ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................1

CAPITULO 1. ANTECEDENTES GENERALES ................................................................................3 1. 1. Estudio de Líneas Celulares Dopaminérgicas .................................................................................................................... 3

1. 1. 1. Enfermedad de Parkinson ......................................................................................................................................... 3 1. 1. 2. Líneas Celulares ....................................................................................................................................................... 3 1. 1. 3. Línea Celular Neuronal Dopaminérgica RCSN-3 ...................................................................................................... 4

1. 2. Optimización de Medios de Cultivo..................................................................................................................................... 6 1. 2. 1. Composición de Medios de Cult ivo ........................................................................................................................... 6 1. 2. 2. Mejoramiento de Medios de Cult ivo .......................................................................................................................... 9 1. 2. 3. Análisis de Flujos Metabólicos ................................................................................................................................ 10 1. 2. 4. Teoría de MFA ........................................................................................................................................................ 12

CAPITULO 2. METODOLOGÍA .....................................................................................................14 2.1. Enfoque Sistemático para el Análisis de Flujos Metabólicos ............................................................................................. 14

2.1.1. Definición de las Reacciones Relevantes del Sistema en Estudio ............................................................................ 14 2.1.2. Establecimiento de las ecuaciones estequiométricas................................................................................................ 16 2.1.3. Establecimiento de balances auxiliares..................................................................................................................... 17 2.1.4. Establecimiento de la ecuación de síntesis de biomasa............................................................................................ 17 2.1.5. Obtención de Valores Experimentales de Velocidades Específ icas .......................................................................... 19 2.1.6. Solución y Visualización ............................................................................................................................................ 19

2.2. Métodos de Trabajo de Laboratorio con Línea Celular RCSN3 ......................................................................................... 20 2.2.1. Aspectos Generales del Trabajo con Células Animales ............................................................................................ 20 2.2.2. Métodos de Cultivo Estático de la Línea Celular RCSN-3 ......................................................................................... 20

2.2.2.1. Adaptación de Células a Bajo Contenido de Suero........................................................................................... 22 2.2.3. Métodos para el cultivo de la línea celular RCSN en suspensión.............................................................................. 22

CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................24 3.1. Caracterización del Crecimiento de la Línea RCSN-3 en Cult ivo Estático a 10% de Suero. ............................................. 24 3.2. Resultados de la Adaptación de Células a Bajo Contenido de Suero................................................................................ 27 3.3. Caracterización del Crecimiento de la Línea RCSN-3 en Cult ivo Estático a 2% de Suero ................................................ 30 3.4. Caracterización del Crecimiento de la Línea RCSN-3 en Cult ivo en Suspensión a 2% de suero ...................................... 32 3.5. Curva de Calibración Análisis de Aminoácidos.................................................................................................................. 34 3.6 Resultados MFA ................................................................................................................................................................ 35

CAPITULO 4. CONCLUSIONES .................................................................................................. 412

ABREVIATURAS ..............................................................................................................................43

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................................45

APÉNDICE Nº 1 ................................................................................................................................48

APÉNDICE Nº 2 ................................................................................................................................50

APÉNDICE Nº 3 ................................................................................................................................51

APÉNDICE Nº 4 ................................................................................................................................54

APÉNDICE Nº 5 ................................................................................................................................55

APÉNDICE Nº 6 ................................................................................................................................59

APÉNDICE Nº 7 ................................................................................................................................62

1

INTRODUCCIÓN

En el transcurso de las últimas décadas la Enfermedad de Parkinson, o Mal de

Parkinson como se le conoce popularmente, ha sido tratada principalmente con la

administración de drogas tales como la levodopa, a través de un tratamiento sintomático cuya finalidad es reestablecer los niveles de dopamina en la ruta llamada

nigro-estriatal. Sin perjuicio de ello, en los últimos años se ha construido evidencia científica en torno a que este tipo de tratamientos podrían ocasionar efectos colaterales o secundarios, como alteraciones graves de la psiquis del paciente y otros de similares

características, además de la tendencia progresiva a perder efectividad en el tiempo si se administran por períodos prolongados. Todo esto ha impulsado la definición y

construcción de tratamientos de alternativa, entre los cuales se cuentan las terapias de transplante celular.

Por su parte la localización del tejido neuronal degenerado en esta condición provee de un modelo ideal para estudiar, a través de los cultivos de células

dopaminérgicas, la fisiopatología celular de la Enfermedad de Parkinson, así también como para el desarrollo de modelos celulares para su posterior aplicación como terapias de transplantes de tejido neuronal, utilizando procedimientos quirúrgicos

mínimamente invasivos.

Una de las principales ventajas que presenta el uso de una línea neuronal dopaminérgica como material de transplante es que, además de poseer las características morfológicas de las células a reemplazar, puede contribuir a mejorar los

niveles de neurotransmisores suficientes para reestablecer la función perdida. Además, estas células producen axones los cuales permiten la integración del tejido

transplantado, con el circuito de información neuronal del receptor. Es indudable que en los próximos años la técnica enunciada podría

transformarse de manera importante en una alternativa para los pacientes que padecen la Enfermedad de Parkinson y otras enfermedades cerebrales. Sin embargo, aún persisten algunos problemas técnicos que deben ser resueltos antes que esta terapia

se transforme en un estándar, tales como la sobrevida de los implantes y la falta de estabilidad que suele afectar a algunas líneas celulares, lo que podría, en definitiva,

manifestarse en la pérdida de propiedades diferenciadas, muerte celular y malignidad, entre otros.

En este contexto, el presente trabajo de análisis de flujos metabólicos pretende realizarse sobre una línea celular única, denominada RCSN-3, misma que ha sido

establecida exitosamente en los últimos años por la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, como modelo para estudios del Parkinson. Esta línea neuronal presenta características claras en la línea de las funciones dopaminérgicas, puesto que

se ha derivado de la sustancia nigra de rata Fisher 344 adulta, expuesta a un medio condicionado por células UCHT1 (línea celular tumoral de tiroides de rata), proceso que

induce la transformación en cultivos celulares primarios.

2

La implementación e implantación de sistemas más eficientes de cultivos de células animales es un objetivo ampliamente valorado a nivel mundial y hoy en día es un objetivo aún no concretado por los creadores de la línea de investigación, los que

demuestran un gran interés por la posibilidad de tener un sistema de propagación de células que pueda ser aplicado para el crecimiento de las diversas líneas celulares

desarrolladas y las que se encuentran en estudio en la actualidad. Así, la implementación de un cultivo en suspensión de microcarriers será la forma elegida para propagar las células en este estudio.

Por cierto que uno de los métodos que presentan características

complementarias a la hora de abordar las primeras etapas de mejoramiento de medios de cultivos, y que efectivamente ayudará notablemente a reducir el tiempo en laboratorio, consiste en usar recursos matemáticos simples y técnicas de laboratorio

asequibles, con el propósito de retratar el metabolismo de la célula a través de un enfoque sistemático, llamado MFA (Análisis de Flujos Metabólicos).

Finalmente, resulta pertinente agregar que si se considera que el primer paso

para realizar un MFA es la identificación de las reacciones bioquímicas más importantes

involucradas en el proceso celular a ser simulado, en esta investigación se estudiará cuales son las principales vías metabólicas y metabolitos de una célula neuronal, con la

capacidad de generar el neurotransmisor dopamina, tal como es la línea RCSN-3. En este orden de ideas es posible establecer, entonces, que los objetivos del

trabajo pueden expresarse, en lo general, como la necesidad de determinar la composición ideal del medio de cultivo para la línea celular RCSN-3, utilizando MFA.

Específicamente, se persigue definir las principales vías metabólicas de la línea celular en estudio, determinando experimentalmente los requerimientos nutricionales de

las células RCSN-3 en cultivo, a fin de obtener, mediante la implementación de MFA, la composición de un medio de cultivo mejorado para la línea RCSN-3 y comparar los

rendimientos iniciales con los rendimientos obtenidos al usar un medio de cultivo mejorado.

3

CAPITULO 1. ANTECEDENTES GENERALES

1. 1. Estudio de Líneas Celulares Dopaminérgicas

1. 1. 1. Enfermedad de Parkinson

La enfermedad de Parkinson es un desorden neurodegenerativo progresivo, con una incidencia en el tiempo de vida de 2,5% y una prevalencia de al menos 2% en individuos mayores de 70 años [1, 2]. A nivel mundial es la segunda enfermedad

neurodegenerativa con más prevalencia, después del Alzheimer.

Esta enfermedad es causada por la degeneración selectiva y progresiva de una pequeña área del cerebro medio, denominada sustancia nigra pars compacta. Sin embargo, la etiología que subyace a este mal aún permanece desconocida [3, 1, 4].

Las neuronas de la sustancia nigra pars compacta producen el neurotransmisor

dopamina, el cual es transportado por los axones que se proyectan al estriado (ganglio basal) y a otras regiones involucradas en el control motor, que forman parte de lo que se conoce como circuito dopaminérgico.

Durante décadas el principal tratamiento contra el Parkinson consistió en la

administración de drogas tales como la levodopa (L-dopa), tratamiento sintomático, cuyo objetivo es la ruta nigro-estriatal. Sin embargo se ha demostrado que estos tratamientos eventualmente pueden causar efectos secundarios, como psicosis,

diskinesias, entre otros, además tienden a ser progresivamente menos efectivas cuando se toman por períodos prolongados [5, 2, 6]. Esto último ha estimulado la

búsqueda de tratamientos alternativos, incluyendo el uso de terapias de transplante celular.

La localización discreta del tejido neuronal degenerado en esta condición -la sustancia nigra pars compacta- hace del cultivo de tejidos dopaminérgicos un modelo

ideal para el estudio de la fisiopatología celular de la enfermedad y así también para la generación de modelos celulares aplicables, como terapias de transplante de tejido neuronal, utilizando procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos [7].

1. 1. 2. Líneas Celulares

Una de las principales ventajas del uso de líneas celulares radica en que estas mantienen un fenotipo estable, pueden obtenerse de masas celulares vivas en forma

ilimitada, son de fácil acceso y manipulación y no presentan mayores consideraciones éticas o legislativas [7].

4

Las líneas celulares de crecimiento continuo pueden obtenerse a partir de tumores o a partir de tejido normal. La transformación de las células en cultivo, proceso mediante el cual se obtienen las líneas celulares, involucra un cambio espontáneo o

inducido en el fenotipo. De ello resulta un cambio permanente en el ADN y en la expresión génica que es heredable.

En la mayoría de los casos las células transformadas mantienen ciertas características del tejido de origen, por ejemplo en el caso de la línea celular neuronal

RCSN3, ésta expresa el neurotransmisor dopamina y posee axones; características únicas que posee el tejido neuronal, y que le permite hacer la conexión del circuito

cerebral y a su vez traspasar información a las neuronas motoras a lo largo de todo el cuerpo, formando una red interconectada de información.

En efecto, la principal ventaja del uso del transplante de células, que presenten la morfología característica de las neuronas y que produzcan neurotransmisores

específicos, es que éstas pueden reestablecer la conexión del circuito de información neuronal del receptor, además de aportar con niveles de neurotransmisores suficientes para reestablecer la función perdida y así finalmente reestablecer la sinapsis, hecho

que ha sido detectado in vitro en laboratorio.

En un futuro cercano esta técnica puede contribuir siendo una alternativa para los pacientes con Parkinson y otras enfermedades cerebrales, sin embargo, aún algunos problemas técnicos deben ser dilucidados antes de que este tipo de terapia se

convierta en un estándar, tales como la sobrevida de los implantes, la falta de estabilidad que suele afectar a algunas líneas celulares, lo que se puede manifestar en

la pérdida de propiedades diferenciadas, muerte celular, malignidad, entre otros. 1. 1. 3. Línea Celular Neuronal Dopaminérgica RCSN-3

El presente trabajo de análisis de flujos metabólicos se realizará sobre una línea celular única, denominada RCSN-3, que ha sido establecida exitosamente hace

algunas décadas por la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. Esta línea neuronal mantiene funciones dopaminérgicas, ya que ha sido derivada de la sustancia

nigra de rata Fisher 344 adulta, al ser expuesta a medio condicionado por células UCHT1 (línea celular tumoral de tiroides de rata), proceso que induce transformación en cultivos celulares primarios [9]. Estas células crecen adheridas a la superficie formando

tejido, presentando más de 50 pasadas sin perder el fenotipo neuronal, como se puede apreciar en la Figura Nº 1.

La línea celular RCSN-3 ha sido implantada con éxito en el pasado, en el estriado de ratas modelo 6-OH DA, el modelo animal más uti lizado en PD, que consiste

en la inyección intracerebral de la neurotoxina 6-hidroxydopamina (6-OH DA), la que destruye las neuronas que se proyectan desde la sustancia nigra hacia el estriado. Este

tratamiento resulta en la pérdida de dopamina y causa un comportamiento de movimiento en círculos en los animales.

5

En esta experiencia, las ratas presentaron un 75% de recuperación en su comportamiento rotacional después de 16 semanas de realizado el transplante en comparación a las rotaciones iniciales. A las ratas tratadas se les extrajeron secciones

del estriado, donde se descubrió la presencia de características catecolinérgicas, es decir, presencia de tirosina hidroxilasa (TH) y dopadecarboxilasa. Además, la línea

celular ha demostrado no inducir tumores al ser transplantada en el estriado de las ratas [9].

Figura Nº 1: Línea Celular RCSN3 con Fenotipo Neuronal Dopaminérgico

En orden a efectuar experimentos de transplante de células RCSN-3 en ratas antes mencionados, se utilizaron 5×105 células por rata, estos requerimientos aumentan en caso de tratarse de transplantes en primates, los que están considerados en la

segunda parte del estudio de este modelo, ya que se necesitarían 4×106 células por hemisferio, y en el caso de humanos (objetivo final), se ha calculado un requerimiento

de 8×106 células por paciente [10].

Esta línea celular, al igual que la mayoría de las células animales, crece adherida

a la superficie y se mantiene actualmente en condiciones estándar de cultivo en placas petri de vidrio, usando medio de cultivo nutritivo. Los cultivos proliferan mantenidos en

un incubador a 37ºC con 100% de humedad y una atmósfera de 5% CO2. Al alcanzar confluencia (i.e. aproximadamente cuando la superficie de la placa se encuentra ocupada en un 80% por células, lo que equivale aproximadamente a 5,6×104 células

por cm2), las células son desprendidas de las placas mediante la acción de enzimas proteolíticas y utilizadas como inóculo de nuevas placas.

Para la propagación de grandes cantidades de células dependientes a anclaje es necesario disponer de una extensa área superficial. Actualmente los creadores y

usuarios de esta línea celular (principalmente el laboratorio de Farmacología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile) usan los sistemas

convencionales para propagar estas células. Esto último es un problema al tener que hacer uso de grandes cantidades de ellas, ya que la superficie disponible para el crecimiento de las células corresponde sólo a la superficie plana que se encuentra al

interior de cada placa petri, flasks o botella, las cuales además deben ser mantenidas bajo condiciones fisiológicas para poder sobrevivir.

6

Los sistemas convencionalmente usados son intensivos en mano de obra,

requieren gran cantidad de superficie en incubadoras y manejo especializado. Además

existe el problema de variación en las distintas unidades de un batch, ya que, por ejemplo, no sería práctico realizar un estricto control del pH midiendo todas las botellas

a cada momento. Finalmente, el riesgo de contaminación aumenta a medida que aumenta el número de unidades a manipular.

Los sistemas de microcarriers (MCs), donde las células pueden multiplicarse adheridas a microesferas en suspensión, representan un sistema apropiado para el

cultivo a gran escala de células animales [11]. Estos sistemas reducen la mayoría de las desventajas inherentes a los cultivos tradicionales y desde su desarrollo han sustentado exitosamente el cultivo de un gran número de tipos celulares [12], incluyendo entre

estos a células con fenotipo neuronal [13].

La implementación de sistemas más eficientes de cultivos de células animales, es un objetivo ampliamente valorado a nivel mundial y hoy en día es un objetivo aún no concretado por los creadores de la línea, quienes además presentan gran interés por la

posibilidad de tener un sistema de propagación de células que pueda ser aplicado para el crecimiento de las diversas líneas celulares que han desarrollado y que se

encuentran hoy en día en estudio (más de 20). Así, la implementación de un cultivo en suspensión de microcarriers será la forma elegida para propagar las células en este estudio.

1. 2. Optimización de Medios de Cultivo

1. 2. 1. Composición de Medios de Cultivo

Con respecto a la optimización de un proceso de cultivo de células animales, la primera etapa, una vez elegida la línea celular a utilizar, es la optimización del medio de

cultivo, que es considerada la etapa más importante, pues es donde se pueden lograr las mejoras más dramáticas en el cultivo.

Cuando las células son removidas de su tejido de origen y colocadas en cultivo in vitro, el medio debe proveer todas las condiciones ambientales a que la célula ha sido

expuesta in vivo. El medio extracelular debe suplir los requerimientos esenciales para la sobrevida y el crecimiento de las células. Dentro de los fluidos biológicos que han

demostrado ser exitosos para cultivar células fuera del cuerpo, el suero es el más utilizado. Sin embargo existen variadas razones para querer abstenerse del uso de suero, especialmente si las células se requieren para transplantes, ya que existe un

gran riesgo al usar elementos interespecies como reactivos. Sin embargo, como se explicitará a continuación, existen muchos desafíos que sobrepasar antes de poder

trabajar con un medio de cultivo sin suero, debido a los complejos requerimientos de las células animales para su crecimiento [14].

7

Cabe mencionar que por lo general los protocolos óptimos para el crecimiento de células animales en altas concentraciones son absolutamente dependientes del tipo de células, e incluso se presentan diferencias también dentro de las líneas celulares en

caso de que las condiciones de cultivos sean diferentes. En el caso particular de una línea celular dopaminérgica, no existe evidencia previa de estos protocolos; además

esta línea celular es propagada actualmente con medios estándar y un alto porcentaje de suero (20%), por lo que una de las primeras metas de este trabajo es acondicionar estas células a proliferar en ausencia de suero.

El suero es una mezcla extremadamente compleja de biomoléculas de diversos

tamaños y con distintas actividades promotoras e inhibidoras del crecimiento que se encuentran fisiológicamente balanceadas.

Algunas de sus mayores funciones consisten en proveer nutrientes básicos, en solución y unidos a proteínas; hormonas y factores de crecimiento y de funciones

especializadas; factores de proliferación y adherencia; proteínas de unión (albúmina, transferrina), hormonas transportadoras, vitaminas, lípidos, etc.; factores de protección no específicos contra daño mecánico; inhibidores de proteasa; buffer.

Así un medio de cultivo con ausencia de suero debe suplir a cabalidad estas

funciones; para esto la mayoría de los medios de cultivo para células animales cuenta con los siguientes componentes.

Tabla Nº 1: Principales Componentes de un Medio de Cultivo para Células Animales[14]

Componentes del Medio Función Ejemplos

Carbohidratos

Principal fuente de energía.

Generalmente glucosa, otros usados son

manosa, fructosa, galactosa. En algunos medios se agrega

piruvato como precursor inmediato para procesos

biosintéticos que requieren de acetil-CoA.

Aminoácidos

Son necesarios

principalmente para la formación de proteínas. El perfil de utilización de

aminoácidos es generalmente único

para cada tipo celular, condiciones de cultivo y productos biológicos.

Con algunas excepciones

los aminoácidos esenciales para líneas celulares son: arginina,

cisteina, glutamina, histidina, isoleucina,

leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, tirosina y

valina.

Vitaminas

Requerimiento nutricional que en

algunos casos sirve como antioxidante,

Acido ascórbico, alfa-tocoferol (vitamina E),

ácido fólico, biotina, pantotenato, riboflavina,

8

estimulante de síntesis

de macromoléculas, inhibidores de peroxidación de lípidos,

entre algunas de sus funciones conocidas.

colina, nicotinamida,

tiamina, inositol, entre otros, son componentes comunes de la mayoría

de los medios

Lípidos Para evitar el alto costo

energético de la biosíntesis de

membranas celulares a partir de acetil-CoA, se pueden introducir al

medio, precursores intermediarios de

lípidos.

Generalmente colesterol,

ácidos grasos de cadena larga y glicéridos, sin

embargo su exceso puede inhibir el crecimiento.

Minerales y Elementos Traza

Algunos actúan como cofactores de enzimas, aunque en general sus

funciones son pobremente entendidas.

Entre algunos minerales inorgánicos y elementos traza que se encuentran

en el medio están: Cu, Zn, Co, Mn, Va, Se, Ag,

Ba, Cr, Ge, Ti, Sn, Ni, etc.

Iones

Es necesario mantener sus concentraciones en niveles fisiológicos y así

controlar la presión osmótica dentro de la

célula, también pueden afectar el crecimiento y diferenciación de

algunas líneas celulares.

Sodio, potasio, calcio, magnesio, cloro, fosfato, entre otros.

Hormonas y Factores de

Crecimiento

Los requerimientos de

hormonas varían dependiendo del tipo celular. Así un mismo

factor puede incidir positivamente o

negativamente en el crecimiento.

Entre las hormonas se

encuentran, estradiol, tirosina, insulina, cortisol, dextametasona,

progesterona, glucagon. Algunos factores de

crecimiento para algunos tipos celulares son: EGF, bGF, FGF, IGF-I, NGF.

Proteínas y Otros Polímeros

Proveen de diversas funciones a las células, buffers, agentes

protectores no específicos, lípidos,

transportadores de hormonas, inhibidores de proteasa, etc.

Albúmina, carboximetilcelulosa, α-ciclodextrina, β-

ciclodextrina, transferrina, α2-macroglobulina.

9

1. 2. 2. Mejoramiento de Medios de Cultivo

El hecho de poder determinar qué cantidad de cada uno de los nutrientes es necesaria para producir una cierta cantidad de biomasa, obteniendo la menor cantidad

de subproductos de desecho, es información de gran relevancia para obtener un crecimiento celular eficiente. Este hecho se hace más inminente aún para cultivos de alta densidad, debido a que algunos subproductos de la célula pueden inhibir su

crecimiento y el costo que significa la subutilización de recursos.

La mejor uti lización de nutrientes por parte de las células es uno de los primeros objetivos a abordar cuando se desea hacer un uso productivo de estas; a su vez no existe un medio de cultivo universal, lo que hace que la búsqueda de la mejor

combinación de nutrientes a proveer para una determinada línea celular sea una tarea inevadible e inminente.

En la actualidad existen medios de cultivos comerciales que cubren la mayoría

de las necesidades de crecimiento de las células y que favorecen en algunos casos la

propagación y en otros casos la productividad de estas. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, cada línea celular tiene diferentes requerimientos ya que

provienen de diversos tejidos específicos, por lo que se requiere un medio distinto para cada línea celular.

Los primeros intentos de mejoramiento de medios de cultivos definidos para células animales datan de principios de la década de los 80. Estos consistían en probar

todas las distintas combinaciones de compuestos en distintas concentraciones para un número limitado pero suficiente de medios de cultivos [Peehl y Ham, 1980, [18]] [Sato 1982, [14]]. Hoy en día lo que se busca es lograr mejorar los medios de cultivos

realizando la menor cantidad de experiencias en laboratorio para así disminuir su tiempo de obtención, gracias al uso de herramientas matemáticas e informáticas como:

el diseño estadístico de experimentos, optimización matemática, screenings de medios mediante microarrays, etc.21

Existen varios niveles de definición dentro de los medios de cultivo que se hallan hoy en día; los hay con bajo porcentaje de suero, medios libres de suero

(potencialmente suplementado con otras proteínas), medios libres de proteínas (sin suplementación de proteínas), y finalmente el medio químicamente definido (ultrapuro que puede contener constituyentes moleculares pequeños, péptidos o proteínas

producidos mediante técnicas de ADN recombinante). Además la optimización del medio de cultivo puede realizarse en etapas de mejoramiento, las cuales tienden a ir

incrementando en costos, tiempo y tecnología. Actualmente existen empresas de outsourcing desarrolladas con el único propósito de proporcionar la fórmula de un medio de cultivo óptimo, con el nivel de definición adecuado para un determinado tipo

celular de interés [14].

1IBC´s Premiere Conference Cell Culture and Upstream Processing (2003, San Diego CA): Pre-conference

workshop Cell Culture Media Development and Optimization notes.

10

Un primer acercamiento generalmente consiste en hacer un análisis de aminoácidos y carbohidratos en el medio gastado, para establecer los requerimientos celulares y poder suplirlos. Otro objetivo más elaborado puede ser encontrar proteínas y

compuestos que reemplacen completamente la necesidad de suero. Los métodos utilizados para alcanzar estos objetivos contemplan la obtención y el rápido análisis de

una gran cantidad de datos, el diseño estadístico de experimentos, el uso de criterios de selección y parámetros de corte, para determinar qué medios pueden seguir una siguiente etapa de optimización, selección de medios base y suplementos, etc. Este

proceso consiste en un trade entre la obtención de suficientes datos de calidad para tomar decisiones con respecto al medio y el tiempo y costo que se necesita para

obtenerlos.

Uno de los métodos complementarios para abordar las primeras etapas de

mejoramiento de medio de cultivos, que ayudará notablemente a reducir el tiempo en laboratorio, consiste en usar recursos matemáticos simples y técnicas de laboratorio

asequibles, con el propósito de retratar el metabolismo de la célula a través de un enfoque sistemático, llamado MFA (Análisis de Flujos Metabólicos).

1. 2. 3. Análisis de Flujos Metabólicos

Ya sea que el objetivo sea destruir, crear o aumentar las capacidades de un

organismo, es necesario desarrollar maneras para comprender cómo la célula cumple con sus objetivos metabólicos. Una forma de hacerlo es mediante el estudio y la

comprensión del funcionamiento de las vías metabólicas más importantes de un sistema. Se entiende por vía metabólica a un conjunto de reacciones interconectadas que se agrupan para un mejor entendimiento de su rol funcional [17].

Tal como se explicó anteriormente, debido a la cantidad de datos a manipular,

estos análisis se basan necesariamente en modelos matemáticos y simulaciones computacionales. Desde hace algunas décadas se han desarrollado una gran cantidad de modelos matemáticos para modelar las funciones metabólicas, principalmente para

microorganismos, así diferentes métodos para el análisis de las redes metabólicas han sido descritos en la literatura. Entre estos se encuentran: Elementary Flux Mode

Análisis (Klamt and Stelling, 2003; Palsson et. al., 2003); Metabolic Control Análisis (Fell, 1996; Kacser and Burns, 1973); Flux Balance Análisis (Edwards, Ramakrishna, Palsson, 2001; Edwards et. al., 1999; Bonarious et. al., 1997; Varma et. al., 1994);

Metabolic Pathway Análisis (Karp et. al., 1999; Liao et. al., 1996; Mavrovouniotis and Stephanoupoulos, 1992; Scilling et. al., 1999; Schuster et. al., 1999); Cybernetic

Modeling (Kompala et. al., 1986; Varner et al., 1998), etc. [Edwras Ramshanga y Palsson] [16].

Para analizar complejas redes metabólicas, tales como las de organismos multicelulares, sería conveniente usar modelos matemáticos dinámicos, basados en

sistemas de ecuaciones diferenciales, que describan el cambio de concentraciones de los intermediarios en función del tiempo.

11

Sin embargo estos presentan algunas dificultades, tales como la necesidad de contar con los parámetros cinéticos que describen las funciones catalíticas y regulatorias de las enzimas participantes en la red metabólica, y otros parámetros

claves que salvo mínimas excepciones, se encuentran disponibles . Tal es el caso de los glóbulos rojos humanos (Joshi et. al., 1989; Mulquiney et. al., 1999) [16].

Otro enfoque para examinar un sistema biológico es el de “tomar una foto del

sistema”, es decir, mirar el sistema en un solo punto. Esto implica asumir que todas las

concentraciones de los intermediarios se encuentran en estado estacionario y descartar el efecto de dilución debido al crecimiento celular, puesto que su velocidad es órdenes

de magnitud mayor que los parámetros cinéticos de las reacciones involucradas. Estos métodos eliminan la necesidad de datos sofisticados y permiten obtener información del sistema [16].

Un método basado en este principio es el análisis de flujos metabólicos,

herramienta tecnológica conocida como MFA, la cual consiste en el desarrollo de modelos matemáticos basados en la estequiometría de la red bioquímica a nivel celular. Estos modelos contemplan el uso de grandes sets de información bioquímica acerca de

reacciones interrelacionadas al interior de la célula, en forma de redes metabólicas (Ozcan, 2005) [15].

El análisis de los flujos metabólicos es importante debido a que estos representan cuantitativamente la interrelación entre los metabolitos que forman una vía,

permitiéndonos determinar el grado de compromiso que tiene una vía en las funciones celulares, en la fisiología de la célula o por ejemplo en la producción de un cierto

metabolito de interés.

El MFA se basa en el balance de flujo másico del metabolismo celular. Así como

la masa no se crea ni se destruye y sólo existen reacciones de conversión, los nutrientes captados por las células, (carbohidratos, aminoácidos, oxígeno y otros

compuestos orgánicos e inorgánicos) necesariamente después de un tiempo deben formar parte de la nueva biomasa, los metabolitos excretados o los productos. La idea es realizar los balances de masa globales sobre estas entradas (nutrientes) y salidas

(nueva biomasa, metabolitos, productos) para ganar perspectiva con respecto a las reacciones que ocurren al interior de la célula y obtener información acerca de como se

comportan los flujos másicos internos, a partir de mediciones externas (experimentales) y de la estequiometría de las reacciones involucradas [19].

En el balance de masa global de la célula, los principales nutrientes o entradas son generalmente glucosa, glutamina y otros aminoácidos, ácidos grasos y lípidos,

entre otros. Otros compuestos orgánicos como nucleótidos y vitaminas no contribuyen significativamente a la formación de biomasa. Algunas salidas del balance lo constituyen dióxido de carbono, agua, productos tales como anticuerpos, factores de

crecimiento, etc., aminoácidos secretados, subproductos de desecho, tales como lactato y amonio [19].

El enfoque de MFA orientado hacia la estructura (estequiometría o basado en restricciones), al contrario de los modelos dinámicos, sólo requiere la topología de la red

bioquímica, la que en general es bien conocida [19]. Si bien este enfoque integrador

12

puede ser una poderosa herramienta, hay que considerar que está basado sobre ciertos supuestos, como el considerar estado estacionario, por lo tanto, su uso es recomendable como una primera aproximación al análisis del metabolismo celular y a

partir de este punto, con un conocimiento cada vez mayor de la línea en cuestión, seguir determinando las mejores condiciones de cultivo in vitro.

El balance de metabolitos ha sido extensivamente usado para la cuantificación

de flujos metabólicos, en células creciendo bajo condiciones balaceadas: i. e.,

crecimiento exponencial en cultivos batch o cultivos continuos en estado estacionario (Stephanopoulos et al., 1998). Usando esta metodología, los flujos intracelulares

pueden ser calculados a partir de unos pocos flujos extracelulares medibles usando balance de masa para los metabolitos intracelulares, los que se consideran en estado estacionario.

En este método existen dos factores determinantes: el modelo estequiométrico y

los flujos externos medidos. El modelo estequiométrico puede asemejarse a modelos estequiométricos previos, tomando como base el metabolismo central y adicionando elementos específicos de la línea celular a estudiar. Los flujos externos a medir se

obtienen a continuación realizando el análisis de grados de libertad del problema, una vez conocida toda la información referente a restricciones que pueda tener el sistema y

analizando que metabolitos se pueden considerar en estado estacionario sin introducir singularidades al sistema.

1. 2. 4. Teoría de MFA

Las diferentes reacciones bioquímicas están conectadas a través de metabolitos

que participan en más de una vía ramificándose, conectando una secuencia de reacciones con otra para formar la vía metabólica [15]. Para describir redes metabólicas

de manera cuantitativa, se deben escribir los balances de masa dinámicos para cada uno de los metabolitos de la red, lo que genera un sistema de ecuaciones diferenciales que describen el comportamiento transiente de las concentraciones de estos

metabolitos [20]:

jjij

i vSdt

dX(Ec. Nº 1)

Donde vj corresponde al j-ésimo flujo metabólico (entendiendo por flujo

metabólico a la velocidad específica de formación o consumo de un metabolito), Xi

representa la concentración del metabolito, y el coeficiente estequiométrico Sij, es el número de moles del metabolito i formado (o consumido) en la reacción j. Debido a que

el interés está enfocado en características estructurales o propiedades invariantes de la red metabólica y a que las constantes de tiempo que caracterizan a los sistemas en estado transiente son generalmente muy rápidas comparadas con las constantes de

tiempo asociadas al crecimiento celular y a la dinámica del proceso, es razonable considerar el sistema en estado estacionario; así el set de ecuaciones diferenciales se

13

reduce a un set de ecuaciones lineales, que escrito en notación matricial queda expresado de la siguiente manera [20]:

0vS (Ec. Nº 2)

Donde S es la matriz de los coeficientes estequiométricos de cada reacción, v es el vector de dimensión n x 1 de los flujos.

Aunque el sistema está efectivamente cerrado al paso de ciertos metabolitos,

otros pueden entrar o salir a través de flujos de intercambio. Estos flujos en general, no

representan conversiones bioquímicas ni fenómenos de transporte como los de los flujos internos, sino que pueden ser pensados como las entradas o salidas del sistema.

Así, se realiza una distinción entre metabolitos intra y extracelulares del sistema, sin embargo el balance de masa considera a todos los metabolitos y es un sistema cerrado [19].

El objetivo de MFA es determinar valores desconocidos del vector v, para una

matriz conocida S, conociendo algunos flujos metabólicos de entrada o salida, determinados experimentalmente. Dependiendo de los grados de libertad del sistema (Incógnitas – Nº de metabolitos en Eº estacionario) y del número de flujos medidos

experimentalmente (ME), éste se puede clasificar como determinado (ME = GL), sobredeterminado (ME > GL) o indeterminado (ME < GL). El método de solución

usado para resolver el sistema de ecuaciones lineales depende de esta clasificación. Así el método apropiado para resolver sistemas indeterminados es el uso de programación lineal el cual se basa en la optimización de una función objetivo bajo

ciertas restricciones, como por ejemplo la velocidad de formación de biomasa, la velocidad de formación de una proteína recombinante, etc. Para sistemas

sobredeterminados el método de solución típicamente usado es el método de aproximación de mínimos cuadrados.

14

CAPITULO 2. METODOLOGÍA

2.1. Enfoque Sistemático para el Análisis de Flujos Metabólicos

2.1.1. Definición de las Reacciones Relevantes del Sistema en Estudio

El primer paso para realizar un MFA es la identificación de las reacciones bioquímicas más importantes involucradas en el proceso celular a ser simulado [19]. En este caso se procedió a estudiar cuales son las principales vías metabólicas y

metabolitos de una célula neuronal, con la capacidad de generar el neurotransmisor dopamina, tal como es la línea RCSN-3.

De acuerdo a la literatura, las principales vías metabólicas de los distintos tipos

celulares cambian según su especificación (ver Apéndice Nº 1). Las principales vías de

una célula neuronal son: la glicólisis, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y el metabolismo de aminoácidos2, que en el caso de las condiciones de cultivo de la línea,

corresponde principalmente al catabolismo de aminoácidos, ya que estos en su mayoría son proporcionados por el medio de cultivo. Tanto ésta información como la de vías específicas fue comprobada haciendo uso de bases de datos tales como BRENDA, a

partir de las cuales se lograron reconstruir las vías de la manera más precisa posible, gracias a la determinación de las enzimas participantes.

La búsqueda se realizó primero identificando la filogenia de las ratas de las

cuales provienen las células, luego se buscó en bases de datos información oficial

acerca de las vías y enzimas conocidas para esta especie o similar, luego en la base de datos de enzimas y vías metabólicas BRENDA se buscaron ciertas enzimas genéricas

claves y de ahí se fue depurando la información hasta llegar a la especie de la cual se obtuvieron las células; o en caso de no haber información se buscó el parentesco inmediatamente más cercano.

El metabolismo es la maquinaria química que lleva a cabo el proceso de la vida.

A través de un vasto repertorio de reacciones enzimáticas y fenómenos de transporte, los organismos vivos pueden procesar y convertir cientos de compuestos orgánicos e inorgánicos, en moléculas o compuestos necesarios para sustentar su existencia [20].

Este proceso parte al transformar los carbohidratos (glucosa en este caso) en energía (en forma de ATP) y poder reductor, necesarios para llevar a cabo las demás

reacciones. Existen tres vías principales que puede tomar la glucosa, en términos de la cantidad que pasa a través de ella: la glicólisis, la vía pentosa fosfato y la vía del glicógeno, para el tejido neuronal; sólo las dos primeras vías se encuentran activas [21].

En la primera etapa del metabolismo central (la glicólisis), la glucosa de seis

carbones, es transformada en dos moléculas de tres carbones (piruvato), proceso que

2 2004, David L. Nelson, Michael M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Ed Freeman, pp

522,606

15

ocurre gracias a la participación de 10 enzimas, que actúan en el citoplasma de la célula. La ecuación general que caracteriza esta serie de reacciones es la siguiente [21]:

Parte de la energía de la molécula de glucosa es conservada como ATP,

mientras que la mayoría se mantiene en su producto piruvato.

La glicólisis se encuentra interconectada con la vía pentosa fosfato (PPP), a

través de su segundo intermediario, la molécula glucosa 6 - fosfato, la que se oxida para formar azúcares de 5 carbonos (pentosas), siendo NADP el aceptor de electrones.

Esta vía permite la biosíntesis de nucleótidos, ácidos grasos y coenzimas en algunos casos tales como ATP, NADH, coenzima A, etc. Y es de particular importancia en algunas células de rápida división [21].

La importancia de esta vía se reflejará en los resultados de los flujos internos, ya

que no es posible llegar a una conclusión taxativa acerca del peso de esta vía en líneas células neuronales, es por esto que se decidió incluirla, pero dependiendo de los resultados esta podría omitirse posteriormente. A continuación se presenta la ecuación

general que caracteriza esta vía, en la que participan 4 enzimas:

El siguiente paso en el metabolismo central, a partir del piruvato, consiste en la primera vía cíclica conocida como TCA o ciclo de Krebs, cuyo último objetivo es

producir una gran cantidad de ATP. En organismos aeróbicos, la glucosa, ácidos grasos y la mayoría de los aminoácidos son finalmente oxidados a CO2 y H2O a través del TCA

y la cadena respiratoria de electrones. Antes de entrar al ciclo, los esqueletos de carbón de los azúcares y los ácidos grasos son degradados al grupo acetilo del acetil-CoA; esta forma activada es la que el ciclo acepta como entrada, los carbonos de varios

aminoácidos también entran al ciclo de esta manera, aunque algunos son degradados a otros intermediarios del ciclo.

El TCA es prácticamente la única vía del catabolismo central universal; en ella la

mayor parte de la energía de oxidación es temporalmente almacenada por los

portadores de electrones FADH2 y NADH; durante el metabolismo aeróbico, los electrones son transferidos al oxígeno y la energía producida por el flujo de electrones

es finalmente retenida como ATP [22]. El complejo de enzimas piruvato deshidrogenasa oxida el piruvato a acetil-CoA, luego

el acetil-CoA es transformado a oxaloacetato luego de una serie de 7 reacciones secuenciales incluyendo dos descarboxilaciones junto a la liberación de dos moléculas

de CO2. Esta vía es cíclica debido a que sus intermediarios no se gastan, por cada oxaloacetato consumido por la vía, uno es producido. Además cabe notar que por cada

a ir o

a o

a o

16

molécula de acetil-CoA oxidada por el ciclo se generan 3 moléculas de NADH, una de FADH2 y un nucleosido trifosfato (ATP o GTP).

Por la importancia que tiene el neurotransmisor glutamato en el circuito nigroestriatal y a través de todo el cerebro, se ha determinando teóricamente y

corroborado en la práctica (mediciones antiguas en los niveles de glutamina de esta línea indican que la formación de glutamina no es una vía metabólica a considerar) que las reacciones que podrían llevar a cabo en este tipo de células son principalmente dos:

la formación de glutamato catalizada por la enzima glutaminasa con la posterior formación de amonio y la transaminación del alfaketoglutarato, catalizada por la enzima

glutamato dehidrogenasa que produce glutamato y H2O, a partir de alfaketoglutarato y amonio.

Finalmente y debido a que esta línea celular en particular ha demostrado producción de TH (Paris, et al 2005 [23]) se estudiaron las vías metabólicas donde se

encuentra el neurotransmisor dopamina. La dopamina pertenece al grupo de neurotransmisores denominados aminas biogénicas que incluye a las catecolaminas (dopamina, noradrenalina y adrenalina), la serotonina y la histamina. Las catecolaminas

son todas sintetizadas a partir del aminoácido tirosina. Existe una vía metabólica común formada por 5 enzimas: (1) tirosina hidroxilasa (TH), (2) decarboxilasa de aminoácidos

aromáticos, (3) dopamina beta – hidroxilasa, (4) pteridina reductasa, (5) feniletanolamina- N- metil transferasa.

La enzima TH convierte tirosina en L- DOPA y está presente en todas las células que producen catecolaminas. La enzima (2) decarboxila L-DOPA y genera dopamina, la

enzima (4) regenera un cofactor necesario para TH [24]. Sin embargo las neuronas dopaminérgicas no expresan las enzimas 3 y 5, por lo que una vez diferenciadas las neuronas de la sustancia nigra no producen adrenalina ni noradrenalina [25]. TH es la

enzima cuya velocidad es limitante en la producción de dopamina en tejido normal [24].

Además, la dopamina puede seguir una vía alternativa a través de un intermediario (dopaquinona, producido por la enzima monofenol monooxigenasa) el cual es transformado en dopacromo, monomero que al unirse genera finalmente el

pigmento melanina [10], también conocido como neuromelanina, el cual presenta un color opaco.

2.1.2. Establecimiento de las ecuaciones estequiométricas

Para establecer qué reacciones de las vías más importantes se analizarían, se procedió a realizar ciertas simplificaciones. En primer lugar se omitió tanto el consumo como la formación de ATP y el del poder reductor, asumiendo que estos se encuentran

en equilibrio, por cada uno que se utiliza uno se forma y así sucesivamente. El H2O y el O2 también se sacaron de las ecuaciones estequiométricas debido a que siempre se

considerarán presentes y en exceso de acuerdo a las condiciones en que se encuentra el cultivo.

17

Por último, se procedió a escribir las ecuaciones estequiométricas de cada vía de manera que estas quedaran representadas lo más simplificadamente posible, es decir considerando el primer y último componente de una serie de reacciones, entre los

cuales no haya una ramificación. A modo de ejemplo, la vía de la glicólisis fue simplificada de 10 ecuaciones a sólo 2. El signo de la reacción se asume que lo darán

los resultados, por lo que así se evita el problema en casos donde no se p uede determinar a priori hacia donde va el signo de la reacción, es decir se asume un signo y luego se comprobará si estaba bien asumido o no, en casos que se desconocen.

Cabe hacer notar que la red simplificada de reacciones que se obtuvo, se

escogió realizando un compromiso entre la mejor representación de los aspectos básicos del metabolismo central y la cantidad de reacciones que provean información útil y manejable para el estudio del sistema metabólico.

Finalmente se obtuvieron 35 reacciones en las que participan 38 compuestos

para describir el sistema con lo que se generó una matriz estequiométrica de (38x35). Cada vector reacción tiene 38 filas y el vector resultante de las velocidades específicas tendrá una magnitud de 1x35. Además, realizando un análisis de la composición de la

matriz se determinó que esta tiene 19 grados de libertad y 24 flujos metabólicos que pueden ser determinados experimentalmente, por lo que el sistema se encuentra

sobredeterminado y el método de resolución conveniente a aplicar es el de mínimos cuadrados (ver Apéndice Nº 2).

2.1.3. Establecimiento de balances auxiliares

Una herramienta más para asegurar la consistencia de los datos del sistema, es

el uso de balances auxiliares, su función es análoga a los sistemas de instrumentación de procesos, donde las variables principales son medidas por más de un sensor. En

MFA se realizan balances globales elementales, de calor u otras restricciones para validar los datos obtenidos de los flujos internos.

En el caso particular de células animales, estos balances generalmente se limitan al balance de los elementos carbono y nitrógeno, puesto que oxigeno e

hidrogeno son difíciles de manejar ya que se encuentran comprometidos en la producción de energía además de formar parte de compuestos. El balance de calor del sistema queda descartado por falta de mayor información [19].

Así realizando los balances de carbono por ejemplo, de cada una de las

reacciones del sistema que lo incluyan (todas en este caso), se puede comprobar que todo el carbono que entra como nutriente debe coincidir con el que sale en biomasa y producto extracelular.

2.1.4. Establecimiento de la ecuación de síntesis de biomasa

La ecuación de biomasa es uno de los temas más controversiales y complicados

de la aplicación de MFA, debido a que se necesita conocer la composición elemental de

18

la célula para establecer la ecuación de síntesis. Existen varios enfoques para desarrollar la ecuación de biomasa los que en general requieren de cierto conocimiento de la composición celular en términos de C, N, O, H o fracción de lípidos, proteínas,

ácidos nucleicos y polisacáridos [19].

Un enfoque simplificado utiliza la composición aminoacídica de algunas proteínas y la composición de ácidos nucleicos, para desarrollar coeficientes estequiométricos para varios aminoácidos de la ecuación de biomasa. Los demás coeficientes se derivan

balanceando las ecuaciones en carbono y nitrógeno [19].

Un enfoque general para abordar la generación de la ecuación de biomasa es combinar las principales reacciones de síntesis de los componentes celulares, agrupadas en una sola ecuación. Como precursor de biomasa, la glucosa es requerida

para la síntesis de lípidos, ribosas y deoxyribosas; los aminoácidos son necesarios para formar proteínas y compuestos de interés, así también algunos aminoácidos son

usados en la síntesis de nucleótidos. Todos estos eventos metabólicos son agrupados en una ecuación general, en la

que se representa el balance de carbono y nitrógeno para la formación de biomasa a partir de glucosa, glutamina, entre otros aminoácidos, y que tiene la siguiente forma

[19]:

a C6H12O6 + b C5H10N2O3 + ∑ c i Cw iHxiNyiOzi → CHαNβOγ (Ec. Nº 3)

Donde C6H12O6, C5H10N2O3, and CHαNβOγ son las fórmulas químicas de glucosa, glutamina y masa celular respectivamente. La expresión c i Cw iHxiNyiOzi denota la contribución de cada aminoácido a la síntesis de biomasa.

El coeficiente estequiométrico, ci, para cada aminoácido es la suma de sus

contribuciones a las proteínas celulares y nucleótidos [19].

Este último es un método bastante usado, sin embargo la composición elemental

de las células de la línea celular RCSN-3 no se conoce y es demasiado caro enviar a determinarlo, por lo que se hará una aproximación utilizando la ecuación de biomasa de

otra línea celular, asumiendo que poseen ciertos aspectos en común.

C6H12O6(glucosa)+0.15C6H12.36N1.50O2.08(xw aa)+0.34C5H12N2O2(glutamina)+1.39O2

2.37CH1.97N0,26O0.49(biomasa)+1.28H2O+1.44C3H6O3(lactato)+0.16NH3

+0.13C4HNO2(al aire)

(Ec. Nº 4: Ecuación para el crecimiento de hybridoma [19])

19

2.1.5. Obtención de Valores Experimentales de Velocidades Específicas

Para calcular el valor de la velocidad específica de consumo de alguno de los aminoácidos presentes en el medio de cultivo (qaa), se aplica la siguiente expresión:

dt

dq

X

1q aa

aa (Ec. Nº 5)

donde X es la concentración de células viables y qaa tiene unidades de mmol de

aminoácido/cell*hr. Para obtener el valor experimental se realiza un perfil de concentración del aminoácido versus tiempo, durante todo el período del cultivo y luego

se aplican métodos numéricos para la obtención de los valores de la expresión (Ec. Nº 5) a partir de la curva obtenida.

Para la obtención de las velocidades específicas de consumo de glucosa y formación de lactato, se aplican las siguientes expresiones, las que también se obtienen

numéricamente a partir del perfi l respectivo:

dt

dq

X

1q

gluc

gluc para glucosa y dt

dq

X

1q lac

lac para lactato.

La cuantificación de las muestras para la obtención de los perfiles de consumo

de glucosa y producción de lactato se realiza mediante el uso de kits colorimétricos, que hacen uso de espectrofotometría para determinar los valores (ver Apéndices Nº 4 y 5). Para la obtención de la velocidad de producción de ión amonio, se puede realizar el

mismo protocolo y se aplica una expresión análoga a la de producción de lactato .

La velocidad específica de CO2 en la mayoría de las investigaciones es muy

difícil de obtener, puesto que este se encuentra tanto en la fase líquida como en la fase gaseosa del cultivo. Sin embargo, debido a que la relación CO2/O2 a nivel celular es

usualmente cercana a 1, una estimación de este valor puede ser el uso de la velocidad específica de consumo de O2, valor que se encuentra generalmente dentro de un rango conocido. Así el valor teórico usado en este trabajo será de 4,3* 10-1 mmol/109

células/hora [19].

Para obtener el valor de la velocidad específica de crecimiento (µ), se realiza la curva de crecimiento (concentración celular versus tiempo), para lo que se cuantifican las células mediante el uso de cámara de Neubahuer y se aplica la expresión:

Xdt

dX o bien

dt

dX

X

1, donde X es la concentración de células viables.

2.1.6. Solución y Visualización

Para la obtención de los flujos internos a partir del sistema de ecuaciones

lineales se usó una hoja de trabajo o templado Excel, desarrollado en el año 2002 por

20

Jong-chan Lee y Wei-Shou Hu, de la Universidad de Minessota, que proporciona los algoritmos para la resolución y visualización de un MFA, sin la necesidad de recurrir a otros programas como Matemática para obtener la solución de mínimos cuadrados. Los

datos necesarios a insertar en el templado son las velocidades especificas de consumo de nutrientes, producción de metabolitos y biomasa, además de la matriz

estequiométrica. Este templado permite la modificación de la ecuación de biomasa y de los datos de entrada [19].

2.2. Métodos de Trabajo de Laboratorio con Línea Celular RCSN3

El trabajo con la línea celular RCSN-3 fue desarrollado en las instalaciones del

laboratorio de cultivo de células animales del Centro de Ingeniería Bioquímica y

Biotecnología, el cual cuenta con los siguientes equipos para el trabajo con células animales: cámara de flujo laminar, incubadora húmeda con control de atmósfera de CO2, centrifuga de ángulo libre IEC Centra MP-4 con rotor 224, microscopio invertido de

contraste de fase, Olympus CK-2, bomba peristáltica, entre otros.

2.2.1. Aspectos Generales del Trabajo con Células Animales

Debido a las características propias de las células animales (como su lento

crecimiento en relación a microorganismos), estas se encuentran muy propensas a la contaminación por bacterias, levaduras u hongos, los que al crecer más rápido pueden causar la depleción de nutrientes, o la muerte de las células en casos de toxicidad. Es

por esto que el trabajo con células se debe realizar con materiales estéri les, los cuales corresponden a materiales plásticos estériles (pipetas, placas microbiológicas, tubos de

15 y 50 ml desechables, etc.), y a material de vidrio que es esterilizado en autoclave (tubos de ensayo, botellas, vasos, botella con agitador magnético, etc.). Además es necesario tomar estrictas medidas de higiene y asepsia, tanto personales (uso de

delantal, guantes quirúrgicos o lavado de manos con agentes desinfectantes, pelo tomado, etc.) como en el lugar de trabajo.

Por esta razón todo el trabajo con células es realizado principalmente dentro de

la cámara de flujo laminar, la que primero debe ser limpiada, para luego asegurar su

asepsia mediante el uso de radiación UV, ventilador y mechero durante media hora antes de trabajar, luego se apaga la luz UV y se introducen todos los materiales y

reactivos que se utilizarán y se dejan por 15 minutos antes de comenzar a trabajar. Todo el material que se contacte directamente con las células debe ser pasado por mechero previamente para asegurar su esterilidad.

2.2.2. Métodos de Cultivo Estático de la Línea Celular RCSN-3

A continuación se presentan las técnicas más utilizadas en el laboratorio de cultivo de células animales, donde usualmente se suele mantener, además de las

experiencias que se estén llevando a cabo, un par de placas en condiciones estándar

21

(alto porcentaje de suero), las que se van manteniendo continuamente, a modo de seguridad en caso de contaminación de los experimentos; cabe señalar que una descripción más detallada de las soluciones utilizadas en cultivo de células, se

encuentran en el Apéndice Nº 6.

Descongelamiento: Se descongela una muestra, agitando constantemente dentro de un recipiente con agua a 37ºC, se limpia el tubo con etanol al 75% y se distribuye homogéneamente sobre una placa que contenga medio de cultivo completo (Ver

Apéndice Nº6). Luego de 24 hrs. se cambia el medio si es necesario para diluir aún más el contenido de DMSO. Este procedimiento proporciona un porcentaje de viabilidad

bastante alto (sobre un 90%), si las células han sido almacenadas en forma correcta.

Cambio de medio de cultivo: En primer lugar se debe retirar el medio gastado, lo

cual se realiza usando una pipeta Pasteur unida mediante una manguera a una bomba peristáltica. Luego se lavan las células con solución salina isotónica, la que es aplicada

en gotas que deben distribuirse homogéneamente por toda la placa, inclinándola levemente de manera de arrastrar los desechos celulares, luego se aspira la solución salina por la parte inferior de la placa, (este procedimiento se repite 2 veces). A

continuación se adiciona el medio fresco, inclinando la placa e introduciéndolo por la parte inferior lentamente. Este procedimiento se realiza cada 2 o 3 días o una vez que

el medio se torne amarillo (chequear diariamente).

Subcultivo: Una vez alcanzada la confluencia es necesario diluir las células en

dos o más placas, para no inhibir el crecimiento por contacto. Para esto se retira el medio gastado, se lavan las células 3 veces con solución salina y luego se aplica

solución de tripsina-EDTA para recuperar las células de la placa (1 ml para placas de 10 cm), se esparce por toda la placa y luego se aspira dejando una fina capa, se incuba por unos segundos a temperatura ambiente. A continuación se determina si se han

despegado las células por observación y se resuspende el contenido de la placa en medio de cultivo (5 ml de medio para una placa de 100 mm). El medio con células se

centrifuga en tubos de 10 o 15 ml por 10 minutos a 7000 rpm, se descarta el sobrenadante y el pellet se resuspende suavemente en 2 ml de medio fresco, con los que pueden ser inoculadas nuevas placas (se puede inocular las nuevas placas en

configuración 1:2, 1:4 etc., es decir, a partir de una placa confluente se inoculan 2, 4, etc. placas de igual superficie a la original. Generalmente se usa la configuración 1:3.

Ensayo de viabilidad celular: Para realizar este ensayo, se realiza el mismo

procedimiento anterior, una vez que se tiene el pellet se resuspende en 200 l de medio

y se mezcla suavemente con 40 l de solución azul tripán, se toma una muestra de

20 l y se llena la cámara de Neubauer por capilaridad. Para realizar el conteo se pone

la cámara bajo el objetivo 10X del microscopio de contraste de fase. Las células

muertas incorporan el colorante azulado, ya que su membrana se presenta con deterioro, de esta manera se pueden diferenciar las células vivas (membrana se ve brillante) de las muertas opacas y azules.

Criopreservación de células: Este procedimiento es análogo al de subcultivo, con

la única diferencia que al momento de resuspender el pellet con células, se utiliza 1 ml de solución de criopreservación, se coloca en tubos de 1,5 ml y estos se introducen en

22

un recipiente con isopropanol, para congelar a una velocidad constante (-1ºC/min), que se coloca directamente en un congelador a -80 ºC.

2.2.2.1. Adaptación de Células a Bajo Contenido de Suero

En primer lugar uno de los objetivos pendientes que presentaba el cultivo de esta línea era acondicionarla a bajo contenido de suero manteniendo una velocidad de

crecimiento razonable. El problema del uso de suero en MFA es muy importante, ya que esta metodología requiere ingresar información lo más definida al sistema con respecto a los requerimientos nutricionales de la célula. El objetivo de esta etapa es lograr

cultivar las células con niveles mínimos de suero (1% o 2%) en el menor tiempo posible.

Para esto se procedió a bajar el porcentaje de suero utilizando un procedimiento estándar, el cual comenzó bajando el contenido de suero fetal bovino de 20% a 5%. Para esto se esperaron dos pasadas antes de bajar el porcentaje de suero fetal bovino

a la mitad del que se estaba usando hasta llegar a un 5%. Luego se realizaron las primeras pruebas a bajo contenido de suero, probando dos combinaciones de tres

suplementos que son reconocidos ampliamente por su eficacia para sustentar el crecimiento de células con bajo contenido de suero, estos son: Albúmina de suero bovino, insulina y emulsión de intralípidos.

La proteína albúmina es uno de los mayores componentes del suero y

proporciona de varias funciones al medio de cultivo, tales como ser un buen buffer frente a cambios de pH, transporta hormonas, factores de crecimiento, una variedad de lípidos, vitaminas lipofílicas, minerales, etc., regula la presión osmótica y protege a las

células frente a daño mecánico.

La insulina es un suplemento general utilizado en medios libres de suero, es una hormona que se puede utilizar en la mayoría de las células, a pesar de que existen algunas que no la necesitan. Como se explicó en el capítulo uno, el uso de una fuente

exógena de lípido es beneficioso para cultivar células in vitro para evitar el gasto energético que se necesita para producirlos en gran cantidad y así poder suplir la

demanda de membrana celular en células de rápida división. 2.2.3. Métodos para el cultivo de la línea celular RCSN en suspensión

Una vez adaptadas las células a bajo contenido de suero, se procedió a su

cultivo de manera más eficiente, es decir de manera de incrementar la superficie

disponible para el crecimiento de las células en relación al medio de cultivo y al volumen total del cultivo. Para esto se optó por utilizar un sistema de microcarriers, que

permite la propagación de células dependiente a anclaje presentando las mismas ventajas que un cultivo de células en suspensión; por su parte el cultivo agitado permite mantener condiciones homogéneas lo que facilita el control del proceso.

23

Los sistemas de microcarriers permiten obtener las razones más altas de área superficial versus volumen. A modo de ejemplo un litro de cultivo de microcarriers puede reemplazar a aproximadamente 300 placas de cultivo de 63 cm2 cada una. Los

sistemas de microcarriers ofrecen superficies disponibles para el crecimiento entre células de 4.000 a 7.000 cm2 por gramo, obteniendo en líneas celulares comerciales

densidades celulares que pueden alcanzar los 3.0×109 células por gramo de microcarriers, al cabo de 8 días de cultivo [26].

Existen diversas alternativas para obtener mayor cantidad de células en cultivo. De acuerdo con Griffiths (1994) [14] los sistemas más adecuados para el uso de

microcarriers porosos son los cultivos agitados, por ejemplo haciendo uso de Spiner Flasks (botellas con agitador magnético) o un biorreactor.

En cuanto a su factibilidad económica, es sabido que estos involucran una reducción significativa de los costos. Esto último fue comprobado previamente en una

investigación relacionada [10] para la situación hipotética de producción de células RCSN-3 para su uso como material de transplante, donde se realiza un análisis comparativo de tres de los métodos más usados para el crecimiento de células

animales en alta densidad.

Para el cultivo de células en suspensión de microcarriers, se utilizaron microcarriers macroporosos CultiSpher-S (Hyclone Inc.), los que están formados por una matriz altamente entrelazada de gelatina; gracias a esto pueden ser fácilmente

degradados por enzimas tales como tripsina y dispasa, con las cuales se obtienen altos rendimientos de recuperación de células. Estos microcarriers poseen una mayor

estabilidad térmica y mecánica, lo que permite su autoclavaje.

Los microcarriers CultiSpher-S deben ser preparados antes de su uso,

hidratándolos en solución salina (Ver Apéndice Nº 6) durante una hora a temperatura ambiente, luego deben ser esterilizados en autoclave por una hora, para posteriormente

ser lavados con solución salina estéril, para finalmente ser almacenados a 4ºC en medio de cultivo.

Para establecer este cultivo en suspensión, se utilizó una botella Wheaton de 100 ml con agitador magnético suspendido (Spinner Flask) con un volumen de trabajo

de 65 ml, el cual debe ser previamente siliconizado y esterilizado. Este se mantiene en incubadora a 37 ºC con una atmósfera con 5% de CO2, puesto sobre un agitador magnético a pilas. Las células inoculadas provienen del segundo pasaje a bajo

porcentaje de suero (pasaje 8 de viales en stock). El protocolo usado para instalar este sistema (Ver Apéndice Nº 7), se obtuvo a través de la aplicación del método sugerido

por el fabricante, el cual se fue depurando a través de modificaciones realizadas tomando en cuenta las características particulares del sistema y a través de conocimientos específicos de esta línea, que se fueron aprendiendo en forma práctica.

24

CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A continuación, en las páginas siguientes, se presentan los resultados para las distintas condiciones de experimentación en laboratorio, así como las conclusiones que

pueden extraerse de las situaciones experimentales expuestas en los cuadros y figuras que se presentan en los párrafos que más adelante se exponen.

3.1. Caracterización del Crecimiento de la Línea RCSN-3 en Cultivo Estático a 10%

de Suero.

Para caracterizar el crecimiento en forma cuantitativa de la línea celular RCSN-3 en condiciones de cultivo estático batch, se realizó la siguiente curva de crecimiento en

las condiciones estándares en que se cultiva está línea, es decir, a 10% de suero, inoculando 12 T-flasks de 25 cm2 a partir de dos placas microbiológicas de 10 mm confluentes, los valores corresponden al promedio de dos mediciones realizadas

diariamente.

Cell Concentration and Viability

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 20 40 60 80 100 120 140

Time (hrs)

Cell

co

nc

. (x

10

5 c

ell

s/c

m2)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Via

bil

ity

(%

)

VIABLE CELL CONC. Xv (x105 cells/cm2) VIABILITY (%)

Gráfico Nº 1: Curva de crecimiento de células RCSN-3 en cultivo estático

con 10% de suero

Como se aprecia en la curva, el inóculo se adhirió eficientemente a la superficie y

el crecimiento comienza al cabo de un par de horas, aunque lento debido a que se

encuentran en baja concentración. La duración de la etapa de crecimiento es corta y la de plateau muy larga, es decir las células crecen rápido ( µ = 0,0195 hr-1 y Td =9,57

hrs), además una vez propagadas se encuentran fuertemente adheridas a la superficie lo que hace que resistan más tiempo, aún con menor concentración de nutrientes, luego de un tiempo aproximado de 100 horas de iniciada la fase plateau comienza el período

de apoptosis por inhibición por contacto y por escasez de nutrientes, esta parte de la curva no se logra apreciar, sin embargo se puede tener una idea al observar que en el

gráfico la viabilidad se mantiene alta durante el tiempo registrado. Para poder

25

cuantificar de manera más precisa estas etapas habría sido necesario realizar el experimento con un mayor número de T-flasks, sin embargo no fue posible realizar tal experimento, por lo que se decidió caracterizar sólo la primera parte de la curva.

A continuación se presentan las curvas características del consumo y formación

de glucosa y lactato, respectivamente asociados a la curva anterior.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 20 40 60 80 100 120 140

Time (hrs)

Glu

co

se C

on

c. (m

M)

Gráfico Nº 2: Perfil de consumo de glucosa para curva de crecimiento estático con 10% de suero

y = -0,0008x2 + 0,1677x + 1,9857

R2 = 0,7145

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120

Time (hrs)

Co

ncen

trati

on

(m

M)

Gráfico Nº 3: Perfil de producción de lactato para curva de crecimiento

Estático con 10% de suero

26

Las curvas obtenidas son similares a las del cultivo de la línea en condiciones normales en años anteriores; la curva de lactato generalmente tiene la forma de una campana de Gauss, sin embargo debido a la dispersión de los datos y a que no se

realizó la curva completamente esto se aprecia sólo levemente. El radio estequiométrico acumulativo de lactato (mmol)/ glucosa/mmol) resultó aproximadamente 2, de lo que se

deduce que la célula cumple de manera normal sus objetivos metabólicos, sin tener una eficiencia adicional, puesto que el cultivo presenta altas concentraciones de nutrientes que son bien aprovechados por las células de rápida división. A continuación se

presenta una tabla resumen con las características de crecimiento de este cultivo:

Tabla Nº 2: Parámetros de crecimiento de RCSN-3 en cultivo estático a 10% de suero.

Es necesario mencionar que el trabajo en laboratorio tuvo dificultad en su partida,

la que se debió posponer durante un mes, debido a que el stock de células a -80ºC estaba descompuesto (aproximadamente 30 crioviales de 2 ml) y las células

provenientes del tanque de nitrógeno líquido, se encontraban débiles y en muy baja concentración. Finalmente luego de un mes y haciendo uso de éstas últimas se logró obtener material suficiente para comenzar a realizar las experiencias programadas.

El problema que presentaron los viales a -80ºC no concordaba con los problemas

más comunes de descongelamiento de células, puesto que este proceso era realizado en completa normalidad. El problema se presentaba en la etapa posterior, ya que las células no se adherían a la superficie de las placas de uso habitual; así se testearon

alrededor de 5 crioviales tomados de fechas al azar y se probaron en superficies de vidrio y plástica y aún así no se adherían por lo que no se propagaban y finalmente

morían. Esta situación nunca antes había ocurrido en este laboratorio, sin embargo es un problema que se ha podido apreciar en otros laboratorios que usan este tipo de líneas. Se intentó determinar las causas de este evento, sin embargo no fue posible de

determinar, aún consultando a profesores de vasta experiencia en el área y con la línea celular.

PARÁMETRO Cultivo RCSN-3 suplementado con 10% de

suero

µ máx (hr-1) 0,072

Td (hrs) 9,57

Dens máx (Xv/cm2) 1,7*105

Duración aprox. de la etapa de crecimiento (hr)

50

Q gluc mmol/cell*106*hr -1,83

Q lac mmol/cell*106*hr 8,02

Lactato/ Glucosa (mmol/mmo) 1,9295

Yx,s mgcell/mg glucosa 49,4*10-4

27

3.2. Resultados de la Adaptación de Células a Bajo Contenido de Suero

La adaptación de las células a bajo contenido de suero procedió durante un mes. A la mitad de la tercera semana (en el sexto pasaje)se realizaron pruebas en duplicado,

combinando los suplementos antes mencionados y se bajó el suero al mínimo (entre 0 y 1), se probaron 3 condiciones, las que se denominaron con las letras, M, A y B, las que se muestran en la Tabla Nº 2, además se consideró un control con placas originales a

5% de suero, a las que no se les bajó el porcentaje de suero sino que se las continuó cultivando normalmente. El control se realizó a 5%, debido a que era de esperar que si

había crecimiento, este sería bastante lento y morfológicamente las células a 5% son muy similares a las de 10 % de suero, y la única diferencia radica en su velocidad de crecimiento que a 10 % es más rápida.

Tabla Nº 3: Condiciones experimentales testeadas para la adaptación de las células a

bajo porcentaje de suero

CONDICIÓN

SUPLEMENTOS

M A B C

% Suero 0 1 1 5

BSA 40 mg/L 40 mg/L 40 mg/L –

Intralípido 10 μl emulsión

al 20%

10 μl emulsión

al 20%

10 μl emulsión

al 20%

–

Insulina 2 mg/L 2 mg/L – –

La manera más rápida de determinar el efecto de un cambio en el medio de cultivo en las células, es realizar un análisis cualitativo, el cual se hizo a través de observación en microscopio de contraste de fase. Las variables observadas fueron

viabilidad, morfología y rapidez de división, lo cual se determinó apreciando cuanto tardaban en llegar a confluencia y a la cantidad relativa de células que se encontraban

realizando mitosis, lo que a simple vista puede constatarse al ver la cantidad de células que se encuentran en la última etapa de división (es decir en forma de círculos pequeños y muy brillantes).

A las 24 horas de inoculadas las placas se obtuvieron los primeros resultados,

como se aprecia en la Figura Nº 2, las células en ausencia de suero presentan viabilidad despreciable, debido a que la mayoría queda flotando en forma de debris celular y muy pocas (menos de 100) se adhieren a la placa.

Las células en condiciones A y B presentaron menor viabilidad que el control (un

40% menos de viabilidad), hay mayor cantidad de debris y se adhiere un menor número, su morfología es acorde a células normales luego de 24 horas.

A partir de las 48 horas se puede apreciar propagación celular en todas las placas excepto en la condición M, no existiendo diferencias apreciables entre las

condiciones A y B, las que sin embargo crecen más lentamente que el control, puesto

28

que éstas últimas ya se encuentran prácticamente en confluencia. Morfológicamente la característica principal que presentan las células cuando se reduce el contenido de suero, es su disminución en la uniformidad en la membrana celular , lo que las hace ver

difusas. Esta diferencia ya se puede apreciar al bajar de 10% a 5% el suero y más dramáticamente se aprecia al bajar a 1%, además presentan menor tamaño y forman

menos matriz que el control.

Figura Nº2: Células RCSN en ausencia de suero a las 24 horas de inoculadas.

Figura Nº 3: a) células propagándose a 1% de suero con suplementos (A), b) células

propagándose a 1% de suero con suplementos pero sin insulina (B)

a) b)

29

Figura Nº 4: Células en confluencia a 5% de suero sin suplementos

Finalmente tomó el doble de tiempo que las células cultivadas a 1% de suero llegaran a confluencia. A continuación se presenta una figura donde se puede apreciar mejor la diferencia en porcentaje de mitosis, entre la primera condición a 1% de suero y

la segunda a 5% de suero.

Figura Nº 5: a) células creciendo a 1% de suero más suplementos, b) células creciendo a 5% de suero sin suplementos.

a) b)

30

En la segunda (b) a pesar del hecho de estar a una menor escala se aprecia

mayor cantidad de células en mitosis, además si se hace un acercamiento sobre la foto

se aprecia que las células a 1% presentan su membrana más difusas y gránulos al interior y al exterior de la células. Se ha planteado anteriormente que estos gránulos

que aparecen en la línea celular corresponden a presencia de dopamina [10]. Otro aspecto que cabe destacar es que el patrón de crecimiento de las células a 1% de suero no es homogéneo, es decir a 5% se inoculan uniformemente y estás se adhieren

formando colonias a su alrededor las que finalmente tienden a juntarse entre sí, hasta poder llenar toda la placa, todas creciendo al mismo ritmo.

Sin embargo las células a 1% inoculadas de la misma manera no lo hacen así,

puesto que cada célula se adapta de diferente manera a las nuevas condiciones,

generando diferencias en la concentración de células por cm2 a lo largo de la placa.

Al finalizar el estudio de adaptación de células a bajo contenido de suero, se consideró que estas toman demasiado tiempo para propagarse, por lo que se decidió aumentar la concentración de suero al 2%, lo que aumentó la rapidez de propagación sin cambiar

mayormente las demás características de comportamiento de la línea a 1% de suero, además se optó por propagarlas usando la mezcla A de suplementos para los

experimentos posteriores. 3.3. Caracterización del Crecimiento de la Línea RCSN-3 en Cultivo Estático a 2% de Suero

Para caracterizar el crecimiento en forma cuantitativa de la línea celular RCSN-3 en condiciones de cultivo estático batch, se procedió a realizar una curva de

crecimiento, inoculando 12 T-flasks de 25 cm2 a partir de dos placas microbiológicas de 10 mm semiconfluentes, sin embargo no se obtuvieron datos representativos, puesto

que además de presentar un bajo inóculo, hubo una disminución inicial del número de células adheridas con respecto del número de células inoculadas, ya que las células no se encuentran con los requerimientos de crecimiento óptimo, por lo que algunas no

logran adherirse. El inóculo utilizado fue de 8x103 cell/cm2. Esta experiencia se repitió, sin embargo esta vez se subestimó el inóculo, lo que resultó en un inóculo final por

placa de 4x104 cells/cm2, con lo que éstas llenaron la poca superficie libre que quedó tras el inóculo muy rápidamente, sin lograrse obtener una curva completa de crecimiento.

Por lo que se ha apreciado y cuantificado en otras ocasiones de trabajo con la

línea, especialmente durante los pasajes, el tiempo de duplicación es aproximadamente de 27 horas, lo que se obtiene aplicando la expresión de la velocidad específica de crecimiento entre dos puntos, correspondientes a dos etapas de subcultivo

consecutivas y dividiendo por el tiempo transcurrido entre ambas. Además se ha observado que la etapa de plateau es relativamente corta, y es necesario estar

suministrando medio fresco con la misma frecuencia que el cultivo de células en condiciones normales a 10% de suero, para retrazar lo más posible la etapa de decaimiento, a la cual estas células están muy propensas, debido a que forman poca

31

matriz lo que es un impedimento adicional a los factores de adherencia para solucionar el problema de adhesión.

Sin embargo claramente se puede apreciar que la eficiencia metabólica del cultivo a 2% es deficiente, pero puede ser mejorada, en el caso del tiempo de

duplicación, considerando la velocidad habitual, este es sólo tres veces mayor, lo que hace que de todas maneras sea una buena velocidad de propagación para realizar estudios con mayores cantidades de células.

En el caso del trabajo con curvas de crecimiento con distintas velocidades de

crecimiento, es necesario realizar un análisis más exhaustivo del inóculo apropiado de manera que las curvas sean homologables (por ejemplo inocular más células en la curva de 2% para obviar el efecto de el menor porcentaje de adherencia que se

produce), sin embargo no se contó con el tiempo necesario para repetirlas.

A continuación se presenta un ejemplo de curva de consumo de glucosa para un cultivo estático con bajo porcentaje de suero. Para obtener la curva se toman muestras de medio de cultivo diariamente y se congelan para su posterior análisis. Una vez

obtenidas las curvas se realiza una curva del mejor ajuste polinomial, la cual es derivada y evaluada en algún punto en la parte lineal de la pendiente, de manera de

obtener el valor de la velocidad específica correspondiente.

Glucose Concentration

y = -0,0004x2 + 0,0091x + 18,077

R2 = 0,9931

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

0 20 40 60 80 100 120

Time (hrs)

Glu

co

se C

on

c. (m

M)

Gráfico Nº 4: Perfil de consumo de glucosa para curva de crecimiento

con bajo porcentaje de suero.

32

En este caso la derivada resulta:

dy/dx = -0,0008 X+ 0,0091, evaluando a 76 hrs y realizando conversión de unidades la velocidad específica de consumo de glucosa en este caso de ejemplo

resulta -0,015x 104 mmol/cellx106 hr, este cálculo se realiza análogamente para obtener las velocidades específicas que sean necesarias.

3.4. Caracterización del Crecimiento de la Línea RCSN-3 en Cultivo en Suspensión

a 2% de suero

Para obtener los datos necesarios para realizar el análisis de flujos metabólicos

se estableció un sistema de suspensión de microcarriers, para sustentar el crecimiento de la línea celular RCSN-3 con bajo porcentaje de suero en suspensión. Esto se realiza

puesto que, como el cultivo es agitado continuamente, las muestras de medio de cultivo para los análisis posteriores son homogéneas y representativas, además para el conteo de células se saca una muestra de 1 ml de microcarriers que contienen células en su

interior con el sistema en movimiento, por lo que se puede lograr obtener una muestra fiel del estado del cultivo agitado.

A continuación se presenta la curva de crecimiento característico de la línea RCSN-3 con bajo porcentaje de suero en sistema de microcarriers porosos.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120 140

Time (hrs)

Ce

ll c

on

c. (

x1

05 c

ells

/cm

2 )

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Via

bili

ty (

%)

VIABLE CELL CONC. Xv (x105 cells/cm2) VIABILITY (%)

Gráfico Nº 5: Curva de crecimiento de la línea RCSN-3 en suspensión con bajo porcentaje de suero

Para realizar este cultivo se inoculó 3x105 cél/ml, de las cuales 1,3x105 cel/ml. se

adhirieron a los microcarriers; esto pudo tener su origen en que el período de agitación

intermitente para la adherencia de las células no se cumplió a cabalidad. Sin embargo, se obtuvo un crecimiento caracterizado por una velocidad específica igual a 0,023 hrs -1,

lo que corresponde a un tiempo de duplicación de 29,16 hrs. En esta curva se pueden apreciar todas las etapas del crecimiento, teniendo una etapa plateau muy pequeña, lo

33

que en general caracteriza a los cultivos en estas condiciones, según se ha podido observar.

A continuación se presenta el gráfico de consumo de glucosa asociado a este cultivo:

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 20 40 60 80 100 120 140

Time (hrs)

Glu

co

se C

on

c. (m

M)

Gráfico Nº 6: Perfil de consumo de glucosa

El perfil que se muestra más arriba es similar a los obtenidos anteriormente en cultivo estático. A continuación se presenta el perfil de producción de lactato asociado

al cultivo en suspensión. Este muestra una forma característica asociada a este tipo de cultivo, evidenciando una singular baja en la producción a partir de las 96 horas, donde

esta baja se produce por completo, para luego, al día siguiente, comenzar a s ubir nuevamente.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 20 40 60 80 100 120 140

Time (hrs)

Lac

tate

Con

cent

ratio

n (m

M)

Gráfico Nº 7: Perfil de producción de lactato para un cultivo en suspensión

La baja en la producción de lactato puede estar asociada a la detención del

crecimiento, que se aprecia a la misma hora en la curva de crecimiento. Sin embargo, la posterior alza no se ha logrado explicar del todo. Además, en este caso, al igual como se vio en el cultivo estático con bajo suero, la mayor alza en el consumo de glucosa no

34

correlaciona con la correspondiente aumento de producción de lactato, lo que puede ser originado por trastornos metabólicos, como se mencionó anteriormente.

Por su parte, la velocidad de crecimiento de la línea es apropiada, sin embargo se pudo haber obtenido una mayor velocidad si el inóculo se hubiera adherido de una

manera más eficiente. De todas maneras es necesario extender el tiempo de la etapa de crecimiento para obtener un mayor rendimiento en el número de células.

A continuación se presenta un cuadro resumen comparativo entre los cultivos de la línea celular suplementados con 2% y a 10% de suero respectivamente:

Tabla Nº4: Parámetros de crecimiento de RCSN-3 en cultivo agitado a 2% de suero.

3.5. Curva de Calibración Análisis de Aminoácidos

Así, se realizaron cuatro pruebas, uti lizando protocolos similares para obtener la curva estándar de aminoácidos, sin embargo sólo la primera vez se obtuvo un perfil de

aminoácidos, pero el gradiente no fue lo suficientemente largo para obtener una mejor resolución de los picks, ya que algunos aparecen traslapados, por lo que se obtuvieron seis picks en vez de los 18 correspondientes a los 18 aminoácidos a medir.

Perfil de elución para muestra standar de aminoácidos

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tiempo (min)

Ab

s (3

40 n

m)

0

20

40

60

80

100

120

Gráfico Nº 8: Perfil de elución para muestra estándar de aminoácidos

PARÁMETRO Cultivo RCSN-3 suplementado con 2% de

suero

µ máx (hr-1) 0,023

Td (hrs) 29,16

Duración aprox. de la etapa de crecimiento (hr)

96

Q gluc mmol/cell*106*hr -0.0518

Q lac mmol/cell*106*hr 0.0163

Lactato/ Glucosa (mmol/mmol) 1,88

Yx,s mgcell/mg glucosa 2x10-4

35

En las posteriores pruebas, en las que se debía utilizar un gradiente más largo,

para lo que se decidió utilizar el protocolo del Apéndice Nº3, se presentaron problemas

de diversa índole, lo que impidió obtener el perfi l apropiado de los 18 aminoácidos y su cuantificación.

Fue imposible dimensionar a priori la complejidad y las dificultades que

presentaría la aplicación del protocolo de análisis de aminoácidos. Por otra parte, en

una primera instancia, sólo se tenía contemplado realizar la adaptación a bajo porcentaje de suero, como algo secundario. Sin embargo, al transcurrir la investigación

se concluyó que esta etapa es ineludible para encontrar resultados coherentes. El tiempo que tomó comenzar el trabajo con la línea celular, adaptar estas células a bajo porcentaje de suero y posteriormente expandirlas a un número tal que pudiera sustentar

cultivos en suspensión, consumieron más tiempo del planificado, el que se podría haber utilizado en perfeccionar el protocolo de medición de aminoácidos, el cual cumple un rol

vital en esta primera etapa del análisis del metabolismo de esta línea celular.

3.6 Resultados MFA

A continuación se presentan las vías metabólicas de las reacciones seleccionadas que conforman esta red metabólica modelo. Cabe señalar que esta red

no describe completamente el metabolismo central de las células en cuestión, sino que se basa en los criterios antes señalados para su selección:

Glicólisis

1.GLUC + ATP => GLUC6P + ADP 2.GLUC6P =>2 PYR + ATP

3. PYR => LAC Ciclo del ácido cítrico

4.PYR + NAD+ + CoA => AcCoAmit + NADH + CO2

5.AcCoAmit + OAC => AKG + NADPH + CO

6.AKG + CoA + NAD+ => SUCCoA + NADH + CO2

7.SUCCoA + ADP =>FUM + FADH2

8.FUM + H2O <=> MAL

9.MAL + NAD+ => OAC + NADH

36

Glutamina

10. GLN=> GLUT

11.GLUT + NAD + H2O <=> AKG + NADH + NH4

12. MAL <=> PYR + NH4

Aminoácidos

De los aminoácidos no esenciales se consideran 2, puesto que son los que se encuentran en menor cantidad en el medio de cultivo usado, Alanina, Asparagina. En

algunos estudios se considera sólo la reacción correspondiente a la generación de alanina.

13. PYR + GLUT <=> ALA + AKG

14.ASP + NH4+ 2ATP <=ASN + 2 ADP

15. ASP + AKG <=> OAC + GLUT Catabolismo de Aminoácidos

16. 2 GLY<=> SER + NH4

17. SER => PYR + NH4 18. CYS <=> PYR + NH4 19. HIS => GLUT + 2NH4 + CO2

20. AKG + ARG + NAD+ =>2 GLUT+ NADH+ 2 NH4 + CO2

21. PRO + ADP => GLUT + ATP 22. PHE => TYR

23. AKG + TYR => 2 AcCOA +FUM + GLUT + CO2

24. AKG + LYS + 4 NAD+=> 2 AcCOA + 2 GLUT + 2 CO2 + 4 NADH

25. AKG + LEU + ATP + NAD+ => 3 AcCOA + GLUT + ADP + NADH 26. MET + SER + AKG =>+ SucCOA + GLUT + CYS

27. THR => SucCOA + NH4 28. VAL + AKG + ATP + 3 NAD+ => SucCOA + GLUT + CO2 + ADP + 3 NADH 29. ILE + AKG => SucCOA + AcCOA + GLUT

Vía dopaminérgica

30. TYR + O2 => LDOPA + H2O 31. LDOPA => DOPA + CO2

37

Vía pentosa fosfato

32. GLUC6P + 2 NADP => RIB5P +2 NADPH + CO2

33. 2 RIB5P => FRUC6P + E4P 34. RIB5P + E4P <=> GAP + FRUC6P

Estas reacciones se muestran en el siguiente mapa metabólico:

38

Figura Nº 6: Mapa metabólico simplificado para la línea celular RCSN-3.

39

Debido a que no se obtuvo la curva de calibración de aminoácidos fue imposible cumplir con los requisitos de entrada para aplicar el método de análisis de flujo. Por lo que no fue posible obtener información de los flujos metabólicos internos de esta línea.

Siendo éste uno de los propósitos del presente trabajo de investigación, es

necesario dejar enunciado, a modo de conclusión, que fue factible obtener información valiosa para el desarrollo de la investigación en que se enmarca este trabajo. Con ello se ha probado que sí es posible obtener cultivos con bajo porcentaje de suero y con

crecimiento en un tiempo razonable para este tipo de células, determinando con ello que el uso de microcarriers es un sistema eficiente, puesto que permite obtener

condiciones homogéneas de cultivo, utilizando una menor área de trabajo.

Además, fue posible establecer una metodología MFA para la línea con el

sistema de reacciones seleccionadas, y esto se puede mostrar utilizando datos ficticios en el lugar de los datos que no se lograron obtener durante el período que duró este

trabajo, pero que sin duda pueden ser obtenidos a posteriori, si se decide continuar con esta investigación y así obtener los flujos metabólicos correspondientes.

Si denominamos r al vector de las velocidades específicas medidas experimentalmente, M a la matriz estequiométrica y v al vector de los flujos metabólicos

desconocidos, se tiene que: M v= r (Ec Nº7)

La solución de mínimos cuadrados para el vector v es la siguiente:

v= [Mt M] -1 Mt r (Ec Nº8), donde Mt M se obtiene una matriz cuadrada.

Entonces, el vector v se obtiene al multplicar la sensibilidad de la solución S =([Mt M] -1 Mt ) pot r.

Así para un ejemplo donde se utilizan valores simulados del vector de

velocidades específicas en [mmol/cellx109 hr], se tiene que r = Mt v :

40

r gluc6p = 0

r AcCoA = 0

r Akg = 0

r ALA= 0,046

r ARG= -0,005

r ASN= -0,0009

r ASP= -0,0002

µ= 0,111

r CO2= 0,43

r CYS= 0

r DOPA= -0,0004

r E4P= 0

r FUM= 0

r FRUC6P= 0

r GAP= -0,127

r GLC= -0,065

r GLN= -0,002

r GLU= -0,0014

r GLY= 0,003

r HIS= 0,003

r ILE= 0,003

r LAC= 0,173

r LDOPA= 0

r LEU= -0,003

r LYS= -0,006

r MAL= 0

r MET= -0,0031

r NH3= 0,047

r OAA= 0

r PHE= 0,0016

r PRO= 0

r PYR= 0

r RIB5P= 0

r SER= -0,0043

r SucCoA= 0

r THR= -0,008

r TYR= 0,002

r VAL= 0,005

V1

V2

V3

V4

V5

V6

V7

V8

V9

V10

V11

V12

V13

V14

V15

V16

V17

V18

V19

V20

V21

V22

V23

V24

V25

V26

V27

V28

V29

V30

V31

V32

V33

V34

V35

T

= =

41

Resolviendo el sistema mediante el templado Excel se obtiene que la solución de mínimos cuadrados para este sistema es:

V1

V2

V3

V4

V5

V6

V7

V8

V9

V10

V11

V12

V13

V14

V15

V16

V17

V18

V19

V20

V21

V22

V23

V24

V25

V26

V27

V28

V29

V30

V31

V32

V33

V34

V35

-0.095667

0.161617

0.171364

0.127093

0.177724

0.188793

0.177295

0.179055

0.181136

-0.00056612

-0.00560175

0.00426258

0.0441649

0.00799257

0.00374842

0.00549558

-0.00122995

0.00199094

0.00318652

0.00968056

-0.000884744

-0.000639273

-0.0174701

0.00222275

0.00656978

0.00002892

0.00394249

0.0114397

0.00647153

-0.00417406

-0.00199218

-0.0923942

-0.00136368

-0.0441516

0.110593

=

42

CAPITULO 4. CONCLUSIONES

Teniendo en cuenta los antecedentes señalados en los capítulos anteriores, podemos inferir que la línea celular creciendo a 2% de suero en medio DMEM/F-12 en

sistemas estáticos, presenta un menor crecimiento en comparación con el cultivo a 10% de suero en el mismo medio en placas microbiológicas, puesto que aún no se encuentran regulados del todo ciertos factores de adherencia y de crecimiento

específico que fueron disminuidos al mínimo, al prácticamente quitarles el suero.

Sin embargo la velocidad de propagación de la línea a 2% de suero en cultivo estático fue mayor que en otro estudio donde creció la línea en similares condiciones pero con otros suplementos (10), para estudios posteriores algunos de los

requerimientos nutricionales a estudiar deberían ser factores de crecimiento y de adherencia, antes de probar factores mitóticos, ya que la velocidad de crecimiento es

buena para una línea celular con las características intrínsecas de ésta.

En cuanto al cultivo de la línea en suspensión con bajo porcentaje de suero, este

fue llevado a cabo exitosamente, obteniéndose una mejor utilización del sustrato que en cultivo estático a 10% de suero, como se esperaba. Este sistema se podría haber

mejorado aún más, si se hubieran logrado obtener los flujos metabólicos que caracterizan al sistema y determinar donde se encuentran las etapas metabólicas limitantes a mejorar, de manera de obtener un medio de cultivo específico para la línea

celular.

Durante el transcurso de este trabajo fue posible establecer una metodología MFA para la línea RCSN-3 con un sistema de reacciones seleccionadas específicamente de acuerdo a sus principales características, sin embargo la ecuación

de producción de biomasa puede ser depurada en estudios posteriores.

43

ABREVIATURAS

1. AC Acetato 2. Ag Plata

3. AcCoAcyt Cytoplasmic AcCoA 4. AND Ácido desoxirribonucleico

5. AKG alfa-ketoglutarate 6. ALA Alanine 7. ARG Arginine

8. ASN Asparagine 9. ASP Aspartate

10. ATP Adenosine-5´-triphosphate 11. cm2 Centímetro cuadrado 12. Co Cobalto

13. CO2 Carbon Dioxide 14. Cu Cobre

15. Cr Cromo 16. CYS Cisteine 17. DMSO Dimetil sulfóxido

18. Eº Estado 19. EDTA Ácido etilendiamino tetracético

20. EGF Ectodernol growth factor 21. E4P Erythrose-4-phosphate 22. FAD Flavine adenine dinucleotide

23. FADH2 Flavine adenine dinucleotide, reduced 24. FRUC6P Fructose-6-Phosphate

25. FUM Fumarate 26. G3P 3-phosphoglycerate 27. GAP Glyceraldeyde-3-phosphate

28. GLUC6P Glucose-6-phosphate 29. GLUC Glucose 30. GLUM Glutamine

31. GLUT Glutamate 32. GLY Glycine

33. HIS Histidine 34. HPLC High performance liquid cromatography 35. ILEU Isoleucine

36. ISOCIT Isocitrate 37. LEU Leucine

38. L-DOPA Levodopa 39. LYS Lysine 40. MAL Malate

41. MCs Microcarriers 42. MET Methionine

43. MFA Análisis de flujos metabólicos 44. mg Milígramo

44

45. mg/L Milígramo por litro 46. mgcell Milígramos de células 47. ml Milílitro

48. mmol Milimol 49. NAD Nicotinamide adenine dinucleotide

50. NADH Nicotinamide adenine dinucleotide reduced 51. NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 52. NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced

53. NH4 Ammonium 54. Ni Níquel

55. O2 Oxygen 56. PHEN Phenylalanine 57. PRO Proline

58. PYR Pyruvate 59. Qgluc Velocidad específica de consumo de glucosa

60. Qlac Velocidad específica de formación de lactato 61. RIB5P Ribose-5-phosphate 62. RIBU5P Ribulose-5-phosphate

63. RNA Ribonucleic Acid 64. rpm Revoluciones por minuto

65. Se Selenio 66. SER Serina 67. Sn Estaño

68. SUC Succinate 69. SUCCoA Succinyl coenzyme A

70. TCA Ciclo de Krebs 71. Td Tiempo de duplicación 72. TH Tirosina hidroxilasa

73. THR Threonine 74. TRYP Tryptophan

75. TYR Tirosine 76. UV Ultravioleta 77. VAL Valine

78. Yx,s Coeficiente de rendimiento de biomasa (Yiel coeficient for biomasa)

79. Zn Zinc

45

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. DOERING L. C. 2001. Components of cell and gene therapy for neurological

disorders. En: KRESINA T. F. (Ed). An introduction to molecular medicine and

gene therapy. EE.UU., Willey-Liss Inc. Pp. 203-233.

2. LAZIC S.E., BARKER R.A. 2003. The future of cell-based transplantation therapies for neurodegenerative disorders. Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. 12 (6): 635-642.

3. BARZILAI A., MELAMED E. 2003. Molecular mechanisms of selective

dopaminergic neuronal death in parkinson´s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (3): 126-132.

4. LINDNER, M., EMERICH, D. F. 1998. Therapeutic potential of a polymer-encapsulated L-Dopa and dopamine-producing cell line in rodent and primate

models of parkinson´s disease. Cell Transplantation. 7: 165-174. 5. KORDOWER J. H. 2003. In vivo gene delivery of glial cell line-derived

neurotrophic factor for parkinson´s disease. Annals of Neurology. 53 ( 3 suppl 1): S120-S134.

6. RASCOL O., PAYOUX P. et al. 2003. Limitations of current parkinson´s

desease therapy. Annals of Neurology. 53 (3 suppl 1): S3-S15.

7. CAVIEDES P. 2001. Chapter 16 The cell in culture. In vitro models for the study

of cell function and transplant therapy. En: Segura-Aguilar J.(Ed). Mechanisms of degeneration and protection of the dopaminergic system. EE.UU., FP Graham Publishing Co. Pp 1-12.

8. VENEGAS, P. C. 2001. Aislamiento de un factor con actividad transformante

para inmortalizar cultivos de células animales. Memoria para optar al Título de

Ingeniero Civil en Biotecnología, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Universidad de Chile. 58p.

9. ARRIAGADA C., SALAZAR J., SHIMAHARA, T., CAVIEDES R., CAVIEDES P.

An inmortalized neuronal cell line derived from the substantia nigra of an adult rat:

application to cell transplant therapy. En: RONKEN E., VAN SHARREMBURG G. J. M. (Eds.). Parkinson´s disease. Holanda, IOS Press. Pp. 120-131.

10. SEPULVEDA D. 2001. Estudio de factores para optimizar el cultivo de células

animales para material de transplante. Memoria para optar al Título de Ingeniero

Civil en Biotecnología, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Universidad de Chile. 46p.

46

11. MENDOZA, R. Z., PEREIRA, C. A. 1998. Cell metabolism and médium perfusión in vero cell-cultures on microcarriers in a bioreactor. Biopress Engineering. 18:213-218.

12. THOMAS, J. N., HU W-S. 1992. Cultivation of mammalian cells on

Macroporous microcarriers. Enzyme Microbiology Technology. 14:203-208.

13. SHAHAR A. 1994. Cerebral neurons, skeletal myoblasts, and cardiac muscle

cell cultured on macroporous beads. Biotechnology and Bioengineering. 43: 826-831.

14. FRESHNEY R. I. 1994. Animal cell culture, a practical approach. 2ª ed.

EE.UU, Oxford University Press Inc. 329p.

15. OZKAN P., SARIYAR B., UTKUR F., AKMAN U., HORTACSU A. 2005.

Metabolic flux analysis of recombinant protein overproduction in escherichia coli. Biochemical Engineering Journal. 22: 167-195.

16. EDWARDS J., RAMAKRISHNA R., PALSSON B. 2002. Characterizing the metabolic phenotype: a phenotype phase plane analysis. Biotechnology and

Bioengineering. Vol.77, 1: 27-36.

17. GONZÁLEZ R., ANDREWS B., MOLITOR J., ASENJO J.A. 2003. Metabolic

analysis of the synthesis of high levels of intracellular human SOD in saccharomyces cervisiae rhSOD 2060 411 SGA 122. Biotechnology and

Bioengineering. Vol.82, 2: 154-169.

18. PEEHL D., HAM R. 1980. Clonal growth of human kera tinocytes with small

amounts of dialyzed serum. In Vitro. 16 (6): 526-538.

19. HU, W-S. [2002]. Cell and tissue reactor engineering [cd-rom]. University of Minesota.

20. SCHILLING, C., EDWARDS. J., LETSCHER, D., PALSSON, B. 2001. Combining pathway analysis with flux balance analysis for the comprehensive

study of metabolic systems. Biotechnology and Bioengineering. Vol.71, 4: 286-306.

21. NELSON, D. L. y COX, M. M. 2004. Lehninger principles of biochemistry. 4ª ed. Wisconsin, Estados Unidos, Freeman, 1.100p.

22. HARPER´S ILLUSTRATED BIOCHEMISTRY. 2003. Por Murray R. K. “et al”. 26ª

ed. Estados Unidos, McGraw-Hill, 643p.

23. PARIS, I. “et al”. 2005. Monoamine transporter ingibitors and norepinephrine

reduced dopamine-dependent iron toxicity in cells derived from the substantia nigra. Journal of Neurochemistry. 92:1021-1032.

47

24. PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE. 2000. Por Kandell, E. R. “et al”. 4ª ed. Estados Unidos, McGraw-Hill.

25. VÉLEZ, P. 2006. Centro de Neurociencia Celular y Molecular. Facultad de Ciencias, Universidad de Valparaíso. Comunicación personal.

26. HYCLONE INC. TECHNICAL DATA SHEET MICROCARRIERS CULTISPHER-

S. 2006.

48

APÉNDICE Nº 1

TABLA 1: SUMARY OF THE MAJOR AND UNIQUE FEATURES

OF THE PRINCIPAL ORGANS.

(FUENTE: Tabla 27-3, del Capítulo 27 del libro Harper´s Illustrated Biochemestry)

49

Ta

bla

1:

Su

ma

ry

of

th

e m

ajo

r a

nd

un

iqu

e f

ea

ture

s o

f th

e p

rin

cip

al

org

an

s

50

APÉNDICE Nº 2

MÍNIMOS CUADRADOS

http://ssn.dgf.uchile.cl/home/informe/ML/servicio.html#apendice

La técnica de mínimos cuadrados persigue encontrar variables componentes de

una ecuación, tal que el error entre los valores reales y los predichos por el modelo sea mínimo. Ella se utiliza sólo para casos en que se manejen modelos lineales. De no ser así, se debe linealizar la fórmula mediante alguna identidad matemática (por ejemplo,

tomar logaritmo de toda la ecuación).

Teniendo un problema lineal, éste puede ser representado matricialmente de la siguiente manera:

G · m = d (A1)

Donde:

G representa las variables del modelo que son conocidos,

m son los valores que se desea calcular, y d los datos reales que se conocen.

Generalmente se tiene que el número de datos (tamaño de d) es mayor que el

número de incógnitas del modelo (largo de m), con lo cual, la matriz G tendrá más filas

que columnas. En otras palabras, ella no es cuadrada.

Premultiplicando ambos lados de la ecuación por GT (la matriz transpuesta de G) se tendrá:

(GT · G) · m = GT · d (A2)

Nótese que la nueva matriz (GT · G) es cuadrada y por ende, invertible. Con ello:

m = (GT · G)-1 · GT · d (A3)

Con lo cual se obtienen los valores de las incógnitas. Este procedimiento es

completamente análogo a optimizar el valor de las incógnitas de manera de minimizar el

error antes señalado.

51

APÉNDICE Nº 3

MEDICIÓN DE AMINOÁCIDOS LIBRES USANDO CROMATOGRAFÍA HPLC FASE

REVERSA

Los aminoácidos son generalmente cromóforos débiles, es decir, no absorben la luz UV. Es por esto que para propósitos analíticos, primero deben ser modificados químicamente (derivatizados), para así poder ser detectados con mayor sensibilidad.

La reactividad de todos los agentes comunes de derivatización, está dirigida

hacia el grupo amino de la estructura del aminoácido. Existen diversos agentes fluorogénicos disponibles, de entre los más importantes dentro de los métodos modernos para análisis de aminoácidos, se encuentra OPA (o-ftalaldehído). La ventaja

más importante de OPA es que no fluorece por si sólo, y sus desventajas principales son que es específico para aminas primarias, dejando a aminoácidos secundarios,

como prolina y triptofano sin detectar y que los fluoróforos resultantes son inestables.

Luego de un análisis bibliográfico se identificaron varios protocolos que utilizan el

reactivo de derivatización OPA, en los cuales siempre existe un compromiso entre alta sensibilidad, buena resolución y menor tiempo de análisis, es por esto que el mejor

método depende de las necesidades específicas de cada estudio.

Referencias:

Godel H., Graser T., Földi P., Pfaender P., Fürst P. (1984) “Measurement of free amino

acids in human biological fluids by high-performance liquid chromatography” J. Chromat., 297: 49-61.

Aguilar M-I. (2003) “Reversed-phase high-performance liquid chromatography” En “HPLC of peptides and proteins: methods and protocols” Editor Aguilar M -I., Humana

Press, Inc., Capítulo 2, pp 9-22.

52

PROTOCOLO PARA DETECCIÓN DE AMINOACIDOS MEDIANTE RP- HPLC

Este protocolo usado por el laboratorio de ingeniería bioquímica del

Departamento de Ingeniería Química y Ciencias de los Materiales de la Universidad de Minesota, se ha realizado con exitosos resultados para muestras de cultivos de células animales, la única diferencia radica en el equipo usado y método de detección, un

detector de fluorescencia Shimadzu RF- 530, con autosampler, sin embargo el método puede ser utilizado tanto para UV como fluorescencia.

El equipo facilitado por la Facultad de Ciencias, con el que se intentará

reproducir los resultados obtenidos por la Universidad de Minesota, y condiciones de

operación se presenta a continuación:

Detector UV: Merck Hitachi L-400 UV. Sistema de Bombas: Merck Hitachi L-6200, low pressure mixing. Columna: Purospher RP-18, 125 x 4 mm (Merck).

Flujo: 1 ml/min Longitud de onda: 340 nm

Temperatura: Ambiente Volumen loop muestra: 100 µl. Fases:

Fase móvil A: 80% 0,05 M CH3COONA (pH: 6,8):19% Metanol: 1% THF, filtrada y

desgasificada. Fase móvil B: 80% Metanol:20% 0,05 CH3COONA (pH:6,8), desgasificada.

Gradiente:

Tiempo

(min)

% Fase

móvil B

0 0

25 0

35 50

48 50

55 100

62 100

63 0

Procedimiento para determinación de curva de calibración:

Antes de equilibrar la columna, se ambientan las líneas con fase móvil A y se instala la columna. Luego se procede a equilibrar la columna, aumentando

gradualmente el flujo de fase móvil A de 0 a 1 ml/min, por 15 minutos aproximadamente hasta obtener una línea base estable. Luego se mezclan 50 µl OPA Reagent P-0532

53

(Sigma) con 50 µl estándar aminoácidos AA S18 (Sigma) y se deja reposar por un minuto.

Luego se inyectan en el loop, 100 µl de la mezcla y se carga el loop, en este minuto se acciona el programa del gradiente, el cual va cambiando los porcentajes de

las fases A y B automáticamente. Una vez terminado éste, se purga con 5 volúmenes de metanol, para limpiar la columna de residuos, además en este solvente será almacenada la columna. Finalmente se limpian las líneas y el loop con agua nanopura

por 10 minutos a un flujo de 6 ml/min, y luego se purga el sistema de bombas con 1,5 litros de agua nanopura.

Procedimiento para medición de muestras de medio de cultivo:

Para precipitar cualquier proteína que haya en el medio, se mezclan 150 µl de muestra con 150 µl solución TCA (ácido tricloroacético) al 5% v/v y se centrifuga por 5

minutos, luego de 5 minutos de reacción. A los 300 µl de sobrenadante se le agregan 500 µl de fase móvil A y 100 µl de 0,5 M de NaOH. Luego se filtran las mezclas usando filtros de 0,2 µm. A continuación se realiza el mismo procedimiento anterior con la única

diferencia que en la mezcla se utiliza OPA más la muestra de medio de cultivo a medir, en vez del estándar de aminoácidos.

Los peaks obtenidos se cuantifican mediante integración área/altura usando la

curva de calibración del estándar de aminoácidos definida anteriormente.

54

APÉNDICE Nº 4

A: MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA

PRODUCTO: Glucosa GOD-PAP cod. 30232. LABKIT

PRINCIPIO: Enzimático- colorimétrico. REACTIVOS:

REACTIVO 1 (Solución Buffer):

Buffer TRIS 92 mmol/l pH 7,5 Fenol 0,3 mmol/l

REACTIVO 2 (Enzimas): Glucosa Oxidasa 15000 U/l

Peroxidasa 1000 U/l 4- Aminofenazona 2,6 mmol/l

PROCEDIMIENTO:

Se disuelve el contenido de una botella de reactivo 2 en una botella de reactivo 1. Esta preparación es estable por 1 mes almacenado entre +2 a +8 ºC.

Luego se realizan las siguientes mezclas:

Mezclas Blanco Estándar Muestra

Estándar - 20µl -

Muestra - - 20 µl

Reactivo 2,00 ml 2,00 ml 2,00 ml

Se incuban por 30 minutos a temperatura ambiente y se mide la absorbancia (ABS) 505

nm contra blanco en espectrofotómetro. CÁLCULO:

Glucosa (mg/dl) = (ABS Muestra/ ABS Estándar) x concentración del Estándar

LINEALIDAD:

Este método es lineal hasta 500 mg/dl, si la concentración de glucosa de la muestra es mayor diluir la muestra 1:2 con solución salina.

55

APÉNDICE Nº 5

B: LACTATE (LIQUID)

Reagent Set

Phone: 734-487-8300 • Toll Free: 800-445-9853 • Fax: 734-483-1592 • www.pointescientific.com

Intended Use For the quantitative determination of lactate in human plasma. For in vitro diagnostic use only.

Clinical Significance Lactate determinations are used in the diagnosis of lactate acidosis. Shock

is the most widely recognized cause of lactic acidosis although, it is possible for elevated lactate levels to precede shock. Myocardial infarction, severe congestive heart failure, pulmonary edema and blood loss are the common

causes of shock which will produce lactic acidosis. Lactic acidosis may also result from renal failure and leukemia. Thiamine deficiency and diabetic

ketoacidosis will usually result in increased levels of lactate. Method History Originally lactic acid determinations were performed by either titrametric or

colorimetric methods. The first enzymatic method for lactic acid was based on the transfer of

hydrogen from lactate to potassium ferrocyanide by lactate dehydrogenase (LD). This procedure was very cumbersome and did not gain wide acceptance. More current enzymatic methods involved the measurement of

NADH formed from the oxidation of lactate by LD.1,2 This method has become more widely used, but still suffers from instability in many analyzer

systems. The current enzymatic method is based on the action of lactate oxidase. This method is fast, accurate and is considerably more stable than previous enzymatic methods.

Principle Lactate oxidase catalyzes the oxidation of lactic acid to pyruvate and hydrogen peroxide. Peroxidase then catalyzes the reaction of hydrogen

peroxide with a hydrogen donor, in the presence of 4-aminophenazone, to form a dye. Color intensity, measured at 550nm, is proportional to the

lactate concentration in the sample. Lactate Oxidase Lactate + O2 -------------------------------_ Pyruvate + Hydrogen Peroxide

Peroxidase Hydrogen Peroxide + TOOS + 4-AAP-----------------------_Dye (550 nm)

Reagents Lactate Reagent (R1): TRIS Buffer 100mM, 4-aminoantipyrene 1.7mM, Peroxidase (Horseradish) > 10,000 U/L, Surfactant, Stabilizer, Sodium Azide

(0.09%) as preservative. Lactate Reagent (R2): TRIS Buffer 100mM, Lactate Oxidase (Microbial) >

1,000 U/L, TOOS 1.5mM, Surfactant, Stabilizer, Sodium Azide (0.09%) as preservative.

56

Precautions 1. This reagent is for in vitro diagnostic use only. 2. Reagents contain sodium azide as preservative. Upon disposal flush

with large volumes of water. 3. All specimens used in this test should be considered potentially

infectious. Universal precautions as they apply to your facility should be used for handling and disposal of materials during and after testing. 4. Do not use the reagents beyond the expiration date printed on the kit

label. Reagent Preparation

Lactate reagents R1 and R2 are ready to use for instruments suitable for two reagent analysis. Reagent Storage

All reagents are stable until the expiration date on the label when stored at 2-8°C. Specimen Collection and Storage

Plasma collected in sodium fluoride/potassium oxalate is the recommended specimen. The specimen should be immediately placed on ice and the cells must be separated within 15 minutes.3 The sample should be drawn from a stasis-free

vein.4 If not analyzed promptly, specimens may be stored at 2-8oC for up to 2 days. If specimens need to be stored for more than 2 days, they may be stored for

one month frozen at –20°C.5 Interferences All interference studies were conducted based on the procedures recommended in

NCCLS guideline No. EP7-P.6 Hemoglobin at levels up to 500 mg/dl and Bilirubin at levels up to 20 mg/dl were found to exhibit negligible interference (<5%) on this

method. Samples with levels of interfering substances higher than the upper limits should be diluted with physiological saline before assaying. Multiply the result obtained from the manual dilution by the appropriate dilution factor. For a

comprehensive review of drug interference on lactate levels see Young et al.7 Materials Provided

Lactate (Liquid) Reagent Set Materials Required but not Provided 1. Lactate standard or suitable serum-based calibrator.

2. Controls with normal and elevated levels of lactate. 3. Automated clinical chemistry analyzer capable of accommodating tworeagent

assays. Procedure Below is a general example of the lactate test procedure for an automated

analyzer. For assistance with applications on automated analyzers, please contact the manufacturer’s Technical Service Department.

37°C 37°C Sample + Reagent 1 --------------_Reagent 2 ------------_ Measurement of 6ul 300ul 30 sec. 200ul 5 min absorbance (700/546nm)

↓ Lactate results

Limitations 1. Anticoagulants containing citrate should not be used. 2. Protect the reagents from direct sunlight.

3. Samples with values greater than 20mmol/L must be diluted 1:1 with saline

57

and re-assayed. Multiply the result by two. Calibration Use an NIST-traceable lactate standard, or a suitable serum-based lactate

standard. The procedure should be calibrated according to the instrument manufacturer’s instructions. If control results are found to be out of range, the

procedure should be re-calibrated. Phone: 734-487-8300 • Toll Free: 800-445-9853 • Fax: 734-483-1592 • www.pointescientific.com

Lactate (Liquid) Reagent Set

Quality Control Reliability of test results should be routinely monitored with control materials that reasonably emulate performance of patient specimens. Quality control

materials are intended for use only as monitors of accuracy and precision. The recovery of control values within the appropriate range should be the

criteria used in evaluation of future assay performance. Controls should be run with every working shift in which lactate assays are performed. It is recommended that each laboratory establish their own frequency of control

determination. Quality control requirements should be determined in conformance with local, state, and/or Federal regulations or accreditation

requirements. Results To convert from S.I. units to conventional units, multiply the S.I. units by

9.01. Example: mmol/L x 9.01 = mg/dL Lactate

Expected Values The following reference range is suggested for L-Lactate.8 Venous 0.5-2.2 mmol/L

Arterial 0.5-1.6 mmol/L It is highly recommended that each laboratory establish its own range of

expected values. Performance 1. Assay Range: 0-20 mmol/L

2. Comparison: This lactate reagent was compared to the method performed on the Dade Chemistry Analyzer. The study was performed

using 57 patient samples ranging from 0.3-10.4 mmol/L. Data was subjected to least-squares linear regression analysis which yielded a correlation coefficient(r) of 0.998 with a regression equation of y = 0.97

x + 0.1. 3. Precision: Within-Day precision for the Lactate Reagent was

determined following a modification of NCCLS document EP5-T2.9 Within-Day precision studies produced the following results: Within Day

Sample N Mean S.D. C.V.% Low 20 1.52 0.04 2.63

Mid 20 3.98 0.07 1.76 High 20 8.89 0.09 1.01 Day To Day precision was also determined following a modification of

NCCLS document EP5-T2.9 Day to Day precision studies produced

58

the following results: Day To Day Sample N Mean S.D. C.V.%

Low 20 1.51 0.04 2.65 Mid 20 4.12 0.09 2.18

High 20 9.19 0.17 1.85 4. Sensitivity: The analytical sensitivity for lactate was determined to be 0.15 absorbance units per 1 mmol/L of lactate.

References 1. Gutmann, I., Wahlefeld, A., Methods of Enzymatic Analysis. 2nd Ed.,

Academic Press, New York, 1974, 1464. 2. Noll, F., Methods of Enzymatic Analysis. 2nd Ed., Academic Press, New York, 1974, 1465.

3. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 4th Ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1996, 367.

4. Tietz, N.W., Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd Ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1995, 382-383. 5. Westgard, J.O., Lahmeyer, B.L, Birnbaum, M.L, Clin Chem 1972, 18:1334-

1338. 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation

Protocols for Interference Testing, Evaluation Protocol Number 7, Vol. 4, No. 8, June 1984. 7. Young, D.S., effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd Ed., AACC

Press, Washington D.C., 1990. 8. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, 4th Ed., W.B. Saunders

Company, 1996, 801. 9. NCCLS document “Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices” 2nd Ed., 1992.

Rev. 5/03 P803-L7596-01 Manufactured by Pointe Scientific, Inc.

5449 Research Drive, Canton, MI 48188 "European Authorized Representative" (O.E.A.R.C.) Av. De Tervueren 34 bte

44 B-1040 Brussels, Belgium

59

APÉNDICE Nº 6

REACTIVOS Y SOLUCIONES USADAS PARA MANEJO DE CÉLULAS RCSN-3

Las soluciones utilizadas para el trabajo con la línea celular RCSN son las siguientes:

Medio de Cultivo

El medio de cultivo utilizado para la propagación de esta línea celular, corresponde a

una mezcla 1:1 de medio DMEM (cat.nº 12100-046) y F12 (cat.nº 12100-018), ambos de GIBCO, enriquecido con 0,02 g de ácido ascórbico (A4544)*, 0,002 g de putrecina (P7505)*, 0,4 g pluronic F-68 (P1300)*, 4,87 g bicarbonato de sodio, 200 µl de

etanolamina (E0135)*, 10.000 U de mezcla penicilina/streptomicina (GIBCO cat. nº 15140-122), 2 µl de stock (5g/l) selenito de sodio (S5261)* y 400 µl de stock (25g/l)

de apo-transferrina (T2036)*, a esta mezcla final se le conoce como medio completo. La mezcla DMEM/F-12 posee un indicador de pH en base a rojo fenol, el cual a pH 7,4

se presenta rojo, a mayor pH este cambia a magenta y bajo este pH toma colores que van desde el naranja hasta el amarillo, sin embargo esto puede sufrir modificaciones al

agregarse otros aditivos. Ambos medios de cultivo DMEM y F-12 vienen en forma de polvo y se preparan con

agua nivel HPLC estéril, luego se le agregan los suplementos y posteriormente se ajusta el pH a 7.2, luego se filtra asépticamente utilizando una membrana de 0,2 [µm] y

se guarda a -20ºC . Al momento de uti lizar, se agrega en forma aséptica el suero fetal bovino (Hyclone SV 30014.03).

Solución salina

La solución salina utilizada para eliminar los desechos producidos por las células, es

Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline (PBS) de la empresa Gibco y su preparación se realiza con agua nivel HPLC estéril, para luego ser filtrado asépticamente utilizando una membrana de 0,2 [µm].

Tripsina

La solución de tripsina utilizada para la recolección de las células se preparó en solución salina, agregando tripsina (1:250 Gibco cat. nº27250-042)) y mezclando

levemente de manera de obtener una solución al 25% p/v. Luego esta solución es filtrada en condiciones estériles con un filtro de 0,2 [µm]. Se mantiene a 4 ºC.

60

Tripsina-EDTA

Esta solución de 5 gr de tripsina más 2 gr de EDTA se prepara diluyendo la solución stock Tripsin-EDTA (Gibco cat. nº 15400-054)) 10 veces en buffer PBS estéril. Luego esta es filtrada en condiciones estériles con un filtro de 0,2 [µm] y es mantenida a 4 ºC.

Solución Fungicida

Esta solución se prepara mezclando lentamente 50 mg de ketoconazole (Sigma K-1003) por 10 ml de etanol absoluto, es mantenida a 4 ºC, cubierta por papel aluminio.

Azul Tripán

El azul tripán (Sigma T0776) es uti lizado en ensayos de viabilidad celular, y es preparado en solución salina al 0,1 % p/v. Esta solución es mantenida a temperatura ambiente.

Tinción MTT

El MTT (Sigma M-2128) se usa para la observación directa de las células sobre los microcarriers; las células viables absorven este compuesto y lo convierten en un

producto azúl oscuro fácilmente visible, este es preparado en solución salina en una concentración de 5 [mg/ml]. Esta solución se mantiene a 4 ºC, cubierta con papel de aluminio para evitar su contacto con la luz.

Solución de Criopreservación

Para la criopreservación de las células se prepara una solución en medio de cultivo con 20% de suero fetal bovino y 10 % de DMSO (Sigma D2438) ultra -puro. Se filtra en

condiciones estériles con filtro 0,22 [µm]. Esta solución debe mantenerse a 4 ºC y cubierta con papel aluminio.

Solución Stock de BSA

La albumina de suero bovino (BSA) purificada de fracción V (Sigma A3294) viene en

forma de polvo, esterlizado y se encuentra almacenada a 4ºC, la solución stock se

61

prepara en solución salina en condiciones de pseudo esterilidad, es decir se esterilizan con luz UV los elementos que usaran para pesar y se limpia bien el área donde se encuentra la pesa con spray esterilizador antes de pesar, se prepara a una

concentración de 40g/l cuidando de no agitar mucho esta solución pues forma espuma, por lo que de preferencia se prepara en un matraz aforado estéril, el cual se flambea

para solubilizar. Se almacena a 4ºC. Solución Stock Insulina

La insulina (Sigma I6634) viene en forma de polvo esterilizado y se encuentra almacenada a -20ºC, la solución stock se prepara en solución salina en condiciones de

pseudo esterilidad a una concentración de 2mg/ml y se almacena a 4ºC. Antes de usar debe agitarse pues la insulina tiende a decantar.

Emulsión de intralípidos

La emulsión 20% de intralípidos (Sigma I141-100 ml) viene en forma de estéril y debe ser alicuotada y almaceda a 4ºC en cuidadas condiciones, pues se contamina fácilmente, tomando un color oscuro.

Melanina (Sigma M0418-100MG)

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APÉNDICE Nº 7

CULTIVO DE CÉLULAS EN BOTELLA CON AGITADOR MAGNÉTICO

A continuación se presentan una serie de pasos necesarios para comenzar un sistema de microcarriers macroporosos:

Inóculo: Se realiza el mismo procedimiento de subcultivo de células, la diferencia es

que una vez centrifugado y resuspendido, se toma una muestra y se cuentan, para determinar el volumen necesario a inocular, dependiendo de la cantidad de células

deseadas para el inóculo. Luego se aplican directamente sobre 50 ml de suspensión de microcarriers (0,8-1 [g/l]), la que se obtiene pesando los microcarriers en una balanza de precisión y luego alicuotando medio de cultivo hasta obtener la concentración

deseada.

Anclaje: Una vez realizado el inóculo, se agita con un régimen intermitente, para

facilitar la adherencia de las células a los microcarriers. Este régimen se mantiene por

las 6 primeras horas para asegurar un buen anclaje. Al final de este proceso se debe agregar medio de cultivo fresco hasta el volumen de trabajo, y pasar a un régimen de

agitación constante muy baja (sólo la necesaria para mantener a los microcarriers en suspensión). A las 24 hrs. se debe realizar un muestreo de los microcarriers para comprobar que las células se hayan pegado.

Ensayo de viabilidad celular: Mediante una pipeta estéril se saca una muestra del

cultivo agitado de 1 ml en un tubo eppendorf (1,5 ml). Luego se dejan decantar los microcarriers, se saca el máximo posible de sobrenadante y se congela para ensayos

posteriores. El sedimentado se lava con 1 ml de solución salina, se deja sedimentar nuevamente y se remueve el sobrenadante, luego se agrega 1 ml de solución de tripsina y se incuba por 30 minutos con agitación ocasional. Luego se procede a contar

las células de acuerdo a procedimiento estándar con cámara de Neubauer.

Procedimiento de tinción con MTT: Mediante una pipeta estéril se saca una muestra

del cultivo agitado en un tubo eppendorf (1,5 ml), se deja decantar, se descarta el

sobrenadante, se lavan con 1 ml de solución salina, se sedimenta nuevamente y se remueve el sobrenadante, hasta dejar 400 µl de pellet, el cual es mezclado con 400 µl

de solución MTT, esta mezcla se incuba a 37 ºC con agitación ocasional entre 5 a 10 minutos (en este tiempo es posible detectar los microcarriers como pequeños puntos azules a simple vista. A continuación se observan las células viables sobre los

microcarriers esparciendo una gota de esta solución sobre un porta -objeto en el microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo 20X.

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Recolección de células: Se aplica procedimiento estándar proporcionado por

fabricante. Se detiene la agitación y se dejan sedimentar los microcarriers por 10 minutos. Se intenta remover la mayor cantidad de medio que sea posible, luego se

agregan 40 ml de solución salina mezclada con 0,02% p/v EDTA (aproximadamente 50 ml/g. microcarriers) y se transfieren los microcarriers a un tubo autosustentable. Se

remueve la solución de lavado y es reemplazada por 30 ml de solución de tripsina. Se mezcla bien y se incuba a 37ºC con agitación ocasional por 40 minutos. Luego se centrifuga a 1700 rpm por 7 minutos y se procede a eliminar el sobrenadante.

Criopreservación de células: Se recuperan las células de la etapa anterior, se

resuspenden suavemente en solución de criopreservación, se coloca en tubos de 1,5 ml y estos se introducen en un recipiente para congelar a una velocidad constante, que se

coloca directamente en un congelador a -80 ºC, una vez pasado un día pueden ser trasladados a almacenamiento permanente en tanque de nitrógeno líquido.