñas cantidades de

carbohidratos (FAO, 2015). La carne de pollo como otras carnes, es rica en vitaminas

del grupo B y vitamina A, además contiene una alta biodisponibilidad por ser rica en

aminoácidos esenciales sobre todo en lisina con un valor biológico promedio de 76 que

es más bajo que el del huevo y el de la leche debido a la deficiencia de triptófano y

fenilalanina (Primo, 1998, pág. 376). En la tabla 2. Se puede observar los componentes

de la carne de pollo y su valor nutricional.

Tabla 2. Componentes de la carne de pollo por cada 100 gramos de la misma (USDA,

2018)

Nutriente Unidad Valor por

100g

*IDR, hombres /mujeres

de edad adulta (19-30)

Agua g 74.30

Energía kcal 109

Energía kJ 456

Proteína g 22.20 1 g/kg/día

12

Total de lípidos g 1.63

Ceniza g 1.10

Hidratos de

carbono g 0.00

Fibra g 0.0

Azúcar g 0.00

Calcio mg 11 1000 mg/día

Hierro mg 0.89 8 /18 mg/día

Magnesio mg 25 400 mg/día

Fósforo mg 223 700 mg/día

Potasio mg 252 4700 mg/día

Sodio mg 51 1500 mg/día

Zinc mg 0.66 11 /8 mg/día

Cobre mg 0.038 900 mg/día

Manganeso mg 0.017 2.3 /1.8 mg/día

Selenio ug 17.8 55 mg/día

Riboflavina mg 0.089 1.3 /1.1 mg/día

Niacina mg 10.217 16 /14 mg/día

Acido

pantoténico mg 0.854 5 mg/día

Vitamina B-6 mg 0.550 1.3 mg/día

Folato ug 4 400 ug/día

Vitamina B-12 ug 0.39 2.4 /2.4 ug/día

Vitamina A ug 8 900 /700 ug/día

Vitamina E(alfa-

tocoferol) mg 0.22 15 g/día

Vitamina K ug 2.4 120 /90 ug/día

Ácidos grasos

saturados totales g 0.370

Ácidos grasos

monoinsaturados g 0.480

Ácidos Grasos

poliinsaturados g 0.400

Colesterol mg 57

Triptófano g 0.259

Treonina g 0.938

Isoleucina g 1.172

Leucina g 1.666

Lisina g 1.886

Metionina g 0.614

Cistina g 0.284

Fenilalanina g 0.881

Tirosina g 0.749

13

Valina g 1.101

Arginina g 1.339

Histidina g 0.689

Alanina g 1.211

A.Aspártico g 1.978

A.Glutamico g 3.325

Glicina g 1.090

Prolina g 0.913

Serina g 0.764

*IDR: Ingesta Diaria Recomendada (The National Academies of Sciences.,

2000)

Inocuidad de la carne de pollo. 2.2.4.

Tradicionalmente se ha considerado la carne como vehículo de una proporción

significativa de enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA), donde la Inocuidad

(garantizar la calidad del alimento desde su producción hasta su distribución), juega un

rol importante, puesto que esta controla los diferentes peligros que pueden presentarse

en la cadena de producción del alimento en este caso la carne. Ha cambiado el espectro

de las enfermedades transmitidas por la carne que son de importancia para la salud

pública, a la par de los cambios sufridos por los sistemas de producción y elaboración.

El hecho de que el problema continúe ha quedado bien ilustrado en años recientes con

estudios de vigilancia en seres humanos, relativos a patógenos transmitidos por la carne

tales como Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Campylobacter spp. y Yersinia

enterocolitica. Aparte de los peligros biológicos, químicos y físicos existentes, están

surgiendo nuevos peligros, por ejemplo, el agente de la encefalopatía espongiforme

bovina (EEB). (Normalización, 2013)

Los peligros de contaminación se presentan en el faenamiento, ya que los cuerpos

pueden entrar en contacto con equipos sucios, con restos de alimentos, además en el

modo de cría de los animales ya que pueden ser tratados de forma inadecuada y por

prevenir enfermedades dosificados con medicamentos de manera inapropiada porque no

hay vigilancia ni un control. Por último, cuando el ave ya fue sacrificada no hay una

regulación en la cadena de frio punto en el cual la inocuidad mediante planes de Buenas

Prácticas de Manufactura (BPM) y Análisis de peligros y puntos críticos de control

(HACCP) pretende disminuir riesgos.

La carne de pollo debe conservarse a una temperatura por debajo de los 4 ºC para

evitar la aparición de bacterias con el consiguiente riesgo de intoxicación. Por tanto

“cuanto más pequeñas sean las piezas, mayor será el riesgo de contaminación, debido a

la mayor superficie. Las canales o las piezas cortadas deberán permanecer congeladas a

lo largo de toda la cadena de comercialización. Cuando la cadena de frío se interrumpe,

los agentes infecciosos empiezan a multiplicarse en la carne. El consumo de carne

14

contaminada puede causar enfermedades, especialmente si la carne no está bien hecha”

(FAO, s.f.)

Los antibióticos. 2.2.5.

“Los antibióticos son sustancias químicas especificas capaces de paralizar el

desarrollo de ciertos microorganismos patógenos, por su acción bacteriostática o de

causar su muerte por su acción bactericida” (Morán, 2014)

“Los antibióticos constituyen un grupo heterogéneo de sustancias con diferente

comportamiento farmacocinético y farmacodinámico, ejercen una acción específica

sobre alguna estructura o función del microorganismo, tienen elevada potencia

biológica actuando a bajas concentraciones, y la toxicidad es selectiva con una mínima

toxicidad para las células de nuestro organismo”. (Bado, y otros)

Los antibióticos pueden clasificar según diferentes criterios, por ejemplo:

De acuerdo a la interacción germen-antibiótico.

- Bactericidas: su acción es letal, llevando a la lisis bacteriana.

- Bacteriostáticos: a las concentraciones que alcanzan en el suero o tejidos

impiden el desarrollo y multiplicación bacteriana, pero sin llegar a destruirlas.

Según el espectro de acción.

- Antibióticos de espectro amplio, como aquellos antibióticos que son activos

sobre un amplio número de especies y géneros diferentes (aminoglucósidos y

carbapenemes).

- Antibióticos de espectro reducido, antibióticos solo activos sobre un grupo

reducido de especies (penicilinas).

Según el mecanismo de acción.

Es el mecanismo por el cual un antibiótico es capaz de inhibir el crecimiento o

destruir una célula bacteriana. Se dividen en inhibidores de la formación de la pared

bacteriana, inhibidores de la síntesis proteica, inhibidores de la duplicación del DNA,

inhibidores de la membrana citoplasmática (alteran la permeabilidad de la membrana), e

inhibidores de vías metabólicas. (Bado, y otros)

Uso de los antibióticos. 2.2.5.1.

El uso de antibióticos con fines terapéuticos y/o profilácticos.

“Los agentes antimicrobianos deberían utilizarse exclusivamente con dos fines perfectamente

definidos:

- Con fines profilácticos, solamente en aquellos casos en que esté demostrado su importancia

para prevenir una infección al realizar un procedimiento determinado y mientras dure éste; por

ejemplo, en los ciclos iniciales de crecimiento de animales, especialmente sensibles a agentes

15

infecciosos muy particulares. En estos casos no deberían emplearse antibióticos de adquisición

reciente ya que en general son menos eficaces como preventivos de infección que los ya

existentes y podrían favorecer además la aparición de resistencias.

- Con fines terapéuticos, como tratamiento de una infección documentada. Esta es la forma

ideal de tratamiento antimicrobiano, conociendo el germen causal.

Muchas veces el tratamiento se comienza de forma empírica en casos de

sospecha de infección cuando se considera urgente la necesidad de este.

Siempre que sea posible es importante realizar cultivos pertinentes previos,

antes de instaurar el tratamiento, para poder valorar a posteriori la eficacia de

los antibióticos utilizados. Es preferible además recurrir siempre a antibióticos

de espectro reducido para poder aumentar la eficacia del tratamiento y reducir el

eventual trastorno que el antibiótico ejercerá sobre la flora comensal.

Únicamente se recomienda la asociación de antibióticos cuando éstos presentan

efectos aditivos o sinérgicos. Las dosis deben ser siempre terapéuticas puesto

que los laboratorios farmacéuticos realizan los ensayos clínicos y los estudios

cinéticos pertinentes que garantizan, para la dosis propuesta, unos niveles de

fármaco adecuados para eliminar la bacteria. Desgraciadamente, el uso de

antibióticos con fines terapéuticos o profilácticos no siempre sigue las

especificaciones de administración, demostrándose en muchas ocasiones que los

animales a los que se prescriben estos agentes no tienen evidencia de infección,

no requieren antimicrobianos o reciben dosis inadecuadas. Aparte de la

prescripción incorrecta de antimicrobianos por parte del facultativo, hay otra

serie de factores que contribuyen al mal uso terapéutico de estos agentes como

son: la dispensación de medicamentos veterinarios en establecimientos distintos

a los autorizados (tiendas de animales de compañía, explotaciones ganaderas...),

la dispensación de antimicrobianos sin necesidad de presentar la receta

veterinaria, o el empleo de antimicrobianos no autorizados en el sector

veterinario. (Cancho Grande, García, & Simal Gándara, 2000)

El uso de antibióticos como promotores del crecimiento animal.

Los promotores de crecimiento son sustancias naturales o sintéticas con actividad

farmacológica que se administran a los animales sanos a través de los piensos para

acelerar la ganancia de peso y mejorar los índices de transformación de los alimentos ya

que permiten en control de microorganismos Gram Positivos y permite que el animal

pueda absorber mejor los nutrientes de la dieta.

Estos promotores de crecimiento pueden ser de tres tipos:

a) antibióticos y quimioterapéuticos de actuación sobre la microflora bacteriana del tubo

digestivo, en concentraciones entre 30 y 100 mg/L, administrados sistemáticamente

durante periodos largos.

b) sustancias ionóforas de actuación sobre el rumen.

16

c) anabolizantes, generalmente sustancias de tipo hormonal, los cuales actúan como

promotores de crecimiento mediante una acción sobre el metabolismo.

Los antibióticos, como aditivos en alimentación animal se encuentran en una lista

de antibióticos aptos como promotores de crecimiento animal que se ha visto reducida

durante los últimos años. Antes de 1997 se podían emplear nueve antibióticos como

promotores de crecimientos: enramicina, avoparcina, tilosina, espiramicina, bacitracina,

virginamicina, monensina, salinomicina, flavofosfolipol y avilamicina. En ese año,

1997, la Unión Europea prohibió la avoparcina para no correr el riesgo de disminuir la

eficacia de un antibiótico que la medicina humana tiene de reserva. En 1999 la misma

entidad prohibió la espiramicina y la bacitracina por tener uso terapéutico en el ser

humano y la tilosina por ser medicamento veterinario. (Cancho Grande, García, &

Simal Gándara, 2000). En Ecuador comúnmente se usa la enrancina y virginamicina,

oxitetraciclina y clortetraciclina pero también El tylán es el nombre comercial para el

antibiótico tartrato de tilosina que está prohibido por la Unión Europea pero se usa en el

país. (Altafuya Rojas & Galdea González, 2006)

Tetraciclinas. 2.2.6.

Las tetraciclinas son parte de un grupo de fármacos descubiertos en la década de

los años 40 con actividad antimicrobiana de amplio espectro obtenida de especies

microbianas Streptomyces, ya que inhiben la síntesis de proteínas y son bacteriostáticas

para muchas bacterias grampositivas. (Rodriguez , y otros, 1998). Se distinguen tres

tipos de tetraciclinas: clortetraciclinas, oxitetraciclinas y tetraciclina, además por

semisíntesis se dan las demeclociclina, metaciclina, doxiciclina y minociclina, todas

estas se caracterizan por el núcleo tetracíclico octahidronaftaleno.

Las principales diferencias radican en su perfil farmacocinético, lo que permite

agrupar a las tetraciclinas en tres categorías: 1º) las de vida media corta (6-8 h), como

clortetraciclina, oxitetraciclina y tetraciclina); 2º) las de vida media intermedia (12-14

h), como demeclociclina y metaciclina); y 3º) las de vida media larga (16-18 h), como

doxiciclina y minociclina, las más liposolubles. (Sánchez Saldaña, Sáenz Anduaga,

Pancarba Mendoza, Lanchipa Yokota, & Zegarra Del Carpio, 2004)

17

Figura 4. Formula Estructural de las tetraciclinas (Dupuy, 2016)

Las tetraciclinas actúan inhibiendo la síntesis de las proteínas bacterianas

(asociación entre el amino-ARNt y el ribosoma) ya que en lugar de ello la tetraciclina se

une a la unidad 30S del ribosoma (Fig. 2.2), el resultado es que se impide la unión de

los aminoácidos a la cadena peptídica lo que impide la elongación de la cadena (López,

2007).

Figura 5. Mecanismo de acción de las tetraciclinas. (Plataforma virtual de la Pontificia

Universidad Javeriana de Bogotá,s.f.)

Las tetraciclinas son administradas por vía oral, se adsorben en el estómago

primero y luego en el intestino delgado en una proporción del 60-80%, ya que se

pueden presentar interacciones con el calcio por una formación de quelatos

disminuyendo su acción.

Después de una dosificación correcta los niveles que se encuentra en la sangre son

de 2.5ug/ml por lo que veterinariamente se aplica de 3 a 4 veces en animales de granja

dependiendo las indicaciones del tipo de tetraciclina. (López, 2007) Esta se excreta por

la orina.

Estos medicamentos son usadas para combatir infecciones causadas por Brucella

o infecciones gastrointestinales causadas por Helicobacter pylori.

18

En la medicina veterinaria son usadas más en aves de corral, rumiantes y animales

de compañía. Ya que al ser baratas son de gran ayuda para naciones en vías de

desarrollo. (López, 2007)

Desarrollo de resistencias. 2.2.6.1.

Las tetraciclinas al haber sido usadas alrededor de 60 años tanto como promotores

de crecimiento como para uso terapéutico, han dado paso al desarrollo de resistencias

bacterianas causantes de zoonosis, existe por ejemplo resistencia a Salmonella,

Campylobacter, Yersinia spp. , Escherichia coli o Enterococcus spp. Estas bacterias

además de provocar infecciones en animales también pueden afectar a humanos ya sea

por contacto directo con los animales vivos o por ingestión de los productos obtenidos

de éstos. (López, 2007)

La resistencia a las tetraciclinas es un ejemplo de resistencia transmitida por

plásmidos portadores de genes capaces de transmitir la resistencia, llamados let genes,

hay 20 let identificados para resistencias a tetraciclinas y oxitetraciclina cuyos

mecanismos son:

a. Alteraciones en la membrana externa bacteriana que disminuyen la penetración

del fármaco, ya que la bacteria produce proteínas que se asocian a la membrana

lo cual reduce la concentración de la tetraciclina y por tanto su acción en el

ribosoma.

b. Protección de los ribosomas: producción de proteínas citoplasmáticas que

protegen a los ribosomas de la acción de las tetraciclinas.

c. Inactivación enzimática: enzimas que inactivan al fármaco dentro del

citoplasma. (López, 2007)

Tipos de tetraciclinas. 2.2.6.2.

Se diferencian tres generaciones de tetraciclinas:

Primera generación: la constituyen los agentes más antiguos. Son los menos

lipofílicos y los que peor absorción muestran. Aquí se incluyen tetraciclina,

oxitetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, limeciclina, metaciclina y

rolitetraciclina. Todos ellos, excepto rolitetraciclina, pueden administrarse por vía oral.

Segunda generación: presentan una mejor absorción y son entre 3 y 5 veces más

lipofílicos que los componentes del grupo anterior. En este grupo se incluyen

doxiciclina y minociclina. Se pueden administrar por vía oral y también por vía

intravenosa.

Tercera generación: las glicilciclinas pertenecen a la última generación de

tetraciclinas. Son análogos semisintéticos obtenidos tras modificar la posición 9 del

anillo tetracíclico de los compuestos de las generaciones anteriores. La tigeciclina es el

9-tert-butil-glicilamido derivado de la minociclina y constituye el principal

19

representante de este nuevo grupo. Además de las glicilciclinas, en esta tercera

generación se incluyen nuevos compuestos en desarrollo, como las aminometilciclinas,

de cuyo grupo ya ha pasado a experimentación humana la PTK 0796 para

administración oral e intravenosa en una sola dosis diaria. (Pérez, 2009)

Tabla 3. Clasificación de las tetraciclinas (Pérez,2009)

Oxitetraciclinas. 2.2.7.

La Oxitetraciclina (figura 7), también denominada Terramicina, se obtiene a partir

de Streptomyces rimosus. Es una sustancia cristalina ligeramente amarilla, inodora y

levemente amarga; anfótera ya que en solución acuosa forman sales, tanto con ácidos

como con bases, estable en forma de polvo, pero no en solución acuosa, siendo

particularmente inestables a pH superiores a 7,0. Se ionizan con soluciones ácidas de

pH inferiores a 2 (Dupuy, 2016). Su nombre químico es: [4S-

(4α,4a,α,5α,5a,α,6β,12a,α)]-4-(dimetilamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahidro-

3,5,6,10,12,12a-hexahidroxi-6-metil-1,11-dioxo-2-naftacenocarboxamida. Su peso

molecular es de 460.44 Da. (Torres, 2015). Al poseer grupos funcionales de oxigeno se

puede dar en esta parte de la molécula modificaciones sintéticas que hacen que pierdan

actividad biológica, pero si hay esta modificación en la parte superior de la molécula

(figura 7), hay una mayor actividad biológica, además puede producir cambios en el

tamaño, la forma, carga, densidad electrónica y polaridad.

La oxitetraciclina a pH entre 3-5 se epimeriza en el carbono 4 a epioxitetraciclina

(Figura 8) que es poco activa como antibiótico, presentando una actividad de entre el 2-

5% de actividad antimicrobiana de la oxitetraciclina.

20

Figura 6. Estructura desglosada de la oxitetraciclina (Dupuy, 2016)

Figura 7. Epimirización de la oxitetraciclina a pH 3-5 (Dupuy, 2016)

Las tetraciclinas son quizás los antimicrobianos más ampliamente utilizados como

promotores del crecimiento y en la terapéutica de animales de abasto, por su bajo costo,

escasa toxicidad y amplio espectro, siendo uno de los medicamentos incluidos en los

programas de vigilancia epidemiológica en todo el mundo. (Acosta , Romero , &

Taborda, 2014)

Entre los usos veterinarios que tienen las tetraciclinas podemos destacar:

21

Bovinos: anaplasmosis, carbunco bacteriano, carbunco sintomático, septicemia

hemorrágica, fiebre de transporte, neumoenteritis, mastitis, leptospirosis, actinomicosis,

actinobacilosis, pietín, metritis, neumonía, bronquitis, pleuresía, pericarditis traumática,

infecciones genitourinarias y como tratamiento pre y posquirúrgico.

Ovinos: carbunco bacteriano, mancha, neumonía infecciosa, enterotoxemia.

Equinos: carbunco bacteriano, adenitis equina, neumonía, bronquitis, pleuresía.

Porcinos: neumonía, paratifosis, metritis, septicemia, disentería infecciosa.

Caninos y felinos: neumonía, bronquitis, pleuresía, peritonitis, complicaciones del

distemper.

Conejos: coriza, pasteurelosis, mamitis, neumonía.

Aves: enfermedad crónica respiratoria, coriza infeccioso (Moquillo), cólera, tifus,

espiroquetosis, sinusitis infecciosa, pullorosis, onfalitis en pollitos. (Sani, s.f.)

Cabe destacar que se recomienda que este tipo de compuestos no sean

administrados a equinos destinados al consumo alimentario humano ni en aves

ponedoras, a menos que los huevos sean destinados para incubación. Tampoco se

recomienda el uso simultáneo de tetraciclinas con antibióticos bactericidas (San

Fransisco Health Plan , s.f.)

La dosis de administración varía en función del animal a tratar, el tipo de

enfermedad y la forma de administración. En todos los casos lo que debe respetarse es

el tiempo de retiro recomendado por el fabricante a fin de garantizar la ausencia de

residuos de este medicamento en los alimentos obtenidos de animales sometidos a

tratamiento. (Plumb, Manual de Farmacologia Veterinaria, 2010, pág. 821)

Para los humanos la ingestión de tetraciclinas se ha asociado con diferentes

efectos adversos como “cambios en la flora intestinal e inhibiciones terapéuticas por el

desarrollo de resistencia bacteriana” (JECFA, 1990), también se ha relacionado con

riesgos teratogénicos, reacciones de hipersensibilidad (Reig & Toldrá, 2008) y manchas

en los dientes de niños (Shaid, y otros, 2007)

Farmacología de la oxitetraciclina. 2.2.7.1.

Como se ha mencionado anteriormente, la oxitetraciclina es un agente

bacteriostático, que inhibe la síntesis proteica por fijación reversible a las subunidades

ribosomales 30S lo que causa que el aminoacil ARNtransferesa no se una, las

tetraciclinas en altas concentraciones han llegado hasta inhibir la síntesis proteica en

células animales.

Tienen actividad contra la mayoría de los micoplasmas, espiroquetas, clamidias y

rickettsias. Asimismo, son eficaces contra bacterias Gram Positivas como Actinomyces

spp, Bacillus anthracis, Clostridium perfringes y tetani, Listeria monocytogenes y

Nocardia, y contra bacterias Gram Negativas como Brucella, Shigella, Yersinia, pero no

son eficaces para Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa.

(Plumb, 2010)

22

Farmacocinética de la oxitetraciclina. 2.2.7.2.

Este antibiótico es absorbido con gran facilidad ya que su biodisponibilidad es de 60-

80%, la presencia de alimento o de leche puede disminuirla a un 50%. Tienen una amplia

distribución en el cuerpo (corazón, riñones, hígado, pulmones, músculos, bilis, saliva,) pero no

alcanzan el líquido cefalorraquídeo, siendo el volumen de distribución de la oxitetraciclina de

2.1 L/kg peso en animales pequeños como las aves.

Las tetraciclinas y las oxitetraciclinas son eliminadas en su mayoría por filtración

glomerular (eliminación por la orina), no obstante, pueden acumularse por dosificaciones

repetidas ya que estos parecen no ser metabolizados, pero en el tracto gastrointestinal se

excretan por vías biliares y no biliares. (Plumb, 2010)

En el caso de las aves, el lugar de mayor concentración de oxitetraciclina es la

pechuga ya que el fármaco se puede administrar vía intramuscular u oral, al ser de la

primera forma penetra directamente en el músculo y al no tener una buena irrigación el

animal, el antibiótico quedará en este y no se eliminará fácilmente por vía biliar o renal,

al administrarse de la segunda forma la oxitetraciclina estará presente en el tracto

gastrointestinal y en la sangre y en el caso de una sobredosificación, éste puede

acumularse en los músculos donde hay una mayor irrigación. (Plumb, 2010)

Método HPLC. 2.2.8.

La cromatografía de líquidos de alta eficacia, HPLC, es una

técnica analítica de separación de gran sensibilidad que se

caracteriza por su fácil adaptación a determinaciones

cuantitativas exactas, la idoneidad para la separación de

especies no volátiles y gran aplicabilidad en sustancias de

interés para la industria. Algunos ejemplos incluyen:

aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,

carbohidratos, fármacos, plaguicidas, terpenos, antibióticos,

esteroides, entre otros. (Skoog, Holler, & Niemas, Principios de

Análisis instrumental, 2001)

En HPLC, se utiliza presiones elevadas para forzar al disolvente a que pase por la

columna que contiene partículas muy finas, consiguiendo así separaciones de gran

resolución (Harris, 2007)

23

Figura 8.Esquema de funcionamiento del HPLC (Skoog, Holler, & Niemas, Principios

de Análisis instrumental, 2001)

Instrumentación para la cromatografía HPLC. 2.2.8.1.

Columna

“Las columnas se construyen de acero inoxidable con un diámetro interno

uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes

resistentes” (Skoog, Holler, & Nieman, 2001, pág. 792). La mayoría de las columnas

tienen una longitud de 10 y 30 cm, con un diámetro interno de 4-10 mm y tamaño de

los rellenos de 5-10 µm.

Figura 9. Columna de HPLC provista de una precolumna cambiable para retener por

adsorción las impurezas (Harris, 2007)

24

Detector

Un detector ideal para la cromatografía de líquidos debería poseer estas

propiedades: adecuada sensibilidad, buena estabilidad y reproducibilidad, respuesta

ideal para los solutos, tiempo de respuesta corto, alta fiabilidad y manejo sencillo, no

destructivo para la muestra (Skoog, Holler, & Nieman, 2001).

Detector UV/visible 2489

“El detector UV/visible 2489 (Figura 13) es el detector de absorbancia de doble

longitud de onda más sensible y versátil que se puede utilizar a la hora de efectuar

análisis mediante HPLC. Combina una fuente de deuterio de alta energía, un diseño

óptico preciso y dispositivos electrónicos con poco ruido y gran velocidad. Estas nuevas

funcionalidades hacen que el rendimiento de la detección UV/visible alcance una nueva

dimensión” (Waters , s.f.)

Características:

- Alta Sensibilidad mejorada que minimiza los efectos del IR

- Poco ruido (< 5 µAU)

- Mejor valor de la relación señal/ruido durante toda su vida útil

- Velocidades de muestreo flexibles, de entre 1 y 80 Hz

- El control mejorado de la oscilación térmica reduce la deriva de la línea base

debidos a las fluctuaciones producidas por condiciones ambientales

- Componentes accesibles del detector que facilitan el funcionamiento y el

mantenimiento (Waters , s.f.)

Figura 10. Detector UV-VIS 2489 Waters

La técnica de HPLC tiene un campo amplio de aplicación por su sensibilidad,

como ejemplo podemos mencionar las siguientes:

- Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

- Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos

- Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,

aditivos, azúcares.

- Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos,

propulsores, colorantes

25

- Contaminantes: fenoles, Pesticidas, Herbicidas, PCB

- Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos

- Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,

estrógenos.

Parámetros de validación para un método cromatográfico. 2.2.8.2.

Linealidad:“capacidad de un método analítico de producir resultados que sean

directamente, o por medio de una transformación matemática definida, proporcionales a

la concentración de analito en la muestra” (Eurachem, 2016).

El límite de detección (LOD) se define como “la menor concentración del analito

que será detectado y puede ser identificado” cuya fórmula es LOD= 3S’o, donde Cb es

la concentración promedio del blanco y S la desviación estándar del blanco. (Eurachem,

2016)

El límite de cuantificación (LC) como “la menor concentración del analito

puede determinarse con una presión y exactitud aceptables bajo las condiciones

establecidas de prueba” de formula LC=10S’o, donde Cb es la concentración promedio

del blanco y S la desviación estándar del blanco (Eurachem, 2016)

Intervalo de trabajo: “es el intervalo en el cual el método proporciona resultados

con una incertidumbre aceptable. El extremo inferior del intervalo de trabajo está

determinado por el límite de cuantificación” (Eurachem, 2016).

Repetibilidad:“precisión obtenida aplicando un mismo procedimiento, sobre una

misma muestra, con el mismo operador, en intervalos cortos de tiempo, utilizando el

mismo equipamiento, dentro de un mismo laboratorio’’ (Eurachem, 2016).

Reproducibilidad: “precisión obtenida aplicando un mismo procedimiento, sobre

una misma muestra, en diferentes laboratorios, distintos operadores, con diferente

equipamiento” (Eurachem, 2016).

Porcentaje de Recuperación: fracción de analito adicionada a una muestra

previa al análisis que es determinada por el método que se calcula con %R= ((CF-

CU)/CA)*100 donde CF es la Concentración muestra fortificada, CU Concentración

muestra sin fortificar y CA Concentración teórica. (Eurachem, 2016)

2.3. Marco Legal

Para el desarrollo del presente trabajo se utilizará como referencia las siguientes normas

nacionales:

- Norma técnica NTE INEN 1338 “Carne y productos cárnicos Productos cárnicos

crudos, productos cárnicos curados-madurados y productos cárnicos precocidos-

cocidos. Requisitos”. - Norma técnica NTE INEN CODEX CAC/MRL 2: Límites máximos de residuos

para medicamentos veterinarios en los alimentos (CAC/MRL 2 – 2012, IDT).

- Resolución 0018 “Instructivo para la supervisión y control post registro de

productos veterinarios” de la Agencia de Regulación y Control Fito y

Zoosanitario AGROCALIDAD.

26

- Resolución 0064 “Plan Nacional de Vigilancia y Control de Contaminantes en la

Producción primaria” de la Agencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario

AGROCALIDAD.

- Constitución de la República del Ecuador 2008 en el Art. 281.- La soberanía

alimentaria constituye un objetivo estratégico y una obligación del Estado para

garantizar que las personas, comunidades, pueblos y nacionalidades alcancen la

autosuficiencia de alimentos sanos y culturalmente apropiado de forma

permanente.

Adicionalmente, se utilizará como referencia las siguientes normas internacionales:

- Código de Prácticas Internacional CAC/MRL 2-2017 “Límites máximos de

residuos (LMR) y recomendaciones sobre la gestión de riesgos (RGR) para

residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos” de la Comisión del

Codex Alimentarius.

- Reglamento (UE) No 37/2010 de la Comisión del 22 de diciembre de 2009

“Sustancias farmacológicamente activas y su clasificación en relación con los

límites máximos de residuos en alimentos de origen animal” de la Unión

Europea.

2.4. Hipótesis

La hipótesis de trabajo y la hipótesis nula que se plantean en esta investigación

son las siguientes:

Hi: Las muestras de carne de pollo contienen residuos de oxitetraciclinas por

encima de los límites máximos establecidos en la normativa vigente.

Ho: Las muestras de carne de pollo no contienen residuos de oxitetraciclinas por

encima de los límites máximos establecidos en la normativa vigente.

2.5. Sistemas de Variables

Variable independiente. 2.5.1.

Muestras de carne de pollo recolectadas en diferentes lugares comerciales de expendio

de carne de pollo de la ciudad de Quito. (Anexo B.)

Variable dependiente. 2.5.2.

Concentración de oxitetraciclina (OTC) en la carne de pollo.

27

Capítulo III

Marco Metodológico

3.1. Diseño de la investigación

3.1.1. Paradigma o enfoque de investigación.

La investigación del proyecto “Determinación de residuos de antibióticos,

tetraciclinas (oxitetraciclinas), en muestras de carne de pollo mediante el método de

cromatografía liquida de alta precisión HPLC” tiene un enfoque mixto, es decir tiene

investigación bibliográfica y experimental ya que mediante estudios, libros, normas y

reglamentos se definieron parámetros para la metodología y tratamiento de la muestra,

además que se reunió información de la procedencia de las muestras de carne de pollo,

adicionalmente se aplicó el método cromatográfico HPLC para conocer las

concentraciones de este tipo de antibióticos en estos productos alimenticios. Luego los

resultados obtenidos fueron comparados con la normativa vigente.

3.1.2. Nivel de investigación.

La investigación que tiene como fin determinar los residuos de oxitetraciclina en

carne de pollo mediante el método analítico de HPLC tiene un nivel descriptivo ya que

se pretende conocer si existe contaminación química por residuos de OTC de la carne de

pollo destinada al consumo humano.

3.1.3. Tipos de investigación.

El proyecto de investigación, según la naturaleza de los objetivos en cuanto al

nivel de conocimiento que se desea alcanzar es una investigación exploratoria: es

considerada como el primer acercamiento científico a un problema. Se utiliza cuando

éste aún no ha sido abordado o no ha sido suficientemente estudiado y las condiciones

existentes no son aún determinantes (Hernandez, 2012), también es una investigación

descriptiva ya que se describe los componentes principales del estudio y una

investigación cuantitativa: es aquella que utiliza predominantemente información de

tipo cuantitativo directo dentro de la cual se encuentra un diseño

experimental (Hernandez, 2012)

3.2. Población y muestra

En esta investigación se trabajó con muestras de pechuga de pollo proporcionadas

por la Unidad de Investigación de Enfermedades Transmitidas por Alimentos y

Resistencias a los Antimicrobianos (UNIETAR).

Las muestras analizadas forman parte del muestreo realizado en el marco del

proyecto “Prevalence and antimicrobial resistance of Camylobacter, Salmonella and

Escherichia coli ESBL in poultry farms, poultry meat at retail and human gastroenteritis

28

cases in Ecuador”, dirigido por el PhD. Cristhian Vinueza de la Facultad de Medicina

Veterinaria.

Para el proyecto en mención, durante el período comprendido entre enero y mayo

de 2018 se recogieron 220 muestras procedentes de supermercados, tiendas y mercados

ubicados al norte y sur de la ciudad de Quito.

Debido a las limitaciones económicas temporales y de disposición para el uso de

equipos, no ha sido posible analizar la totalidad de las muestras tomadas, por lo que se

decidió tomar una submuestra aleatoria compuesta por 32 unidades, por tanto, en este

caso se trata de un muestreo dirigido.

El origen y las fechas de muestreo se detallan en el Anexo E.

3.3. Métodos y Materiales

El estudio se realizó entre los meses de abril y agosto de 2018, en el Laboratorio

de Análisis de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas para la extracción de

muestra mientras que la determinación cromatográfica por HPLC se realizó en el

Laboratorio de Insumos Veterinarios de Agrocalidad.

El método experimental utilizado para la determinación fue “AOAC 995.09:

Clortetraciclina, Oxitetraciclina y Tetraciclina en tejidos animales por cromatografía

líquida” descrito en el Manual de Métodos Oficiales de Análisis de la Association of

Official Analytical Chemists (AOAC), con pequeñas modificaciones para poder

adaptarlo a las condiciones de trabajo del laboratorio.

En la investigación se trabaja con un equipo HPLC de marca Waters Alliance

2695, que tiene como características:

- “Presión máxima de funcionamiento: 5000psi

- Rango de volumen de inyección: 0.1 a 100 μL

- Velocidad de flujo: hasta 10 ml / min

- Número de viales de muestra: 120

- Cantidad de solventes: 1 a 4” (Sientific Support, 2017)

Figura 11.Equipo HPLC Waters Alliance 2695 (Sientific Support, 2017)

29

También para el análisis de oxitetraciclinas en muestras de carne de pollo se

utiliza una columna de marca Merck llamada Purospher STAR RP-18 endcapped (5

um) Lichrocart 150-4.6 HPLC-Cartridge (Figura 12).

Figura 12. Columna Merck Purospher STAR RP-18 endcapped (5 um) Lichrocart 150-

4.6 HPLC-Cartridge con sus respectivos manucarts. (Merck, 2018)

3.3.1. Extracción de muestra.

Se pesaron 5 ± 0.05 g de pechuga y se homogeneizaron con 20 mL del Buffer

Mcllvaine-EDTA en una licuadora durante 30 segundos o más hasta conseguir un

tamaño de partícula adecuado.

Las muestras se trasladaron a recipientes de plástico de 50 mL, se agitaron

manualmente por 10 segundos y se sometieron después a centrifugación durante 10

minutos a 2500 rpm en una centrifuga Thermo Scientific. Se recogió el sobrenadante en

un segundo tubo Falcón de 50 ml y al tejido que quedó en el primer tubo se le sometió a

una segunda extracción en las mismas condiciones. Finalmente, se realizó una tercera

extracción con 10 mL de buffer. El segundo tubo que contiene aproximadamente 50

mL de extracto se centrifuga a 2500 rpm por 20 minutos y luego se trasvasa el

contenido a recipientes de plástico de 50 mL.

El extracto es filtrado al vacío con papel filtro de poro común y lavado con 2 mL

del Buffer Mcllvaine-EDTA.

Para finalizar el proceso de extracción y asegurar una mayor pureza de las

muestras, el extracto se pasó por una columna de fase sólida reversa (C18 SPE)

acondicionada con 20 mL metanol y 20 mL agua. Se lavó el frasco de cada muestra con

10 mL de agua destilada y se dejó secar la columna para luego añadir 6mL de ácido

oxálico metanólico y así eluir la oxitetraciclina que se recogió en matraces de vidrio 10

mL que se aforaron con agua tipo I.

Por último, cada matraz se homogenizo y se trasladó a jeringas con filtros de 0.22

um para ser filtradas manualmente en los viales para luego ser leídas en el HPLC del

Laboratorio de insumos veterinarios de Agrocalidad.

30

Tabla 4. Materiales, Equipos y reactivos para la extracción de la muestra (Ayala S.,

2018)

Materiales Equipos Reactivos

Cuchillo

Tabla de picar

Espátula

Recipientes de plástico

de 50 mL

Balones aforados de 10

mL, 1L, 2L (vidrio)

Erlenmeyer de 250 mL

Probeta de 50 mL

Tubos Falcon de 50 mL

Papel filtro

Filtros de poro 0.22 µm

Jeringas

Columnas SPE C18

Balanza analítica Mettler

Toledo ±0.0001 unidades

Licuadora Oster

Centrifuga Thermo Scientific

ST40

Equipo de filtración al vacío

Equipo de filtración SPE de

20 puertos

Potenciómetro Mettler

Toledo ± 0.005 unidades

Buffer McIlvaine

Ácido disódico fosfórico,

Na2HPO4 grado reactivo

Agua destilada

Ácido cítrico monohidratado

Hidróxido de sodio, NaOH

0.1 M

EDTA dihidratado

Buffer McIlvaine -EDTA

Ácido oxálico dihidratado

grado reactivo

Metanol grado HPLC

3.3.2. Preparación de la curva de calibración.

Preparación de estándares

Para la realización de estos se preparó una solución madre de 5 µg/mL, para la

cual se pesó 0.0005 g del estándar de oxitetraciclina USP en un balón aforado de

100mL y se diluyó con metanol grado HPLC. De esta solución se tomaron volúmenes

de 0.1, 0.2, 0.5. 1.0 y 2.0 mL en balones de 10 mL a los cuales se les añadió 6 mL de

ácido oxálico metanólico 0.001M y se aforaron con agua tipo I, para realizar los

estándares de concentraciones 0.05 ppm, 0.1 ppm, 0.25 ppm, 0.5 ppm y 1.0 ppm

respectivamente, que finalmente fueron pasados a jeringas con filtros de 0.22 µm para

pasarlos a los viales de 2mL y realizado la corrida en HPLC para obtener las curvas de

calibración.

Tabla 5. Materiales, Equipos y reactivos para preparación de curvas de calibración

(Ayala S., 2018)


Espátula

Balón aforado de 100

mL

Balones aforados de

10 mL (vidrio)

Balanza analítica Mettler Toledo ±0.0001

unidades

Equipo HPLC Alliance Waters 2695

Detector UV-VIS Waters 2489

Columna Puospher STAR RP-18 endcapped

Estándar USP

100%

Agua tipo 1

Acido oxálico

metanólico

31

Pipeta graduada de

0.2 mL

Pipeta graduada de 1

mL

Pipeta aforada de

1mL

Pipeta aforada de 2

mL

Filtros de poro 0.22

µm

Jeringas

(5um) LiChro CART 150-4.6 HPLC-

Cartridge

Metanol grado

HPLC

3.3.3. Recuperación (fortificación de la muestra).

Se tomó 5.0203 g y 5.0040 g de pechuga de pollo de un ave de granja a la cual no

se le administró ningún tipo de medicamento, a ambas muestras se adicionó 100 µL de

una solución de concentración 25 µg/ml de oxitetraciclina (0.00262g de estándar de

oxitetraciclina 95.6% a un aforo de 100 mL de metanol), se dejó reposar por un día y se

realizó la extracción.

Tabla 6. Materiales, Equipos y reactivos para fortificar la muestra y obtener la

recuperación del método (Ayala S., 2018)


Cuchillo

Tabla de picar

Espátula

Recipientes de plástico

de 50 mL

Balones aforados de 10

mL, 1L, 2L (vidrio)

Erlenmeyer de 250 mL

Probeta de 50 mL

Tubos Falcon de 50 mL

Papel filtro

Filtros de poro 0.22 µm

Jeringas

Columnas SPE C18

Balón aforado de 100

mL

Espátula

Pipeta de 100 uL

Balanza analítica Mettler

Toledo ±0.0001 unidades

Licuadora Oster

Centrifuga Thermo Scientific

ST40

Equipo de filtración al vacío

Equipo de filtración SPE de

20 puertos

Potenciómetro Mettler

Toledo ± 0.005 unidades

Estándar Oxitetraciclina

95,6%

Buffer McIlvaine

Ácido disódico fosfórico,

Na2HPO4 grado reactivo

Agua destilada

Ácido cítrico monohidratado

Hidróxido de sodio, NaOH

0.1 M

EDTA dihidratado

Buffer McIlvaine -EDTA

Ácido oxálico dihidratado

grado reactivo

Metanol grado HPLC

32

3.3.4. Análisis de muestras por HPLC.

Para acondicionar el equipo se filtró 1L de acetonitrilo, 1L de metanol, 1L de

ácido oxálico metanólico y agua tipo I, una vez filtrados se sumergieron los buzos y se

empezó a pasar agua a un flujo de 0.1 mL/min por 45 min, una vez lavado el equipo

HPLC Alliance Waters 2695 se acondicionó la columna Puospher STAR RP-18

endcapped (5um) LiChro CART 150-4.6 HPLC- Cartridge con la fase móvil en

proporciones de 15% de acetonitrilo, 65% de Ácido oxálico metanólico 0.001M y 20 %

de metanol, a un flujo final de 1.2 mL/min, se colocaron los viales de los estándares y

muestras en el carrusel A y se empezó la corrida a condiciones cromatográficas finales

de un volumen de inyección de 115 uL, una temperatura del horno y de la muestra de

20ºC, un tiempo de corrida de 3 min y una longitud de onda del detector UV-VIS

Waters 2489 de 350nm.

Tabla 7. Materiales, Equipos y reactivos para análisis de las muestras de carne de pollo

(Ayala S., 2018)


Viales 2 mL

Equipo HPLC Alliance Waters 2695

Detector UV-VIS Waters 2489

Columna Puospher STAR RP-18

endcapped (5um) LiChro CART 150-4.6

HPLC- Cartridge

Metanol grado HPLC

Acetonitrilo grado HPLC

Acido oxálico

metanólico

Agua tipo 1

3.3.5. Preparación de los reactivos

- Buffer Mcllvaine: Se pesó 28.4107 g de Na2HPO4 grado reactivo, se llevó esto

a un balón aforado de 1 L y se disolvió con agua hasta el aforo. Luego se pesó

21.0010 g de ácido cítrico monohidratado, se trasladó a un balón aforado de 1 L

y se aforo con agua destilada. En un balón de 2L se mezcló 625 mL de la

solución de fosfato disodio junto con 1L de la solución de ácido cítrico. Se

midió el pH con el potenciómetro resultando un pH de 3.25 y se ajustó con 50

mL de NaOH a un pH de 4.004 como indica el método (pH 4.0 ± 0.05).

- Buffer Mcllvaine-EDTA: a la solución Buffer Mcllvaine que contenía 1.625 L

se le añadió 47.5041g de EDTA 0.1 M y se preparó semanalmente.

- Acido Oxálico metanólico. Se disolvió 1.2605 g de ácido oxálico dihidrato

(grado reactivo) en metanol grado HPLC en un matraz aforado de 1 L, este se

preparó diariamente.

3.4. Operacionalización de variables

Tabla 8. Matriz de operacionalización de Variables (Ayala S, 2018)

Variables Dimensiones Indicadores

V. Independiente Músculo de pollo Cantidad de muestra

33

Muestras de pollo (pechuga) analizada (~ 5g)

V. Dependiente

Concentración de

oxitetraciclina

Oxitetraciclinas Concentración de OTC,

ppb (µg/kg)

3.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos

La observación fue la técnica empleada para la recolección de los datos y el

instrumento utilizado fue un formato proporcionado por el laboratorio de Insumos

Veterinarios de AGROCALIDAD donde se anotó los resultados obtenidos de la parte

experimental tanto de las muestras, estándares y parámetros de desempeño del método

(anexo D), además de la procedencia de las muestras y la parte de cual fue obtenidas las

mismas.

3.6. Validez y Confiabilidad de los instrumentos de recolección de datos.

Al utilizar un instrumento para la recolección de datos que es empleado por las

autoridades oficiales de control, se considera que el mismo está validado y es confiable

no requiriendo por lo tanto una validación adicional (ver Anexo D).

3.7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos

Para poder analizar los resultados obtenidos, primero se definieron los parámetros

del método, para lo cual se obtuvo una curva de calibración promedio midiendo el área

del pico del cromatograma producido por concentraciones estándares de 0.05 ppm, 0,10

ppm, 0.25 ppm, 0.50 ppm y 1.0 ppm se obtuvieron cuatro curvas de calibración

midiendo el área producida durante cuatro días no consecutivos.

Estas determinaciones permitieron definir lo siguiente:

Ecuación 1.Ecuación de la recta

y = ax + b

Ecuación 2. Linealidad

+b

Ecuación 3.Límite de cuantificación

LC = 10Sr

Ecuación 4.Límite de detección

LOD = 3Sr

Ecuación 5.Rango de trabajo

LC y C max

Ecuación 6. Porcentaje de recuperación

%Rec=

100

34

Una vez analizadas las muestras, los resultados se sometieron a un análisis de

contraste comparando la concentración obtenida con un valor de referencia, en este caso

el valor de referencia es el LMR del Codex Alimentarius, que para el músculo de pollo

es de 200 ppb para oxitetraciclinas y por parte de la Unión Europea el LMR de 100 ppb.

Con los valores obtenidos se hizo un análisis estadístico de medidas de dispersión donde

se calculó el rango y la media de los resultados y como límite de control se usó el LMR.

35

Capítulo IV

Análisis de resultados

4.1.Resultados de las curvas de calibración con los estándares

Para el estudio se realizó cuatro curvas de calibración, las curvas se elaboraron

con cinco concentraciones diferentes de estándar de oxitetraciclina: 0.05 ppm; 0,10

ppm; 0.25 ppm; 0.50 ppm y 1.0 ppm. A partir de estos datos se determinaron los

parámetros del método.

En las gráficas siguientes se puede observar las rectas obtenidas al representar el

área del pico frente la concentración del estándar (ppm). Las curvas se obtuvieron

durante 4 días diferentes.

Gráfica 2. Curva de calibración 1 (Ayala S, 2018)

y = 65548x - 1838,6 R² = 0,9943

0,00

10000,00

20000,00

30000,00

40000,00

50000,00

60000,00

70000,00

0,00000 0,20000 0,40000 0,60000 0,80000 1,00000

área

concentración, ug/mL

Concentracion vs área

y = 23304x - 457,06 R² = 0,9951

0,00

5000,00

10000,00

15000,00

20000,00

25000,00

0,00000 0,20000 0,40000 0,60000 0,80000 1,00000 1,20000

area

Conc. ug/ml

Concentración vs Área

36




En la tabla 9 pueden observarse los valores obtenidos para cada curva, así como el valor

promedio de los parámetros.

Tabla 9. Pendientes, ordenadas y coeficiente de correlación de cada curva, con el

promedio de cada parámetro (Ayala S. 2018)

Curva Pendiente Ordenada R2

1 65548 1838,60 0,994355

2 23304,22 457,06 0,994655

3 60954,00 1829,40 0,995092

4 98909,00 2959,20 0,995986

Promedio 62178,80 1771,06 0,994997

Las curvas mantienen un coeficiente de correlación promedio de 0.9950 lo que

indica que no hay mucha dispersión en los datos y la linealidad se mantiene, al

comparar este resultado con los obtenidos en el estudio “Extracción de oxitetraciclina en

y = 60954x - 1829,4 R² = 0,9951

0,00

20000,00

40000,00

60000,00

80000,00

0,000000,200000,400000,600000,800001,000001,20000

area

,

conc. ug/ml


y = 98909x - 2959,2 R² = 0,996

0,00

20000,00

40000,00

60000,00

80000,00

100000,00

120000,00

0,000000,200000,400000,600000,800001,000001,20000

area

conc. ug/ml


37

carne de pollo: estudios de rendimiento con aumento de la fase polar del solvente de

extracción” (Izquierdo, y otros, 2010) vemos que el coeficiente de relación obtenido en

la investigación es mayor (0,9950 frente a 0,9677), demostrándose la relación que existe

entre la concentración de oxitetraciclina y el área del pico obtenido.

4.2. Resultados de los parámetros del método

La elaboración de las curvas de calibración permitió obtener los parámetros del

método como: linealidad y rango de trabajo, con los datos del estándar de concentración

más baja se definió el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LC),

finalmente con los datos de las muestras fortificadas se obtuvo el porcentaje de

recuperación del método de extracción.

4.2.1. Linealidad

Como se muestra en la Gráfica 5 la linealidad del método se comprueba porque de

acuerdo con la concentración del analito existe una respuesta proporcional del área del

pico. Los datos muestran que el intervalo lineal tiene como valor máximo una

concentración de 1000 ppb y una señal de 97842.68 AU y un valor mínimo de 50 ppb y

una señal mínima de 1236.57 AU.

Gráfica 6. Intervalo de linealidad del método (Ayala S, 2018)

4.2.2. Límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LC) y

repetibilidad.

Para poder establecer los parámetros LOD y LC se utilizó los resultados del área

del pico obtenidos para la solución estándar de OTC de 50 ppb en los diferentes días en

los que se realizó las curvas de calibración. A partir de la ecuación de la recta obtenida

para cada curva (Tabla 9) y el área de pico promedio se determinó la concentración

detectada y la desviación estándar.

1000; 97842,68

50; 1236,57

0,00

10000,00

20000,00

30000,00

40000,00

50000,00

60000,00

70000,00

80000,00

90000,00

100000,00

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Are

as

Conc (ppb)

linealidad

38

De los resultados detallados en la tabla 10, se obtiene que el método presenta un

LOD de 2.94 ppb y un LC de 9.79 ppb, que al ser comparados con el estudio realizado

en Colombia por Acosta, Romero y Taboarda (2014) titulado “DETERMINACIÓN DE

RESIDUOS DE OXITETRACICLINA EN MUESTRAS DE CARNE BOVINA” que

presenta un límite de cuantificación de 100 ppb (ug/L) se observa que el instrumento

utilizado para esta determinación tiene una mayor sensibilidad y que se puede detectar

muestras con concentraciones de oxitetraciclina inferiores a los límites máximos de

residuos establecidos tanto por el CODEX que es de 200 ppb como por la Unión

Europea que es de 100 ppb.

Tabla 10. Desviación estándar, promedio y coeficiente de variación del estándar uno

utilizado para obtener LOD y LC (AGROCALIDAD,2018)

Curva a b (-) Area 1 Area 2 Area

Promedio

Conc.

ppm

1 65548 1838,6 2956,46 2827,78 2892,12 0,072

2 23304,22 457,06 1169,54 1303,6 1236,57 0,073

3 60954 1829,4 2373,31 2464,13 2418,72 0,070

4 98909 2959,2 4623,94 4182,51 4403,225 0,074

S 0,002

X 0,072

CV 0,027

s' 0,0010

LOD 0,003

LC 0,010

En el estudio “EXTRACCIÓN DE OXITETRACICLINA EN CARNE DE

POLLO: ESTUDIOS DE RENDIMIENTO CON AUMENTO DE LA FASE POLAR

DEL SOLVENTE DE EXTRACCIÓN” (Izquierdo, y otros, 2010) el límite de detección

obtenido para la extracción de Oxitetraciclina con acetonitrilo/hexano en proporción 2:1

fue de 0,09 µg/g, que equivale a 90 ppb, encontrándose este valor también por encima

del límite de detección calculado en el presente estudio (2.94 ppb), pudiendo cuantificar

muestras a partir de esa concentración, aunque con cierta inexactitud y precisión.

La repetibilidad del método se calculó con √ donde el valor de

Student (3.2) y desviación estándar medida bajo condiciones de repetibilidad

(Eurachem, Guía de Laboratorio para la validación de métodos y temas relacionados,

2016). Obteniéndose r= 0.006 y un CV=0.006 para una concentración de 250ppb y para

una concentración de 1000ppb un r=0.032 y CV=0.006 que indica que hay una

proximidad entre los datos diciéndose que el método es repetible ya que un estudio

realizado por (Henández Falcon, Ledea Lozano, Gonzáles, & González García, 2015)

titulado “Validación de un método cromatográfico para la determinación de cafeína en

muestras acuosas de la Industria Farmacéutica” donde se trabaja la repetibilidad del

método a concentraciones equivalentes de 50 y 150% es decir un valor bajo y otro alto,

siendo así que hace sextuplicados en las mismas condiciones y obtiene un coeficiente de

39

variación CV< 1.5% . Además, la desviación estándar del método nos indica que el

método es preciso con 0.002 de distancia entre los resultados.

4.2.3. Rango de trabajo.

El rango de trabajo se estableció a partir del límite de cuantificación que es 9.79

ppb y con el valor máximo de concentración de la curva que es 1000 ppb, es decir que

dentro de 10-1000 ppb se encontrarán los datos de las muestras analizadas. Ver gráfico

13.

4.2.4. Sesgo (Porcentaje de recuperación del método).

Con el fin de evaluar la veracidad del método se calculó el sesgo, utilizando para

ello el enfoque del porcentaje de recuperación. Se trabajó con dos muestras blanco

fortificadas a la concentración de 0.5 µg/g (500 ppb).

Se garantiza que las muestras utilizadas para la fortificación no contenían ningún

tipo de medicamento veterinario por su procedencia, se trata de muestras provenientes

de un criadero artesanal de aves de corral donde se controla la no utilización de

medicamentos veterinarios tanto en la alimentación (a base de morochillo) como en el

agua de bebida.

Las muestras al ser sometidas al proceso de extracción indicado en el método y

analizadas con el equipo HPLC, emitieron una señal correspondiente a las siguientes

concentraciones calculadas según la curva: 0.14 µg/g (140 ppb) y 0.19 µg/g (190 ppb)

(ver detalle en 4.3), aplicando la fórmula se obtiene el porcentaje de recuperación

estimado.

% recuperación=

Tabla 11. Comparación de recuperación de muestras fortificadas con 0.5 µg/g de

oxitetraciclina (Ayala S., 2018).

Concentración fortificada, µg/g

Concentración calculada, µg/g % Recuperación

0,5 0,145 29

0,5 0,195 39

Promedio 0.17 34

En promedio se tuvo un 34% de recuperabilidad del método, este valor es muy

bajo si lo comparamos con el porcentaje de recuperación estimado en el método AOAC

995.09 “Clortetraciclinas, oxitetraciclinas y tetraciclinas en tejidos animales por

cromatografía líquida” donde se indica que gracias a la extracción en fase sólida SPE

que brinda una mayor elución y pureza, debería obtenerse una recuperación ≥80% en

tejidos fortificados, lo que contrasta drásticamente con la experimentación. Esta

diferencia en los resultados se pudo dar por diferentes factores como: la experticia del

operador, la pureza de los solventes o muy probablemente por el tamaño del poro del

filtro que se usa para pasar a los viales ya que se utilizó un filtro de 0.22 µm y en la

técnica se indica un filtro de 0.45 µm, por tanto esto pudo interferir con el paso del

40

antibiótico y haciendo que las moléculas queden retenidas en el poro del mismo

disminuyendo en gran medida la cantidad de antibiótico cuantificado.

Adicionalmente, Ciarlone, Fry y Zimer (1990) encontraron que cuando se utiliza

material de vidrio en las determinaciones de oxitetraciclina hay una unión entre la

tetraciclina y el borosilicato presente en el vidrio, lo que puede ocasionar una

disminución en el rendimiento de extracción que será menor a medida que aumente el

tiempo de interacción, esto también pudo influir en los resultados obtenidos ya que se

utilizó una licuadora de vidrio para la homogeneización de la muestra y matraces de

vidrio para el aforo a 10 mL de las muestras antes de pasar a los viales.

Cuando se modificó la fase polar del solvente de extracción para la determinación

de OTC en carne de pollo, se observó que a concentraciones de 200 ppb se obtenía una

recuperación del 91.5% para la proporción de 5:4 (Acetonitrilo/hexano) y 92.5 % para

la proporción 2:1 (Acetonitrilo/hexano); sin embargo, al aumentar la concentración de

oxitetraciclina a 0.5 ug/g (500 ppb) la recuperación disminuye a 46.2% con

proporciones de 5:4 (Acetonitrilo/hexano) y a 89% con la proporción 2:1

(Acetonitrilo/hexano). (Izquierdo, y otros, 2010). Al ser diferentes el método de

extracción y la fase móvil del método no es del todo recomendable comparar los

porcentajes obtenidos, pero se observa que a medida que se incrementa la concentración

de OTC hasta los niveles utilizados en este estudio, el porcentaje de recuperación de la

molécula disminuye; también conviene destacar lo mencionado en el estudio con

respecto a la adsorción del analito como fuente de pérdida, en este caso la

homogeneización de la muestra se hizo mediante una licuadora donde se depositaron

apenas 5 g del tejido lo cual es insignificante para el área y volumen de la licuadora que

llega a contener hasta 1200 ml pudiendo quedarse retenido el analito en esta superficie.

4.3. Resultados de la fortificación de la muestra blanco

Siguiendo las directrices del método AOAC 995.09 ”Clortetraciclina,

Oxitetraciclina y Tetraciclina en tejidos animales por cromatografía liquida” las

muestras de código mf1y mf2 de peso 5.0203g y 5.0040 g respectivamente, se

fortificaron con 100 µl de una solución de oxitetraciclina de 25 µg/mL, lo que equivale

a una concentración de 0.5 µg/g.

Las muestras fortificadas se sometieron al mismo procedimiento de extracción

recomendado en el método y que se utilizó para las demás muestras de pollo. Las

condiciones en las que se llevó a cabo el análisis en el equipo HPLC Alliance Waters

2695 fueron: fase móvil acetonitrilo: ácido oxálico metanólico: metanol (15:65:20);

longitud de onda 350nm; flujo 1.2mL/min; volumen de inyección 15uL, tiempo de

corrida 3 minutos y temperatura del horno y de la muestra a 20ºC.

Para el cálculo de la concentración experimental se utilizó dos de las curvas de

calibración elaboradas con estándares de 0.05 ppm,0,10 ppm, 0.25 ppm, 0.50 ppm y 1.0

ppm. En las tablas 12 y 13 se observa los resultados obtenidos.

41

Tabla 12. Área de pico obtenida con estándares de OTC (AGROCALIDAD,2018)

Área

concentración, ug/mL aforo 1 L1 L2 Promedio

st1 0,05000 10 2373,31 2464,13 2418,72

st2 0,10000 10 4384,40 4442,76 4413,58

st3 0,25000 10 13665,70 13502,17 13583,93

st4 0,50000 10 25887,26 25789,49 25838,38

st5 1,00000 10 60381,794 60438,895 60410,34

Gráfica 7. Curva de calibración obtenida a partir de los estándares de OTC (Ayala S.,

2018)

Tabla 13. Área de pico 2 obtenida con estándares de OTC (AGROCALIDAD,2018)

Área


aforo 1 L1 L2 Promedio

st1 0,05000 10 4623,94 4182,51 4403,22

st2 0,10000 10 7241,49 6713,61 6977,55

st3 0,25000 10 21175,69 21083,55 21129,62

st4 0,50000 10 42835,12 42721,64 42778,38

st5 1,00000 10 97920,967 97764,385 97842,68

y = 60954x - 1829,4 R² = 0,9951

0,00

10000,00

20000,00

30000,00

40000,00

50000,00

60000,00

70000,00

0,000000,200000,400000,600000,800001,000001,20000

area

,

conc. ug/ml

curva de calibracion 23/07

42

Gráfica 8. Curva de calibración 2 obtenida a partir de los estándares de OTC (Ayala S.,

2018)

Tabla 14. Concentración de oxitetraciclina cuantificada en HPLC de las muestras

fortificadas con 0.5ug/g de oxitetraciclina (Ayala S., 2018)

Muestra peso, g L1 L2 promedio

Conc. ug/ml

Conc. ug/g

Conc. ug/kg

1 5,0203 2785 2406 2595,5 0,07 0,14 145

2 5,0040 6592 6633 6612,5 0,10 0,19 193

Promedio 0.09 0.17 169

Los resultados obtenidos con las muestras fortificadas se utilizaron para el cálculo

de uno de los parámetros del método (sesgo) que ya se mencionó en la sección anterior

en donde se toma en cuenta el peso de la muestra en g y el aforo de 10 mL para obtener

el resultado de la concentración en ug/g.

4.4. Resultados de residuos de oxitetraciclina en las muestras de pollo

Como se mencionó anteriormente, todas las 32 muestras analizadas fueron

recogidas en diferentes lugares comerciales de la ciudad de Quito. Se analizó músculo

de pollo proveniente concretamente de la pechuga de las aves.

Se tomó 32 muestras de las cuales 8 corresponden a supermercados, 14 a

mercados municipales y 10 a tiendas ubicadas en barrios de la ciudad de Quito.

y = 98909x - 2959,2 R² = 0,996

0,00

20000,00

40000,00

60000,00

80000,00

100000,00

120000,00

0,000000,200000,400000,600000,800001,000001,20000

area

conc. ug/ml


43

Gráfica 9. Porcentaje de muestras recogidas por superficies en la ciudad de Quito.

(Ayala S. 2018)

Gráfica 10. Zonas de muestreo con el 46.88% (15 muestras) en el Sur de Quito y el

53.12 % (17 muestras) en el Norte de Quito. (Ayala S. 2018)

De igual manera, se procuró que la toma de muestras sea equitativa tanto en la

zona norte y sur de la ciudad, como se observa en la Gráfica 9 el 46.88% de las

muestras pertenece a la zona Sur mientras que el 53.12% restante fue tomado en la zona

norte.

En la tabla 15 se muestra el detalle de las muestras analizadas y los resultados de

la concentración obtenida para cada una de ellas. Los cromatogramas correspondientes a

cada muestra se encuentran en el Anexo H, mientras que en el Anexo K se encuentran

los datos de las muestras en el instrumento de recolección de datos utilizado por

Agrocalidad.

44

Tabla 15. Resultados de las muestras de pollo por zona y lugar (Ayala S., 2018).

Muestra Codigo Lugar

/zona

Tipo de Peso g Area 1 Area 2

Area

Promedio

Conc.

Calc.

Conc.

Real

ug/g

Conc.

ug/kg

(ppb)

Superficie ug/ml

1 U818s Sur Mercado 5,039 3198 3369 3283,5 0,0781 0,1551 155,1

2 U882s Norte Tienda 5,058 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ

3 U1055s Sur Mercado 5,036 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ

4 U1065s Sur Supermercado 5,002 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤≤LOQ


6 U983s Sur Supermercado 5,034 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ

7 U1095s Norte Mercado 5,022 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ


9 U1020s Sur Mercado 5,048 46,89 427 236,945 0,0317 0,0627 62,7

10 U970s Norte Supermercado 5,037 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ




14 U1052s Norte Tienda 5,038 1796 0 1796 0,0554 0,1101 110,1


16 U1128s Norte Mercado 5,004 969 0 969 0,0428 0,0856 85,6

17 U769s Sur Tienda 5,021 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ



20 U989S Sur Mercado 5,043 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ




24 U1015s Sur Supermercado 5,019 0 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ







31 U879s Norte Supermercado 5,000 949 0 949 0,0603 0,1207 120,7

32 U856s Norte Supermercado 5,041 0 0 0 ≤LOD ≤LOQ ≤LOD

En el estudio se obtuvo 5 muestras positivas (Gráfico 10), es decir que el 15,63%

de las muestras analizadas contiene residuos de oxitetraciclina, sin embargo, en ninguna

Mercado

Supermercado

Supermercado

Tienda

45

de las muestras identificadas como positivas se supera el límite máximo de residuos

establecido por el Codex Alimentarius que es de 200 ppb (ug/kg).

Si estos resultados se comparan con los límites máximos establecidos para los

residuos de oxitetraciclina en músculo de pollo en la regulación de la Unión Europea,

cuyo valor es 100 ppb, se obtiene que hay 3 muestras que superan este límite, lo que

equivale a un 9,38% de las muestras analizadas.

Gráfica 11. Porcentaje de muestras positivas (5 muestras de 32) (Ayala S. 2018)

Al expresar los resultados obtenidos en función de la superficie comercial de la

que fue tomada la muestra, se desprende que hay una mayor incidencia de residuos de

oxitetraciclina en muestras provenientes de mercados representando un 60% del total de

muestras positivas, mientras que las muestras provenientes de tiendas y supermercados

representan un 20% en cada caso del total de muestras positivas.

Del total de muestras analizadas, las muestras de mercados positivas representan

un 9,38% mientras que las muestras provenientes tanto de tiendas como de

supermercados corresponden al 3,13%. En términos de concentración, se obtuvo que

las muestras correspondientes a mercados presentan los siguientes valores: U818s

contiene 155 ppb, U1020s contiene 63 ppb y la muestra U1128s presenta 86 ppb. En el

caso de las muestras de tiendas hubo 1 muestra positiva que corresponde a la U1052s

con 110 ppb y de igual manera para las muestras de supermercados se tuvo 1 resultado

positivo (U879s) que contiene 120 ppb de oxitetraciclina.

46

Gráfica 12. Porcentaje de muestras positivas por superficie de muestreo. (Ayala S.

2018)

Al analizar los resultados por zona de muestreo, se obtiene que del total de

muestras que contienen residuos, el 60% pertenecen a la zona norte de la ciudad de

Quito, encontrándose el 40% restante en el sur. En el gráfico 12 se puede observar la

incidencia de muestras que contienen residuos de oxitetraciclina por zona de muestreo

con respecto del total de muestras analizadas.

Gráfica 13. Porcentaje de muestras positivas por Zonas de muestreo (Sur –Naranja y

Norte- Gris) (Ayala S. 2018)

Al comparar los resultados obtenidos en este estudio con el estudio realizado por

Acosta, Romero y Taborda (2014) para la “DETERMINACIÓN DE RESIDUOS DE

OXITETRACICLINA EN MUESTRAS DE CARNE BOVINA” donde al analizar 149

muestras de carne bovina se obtuvo un 49% de muestras con presencia de

oxitetraciclina, de las cuales el 8% tenía cantidades de oxitetraciclina superior al LMR

de la Unión Europea, se observa que en términos de porcentaje, hay un mayor

47

cumplimiento con los límites de uso en las muestras de pollo recogidas en la ciudad de

Quito.

La gráfica 13 muestra la carta de control que estadísticamente se conoce como

medida de dispersión, la cual sirve para resumir los resultados obtenidos donde, se

puede observar claramente las muestras positivas en residuos de oxitetraciclina, las

cuales se encentran bajo el Límite Máximo de Residuos (LMR) del Codex

Alimentarius, también se observa los límites de cuantificación (9.79 ppb) y de detección

de método (2.94 ppb) y el valor máximo del método que fue de 1000 ppb,

Gráfica 14. Carta de control del método para residuos de oxitetraciclinas en muestras

de carne de pollo de la ciudad de Quito (Ayala S, 2018)

Puesto que ninguna de las muestras que presenta residuos de oxitetraciclina

contiene residuos por encima del límite máximo establecido por el Codex, pero si hay 3

muestras que contienen residuos por encima de los límites de la Unión Europea; se

realizó un contraste de significancia de dos colas para ver si esas diferencias son

significativas. Para esto se plantean las siguientes hipótesis:

Hipótesis nula: No hay diferencia significativa entre la media calculada de las muestras

positivas y el valor límite de la UE Ho:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

U8

18

s

U8

82

s

U1

05

5s

U1

06

5s

U8

99

s

U9

83

s

U1

09

5s

U9

76

s

U1

02

0s

U9

70

s

U8

08

s

U7

60

s

U1

09

2s

U1

05

2s

U1

04

9s

U1

12

8s

U7

69

s

U8

62

s

U8

85

s

U9

89

S

U1

00

6s

U1

06

8s

U1

00

3s

U1

01

5s

U8

15

s

U1

01

7s

U1

11

5s

U8

70

s

U1

14

0s

U9

86

s

U8

79

s

U8

56

s

Carta de control

LMR, ppb V maximo Concentración, ppb LOD LC

48

Hipótesis alterna: Hay diferencia significativa entre la media calculada de las muestras

positivas y el valor límite de la UE H1:

Tabla 16. Contraste de significancia (Ayala S., 2018)

Codigo Media Exp,

ppb Desviación estándar t exp. t0,05 t0,01

Hipótesis aceptada

U818s 155 3,66 21,2518 6,3138 31,8205 H1

U1052s 110 77,83 0,1817 6,3138 31,8205 H0

U879s 120 77,83 0,1817 6,3138 31,8205 H0

El contraste de significancia o contraste de hipótesis emitió que HAY una

diferencia significativa al 95% en la muestra U818s, pero al 99% de confianza NO hay

diferencia entre la media de las muestras, por otra parte, en las muestras U1052s y

U879s NO existe diferencia al 95% y al 99% de confianza.

49

Capítulo V

Conclusiones y Recomendaciones

5.

5.1. Conclusiones

- Se utilizó la metodología propuesta por la AOAC 995.09 “Clortetraciclina,

Oxitetraciclina y Tetraciclina en tejidos animales por cromatografía liquida”,

con algunas modificaciones para la determinación de residuos de oxitetraciclina

en muestras de carne de pollo. Los resultados se expresan en términos de

concentración, en microgramos / kilogramo (µg/ kg).

- Tras realizar las modificaciones y adaptaciones del método cromatográfico, se

definió las condiciones óptimas del mismo para el análisis de las muestras con

residuos de oxitetraciclinas las cuales fueron: fase móvil 15:65:20 v/v/v de

acetonitrilo, acido oxálico metanólico 0.001M y metanol, respectivamente;

longitud de onda de 350 nm; flujo de 1.2 ml/min: volumen de inyección de 15

uL; tiempo de corrida de 3 minutos y un tiempo de retención promedio de 1

minuto; temperatura del horno y de la muestra 20 grados centígrados y

finalmente una presión de 1136 psi.

- Los parámetros obtenidos para el método son: linealidad con un coeficiente de

correlación de r2=0.994, límite de detección de 2.94 ppb, límite de cuantificación

de 9.79 ppb y repetibilidad =0.019, con un CV= 0.027 y precisión de 0.0020

dada por la desviación estándar. El porcentaje de recuperación obtenido fue de

34%.

- Se determinó que el 15,63% de las muestras analizadas contiene residuos de

oxitetraciclina, en ninguno de los casos se supera el LMR establecido por el

Codex Alimentarius, sin embargo el 9,38% (3 muestras) de las muestras

contiene más de 100 ppb de residuos de oxitetraciclina, superando el LMR

máximo establecido en la Unión Europea para estas moléculas lo que limitaría el

comercio exterior de las mismas disminuyendo su competitividad en el caso de

que el Ecuador fuera un exportador de carne de pollo a Europa.

- En los que respecta al tipo de lugar comercial, se determinó que hay una mayor

incidencia de residuos de oxitetraciclina en las muestras procedentes de

mercados (9.38%) frente a las que presentaron residuos provenientes de tiendas

(3,13%) y supermercados (3.13%).

- Se encontró una mayor presencia de residuos de oxitetraciclina en las muestras

procedente de la zona Norte de la ciudad de Quito (9.38%) frente al 6,25% de

muestras positivas en residuos de oxitetraciclina procedentes del sur.

50

- El contraste de significación entre un valor de referencia (límite de la Unión

Europea) y un valor experimental (concentración de oxitetraciclina) establece

que de las 3 muestras analizadas que contienen más de 100 ppb de

oxitetraciclina NO difieren significativamente al 99% de confianza con el límite

establecido por la UE, pero en la muestra U818s al 95% de confianza si presenta

diferencia significativa.

5.2. Recomendaciones

- No utilizar material de vidrio en el proceso de extracción de la oxitetraciclina del

tejido, ni para el transporte de las muestras ni para el almacenamiento ya que se

puede producir una disminución en el rendimiento de extracción debido a

interacciones de las moléculas de oxitetraciclina con el borosilicato que

compone el vidrio.

- Utilizar en el proceso de filtrado de la muestra para el paso a los viales el tamaño

de poro recomendado en la metodología (0.45 µm) ya que tamaños inferiores

pueden producir que las moléculas de analito se queden retenidas en el filtro y se

disminuya así el rendimiento de la determinación.

- Para la determinación del porcentaje de recuperación, se recomienda que, al

fortificar las muestras, se deje reposar las muestras fortificadas al menos 24

horas antes del análisis para que la interacción con la matriz de estudio sea

mayor.

- Usar una balanza analítica con mínimo de 5 decimales para medir la cantidad de

estándar ya que de este se utiliza una muy pequeña porción para preparar la

solución madre, y así tener una mayor certeza que la solución tiene la

concentración adecuada para la preparación de los estándares que parten de esta.

- Antes de usar el HPLC siempre filtrar los solventes y realizar varias lavados y

purgas al equipo para que no haya interferencias en las corridas de las muestras.

Dejar correr la fase móvil alrededor de 40 min con la columna ya puesta en el

equipo para que se acondicione correctamente.

- Se debe tener en cuenta que en la regulación de la Unión Europea el límite de

100 ppb establecido es para los residuos de oxitetraciclina y su epímero, por lo

que se debe realizar un análisis del epímero 4- epioxitetraciclina que puede

interferir en los resultados de la oxitetraciclina incrementando los resultados

positivos encontrados.

- Difundir los resultados del a las autoridades que regulan la inocuidad en el país

para dar un aviso sobre la manipulación de este tipo de antibióticos y que se

ponga más rigor en la comercialización de estos.

52

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56

Desarrollo de resistencias bacterianas

Residuos de antibioticos en carnes

de animales de consumo humano

Inadecuado suministro de antibioticos en los animales como el pollo que no son controlados por las autoridades correspondientes

Controlar enfermedades

Dosis elevadas de antibioticos

Promotores del crecimiento

Disminucion del metabolismo

Alimento de animales contaminados con

medicamentos

Agua contamiminada con medicamentos

Productos no inocuos

Anexos

Anexo A. Árbol de problemas

57

Inocuidad Alimentaria

muestras de carne de

pollo

Pechuga

Inocuidad alimentaria

Concentracion de OTC

oxitetraciclinas

Anexo B. Categorización de variables: Variable independiente

Anexo C. Categorización de variables: Variable dependiente

58

Anexo D. Formato de recolección de datos de la parte experimental

RESIDUOS DE OXITETRACICLINA

Fecha: Columna:

Long onda

Flujo: Fase móvil:

Volumen:

T°C

Área CURVA


aforo 1 L1 L2 Promedio ug/mL Promedio

st1

st2

st3

st4

st5

Área

Cumple

Codigo Lugar /zona

pieza de pollo

Muestra peso,

g Aforo 1 L1 L2 PROMEDIO

Conc. ug/ml

conc. ug/g

conc. ug/kg LMR

Codex, ug/kg

Sí No

60

Anexo E. Especificaciones de las muestras analizadas en el estudio (UNIETAR,2018)

Muestra ID

Fecha de toma de Muestra

Fecha de Recepción

en el Laboratorio

de Bacteriología

Sector o zona de

Muestreo Ciudad

# semana

de estudio

Especie Tipo de

Muestra (Origen)

Lugar

U760s 29/01/2018 29/01/2018 Norte Quito 11 Pollo de Engorde

Piel de Carcasas

MERCADO

U769s 05/02/2018 05/02/2018 Sur Quito 12 Pollo de Engorde

Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO AKI


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO

61


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

SUPERMERCADO


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

TIENDA


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

MERCADO


Piel de Carcasas

MERCADO

62

Anexo F. Fotografías del proceso de extracción y lectura de las muestras en HPLC

reactivos para preparar buffer McIlvaine

preparación de ácido oxálico metanólico

Dosificación de 100ul de OTC 25ug/ml a muestra

blanco

ajuste del pH del buffer aproximadamente 4 ±0.05

Pesaje de las muestras de pollo

Cortado de la pechuga Homogenizado de las

muestras con 20 mL de buffer McIlvaine

Muestras homogenizadas con el buffer

Centrifuga Thermo Scientific para centrifugar

las muesras a 2500 xg

muestras centrifugadas Extracto resultado de las

tres centrifugaciones Filtración al vacío de las

muestras

63

Extracción SPE de las muestras

Estándar USP

Pesaje del estándar de OTC para preparacion de

solucion madre de 5 ug/ml

Material para prepaparacion de los 5

estándares

Paso de las soluciones a los viales Aforado de las muestars

eluidas

Filtración de las muestars para llevarlas a los viales

Muestras para ser leídas en el HPLC

Equipo HPLC Waters Alliance 2695

64

Anexo G. Cromatogramas de los estándares

a) Cromatogramas de estándares

para la lectura de las muestras m1 a

la m16

66

Curva de los estándares 1

67

b) Cromatogramas de la segunda curva de calibración para las muestras m14 a m32

68

Cu

rva

de

los

est

ánd

are

s 2

69

c) Cromatogramas de los estándares usados para la muestra fortificada 1 y blanco

71

Curva de estándares 3

72

d) Curva de calibración para la

73

lectura de la muestra fortificada 2

74

Curva de estándares 4

75

Anexo H. Cromatogramas de las muestras de carne de pollo m1 a m32

87

Anexo I. Cromatogramas del blanco

88

Anexo J. Cromatogramas de muestras fortificadas 1 y 2

90

Anexo K. Resultados obtenidos del análisis de oxitetraciclina en carne de pollo


Fecha: 04/07/201

8 Columna: Purospher STAR RP-18 encapped LichroCART 150-4,6 (5um) MERCK

Long onda 350 nm

Flujo: 1,2 mL/min Fase móvil: ACN: 15%

Volumen: 15 uL A. Oxálico: 65%

T°C 20

MeOH: 20%

Estándar : Oxitetraciclina 100% puro declarado en el certificado de análisis del estándar (USP)

Solución madre de concentración 5 ug/mL

Área CURVA


aforo 1 L1 L2 Promedi

o ug/mL Promedio

st1 0,05000 10 2956,46 2827,78 2892,12

0,05000

2892,12

st2 0,10000 10

5108,869 5118,75 5113,81

0,10000

5113,81

st3 0,25000 10 14379,62 14361,36

14370,49

0,25000

14370,49

st4 0,50000 10 27707,31 27744,37 27725,8 0,5000 27725,84

y = 65548x - 1838,6 R² = 0,9943

0,00

10000,00

20000,00

30000,00

40000,00

50000,00

60000,00

70000,00

0,000000,200000,400000,600000,800001,00000

área

concentración

Concentracion vs área

91

4 0

st5 1,00000 10 65228,02

1 65265,585 65246,8

0 1,0000

0 65246,80

Y=aX+b donde: Y: área

a: pendiente

área-b .= Conc.

b: corte a la ordenada

a

X: Concentración de la muestra

a 65548

b -1838,60

Muestras

Área

Cumple

Codigo

Lugar /zona pieza de

pollo Muestra peso, g Aforo 1 L1 L2

PROMEDIO

Conc. ug/ml

conc. ug/g

conc. ug/kg

LMR Codex

, ug/kg

Sí No

U818s Quito /Sur pechuga 1 5,03900 10 3198 3369 3284 0,078 0,16 155

200,00

x

U882s Quito /Norte pechuga 2 5,05770 10 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U1055s Quito /Norte pechuga 3 5,0363 10 2956,4

6 2827,78

≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ 200,0

0 x

U1065s Quito /Sur pechuga 4 5,0018

10 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U899s Quito /Sur pechuga 5

5,0523 10 0 0


0 x

U983s Quito /Sur pechuga 6 5,0343 10 0 0 ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ ≤LOQ 200,0 x

92

0

U1095s Quito /Norte pechuga 7 5,0215


200,00

x

U976s Quito /Norte pechuga 8

5,0256 10 0 0


0 x


10 46,89 427 237 0,032 0,06 63

200,00

x

U970s Quito /Norte pechuga 10 5,0371


200,00

x


5,0288 10 0 0


0 x


5,0135 10 0 0


0 x


5,042 10 0 0


0 x


5,0377 10 1796 0 1796 0,055 0,11

110 200,0

0 x


5,0417 10 0 0


0 x


5,0041 10 969 0 969 0,043 0,09

86 200,0

0 x


93

Fecha: 05/07/2018 Columna: Purospher STAR RP-18 encapped LichroCART 150-4,6 (5um) MERCK

Long onda 350 nm


Volumen: 15ul A. Oxálico: 65%

T°C 20 MeOH: 20%



Área CURVA


aforo 1 L1 L2 Promedi

o ug/mL Promedio

st1 0,05000 10 1169,54 1303,60 1236,57 0,05000 1236,57

st2 0,10000 10 2332,71 1764,42 2048,56 0,10000 2048,56

st3 0,25000 10 5100,61 5207,65 5154,13 0,25000 5154,13

st4 0,50000 10 10245,54 10150,48

10198,01

0,50000 10198,01

st5 1,00000 10

23602,033 23108,888

23355,46

1,00000 23355,46


a: pendiente

y = 23304x - 457,06 R² = 0,9951

0,00

5000,00

10000,00

15000,00

20000,00

25000,00

0,00000 0,20000 0,40000 0,60000 0,80000 1,00000 1,20000

area

Conc. ug/ml


94

área-b .= Conc.


a


a 23304,22

b -457,06

Muestras

Área

Cumple

Codigo

Lugar /zona pieza de

pollo Muestra peso, g Aforo 1 L1 L2 PROMEDIO

Conc. ug/ml

conc.

ug/g

conc. ug/kg

LMR Codex

, ug/kg

Sí No


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x


5,0108 10 0 0 0

≤LOQ ≤LO

Q ≤LOQ 200,0

0 x


5,0246 10 0 0 0

≤LOQ ≤LO

Q ≤LOQ 200,0

0 x

U989S Quito /Sur pechuga 20

5,0425 10 0 0 0

≤LOQ ≤LO

Q ≤LOQ 200,0

0 x

U1006s

Quito /Norte pechuga 21 5,0416

10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U1068s

Quito /Sur pechuga 22 5,0458

10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U1003s


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U1015 Quito /Sur pechuga 24 5,019 10 0 0 0 ≤LOQ ≤LO ≤LOQ 200,0 x

95

s Q 0

U815s Quito /Sur pechuga 25

5,0252 10 0 0 0

≤LOQ ≤LO

Q ≤LOQ 200,0

0 x

U1017s


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U1115s


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U870s


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U1140s


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U986s


10 0 0 0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x

U879s

Quito /Norte pechuga 31 5

10 949 0 949 0,06033

5 0,12

120 200 x

U856s


10 0 0

0 ≤LOQ

≤LOQ ≤LOQ

200,00

x


96

Fecha: 23/07/2018 Columna: Purospher STAR RP-18 encapped LichroCART 150-4,6 (5um) MERCK

Long onda 350 nm



T°C 20 MeOH: 20%



Área CURVA


aforo 1 L1 L2 Promedio ug/mL Promedio

st1 0,05000 10 2373,31 2464,13 2418,72 0,05000 2418,72

st2 0,10000 10 4384,40 4442,76 4413,58 0,10000 4413,58

st3 0,25000 10 13665,70 13502,17 13583,93 0,25000 13583,93

st4 0,50000 10 25887,26 25789,49 25838,38 0,50000 25838,38

st5 1,00000 10 60381,794 60438,895 60410,34 1,00000 60410,34


a: pendiente

área-b .= Conc.


a


a 60954,00

b -1829,40

Blanco y muestra fortificada

aforo 10

y = 60954x - 1829,4 R² = 0,9951

0,00

20000,00

40000,00

60000,00

80000,00

0,00000 0,50000 1,00000 1,50000

area

,

conc. ug/ml

Título del gráfico

97

muestra peso, g Área

Área promedio

concentación fortificada, ug/g

conc. Calculada, ug/ml

conc. Calculada ug/g conc. Calculada ug/kg

% recuperación

blanco 5,0382

- 0 - - - - -

- 0 - - - - -

muestra fortificada 5,0203

2785,00000 2595,5 0.5 0,07 0,14

145

29

2406,00000

98

RESIDUOS DE OXITETRACICLINA Fecha: 26/07/2018 Columna: Purospher STAR RP-18 encapped LichroCART 150-4,6 (5um) MERCK

Long onda 350 nm



T°C 20 MeOH: 20%



Área CURVA

concentración, ug/mL aforo 1 L1 L2

Promedio

ug/mL Promedio

st1 0,05000 10 4623,94 4182,51 4403,2

2 0,0500

0 4403,

22

st2 0,10000 10 7241,49 6713,61 6977,5

5 0,1000

0 6977,

55

st3 0,25000 10 21175,69 21083,55 21129,

62 0,2500

0 21129

,62

st4 0,50000 10 42835,12 42721,64 42778,

38 0,5000

0 42778

,38

st5 1,00000 10 97920,967 97764,385

97842,68

1,00000

97842,68


a: pendiente

área-b .= Conc.


a


a 98909,00

y = 98909x - 2959,2 R² = 0,996

0,00

20000,00

40000,00

60000,00

80000,00

100000,00

120000,00

0,00000 0,50000 1,00000 1,50000

area

conc. ug/ml


99

b -2959,20

Área

Muestra concentración fortificada,

ug/g peso, g L1 L2 promedio

Conc. ug/ml

conc. ug/g

conc. ug/kg %recuperación

2 0,5 5,004 6592 6633 6612,5 0,10 0,19 193 39

Cálculo LOD y LOQ

Parámetros de la curva

Curva a b (-) Area 1 Area 2 Area Promedio Conc.

ppm

1 65548 1838,6 2956,46 2827,78 2892,12 0,072

2 23304,22 457,06 1169,54 1303,6 1236,57 0,073

3 60954 1829,4 2373,31 2464,13 2418,72 0,070

4 98909 2959,2 4623,94 4182,51 4403,225 0,074

S 1310,593 0,0020

X 2737,659 0,072

CV 0,479 0,027

s' 655,2963 0,0010

LOD 4703,54759 0,003 2,94 ppb

LOQ 9290,62155 0,010 9,79 ppb

Cálculo LOD y LOQ

Parámetros de

la curva

Curva a b (-) Area

1 Area 2 Area Promedio

Conc.

ppm

1 65548 1838,6 2956,

46 2827,78 2892,12 0,072

2 23304, 457,06 1169, 1303,6 1236,57 0,073

100

22 54

3 60954 1829,4 2373,

31 2464,13 2418,72 0,070

4 98909 2959,2 4623,

94 4182,51 4403,225 0,074

S 1310,593 0,0020

X 2737,659 0,072

CV 0,479 0,027

s' 655,2963 0,0010

LOD 4703,54759 0,003 2,94 ppb

LOQ 9290,62155 0,010 9,79 ppb

REPETITIBILIDAD

A 250 ppb


Curva a b (-) Area 1 Area 2

Conc1. Conc2.

ppm ppm s x

1 65548 1838,6 14379,62 14361,36 0,247 0,247 0,00019701 0,247

2 23304,22 457,06 5100,61 5207,65 0,238 0,243 0,00324779 0,241

3 60954 1829,4 13665,70 13502,17 0,254 0,252 0,00189707 0,253

4 98909 2959,2 21175,69 21083,55 0,244 0,243 0,00065877 0,244

Sr 0,00136844 0,246

0,00472638

CV 0,00556006

T tablas al 95%, dos colas y 3 grados de

libertad 3,2

repetibilidad 0,00619285

A 1000 ppb

101


Curva a b (-) Area 1 Area 2

Conc1. Conc2.

ppm ppm s x

1 65548 1838,6 65228,021 65265,585 1,023 1,024 0,00040523 1,023

2 23304,22 457,06 23602,033 23108,888 1,032 1,011 0,01496322 1,022

3 60954 1829,4 60381,794 60438,895 1,021 1,022 0,00066241 1,021

4 98909 2959,2 97920,967 97764,385 1,020 1,018 0,00111941 1,019

Sr 0,00712323 1,021

CV 0,00697416

T tablas al 95%, dos colas y 3 grados de

libertad 3,2


REPETITIBILIDAD

A 250 ppb


Curva a b (-) Area 1 Area 2 Conc1. Conc2.

ppm ppm s x

1 65548 1838,6 14379,62 14361,36 0,247 0,247 0,00019701 0,247

2 23304,22 457,06 5100,61 5207,65 0,238 0,243 0,00324779 0,241

3 60954 1829,4 13665,70 13502,17 0,254 0,252 0,00189707 0,253

4 98909 2959,2 21175,69 21083,55 0,244 0,243 0,00065877 0,244

Sr 0,00136844 0,246

0,00472638

CV 0,00556006

T tablas al 95%, dos colas y 3 grados de libertad 3,2


102

A 1000 ppb


Curva a b (-) Area 1 Area 2 Conc1. Conc2.

ppm ppm s x

1 65548 1838,6 65228,021 65265,585 1,023 1,024 0,00040523 1,023

2 23304,22 457,06 23602,033 23108,888 1,032 1,011 0,01496322 1,022

3 60954 1829,4 60381,794 60438,895 1,021 1,022 0,00066241 1,021

4 98909 2959,2 97920,967 97764,385 1,020 1,018 0,00111941 1,019

Sr 0,00712323 1,021

CV 0,00697416

T tablas al 95%, dos colas y 3 grados de libertad 3,2


DATOS PARA CONTRASTE DE SIGNIFICANCIA

codigo peso aforo area 1 area 2 con ug/ml con ug/ml conc ug/g conc ug/g ug/kg ug/kg S U818s 5,039 10 3198 3369 0,07683835 0,07944712 0,15248729 0,15766446 152,487294 157,664463 3,66

U1020s 5,0484 10 46,89 427 0,02876503 0,03456398 0,0569785 0,06846522 56,9785024 68,4652239 8,12

U1052s 5,0377 10 1796 - 0,05544944 - 0,11006896 - 110,068963 0 77,83

U1128s 5,0041 10 969 - 0,04283273 - 0,08559528 - 85,5952784 0 60,53

U879s 5,0405 10 949 - 0,060335 - 0,11970043 119,700427 0 84,64

103

Anexo

L. Certific

ado del

estánda

r USP

106

Anexo M. Manual AOAC 2012 Método oficial 995.09 “Chlortetracilina, tetraciclina y oxitetraciclina en tejidos animales por cromatografía

líquida”

universidad central del ecuador facultad de ciencias ... · iv universidad central del ecuador...

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