universidad central del ecuador facultad de ciencias ... · pablo marañon, german marañon y...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN UN CULTIVO COMERCIAL DE GUAYUSA (Ilex guayusa)
Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del Título de Ingeniera Agrónoma
Autor: Rocha Santafé Mayra Rocío Tutora: Gioconda Magdalena García Santamaría, Ph.D.
Quito, febrero 2018
DERECHOS DEL AUTOR
Yo, Pamela Lizbeth Crespo Calva en calidad de autor del trabajo de investigación:"DETERMINACIÓN INDIRECTA DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN ELCULTIVO DE GUAYUSA(//e.x: guayusa), MEDIANTE EL NDVI", autorizo a laUniversidad Central del Ecuador a hacer uso del contenido total o parcial que mepertenece, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos de como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,seguirán vigentes a mi favor, de conformidad a lo establecido en los artículos 5,6,8,19 yademás pertinentes de la ley de propiedad intelectual y su reglamento.
También, autorizo a realizar la digitalización y publicación de este trabajo de investigaciónen el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art.l 14 de la Ley Orgánica deEducación Superior.
Pamela Lizbeth Crespo Calva
CC.: 1721860995
APROBACIÓN DEL TUTOR/A
DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Gioconda Magdalena García Santamaría en mi calidad de tutora del trabajo detitulación, modalidad proyecto de investigación, elaborado por PAMELA LIZBETHCRESPO CALVA cuyo título es " DETERMINACIÓN INDIRECTA DELCONTENIDO DE CAFEÍNA EN EL CULTIVO DE GUAYUSA(//e\:guayusa),MEDIANTE EL NDVI", previo a la obtención del título de IngenieraAgrónoma, considero que el proyecto reúne los requisitos y méritos necesarios en el campometodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del tribunalexaminador designado, por lo que APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado paracontinuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
Tumbaco, a los 28 días del mes de noviembre del 2017
üoconda García, Ph.D.•—- \m^l^
Docente- Tutor
CC.:1801516624
ni
DETERMINACIÓN INDIRECTA DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN EL CULTIVODE GUAYUSA (//ex guayusa), MEDIANTE EL NDVI
APROBADO POR:
Dra.Gioconda García S.,Ph.D.
TUTORA
Ledo. Diego Salazar, M.Sc.PRESIDENTE DEL TRIBUNAL
Ing. Agp. Francisco Gutiérrez, M. Se.PRIMER VOCAL DEL TRIBUNAL
Ing. Agr. Jorge Caicedo, M.Sc.SEGUNDO VOCAL DEL TRIBUNAL
IV
v
DEDICATORIA
Dedico esta tesis. A DIOS Y A LA SANTÍSIMA CRUZ, por las bendiciones
recibidas y darme fuerza de seguir adelante.
A mis queridos Padres VICENTE ROCHA y
CARLOTA SANTAFÉ, quienes me dieron la
vida, educación, por ese gran apoyo incondicional en momentos difíciles, por sus palabras de aliento, por sus excelentes consejos en mi caminar diario y por todo su amor que me brindan día a día.
A mis hermanos, ANDRÉS, ALEXIS y
DAVID, quienes han estado conmigo en cada
paso que doy, por ser un ejemplo de superación.
A mí hijo amado RONNY, por ser la mayor
motivación, eres mi gran inspiración para lograr alcanzar esta dichosa y muy merecida victoria, encaminaste conmigo una etapa de mi vida estudiantil, me ayudaste en momentos de siembra por eso este triunfo de cosecha te lo mereces tú también.
A XAVIER, por ser un pilar fundamental que llegó
a mi vida, por su insistencia de hacer las cosas bien, por su innegable dedicación, amor y paciencia.
Les amo.
Mayra Rocío Rocha Santafé
vi
AGRADECIMIENTO Agradezco a Dios por llenarme de cuantiosas bendiciones, para llegar hasta donde he llegado y darme la fortaleza para este sueño anhelado. A mi madre, a mi padre, gracias a ustedes he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo que soy. Un privilegio ser su hija, son los mejores padres. A la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador y su personal docente, que formaron mi aspecto profesional. A mi Tutora la Dra. Gioconda García, por confiar en mí, haberme dado la oportunidad de realizar el presente trabajo e impartir sus conocimientos. Infinitas gracias a Química Aristón en especial al Dr. Santiago Balarezo y la Ing. Cristhina Martínez por todo su apoyo y compartir sus conocimientos en la realización de este proyecto de investigación. A Huasquila Amazon Long a sus propietarios Pablo Marañon, German Marañon y Bastienne Paliz, por la oportunidad de conocer su cultivo de Guayusa y brindar toda su experiencia. A mis amigos del alma Darío L. y Dennis Q. por compartir momentos únicos de risas, deberes, llantos, experiencias, congresos, giras, bailes, juegos y ser mis directores técnicos de una de mis pasiones mi equipo femenino “MAMYS”.
Mayra Rocío Rocha Santafé
vii
CONTENIDO
CAPÍTULOS PÁGINAS
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1
2. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................................ 3
2.1 Cultivo de guayusa (Ilex guayusa) .................................................................................................. 3
2.1.1 Generalidades ................................................................................................................................. 3
2.1.2 Origen y clasificación taxonómica ................................................................................................... 3
2.1.3 Descripción morfológica.................................................................................................................. 4
2.2 Cultura y tradiciones ...................................................................................................................... 4
2.3 Propiedades y uso de la guayusa ................................................................................................... 4
2.4 Manejo del cultivo .......................................................................................................................... 5
2.4.1 Requerimiento climático ................................................................................................................. 5
2.4.2 Requerimientos edáficos ................................................................................................................. 5
2.4.3 Requerimiento luz ........................................................................................................................... 5
2.4.4 Estado de conservación ................................................................................................................... 6
2.4.5 Propagación vegetativa ................................................................................................................... 6
2.4.6 Diversidad genética ......................................................................................................................... 7
2.4.7 Especies asociadas con guayusa...................................................................................................... 7
2.5 Componentes químicos de hoja de guayusa .................................................................................. 8
2.6 Cafeína ............................................................................................................................................ 9
2.6.1 Concepto ......................................................................................................................................... 9
2.6.2 Propiedades químicas ..................................................................................................................... 9
2.6.3 Biosíntesis de la cafeína. ............................................................................................................... 10
2.6.4 Catabolismo de cafeína ................................................................................................................. 10
2.6.5 Cafeína en la naturaleza ................................................................................................................ 11
2.6.6 Función de la cafeína en la planta ................................................................................................. 12
2.6.6.1 Defensa química ......................................................................................................................... 12
2.6.6.2 Alelopatía ................................................................................................................................... 12
2.8 Método para análisis fitoquímico ................................................................................................ 12
2.8.1 Cromatografía ............................................................................................................................... 12
2.8.2 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) ........................................................................ 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 15
3.1 Ubicación del ensayo .................................................................................................................... 15
viii
3.1.1 Ubicación política de la parcela (Fase de campo) ......................................................................... 15
3.1.1.1 Ubicación geográfica parcela ..................................................................................................... 15
3.1.1.2 Características agro-climáticas ................................................................................................... 15
3.1.2 Ubicación geográfica determinación del contenido de cafeína (Fase de laboratorio) ................. 15
3.1.2.1 Ubicación política determinación del contenido de cafeína ...................................................... 15
3.2 Materiales .................................................................................................................................... 16
3.2.2 Material de campo ........................................................................................................................ 16
3.2.3 Material de laboratorio ................................................................................................................. 16
3.2.4 Material de escritorio .................................................................................................................... 16
3.3.1 Factor en estudio........................................................................................................................... 17
3.3.2 Tratamientos ................................................................................................................................. 17
3.4 Análisis estadístico ....................................................................................................................... 17
3.4.1 Diseño experimental ..................................................................................................................... 17
3.4.2 Unidad experimental ..................................................................................................................... 17
3.4.3 Esquema del análisis de la varianza .............................................................................................. 17
3.4.4 Análisis Funcional .......................................................................................................................... 18
3.5 Variables y métodos de evaluación .............................................................................................. 18
3.5.1 Altura de la planta ......................................................................................................................... 18
3.5.2 Ancho de la copa ........................................................................................................................... 18
3.5.3 Diámetro del tallo a la atura del pecho (DAT) ............................................................................... 18
3.5.4 Contenido de cafeína .................................................................................................................... 18
3.6 Método del manejo de las muestras............................................................................................ 18
3.6.1 Pruebas preliminares .................................................................................................................... 18
3.6.2 Formación de Estratos en base a la pendiente ............................................................................. 19
3.6.2.1 Estrato bajo (Eb) ......................................................................................................................... 19
3.6.2.2 Estrato medio (Em) .................................................................................................................... 19
3.6.2.3 Estrato alto (Ea) .......................................................................................................................... 20
3.7 Recolección de las muestras ........................................................................................................ 21
3.8 Secado de las muestras ................................................................................................................ 22
3.9 Molienda ...................................................................................................................................... 22
3.10 Análisis químico mediante HPLC ................................................................................................ 22
3.10.1 Determinación de humedad ....................................................................................................... 23
3.10.2 Determinación de cafeína en guayusa por método espectrofotométrico. ................................ 23
3.10.3 Condiciones en el equipo HPLC ................................................................................................... 24
ix
4. RESULTADOS Y DISCUSION .............................................................................................. 26
4.1 Análisis de las variables ................................................................................................................ 26
4.2 Contenido de cafeína en muestras con humedad al 5%. ............................................................. 26
4.3 Altura de la planta. ....................................................................................................................... 31
4.4 Diámetro del tallo a la altura del pecho (DAP) ............................................................................. 32
4.5 Ancho de la copa .......................................................................................................................... 34
4.6 Regresión múltiple ....................................................................................................................... 35
5. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 38
6. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 39
7. RESUMEN ........................................................................................................................... 40
8. ABSTRAC ............................................................................................................................ 42
9. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... 43
10. ANEXOS ............................................................................................................................ 48
x
ÍNDICE DE CUADROS
CUADROS PÁG.
1. Lista de especies que pueden crecer en asociación con la guayusa. ................................................... 7
2. Composición química de Yerba mate, té verde y guayusa. ................................................................. 9
3. Heliofanía, precipitación anual, temperatura media mensual, humedad relativa del primer y
segundo semestre del 2012, precipitación y temperatura del primer semestre del 2016,
reportadas por la Estación Meteorológica Puyo. ................................................................................... 15
4. Tratamientos a ser evaluados en el estudio de la determinación de contenido de cafeína en un
cultivo comercial de guayusa. ................................................................................................................ 17
5. Esquema del ADEVA del experimento para la determinación del contenido de cafeína en un
cultivo comercial de guayusa (Ilex guayusa). ......................................................................................... 17
6. Contenido de cafeína a tres temperaturas en follaje de guayusa. .................................................... 18
7. Comprobación de los supuestos de ANOVA en las 72 plantas de guayusa. Cotundo-Archidona.
2016 ........................................................................................................................................................ 26
8. ADEVA no paramétrico Kruskal-Wallis, medias, desviación estándar y probabilidad, para la
variable contenido de cafeína en guayusa. Cotundo-Archidona. 2016 ................................................. 27
9. Comparaciones de a pares entre las medias de los estratos para la variable contenido de
cafeína en guayusa. Cotundo-Archidona. 2016 ..................................................................................... 29
10. Análisis de suelo de acuerdo a los estratos con macronutrientes y micronutrientes. Cotundo,
Archidona 2016. ..................................................................................................................................... 30
11. Análisis de la covarianza entre el contenido de cafeína y los arboles vecinos. Cotundo-
Archidona. 2016 ..................................................................................................................................... 31
12. Análisis de varianza para la variable altura de la planta en 72 individuos de guayusa Cotundo-
Archidona. 2016 ..................................................................................................................................... 31
13. Análisis de varianza para la variable diámetro del tallo en 72 individuos de guayusa Cotundo-
Archidona. 2016 ..................................................................................................................................... 33
14. Análisis de varianza para la variable ancho de la copa en 72 individuos de guayusa Cotundo-
Archidona. 2016 ..................................................................................................................................... 34
15. Análisis de regresión lineal, coeficientes de regresión, p-valor y CpMallows ................................. 35
xi
ÍNDICE DE FIGURAS FIGURAS PÁG.
1. Estructura molecular de la Cafeína (Calle, 2011). ................................................................................ 9
2. Principal ruta de biosíntesis de la cafeína (Ashihara et al., 2008) ...................................................... 10
3. Ruta catabólica de las purinas y cafeína (Ashihara et al., 2008). ....................................................... 11
4. Cantidad de cafeína por producto (Runa, 2014). ............................................................................... 11
5. Delimitación de cada pendiente. ....................................................................................................... 20
6. Georreferencia de cada planta muestreada. ..................................................................................... 21
7. Muestras de follaje en fundas de papel perforado ............................................................................ 21
8. Horno comercial a gas para el secado de muestras de follaje. .......................................................... 22
9. Molino eléctrico ................................................................................................................................. 22
10. Determinador de humedad Karl – Fischer. ...................................................................................... 23
11. Ultrasonido BRASON 3510 ............................................................................................................... 23
12. Extracción de guayusa ...................................................................................................................... 23
13. Frecuencia absoluta de la distribución del contenido de cafeína (mg 100 mg-1) de 72
individuos. .............................................................................................................................................. 27
14. Planta de guayusa 21A (Izquierda) con mayor contenido de cafeína y planta guayusa 24B
(derecha) con menor contenido de cafeína. .......................................................................................... 28
15. Distribución de árboles que generan sombran: Balza (Ochroma pyramidale), Guaba (Inga
edulis) y Laurel (Laurus nobilis) en la unidad experimental. .................................................................. 30
16. Rangos de significancia de cada estrato para la variable altura de la planta en 72 individuos. ...... 32
17. Rangos de significancia de cada estrato para la variable altura de la planta en 72 individuos. ...... 33
18. Rangos de significancia de cada estrato para la variable ancho de la copa en 72 individuos. ........ 34
19. Diagrama de dispersión entre el contenido de cafeína y la altura de planta, las líneas verdes
representan al intervalo de confianza de la altura de planta. ............................................................... 36
20. Diagrama de dispersión entre el contenido de cafeína y el ancho de la copa, las líneas verdes
representan al intervalo de confianza del ancho de la copa. ................................................................ 37
xii
ÍNDICE DE ANEXOS ANEXOS PÁG.
1. Datos de altura, diámetro a la altura del pecho y ancho de copa, de cada planta muestreada con
sus respectivas coordenadas UTM. ........................................................................................................ 48
2. Área de la muestra, contenido de cafeína y humedad de cada muestra. ......................................... 51
3. Matriz de correlación múltiple de Pearson para determinar la relación existente entre las
variables. ................................................................................................................................................ 52
4. Cromatograma del individuo con mayor contenido de cafeína (21A). .............................................. 53
5. Cromatograma del individuo con mayor contenido de cafeína (24B). .............................................. 54
6. Fotografías del campo de investigación. ............................................................................................ 55
xiii
TEMA: DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN UN CULTIVO COMERCIAL DE GUAYUSA (Ilex guayusa).
Autor: Mayra Rocío Rocha Santafé
Tutor: Dra. Gioconda García, PhD
RESUMEN
Guayusa (Ilex guayusa) es un árbol perenne utilizado por culturas indígenas ancestrales debido a sus propiedades estimulantes y curativas de sus componentes bioactivos, como es la cafeína. El objetivo de este estudio fue determinar el contenido de cafeína en plantas de guayusa mediante el método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), dentro de una plantación orgánica ubicada en el noroeste de la Amazonía Ecuatoriana. El lote se estratificó en 3 estratos de acuerdo a la pendiente en un arreglo de Diseño completamente al azar, considerando los estratos como tratamientos: estrato alto, estrato medio y estrato bajo. El rango de cafeína fluctuó de 0,98 mg.100 mg-1 a 5,64 mg.100 mg-1. Las plantas que presentaron la media más alta de contenido de cafeína se encontraron en el estrato medio con 2,99 mg.100 mg-1 seguido el estrato alto con 2,64 mg.100 mg-1 y por último el estrato bajo con 2,22 mg.100 mg-1 de cafeína. PALABRAS CLAVE: GUAYUSA / ILEX GUAYUSA / CAFEÍNA / PEDIENTE / CONTENIDO.
xiv
DETERMINATION OF CAFFEINE CONTENTS IN A COMMERCIAL CULTIVATION OF GUAYUSA (Ilex guayusa).
Autor: Mayra Rocío Rocha Santafé Tutor: Dra. Gioconda García, PhD
SUMMARY
Guayusa (Ilex guayusa) is a perennial tree used by ancestral indigenous cultures due to its stimulating and healing properties of its bioactive components, such as caffeine. The objective of this study was to determine the caffeine content in guayusa plants by the method of high performance liquid chromatography (HPLC), within an organic plantation located in the northwest of the Ecuadorian Amazon. The lot was stratified into 3 layers according to the inclination in a design arrangement completely random, considering the strata as treatments: stratum high, middle stratum and low stratum. The caffeine range ranged from 0.98 mg.100 mg-1 to 5.64 mg.100 mg-1.The plants that presented the highest average caffeine content were found in the stratum medium with 2.99 mg.100 mg-1 followed the high stratum with 2.64 mg.100 mg-1 and finally the low stratum with 2.22 mg.100 mg-1 of caffeine. KEY WORDS: GUAYUSA / ILEX GUAYUSA / CAFFEINE / PEDIENT / CONTENT.
CERTIFICACIÓN
En calidad de tutora del trabajo de graduación cuyo tema es " DETERMINACIÓNINDIRECTA DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN EL CULTIVO DE GUAYUSA(Itex guayusa), MEDIANTE EL NDVI." presentado por la señorita PAMELA LIZBETHCRESPO CALVA, previo a la obtención del título de Ingeniera Agrónoma, certifico haberrevisado y corregido el ABSTRACT para el trabajo de grado, aprobado el mismo, despuésde realizadas por los miembros del tribunal, por lo que apruebo el mismo, para elempastado final.
Dra. Gio^mda^García, Ph.D.
Docente-Tutor
CC.: 1801516624
XVI
1
1. INTRODUCCIÓN
La Amazonía ecuatoriana es una de las áreas con mayor biodiversidad del planeta por lo tanto es una fuente incalculable de riqueza genética, con alto potencial para la identificación de nuevas materias primas para la industria farmacéutica, cosmética y alimenticia (Radice et al., 2007).
Ecuador es uno de los países megadiversos del planeta y junto a Colombia, Venezuela, Colombia, Perú concentran el 75% de la diversidad animal y vegetal de la zona andina (Estrella et al., 2005). Muchas de las especies que se encuentran allí, son desconocidas para el mundo moderno, a pesar de que han sido utilizadas milenariamente por culturas indígenas ancestrales, debido a sus propiedades estimulantes y curativas generalmente están asociadas a rituales sagrados, como es el caso de la guayusa (Ilex guayusa) (Radice et al., 2007).
Guayusa es un árbol perenne nativo de la Amazonía ecuatoriana, generalmente se encuentra de forma silvestre con menos frecuencia en forma de cultivo en chacras de pequeños agricultores y gradualmente, pero debido al interés que ha despertado gradualmente se están incrementando cultivos comerciales. Las poblaciones nativas de la Amazonia de las provincias de Napo y Pastaza consumen la hoja de este árbol en forma de infusión previo a prácticas ceremoniales. Actualmente debido a que es una bebida estimulante con propiedades nutraceúticas y actividad antioxidante, se ha difundido rápidamente su consumo (Torres, 2013).
En el Ecuador de acuerdo a los registros de Herbarios de Loja, la guayusa está presente en las provincias de Sucumbios, Napo, Pastaza, Morona Santiago y Zamora Chinchipe; pero, también se registra individuos en las provincias de Pichincha y Tungurahua (Radice et al., 2007).
Guayusa es una de las 8 especies del género ilex en las que se incluye la Yerba Mate (Ilex paraguariensis) de la selva atlántica y alrededor de Argentina. Los árboles de estas dos especies son aceitosos y producen varios metabolitos bioactivos (MB). Ilex guayusa, representa una de las especies productoras de cafeína que ha sido utilizada desde tiempos tempranos, como estimulante, emético y medicinal (Puangpraphant et al., 2010); En el caso, de Yerba Mate las hojas tienen un fuerte sabor amargo, mientras que las hojas de Guayusa tienen un sabor suave. La guayusa es consumida en forma de infusión de las hojas se secan y se elabora con ellas un té al que se le atribuye propiedades estimulantes, digestivos y reductor del nivel de glucosa en la sangre (Zúñiga, 2015).
Estudios moleculares sobre la diversidad genética del cultivo han determinado que la variabilidad es reducida y se han identificado dos grupos. El primer grupo con una línea ancestral proveniente de Sucumbíos y el segundo grupo con línea ancestral de Napo, Orellana, Pastaza, Morona Santiago y Zamora Chinchipe. Las plantaciones provienen de la multiplicación vegetativa (estacas) de estos dos lugares de origen (Mosquera, 2015).
Análisis químicos realizados en guayusa han mostrado que el contenido de cafeína va de 2,90 a 3,28 % (Torres, 2013). Por otro lado, en un estudio más amplio en 78 individuos procedentes de diferentes localidades de las provincias de Napo, Pastaza, Orellana, Morona Santiago, determinaron un rango de variación en el contenido de cafeína que fluctuó de 0,599 mg g -1 a 16,64 mg g -1 (Mosquera, 2015). Estas inconsistencias en contenido de cafeína, hacen difícil la estandarización de un producto transformado para la generación de valor agregado que garantice calidad y origen de la materia prima.
Con base en lo anterior se estableció el presente proyecto de investigación para determinar el contenido de cafeína en individuos de un cultivo comercial de guayusa, considerando que es un
2
cultivo tradicional emergente que se está insertando en el mercado internacional. Hasta donde se conoce, no se han desarrollado estudios completos en el que se considere la influencia de factores ambientales, agronómicos, manejo de cosecha y pos cosecha en la concentración de fotoquímicos como el contenido de cafeína de la guayusa.
1.1 OBJETIVOS 1.1.1 General
Determinar el contenido de cafeína entre individuos de un cultivo comercial de guayusa. 1.1.2 Específicos
Determinar el efecto de la pendiente, en el contenido de cafeína.
Determinar el efecto, altura, ancho de la copa y diámetro del tallo en el contenido de cafeína.
Determinar la cantidad de cafeína mediante cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC).
3
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Cultivo de guayusa (Ilex guayusa)
2.1.1 Generalidades El género Ilex está distribuido en las regiones tropicales y subtropicales del continente americano e incluso en Oceanía, se calcula que existen más de 500 especies. El subgénero ilex es el más extenso, puesto que incluye varias especies en el neo trópico distribuidas en Colombia, Ecuador, Brasil, Uruguay, Paraguay y el norte de Argentina (Radice et al., 2007). La guayusa esta filogenéticamente relacionada con la Yerba Mate (Ilex paraguarienses), esta última es reconocida y se ha difundido ampliamente en el mundo debido a los beneficios y efectos energizantes que se le adjudican a pesar de su característico sabor amargo que es consecuencia del contenido de ácido tánico. En el caso de la guayusa que también posee las propiedades del mate con la diferencia de que el sabor es suave y agradable, su bebida es ofrecida a visitantes y debido a su suavidad y propiedades se advierte a quien lo consume por primera vez que regresara por más bebida (Molestina, 2014).
La especie Ilex guayusa, es conocida como Waisi en idioma Shuar, dentro de esta nacionalidad la guayusa es utilizada para la limpieza del estómago, para ello la toman en la madrugada en ayunas, de igual forma las mujeres luego del parto, quienes son bañadas con una infusión de la planta a los tres días del alumbramiento, también refieren que tiene propiedades afrodisiacas y mejora la fertilidad. Los quichuas amazónicos la utilizan como una bebida social, al ofrecerla a visitante, en ceremonias y festividades (García et al., 2014).
La guayusa es una bebida que está ligada a tradiciones culturales de los nativos amazónicos, y es considerada una planta sagrada, pues sus hojas contienen una variedad de propiedades energéticas y curativas, por lo cual: su consumo constituye uno de los rituales más importantes para muchos pueblos amazónicos, sobre todo para los kichwa amazónico (Dueñas et al., 2016). 2.1.2 Origen y clasificación taxonómica Se reconoce que la Amazonia es el lugar de origen de la guayusa (Ilex guayusa), aquí se lo encuentra en forma silvestre y su consumo es tradicional y se remonta a siglos atrás. En la actualidad esta especie es parte de la chacra de la amazonia, especialmente dentro del sistema agro-silvícola del pueblo Kichwa amazónico del Ecuador (Crespo, 2013). Para el mismo autor el ecosistema ideal de la guayusa donde se observa un buen crecimiento es el pie de monte Amazónico desde el sur de Colombia hasta el norte de Perú. En Ecuador el ecosistema ideal en donde mayor frecuencia de árboles vigorosos se observa es en las partes altas de la Amazonia ecuatoriana, en especial en la provincia de Napo, lo cual representa una ventaja comparativa importante en relación a otros lugares. Un segundo lugar de cultivo aparte de la Amazonia es Santo Domingo de los Tsáchilas ubicado al oeste del país, los integrantes de la etnia Tsáchilas han afirmado que en su territorio durante décadas se ha cultivado y utilizado, principalmente para baños de purificación o medicina ancestral (Pacha, 2017). Su clasificación taxonómica es la siguiente:
4
Guayusa pertenece a la familia aquifoliácea, es uno de las 8 especies del género ilex presentes en Ecuador (Torres, 2013).
Reino: Plantae Clase: Equisetopsida Subclase: Magnoliidae Orden: Aquifoliales Familia: Aquifoliáceae Género: Ilex L. Nombre científico: Ilex Guayusa
2.1.3 Descripción morfológica Hábitat: Es un árbol perenne nativo de la región amazónica, donde es silvestre, pero también está presente en ciertos lugares subtropicales de la región andina en estado cultivado (Radice et al., 2007). Nombre común: Los nombres comunes tanto del árbol como de la infusión son: Aguayusa, guayusa, huayusa, guañusa, guayyusa, wayusa, en el oriente de Ecuador (Melo, 2014). Tronco: Tiene un fuste a menudo bifurcado a la altura del pecho, corteza blanca y textura lisa. Las ramas son extendidas y flexibles, (Aldaz et al., 2011). Hojas: Sus hojas son dentadas y elípticas, de 15 cm de longitud y 7 cm de ancho, son de textura coriáceas, color verde oscuro, enteras, oblongo-elípticas, simples, alternas sin estípulas, sin pubescencias en el haz y envés, ápice acuminado, base aguda y su pecíolo corto de 1cm de largo (Torres, 2013) Flor: Posee una corola blanco verdosa con pétalos obtusos de igual número de estambres y pétalos, anteras alargadas, un ovario sub-sésil global que contiene de 4 a 6 cavidades (Aldaz et al., 2011).
Fruto: Es una baya globosa verde o roja y crece hasta alcanzar 1 cm (Torres, 2013).
2.2 Cultura y tradiciones Esta planta encierra tradiciones y mitos en la Amazonía, de acuerdo a la tradición Kichwa inician su jornada a las 3 de la madrugada con la bebida de la infusión de guayusa. Tradicionalmente, las familias indígenas kichwa se despiertan y se reúnen alrededor de un fuego comunal para beber en pilche. Durante este ritual, los miembros de la comunidad comparten sueños, mitos y leyendas. Varios mitos relatan cómo la planta guayusa enseñó a los seres humanos cómo soñar, ya lo largo de la mañana los chamanes interpretan los sueños de la noche anterior (Pacha, 2012). Según, Runa (2014), los cazadores también beben guayusa antes de los viajes nocturnos de caza con el fin de aumentar sus sentidos de conciencia y enfoque. Beber guayusa les permite estar más alerta y en contacto con el entorno, permitiéndoles cazar con seguridad en la selva. Por esta razón guayusa es conocido como "El hombre nocturno”. 2.3 Propiedades y uso de la guayusa El género Ilex, es el de mayor importancia económica, por su gran número de especies se emplean como plantas ornamentales y medicinales. Las especies que se destacan como fuente de varias
5
preparaciones ricas en cafeína y teobromina son: Ilex vomitoria Aiton (yaupon), Ilex paraguayensis (yerba mate) e Ilex guayusa Loes. (guayusa) (Radice et al.,2007). Según Hernández (2014), en Ecuador el uso tradicional de la guayusa es en forma de té, usada como bebida refrescante y tonificante debido a su elevado contenido de xantinas de tipo cafeína. A la vez se le atribuyen propiedades hipoglucemiantes en pacientes diabéticos. El té se prepara agregando a un litro de agua hirviente 4 o 5 hojas y se toma de una a dos tazas al día. La infusión de guayusa por sus propiedades se lo utiliza como:
Potente antioxidante. Su contenido de cafeína es de un promedio del 3%, además contiene antioxidantes con mayor capacidad de absorción de los radicales libres que el té verde que se comercializa tradicionalmente.
Rica en vitaminas y minerales. Contiene magnesio, calcio, zinc, potasio y vitaminas D y C. También contiene ácidos clorogénicos, muy beneficiosos para la salud cardiovascular y aminoácidos esenciales.
Contiene estimulantes. Además de cafeína, la guayusa contiene estimulantes como methylxantina alcaloidea, theofilina que se encuentran en el té verde y theobromina, que también puedes aprovechar en el chocolate negro.
Gran energizante. Las bebidas energéticas siempre han sido valoradas y a pesar de que ahora se venden en latas en la antigüedad ya se aprovechaban desde las plantas. Los guerreros amazónicos usaban la guayusa como energizante natural para activar la mente y cazar y recolectar todo lo necesario para sobrevivir.
2.4 Manejo del cultivo 2.4.1 Requerimiento climático
Muestras depositadas en el Herbario Nacional Colombiano Bogotá, Ilex guayusa crece en Colombia en 2.000 msnm, esta especie se distribuye en altitudes entre 200 y 2.000 msnm (Sequeda et al., 2016). El mismo autor manifiesta que en Ecuador han sido recolectadas a 500 msnm y en Perú a 220 msnm. Además, en Ecuador esta distribución de la especie es desde el nivel del mar hasta los 1.500 msnm (Radice et al., 2007).
Según Collahuazo, (2012), Ilex guayusa se desarrolla a temperaturas de 18 a 26 C°, con precipitaciones anuales de 1000 a 3000 mm.
2.4.2 Requerimientos edáficos Las plantas de guayusa se desarrollan en suelos donde tiene una textura arenosa característico con pH ácido entre 4,34 y 5,01. Tiene baja capacidad catiónica, aluminio alto, siguiendo el patrón de suelos ácidos con tendencia a ser pobres (Sequeda et al., 2016). De acuerdo a su distribución, crece en suelos jóvenes (Entisoles) de meteorización reciente y de estado intermedio (Inceptisoles) de textura franco a franco arenoso. Se adapta tanto a suelos húmedos como a secos, tolera suelos compactados, aunque prefiere los suelos drenados y fértiles. Tiene un buen crecimiento en terrenos planos, de pendiente entre 0 y 5% y en partes onduladas e inclinadas, con pendientes entre 6 y 15% (Collahuazo, 2012).
2.4.3 Requerimiento luz
Teniendo en cuenta los requerimientos de luz puede considerarse una especie forestal, como un heliófito duradero, ya que su regeneración natural puede mantenerse a niveles de luz bajos. De
6
hecho, los sitios semi-oscuros son los más recomendados para su proliferación. Originalmente las plántulas de guayusa necesitan poca luz para cumplir con sus funciones (Sequeda et al. 2016).
Este autor también sostiene que, en un ambiente libre de exposición a la luz tiende a ramificar y crecer brotes, ya que el brote terminal se ha visto afectado por la luz y crece ramas. Los tallos formadores arrojan una sombra sobre los brotes basales que se generan en tallos muertos o poco vigorosos.
2.4.4 Estado de conservación
Ilex guayusa no se encuentra dentro de la categoría de conservación en el catálogo de plantas vasculares, como el libro rojo, propuesto por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales, es decir, no es vulnerable, no está en peligro, Por lo tanto, no es una especie en riesgo (Aldaz et al., 2011).
2.4.5 Propagación vegetativa
Durante muchos años algunos botánicos pensaron que Ilex guayusa había perdido su florecimiento y capacidad de producción de frutos ocasionada por años de selección y propagación vegetativa por el hombre. Esta teoría se basó en la falta de especímenes con órganos reproductivos, por lo que en la actualidad la forma de propagación utilizada es asexualmente (Sequeda et al., 2016). Todos los miembros del género Ilex, se caracterizan por ser de plantas unisexuales dioicas; es decir, con sexos separados; hay individuos con flores masculinas y otros individuos con flores femeninas. La condición de unisexual implica la presencia obligatoria de al menos de un individuo polinizador capaz de fertilizar a plantas femeninas y así producir semilla (Montagnini et al., 2015). No se conoce mucho sobre la planta de guayusa y según Collahuazo (2012), existe muy poca información, es un árbol que se lo encuentra disperso en potreros y en huerto o chacra familiar Shuar. Su propagación sexual aparentemente presenta dificultades por la limitada producción de semilla, la propagación por estacas es la alternativa, aunque también existe dificultad en ello, se ha reportado varias formas de propagación por estacas.
El mismo autor también menciona que para sembrar guayusa por estacas es necesario que la planta madre tenga ramas con brotes o a su vez de la planta sacar nuevas plántulas que están al contorno y de esta manera obtener las estacas.
Debido a que la producción de semillas es poco frecuente, se ha propuesto la formulación de un protocolo para recabar información acerca de la fenología de la guayusa. En Perú se reporta que la floración es de marzo a noviembre (Montagnini et al., 2015). Este autor manifiesta que la Fundación Runa tiene interés acerca de las características de las semillas y la mejor manera en que podrían ser germinadas. Es posible, tal como sucede con las semillas de otras especies del género Ilex, como la yerba mate (Ilex paraguariensis), que las semillas de guayusa tengan un complejo y largo periodo de germinación. Por tal motivo quizás sea necesario aplicar tratamientos para estimularla. Runa está formulando un programa de estudio para ensayar métodos de preservación y germinación, basados en técnicas empleadas para semillas de yerba mate y otras plantas similares.
7
2.4.6 Diversidad genética Las plantas de guayusa carecen de diversidad genética generada mediante la reproducción sexual y flujo génico, esto está siendo demostrado por investigaciones desarrolladas entre Runa y científicos de la Universidad San Francisco, Quito. La posibilidad de encontrar plantas en la actualidad que tengan poca capacidad para adaptarse y resistir el impacto de plagas, hongos o enfermedades es habitual, por lo cual la diversidad genética puede contribuir para que no sean afectadas en el futuro. La fundación Runa durante el 2010 y 2011 enfocó sus esfuerzos en documentar información sobre las posibles amenazas a la guayusa, pese a su aparente resistencia a enfermedades, parásitos y predadores (Montagnini et al., 2015). El mismo autor manifiesta que en el año 2013, la Fundación Runa, en conjunto con la Universidad San Francisco de Quito, empezó un estudio para examinar la diversidad genética de la especie. Las muestras de guayusa se colectaron procurando cubrir la mayor área posible de la región amazónica ecuatoriana, donde se ha registrado guayusa en el pasado. Dichas muestras se enviaron a los laboratorios de biotecnología vegetal y química analítica de la universidad, para su respectivo análisis de composición genética y fitoquímica. Según Mosquera (2015), con el estudio realizado de diversidad genética de guayusa en diferentes localidades de Sucumbíos, Napo, Orellana, Pastaza, Morona Santiago y Zamora Chinchipe, donde se analizó con 157 individuos de guayusa, se obtuvo dos posibles líneas ancestrales, la primera comprende los individuos de la población de Sucumbíos y parte de los individuos de la población de Napo; y la segunda el resto de individuos de Napo y de las poblaciones de las provincias de Orellana, Pastaza, Morona Santiago y Zamora Chinchipe, tomando en cuenta que es el primer estudio de diversidad genética en Ilex guayusa.
2.4.7 Especies asociadas con guayusa La guayusa se ha cultivado tradicionalmente en las chacras, por lo que se puede cultivar en asociación con especies maderables, medicinales y frutales, considerando que son inversiones de largo plazo (Cuadro 1). Algunas especies crecen rápido, pero otras requieren de 10 hasta 20 años para ser cosechadas. En este periodo de tiempo, los árboles maderables proveen sombra para la Guayusa y pueden requerir podas para mejorar el paso de la luz (Martínez, 2015). El mismo autor acota que se debe observar la salud de los árboles maderables para asegurar que no presenten plagas que se puedan trasmitir a las plantas de Guayusa. Es importante también hacer una selección de los árboles en su chacra y dejar los que crezcan rectos y con mayor vigor. Cuadro 1: Lista de especies que pueden crecer en asociación con la guayusa.
Familia Especie Nombre Común Tipo
Annonaceae Rollinia mucosa Chirimoya/Anona Frutal
Bignoniaceae Tabebuia chrysantha Guayacán Maderable
Bombacaceae Ochroma pyramidale Balsa Maderable
Burseraceae Dacryodes spp. Copal Maderable
Cecropiaceae
Pourouma cecropifolia/ Pourouma minor
Uva de monte Frutal
Euphorbiaceae Manihot esculenta Yuca Comestible
Euphorbiaceae Croton lechleri Sangre de Drago Medicinal
Fabaceae Phaseolus vulgaris L. Fréjol Ciclo corto
Fabaceae Arachis hypogea Maní Ciclo corto
8
Fabaceae Inga spp. Guaba Frutal
Fabaceae Calliandra angustifolia Yutzu Maderable
Fabaceae Mycroxylum balsamum Bálsamo Medicinal
Lauraceae Persea americana Aguacate Frutal
Malvaceae Sterculia apetala Cacao de monte/Cambia
Frutal
Meliaceae Cedrela odorata Cedro Blanco Maderable
Meliaceae
Guarea kunthiana, G. purusiana, G.gomma, G. guidonia
Manzano Maderable
Meliaceae Cabralea canjerana (Vell.) Mart.
Batea Caspi Maderable
Mimosaceae Cedrelinga cataeniformes Seique/Chuncho Maderable
Mimosaceae Parkia balslevii Guarango Maderable
Moraceae Artocarpus artilis Frutipan Frutal
Musaceae Musa paradisiaca Plátano/banano Frutal
Musaceae Musa acuminata Orito Frutal
Myristicaceae Virola spp. Sangre de gallina/Doncel/Tabano
Maderable
Myrtaceae Psidium guajava Guayaba Frutal
Poaceae Zea mays Maíz Ciclo corto
Simaroubaceae Simarouba amara Arenillo Maderable
Sterculaceae Theobroma cacao Cacao Frutal
Fuente: Montagnini et al. (2015).
Según Montagnini et al. (2015), la guayusa es una especie que tolera la sombra, lo que la hace ideal para asociar en un sistema agroforestal, pero es preciso entender qué especies pueden proveer el régimen de sombra óptimo para la guayusa. Existen especies que no se asocien de manera favorable con la guayusa, sea porque producen demasiada sombra, o porque su hojarasca contiene algún elemento químico que inhibe el crecimiento de otras especies (alelopatía, por ejemplo, el nogal o eucaliptos), o porque sus raíces interfieren con las de la guayusa (por ejemplo, el cacao). En esos casos se usan diseños espaciales para incluir estas especies, de manera que no estén muy cerca, sea formando bordes, linderos, o bien estratificando la chacra plantando diferentes especies en diversas áreas, de modo que no interfieran unas con otras y exista una competencia entre ellas.
2.5 Componentes químicos de hoja de guayusa
Las hojas contienen cafeína en cantidades variables, superiores a las del café y el té; contiene además teobromina y cantidades menores de teofilina y otras xantinas, esteroides, terpenoides y lactonasterpénicas (Pacha, 2012). Por otro lado estudios del análisis fitoquímico revelan que según Arias & Gualli (2013), contiene alcaloides, flavonoides, azúcares reductores, fenoles, triterpenos, quinonas, grasas, y aceites, con respecto al estudio bromatológico indicaron un contenido de la proteína entre 0,6 y 1,3%, contenidos total de grasa entre 1,6 y 4,0%, contenido total de cenizas entre 5,5 y 6,9%, ácido clorhídrico Cenizas insolubles entre 0,7 y 0,8%, sustancias solubles en agua entre 0,9 y 2,9%, hidratos de carbono (Incluyendo monosacáridos a polisacáridos estructurales) entre 78,4 y 83,6% y contenido de cafeína fue del 3,7%. En el Cuadro 2 se observa la composición química de especies del género Ilex.
9
Cuadro 2: Composición química de Yerba mate, té verde y guayusa.
Compuesto químico Guayusa Yerba Mate Té verde
Cafeína % 3,33 0,78 – 1,25 -
Teobromina % 0,02 0,34 – 0,43
Ácido gultámico - - -
Flavonoides % - - -
Antioxidantes uM/gram 58 28 - 29
Polifenoles mg 7,73 7,15
Fuente: Arias & Gualli (2013)
2.6 Cafeína La cafeína es una de las sustancias adictivas más consumidas en todo el mundo, su uso y abuso ha llegado a convertirse en un hábito culturalmente aceptado en occidente. Las bebidas gasificantes, actualmente, son las más populares en los Estados Unidos y en el resto del mundo, y la mayoría contiene cafeína (Osada et al., 2008).
2.6.1 Concepto La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas, sólido cristalino, blanco y de sabor amargo, que actúa como una droga psicoactiva y estimulante. La cafeína fue descubierta en 1819 por el químico alemán Friedrich Ferdinand Runge: fue él quien acuñó el término Koffein, un compuesto químico en el café, el cual pasaría posteriormente al español como cafeína. La cafeína es también parte de las mezclas químicas y complejos insolubles guaranina (encontrada en la guaraná), mateína (encontrada en el mate) y teína (encontrada en el té), todas las cuales contienen además algunos alcaloides adicionales como los estimulantes cardíacos teofilina y teobromina y a menudo otros compuestos químicos como los polifenoles, los cuales pueden formar complejos insolubles con la cafeína (Pacha, 2012). El mismo autor manifiesta que la cafeína puede encontrarse en cantidades variables en las semillas, las hojas y los frutos de algunas plantas, donde actúa como un pesticida natural que paraliza y mata ciertos insectos que se alimentan de las plantas.
2.6.2 Propiedades químicas La cafeína es un alcaloide de la familia metilxantina, las bases xánticas o púricas son alcaloides derivados de la purina. Concretamente, provienen del anillo de la purina que se forma a través de la condensación de una pirimidina con un imidazol. Poseen una estructura cristalina y su fórmula molecular es C3H4N2. Las más importantes son las metilxantinas: cafeína, teofilina y teobromina, conocidas respectivamente como 1,3,7-trimetilxantina, 1,3-dimetilxantina y 3,7- dimetilxantina (Calle, 2011).
Figura 1: Estructura molecular de la Cafeína (Calle, 2011).
10
El mismo autor acota que la fórmula química de la cafeína es C8H10N4O2, con una masa molecular de 194,19 g/mol. Es una molécula química aquiral, por lo tanto, no tiene enantiómeros ni tiene estereoisómeros. Su nombre sistemático es 1,3,7-trimetilxantina, 1,3,7-trimetil-2,6-dioxopurina o 3,7-dihidro-1,3,7-trimetil-1H-purina-2,6-diona. También es conocida como trimetilxantina, teína, mateína, guaranína, metilteobromina o metilteofilina, ya que se obtiene por extracción de materiales vegetales como el café, té, guaraná, chocolate, yerba mate o la nuez de cola. A su vez manifiesta que en estado puro es un sólido cristalino blanco inodoro en forma de agujas blancas o polvo, con un gusto muy amargo, que tiene una densidad de 1,23 g/ml, un punto de fusión de 237 °C y es eflorescente en contacto con aire. A presión atmosférica sublima a 176 °C, sin descomposición. También, puede cristalizar en forma de prismas hexagonales.
Expone que esta sustancia es soluble en agua, por lo que es una función directa de la temperatura. A 25 °C se disuelven 22 mg de cafeína en 1 ml de agua, mientras que a 80 °C se diluyen 180 mg/ml y a 100 °C lo hacen 670 mg/ml. Es muy soluble en agua hirviendo en la que cristaliza como monohidrato, ya que va perdiendo progresivamente la molécula de agua, hasta que lo hace totalmente a los 100 °C. Sin embargo, tiene más afinidad por algunos disolventes orgánicos, como el cloroformo (CHCl3) y el diclorometano (CH2Cl2), que a su vez son casi inmiscibles en agua. La cafeína puede formar combinaciones estables con sales alcalinas de ácidos débiles, como el benzoato y silicato de sodio, pero su reacción con ácidos da lugar a compuestos muy inestables. Se descompone fácilmente por la acción de álcalis calientes y por cloro.
2.6.3 Biosíntesis de la cafeína. La principal vía de biosíntesis de la cafeína ocurre en cuatro pasos secuenciales, la primera conversión es la xantosina en 7- metilxantosina catalizada por la 7- metilxantosina sintasa, el segundo paso de la biosíntesis de la cafeína implica una nucleosidasa que cataliza la hidrólisis de la 7-metilxantosina, el tercer paso la conversión de 7-metilxantosina en teobromina y la cuarta la cafeína sintasa puede utilizar paraxantina, teobromina y 7- metilxantina (Grafico 2) (Ashihara et al., 2008).
Figura 2: Principal ruta de biosíntesis de la cafeína (Ashihara et al., 2008)
2.6.4 Catabolismo de cafeína La cafeína se produce en hojas jóvenes y frutos inmaduros, y continúa acumulándose gradualmente durante la maduración de estos órganos. Sin embargo, se degrada muy lentamente con la eliminación principal de xantina vía teofilina y 3-metilxantina dando como resultado la formación de xantina. La xantina se degrada a CO2 y NH3 por la vía catabólica oxidativa purina convencional (Figura 3). Normalmente, la conversión de la cafeína en la teofilina es el paso
11
limitante de la velocidad principal y como consecuencia la cafeína se acumula en especies tales como Coffea arabica y Camellia sinensis (Ashihara et al., 2008).
Figura 3: Ruta catabólica de las purinas y cafeína (Ashihara et al., 2008).
2.6.5 Cafeína en la naturaleza La cafeína es un alcaloide de base nitrogenada que se encuentra naturalmente en muchas especies de plantas como: guarana (guaranina), mate (mateina), té (teína), cacao, guayusa, entre otros. El contenido de cafeína varía enormemente de unas plantas a otras inclusive dentro de una misma especie existe gran variabilidad (Figura 4) (Osada, 2008).
Figura 4: Cantidad de cafeína por producto (Runa, 2014).
12
2.6.6 Función de la cafeína en la planta El papel fisiológico de alcaloides de purina en las plantas tiene en común tres características entre ellas, la primera son solubles en agua, segundo contienen al menos un átomo de nitrógeno en la molécula, y la tercera presentan actividad biológica. Los alcaloides se encuentran en el 20% alrededor de las plantas vasculares, la mayoría dicotiledóneas herbáceas (García et al., 2009). Existen dos hipótesis relativas sobre el papel de la cafeína en las plantas, la teoría de ''defensa química” y “alelopática”. (Ashihara et al., 2008).
2.6.6.1 Defensa química Las plantas producen cafeína almacenadas en tejidos jóvenes, frutas y flores actúa como pesticida natural, a modo de protección mecánica a través de la cual logran paralizar y matar ciertos insectos que se alimentan de la planta (Ashihara et al., 2008).
2.6.6.2 Alelopatía
La cafeína en cubiertas de semillas y hojas que caen en el suelo, inhiben la germinación de las semillas alrededor de las plantas madre. Aunque no existe evidencia experimental de laboratorio, los estudios de apoyo de esta sugerencia, no está claro hasta qué medida la cafeína está involucrado en la alelopatía en ecosistemas naturales, especialmente como las bacterias del suelo tales como Pseudomonas putida que puede degradar el alcaloide purina (Ashihara et al., 2008). 2.8 Método para análisis fitoquímico Los fitoquímicos, como su nombre lo indica, son compuestos químicos individuales, los cuales están presentes en las plantas se puede identificar de forma cualitativa y cuantitativa (Melo, 2014). Por otro lado, para la utilización de la técnica de separación de la cafeína según Calle (2011), se debe tener en cuenta los criterios económicos y de accesibilidad, además las consideraciones sobre propiedades físicas y estructurales de las moléculas que se pretende separar. 2.8.1 Cromatografía
La cromatografía es un método que comprende un conjunto de técnicas de análisis empleadas con la finalidad de separar, identificar y determinar componentes presentes en una mezcla. Todos los métodos o técnicas cromatografías utilizan una fase móvil (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra los componentes de la mezcla a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido (Carpintero et al., 2014).
Este autor manifiesta que los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando, para luego pasar por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo del compuesto.
2.8.2 Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
La cromatografía liquida de alta resolución es un método de análisis cuantitativo con elevada especificidad y sensibilidad. La muestra que contiene los compuestos a separar es disuelta e inyectada en una columna rellena de fase estacionaria a través de la cual es forzada a pasar por una fase móvil liquida impulsada por una bomba de alta presión. Los componentes se separan en
13
función de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que atraviesan la columna (Carpintero et al., 2014). Según Regalado (2014), las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases. 2.8.2.1 Instrumentación de HPLC La instrumentación de HPLC involucra bomba, inyector, columna, detector, integrador y sistema de visualización. En la columna se produce la separación. Las partes incluyen (Thammana, 2016):
Recipiente de disolvente: El contenido de la fase móvil está presente en el contenedor de vidrio. En HPLC, la fase o disolvente móvil es una mezcla de componentes líquidos polares y no polares, dependiendo de la composición de la muestra, se variarán los disolventes polares y no polares.
Bomba: La bomba aspira la fase móvil del depósito de disolvente y la fuerza a la columna,
luego pasa al detector. La presión de funcionamiento de la bomba es 42000 KPa. Esta presión de funcionamiento depende de las dimensiones de la columna, el tamaño de partícula, el caudal y la composición de la fase móvil.
Inyector de muestra: El inyector puede ser una infusión solitaria o un marco de infusión
computarizado. Un inyector para un HPLC debe dar infusión de la muestra de líquido dentro del alcance de 0,1 ml a 100 ml de volumen con alta reproducibilidad y bajo alta presión (hasta 4000 psi).
Columnas: Las columnas están hechas típicamente de acero inoxidable limpiado, tienen
alrededor de 50 mm y 300 mm de largo y tienen una distancia hacia adentro alrededor de 2 y 5 mm. Generalmente se cargan con una estacionaria con un tamaño de molécula de 3 μm a 10 μm. Las columnas con diámetros interiores de <2 mm se manifiestan regularmente como segmentos de microporos. Preferiblemente, la temperatura de la fase móvil y la columna deben mantenerse constantes durante la investigación
Detector: El detector de HPLC, situado hacia el final de la columna, distingue a los analitos
cuando se absorben de la columna cromatográfica. Los detectores utilizados regularmente son la espectroscopia UV, la fluorescencia, la espectrofotometría y los identificadores electroquímicos.
Dispositivos de Recolección de Datos o Integrador: Las señales del detector pueden ser
recogidas en graficadores o integradores electrónicos que fluctúan en la calidad de muchos lados y en su capacidad de procesar, almacenar y reprocesar la información cromatográfica. El PC coordina la reacción del indicador en cada parte y la coloca en un cromatógrafo que es difícil de interpretar
2.8.2.2 Tipos de HPLC Dependiendo del sustrato utilizado, es decir, de la fase estacionaria utilizada, el método HPLC se divide en los siguientes tipos (Thammana, 2016):
14
HPLC de fase normal: En este método la separación se basa en la polaridad. La fase
estacionaria es polar, principalmente se utiliza sílice y la fase no polar utilizada es hexano, cloroformo y éter dietílico. Las muestras polares son retenidas en la columna.
HPLC de fase inversa: es inversa a la HPLC de fase normal. La fase móvil es polar y la fase
estacionaria es no polar o hidrófoba. Cuanto más es la naturaleza no polar, más se conservará
HPLC de exclusión de tamaño: La columna se incorporará con moléculas de sustrato controladas con precisión. Basándose en la diferencia en los tamaños moleculares, se producirá la separación de los constituyentes.
HPLC de intercambio iónico: La fase estacionaria tiene una superficie cargada iónicamente
opuesta a la carga de la muestra. La fase móvil utilizada es un tampón acuoso que controlará el pH y la fuerza iónica.
15
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Ubicación del ensayo
Este experimento se realizó en dos lugares diferentes la fase de campo en la hostería Huasquila Amazon Lodge y fase de laboratorio en Química Aristón.
3.1.1 Ubicación política de la parcela (Fase de campo)
Provincia: Napo
Cantón: Archidona
Parroquia: Cotundo
3.1.1.1 Ubicación geográfica parcela Latitud: 01°30’27’’ S
Longitud: 77°56’38’’ O
Altitud: 960 msnm
Fuente: INAMI, 2015
3.1.1.2 Características agro-climáticas Cuadro 3: Heliofanía, precipitación anual, temperatura media mensual, humedad relativa del primer y segundo semestre del 2012, precipitación y temperatura del primer semestre del 2016, reportadas por la Estación Meteorológica Puyo.
Períodos Heliofanía h
Precipitación anual mm
Temperatura media mensual
°C
Humedad relativa
%
Anual 2012 1101,9 4470,3 21,2 88
Primer semestre 450,4 2596,8
Segundo semestre 651,5 1873,5
Primer semestre 2016 - 2918 29,8 - Fuente: Anuario Meteorológico N° 52-2012. Boletín semestral N° 01-2016. Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología. Elaborado por la autora.
3.1.2 Ubicación geográfica determinación del contenido de cafeína (Fase de laboratorio)
Latitud: 0° 6´0.29”S Longitud: 78° 28´28.78”O Altitud: 2841 msnm
Fuente: INAMI, 2015
3.1.2.1 Ubicación política determinación del contenido de cafeína
Provincia: Pichincha Cantón: Quito
Parroquia: Carcelén
16
3.2 Materiales Las muestras de follaje Guayusa proceden de un cultivo comercial orgánico de tres años de edad, establecido mediante propagación vegetativa de estacas, la siembra fue desarrollada en forma escalonada con diferencia de 3 meses entre pendientes.
3.2.2 Material de campo
Fundas de papel
Fundas plásticas
Tijera
Pintura spray
Marcadores permanentes
Cinta métrica
Etiquetas
Equipo
GPS
Horno a gas
3.2.3 Material de laboratorio
Balones volumétricos de 100 ml
Pipetas volumétricas de 1 ml
Vaso de precipitación
Filtros de 0.45 nm
Jeringuilla
Frascos 2 ml
Equipos
Balanza analítica de precisión
Determinador de humedad Karl – Fischer
Cromatógrafo líquido de alta eficiencia (HPLC) (PERKIN ELMER SERIE 200)
Ultrasonido (BRANSON 3510)
Reactivos
Agua grado HPLC
Acetonitrilo grado HPLC
Ácido acético glacial
Tetrahidrofurano
Acetato de sodio
3.2.4 Material de escritorio
Libreta de campo
Fichas y registros
Cámara fotográfica
Computador personal
Lápiz
3.2.5 Programas informativos
Infostat
17
ArcGis 10.4
3.3 Métodos
3.3.1 Factor en estudio Para alcanzar los objetivos de esta investigación se planteó evaluar un factor en estudio: Contenido de cafeína en cada variable establecida.
3.3.2 Tratamientos Los tratamientos del estudio resultan de los diferentes estratos de la pendiente, como se explica en el siguiente cuadro. Cuadro 4: Tratamientos a ser evaluados en el estudio de la determinación de contenido de cafeína en un cultivo comercial de guayusa.
Tratamiento Código Descripción
1 Ea Estrato alto
2 Em Estrato medio
3 Eb Estrato bajo
Elaboración: La autora
3.4 Análisis estadístico
3.4.1 Diseño experimental
Se utilizó en el experimento un Diseño completamente al azar (DCA), con tres tratamientos para cada observación.
3.4.2 Unidad experimental
El estudio consistió de 1ha de guayusa, con individuos plantados a una distancia de 1,5 m entre
árboles y 2 m entre hileras (3m2), con un número total de 3333 individuos .
Número de unidades experimentales: 72 Número de tratamientos: 3 Número de observaciones: 24
3.4.3 Esquema del análisis de la varianza Cuadro 5: Esquema del ADEVA del experimento para la determinación del contenido de cafeína en un cultivo comercial de guayusa (Ilex guayusa).
Fuentes de Variación Grados de Libertad
Tratamientos 2
Error experimental 69
Total 71
Elaboración: La autora
18
3.4.4 Análisis Funcional
Los datos se evaluaron mediante los siguientes análisis: regresión múltiple, análisis de varianza, correlación (Pearson) y LSD de Fischer, se usó la prueba de LSD de Fischer (p=0,05), para comparar sus promedios; mientras que para comprobar la existencia de diferencias estadísticamente significativas en las variables las mismas que cumplieron con los supuestos de normalidad se aplicó la prueba de Shapiro-Wilks y Prueba de Levene, para las variables que no cumplieron los supuestos de normalidad se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.
3.5 Variables y métodos de evaluación
3.5.1 Altura de la planta
Se evalúo a partir de que las plantas tienen tres años de edad, tomando la distancia en metros, con una cinta métrica, desde el nivel del suelo, hasta el último ápice terminal.
3.5.2 Ancho de la copa
Se evalúo a partir de que las plantas tienen tres años de edad, midiendo la copa grande donde se
tomó de las ramas bajeras más largas de extremo a extremo.
3.5.3 Diámetro del tallo a la atura del pecho (DAT) Se evalúo a partir de que las plantas tienen tres años de edad, midiendo la circunferencia del tronco (C), a 1,30 m de altura, y se calculó a partir de la fórmula de la circunferencia C= D x π para lo cual se procedió a despejar el diámetro D = /π) y se reemplazó los valores, ejemplo: Circunferencia 5 cm. DAP= 5 cm/ π DAP= 1,59 cm
3.5.4 Contenido de cafeína La cuantificación de cafeína se realizó mediante el método USP38 utilizando un cromatógrafo líquido de alta eficiencia (HPLC) (PERKIN ELMER SERIE 200).
3.6 Método del manejo de las muestras
3.6.1 Pruebas preliminares Se realizó en el laboratorio de suelos de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador, se probaron tres temperaturas de secado de 40°C, 50°C y 80°C por 8 horas. Las tres temperaturas no presentaron un efecto en el contenido de cafeína en las muestras procesadas (Cuadro 6). Cuadro 6: Contenido de cafeína a tres temperaturas en follaje de guayusa.
.
Temperatura
Peso real
Humedad
Peso
corregido
Contenido de
cafeína
°C 40°
mg 100,2
% 5,64
mg 94,560
mg 100 mg-1 1,91
50°
100,7
5,65
95,050
1,89
80°
100,8
4,98
95,820
1,93
19
Elaboración: La autora
Al obtener los datos de contenido de cafeína a tres temperaturas en follaje de guayusa se determinó que no existe un efecto en el contenido de cafeína, por lo cual se procedió a realizar la investigación tomando como base la temperatura de 80°C para el secado de las muestras.
3.6.2 Formación de Estratos en base a la pendiente
Se dividió el terreno en tres estratos de acuerdo a la pendiente (baja, media y alta), tomando las altitudes de cada estrato. Para determinar el porcentaje de cada pendiente se utilizó la siguiente formula, la cual la pendiente o inclinación de un terreno es la relación que existe entre el desnivel que se debe superar y la distancia horizontal que se debe recorrer (Yugcha, et al, 2008).
Tomando en cuenta los datos requeridos se procedió a calcular la pendiente para dividir por estratos.
3.6.2.1 Estrato bajo (Eb) Datos: A1= 828 A2= 835 Diferencia= 7 Distancia horizontal= 69m Cálculo
3.6.2.2 Estrato medio (Em) Datos: A1= 835 A2= 844 Diferencia= 9 Distancia horizontal= 67m Cálculo:
20
3.6.2.3 Estrato alto (Ea) Datos: A1= 844 A2= 828 Diferencia= 16 Distancia horizontal= 87m Cálculo:
Se aplicó la fórmula para obtener las pendientes (baja, media y alta) que corresponde a cada uno de los estratos (Figura 5).
Figura 5: Delimitación de cada pendiente.
21
3.7 Recolección de las muestras Los individuos muestreados fueron seleccionados al azar, la ubicación de cada planta fue determinada mediante GPS, y se asignó etiquetas para la identificación de cada planta con su respectiva pendiente. En total se recolectaron 72 muestras como se muestran en la (Figura 6).
Figura 6: Georreferencia de cada planta muestreada.
Las hojas cosechadas fueron mezcladas, se formó una muestra y se almaceno en fundas de papel perforadas, adicionalmente se registraron datos sobre la ubicación como muestra en la (Figura 7).
Figura 7: Muestras de follaje en fundas de papel perforado
22
3.8 Secado de las muestras El material colectado fue secado en un horno comercial a gas ubicado en la parroquia de Cotundo, a una temperatura de 80°C por dos horas, como muestra la (Figura 8).
Figura 8: Horno comercial a gas para el secado de muestras de follaje.
3.9 Molienda Las muestras secas fueron molidas en un molino eléctrico de banda horizontal (ARTHUR.H TOMAS CO.) del Departamento de Suelos de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central (Figura 9).
Figura 9: Molino eléctrico
3.10 Análisis químico mediante HPLC Los análisis de humedad y determinación de cafeína se realizaron en el laboratorio farmacéutico de “Química Aristón”.
23
3.10.1 Determinación de humedad La humedad de las muestras se determinó mediante el método halógeno utilizando el equipo determinador de humedad Karl – Fischer (Figura 10).
Figura 10: Determinador de humedad Karl – Fischer.
3.10.2 Determinación de cafeína en guayusa por método espectrofotométrico. La cuantificación de cafeína se realizó mediante el método utilizado en el laboratorio por Farmacopea USP38 mediante un cromatógrafo líquido de alta eficiencia HPLC (Figura 11, 12).
Figura 11: Ultrasonido BRASON 3510
Figura 12: Extracción de guayusa
24
Preparación del extracto de guayusa:
1. Pesar aproximadamente 100 mg de guayusa molida 2. Transferir a un balón de 50 ml. 3. Agregar 30 ml de agua tipo HPLC. 4. Extracción en ultrasonido BRASON 3510 por 20 minutos y aforar con agua. 5. Filtrar por filtro jeringa de 0,45 µm e inyectar al HPL.
Preparación de estándar:
1. Pesar aproximadamente 30 mg de Cafeína anhidra estándar de referencia y transferirlo a un balón de 100 ml.
2. Agregar 50 ml de agua tipo HPLC. 3. Sonicar por 10 minutos 4. Aforar con agua tipo HPLC. 5. Tomar una alícuota de 1ml y transferirlo a balón de 10ml. 6. Aforar con agua 7. Filtrar por filtro jeringa de 0,45 µm e inyectar.
3.10.3 Condiciones en el equipo HPLC Fase móvil
Acetonitrilo HPLC Tetrahidrofurano Solución amortiguadora (25: 20: 955). Ajustar a 4,5 +/- 0,05 utilizando ácido acético glacial. Filtrar por membrana de poro de 0,45 µm y desgasificar
Fase estacionaria
Columna C18, 5 µm, (4 X 250) mm o equivalente. Longitud de onda 275 nm Flujo 1,0 ml/min Volumen de Inyección 10 µl Temperatura de la columna: 30°C
Operación: Una vez que se alcanzó las condiciones en el equipo de HPLC se realizó 5 inyecciones del estándar y 1 inyección de la muestra, tomando en consideración que el coeficiente de variación de los 5 estándares no debe ser mayor a 2,0%.
Cálculos:
25
Dónde: = Área de la muestra. = Peso del estándar (mg). = Porcentaje de pureza del estándar. = Área promedio del estándar. = Peso de la muestra (mg). 20= Factor de cálculo.
Este cálculo se realizó a cada una de las 72 muestras de guayusa, considerando todos los datos para su desarrollo.
26
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Análisis de las variables
Para verificar la distribución normal de los residuos y las varianzas constantes se realizaron las pruebas de Shapiro Wilks y Levene, respectivamente. El resultado de la prueba de normalidad “Shapiro-Wilks” (modificado) y la prueba de varianzas constantes “Levene”, indicó que para las variables altura, diámetro y ancho cumplen con los supuestos requeridos por el ADEVA, mientras que para la variable contenido de cafeína no cumple con los supuestos requeridos por el ADEVA, por lo cual se realizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (Cuadro 7). Cuadro 7: Comprobación de los supuestos de ANOVA en las 72 plantas de guayusa. Cotundo-Archidona. 2016
Variables
Normalidad Varianzas constantes
Shapiro-Wilks (modificado)
p-valor¹
Levene
p-valor2
Altura de la planta 0,0785 0,6832
Diámetro del tallo 0,0730 0,4724
Ancho de la copa 0,8417 0,3254
Contenido de cafeína 0,0207 0,2103
1 p-valor < 0,05 indica normalidad de los residuos 2 p-valor < 0,05 indica varianzas constantes de los residuos absolutos
4.2 Contenido de cafeína en muestras con humedad al 5%.
Los datos obtenidos en el análisis de varianza para el contenido de cafeína en guayusa, determinó el coeficiente de variación (30,47%), para ensayos agrícolas de campo este coeficiente de variación es considerado como alto es frecuente en condiciones no controladas (Gordón et al., 2015). Esto explica que el estudio se realizó en un cultivo comercial de tres años de edad ya establecido, en el cual no se realizó ningún trazado del experimento en campo que permita reducir el error y controlar factores como: origen de las estacas, homogeneidad del material vegetal, diferencia en fecha de siembra entre extractos, distancia de siembra, y a su vez el número de muestras fue limitada por los costos de análisis de las muestras. Por lo tanto, los resultados obtenidos son a base de un estudio observacional.
En la distribución de frecuencias absolutas se encontró que el mayor número de individuos (25) está presente en un intervalo de 2,53 a 3,31 mg 100 mg-1 con un promedio de 2,92 mg 100 mg-1, la planta con mayor contenido de cafeína se situó en el intervalo de 4,86 a 5,64 mg 100 mg-1 con un promedio de 5,25 mg 100 mg-1 siendo este el intervalo con menor número de individuos (1). La baja frecuencia de individuos con alto contenido de cafeína podría ser mayor incrementando el tamaño de muestras (Figura 13).
27
Figura 13: Frecuencia absoluta de la distribución del contenido de cafeína (mg 100 mg-1) de 72 individuos.
Los datos obtenidos en el análisis contenido de cafeína en guayusa no presentaron una distribución normal, por lo cual se procedió a realizar el ANOVA no paramétrico mediante la Prueba de Kruskal-Wallis, mismo que de los residuos detectó diferencias altamente significativas entre medias de contenidos de cafeína entre los estratos analizados (alto, medio y bajo) para el contenido de cafeína. El promedio general del lote fue de 2,56 mg 100 mg -1, la media más alta en contenido de cafeína se detectó en el estrato medio con 2,93 mg 100 mg -1, seguido por 2,48 mg 100 mg-1 de cafeína del estrato alto y en el estrato bajo la media más baja con 2,28 mg 100 mg-1 de cafeína (Cuadro 8).
Cuadro 8: ADEVA no paramétrico Kruskal-Wallis, medias, desviación estándar y probabilidad, para la variable contenido de cafeína en guayusa. Cotundo-Archidona. 2016
Variable Estratos Número de individuos
Medias Desviación Estándar
p – valor *
Contenido
Alta
N 24
mg 100 mg-1 2,48
0,84
de Baja 24 2,28 0,88 0,0033
cafeína Media 24 2,93 0,65
* significativo al 0,05 de probabilidad
El contenido de cafeína en los tres estratos presentó un rango de variación que estuvo entre 0,98 a 5,64 mg.100 mg-1, es decir una diferencia de 4,66 mg.100 mg-1. Se debe indicar que la planta con el mayor contenido de cafeína se encuentra en el estrato alto y el de menor valor se encuentra en el estrato bajo presentando uniformidad fenotípica como se observa en la (Figura 14).
28
Figura 14: Planta de guayusa 21A (Izquierda) con mayor contenido de cafeína y planta guayusa 24B (derecha) con menor contenido de cafeína.
Al existir pocos estudios sobre el contenido de cafeína en guayusa, se relacionó con uno de los estudios realizados por Lewis, et al. (1991), quienes utilizaron 6 colecciones procedentes de diferentes lugares de Perú de la provincia de Andoas y de Ecuador de la provincia de Pastaza, se determinó un rango de variación en el contenido de cafeína de 5,84 puntos, que efectuó entre 1,73 % a 7,57 % en muestras procedentes de Perú, en caso de las muestras de Ecuador con un rango de variación en el contenido de cafeína de 1,41 puntos, que procedió entre 1,92% a 3,33% rangos que se presentan a la aproximación de los resultados obtenidos en el presente estudio. Un estudio sobre contenido de cafeína en guayusa en Ecuador por Melo (2014), analizando 78 muestras procedentes de diferentes localidades de la Amazonia en las provincias de Napo, Pastaza, Orellana y Morona Santiago, determinó un rango de variación en el contenido de cafeína de 16,04 puntos, que fluctuó entre 0.599 mg g-1 a 16.64 mg g-1 en muestras procedentes de Zamora Chinchipe y de Napo, respectivamente. Este rango de variación tan amplio difiere con los 4,66 puntos que se obtiene en la presente investigación en la provincia de Napo. Este rango de variación se manifiesta debido que las muestras analizadas proceden de una misma localidad, de una misma plantación, donde las condiciones ambientales de desarrollo y manejo del cultivo son altamente uniformes, lo cual difiere con las muestras de los individuos en diferentes localidades,
29
pues estos están sometidos a procesos de selección genética, fisiológica, morfológica y composición química diferente (Lewis, 1991) Uno de los factores de variación que puede existir entre los estudios es el proceso de secado de la hoja, al ser secadas, se disminuyen los fenómenos enzimáticos que deterioran los principios activos y a su vez las propiedades organolépticas (Camacho & Martínez, 2015). En el caso de yerba mate se ha demostrado una disminución del 6% en el contenido de cafeína con relación a hojas frescas y un 20% durante la etapa de secado (Hartwing, 2015). En esta investigación para determinar el contenido de cafeína se realizó el proceso de secado de la hoja en hornos eléctricos a una temperatura de 80°C, a diferencia del estudio de Melo (2014), que se desarrolló con hojas frescas, esto explica la amplia gama de los valores de contenidos de cafeína que existe en el estudio, con relación al estudio de Lewis et al. (1991), quienes desarrollaron el secado en campo obteniendo valores casi similares a la investigación realizada con el secado de la hoja en hornos eléctricos, se ha demostrado que el secado de hojas en guayusa realizado en horno eléctrico presenta mayor porcentaje de cafeína de 3,71% a diferencia del secado de hoja al ambiente con porcentaje de 3,02% (Camacho & Martínez, 2015), esto podría explicar el posible acercamiento a los valores con el estudio realizado, por lo tanto existen otros factores que posiblemente estén influyendo en las diferencias de contenidos de cafeína como pueden ser: condiciones ambientales, condiciones de cultivo y edad de la planta (Bastos et al., 2006). La comparación de a pares entre las medias de los rangos, detectó dos rangos de significancia, en el primer rango con el mayor contenido promedio de cafeína se situó el estrato medio con 2,93 mg.100 mg-
1 este rango fue compartido con el estrato alto con 2,48 mg.100 mg-1
de cafeína. Por otro lado, el estrato alto, compartió el segundo rango con el estrato bajo con un promedio 2,28 mg.100 mg-1
de cafeína (Cuadro 9). Cuadro 9: Comparaciones de a pares entre las medias de los estratos para la variable contenido de cafeína en guayusa. Cotundo-Archidona. 2016
Estrato Medias contenido de cafeína
mg 100 mg-1
Número de individuos N
Bajo 2,28 B 24
Medio 2,93 A 24
Alto 2,48 A B 24
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05) El mayor contenido de cafeína en el estrato medio las plantas pueden deberse a varias razones, en el caso de la posición de la pendiente, donde el suelo de los sitios más elevados sufre un rejuvenecimiento y existe un arrastre de materiales, los cuales son depositados en las partes bajas (Campo, 2003), sin embargo, no se pudo atribuir con los supuestos, ya que los análisis de suelo no muestran diferencias en contenido nutricional, tampoco en niveles de materia orgánica entre pendientes, presentando valores altos en la determinación del análisis de suelo (Cuadro 10). Según Perdomo et al., (2003), quienes manifiestan que, la orientación de la pendiente en el Hemisferio Sur, los suelos orientados hacia el Norte que reciben niveles mayores de radiación solar, tienden a presentar mayores contenidos de materia orgánica que los suelos orientados en otras direcciones.
30
Cuadro 10: Análisis de suelo de acuerdo a los estratos con macronutrientes y micronutrientes. Cotundo, Archidona 2016.
Estratos pH
Conductividad
eléctrica
dS/m
Materia
Orgánic
a (%)
N P
(ppm)
K
cmol/
kg
Fe
(ppm)
Mn
(ppm)
Cu
(ppm)
Zn
(ppm)
Bajo 4,28 0,29 23,62 1,18 33,1 2,20 156,9 98,3 6,3 10,7
Medio 4,39 0,22 28,05 1,40 31,1 2,03 105,4 90,3 6,2 10,4
Alto 4,26 0,31 27,68 1,38 40,6 4,38 296,8 85,1 10,6 9,5
Otro factor que posiblemente este alterando el contenido de cafeína es la presencia de varios árboles que generan sombra en el cultivo, el estrato bajo se identificó por la acumulación de árboles de una altura aproximada de 10 a 15 metros, estos árboles generan sombra a las plantas de guayusa que se encuentran en este estrato (Figura 15).
Figura 15: Distribución de árboles que generan sombra: Balza (Ochroma pyramidale), Guaba (Inga edulis) y Laurel (Laurus nobilis) en la unidad experimental.
31
Para comprobar si existe influencia de la sombra sobre el contenido de cafeína se realizó el análisis de covarianza. El ANCOVA para el contenido de cafeína, detectó influencia significativa en los árboles que generan sombra para cada estrato. De acuerdo al coeficiente de la pendiente, sugiere que un incremento en una unidad en la sombra, este representa una reducción de -0,23 mg.100 mg-
1 en el contenido de cafeína, esto quiere decir que el contenido de cafeína está influenciado por la luminosidad es decir que, a menor sombra mayor contenido de cafeína (Cuadro 11). Según Bieto et al., (2013), afirma que la radiación luminosa, es el elemento clave de la fotosíntesis, debido que es su fuente primaria de energía, por otra parte, la luz también actúa como factor regulador del crecimiento y desarrollo. De acuerdo con los resultados obtenidos existe una relación con lo que manifiesta Hartwig (2015) en yerba mate, donde indica que cultivos naturales bajo cubierta hasta 60-70% de sombra, se encuentran limitados en su proceso de fotosíntesis, por lo cual existe baja producción de biomasa, en cambio en plantaciones con terrenos abiertos con condiciones de exposición solar es más productivo en su biomasa, de la misma manera para Bastos et al. (2006), quien menciona la edad del tejido y la exposición a la luz o sombra influye en la cantidad de sustancias bioactivas en hojas de mate, conjuntamente para Ríos (2009), quien señala que los alcaloides como cafeína absorben fuertemente radiaciones comprendidas en el rango ultravioleta (UV) donde cumple un rol protector frente a este tipo de radiación.
Cuadro 11: Análisis de la covarianza entre el contenido de cafeína y los arboles vecinos. Cotundo-Archidona. 2016
Fuente de variación
Suma de Cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrados Medios
F P- valor
Coeficiente
Estratos
7,54
2
mg 100 mg-1 3,77 *
6,25
0,0032
Sombra Error
2,95 40,98
1 68
2,95 * 0,60
4,89
0,0303
-0,23
Total 51,08 71
*significativo al 0,05 de probabilidad
4.3 Altura de la planta. El análisis de varianza para la variable altura de planta, detectó diferencias estadísticas altamente significativas para los estratos. El promedio general fue 1,69 m y un coeficiente de variación de 17,74 % (Cuadro 12). Cuadro 12: Análisis de varianza para la variable altura de la planta en 72 individuos de guayusa Cotundo-Archidona. 2016
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrados Medios
Fisher calculado
p-Valor
Estratos Error
6,01 6,20
2 69
3,00** 0,09
33,40
<0,0001
Total 12,21 71
Promedio CV
1,69 (m) 17,74 (%)
** Altamente significativo al 0,01 de probabilidad
32
La prueba LSD de Fisher al 5% para altura de la planta, detectó dos rangos de significancia, ubicándose en el primer rango con la mejor respuesta el estrato alto, con un promedio de 1,94 m; mientras que, en el segundo rango con la menor respuesta se encuentra el estrato bajo, con un promedio de 1,29 m (Figura 16). Cabe mencionar que el resultado obtenido es de un cultivo comercial de tres años y a la vez por las labores culturales de poda que se realizan en la finca, debido a esto se puede considerar que el estrato alto presenta una mayor altura ya que al momento de realizar las mediciones en este estrato se encontraba sin realizar la labor de poda, tomando en consideración en otros documentos (Dueñas et al., 2016), donde los individuos guayusa domesticados pueden alcanzar un promedio de 10 m de altura, constituido por una multitud de troncos delgados y flexibles que nacen desde su base, cuando maduran y si no se manejan, los individuos guayusa pueden alcanzar una altura de aproximadamente 25 metros.
Figura 16: Rangos de significancia de cada estrato para la variable altura de la planta en 72 individuos.
Se realizó la correlación entre la variable contenido de cafeína y la variable altura de planta, el coeficiente de correlación de Pearson fue de 0,47, donde indica una tendencia positiva débil siendo directamente proporcional, entre el contenido de cafeína y la altura de planta (Anexo 3).
4.4 Diámetro del tallo a la altura del pecho (DAP) El análisis de varianza para la variable diámetro del tallo, detectó diferencias estadísticas altamente significativas para los estratos. El promedio general fue 6,08 cm y un coeficiente de variación de 22,29 % (Cuadro 13).
33
Cuadro 13: Análisis de varianza para la variable diámetro del tallo en 72 individuos de guayusa Cotundo-Archidona. 2016
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrados Medios
Fisher calculado
p-Valor
Estratos Error
6,46 12,83
2 69
3,23** 0,19
17,36
<0,0001
Total 19,29 71
Promedio CV
1,93 (cm) 22,29 (%)
** Altamente significativo al 0,01 de probabilidad La prueba LSD de Fisher al 5% para diámetro del tallo, indican dos rangos de significancia, ubicándose en el primer rango con la mejor respuesta el estrato alto, con un promedio de 2,24 cm; mientras que, en el segundo rango con la menor respuesta se encuentra el estrato bajo, con un promedio de 1,53 cm (Figura 17). El resultado obtenido es de un cultivo comercial de tres años que procede de estacas de material vegetal desconocido, según Arias (2016), el promedio del diámetro del tallo al pecho es de 20 a 50 cm en árboles de mayor edad.
Figura 17: Rangos de significancia de cada estrato para la variable diámetro del tallo en 72 individuos.
Se realizó la correlación entre la variable contenido de cafeína y la variable diámetro del tallo, el coeficiente de correlación de Pearson fue de 0,40, donde indica una tendencia positiva débil siendo directamente proporcional, entre el contenido de cafeína y el diámetro del tallo (Anexo 3).
34
4.5 Ancho de la copa El análisis de varianza para la variable ancho de la copa, detectó diferencias estadísticas altamente significativas entre los estratos. El promedio general fue 1,59 m y un coeficiente de variación de 18,60 % (Cuadro 14). Cuadro 14: Análisis de varianza para la variable ancho de la copa en 72 individuos de guayusa Cotundo-Archidona. 2016
Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de Libertad
Cuadrados Medios
Fisher calculado
p-Valor
Estratos Error
2,24 6,06
2 69
1,12** 0,09
12,72
<0,0001
Total 8,30 71
Promedio CV
1,59 (m) 18,60 (%)
** Altamente significativo al 0,01 de probabilidad La prueba LSD de Fisher al 5% para ancho de la copa, detectó dos rangos de significancia, ubicándose en el primer rango con la mejor respuesta el estrato alto, con un promedio de 1,72 m; mientras que, en el segundo rango con la menor respuesta se encuentra el estrato bajo, con un promedio de 1,35 m (Figura 18). Estas diferencias altamente significativas entre los estratos podrían ser ocasionadas por las labores culturales de poda que se realizaron en el cultivo debido a estas labores se pudo apreciar que el estrato alto presenta mayor ancho de la copa puesto que al momento de realizar las mediciones este estrato se encontraba sin realizar esta práctica.
Figura 18: Rangos de significancia de cada estrato para la variable ancho de la copa en 72 individuos.
35
Se realizó la correlación entre la variable contenido de cafeína y la variable ancho de la copa, el coeficiente de correlación de Pearson fue de 0,49, donde indica una tendencia positiva débil siendo directamente proporcional, entre el contenido de cafeína y el ancho de la copa (Anexo 3).
4.6 Regresión múltiple
Se realizó un remuestreo para generar una población aleatoria que se asemeja a la distribución original de la población de cada una de las variables en estudio; posterior a esto se procedió a realizar la regresión múltiple con los datos generales. Este análisis permitió establecer la relación existente entre las variables ancho de la copa lineal, ancho de la copa cuadrática, altura de la planta lineal, altura de planta cuadrática, diámetro del tallo y sombra son las variables que influyen en el contenido de cafeína, ya que el p-valor obtenido es menor a 0,05. El CpMallows es un indicador de la contribución de cada variable en el aporte del modelo, a mayor valor del CpMallows mayor es la contribución predictiva de esa variable en el modelo, según esto la variable que mayor influencia presenta en el modelo es la altura lineal (7757,31), seguida por la altura cuadrática (6941,49), luego por él diámetro del tallo (138,99), por el ancho de la copa lineal (118,19), por la sombra (35,08) y por último el ancho de la planta (26,24) (Cuadro 15).
Cuadro 15: Análisis de regresión lineal, coeficientes de regresión, p-valor y CpMallows
Variable Coeficiente de regresión
p-valor
CpMallows
Constante Ancho de la copa
-4,60 ** 1,33 **
<0,0001 <0,0001
118,19
Ancho de la copa ^2 -0,18 ** <0,0001 26,24
Altura de planta 7,08 ** <0,0001 7757,31 Altura de la planta ^2 -2,07 ** <0,0001 6941,49 Diámetro del tallo -0,04 ** <0,0001 138,99
Sombra -0,02 ** <0,0001 35,08
** Altamente significativo al 0,01 de probabilidad
El modelo de regresión obtenido es el siguiente:
Contenido de cafeína (mg*100 mg-1) = -4,60 + 1,33.An - 0,18.An^2 + 7,08.A – 2,07.A^2 – 0,04.D – 0,02.S
Donde:
C= Contenido de cafeína (mg.100 mg-1) A= altura de planta (m) (variable regresora) An= ancho de copa (m) (variable regresora) D= Diámetro (cm) S= Sombra El análisis de regresión múltiple determinó que la altura y el ancho de la planta son los factores que mayor incidencia tiene sobre el contenido de cafeína con 41% de la variación, de acuerdo a esto se seleccionó el estrato medio que fue el que presento el mayor contenido de cafeína.
Se determinó el intervalo de confianza de la variable altura de planta con una probabilidad del 95%, este fue de 1,49 m a 1,74 m, se observa una acumulación de la población proveniente del
36
remuestreo en el intervalo de confianza y la línea de tendencia que alcanzan la altura y el contenido de cafeína (Figura 19).
Figura 19: Diagrama de dispersión entre el contenido de cafeína y la altura de planta, las líneas verdes representan al intervalo de confianza de la altura de planta.
Para la variable ancho de la copa el intervalo de confianza con una probabilidad del 95%, fue de 1,44 m a 1,63 m, se observa la acumulación de la población proveniente del remuestreo en el intervalo de confianza y la línea de tendencia que alcanzan el ancho y el contenido de cafeína (Figura 20).
37
Figura 20: Diagrama de dispersión entre el contenido de cafeína y el ancho de la copa, las líneas verdes representan al intervalo de confianza del ancho de la copa.
La influencia de la altura de la planta y ancho de la copa en el contenido de cafeína, se puede explicar por las labores culturales de podas realizadas en algunos estratos, ya que puede actuar de forma directa en determinados procesos fisiológicos. Estudios realizados en Leucaena leucocephala en el efecto de la altura de poda, existe una mayor disponibilidad de tejido parenquimático reservarte y tejido meristemático activo, por lo que los carbohidratos solubles a través del floema son más efectivos. Estas condiciones permiten un mayor engrosamiento del tallo y emisión de rebrotes, incrementándose, por consecuencia, los rendimientos de biomasa (Bacab et al., 2012). Por otra parte, los análisis de suelo que se realizó en el estudio presentan un alto contenido de nitrógeno. Según Leal et al. (2007), manifiestan que es un nutriente que tiene efectos sobre el crecimiento de la planta, a su vez participa en la síntesis de aminoácidos esenciales y de otros compuestos vitales como son la clorofila, los ácidos nucleicos y las enzimas. Además, el Nitrógeno es esencial en muchos procesos metabólicos como en la utilización de los carbohidratos producto principal de la fotosíntesis. La actividad fotosintética de la planta produce carbohidratos que pueden acumularse para constituir ácidos orgánicos, azucares y celulosa. A su vez, parte de estos carbohidratos se combinan con el N absorbido y forma proteínas y aminoácidos (Perdomo et al., 2003).
38
5. CONCLUSIONES
Entre los estratos existe diferencias altamente significativas para el contenido de cafeína, los individuos que presentaron la media más alta de concentración de cafeína se encontraron en el estrato medio con 2,99 mg.100 mg-1 seguido el estrato alto con 2,64 mg.100 mg-1 y el estrato bajo con 2,22 mg.100 mg-1.
En el análisis de covarianza, el efecto de la sombra provocado por los árboles influye de
manera negativa sobre el contenido de cafeína donde presentó una reducción de -0,23 mg.100 mg-
1 donde a menor sombra mayor contenido de cafeína.
En la determinación del contenido de cafeína los valores estuvieron entre 0,98 a 5,64 mg.100 mg-1, es decir una diferencia de 4,66 mg.100 mg-1. El mayor número de individuos se situó en el rango de 2,53 a 3,31 mg.100 mg-1, con un promedio de 2,92 mg.100 mg-1, indicando que una sola planta presenta concentraciones de 5,64 mg.100 mg-1.
De las variables evaluadas, hubo diferencias altamente significativas para la altura de la planta, diámetro del tallo y ancho de la copa, esto probablemente podría deberse por la edad, material vegetal, origen de estacas, diferencia de fecha de siembra y el efecto de las labores culturales como la poda.
El coeficiente de correlación para las variables altura de la planta presento una correlación positiva de 0,47, de igual forma para la variable ancho de la copa con una correlación positiva de 0,49 y diámetro del tallo con una correlación positiva de 0,40 respectivamente el grado de asociación es débil con el contenido de cafeína.
El análisis de regresión múltiple determinó que el 41% de la variación del contenido de cafeína es explicado por la influencia de la altura y el ancho de la copa, la ecuación para predecir el contenido de cafeína es la siguiente: Cafeína (mg*100 mg-1) = -4,60 + 1,33.An - 0,18.An^2 + 7,08.A – 2,07.A^2 – 0,04.D – 0,02.S
39
6. RECOMENDACIONES
En este estudio se evidencia que existe un efecto de ambiente en el contenido de cafeína por lo tanto es necesario repetir el experimento en el mismo lugar, utilizando las plantas que fueron ya identificadas y etiquetadas, por lo menos dos ciclos en el año durante la época de mayor precipitación y menor precipitación. Además, es necesario realizar
experimentos en otras localidades en cultivos comerciales bajo condiciones ambientales (Clima y suelo), aspectos agronómicos (prácticas culturales y asociaciones).
Pruebas preliminares demostraron que no existe efecto con la temperatura del follaje en el contenido de cafeína, por lo tanto, es recomendable buscar un método económico y eficiente de secado de la hoja.
Los individuos que presentaron mayor contenido de cafeína y que son atípicos, deberían ser multiplicados asexualmente para ser evaluados y verificar los contenidos que se observaron en este estudio.
En base al estudio realizado, se recomienda generar un valor agregado en base al contenido de cafeína, para mejorar el precio por calidad y a su vez considerar el manejo del cultivo.
Diseñar un plan de manejo integral teniendo en consideración los aspectos agronómicos: densidad de siembra, necesidades nutricionales de la planta, métodos de poda y asociación de los cultivos para evitar efectos de sombra.
40
7. RESUMEN
Guayusa (Ilex guayusa) es un árbol perenne nativo de la Amazonía ecuatoriana, desconocida para el mundo moderno pero utilizada por culturas indígenas ancestrales debido a sus propiedades estimulantes y curativas por obtener uno de sus componentes como es la cafeína. Se encuentra de forma silvestre, ocasionalmente en forma de cultivo asociado y menos frecuente como monocultivo comercial. Información acerca del cultivo, manejo post cosecha sobre metabolitos bioactivos (MB) como el contenido de cafeína es limita en pocos individuos silvestres dispersos en diferentes ambientes. El objetivo de este estudio fue determinar el contenido de cafeína en individuos de una plantación comercial orgánica ubicada en el noroeste de Ecuador, donde se estratifico de acuerdo a la pendiente obteniendo; Estrato alto, estrato medio y estrato bajo, 24 individuos fueron seleccionados al azar dentro de cada estrato, dando una totalidad de 72 individuos muestreados. El follaje recolectado se procedió a secar, moler y analizar separadamente. La cuantificación de la cafeína se realizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Adicionalmente, se correlacionó el contenido de cafeína con variables agronómicas de altura de planta, ancho de copa de planta y Diámetro del tallo. Anterior al análisis estadístico, se verificó el supuesto de normalidad de los residuos para todas las variables en estudio, en el cual se aplicó la prueba de Shapiro-Wilks, donde el p-valor debe ser superior a 0,05, caso contrario, las variables no se ajustan a la curva normal. La variable contenido de cafeína no cumplió con este supuesto, por ello fue analizada por la prueba no paramétrica de Kruskal y Wallis que permitió realizar un análisis de varianza de una vía de clasificación. El análisis de variación no paramétrico detectó diferencias altamente significativas entre estratos, los individuos que presentaron la media más alta de concentración de cafeína se encontraron en el estrato medio con 2,99 mg.100 mg-1 seguido el estrato alto con 2,64 mg.100 mg-1 y el estrato bajo con 2,22 mg.100 mg-1 de cafeína, probablemente estas diferencias se deba a la sombra ocasionada por los árboles presentes en el cultivo, al realizar el análisis de covarianza el efecto sombra se encuentra influyendo de manera negativa sobre el contenido de cafeína donde presentó una reducción de -0,23 mg.100 mg-
1. La correlación de las variables altura de la sombra con 0,47, ancho de la copa con 0,49 y diámetro del tallo con 0,40 mostraron una correlación positiva débil con el contenido de cafeína. Para el análisis de regresión múltiple se realizó un remuestreo para generar una población aleatoria que se asemeja a la distribución original de cada una de las variables en estudio, este análisis permitió determinar que la variable altura de planta lineal, altura de planta cuadrática, ancho de la copa lineal, ancho de la copa cuadrática, diámetro del tallo y sombra son las variables que influyen en el contenido de cafeína, ya que el p-valor obtenido es menor a 0,05. El CpMallows es un indicador de la contribución de cada variable en el aporte del modelo, a mayor valor del CpMallows mayor es la contribución de esa variable en el modelo, según esto la variable que mayor influencia presenta en el modelo es la altura lineal (7757,31), seguida por la altura cuadrática (6941,49), luego por él diámetro del tallo (138,99), por el ancho lineal (118,19), por la sombra (35,08) y por último el ancho de la copa (26,24). El modelo de regresión obtenido es el siguiente:
Contenido de cafeína (mg*100 mg-1) = -4,60 + 1,33.An-0,18.An^2 + 7,08.A- 2,07.A^2 - 0,04.D - 0,02.S
Donde:
C= Contenido de cafeína (mg.100 mg-1) A= altura de planta (m) (variable regresora) An= ancho de copa (m) (variable regresora) D= Diámetro (cm) S= Sombra
41
Se determinó el intervalo de confianza para las variables altura de planta y ancho de la copa con una probabilidad del 95%, este fue de 1,49 m a 1,74 m para altura y para ancho de la copa fue de 1,44 m a 1,63 m, estos intervalos pueden afirmar que las podas a realizar no excedan estos rangos.
42
8. ABSTRAC
Guayusa (Ilex guayusa) is a perennial tree native to the Ecuadorian Amazon, unknown to the modern world but used by ancestral indigenous cultures due to its stimulating and healing properties to obtain one of its components such as caffeine. It is found wild, occasionally in the form of associated crop and less frequent as commercial monoculture. Information on the crop, post harvest management on bioactive metabolites (MB) as the caffeine content is limited in few wild individuals dispersed in different environments. The objective of this study was to determine the caffeine content in individuals from an organic commercial plantation located in the northwest of Ecuador, where it was stratified according to the slope obtaining; High stratum, medium stratum and low stratum, 24 individuals were randomly selected within each stratum, giving a total of 72 individuals sampled. The harvested foliage was dried, ground and analyzed separately. Caffeine quantification was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). In addition, the caffeine content was correlated with agronomic variables of plant height, plant glass width and stem diameter. Before the statistical analysis, the assumption of normality of the residuals for all the variables under study was verified, in which the Shapiro-Wilks test was applied, where the p-value should be greater than 0.05, otherwise the variables do not fit the normal curve. The variable caffeine content did not comply with this assumption, so it was analyzed by Kruskal and Wallis nonparametric test that allowed to perform a variance analysis of a classification pathway. The analysis of non-parametric variation detected highly significant differences between strata, individuals presenting the highest mean caffeine concentration were found in the middle stratum with 2.99 mg.100 mg-1 followed by the high stratum with 2.64 mg .100 mg-1 and the low stratum with 2.22 mg.100 mg-1 of caffeine, probably these differences are due to the shade caused by the trees present in the crop, when performing the covariance analysis the shadow effect is found significantly influencing the caffeine content where it presents a reduction of -0.23 mg.100 mg-1 where at lower shade higher caffeine content. The correlation of the variables height of the shade with 0.47, width of the glass with 0.49 and diameter of the stem with 0,40 showed a weak positive correlation with the content of caffeine. For the multiple regression analysis a resampling was performed to generate a random population that resembles the original distribution of each of the variables under study, this analysis allowed to determine that the variable plant height, quadratic plant height, width of the linear cup, the width of the quadratic cup, stem diameter and shadow are the variables that influence the caffeine content, since the p-value obtained is less than 0.05. The CpMallows is an indicator of the contribution of each variable in the contribution of the model, the higher the value of the CpMallows, the greater the contribution of that variable in the model, according to which the variable that has the greatest influence in the model is the linear height (7757 , 31), followed by the quadratic height (6941,49), followed by stem diameter (138,99), linear width (118,19), shadow (35,08) and finally width of the cup (26, 24). The regression model obtained is as follows:
Caffeine content: (mg*100 mg-1) = -4,60 + 1,33.An-0,18.An^2 + 7,08.A- 2,07.A^2 - 0,04.D - 0,02.S Where: C = Caffeine content (mg.100 mg-1) A = plant height (m) (regressive variable) An = cup width (m) (return variable) D = Diameter (cm) S = Shadow The confidence interval was determined for the variables plant height and stem width with a probability of 95%, this was 1.49 m to 1.74 m for height and for width was 1.44 m to 1.63 m, these intervals can affirm that the prunings to be realized do not exceed these ranges.
43
9. BIBLIOGRAFIA
Aldaz, J., & Humanante, A. (2011). Estudio sobre la Taxonomía y Estado de Conservación de la
Guayusa (Ilex guayusa Loess.) del Cantón Pastaza. Herbario Escuela Superior Politécnica del
Chimborazo. disponible en URL:
http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/767/1/Articulo_Guayusa.pdf. [consulta 10 de
noviembre del 2016].
Arias, R., & Gualli, A. (2013). Estudio Comparativo del Té de la especie (Ilex guayusa) procedente
dela Región Amazónica y el producto comercial de la empresa “Aromas del Tungurahua. Trabajo
de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingeniera de Alimentos.
Guayaquil. disponible en URL: https://www.dspace.espol.edu.ec/retrieve/89621/D-79842.pdf.
[consulta 04 de abril del 2017].
Arias, E. (2016). Aporte del aprovechamiento de guayusa (Ilex guayusa Loes) al mantenimiento del
bosque y bienestar de la comunidad Kichwa Wamaní, Provincia del Napo, Ecuador. Trabajo de
titulación presentado como requisito parcial para optar el grado de Magister Scientiae en Manejo
y Conservación de Bosques Tropicales y Biodiversidad. Turrialba. disponible en URL:
http://repositorio.bibliotecaorton.catie.ac.cr/bitstream/handle/11554/8541/Aporte_del_aprovec
hamiento_de_guayusa.pdf?sequence=1&isAllowed=y. [consulta 19 de Julio del 2017].
Ashihara, H., Sano, H., & Crozier, A. (2008). Caffeine and related purine alkaloids: Biosynthesis,
catabolism, function and genetic engineering. ELSEVIR. disponible en URL:
http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.465.8258&rep=rep1&type=pdf.
[consulta 04 de abril del 2017].
Bacab, H., Solorio, F., & Solorio, S. (2012). Efecto de la altura de poda en Leucaena leucocephala y
su influencia en el rebrote y rendimiento de Panicum maximun. Campus de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias. disponible en URL: http://ww.ucol.mx/revaia/portal/pdf/2012/enero/4.pdf.
[consulta 23 de octubre del 2017].
Bastos, D., Fornari, A., Queiroz, Y., & Torres, E. (2006). Compuestos bioactivos aparean infusiones
de contenido relacionado con la húmedad de la yerba mate (Ilex Paraguariensis hojas). Scielo. Vol.
49: pp (3). disponible en URL: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-
89132006000400007&script=sci_arttext&tlng=pt. [consulta 30 de agosto del 2017].
Bieto, J., Fleck, I., Aranda X., & Casanovas, N. (2013). Fotosintesis, factores ambientales y cambio
climático, Fisiología Vegetal. disponible en URL:
http://biblio3.url.edu.gt/Publi/Libros/2013/FisioVegetal/13.pdf. [consulta 08 de noviembre del
2017].
Calle, S. (2011). Determinación analítica de la cafeína en diferentes productos comerciales. Trabajo
de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingeniería Técnica
Industrial especialidad Química. Barcelona. disponible en URL:
https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099.1/11148/Mem%C3%B2ria.pdf. [consulta 04
de abril del 2017].
44
Camacho, C., & Martínez, D. (2015). Determinación de parámetros Físico-Químicos en la
Deshidratación de las hojas de Ilex guayusa para la formulación de una bebida Energética. Trabajo
de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingenieras en alimentos.
Guayaquil: Esquela Superior Politécnica del Litoral. disponible en URL:
https://www.dspace.espol.edu.ec/retrieve/97247/D-CD88386.pdf. [consulta 06 de abril del 2017].
Campos, J. (2003). Disponibilidad y flujos de nutrimentos en una toposecuencia con bosque
tropical seco en México. Agrociencia. Vol. 37, pp. 212-218. disponible en URL:
http://www.redalyc.org/pdf/302/30237212.pdf. [consulta 30 de agosto del 2017].
Carpintero, N., & Salazar, M. (2014). Evaluación del efecto anticelulítico de una formulación
cosmética a base de extracto alcohólico foliar de Guayusa, Ilex guayua Loes (Aquifoliaceae).
Trabajo de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Magister en
Ciencias y Tecnologías Cosméticas. Quito. Universidad Politécnica Salesiana Sede Quito.
disponible en URL: http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/7358/1/QT06124.pdf.
[consulta 04 de abril del 2017].
Crespo, J. (2013). La guayusa trayectoria y sentido. Programa Manejo Forestal Sostenible (MFS).
disponible en URL: http://repiica.iica.int/docs/B3414e/B3414e.pdf. [consulta 10 de marzo del
2017].
Collahuazo, P. (2012). Plan de manejo de la especie guayusa (Ilex guayusa L.). Fundación
Chankuap. disponible en URL: http://chankuap.org/wp-content/uploads/2014/03/4.-Plan-de-
Manejo-Guayusa-Wapu.pdf. [consulta 04 de abril del 2017].
Dueñas, F., Jarrett, C., Cummmins, I., & Hines, E. (2016). Amazonian Guayusa (Ilex guayusa Loes.),
A Historical and Ethnobotanical Overview. Fundación Runa. disponible en URL:
https://www.researchgate.net/profile/Juan_Duenas3/publication/295085067_Amazonian_Guayu
sa_Ilex_guayusa_Loes_A_Historical_and_Ethnobotanical_Overview/links/56d83e9608aee1aa5f7b
5da8.pdf. [consulta 04 de abril del 2017].
García, L., & Neira, M. (2014). Propuesta para producir y distribuir bebida energizante natural a
base de guayusa en Guayaquil. Trabajo de titulación presentado como requisito parcial para optar
el título de Ingeniera en Comercio y Finanzas Internacionales Bilingüe. Guayaquil: Universidad
Católica de Santiago de Guayaquil. disponible en URL:
http://repositorio.ucsg.edu.ec/bitstream/3317/2770/1/T-UCSG-PRE-ESP-CFI-107.pdf. [consulta 04
de abril del 2017].
García, A., & Urria, E. (2009). Metabolismo secundario de plantas. Reduca. Vol. 2, pp. 139 – 142.
disponible en URL: http://eprints.ucm.es/9603/1/Metabolismo_secundario_de_plantas.pdf.
[consulta 30 de septiembre del 2017].
Gordón, R., & Camargo, I. (2015). Selección de estadísticos para la estimación de la precisión
experimental en ensayos de maíz. Agronomía Mesoamericana es desarrollada en la Universidad
de Costa Rica. disponible en URL: http://www.scielo.sa.cr/pdf/am/v26n1/a06v26n1.pdf. [consulta
30 de agosto del 2017].
45
Hartwing, V. (2015). Obtención de extractos secos de yerba mate con alto contenido de polifenoles y alta capacidad antioxidante. Trabajo de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial. Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. disponible en URL: http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5817_Hartwig. [consulta 30 de agosto de 2017]. Hernández, C. (2014). Elaboración y caracterización de microcapsulas mediante gelificación iónica
externa, de la fracción alcaloidea de ilex guayua con alginato sódico, y su utilización en la
formulación de una forma de dosificación sólida. Trabajo de titulación presentado como requisito
parcial para optar el título de Bioquímico Farmacéutico. Riobamba. Escuela Superior Politécnica
de Chimborazo. disponible en URL:
http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/3697/1/56T00470%20UDCTFC.pdf. [consulta
04 de abril del 2017].
Leal, L., Salamanca, A., & Khalajabadi, S., (2007). Pérdidas de nitrógeno por volatilización en cafetales en etapa productiva. Trabajo de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingeniero Agrónomo. Colombia. Universidad del Tolima. disponible en: URL: http://www.cenicafe.org/es/publications/arc058(03)216-226.pdf. [consulta 10 de noviembre del 2017]. Lewis, W., Kennelly, G., Bass, H., Wedner, H., Elvin, L., & Fast, D., (1991). Ritualistic use of the holly Ilex guayusa by Amazonian Jivaro Indians. Journal of Ethnopharmacology 33:25-30. disponible en URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0378874191901568 [consulta 30 de agosto de 2017]
Martínez, J. (2015). Manejo Sostenible de Guayusa para Agricultores Familiares. Fundación Runa.
disponible en URL: http://fundacionruna.org/wp-content/uploads/2015/05/Manual-Buenas-
Practicas-de-Guayusa.pdf. [consulta 04 de abril del 2017].
Melo, V. (2014). Composición y Análisis Químico de la Especie Ilex guayusa Loes. Trabajo de
titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingeniero Químico. Quito:
Universidad San Francisco de Quito. disponible en URL:
http://repositorio.usfq.edu.ec/bitstream/23000/3269/1/000110421.pdf. [consulta 10 de marzo
del 2017].
Molestina, R. (2014). Factibilidad para la creación de una empresa comercializadora de la bebida energizante a base de Guayusa “Runa” en el mercado de Guayaquil. Trabajo de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingeniero en comercio y finanzas internaciones bilingüe. Guayaquil: Universidad Católica de Santiago de Guayaquil. disponible en URL: http://repositorio.ucsg.edu.ec/bitstream/3317/2227/1/T-UCSG-PRE-ESP-CFI-43.pdf. [consulta 04 de abril del 2017]. Montagnini, F., Somarriba, E., Murgueitio, E., Fassola, H., & Eibl, B. (2015). Sistemas Agroforestales. Funciones Productivas, Socioeconómicas y Ambientales. Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología y la Innovación Francisco José de Caldas. disponible en URL: https://www.researchgate.net/profile/Elias_De_Melo_Virginio_Filho/publication/273003069_LA_PRODUCTIVIDAD_UTIL_LA_MATERIA_ORGANICA_Y_EL_SUELO_EN_LOS_PRIMEROS_10_ANOS_DE_EDAD_EN_SISTEMAS_DE_PRODUCCION_DE_CAFE_A_PLENO_SOL_Y_BAJO_VARIOS_TIPOS_DE_S
46
OMBRA_Y_NIVELES_DE_INSUMOS_ORGANICOS_Y_CONVEN/links/54f4f5d90cf2eed5d735b266.pdf. [consulta 06 de abril del 2017].
Mosquera, J. (2015). Estudio Preliminar de Diversidad Genética de Ilex guayusa en la Amazonía
ecuatoriana mediante marcadores moleculares ISSR. Trabajo de titulación presentado como
requisito parcial para optar el título de Ingeniería en Procesos Biotecnológicos. Quito: Universidad
San Francisco de Quito. disponible en URL:
http://repositorio.usfq.edu.ec/bitstream/23000/4555/1/113915.pdf. [consulta 10 de noviembre
del 2016].
Osada, J., Rojas, M., Rosales, C., & Vega, D. (2008). Consumo de cafeína en estudiantes de medicina y su coexistencia con sintomatología ansiosa y depresiva. Medica Herediana. Vol. 19, pp. 1,2. disponible en URL: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1018-130X2008000300004&script=sci_arttext. [consulta 06 de abril del 2017].
Pacha, A. (2012). Comprobación del efecto adelgazante de la pintura de guayusa (Ilex guayusa) en
ratones (Mus musculus) con sobrepeso inducido. Trabajo de titulación presentado como requisito
parcial para optar el título de Bioquímico farmacéutico. Riobamba. Escuela Superior Politécnica de
Chimborazo. disponible en URL:
http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/2596/1/56T00373.pdf. [consulta 04 de abril
del 2017].
Pacha. (2017). Fundación Pacha. disponible en URL: http://www.pacha.ec/index.php/about-us. .
[consulta 30 de agosto del 2017].
Perdomo, C., & Barbazan, M. (2003). Área de suelos y aguas Cátedra de fertilidad. Facultad de
agronomía. Universidad de la república. Montevideo – Uruguay. disponible en URL:
http://www.fagro.edu.uy/fertilidad/publica/Tomo%20N.pdf. [consulta 10 de noviembre del
2017].
Puangpraphant, S., Berhow, M. & Mejia, E. (2010). Mate (Ilex paraguariensis St. Hilaire) saponins induce caspase-3-dependent apoptosis in human colon cancer cells in vitro. Elsevier. disponible en URL: https://naldc.nal.usda.gov/download/49048/PDF. [consulta 30 de septiembre del 2017].
Radice, M. & Vidari, G. (2007). Caracterización fitoquímica de la especie Ilex guayusa Loes. y
elaboración de un prototipo de fitofármaco de interés comercial. La Granja. 6: pp (3-4). disponible
en URL: http://www.redalyc.org/pdf/4760/476047390002.pdf. [consulta 06 de abril del 2017].
Ríos, L. (2009). Efecto de la Radiación Ultravioleta-B en plantas. IDIESA. Vol 27: pp. 59-76. disponible en URL: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-34292009000300009. [consulta 30 de agosto del 2017]. Runa. (2014). Guayusa amazónica. disponible en URL: http://runa.org/guayusa/#traditional-uses.
[consulta 06 de abril del 2017].
Sequeda, L., Modesti, G., Celis, C., Gamboa, F., & Gutierrez, S. (2016). Ilex guayusa Loess
(Aquifoliaceae) Amazon and Andean native plant. Pharmacologyonline. disponible en URL:
http://pharmacologyonline.silae.it/files/archives/2016/vol3/PhOL_2016_3_A028_50_Sequeda.pd
f. [consulta 04 de abril del 2017].
47
Torres, G. (2013). El aprovechamiento de la guayusa, Manual de buenas practicas de recolección
para la cosecha de guayusa. Fundación Chankuap. disponible en URL: http://chankuap.org/wp-
content/uploads/2014/03/Manual-de-buenas-practicas-de-la-Guayusa.pdf. [consulta 10 de
noviembre del 2016].
Thammana, M. (2016). A Review on High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Research &
Reviews. Vol.5: pp. 24-26. disponible en URL: https://www.rroij.com/open-access/a-review-on-
high-performance-liquid-chromatography-hplc-.pdf. [consulta 30 de septiembre del 2017]
Yugcha, T., Sangucho, R., Hidalgo, J., & Woolfson J. (2008). Metodología de valoración de tierras rurales. Programa de Regularización y Administración de Tierras Rurales. disponible en URL: http://app.sni.gob.ec/sni-link/sni/Portal%20SNI%202014/GEOGRAFICA/Conage/Documentos/Metodologias/Metodologia_valoracion_tierras_rp.pdf. [consulta 06 de abril del 2017]. Zuñiga, W. (2015). Elaboración de Té de guayusa (Ilex guayusa Loes) con la adición de ácido cítrico y edulcorante bajo en calorías. Trabajo de titulación presentado como requisito parcial para optar el título de Ingeniero de Alimentos. Ambato. Universidad Técnica de Ambato. disponible en URL: http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/15873/1/AL%20584.pdf. [consulta 30 de septiembre del 2017].
48
10. ANEXOS
Anexo 1: Datos de altura, diámetro a la altura del pecho y ancho de copa, de cada planta muestreada con sus respectivas coordenadas UTM.
Plantas Altura
(m) Diámetro
(cm) Ancho
(m) Coordenadas UTM
1B 1,48 1,27 1,40 188773 9909147
2B 1,45 1,75 1,53 188776 9909152
3B 1,83 1,27 0,95 188766 9909139
4B 1,30 1,75 1,80 188774 9909151
5B 0,90 1,11 1,20 188791 9909182
6B 1,83 1,59 1,30 188778 9909150
7B 1,10 2,39 2,00 188783 9909157
8B 0,67 1,59 0,98 188789 9909175
9B 1,20 1,43 1,00 188780 9909163
10B 1 1,27 1,39 188781 9909163
11B 1,65 1,59 1,40 188777 9909144
12B 1,60 2,55 1,40 188769 9909130
13B 1,40 1,43 1,20 188773 9909133
14B 1,38 1,43 1,30 188769 9909139
15B 1,65 1,43 1,45 188764 9909130
16B 1,13 1,75 1,40 188762 9909127
17B 1,44 1,75 1,50 188767 9909121
18B 1,25 1,27 0,96 188769 9909127
19B 1,33 1,11 0,80 188772 9909136
20B 1,09 1,75 1,75 188778 9909149
21B 1 1,43 1,30 188784 9909167
22B 1,30 1,11 1,30 188765 9909136
23B 1,08 1,66 2,00 188776 9909154
24B 0,80 0,95 0,97 188793 9909180
1M 2,10 1,59 1,50 188775 9909190
2M 1,90 1,91 1,80 188771 9909174
3M 1,20 1,91 0,80 188763 9909170
4M 1,80 1,43 1,65 188763 9909184
5M 2,10 2,55 2,00 188754 9909183
6M 1,90 1,59 2,10 188744 9909180
7M 2,40 2,07 1,80 188777 9909207
8M 2,20 1,59 1,50 188778 9909214
9M 1,68 2,39 1,45 188748 9909152
10M 1,30 2,39 1,45 188786 9909199
11M 2,10 1,91 1,80 188747 9909153
49
Anexo 1: Datos de altura, diámetro a la altura del pecho y ancho de copa, de cada planta muestreada con sus respectivas coordenadas UTM.
12M 1,50 2,86 2,00 188766 9909166
13M 1,75 2,07 2,00 188745 9909158
14M 1,85 1,43 1,20 188745 9909161
15M 2 2,23 2,00 188735 9909162
16M 1,40 1,91 1,80 188777 9909194
17M 2 1,91 2,00 188771 9909211
18M 2,20 2,23 2,00 188757 9909205
19M 1,80 2,39 1,60 188782 9909211
20M 1,50 1,59 1,70 188769 9909174
21M 1,90 1,59 1,35 188761 9909193
22M 1,95 2,07 1,60 188740 9909175
23M 2,40 3,18 2,30 188755 9909194
24M 1,30 2,23 1,80 188774 9909192
1A 2,15 2,55 1,90 188741 9909192
2A 1,80 2,23 1,60 188730 9909235
3A 2,10 2,23 1,70 188737 9909234
4A 1,70 1,91 1,50 188740 9909241
5A 2,30 2,55 1,80 188752 9909219
6A 1,78 2,55 2,20 188731 9909247
7A 2,10 3,18 1,90 188723 9909257
8A 2,15 2,86 2,20 188728 9909251
9A 1,90 2,23 1,60 188746 9909228
10A 2,10 1,91 1,40 188710 9909173
11A 1,65 1,59 1,50 188728 9909226
12A 2,10 2,55 1,80 188743 9909234
13A 1,65 1,59 2,00 188733 9909201
14A 1,60 2,55 1,60 188729 9909267
15A 1,83 1,91 1,70 188735 9909207
16A 1,55 1,43 1,40 188745 9909213
17A 2,30 2,55 1,90 188752 9909214
18A 2,20 2,86 1,75 188751 9909239
19A 2,15 2,23 1,40 188759 9909215
20A 1,60 1,59 1,50 188724 9909228
21A 1,60 1,59 1,90 188747 9909224
22A 2,20 2,55 1,70 188713 9909185
23A 2,00 2,23 1,75 188726 9909185
24A 2,10 2,23 1,60 188743 9909241
50
Anexo 2: Área de la muestra, contenido de cafeína y humedad de cada muestra.
Plantas Área de la muestra
Cafeína mg 100mg -1
Humedad %
1B 2393711,000 3,03 5
2B 2882478,250 3,61 5
3B 3027194,500 3,86 5
4B 2797226,000 3,50 5
5B 925563,375 1,16 5
6B 1200976,250 1,49 5
7B 1768112,750 2,21 5
8B 1921963,625 2,38 5
9B 922067,188 1,18 5
10B 967467,688 1,22 5
11B 1833164,375 2,29 5
12B 1350841,500 1,67 5
13B 1784371,875 2,26 5
14B 1950642,250 2,47 5
15B 1881829,375 2,33 5
16B 1395631,875 1,73 5
17B 1874384,375 2,32 5
18B 990602,688 1,26 5
19B 2480458,500 3,07 5
20B 1179062,375 1,46 5
21B 1065919,625 1,35 5
22B 2584434,750 3,30 5
23B 2525960,500 3,19 5
24B 767187,750 0,98 5
1M 2816394,500 3,59 5
2M 2054043,000 2,62 5
3M 2247991,250 2,92 5
4M 2437556,750 3,14 5
5M 2374908,500 3,03 5
6M 1682452,250 2,15 5
7M 2234015,000 2,88 5
8M 2296338,500 2,93 5
9M 3368496,000 4,26 5
10M 2556435,250 3,33 5
11M 2081234,875 2,68 5
51
Anexo 2: Área de la muestra, contenido de cafeína y humedad de cada muestra.
12M 3390899,750 4,37 5
13M 1874303,625 2,41 5
14M 2480467,500 3,16 5
15M 1740506,625 2,24 5
16M 2363470,000 2,99 5
17M 1969873,875 2,56 5
18M 1209743,250 1,56 5
19M 2186432,000 2,82 5
20M 2403476,500 3,10 5
21M 2280110,250 2,91 5
22M 2988881,500 3,85 5
23M 2032026,375 2,59 5
24M 2920130,750 3,72 5
1A 1987379,500 2,51 5
2A 1927190,500 2,43 5
3A 2345606,500 2,96 5
4A 1792626,375 2,29 5
5A 1988420,750 2,51 5
6A 3339856,750 4,26 5
7A 1617663,250 2,04 5
8A 1930047,500 2,44 5
9A 1309862,750 1,69 5
10A 1838849,750 2,37 5
11A 1645353,375 2,14 5
12A 1920610,875 2,45 5
13A 2062489,125 2,63 5
14A 1756298,375 2,22 5
15A 1961766,625 2,50 5
16A 2411803,000 3,23 5
17A 2104375,250 2,82 5
18A 2135335,000 2,89 5
19A 2096474,250 2,89 5
20A 1602963,750 2,17 5
21A 4092351,500 5,64 5
22A 1768953,750 2,37 5
23A 940193,250 1,30 5
24A 1982461,625 2,68 5
52
Anexo 3: Matriz de correlación múltiple de Pearson para determinar la relación existente entre las variables.
Variables Contenido de cafeína
mg.100 mg-1
Altura de la planta
(m)
Ancho de la copa (m)
Diámetro del tallo (cm)
Contenido de cafeína
Altura de la planta (m)
0,47
Ancho de la copa (m)
0,49 0,77
Diámetro del tallo (cm)
0,40 0,82 0,81
53
Anexo 4: Cromatograma del individuo con mayor contenido de cafeína (21A).
54
Anexo 5: Cromatograma del individuo con mayor contenido de cafeína (24B).
55
Anexo 6: Fotografías del campo de investigación.
Planta de guayusa de la pendiente baja etiqueta azul
Planta de guayusa de la pendiente media etiqueta rojo
Planta de guayusa de la pendiente balta etiqueta amarilla
Muestra secas Muestra molida Muestras procesadas