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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

TESIS DOCTORAL

Prevención de la anafilaxia con antígenos del anisakis simplex en un modelo animal

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA

PRESENTADA POR

Guadalupe Marco Martín

DIRECTORES

María Luisa Baeza Ochoa de Ocáriz José Manuel Zubeldia Ortuño Pedro Antonio Reche Gallardo

Madrid, 2017

© Guadalupe Marco Martín, 2016

FACULTAD DE MEDICINA

DOCTORADO EN INMUNOLOGÍA

TESIS DOCTORAL

PREVENCIÓN DE LA ANAFILAXIA CON ANTÍGENOS DEL ANISAKIS SIMPLEX EN UN MODELO ANIMAL

Presentada por:

Guadalupe Marco Martín

Co-‐dirigida por:

María Luisa Baeza Ochoa de Ocáriz

Jose Manuel Zubeldia Ortuño

Pedro Antonio Reche Gallardo

Madrid, 2015

0 1. Maria luisa Baeza Ochoa de Ocáriz, O. José Manuel Zubeldla Ortuño y D. Pedro

Antonio Reche Gallardo

CERTfflCA~: ...

Que el presente t rabajo de investigación t itulado "Prevención de la anfilaxia con

antfgenos del Anlsakls slmplex en un modelo anlmal", ha sido rea lizado bajo su

dirección por la Licenciada en Medicina O! Guadalupe Marco Martín, y reúne todos los

requisitos científicos, metodológicos, formales y de originalidad suficientes para ser

defendido como Tesis OoctoraJ ante el Tribunal que legalmente proceda.

Y para que asi conste a todos los efectos, se extiende la presente certificación en Madrid,

de ___ de 2015.

--y~-~~ /

O!. Maria Luisa Baeza Ochoa de Ocáriz 0. José Manuel Zubeldia Ortuño

D. Pedro Antonio Reche Gallardo

A mis padres

Agradecimientos

Este trabajo ha sido desarrollado en la Unidad de Medicina Experimental delHospital Gregorio Marañón. Quiero agradecer a todo su personal, especialmente alequipo de veterinarios, el trabajo realizado ya que sin vuestra ayuda este trabajono habría podido desarrollarse. No quisiera olvidarme de todos los investigadores,compañeros, que trabajan en esta unidad a los que he recurrido en más de unaocasión y, en muchas de ellas, al borde del colapso. Gracias a todos.

Además, me gustaría agradecer con todo mi cariño a mis directores. En primerlugar, a la Dra. María Luisa Baeza, por haberme iniciado y sumergido de lleno eneste mundo de la investigación. Tu capacidad didáctica, tu disponibilidad, buenavoluntad y entusiasmo por este campo son algunas de las múltiples cualidades quehe tenido la suerte de descubrir en estos años. Gracias por enseñarme tanto.También quisiera agradecer al Dr. José Zubeldia no sólo la dirección de esta tesis,sino también su esfuerzo y el apoyo recibido en estos años. Igualmente, al Dr.Pedro Reche por la inestimable ayuda en el mundo de la inmunología facilitándome su comprensión.

También agradecer al Servicio de Alergia del Hospital Gregorio Marañón, dondemuchos de vosotros habéis participado de forma directa en alguna parte de estatesis y otros nos habéis acompañado en este largo camino. En especial a Alberto,por haberme ayudado en esta etapa final. También agradecer al Servicio de Alergiadel Hospital Clínico, grandes sufridoras de mis últimas etapas de esta tesisdoctoral.

No me puedo olvidar de Alejandro la Rotta, mi R mayor con mayúsculas. Medescubriste el mundo de la alergia y cómo pasar el día entre “manis”, ratones yguardias (y alguna que otra cerveza posterior) podía ser más divertido de lo quesuena. Gracias Alejo por tantos años de enseñanzas y por tu amistad incondicional.

Por supuesto, a mi gran familia. A TODOS, que habéis estado ahí siempre que os henecesitado. Especialmente, a mis padres, grandes “culpables” de todo este proceso,por enseñarme a esforzarme siempre al máximo. Con especial cariño a la parteinglesa, María y sus “angels”, por el gran apoyo ofrecido y la ayuda con el inglés.

A Santi, no solo por tu ayuda con la informática sino por estar siempre a mi lado,acompañándome, alentándome a seguir adelante. Nadie mejor que tú sabe lo queha supuesto esta tesis para mí (nosotros). Gracias por todo.

Y a todos los que alguna vez habéis preguntado “¿Qué tal van los ratones?”.Amigos, compañeros y, especialmente a “J”, lo feliz que debes estar, allí dondeestés, de ver el final de este proyecto.

GRACIAS.

Prevención de la anafilaxia con antígenos del Anisakis simplex en un modelo animal

Índice

ÍNDICE DE FIGURAS............................................................................................................................ 8

ÍNDICE DE TABLAS............................................................................................................................11

ABREVIATURAS .................................................................................................................................12

RESUMEN .............................................................................................................................................14

SUMMARY............................................................................................................................................21

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................27

1. ANAFILAXIA......................................................................................................................................................27

1.1. Modelos murinos de anafilaxia.........................................................................................................28

2. INFECCIÓN POR PARÁSITOS Y ALERGIA .......................................................................................................36

2.1. Clasificación parásitos .........................................................................................................................36

2.2. El sistema inmune y la infección por parásitos .........................................................................37

2.3. Anisakis simplex ......................................................................................................................................41

2.4. Teoría de la higiene y el equilibrio Th1/Th2..............................................................................44

2.5. Equilibrio Th1/Th17/Th2/Treg ......................................................................................................46

2.6. Infección por parásitos y enfermedades alérgicas...................................................................48

HIPÓTESIS ...........................................................................................................................................53

OBJETIVOS...........................................................................................................................................54

1. OBJETIVOS PRIMARIOS ...................................................................................................................................54

2. OBJETIVOS SECUNDARIOS ..............................................................................................................................54

MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................................................55

1. DESARROLLO DEL MODELO DE ANAFILAXIA Y SELECCIÓN DE LA CEPA.............................................55

1.1. Ratones y extractos................................................................................................................................55

1.2. Protocolo de sensibilización ..............................................................................................................56

1.3. Demostración de la sensibilización a cacahuete ......................................................................57

1.4. Valoración de la respuesta anafiláctica .......................................................................................59

1.5. Determinación del perfil de citocinas ............................................................................................61

2. SELECCIÓN DEL PROTOCOLO DE ANAFILAXIA ........................................................................................62

Índice 5


2.1. Protocolo de sensibilización y protocolo de provocación .....................................................62


3. PREVENCIÓN DE LA ANAFILAXIA CON LOS EXTRACTOS DE ANISAKIS SIMPLEX.....................................64

3.1. Extractos de Anisakis simplex ...........................................................................................................64

3.2. Pretratamiento con los extractos de Anisakis simplex...........................................................65

3.3. Demostración de la sensibilización a cacahuete ......................................................................66


3.5. Determinación del perfil de citocinas ............................................................................................67

4. PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS.................................................................................................................67

RESULTADOS ......................................................................................................................................69

1. DESARROLLO DEL MODELO DE ANAFILAXIA Y SELECCIÓN DE LA CEPA.............................................69

1.1. Sensibilización al cacahuete..............................................................................................................69

1.2. Respuesta anafiláctica .........................................................................................................................73

1.3. Perfil de citocinas ...................................................................................................................................76

2. SELECCIÓN DEL PROTOCOLO DE ANAFILAXIA ........................................................................................78

2.1. Selección de dosis....................................................................................................................................79

3. PREVENCIÓN DE LA ANAFILAXIA CON LOS EXTRACTOS DE ANISAKIS SIMPLEX.....................................82

3.1. Los extractos de Anisakis simplex inhiben parcialmente la sensibilización al

cacahuete. ..........................................................................................................................................................83

3.2. Los extractos de Anisakis simplex reducen la reacción anafiláctica ...............................86

3.3. Los extractos de Anisakis simplex modifican el perfil de citocinas...................................91

DISCUSIÓN...........................................................................................................................................94

1. NECESIDAD DEL DESARROLLO DEL MODELO DE ANAFILAXIA.............................................................94

2. DESARROLLO DEL MODELO DE ANAFILAXIA SISTÉMICA ......................................................................95

2.1. Consideraciones sobre la sensibilización en este modelo .....................................................95

2.2. Comparación de las cepas C3H/HeOuJ y BALB/c.....................................................................99

3. SELECCIÓN DEL PROTOCOLO DE ANAFILAXIA. ELECCIÓN DE LA DOSIS DE ANTÍGENO..................... 102

4. TRATAMIENTOS PARA LA ANAFILAXIA ESTUDIADOS EN MODELOS MURINOS ................................... 103

5. INMUNOMODULACIÓN DE LA RESPUESTA ALÉRGICA INDUCIDA POR PARÁSITOS ............................. 104

Índice 6


5.1. Infección por parásitos vivos en los modelos murinos de anafilaxia ............................104

5.2. Tratamiento con antígenos de excreción/secreción en los modelos murinos de

alergia...............................................................................................................................................................107

5.3. Anisakis simplex y modelos murinos de alergia.....................................................................110

5.4. Extracto de Excreción/Secreción como tratamiento en nuestro modelo murino de

anafilaxia.........................................................................................................................................................111

REFERENCIAS .................................................................................................................................. 114

Índice 7


Índice de figuras

Figura 1. Vías clásica y alternativa de anafilaxia en el ratón. Modificado de Finkelman (12). Los receptores que activan los mastocitos y macrófagos semuestran en verde mientras que aquellos que inactivan estas células semuestran en rojo. ....................................................................................................................... 30

Figura 2. Respuesta inmune en las infecciones parasitarias producidas en elhombre y sus evolución durante el tiempo de la infección. Modificado deNutman (60). MAC: Macrófagos; Monos: Monocitos; DC: células dendríticas;Eos: eosinófilos; ILC: células linfoides innatas, NKs: células NK; Baso/MC:Basófilos/mastocitos; TCM: linfocitos T memoria; Teff: linfocitos T efectores............................................................................................................................................................. 40

Figura 3. Clasificación de los nematodos. El Anisakis simplex pertenece a la familia de los nematodos, clase rhabditae, orden ascaridida. Modificado de (64). ...... 41

Figura 4. Ciclo vital del Anisakis simplex. Extraído de Baeza (67). ................................. 42

Figura 5. Equilibrio Th1/Th17/Th2/Treg. A la izquierda, se muestra el equilibrioentre estos cuatro tipos celulares. A la derecha y arriba, se muestra como eldesarrollo de las células inflamatorias Th2 junto con las células Th17 inducenla enfermedad alérgica, mientras que la expansión de células Th2 junto con lasTreg induce el desarrollo de una repuesta Th2 asintomática.. Modificado deOrihara y cols. (98).................................................................................................................... 48

Figura 6. Protocolo de sensibilización para el desarrollo del modelo de anafilaxia yelección de la cepa más adecuada....................................................................................... 57

Figura 7. Protocolo de provocación para el desarrollo del modelo de anafilaxia yelección de la cepa más adecuada....................................................................................... 59

Figura 8. Protocolo de sensibilización para la selección de la dosis antigénicaóptima para el modelo. ............................................................................................................ 63

Figura 9. Protocolo de provocación para la selección de la dosis antigénica óptimapara el modelo............................................................................................................................. 63

Figura 10. Larvas vivas de A. simplex extraídas de Merluccius merluccius compradoen la pescadería. Las larvas fueron cultivadas en una solución de PBS,gentamicina, vancomicina y glucosa.................................................................................. 65

Figura 11. Protocolo de sensibilización para la prevención de la anafilaxia con losextractos de Anisakis simplex. ............................................................................................... 66

Figura 12. Protocolo de provocación para la prevención de la anafilaxia con losextractos de Anisakis simplex. ............................................................................................... 67

Figura 13. Niveles séricos de IgG1 específica a cacahuete en los grupossensibilizados (C3H-‐AC y BALB-‐AC) y en los grupos control (C3H-‐NAC y BALB-‐

Índice de figuras 8


NAC) durante 6 semanas. Los resultados se expresan como la media ± ESM (*p


(**p


Índice de tablas

Tabla I. Clasificación de los parásitos según sus características biológicas,

morfológicas y fisiológicas. Extraído de Murray y cols. (54). ................................. 36

Tabla II. Características de la respuesta Th2 alérgica frente a la respuesta Th2

inducida en las infecciones por helmintos. Modificada de Fallon y cols (59).. 49

Tabla III. Modelos murinos sobre asma bronquial y prevención del desarrollo de

alergia. Modificado de Evans y cols (100). ...................................................................... 50

Tabla IV. Modelos murinos sobre asma bronquial y tratamiento de la alergia

establecida. Modificado de Evans y cols (100).............................................................. 51

Tabla V. Modelos murinos sobre la anafilaxia sistémica y la prevención del

desarrollo de alergia. Modificado de Evans y cols (100). ......................................... 52

Tabla VI. Descripción de la puntuación de síntomas anafilácticos (score clínico)

descrito por Xu y cols. (131). ................................................................................................ 60

Tabla VII. Grupos de ratones englobados en el primer estudio....................................... 69

Tabla VIII. Porcentaje de descenso de la temperatura corporal tras la provocación

con cacahuete en los ratones sensibilizados (AC) y los no sensibilizados (NAC).

............................................................................................................................................................ 74

Tabla IX. Niveles de citocinas en los grupos sensibilizados de las cepas C3H/HeOuJ

y BALB/c. ....................................................................................................................................... 77

Tabla X. Grupos de ratones englobados en el segundo estudio....................................... 79

Tabla XI. Porcentaje de descenso de la temperatura corporal tras la provocación

con cacahuete en los ratones que recibieron dosis de cacahuete de 250 µg, 100 µg y 50 µg. ..................................................................................................................................... 81

Tabla XII. Grupos de ratones englobados en el tercer estudio......................................... 83

Tabla XIII. Resultado del algoritmo de cluster de las K-‐medias aplicado a la

puntuación de síntomas. Se observa como los individuos son claramente

mejor clasificados al comparar el grupo AC frente a AC+E/S................................. 88

Tabla XIV. Porcentaje de descenso de la temperatura corporal tras la provocación con cacahuete en los ratones sensibilizados sin tratamiento y los que

recibieron tratamiento con extracto somático de A. simplex (AC+AK), extracto de excreción/secreción de A. simplex (AC+E/S)........................................................... 89

Índice de tablas 11


Abreviaturas

MAA: Macrófagos activados alternativamente.

aIL-‐10R: anticuerpo neutralizador del receptor de la IL-‐10.

Al(OH)3: Hidróxido de aluminio.

A. simplex: Anisakis simplex.

Ara h2: Arachis hypogaea 2.

As-‐MIF: factor inhibidor de la migración de macrófagos obtenido del A. simplex.

BBS: Tampón de borato sódico.

BSA: Albúmina sérica bovina.

CD: Cúmulo de diferenciación.

ConA: Concanavalina A sepharosa.

CXCL: Ligando de la subfamilia CXC de quimiocinas.

E/S: Extracto de Excreción/Secreción.

ESM: error estándar de la media.

FcεRI: Receptor IgE de alta afinidad.

Fcγ-‐Fcε: Proteína de fusión bifuncional de una inmunoglobulina humana.

FcγRIIb: Receptor de inhición IgG.

FcγRIII: Receptor IgG1 de baja afinidad.

FcγRIV: Receptor IgG2a e IgG2b.

HES: Extracto de Excreción/Secreción obtenido de H. polygyrus.

HRP: Enzima peroxidada de rábano picante.

ICD: Clasificación internacional de las enfermedades.

IFN-‐γ: Interferón-‐gamma.

Ig: Inmunoglobulina.

IL: Interleucina.

ILC: Células linfoides innatas.

ITAMs: Motivos de activación en inmunoreceptores basados en tirosina.

Abreviaturas 12


ITIMs: Motivos de inhibición en inmunoreceptores basados en tirosina.

i.p.: Intraperitoneal.

LPS: Lipopolisacárido.

MIF: factor inhibidor de la migración de macrófagos.

MMCP-‐1: Proteasa-‐1 de los mastocitos.

NK: células Natural Killer.

OVA: ovoalbúmina.

PAF: Factor activador plaquetario.

PAMP: Patrones moleculares asociados a patógenos.

PBS: Tampón fosfato.

RELMα: molécula similar a la resistina alfa.

sIg: Inmunoglobulinas específicas.

TGF-‐β: Factor de crecimiento transformante.

Th: Linfocitos T helper.

Tl-‐ES: Antígeno de excreción/secreción de Toxascaris leonina.

TLR: Receptores tipo Toll.

Tl-‐TP: antígeno completo Toxascaris leonina.

TMB: Tetrametil bencidina.

TNF-‐α: Factor de necrosis tumoral alfa.

TP: Toxina pertussis.

Treg: Linfocitos T reguladores.

Ts E/S: Extracto de excreción/secreción obtenido de Trichuris suis.

UA: Unidades Arbitrarias.

Ym1: molécula similar a la quitinasa Chi3L3.

WT: Wild-‐type.

Abreviaturas 13


Resumen

1. Introducción

La anafilaxia es una reacción alérgica aguda, grave y potencialmente mortal

cuya incidencia va en aumento en los últimos años en los países industrializados.

Debido a su gravedad, no es posible investigar los mecanismos subyacentes en el

hombre. Sin embargo, los modelos murinos han supuesto un gran avance en el

conocimiento de esta patología gracias a la similitud del sistema inmunológico y

los síntomas anafilácticos entre el hombre y el ratón.

El cacahuete es un importante alérgeno alimentario capaz de inducir

reacciones graves debido a que sus proteínas son capaces de resistir la digestión

gástrica y sus epítopos son capaces de unirse a los linfocitos B y T y de activar la

señalización de las células dendríticas y el complemento, induciendo una respuesta

alérgica tipo Th2.

Existen distintas cepas de ratón que han sido utilizadas para los estudios de las

enfermedades alérgicas cuya respuesta ha demostrado ser diferente según la cepa

empleada. Entre ellas, destacan la cepa BALB/c y la cepa C3H/HeOuJ, cuyos

fenotipos alérgicos han permitido avanzar en el conocimiento de estas patologías.

Sin embargo, hay pocos estudios que comparen las cepas entre sí. Hasta la fecha,

no se han realizado estudios comparativos en estas cepas en un modelo de

anafilaxia sistémica inducida por la administración de cacahuete por vía

intraperitoneal (i.p.) como el que se describe a continuación por lo que este trabajo

se inició con la selección de la cepa a utilizar.

Los parásitos son animales invertebrados capaces de provocar enfermedades

en el hombre de forma crónica. Para sobrevivir en el huésped, evolutivamente, han

desarrollado mecanismos que les permitan suprimir las respuestas efectoras de

éste. Además, el huésped requiere de esta modulación para evitar respuestas

inmunes dañinas para el individuo por lo que esta habilidad se ha ensayado en la

terapéutica alergológica.

Resumen 14


El Anisakis simplex es un parásito helminto capaz de infectar de forma

accidental al hombre al ingerir pescado crudo o poco cocinado. El hombre no

forma parte del ciclo vital del parásito pero puede desarrollar una respuesta de

hipersensibilidad. En este parásito, se han encontrado antígenos somáticos o

estructurales que forman parte de la estructura parasitaria y antígenos de

excreción/secreción (E/S) que son producto de su actividad fisiológica. Un aspecto

característico de estos antígenos es su papel inmunomodulador, exhibiendo un

efecto protector en modelos murinos de asma bronquial. Sin embargo, hasta la

fecha, no se han realizado estudios de anafilaxia sistémica en los que se

administren extractos de A. simplex de forma simultánea a la sensibilización

antigénica.

2. Hipótesis

En este trabajo gira alrededor de dos hipótesis: A) el desarrollo de modelos

murinos de anafilaxia sistémica son instrumentales para el entendimiento de los

mecanismos subyacentes en la patología humana y B) las infecciones por parásitos

podrían reducir las respuestas alérgicas.

3. Objetivos

3.1. Objetivos primarios

• Desarrollar un modelo murino de anafilaxia sistémica inducida por

cacahuete que permita obtener una respuesta clínica e inmunológica

potente.

• Analizar los efectos inhibitorios de dos antígenos del Anisakis simplex

(antígeno somático y excreción/secreción (E/S)) en el modelo murino de

anafilaxia.

3.2. Objetivos secundarios

• Comparar la respuesta clínica e inmunológica de dos cepas de ratón

(C3H/HeOuJ y BALB/c) empleando el modelo murino de anafilaxia y

seleccionar aquella cepa que presente una respuesta anafiláctica

clínicamente más evidente.

Resumen 15


• Optimizar la dosis de extracto de cacahuete necesario para la

sensibilización.

• Analizar los efectos inmunomoduladores de los antígenos del Anisakis

simplex en la respuesta clínica e inmunológica (humoral y celular).

4. Materiales y métodos

El estudio se ha realizado en 3 fases:

I. Desarrollo de un modelo de anafilaxia en dos cepas de ratón (C3H/HeOuJ y

BALB/c) y selección de aquella con una mejor respuesta clínica o inmunológica.

Grupos de ratones de 5 semanas de vida de las cepas BALB/c y C3H/HeOuJ se

sensibilizaron por vía i.p. con cacahuete en presencia de adyuvantes. El grupo

control recibió dosis equivalentes de solución salina en presencia de

adyuvantes. Se midieron en el suero los niveles de inmunoglobulinas específicas

a cacahuete (IgG1, IgG2a, IgE) y de IgE total. En la semana 6, todos los ratones

fueron provocados mediante la administración i.p. de cacahuete. La anafilaxia se

midió a través de la puntuación de síntomas y de los cambios en la temperatura

corporal. Tras la provocación sistémica, se midieron la liberación de histamina y

la de las citocinas liberadas por los esplenocitos estimulados (IL-‐4, IL-‐5, IL-‐12,

IL-‐13, IL-‐10 e IFN-‐γ).

II. Búsqueda de dosis que produce una respuesta anafiláctica más potente. Para

ello, grupos de ratones de la cepa C3H/HeOuJ se sensibilizaron por vía i.p. con

distintas dosis de cacahuete en presencia de adyuvantes. El grupo control

recibió dosis equivalentes de solución salina en presencia de adyuvantes. En la

semana 6, se estudió la respuesta anafiláctica.

III. Estudio del efecto inmunomodulador del Anisakis simplex, tanto del extracto

somático como del de E/S, sobre la anafilaxia en la cepa y dosis más adecuada.

Para ello, grupos de ratones de la cepa C3H/HeOuJ fueron sensibilizados por vía

i.p. con cacahuete en presencia de adyuvantes. De forma simultánea, un grupo

de estos ratones se trató diariamente con extracto somático de A. simplex, otro

grupo se trató diariamente con extracto de E/S de A. simplex y otro grupo se

trató con suero salino. Se midieron en el suero los niveles de inmunoglobulinas

específicas a cacahuete (IgG1, IgG2a, IgE),. A las 5 semanas del inicio del estudio,

se realizó una provocación con cacahuete administrado por vía i.p. Tras la

Resumen 16


provocación sistémica, se midieron la liberación de histamina y la de las

citocinas liberadas por los esplenocitos estimulados (IL-‐4, IL-‐5, IL-‐12, IL-‐13, IL-‐

10 e IFN-‐γ).

5. Resultados

Se presenta el desarrollo de un modelo murino de anafilaxia. En primer lugar

se comparó la respuesta anafiláctica de dos cepas de ratón, C3H/HeOuJ y BALB/c,

sensibilizadas a cacahuete. En ambas cepas, la generación de IgG e IgE específica

demostró la sensibilización de los ratones. Los ratones C3H/HeOuJ presentaron

niveles significativamente más altos de IgG1 e IgE específica a cacahuete que el

grupo de los ratones BALB/c. Tras la provocación con extracto de cacahuete, se

objetivaron síntomas anafilácticos, instaurándose más rápida e intensamente en el

grupo de ratones C3H/HeOuJ. La afectación clínica sistémica en este grupo fue

mayor que en su homólogo de los BALB/c y se acompañó de un descenso más

significativo de la temperatura y de una mayor liberación de histamina plasmática

tras la provocación. Aunque ambas cepas desarrollan citocinas Th1, Th2 y Treg, los

niveles de estas citocinas fueron muy superiores en el grupo de ratones

sensibilizados BALB/c. El patrón encontrado en la respuesta linfocitaria en los

ratones BALB/c sugiere una activación mixta Th1 y Th2. Dado que la respuesta

clínica fue más evidente en la cepa C3H/HeOuJ se seleccionó ésta para los estudios

siguientes.

A continuación, se compararon distintas dosis de cacahuete para la

sensibilización de los ratones C3H/HeOuJ y se realizó una provocación con el

alérgeno. Tras la provocación con cacahuete, se objetivaron síntomas anafilácticos,

de aparición más precoz en el grupo de ratones en los que se empleó la dosis de

100 µg, acompañado de mayor gravedad clínica. Por ello, se estableció esta dosis

como la idónea para la continuación del estudio.

En último lugar, se compararon los efectos de los extractos del Anisakis simplex,

tanto el antígeno somático como el de excreción/secreción, sobre el modelo

desarrollado previamente. En ambos casos, la sensibilización desarrollada fue

inferior en los grupos que recibieron los extractos del A. simplex, encontrando

niveles de IgG1 e IgE específica significativamente menores en los grupos

Resumen 17


pretratados, sugiriendo una posible protección de la sensibilización en estos

grupos. Además, los niveles de IgG2a específica fueron mayores en el grupo que

recibió el extracto E/S, lo que mediaría también en el efecto protector de este

extracto. Tras la provocación con cacahuete, los ratones que recibieron extractos

de A. simplex presentaron síntomas anafilácticos de menor intensidad y de inicio

más tardío, destacando los leves síntomas clínicos presentados en los ratones que

reciben las proteínas secretadas por el parásito. La temperatura corporal

permaneció prácticamente estable en estos ratones de forma similar a los ratones

no sensibilizados. La escasa liberación de histamina tras la provocación en este

grupo, refuerza todos estos datos. Por último, ambos grupos desarrollaron

citocinas que demuestran un patrón mixto. Destaca especialmente la inhibición de

la IL-‐5 producido por el pretratamiento con el E/S. Además, el incremento de la

citocina Th1, IFN-‐γ, y reguladora, IL-‐10, en los ratones que recibieron E/S sugieren

una posible modulación de la respuesta alérgica Th2 hacia Th1.

6. Discusión

Se ha creado un modelo de anafilaxia murino en el que se ha investigado el

efecto protector de las proteínas parasitarias del Anisakis simplex.

En el modelo mostrado, se empleó la vía intraperitoneal como vía de

sensibilización y provocación ya que se ha demostrado la necesidad de que los

alérgenos sean absorbidos de forma sistémica para inducir una respuesta alérgica

clara. Se ha demostrado que los niveles de IgE, IgG1 e IgG2a desarrollados en el

ratón sensibilizado se relacionan con el número de dosis recibidas durante el

periodo de sensibilización y que el empleo de 3 dosis induce una respuesta inmune

humoral, celular y clínica óptima para este estudio. Los adyuvantes han sido

ampliamente utilizados en los modelos murinos de enfermedades alérgicas ya que

los antígenos purificados son poco inmunogénicos. En este estudio se ha

seleccionado el hidróxido de aluminio por ser un potente adyuvante pro-‐Th2, con

la toxina pertussis, promotor de respuestas Th1 y Th2.

Hay varios estudios que comparan las cepas C3H/HeOuJ y BALB/c con

resultados dispares. Li y cols. (J Immunol. 1999;162(5):3045) demostraron que los

ratones C3H/HeOuJ presentaban niveles más elevados de IgG1, pero menores

Resumen 18


niveles de IgE específica junto con mayor liberación de citocinas que los BALB/c,

mientras que Morafo y cols. (J Allergy Clin Immunol. 2003;111(5):1122) y Smit y

cols. (PLoS One. 2011;6(12):e28917) demostraron que la cepa C3H/HeOuJ

presentaba mayor grado de anafilaxia junto con niveles más elevados de IgE

específica. Curiosamente, Morafo y cols. no encontraron síntomas anafilácticos en

los ratones BALB/c a pesar de encontrar IgE específica en ellos. Por último, los

niveles de citocinas fueron más elevados en la cepa BALB/c en el estudio de Li y

cols., mientras que Smit y cols. encontraron niveles más altos en la cepa

C3H/HeOuJ.

Con respecto a las dosis de antígeno empleada, los datos hallados en la

literatura son muy dispares. Por un lado, Chen y cols. (Food Chem Toxicol.

2013;62:41) encontraron que las dosis bajas eran las que inducían una mayor

producción de IgE e IgG1 específicas, mientras que para Yamanishi y cols. (Biosci

Biotechnol Biochem. 2003;67(1):166) las dosis más altas tendrían una mayor

respuesta alérgica. Por ello, se hace necesario ensayar distintas dosis para elegir la

más adecuada. En nuestro caso, fue con la dosis intermedia con la que se obtuvo

una mejor respuesta clínica.

La mayoría de los estudios extraídos de la literatura muestran un efecto

protector de los parásitos y sus productos para la prevención y el tratamiento del

asma bronquial y la anafilaxia en los modelos murinos y que dicha protección se

relaciona con los niveles elevados de IL-‐10. Estudios aislados, como el de Michels y

cols. (Infect Immun. 2006;74(10):5926) no hallan dicha protección en su modelo

de anafilaxia y demuestran como los ratones infectados por Syphacia obvelata

presentaban mayor grado de anafilaxia que los no infectados.

Los últimos estudios, se han centrado en el estudio de los antígenos de

excreción/secreción de los parásitos demostrando que estos extractos son capaces

de proteger frente al desarrollo de asma bronquial tanto de forma sistémica como

local. Aunque muchos autores relacionan esta protección con la IL-‐10, McSorley y

cols. (Eur J Immunol. 2012;42(10):2667) postulan que esté relaciona también con

la disminución en los macrófagos activados alternativamente.

Resumen 19


Por último, Park y cols. (J Immunol. 2009;182(11):6907) emplearon un

producto del E/S del A. simplex para tratar a ratones sensibilizados. Observaron

como el tratamiento con este antígeno fue capaz de proteger frente al asma

bronquial y de inmunomodular e inhibir la reacción alérgica Th2 a través de las

citocinas reguladoras IL-‐10 y TGF-‐β.

Basado en estos estudios, se ha desarrollado en este trabajo el tratamiento

preventivo de la anafilaxia con los antígenos somáticos y de E/S del A. simplex. En

el modelo presentado, la administración de E/S de forma simultánea a la

sensibilización fue capaz de proteger y evitar la respuesta anafiláctica. Los niveles

bajos de IgE e IgG1 sugieren una alteración del desarrollo de la respuesta alérgica

desde el inicio de la sensibilización. También, permanecieron bajos los niveles de

IL-‐5 lo que sugiere un papel principal de esta citocina en este modelo. Por último,

los niveles elevados de IgG2a e IL-‐10 demuestran que la inmunomodulación

inducida por el E/S de la respuesta alérgica Th2 hacia Th1 ocurre a través de estas

rutas.

7. Conclusiones

• Las cepas C3H/HeOuJ y BALB/c son ambas idóneas para el estudio de la

anafilaxia sistémica, siendo la primera más adecuada para la evaluación de

la respuesta clínica, idóneamente con 100 µg por dosis y 3 dosis de extracto.

• Los antígenos parasitarios del Anisakis simplex somáticos y,

fundamentalmente, los de excreción/secreción, son capaces de reducir la

respuesta anafiláctica.

• Los antígenos de Anisakis simplex ejercen un efecto inmunomodulador a

nivel humoral y celular.

Resumen 20


Summary

1. Introduction

Anaphylaxis is an acute, severe and potentially lethal allergic reaction whose

incidence is increasing over the last years in industrialized countries. Due to its

severity, there is no possibility to study the underlying mechanisms in humans.

Thereby, murine models have posed a great advancement in building the

knowledge around this pathology thanks to the similarities observed between

immune system and anaphylactic symptoms in both humans and mice.

Peanut is one of the main food allergens and it is responsible for one of the

highest incidences of severe food allergic reactions. Peanut’s proteins are known to

resists digestion, comprise B-‐cell and T-‐cell epitopes and activate dendritic cells

and complementary pathways, inducing a Th2 allergic response.

There are diverse mice strains that have been used in the study of allergic

pathologies and their responses have been variable depending on the strain

initially selected. BALB/c and C3H/HeOuJ strains should be highlighted for their

contribution to the advancement of these pathologies thanks to their allergic

phenotypes. However, only a limited number of studies compare these two strains.

In fact, there are no studies comparing both strains in a systemic anaphylaxis

model induced by peanut intraperitoneal (i.p,) administration to date. Hence,

selection of the strain to be used became the first step of our research plan.

Parasites are invertebrate animals that may produce chronic diseases in

humans. In order to survive in the host, parasites have evolved and developed

mechanisms for suppressing host effector responses. Additionally, the host

requires this modulation in order to avoid self-‐harming immune responses.

Exploitation of this capability in allergic therapies has already been attempted.

Anisakis simplex is a helminth parasite able to accidentally infest human beings

when they eat raw or rare fish. Humans do not participate in the vital cycle of the

parasite but they can develop hypersensitivity reactions. This parasite bears

Summary 21


somatic or structural antigens that engage in structural functions and

excretion/secretion (E/S) antigens that are products of its physiologic activity. One

relevant aspect of these antigens is their role as immunomodulators, showing a

protective effect in murine models of bronchial asthma. Nevertheless, no studies

on systemic anaphylaxis with simultaneous administration of A. simplex extract

and antigen sensitization are available to date.

2. Hypothesis

This work is based on two hypotheses: A) murine models of systemic

anaphylaxis are instrumentals for understanding the underlying mechanisms in

human diseases and B) parasites infections may reduce allergic responses.

3. Objectives

3.1. Primary objectives

• Develop a systemic anaphylaxis murine model induced by peanut that

produces a potent clinical and immunologic response.

• Analyze the inhibitory effects of two Anisakis simplex antigens (somatic and

excretion/secretion (E/S)) in the anaphylaxis murine model.

3.2. Secundary objectives

• Compare clinical and immune responses in two mice strains (C3H/HeOuJ y

BALB/c) using the anaphylaxis murine model. Select the strain that

presents a more defined clinical anaphylactic response.

• Optimize peanut extract dose necessary for sensitization.

• Analyse immunomodulatory aspects of Anisakis simplex antigens in the

clinical an immunological responses (humoral and cellular).

4. Materials y methods

The study has been developed in three phases:

IV. Development of a murine model of anaphylaxis in two mice strains (C3H/HeOuJ

y BALB/c) and selection of the strain that shows a more defined clinical and

immunological response. Groups of 5-‐week-‐old mice from BALB/c and

Summary 22


C3H/HeOuJ strains were sensitized following i.p. administration of peanut plus

adjuvants. Control group received equivalent doses of saline solution plus

adjuvants. Blood serum was collected for measurement of peanut specific

immunoglobulins (IgG1, IgG2a and IgE) and total IgE. At week 6, all mice were

challenged by the administration of peanut intraperitoneally. Anaphylaxis was

measured through clinical score and changes in body core temperature. After

systemic challenge, histamine and cytokines from stimulated spleen cells were

measured (IL-‐4, IL-‐5, IL-‐12, IL-‐13, IL-‐10 e IFN-‐γ).

V. Determination of dose required to produce a potent anaphylactic response.

Groups of mice from the C3H/HeOuJ strain were sensitized following i.p.

administration of different peanut doses plus adjuvants. Control group received

equivalent doses of saline solution plus adjuvants. Anaphylactic response was

then studied at week 6.

VI. Study of the immunomodulator effect of Anisakis simplex antigens, somatic and

E/S, in an anaphylaxis model using the strain selected and at the most suitable

dose. Groups of mice from the C3H/HeOuJ strain were sensitized by peanut i.p.

administration plus adjuvants. Simultaneously, a group of these mice were daily

treated with A. simplex somatic extract, a second group was daily treated with A.

simplex E/S extract and a control group was treated with saline solution. Blood

serum was collected for quantification of peanut specific immunoglobulins

(IgG1, IgG2a, IgE). At week 5, all mice were challenged with peanut

administrated intraperitioneally. After systemic challenge, histamine and

cytokine from stimulated spleen cells were measured (IL-‐4, IL-‐5, IL-‐12, IL-‐13,

IL-‐10 e IFN-‐γ).

5. Results

Development of a murine model of anaphylaxis is shown. First of all,

anaphylactic response of two peanut sensitized mice strains, C3H/HeOuJ and

BALB/c, were compared. In both strains, specific IgG and IgE responses showed

that mice were peanut sensitized. C3H/HeOuJ mice exhibited significantly higher

specific IgG1 and IgE than BALB/c mice. After peanut challenge, anaphylactic

symptoms were observed, those being faster and more intense in C3H/HeOuJ

mice. Systemic clinical response in this group was more severe and shared a more

Summary 23


significant decrease in body temperature and higher histamine release after

peanut challenge than BALB/c mice. Conversely, although both strains developed

Th1, Th2 and Treg cytokines, higher levels of these cytokines were found in

BALB/c sensitized group. Lymphocytic pattern response in BALB/c mice suggests

a Th1 and Th1 mixed activation. Due to a more pronounced clinical response

observed in C3H/HeOuJ mice, this strain was selected for further studies.

Next, comparison of different peanut doses needed for C3H/HeOuJ

sensitization was carried out. After peanut challenge, anaphylaxis response was

then observed. This response happened earlier and was more severe in those mice

receiving a 100 µg dose. For that reason, this dose was established as the suitable

dose for the subsequent studies.

Finally, somatic and E/S A. simplex effects were compared in the murine model

previously developed. In both cases, lower sensitization was observed in the

groups receiving A. simplex extracts. Significant lower levels of specific IgG and IgE

were found in the pretreated groups, suggesting a feasible protection by

sensitization in those groups. Besides, specific IgG2a levels were higher in the

group that received E/S extract, which suggests a potential link in the protective

effect caused by this extract. After peanut challenge, mice receiving A. simplex

extracts showed milder and delayed onset of anaphylactic symptoms, this milder

effect being particularly remarkable for mice treated with parasite secreted

proteins. Core body temperature remained almost stable in this group, in a similar

behaviour to the non-‐sensitized mice group. Scarce release of histamine after

peanut challenge in this groups, strengthen all these data. Finally, both groups

released cytokines, showing a mix pattern. Particularly remarkable was the

inhibition of IL-‐5 induced by E/S pretreatment. Additionally, an increase in Th1,

IFN-‐γ, and regulatory cytokine, IL-‐10, in mice receiving E/S suggests a feasible

modulation of allergic response from Th2 to Th1.

6. Discussion

A murine model of anaphylaxis has been developed. The protective effect of A.

simplex parasite proteins has been studied.

Summary 24


In the model described, intraperitoneal route was used for sensitization and

challenge because it has been demonstrated that allergens must be systemically

absorbed for inducing a clear anaphylactic response. Levels of IgE, IgG1 and IgG2a

developed in sensitized mice correlated well with the number of doses received

during sensitization. The utilization of 3 doses was considered optimal in terms of

the humoral, cellular and clinical response necessary for this study. Adjuvants have

been widely used in allergic murine models because purified antigens are poorly

immunogenic. In this study, aluminium hydroxide was selected because it is a

potent pro-‐Th2 adjuvant, in conjunction with pertussis toxin, which promotes both

Th1 and Th2 responses.

There are some studies comparing C3H/HeOuJ y BALB/c strains but they

showed different results. Li et al. (J Immunol. 1999;162(5):3045) showed that

C3H/HeSn mice exhibited higher specific IgG1 levels but lower specific IgE levels

with a higher release of cytokines than BALB/c., both sensitized to peanut Morafo

et al. (J Allergy Clin Immunol. 2003;111(5):1122) and Smit et al. (PLoS One.

2011;6(12):e28917) showed that C3H/HeOuJ exhibited higher anaphylaxis degree

with higher specific IgE levels. Curiously, Morafo et al. showed that BALB/c mice

were not able to develop an anaphylactic response, even if they exhibited specific

IgE levels. Finally, cytokines levels were higher in BALB/c mice in Li et al. study,

whereas Smit et al. found that higher cytokines levels were observed in

C3H/HeOuJ group.

Regarding antigen doses used, data found in the literature are variable. On one

hand, Chen et al. (Food Chem Toxicol. 2013;62:41) found that lower doses induced

a higher specific IgE and IgG production. On the other hand, Yamanishi et al.

(Biosci Biotechnol Biochem. 2003;67(1):166) found that higher doses triggered a

stronger allergic response. Because of this variability, there is a need to test

different doses in order to select the most suitable one. In our study, intermediate

dose showed a stronger clinical response.

The majority of studies found in literature, show a protective effect of parasites

and their products in the prevention and treatment of bronchial asthma and

anaphylaxis in murine models. These studies relate the observed protective effect

with higher levels of IL-‐10. Particular studies, like the one of Michels et al. (Infect

Summary 25


Immun. 2006;74(10):5926) did not showed the protective effect of helminths in

their model of anaphylaxis. On the contrary, it has been reported that mice infested

with Syphacia obvelata developed a more severe anaphylactic response than non-‐

infected mice.

More recent studies have been focussed on the exploration of parasite

excretion/secretion antigens. In these studies, extracts were able to protect from

bronchial asthma, both locally and systemically. Although many authors related

this protection with IL-‐10, McSorley et al. (Eur J Immunol. 2012;42(10):2667) also

suggested that it might be related to a decrease in alternative activated

macrophages.

Finally, Park et al. (J Immunol. 2009;182(11):6907) used A. simplex E/S

products for treating sensitized mice. The authors showed how treatment with this

antigen was able to protect from bronchial asthma and inhibited Th2 allergic

response through regulatory cytokines, IL-‐10 and TGF-‐β.

Based on these studies, a preventive treatment of anaphylaxis with A. simplex

somatic and E/S antigens has been developed. In the model presented,

administration of E/S antigen simultaneously with sensitization was able to

protect and avoid anaphylactic response. Low levels of IgE and IgG1 suggest an

alteration in the development of allergic response from the very beginning of

sensitization. In addition, IL-‐5 levels remained low, suggesting a key role for this

cytokine in this model. Finally, high levels of IgG2a and IL-‐10 also suggest that

immunomodulation induced by E/S extract changed the allergic response from

Th2 to Th1.

7. Conclusions

• C3H/HeOuJ y BALB/c strains are both suitable for studying systemic

anaphylaxis. C3H/HeOuJ was the most suitable strain for evaluating clinical

response, especially at 100 µg per dose, with 3 extract doses.

• Somatic parasite antigens from Anisakis simplex and, particularly,

excretion/secretion antigens can prevent anaphylaxis.

• Anisakis simplex antigens show an immunomodulatory effect at the humoral

and cellular levels.

Summary 26


Introducción

1. Anafilaxia

La anafilaxia es una reacción alérgica aguda, grave, con compromiso vital y

potencialmente mortal (1), descrita por primera vez por Richet en 1904 (2). Su

incidencia se cree que está infraestimada debido a la ausencia de una codificación

correcta en la clasificación internacional de las enfermedades (ICD) y a que, en

muchas ocasiones, los síntomas son autolimitados (1). Se estima que del 0,05 al

2% de la población mundial sufrirá algún episodio de anafilaxia a lo largo de su

vida y dicha incidencia va en aumento (3). En Europa, la incidencia es de 1,5 a 7,9

casos por cada 100.000 personas al año, habiéndose observado un incremento de

los ingresos en Urgencias por esta causa aunque, afortunadamente, la tasa de

mortalidad se encuentra por debajo del 0,001% (4).

La anafilaxia se caracteriza por la aparición brusca de varios síntomas y signos

dentro de las dos horas posteriores a la exposición al alérgeno. Se produce un

compromiso de la vía aérea y/o problemas cardiovasculares que, habitualmente

pero no siempre, se acompañan de síntomas en piel y mucosas (1, 4). El

tratamiento de elección de la anafilaxia es la administración intramuscular de

adrenalina a dosis de 0,01 ml/kg de peso hasta una dosis máxima de 0,5 ml, que

puede repetirse a los 5 minutos, en caso necesario. La segunda línea de

tratamiento incluye la retirada del alérgeno responsable, colocar al paciente en

una posición correcta, la administración de oxígeno a alto flujo, agonistas beta-‐2 de

acción corta, reposición de líquidos por medio de cristaloides y la administración

de adrenalina nebulizada. Por último, las guías europeas recomiendan el uso de

Introducción 27


antihistamínicos y glucocorticoides (1). Todos los pacientes que sufren un episodio

de anafilaxia deben ser estudiados en un servicio de Alergia para identificar el

alérgeno responsable y poder así evitarlo (5). Sin embargo, estos pacientes están

permanentemente en riesgo de sufrir un nuevo episodio de anafilaxia si entran en

contacto de forma inadvertida con el alérgeno.

Debido a la gravedad de las reacciones y a la necesidad de conocer los

mecanismos responsables de esta patología para innovar en nuevas terapias

efectivas, es necesario ampliar los estudios en este campo. Sin embargo, el estudio

de los mecanismos inmunológicos subyacentes en el hombre es bastante complejo

(6, 7). Gracias a la similitud del sistema inmunológico entre el hombre y el ratón y

al desarrollo de cepas modificadas genéticamente, se han desarrollado con éxito

modelos murinos de anafilaxia que han supuesto un gran avance en el

conocimiento de esta patología, permitiendo elucidar los mecanismos

responsables así como buscar nuevos tratamientos (8, 9). Por ello, estos modelos

murinos son cada vez más empleados (10).

1.1. Modelos murinos de anafilaxia

Estos estudios se iniciaron en 1941 (11). Desde entonces, las diferentes cepas

de ratón empleadas en los modelos han permitido conocer mecanismos

importantes de las vías de la anafilaxia que, posteriormente, han sido

corroborados en el hombre.

1.1.1. Respuesta anafiláctica sistémica en los modelos murinos

Se han descrito dos mecanismos independientes para explicar las reacciones

anafilácticas sistémicas en el ratón: la vía clásica y la vía alternativa (12). La vía

clásica es mediada por la inmunoglobulina E que se encuentra unida al receptor

Introducción 28


IgE de alta afinidad (FcεRI) presente en los mastocitos y basófilos. El

reconocimiento de un alérgeno a través de moléculas de IgE adyacentes, induce la

agregación de los FcεRI, activando así los mastocitos y basófilos. Al activarse, se

induce una rápida liberación de histamina, proteasa-‐1 de los mastocitos (MMCP-‐1)

y factor activador plaquetario (PAF). A continuación, se produce una

vasodilatación, un aumento de la permeabilidad vascular, un aumento de la

contractilidad muscular cardíaca, y una caída de la temperatura corporal (13).

La vía alternativa es mediada por la inmunoglobulina G1 (IgG1), producida

durante el periodo de sensibilización (14). La IgG1 se une al receptor IgG1 de baja

afinidad, FcγRIII, localizado en los macrófagos y basófilos. Esta activación, induce la

liberación de PAF (15). De la misma forma que la vía clásica, en esta vía se llegaría

a inducir una vasodilatación, un aumento de la permeabilidad vascular y una

disminución de la temperatura corporal. Sin embargo, la liberación de PAF induce

una disminución de la función miocárdica (13).

La estimulación de mastocitos y macrófagos se lleva a cabo a través de

receptores FcRs con motivos de activación en inmunoreceptores basados en

tirosina (ITAMs) localizados en el dominio intracitoplasmático de éstos. La

supresión de estas vías se lleva a cabo, entre otros, por otros receptores celulares

con ITIMs (motivos de inhibición en inmunoreceptores basados en tirosina) (12)

(Figura 1).

Introducción 29


Vía VíaAntigeno clásica alternativa

Pl-3K Histamina +PAF PAF ~ ~ ~ / eNOS · )

Adrenalina ----¡..___ Músculo liso ~Nt ...------ ~;-;1-stat6 · Endotelio vascular ¡

Anafilaxia

Figura 1. Vías clásica y alternativa de anafilaxia en el ratón. Modificado de

Finkelman (12). Los receptores que activan los mastocit.os y macrófagos se

muestran en verde mientras que aquellos que inactivan estas células se muestran

en rojo.

Otros autores han descrito niveles elevados de IgE e IgG específicas a cacahuete

en modelos de anafilaxia, lo que supondría la activación de ambas vías de la

anafilaxia (15, 16). Se postula que al administrar el antígeno por vía parenteral y

alcanzar dosis elevadas en el torrente sanguíneo, se excede la capacidad de la IgGl

de bloquear la unión del antígeno con la IgE-mastocito y desarrollándose así una

anafilaxia sistémica mediada por IgG1 e IgE. Por otro lado, la administración del

antígeno por vía oral o las bajas dosis recibidas por vía parental se relacionan más

Introducción 30

http:mastocit.os


frecuentemente con la activación casi exclusiva de los mastocitos a través de la IgE

(17).

Por otro lado, la IgG1 es capaz de bloquear la anafilaxia dependiente de IgE

bien interfiriendo con el antígeno antes de que induzca la activación mastocitaria a

través del sobrecruzamiento en el FcεRI o bien a través de la formación de

inmunocomplejos IgG-‐antígeno-‐IgG que induciría una señal inhibitoria a través de

su unión con el receptor inhibidor FcγRIIb (receptor IgG que contiene ITIM) (18).

Se han descrito diferencias notables entre cepas en este campo. Smit y cols (19)

en su modelo de anafilaxia inducida por cacahuete observan un mayor descenso de

la temperatura corporal en los ratones C3H/HeOuJ al reducir el número de

plaquetas, comparado con la cepa BALB/c, lo que sugiere que parte de la activación

de la vía alternativa es dependiente de las plaquetas. De esta forma, postulan que

la activación de los mastocitos induciría la liberación de histamina y PAF

activándose a continuación los monocitos y macrófagos, liberándose mayor

cantidad de PAF lo que activaría las plaquetas. En otras cepas, como por ejemplo

los ratones C3H/HeSn (20) y C57BL/6 (19), también se describe la participación

de la vía alternativa.

Arumugam y cols. (21) observan una gran variabilidad en el número de

mastocitos en los tejidos de las diferentes cepas. En su caso, los mastocitos

tisulares de los ratones 129S5 presentan, con respecto a los ratones BALB/c, un

aumento de la capacidad proliferativa y una disminución de la frecuencia de

apoptosis junto con una mayor sensibilidad a la histamina plasmática. Dado que la

histamina produce un efecto vasodilatador, se induciría un mayor descenso de la

Introducción 31


temperatura corporal al desencadenarse una reacción IgE mediada en esta cepa de

ratón.

Así, la predisposición genética presente en las distintas cepas tendrá una

repercusión importante en la activación de las diferentes vías que inducen la

respuesta anafiláctica. De ello se deduce que la elección de la cepa adecuada será

crucial para la obtención del modelo de anafilaxia más conveniente.

Por otro lado, se ha descrito como la IgG2a puede actuar como un anticuerpo

bloqueante y antagonizar de forma efectiva la respuesta alérgica. Tanto en los

ratones tratados con inmunoterapia específica como en el hombre, se detectan

niveles elevados de IgG2a e IgG4, respectivamente (22, 23). En el hombre, los

niveles elevados de IgG4 se han asociado además con la mejoría clínica en los

pacientes que reciben inmunoterapia subcutánea (24). En los ratones, el

tratamiento con inmunoterapia específica induce una elevación de los niveles de

IgG2a que se correlacionan de forma inversa con una disminución de la

hiperreactividad bronquial (25). Se ha descrito como los anticuerpos IgG2a pueden

interferir con la liberación de mediadores por parte de los mastocitos y basófilos

mediada por IgE e inhibir la formación de inmunocomplejos desencadenados por

otras IgGs (26), protegiendo así de la reacción anafiláctica.

1.1.2. Cepas murinas en anafilaxia

Tradicionalmente, se ha utilizado la cepa BALB/c para caracterizar el fenotipo

alérgico y, a través de esta cepa, se han podido describir las diferentes vías de la

anafilaxia en el ratón (12, 15). Además, esta cepa ha permitido estudiar los efectos

de tratamientos como las vacunas multivalentes (que contienen alérgenos dispares

provenientes de alimentos, ácaros, epitelios, pólenes, y veneno de avispa) que

Introducción 32


evitan la sensibilización y protegen de la anafilaxia y que, potencialmente, podrían

ser aplicables en el hombre (27). También, la cepa BALB/c ha permitido conocer

parte de las diferencias en los mecanismos observados entre la sensibilización

alérgica y la tolerancia oral, lo que podría permitir conocer los mecanismos

reguladores y evitar la sensibilización alérgica en los niños (28).

La cepa 129SvEvBrd ha demostrado una mayor sensibilidad a la histamina y la

presencia de un mayor número de mastocitos en los tejidos, por lo que es más

susceptible a la anafilaxia mediada por IgE y los mastocitos. Así, el uso de esta cepa

permitiría estudiar en profundidad la anafilaxia mediada por IgE y la biología de

los mastocitos en este tipo de reacciones alérgicas (21).

Una tercera cepa, la cepa C57BL/6, se ha utilizado para generar ratones

transgénicos (“knockout”). Con ella, se ha establecido la participación de las

inmunoglobulinas específicas y los mastocitos funcionales en la anafilaxia

sistémica (29), y la implicación del Receptor de IgG2a e IgG2b (FcγRIV), los

neutrófilos y el factor activador de plaquetas (PAF) en la anafilaxia tanto activa

como pasiva (30).

Por último, otra cepa que ha permitido conocer la contribución de la IgE

específica, la liberación de histamina y la desgranulación mastocitaria en la

anafilaxia sistémica es la C3H/HeJ (31). Los síntomas clínicos observados en esta

cepa en los modelos que se han generado de anafilaxia se asemejan a los

aparecidos en el hombre por lo que posteriormente ha sido empleada para

estudiar tratamientos, como es el caso de la fórmula de hierbas chinas que ha

demostrado ser útil para bloquear las reacciones anafilácticas (32). Las infecciones

Introducción 33


por helmintos también han demostrado protección frente al desarrollo de la

sensibilización alérgica (33, 34).

Finalmente, los ratones transgénicos se han empleado para demostrar la

inhibición de la desgranulación de los mastocitos y basófilos a través de los

receptores FcεRI por medio de una proteína de fusión bifuncional de una

inmunoglobulina humana Fcγ-‐Fcε que podría terminar en un tratamiento de

inmunoterapia (35).

Sin embargo, no todas las cepas son adecuadas para el estudio de la anafilaxia.

Por ejemplo, las cepas AKR/J y la CBA/J, empleadas extensamente en estudios de

alergia respiratoria (36, 37), han demostrado no ser adecuadas para la inducción

de la alergia alimentaria (20, 38).

De esta forma, aunque todos los modelos murinos han sido validados, cada

estudio requiere una cepa concreta para obtener la respuesta clínica e

inmunológica más satisfactoria. Sin embargo, hay pocos estudios que comparen las

características específicas de las cepas de ratón, por lo que resulta difícil comparar

los resultados obtenidos entre los diferentes estudios. En este sentido, son pocos

los estudios en los que se comparan las características de las cepas BALB/c y

C3H/HeOuJ y, hasta la fecha, nunca se ha descrito en un modelo de anafilaxia

sistémica inducida mediante la administración del alérgeno por vía

intraperitoneal. En este estudio y basándonos en datos previos de nuestro grupo

(39), inicialmente se ha querido comparar dos cepas diferentes en cuanto a la

respuesta clínica e inmunológica para selección la más adecuada para el estudio de

protección con antígenos del Anisakis simplex.

Introducción 34


1.1.3. Modelos murinos de anafilaxia. Uso de cacahuete como antígeno

La alergia al cacahuete tiene unas características propias. En primer lugar, es

una de las alergias alimentarias más frecuentes, de inicio en la primera infancia y

que no suele resolverse de forma espontánea con los años (40). Es la principal

causa de muerte por reacciones alérgicas con alérgenos alimentarios (41).

Actualmente, se estima que afecta al 2% de los niños que viven en países

industrializados y su incidencia está en aumento (42). En los últimos años, se han

realizado varios estudios que podrán suponer grandes cambios en el diagnóstico

de la alergia al cacahuete mediante el test de activación de basófilos (43), en su

tratamiento mediante protocolos de inmunoterapia oral (44) e incluso en su

prevención mediante la administración de cacahuete de forma temprana (45).

Se han descrito características propias del cacahuete como alérgeno: por un

lado, tienen gran cantidad de proteínas cuyos epítopos se unen a los linfocitos B y

T desencadenando una respuesta alérgica IgE mediada (46, 47). Además, estás

proteínas son capaces de resistir la digestión gástrica (46), lo que se relaciona con

su capacidad de desencadenar reacciones alérgicas graves. El alérgeno mayoritario

Ara h1 es capaz de activar las células dendríticas de tal forma que éstas inducen

una respuesta Th2 (48).

Por otro lado, Khodoun y cols. (49) a través de ratones transgénicos, han

descrito como el cacahuete es capaz de inducir un shock anafiláctico activando

directamente la vía del complemento y la desgranulación mastocitaria al mismo

tiempo.

Dada la gran potencia y estabilidad, el cacahuete se ha utilizado ampliamente

en los modelos de anafilaxia (19, 20, 29, 31-‐33, 38, 49-‐53).

Introducción 35

Prevención de Ja anafilaxia con antígenos del Anisakis simplex en un modelo animal

2. Infección por parásitos y alergia

Los parásitos son animales invertebrados capaces de provocar enfermedades

en el hombre y en otros animales. Las infecciones por parásitos se adquieren

habitualmente de fuentes exógenas y los parásitos penetran por vía oral, a través

de la piel o a través de las picaduras de artrópodos vectores. La transmisión de

estas enfermedades se facilita por la contaminación del entorno con desechos de

animales y humanos. Las parasitosis son, con frecuencia, crónicas pudiendo

prologarse durante meses o años (54).

2.1. Clasificación parás itos

Según sus características biológicas, morfológicas y fisiológicas, los parásitos

patógenos para el hombre se han clasificado en protozoos, hongos, helmintos y

artrópodos. A su vez, los helmintos se dividen en platelmintos (trematodos y

cestodos) y nematodos (Tabla 1).

Clasificación de los parásitos patógenos

Protozoos

Ameba Flagelados Ciliados Esporozoos

Hongos Microsporidios

Helmintos Platelmintos

Nematodos Cestodos

Nematodos

Artrópodos

Miriápodos Pentastomida Crustáceos Arácnidos Insectos

Tabla l. Clasificación de los parásitos según sus características biológicas,

morfológicas y fisiológicas. Extraído de Murray y cols. (54).

Los helmintos son unos microorganismos pluricelulares complejos que tienen

forma alargada y simetría bilateral. Su tamaño es mucho mayor que el de los

Introducción 36


parásitos protozoarios y habitualmente son macroscópicos, con un tamaño que

oscila entre 1 mm a 1 cm o más. Los helmintos poseen con frecuencia unas

elaboradas estructuras de fijación localizadas generalmente en la región anterior,

como pueden ser ganchos, ventosas, dientes o placas. Poseen también un sistema

excretor y nervioso primitivos. Los helmintos se subdividen a su vez en

platelmintos y nematodos. Los primeros presentan cuerpo aplanado mientras que

los segundos presentan cuerpos cilíndricos. Los platelmintos engloban los

nematodos y los cestodos (54).

2.2. El sistema inmune y la infección por parásitos

2.2.1. Respuesta inmune inducida por los parásitos en el huésped

Los parásitos se caracterizan por su habilidad para mantener una infección

crónica en los huéspedes. Para ello, deben modular la respuesta inmune del

huésped de forma que o bien se supriman las respuestas efectoras desarrolladas

para eliminar al parásito o bien éstas sean ineficaces, prolongándose así su

supervivencia. Esta inmunomodulación es necesaria para evitar la aparición de

respuestas inmunes contra el parásito y, por otra parte, para evitar que esta

reacción dañe al propio huésped.

Las respuestas inmunes que inducen los helmintos en el hombre, aunque

puede variar entre las distintas especies de parásitos, presenta características

comunes. Se produce un primado y expansión de linfocitos Th2 productores de IL-‐

4, IL-‐5, IL-‐9 e IL-‐13 que inducen la producción de IgE antígeno-‐específica y la

activación de eosinófilos. La inducción de esta respuesta Th2 en el huésped

pretende aislar y matar al parásito (55). Por el contrario, la inducción de

respuestas Th1/Th17 en el huésped no protege frente a la infección parasitaria y

Introducción 37


se relacionan directamente con la aparición de síntomas clínicos graves y

potencialmente mortales (56).

La modulación de los helmintos actúa a distintos niveles: por un lado, en el

sistema inmune innato, alterando la función de las células dendríticas, células

linfoides innatas (ILC) y macrófagos; por otro, en el sistema inmune adaptativo

donde los helmintos inducen la expansión de linfocitos T y B reguladores (Tregs y

Bregs, respectivamente) produciéndose una hiporrespuesta de los linfocitos T

efectores (57-‐61).

En las células dendríticas, los helmintos son capaces de alterar su maduración y

disminuir su capacidad de responder frente a otros procesos infecciosos, como la

infección por Micobacterium tuberculosis, por ejemplo (62), o incluso de inducir su

apoptosis (57). En estudios realizados con las ILC tipo 2, se ha observado como los

productos secretados por algunos parásitos (por ejemplo, H. polygyrus) inducen un

bloqueo de la producción de IL-‐33 lo que dificulta la activación de las ILC tipo 2

(58). En muchos de los estudios desarrollados en pacientes con filariasis, se

observa también que la presencia de IL-‐4 e IL-‐13 induce la activación de los

macrófagos activados alternativamente (MAA) (59). Los MAA tienen una acción

fundamentalmente reguladora ya que son capaces de liberar IL-‐10 y TGF-‐β e

interfieren con la activación de los linfocitos T CD4+ antígeno-‐específicas. La

supervivencia de los helmintos en el huésped se ha relacionado directamente con

la activación de los linfocitos T reguladores (Treg) en el huésped las cuales, a

través de la liberación de IL-‐10 y TGF-‐β, reducen fuertemente la respuesta inmune

frente al parásito (60). Por último, en los linfocitos B la presencia de IL-‐10 y T TGF-‐

β induce un cambio de isotipo de las inmunoglobulinas a IgG4 (incapaz de unirse a

Introducción 38


los receptores de basófilos, mastocitos y eosinófilos) y la producción de más IL-‐10

(61). Con ello, se disminuye la respuesta efectora de los linfocitos T, lo que se

conoce como “hiporrespuesta de los linfocitos T efectores” (60). A esta

hiporrespuesta se suma la inhibición de las células dendríticas descrita

previamente, ya que al alterarse la maduración de las células dendríticas se induce

una activación subóptima de los linfocitos T CD4+ (60). Por otra parte, hay un

mayor número de linfocitos T circulantes que expresan el antígeno 4 del linfocito T

citotóxico (CTLA-‐4), importante inhibidor de la señalización en los linfocitos T

efectores) (61), participando así de esta hiporrespuesta.

Se ha observado que las personas portadoras de parásitos durante muchos

años y clínicamente asintomáticos (tolerantes immunológicamente hablando)

presentan un perfil Th2 modificado en el que se encuentran niveles de IL-‐5

disminuidos pero sin cambios en los niveles de IL-‐4 (58) junto con una expresión

máxima de IgG4 (61).

De forma cronológica, los cambios inmunológicos observados en el huésped

son los siguientes: los helmintos pueden acceder al huésped a través de la barrera

cutánea activando las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células

dendríticas, las células NK, los eosinófilos y los basófilos/mastocitos. A

continuación, se induce la diferenciación de los linfocitos T CD4 naïve hacia

linfocitos Th1, Th17 y Th2. Coincidiendo con la puesta de huevos del parásito, se

produce una expansión de los linfocitos Th2 y una disminución de las células Th1,

lo que es absolutamente necesario para el huésped ya que en caso contrario se

produciría una enfermedad letal (63). Durante la infección crónica, se produce una

expansión de los Treg productores de IL-‐10 y TGF-‐β que inhiben la activación de

Introducción 39


los macrófagos y suprimen la función de los linfocitos T memoria y T efectores

(Figura 2) (60).

Estas propiedades inmunológicas de los parásitos se han utilizado

ampliamente para el tratamiento y prevención de procesos inmunológicos, en

concreto, reacciones alérgicas .

.~

~

-~ )# ~ Q


2.3. Anisakis simplex

2.3.1. Clasificación A. simplex

El A. simplex es un parásito helminto que pertenece a la familia de los

nematodos, clase rhabditae, orden ascaridida (Figura 3) capaz de infectar a los

pescados y a los invertebrados, incluyendo los moluscos y los crustáceos.

Figura 3. Clasificación de los nematodos. El Anisakis simplex pertenece a la familia

de los nematodos, clase rhabditae, orden ascaridida. Modificado de (64).

2.3.2. Ciclo vital de A. simplex

El huésped primario del A. simplex son los cetáceos (las ballenas y los delfines).

Éstos liberan huevos al mar a través de sus heces. Dentro de ese huevo liberado, se

produce el cambio del estadio de la larva de L1 a L2, liberándose larvas vivas en

estadio L2 que son ingeridas por crustáceos como el krill (primeros huéspedes

Introducción 41

L 111

1'.

Prevención de Ja anafilaxia con antígenos del Anisakis simplex en un modelo animal

intermedios). En ellos, la larva alcanza su estadio L3. Estos crustáceos son

ingeridos, a su vez, por otros peces, otros crustáceos más grandes o por

cefalópodos (segundos huéspedes intermedios). Dentro de éstos, la larva se

encapsula en la superficie de órganos y músculos. Estos huéspedes intermedios

pueden ser ingeridos por los cetáceos o por el hombre. En el primer caso, al ser

ingeridos por los cetáceos, se t ransfieren las larvas en estadio L3 que se

transforman en larvas estadio L4, LS y, finalmente, en adultos, capaces de liberar

de nuevo huevos, completándose así el ciclo vital. En el segundo caso, el hombre, al

comer estos pescados o mariscos que contienen larvas en estadio L3, se convierte

en huésped accidental. En él, la larva no puede completar su ciclo vital (Figura 4)

(65, 66).

Huésped definitivo

.......... • Huevos--• • -.MAMIFEROS MARINOS ~

--. L1 v ~Adultos

CICLO VITAL

.,; CRUSTÁCEOS Lu + Lm ~ Larva-III " ~······ •• . __.,J:el., ,f

PECES, CEFALOPODOS,CRUSTÁCEOS

Huésped intermediario

Figura 4. Ciclo vital del Anisakis simplex. Extraído de Baeza (67).

Introducción 42


2.3.3. Enfermedades producidas por A. simplex en el hombre

La ingesta de pescado crudo o poco cocinado que contenga larvas de Anisakis

simplex en estadio L3 puede dar a enfermedades en el hombre. La primera

referencia del término “anisakiasis” (enfermedad provocada por el A. simplex) fue

realizada por Van en 1962 (68). La incidencia de estas patologías es muy extensa

habiéndose diagnosticado más de 20.000 casos en todo el mundo y asociándose de

forma estrecha al consumo de pescado crudo. Por ello, es más frecuente en Japón

donde, actualmente, se diagnostican entre 2.000 y 3.000 casos al año (69, 70),

seguido de Europa y algunos países de África y América del Sur (71).

En el hombre, las larvas pueden penetrar en la mucosa gástrica, produciéndose

una “anisakiasis gástrica aguda” (71). En ésta, se presentan síntomas

gastrointestinales agudos (dolor abdominal, vómitos, diarrea) sin asociar síntomas

alérgicos y su tratamiento debe incluir en muchos casos la retirada de la larva por

medio de una endoscopia. Por otro lado, se pueden desencadenar una “anisakiasis

gastroalérgica” (72) en la que aparecen síntomas alérgicos (desde la urticaria o el

angioedema hasta la anafilaxia) sin asociar síntomas gastrointestinales o siendo

éstos muy leves. Dichos síntomas alérgicos pueden aparecer hasta días después de

la ingesta del pescado (73). Su tratamiento incluye el requerido para tratar las

reacciones alérgicas sin ser necesaria, habitualmente, la endoscopia. Alonso-‐

Gómez y cols. (74) demostraron que, para inducir síntomas alérgicos, el A. simplex

debía parasitar el tracto digestivo.

Se han descrito 13 alérgenos en el A. simplex. Los pacientes en primer lugar

entran en contacto con los antígenos somáticos (tienen una función estructural en

el parásito) y, posteriormente, con los antígenos de excreción/secreción

Introducción 43


(productos secretados por el parásito para penetrar en los tejidos del huésped)

(66). Estudios realizados con el extracto de excreción/secreción (E/S) del A.

simplex han observado una potencia antigénica mayor que en el extracto somático,

medida por niveles de IgE específica y tamaño de pápula de pacientes alérgicos a

este parásito (73). Además, los alérgenos reconocidos por los pacientes alérgicos al

A. simplex provienen, la mayoría de ellos, de los productos de E/S (71).

Las dos patologías descritas en relación con el A. simplex se corresponden

probablemente con la respuesta del huésped a la infección parasitaria. La

respuesta mediada por IgE que desencadena los síntomas alérgicos facilitaría la

expulsión del parásito. Sin embargo, la ausencia de esta repuesta puede limitar la

expulsión permitiendo que la larva penetre en la mucosa gástrica (75).

2.4. Teoría de la higiene y el equilibrio Th1/Th2

En 1989, Strachan postuló la “Teoría de la higiene” (76), por la cual el

incremento de la incidencia en las enfermedades alérgicas observado en los

últimos años en los países industrializados podría ser debido a una disminución de

la exposición a infecciones en la infancia. La falta del estímulo de la inmunidad

dirigida a patógenos, potenciaría la respuesta inmune tipo 2 (mediada por

linfocitos Th2 e inductora de la respuesta alérgica por IgE) a costa de la respuesta

tipo 1 (mediada por linfocitos Th1 y responsable de la respuesta inmune frente a

infecciones virales, bacterianas o causadas por protozoos) (77). Sin embargo, los

estudios epidemiológicos realizados hasta la fecha no han demostrado una

asociación directa e inversa entre la sensibilización alérgica y las infecciones

respiratorias en la infancia. Se ha postulado que el ascenso de la patología alérgica

se asocia también con el uso de antibióticos en la infancia y los cambios en la dieta,

Introducción 44


cuya influencia en la microbiota intestinal podría alterar la maduración del sistema

inmune, induciéndose así la respuesta alérgica (78).

Sin embargo, el incremento de las enfermedades alérgicas en los países

industrializados se ha asociado paralelamente con un aumento de la incidencia de

las enfermedades autoinmunes (mediadas por una respuesta Th1), como la

diabetes tipo I o la esclerosis múltiple (79). Además, los defectos en la vía de

señalización de la IL-‐12 o el IFN-‐γ (citoquinas promotoras de una respuesta Th1)

no se relacionan con una mayor gravedad de las enfermedades alérgicas (80). De

esta forma, el paradigma Th1/Th2 no parece explicar completamente las

diferencias observadas en la prevalencia de enfermedades alérgicas y autoinmunes

en las distintas regiones, por lo que deberán existir otros mecanismos que las

justifiquen y que, probablemente, sean comunes tanto en las respuestas tipo 1

como en las tipo 2.

En los países en vías de desarrollo se ha observado una mayor prevalencia de

las infecciones parasitarias. Curiosamente, y a pesar de que tanto las infecciones

parasitarias como las patologías alérgicas comparten los mecanismos de respuesta

inmune tipo 2, varios autores relacionan las infecciones por helmintos con una

menor incidencia de asma bronquial (81) y atopia (entendida como positividad en

las pruebas cutáneas) (82, 83). Además, se ha observado un incremento de la

atopia en pacientes de zonas endémicas parasitarias que recibieron un tratamiento

anti-‐helmíntico (84-‐86).

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