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UNIVERSIDAD DE MURCIA
Dña. Camila Peres Rubio2018
ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO
New Markers of Oxidative Stress in Dogs: Technicaland Applicative Issues
Nuevos Marcadores de Estrés Oxidativo en Perros:Aspectos Técnicos y Aplicaciones Prácticas
UNIVERSIDAD DE MURCIA
FACULTAD DE VETERINARIA
“New markers of oxidative stress in dogs: technical and applicative issues”
“Nuevos marcadores de estrés oxidativo en perros: aspectos técnicos y aplicaciones prácticas”
Camila Peres Rubio 2018
UNIVERSIDAD DE MURCIA
FACULTAD DE VETERINARIA
“New markers of oxidative stress in dogs: technical and applicative
issues”
“Nuevos marcadores de estrés oxidativo en perros: aspectos técnicos y
aplicaciones prácticas”
Memoria presentada por
Camila Peres Rubio
Para optar al grado de Doctora en Ciencias Veterinarias con Mención Internacional
Tutor
José Joaquín Cerón Madrigal1
Directores
Josefa Hernández Ruíz2
Silvia Martínez Subiela1
1 Laboratorio interdisciplinar de Análisis Clínicos, Interlab-UMU, Departamento de Medicina y Cirugía
Animal. Facultad de Veterinaria. Campus de Excelencia Internacional ‘Mare Nostrum’ Universidad de Murcia,
España
2 Departamento de Biología Vegetal, área de Fisiología Vegetal, Facultad de Biología. Universidad de Murcia,
España
“The joy of exploring the unknown and finding something novel and noteworthy:
what a privilege!”
Prof. Helmut Sies
AGRADECIMIENTOS
Minha caminhada para a construção desta tese chegou ao fim. O caminho escolhido não
foi fácil, porém, graças a Deus, que iluminou cada passo dado, e ao apoio de muitas pessoas que
contribuíram de forma direta ou indireta durante o processo, pude atravessar todos os obstáculos
encontrados. Se não fossem as mensagens de “ánimo” e o carinho recebidos de todos vocês, esta
tese não haveria sido concretizada. Muito obrigada!
Comienzo ofreciendo mi más sincero agradecimiento al Dr. José Joaquín Cerón Madrigal,
tutor de ésta tesis, por aceptar y acoger en su laboratorio a una persona extraña que apenas hablaba
español, por haber mostrado una paciencia infinita ante mis errores y dificultades de comprensión
durante todo el proceso de investigación. Esta tesis es producto de su tiempo y de su energía. Yo
no sería la persona que soy hoy sin la oportunidad que me ofreció y sin la confianza que me ha
brindado a largo de estos años. Su pasión por la investigación siempre me inspirará. ¡Un millón
de gracias!
En segundo lugar, a mis directoras de Tesis la Dra. Josefa Hernández Ruiz y la Dra. Silvia
Martínez Subiela, quienes guiaron mis pensamientos y me dirigieron científicamente, con
excelentes consejos, críticas y comentarios día tras día. Gracias por su tiempo y su ayuda infinita.
Gracias a vuestro apoyo incesante durante estos 4 años de estudios he podido llevar a cabo todas
las investigaciones propuestas y presentar esta tesis. He aprendido mucho de vosotras. ¡Muchas
gracias!
Jose, además de directora, has sido amiga, madre, y mucho más. Siempre lista para todo.
Me has dejado compartir el cariño de tu familia. Me has hecho sentir amada. ¡Muchas gracias!
Estarás siempre en mi corazón.
A la Dra. Asta Tvarijonaviciute, por su prontitud y disposición en ayudarme en cualquier
momento. Por la enseñanza y soporte que me ha dado. Por su estímulo y su alegría en los
momentos más duros. Su pasión por la investigación y su demostración de que nada es imposible
son, para mí, una fuente constante de energía y de entusiasmo.
Mi agradecimiento a todos los miembros del laboratorio. Gracias Isabel, Luis, Teresa y
José María, y en especial a Susana y Jose. Gracias a todos por darme la bienvenida calurosamente,
por vuestra simpatía, apoyo y ayuda. La alegría infinita y la motivación que proporcionáis en el
día a día han hecho del Lab4 un lugar maravilloso. Con vosotros pude reír, tomarme un café o
"simplemente" reconstruir el mundo en una conversación infinita. Sois personas increíbles que
habéis conseguido que me sintiera como en casa. Gracias.
Gracias a mis amigas y compañeras de tesis (y de espacio): Ana, Mariló, Marina, Sandra
y Lorena, por vuestro apoyo y por vuestra presencia. Por escuchar mis desahogos y lamentaciones,
por el abrazo en los momentos más difíciles, pero sobre todo por compartir vuestras historias e
hilaridades que me proporcionaron momentos de distracción y alegría facilitando la realización
de este trabajo. ¡Muchas gracias!
También quiero expresar mi agradecimiento a Alberto y a Damián (perdón: Dr. Damián),
por el cariño y atención que me habéis dado, por darme fuerzas y consejos siempre que los he
necesitado. Gracias por el soporte y la ayuda en la traducción al castellano en esta fase final de la
tesis. Muchísimas gracias por las “clases” de español y, porque gracias a ti Damián, he descubierto
que el Cobas no “está bueno” sino que “está bien.”
Muchas gracias al Dr. Marco Caldin, director del laboratorio de Patología Clínica de la
Clínica Veterinaria Privata San Marco, por permitirme realizar mi estancia en su laboratorio.
Mi gratitud al Profesor Dr. Özcan Erel, Profesor del departamento de Bioquímica Medica
de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ankara Yildirim Beyazit, por permitirme realizar
la estancia en el laboratorio de investigación del Hospital Ataturk de Ankara. A todas las personas
de su equipo, por su colaboración y ayuda en la realización de mis estudios, y por hacer que mi
estancia transcurriera de forma tan agradable.
A los profesores Dr. Fernando Tecles Vicente y Dr. Luis Bernal Gambín por brindarme
su ayuda y colaboración siempre que los he necesitado.
Muchísimas gracias a los Profesores Dra. Zoe Polizopoulou, del Departamento de
Estudios Clínicos y Laboratorio de Diagnóstico de la Escuela de Medicina Veterinaria de la
Universidad Aristóteles de Tesalónica, y Dr. Fabio Gentilini, del Departamento de Ciencias
Médicas Veterinarias de la Universidad de Boloña, por la participación en la revisión de esta
Tesis.
Agradecer también a cada uno de los profesores, estudiantes y personal de la Universidad
de Murcia, con quienes he tenido el honor y el placer de interactuar en tantas ocasiones.
Quero agradecer especialmente à minha família pelo apoio e incentivo durante todos
esses anos de estudo. Apesar da distância, estivemos mais unidos que nunca. Aprendemos a
valorizar ainda mais cada momento vivido, cada minuto que passamos juntos. Cada abraço dado
foi para mim como combustível para continuar mais um período. Graças a vocês, esta tese está
sendo concluída com êxito! Agradeço aos meus pais, Celia e Francisco pela força infinita que
me deram, por confiar em mim e apoiar-me em cada passo. Pai, mãe: minha educação é fruto
dos vossos ensinamentos e graças a ela pude chegar onde estou e aprender ainda mais.
Obrigada! Amo vocês infinitamente. Às minhas irmãs Jaqueline e Viviane, pela força, pela
paciência nos momentos mais difíceis e pelo carinho e amor transmitidos constantemente.
Obrigada pelos momentos tão felizes que vivemos durante os poucos dias que tivemos a cada ano
que passava. Às minhas sobrinhas, Ana Beatriz e Lorena, pelo amor incondicional. A alegria que
vocês me dão é o maior tesouro que tenho nessa vida. Agradeço ao meu cunhado e amigo, Daniel,
pelo apoio desde quando “Espanha” era apenas um sonho. Obrigada! Amo vocês!
Também quero agradecer ao Thalles, quem me apoiou e me encorajou para começar
uma “nova aventura”. Obrigada pela força e por ajudar nos momentos mais difíceis
principalmente naqueles primeiros contatos com um mundo novo e desconhecido. Obrigada
também a toda sua família pelo carinho durante esse período.
Agradeço à professora Dra. Elizabeth Moreira dos Santos Schmidt, da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista. Graças a confiança
depositada em mim, pude chegar até aqui.
Agradecimento especial ao CNPq pela bolsa concedida através do programa Ciências
Sem Fronteiras.
Por último, agradeço ao meu cachorro Figo. Graças à sua vontade incessável de urinar
e devorar o mundo me obrigou a levá-lo à rua inúmeras vezes e assim a não ficar diante do
computador 24 horas por dia nessa reta final da tese. Obrigada meu fiel amigo “Fiiiiigo”!
A mi familia
TESIS DOCTORAL POR COMPENDIO DE PUBLICACIONES
1. Rubio CP, Hernández-Ruiz J, Martinez-Subiela S, Tvarijonaviciute A, Ceron JJ., 2016.
Spectrophotometric assays for total antioxidant capacity (TAC) in dog serum: an update.
BMC Veterinary Research 12:166.
2. Rubio CP, Tvarijonaviciute A, Martinez-Subiela S, Hernández-Ruiz J, Cerón JJ., 2016.
Validation of an automated assay for the measurement of cupric reducing antioxidant
capacity in serum of dogs. BMC Veterinary Research 12:137.
3. Rubio CP, Hernández-Ruiz J, Martinez-Subiela S, Tvarijonaviciute A, Arnao MB, Ceron
JJ., 2016. Validation of three automated assays for total antioxidant capacity
determination in canine serum samples. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation
28, 693-698.
4. Rubio CP, Martinez-Subiela S, Hernández-Ruiz J, Tvarijonaviciute A, Ceron JJ., 2017.
Analytical validation of an automated assay for ferric-reducing ability of plasma in dog
serum. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 29, 574-578.
5. Rubio CP, Martinez-Subiela S, Tvarijonaviciute A, Hernández-Ruiz J, Pardo-Marin L,
Segarra S, Ceron JJ., 2016. Changes in serum biomarkers of oxidative stress after
treatment for canine leishmaniosis in sick dogs. Comparative Immunology, Microbiology
and Infectious Diseases 49, 51-57.
6. Rubio CP, Martínez-Subiela S, Hernández-Ruiz J, Tvarijonaviciute A, Cerón JJ,
Allenspach K., 2017. Serum biomarkers of oxidative stress in dogs with idiopathic
inflammatory bowel disease. Veterinary Journal 221, 56-61.
7. Rubio CP, Yilmaz Z, Martínez-Subiela S, Kocaturk M, Hernández-Ruiz J, Yalcin E,
Tvarijonaviciute A, Escribano D, Ceron JJ., 2017. Serum antioxidant capacity and
oxidative damage in clinical and subclinical canine ehrlichiosis. Research in Veterinary
Science 115, 301-306.
8. Almela RM, Rubio CP, Cerón JJ, Ansón A, Tichy A, Mayer U., 2018. Selected serum
oxidative stress biomarkers in dogs with non-food-induced and food-induced atopic
dermatitis. Veterinary Dermatology 29, 229-e82.
Contents
ABBREVIATIONS ....................................................................................................................................................... 3
EXTENDED SUMMARY ........................................................................................................................................... 5
1. INTRODUCTION .................................................................................................................................... 6
- What is oxidative stress? ......................................................................................................................... 6
- How can be measured the antioxidant status? .................................................................................. 7
- Studies in dogs ............................................................................................................................................ 7
2. OBJECTIVES ............................................................................................................................................... 8
3. COMMON MATERIAL AND METHODS ......................................................................................... 9
3.1 Biomedical ethics .................................................................................................................................. 9
3.2 Sampling procedure ............................................................................................................................. 9
3.3 Analyte determination in canine serum samples .......................................................................... 9
3.4 Analytical validation............................................................................................................................ 12
3.5 Effects of haemolysis and lipemia.................................................................................................... 13
4. EXPERIMENTAL DESIGN, RESULTS AND DISCUSSION OF THE DIFFERENT
OBJECTIVES .................................................................................................................................................................. 14
a. OBJECTIVE 1 ....................................................................................................................................... 14
b. OBJECTIVE 2 ....................................................................................................................................... 16
c. OBJECTIVE 3 ...................................................................................................................................... 19
d. OBJECTIVE 4 ....................................................................................................................................... 28
5. CONCLUSIONS ..................................................................................................................................... 30
ARTICLES ................................................................................................................................................................... 31
Article 1 .................................................................................................................................................................. 33
Article 2 .................................................................................................................................................................. 35
Article 3 .................................................................................................................................................................. 37
Article 4 .................................................................................................................................................................. 39
Article 5 .................................................................................................................................................................. 41
Article 6 .................................................................................................................................................................. 43
Article 7 .................................................................................................................................................................. 45
Article 8 .................................................................................................................................................................. 47
Results submitted to publication ...................................................................................................................... 49
RESUMEN GENERAL .............................................................................................................................................. 51
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 52
- ¿Qué es el estrés oxidativo ................................................................................................................... 52
- ¿Cómo se puede determinar el estado antioxidante en suero? .................................................. 53
- Estudios en perros .................................................................................................................................. 53
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................... 54
3. MATERIALES Y MÉTODOS COMUNES ......................................................................................... 55
3.1 Ética biomédica ................................................................................................................................... 55
3.2 Procedimiento de muestreo ............................................................................................................ 55
3.3 Determinación de analitos en muestras de suero canino ........................................................ 55
3.4 Validación analítica ............................................................................................................................. 58
4. DISEÑO EXPERIMENTAL, RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LOS DIFERENTES
OBJETIVOS .................................................................................................................................................................... 61
a. OBJETIVO 1......................................................................................................................................... 61
b. OBJETIVO 2......................................................................................................................................... 63
c. OBJETIVO 3 ........................................................................................................................................ 67
d. OBJETIVO 4......................................................................................................................................... 77
5. CONCLUSIONES ................................................................................................................................... 79
REFERENCES ............................................................................................................................................................. 80
3
ABBREVIATIONS
ABTS: 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid
ABTS•+: radical ABTS
AD: atopic dermatitis
AOPP: advanced oxidation protein products
CUPRAC: cupric reducing antioxidant capacity
CV: coefficient of variation
FRAP: ferric reducing ability of plasma
FOX: ferrous oxidation in xylenol orange
HRP: horseradish peroxidase
H2O2: hydrogen peroxide
IBD: with inflammatory bowel disease
PON1: paraoxonase 1
RNS: reactive nitrogen species
ROS: reactive oxygen species
SD: standard deviation
TAC: total antioxidant capacity
TAS: total antioxidant status
TBARS: thiobarbituric acid reactive substances
TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity
TEACA: Trolox equivalent antioxidant capacity using H2O2 in acidic medium
TEACH: Trolox equivalent antioxidant capacity using H2O2 and enzyme (HRP) and H2O2
TOS: total oxidant status
4
5
EXTENDED SUMMARY
6
1. INTRODUCTION
- What is oxidative stress?
Originally defined by Sies (1985), oxidative stress is “a disturbance in the pro-oxidant-
antioxidant balance in favour of the former” leading to “a disruption of redox signalling and
control and/or molecular damage” (Sies and Jones, 2007).
Antioxidants are natural or synthetic substances that may prevent or delay oxidative cell
damage caused by physiological oxidants (Apak et al., 2016). Some antioxidants are proteins and
enzymes, while others are small molecules. Alpha-tocopherol, β-carotene, ascorbic acid,
superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase are examples of antioxidants.
Pro-oxidants, also known as reactive oxygen species (ROS) and/or reactive nitrogen species
(RNS), are generated endogenously as a normal product of aerobic metabolism, or they may arise
from interactions with exogenous sources such as xenobiotic compounds (Kehrer and Klotz,
2015; Ray et al., 2012; Sies, 1986). The steady-state formation of pro-oxidants is balanced by a
similar rate of their consumption by antioxidants that are enzymatic and/or nonenzymatic (Sies,
1991). The balance between these compounds (ROS and antioxidants) is tightly regulated and
extremely important for maintaining vital cellular and biochemical functions. Uncontrolled
increases in the steady-state concentrations of these oxidants lead to free-radical mediated chain
reactions which indiscriminately target proteins, lipids, polysaccharides and DNA (Sies, 1997;
Turrens, 2003).
Probably the oxidative stress participates in processes as diverse as inflammation,
atherosclerosis, aging, carcinogenesis, drug action and toxicity, and defence against protozoa,
among others (Sies and Jones, 2007).
7
- How can be measured the antioxidant status?
The serum antioxidant status can be measured by two ways:
Global assays. This is based on the total antioxidant capacity (TAC) which measures in
general the different antioxidant components in a global way (Erel, 2004; Pryor et al., 1991).
TAC can be measured by various different assays and the main spectrophotometric assays used
are: Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), ferric reducing ability of plasma (FRAP),
and cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC). In addition, TEAC can be measured by
different assays. For example, by using metmyoglobin and hydrogen peroxide (H2O2) to generate
the radical for the assay, or by using H2O2 in acidic medium, or by using horseradish peroxidase
enzyme (HRP) and H2O2.
Individual assays. They measure individual antioxidant components such as ascorbic
acid, uric acid, α-tocopherol, bilirubin, albumin, thiol-groups, catalase, glutathione peroxidase,
among others.
- Studies in dogs
There have been previous studies about markers of oxidative stress in different dogs’
diseases such as: canine ehrlichiosis (Da Silva et al., 2013; Rudoler et al., 2015), heart disease
(Hetyey et al., 2007), sarcoptic mange (Camkerten et al., 2009), leishmaniosis (Almeida et al.,
2013; Martínez-Subiela et al., 2014) or Babesia vogeli (Ciftci et al., 2014). However, in general
these studies only focus on selected oxidant or antioxidants and there is in general a lack of
knowledge about how TAC, measured by different assays, can behaves in these diseases, as well
how complete profiles of antioxidant and oxidant molecules can change and correlate with TAC.
In addition, in dogs as well in other veterinary species, there are no data about the stability of the
serum samples under different storage conditions.
8
2. OBJECTIVES
The global objective of this PhD thesis was to increase the knowledge about the possible
use and applications of the different assays that can be used for TAC determination in dogs. In
addition, we wanted to provide an overview of how TAC measured by different assays and
individual antioxidants and oxidants biomarkers can behave in selected diseases. Finally, we
pursued to provide data about stability of the different TAC assays as well as other oxidative
stress biomarkers in canine serum. With this purpose, the individual objectives were:
1. To review the state of the art of the main spectrophotometric assays used to evaluate TAC
in serum samples of dogs, and to compare them with the current human studies using TAC
methodologies (Article 1).
2. To validate new different spectrophotometric assays to evaluate TAC in serum of dogs
(Articles 2, 3 and 4).
3. To apply the validated TAC assays to different diseases in dogs. In addition to evaluate
and compare with TAC assays the behaviour of others oxidative stress markers (Articles 5, 6, 7
and 8).
4. To study the effect of storage time and temperature on the concentrations of 11
biomarkers of oxidative stress in canine serum (results submitted for possible publication).
9
3. COMMON MATERIAL AND METHODS
3.1 Biomedical ethics
Procedures involving animal handling were approved by the Ethics Committee of the
University of Murcia (Spain). Moreover, experimental procedure of article 6 was performed at
the Royal Veterinary College (RVC), London, and was approved by the RVC Ethics and Welfare
Committee. In case of article 7, experimental procedures were performed at Veterinary Hospital
of Uludag University, Bursa, Turkey and were conducted according Uludag University ethics
committee.
3.2 Sampling procedure
Blood samples were collected from via jugular, cephalic or lateral saphenous
venipuncture into tubes without anticoagulant or with a coagulation activator and a gel separator.
Samples were centrifuged at 3000 or 3500 x g for 5 or 10 min. Serum samples were stored in
plastic vials at -20 °C or -80 ºC until analysis.
3.3 Analyte determination in canine serum samples
All assays were performed in the Olympus AU400 and AU600 Automatic Chemistry
Analyzer (Olympus Europe GmbH) unless otherwise stated.
3.3.1 CUPRAC determinations
The CUPRAC assay was based on the method described by Campos et al. (2009) and was
performed in the Cobas Mira Plus Biochemical Auto Analyzer (ABX Diagnostic) and in the
Olympus AU400 Automatic Chemistry Analyzer (Olympus Europe GmbH). The performance
conditions for the assay were optimized and different concentrations of reagent 1 and 2 were
tested. Final protocol was performed as follows:
10
Five µL of serum sample or standard (Trolox solution) and 195 µL of reagent 1 (0.25
mmol/L bathocuproinedisulfonic acid disodium salt) were pipetted. A first read at 480 nm was
taken and 50 μL of reagent 2 (0.5 mmol/L copper(II) sulphate (CuSO4)) were added to the mixture
and incubated at 37 °C during 280 seconds. A second read at 480 nm was taken and the difference
between the first and the second read was used for calculation of the antioxidant capacity of the
sample.
3.3.2 TEAC determinations
TEAC determination was based on three different assays as follows:
Assay A) Using a commercial kit following manufacturer instructions (Total antioxidant
status (TAS) kit, Randox Laboratories Ltd, UK).
Assay B) Using the method based on that described by Erel (2004): sample or standard
(Trolox solution) was mixed with reagent 1 (40 mmol/L of acetate buffer (pH 5.8)) and
absorbance was measured at 600 nm. Reagent 2 (2 mmol/L of hydrogen peroxide (H2O2) and 10
mmol/L of 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) in 30 mmol/L of acetate
buffer solution (pH 3.6)) was added to the reaction, and a second reading was taken. The
difference between the first and second absorbance was used to calculate the antioxidant capacity
of the sample expressed in millimoles of Trolox equivalents per liter.
Assay C) Using the method based on that described by Arnao et al. (1996): reagent (2
mmol/L of ABTS, 0.25 µmol/L of horseradish peroxidase (HRP) and 40 µmol/L of H2O2 in 50
mmol/L of phosphate buffer (pH 7.5)) was pipetted and a first reading was taken at 700 nm.
Eighteen seconds later the sample or standard (Trolox solution) was added, and a second reading
was taken. The difference between the first and second absorbance was used to calculate the
antioxidant capacity of the sample expressed in millimoles of Trolox equivalents per liter.
11
3.3.3 FRAP determinations
FRAP determination was based on the assay described by Benzie and Strain (1996) and
performed as follows:
Ten µL of sample or standard (ferrous sulfate heptahydrate (FeSO4·7H2O) solution) were
added to 300 µL of reagent (0.7 mmol/L of tripyridyltriazine (TPTZ), and 1.5 mmol/L of ferric
chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) in 0.25 mol/L of acetate buffer (pH 3.6)) and a first read at
600 nm was taken. The assay mixture was incubated at 37 ºC for 240 seconds and a second read
was taken. The difference between the first and the second read were used to calculate the
antioxidant capacity of the sample.
3.3.4 Total thiol determinations
Total thiol concentration was measured according to the method described by Jocelyn
(1987) and Costa et al. (2006).
3.3.5 Paraoxonase 1 (PON1) determinations
PON1 activity was measured using a method previously validated for use in serum of
dogs (Tvarijonaviciute et al., 2012).
3.3.6 Total oxidant status (TOS) determinations
TOS concentration was measured using a method described by Erel (2005).
3.3.7 Ferrous oxidation in xylenol orange (FOX) determinations
FOX concentration was measured using the method of Arab and Steghens (2004).
3.3.8 Advanced oxidation protein products (AOPP) determinations
AOPP concentration was measured as described by Witko-Sarsat et al. (1996).
12
3.3.9 Reactive oxygen species (ROS) determination
ROS levels were estimated by luminol-mediated chemiluminescence assay as described
by Vong et al. (2014) using a microplate reader (Victor 2 1420 Multilabel Counter; PerkinElmer,
Finland) and expressed in counts per second (cps).
3.3.10 Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) determinations
TBARS concentration was determined following the method by Buege and Aust (1978)
using a microplate reader (Powerwave XS, Biotek instruments).
3.4 Analytical validation
To assess the analytical performance of the methods, precision, accuracy, and detection
limit (Kjelgaard-Hansen and Jacobsen, 2011) were determined:
3.4.1 Assessment of intra-assay and inter-assay precision
Inter- and intra-assay precision were expressed as the coefficient of variation (CV;
standard deviation [SD] divided by the mean value) based on five replicate determinations of
TAC in three (one with high, one with medium, and one with low concentration) or four (two
with high and two with low concentration) canine serum (or pools) samples within the same
analytical run (same day) and across analytical runs (different days), respectively. For the
determination of inter-assay precision, the serum pools were stored at −20 °C in aliquots, and
only vials needed for each analytical run were thawed.
3.4.2 Assessment of accuracy
The accuracy was evaluated through assessment of linearity under dilution and spiking
recovery, and when possible by assay comparison, as follows:
Linearity under dilution was performed by using one canine serum sample serially diluted
(1:2, 1:4, 1:8, 1:16, and 1:32) using ultrapure water, and the analyte concentrations was measured
13
for each dilution in duplicate. Then regression lines showing the measured analyte concentrations
versus expected analyte concentration were constructed.
Spike recovery was checked by mixing at different percentages (12.5, 25, 50, 75 and 87.5
%) of two canine serum samples with a known analyte concentration. The ratios of the measured
analyte values to the expected analyte values were compared and then percentages of recovery
were calculated.
3.4.3 Assessment of detection limit
The detection limit was calculated based on data from 20 replicate analyte determinations
of ultrapure water as mean plus 3 SDs.
3.5 Effects of haemolysis and lipemia
The effects of haemolysis were studied by using fresh hemolysate prepared from canine
red cells by lysing erythrocytes in distilled water. The haemoglobin concentration was adjusted
to 80, 40, 20, 10, 5, and 0.0 g/L by adding saline solution. Ten μL of each concentration were
added to three 90 μL samples of canine serum to produce test samples with final haemoglobin
concentration of 8, 4, 2, 1, 0.5, and 0.0 g/L, respectively. The 0.0 g/L concentration was reached
by adding 10 μL of distilled water to 90 μL of the serum sample. Prepared samples were used to
determine the analyte concentrations (Martínez-Subiela et al., 2002).
The effects of lipemia were studied by using a commercial lipid emulsion with
triglyceride concentration of 200 g/L that was serially diluted to 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, and 0.0
g/L using ultrapure water. Ten microliters of each dilution were added to three 90 µL samples of
canine serum and were used to determine the analyte concentration. The final concentrations of
triglycerides in the test samples were 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, and 0.0 g/L (10 µL of ultrapure
water was added to 90 µL of the serum samples) (Martínez-Subiela et al., 2002).
14
4. EXPERIMENTAL DESIGN, RESULTS AND DISCUSSION OF THE DIFFERENT OBJECTIVES
a. OBJECTIVE 1
The objective 1 was covered by a review of the literature corresponding to Article 1.
i. Review. Spectrophotometric assays for total antioxidant
capacity (TAC) in dog serum: an update
Experimental design
The main spectrophotometric assays used in dogs to evaluate the TAC in fluid samples
were evaluated and investigated by reviewing the basis of each one, their practical application in
the determination of TAC in dogs, and also providing selected information about reports in
humans for comparative purposes.
The assays included were: TEAC, FRAP and CUPRAC.
TEAC assay is based on the ability of antioxidants presenting in a sample in reduce or
inhibit oxidized products generated in the assay such as the radical ABTS (ABTS•+.) The ABTS•+
has a blue-green colour, and antioxidants in the sample reduce ABTS•+ suppressing this colour
production to a degree that is proportional to their concentrations (Erel, 2004; Miller et al., 1993).
In serum samples of dogs, TEAC have been determined after anaesthesia and surgery (Lee, 2013;
Lee and Kim, 2014), after vaccination against canine monocytic ehrlichiosis (Rudoler et al.,
2015), in dogs with visceral leishmaniosis (Almeida et al., 2013), demodicosis (Matínez-Subiela
et al., 2014), parvoviral enteritis (Kocaturk et al., 2015), Babesia vogeli (Cifti et al., 2014), atopic
dermatitis (Kapun et al., 2012) and with heart diseases (Hetyey et al., 2007).
FRAP assay is based on the principle of reduction of ferrictripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)
complex to ferrous tripyridyltriazine (Fe2+-TPTZ) by the antioxidants of a sample at low pH. The
end product (Fe2+-TPTZ) has blue color with absorption maximum at 593 nm and the change in
absorbance is related to the antioxidant capacity of the plasma. In dogs, FRAP has been used to
15
evaluate the influence of age on TAC (Blount et al., 2004), in case of dogs with heart disease
(Hetyey et al., 2007), mammary carcinoma (Machado et al., 2015), lymphoma (Vajdovich et al.,
2005), in obese dogs submitted to a weight loss program (Bastien et al., 2015) and healthy dogs
submitted to a weight gain program (Van de Velde et al., 2012), exposed to asoxime chloride dose
(Pohanka et al., 2011), and to lidocaine during ovariohysterectomy (Mesgarani et al., 2014).
CUPRAC assay evaluates the capacity of the antioxidants of a sample to reduce the Cu2+
to Cu1+ in the presence of a chelating agent which forms coloured stable complexes with Cu1+
(Apak et al., 2005). In dogs, the CUPRAC assay has been studied in animals with inflammatory
bowel disease (Rubio et al., 2016).
Results and discussion
The current study showed that all assays studied present scarce but good validation results
and advantages such as the fact that can be made with inexpensive reagents, they are quick and
simple to perform, and can be automated, but they also show limitations such as the non-ability
to measure antioxidant enzymes. Also, this study showed that there is variability on TAC results
depending on the assay studied. Therefore, until an ideal reference method is found, various
different assays integrated in a panel should be used for TAC evaluation in dogs.
16
b. OBJECTIVE 2
The objective 2 was covered by 3 experiments corresponding to Article 2 (experiment 1),
Article 3 (experiment 2), and Article 4 (experiment 3).
i. Experiment 1. Validation of an automated assay for the
measurement of cupric reducing antioxidant capacity in serum
of dogs
Experimental design
An automated assay for CUPRAC measurements was validated in dogs and, in addition,
its ability to show changes between healthy and diseased dogs was investigated by comparing it
in healthy dogs and dogs with inflammatory bowel disease (IBD). The healthy group of dogs was
integrated by ten (seven males and three females) clinically healthy dogs of several different
breeds aged between 3 and 8 years old, that were presented for routine checkups and had normal
physical examination. The group of dogs with IBD was integrated by twelve dogs that were four
females and eight male dogs aged between 3 and 8 years old also of different several breeds. A
diagnosis of IBD was made on the basis of clinical signs (vomiting, diarrhea, and weight loss) of
at least 3 weeks’ duration, and detection of lymphoplasmacytic inflammation during histologic
examination of duodenal biopsy samples following the criteria of Ohta et al. (2014). Exclusion of
other causes of chronic gastrointestinal tract signs including urinalysis, abdominal ultrasound,
faecal exam, complete blood count and serum biochemistry were made.
Results and discussion
Final concentrations of 0.25 mmol/L bathocuproinedisulfonic acid disodium salt (reagent
1) and 0.5 mmol/L CuSO4 (reagent 2) were established as optimal for the assay. With these
concentrations of reagents intra- and inter-assay CVs were lower than 2 % and 9 %, respectively.
The method showed a high linearity with the Trolox and with canine serum sample, and spiking
17
recovery results were between 100 % and 103 %. Lipids did not interfere with the assay but the
addition of haemoglobin significantly increased the CUPRAC concentrations, this increase is
proportional to the haemoglobin concentration of the sample. In addition, the CUPRAC
concentrations in dogs with IBD were significantly lower than those in healthy dogs. In humans,
the serum TAC, evaluated by the crocin bleaching method, was significantly reduced in IBD
patients compared to healthy controls (Koutroubakis et al., 2004). This is in line with the results
of the present study, where our assay was able to demonstrate diminished concentrations of total
antioxidants likely in response to oxidative stress in dogs with IBD.
ii. Experiment 2. Validation of three automated assays for total
antioxidant capacity determination in canine serum samples
Experimental design
Three automated assays for TEAC measurement were validated to determine TAC in
serum of dogs. One uses metmyoglobin and H2O2 (assay A) to generate the radical ABTS, the
second one uses H2O2 in acidic medium (assay B), and the third one uses HRP and H2O2 (assay
C). The behaviour of the 3 TAC assays was evaluated in dogs with IBD. Twenty dogs with IBD
of various breeds, 1–12 years of age; 12 males, 8 females were included in the study. IBD was
diagnosed based on the criteria indicated in experiment 1. Control samples were from 8 clinically
healthy dogs of different breeds, 2–8 years of age; 5 males, 3 females that were presented for
routine check-ups and physical examination and showed normal laboratory test results.
Results and discussion
Intra- and inter-assay CVs for assay A were lower than 7 % and 10 %, respectively. For
assay B, intra- and inter-assay CVs were lower than 4 % and 12 %, respectively. Assay C showed
an intra- and inter-assay CVs lower than 1 % and 11%, respectively. The 3 TEAC assays showed
high linearity with canine serum sample and spiking recovery results between 94 % and 106 %.
In all 3 assays, the limit of detection was low enough to quantify TAC in all samples studied.
18
High degree of haemolysis decreased and increased TAC values in assay A and C, respectively;
whereas TAC values in assay B decreased even with low degree of haemolysis. Lipemia produced
significant interference only in assay C, wherein decreased TAC values were observed.
Significant lower TAC values in dogs with IBD compared with healthy dogs were
observed when evaluated by assays A and C, but not by assay B. In humans, uncontrolled
overproduction of free radicals during active episodes of this disease has been suggested to cause
a decrease in serum antioxidants (Pavlick et al., 2002). The reason why assays A and C, but not
B, could detect differences in TAC between dogs with IBD and healthy dogs is unknown. The
main difference among the 3 assays is that assays A and C use a physiologic pH medium (pH 7.4
and 7.5, respectively), whereas assay B uses an acidic medium (with pH 3.6 and 5.8 buffers). In
addition, an enzyme source is used to generate ABTS•+ in assays A (metmyoglobin) and C (HRP),
but not in assay B.
iii. Experiment 3. Analytical validation of an automated assay for
ferric-reducing ability of plasma in dog serum
Experimental design
The analytical validation of an automated FRAP assay for measuring TAC in dog serum
was performed. In addition, the behaviour of the assay was evaluated in dogs with leishmaniosis.
A control group of dogs integrated by thirty-two clinically adult healthy dogs that had been
presented for routine check-ups, had no abnormal findings at physical examination, and routine
hematologic and biochemical test results were unremarkable was used. The group of dogs with
leishmaniosis was integrated by 47 dogs that showed compatible clinical signs and positive
ELISA serology and/or positive PCR.
Results and discussion
Intra- and inter-assay CVs were lower than 1% and 13%. The assay showed high linearity
with canine serum and showed a proportional bias with a previously validated manual assay. The
19
detection limit was below the range for canine serum FRAP concentrations observed in all
samples used in our study. Only severe haemolysis resulted in substantial interferences in the
FRAP assay. In the case of lipemic samples, caution is needed when interpreting results. Serum
FRAP in dogs with leishmaniosis were significantly lower than those observed in healthy dogs.
Infection by Leishmania induces oxidative burst generation and production of reactive oxygen
species as part of the host response to the parasite (Van Assche et al., 2011). Therefore, a decrease
in antioxidant capacity in response to oxidative stress may be expected in dogs with leishmaniosis
(Almeida et al., 2013) as described herein.
c. OBJECTIVE 3
The objective 3 was covered by 4 experiments corresponding to Article 5 (experiment 1),
Article 6 (experiment 2), Article 7 (experiment 3), and Article 8 (experiment 4).
i. Experiment 1. Changes in serum biomarkers of oxidative
stress after treatment for canine leishmaniosis in sick dogs
Experimental design
The behaviour of a panel of biomarkers of oxidative stress integrated by TEAC (using
acidic medium, assay B from experiment 2, objective 2), CUPRAC, FRAP, total thiol, PON1, and
TOS was investigated in 12 sick dogs naturally infected by canine leishmaniosis (CanL) before
and at days 30 and 180 of a successful therapy. C-reactive protein (CRP), ferritin concentration
and urinary protein:creatinine ratio (UPC) were also determined.
Serum samples were obtained from client-owned dogs naturally infected by L. infantum
which were of different breeds, ages between 7 months and 10 years, and classified in clinical
stages (IIa, IIb and III) at the time of diagnosis as previously described (Solano-Gallego et al.,
2011). The diagnosis of CanL was established by quantitative serology for the detection of L.
infantum specific anti-bodies by means of enzyme-linked immunosorbent assay
20
(Leiscan®Leishmania ELISA Test, Esteve Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona,
Spain) from a blood sample obtained at the screening visit and being positive on either cytology
or real time PCR from bone marrow or lymph node. All animals were serologically negative for
heartworm disease, ehrlichiosis, Lyme disease and anaplasmosis (SNAP 4Dx®, IDEXX
Laboratories, USA) and did not receive any treatment two months before starting the study. Dogs
received 50 mg/kg N-methylglucamine antimoniate (MGA) subcutaneously every 12 h for the
first 28 days of treatment and 10 mg/kg allopurinol orally twice daily for six months. Treatment
was started immediately after enrolment. Blood samples were collected from each dog at
admission (day 0 (T0), before the dogs had been treated), and at 30 (T1) and 180 (T6) days of
treatment.
A control group with 10 healthy dogs which were undergoing routine check-ups or
vaccination and had normal clinic pathological evaluation (physical examination, haematological
and biochemistry evaluations) were included in the study.
Results and discussion
Biomarkers of oxidative stress
At admission day, the biomarkers TEAC, CUPRAC, total thiol and PON1 were
significantly lower (P < 0.01) in dogs with leishmaniosis when compared to healthy dogs, whereas
FRAP and TOS showed no significant differences (P > 0.05).
A significant increase in serum CUPRAC values was observed after 180 days of treatment
(P ≤ 0.0001) (Fig. 1). Serum total thiol and PON1 increased (P ≤ 0.001) on day 30 and 180 of
treatment compared to T0 (Fig. 1). No statistically significant differences (P > 0.05) before and
after treatment for serum TEAC, FRAP and TOS in leishmaniotic dogs were observed (Fig. 1).
Our results are in line with the decreased concentrations of antioxidants such as ascorbic
acid, β-carotene, uric acid, and blood GSH in dogs affected by leishmaniosis (Almeida et al.,
2013; Bildik et al., 2004). Thiol antioxidants play a crucial role in protecting cells from oxidative
damage and PON1 protects the serum lipids from oxidation (Aviram et al., 2004; Yardim-
Akaydin et al., 2003) that is in agreement with the findings of this study.
21
D a y s
TE
AC
(mm
ol
Tro
lox
eq
uiv
ale
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/L)
030
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0 .4
0 .6
0 .8
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CU
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AC
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/L)
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0 .3
0 .4
0 .5
* *
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180
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L)
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0 .2
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* *
* *
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0
2
4
6
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D a y s
TO
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mm
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L)
030
180
0
2 0
4 0
6 0
8 0
Markers of inflammation
At admission, CRP and ferritin concentrations were significantly higher (P = 0.0022 and
P < 0.0001, respectively) in dogs with leishmaniosis than healthy dogs. Both markers were also
significantly lower on day 30 and 180 of treatment when compared with T0. Decrease in
inflammatory biomarkers has been described with CanL treatment (Martinez-Subiela et al., 2014).
Serum thiols and PON1 were inversely related to inflammatory (CRP and ferritin) and glomerular
disease (UPC) markers. It could be hypothesized that the antioxidant defence ability in these
animals might be enhanced as the inflammatory process decreases.
The results of this study demonstrated that CUPRAC and serum thiols increased after a
successful treatment against CanL showing a potential for use in monitoring the treatment of this
disease.
Fig. 1. Results for serum Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), ferric reducing ability of plasma (FRAP),
cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), total serum thiol, paraoxonase 1 (PON1) and total oxidant status (TOS) in
dogs with leishmaniosis before and at 30 and 180 days after treatment. The plots show median (line within box), 25th and
75th percentiles (box) and minimum and maximum values (whiskers). Asterisks indicate significant differences between
before treatment. *P ≤ 0.001, **P ≤ 0.0001.
22
ii. Experiment 2. Serum biomarkers of oxidative stress in dogs
with idiopathic inflammatory bowel disease
Experimental design
A panel of various serum oxidative stress biomarkers including TEAC (using HRP, assay
C from experiment 2, objective 2), CUPRAC, FRAP, thiol, PON1, FOX, TBARS, and ROS, were
evaluated in dogs with IBD.
It was a retrospective study, where a group of 18 dogs diagnosed with IBD at the RVC,
London, were analysed. The dogs had a history typical for chronic enteropathy (≥3 weeks of
vomiting, diarrhoea or both, with or without weight loss) which diagnostic was confirmed based
on established criteria (no clinically relevant abnormalities on routine haematology, serum
biochemistry; trypsin-like immunoreactivity [TLI], canine pancreatic lipase [cPL] and
adrenocorticotropic hormone [ACTH]-stimulation test results within the reference ranges; no
abnormalities on abdominal imaging [radiographs, abdominal ultrasound examination or both];
Allenspach et al., 2007). The histopathological criteria for IBD were based on the guidelines for
evaluation of gastrointestinal inflammation in companion animals, as established by Washabau et
al. (2010). In all cases biopsies were obtained and reviewed by a board-certified pathologist. A
control group of twenty clinically healthy dogs were included in this study.
Results and discussion
TEAC, CUPRAC, serum thiol and PON1 were significantly lower (P < 0.0001) in dogs
with IBD than in healthy dogs (Fig. 2). Serum FRAP did not differ (P > 0.05) between dogs with
IBD and control dogs (Fig. 2). On the other hand, ROS, FOX and TBARS values were
significantly higher (P < 0.0001) in dogs with IBD than in healthy dogs (Fig. 2).
23
TE
AC
(mm
ol
Tro
lox
eq
uiv
ale
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/L)
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mo
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Healt
hy d
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Do
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IB
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0 .2
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0 .8P = 0 .6 4 5 9
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(µm
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L)
Healt
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hy d
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L)
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cp
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0
1 0 0 0 0
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3 0 0 0 0
4 0 0 0 0P < 0 .0 0 0 1
TB
AR
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µm
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L)
Healt
hy d
og
s
Do
gs w
ith
IB
D
0
5
1 0
1 5P < 0 .0 0 0 1
The decreased antioxidant response in dogs with IBD could be due to severe, persistent
oxidative stress that depletes antioxidant resources and overtakes the ability of the body to
produce more antioxidants (Rezaie et al., 2007). In addition, it has been reported that phagocytic
cells (neutrophils and macrophages) isolated from inflamed intestinal tissue in human patients
with IBD, release large amounts of ROS during stimulation, that could act locally or be secreted
into the circulation to produce different systemic effects (Alzoghaibi, 2013; Kitahora et al., 1988).
In our study, inflamed intestinal mucosa in the dogs with IBD contained lymphocytes and plasma
cells, which could suggest that these cells might also be a source of systemic ROS, as reported in
humans (Lantow et al., 2006).
Fig. 2. Comparisons of antioxidant biomarkers and oxidant biomarkers in healthy dogs and dogs with IBD. The plots
show median (line within box), 25th and 75th percentiles (box) and minimum and maximum values (whiskers). TEAC,
Trolox equivalent antioxidant capacity; CUPRAC, cupric reducing antioxidant capacity; FRAP, ferric reducing ability of
plasma; PON1, paraoxonase 1, ROS, reactive oxygen species; FOX, ferrous oxidation-xylenol orange; TBARS,
thiobarbituric acid reactive substances.
24
These findings support the hypothesis that oxidative stress can play an important role in
the pathogenesis of canine IBD and that a profile including selected antioxidant and oxidant
biomarkers might be useful in the comprehensive evaluation of the oxidative stress response in
dogs with IBD.
iii. Experiment 3. Serum antioxidant capacity and oxidative
damage in clinical and subclinical canine ehrlichiosis
Experimental design
The main aim of this study was to evaluate and compare serum antioxidant capacity
(CUPRAC, FRAP, TEACA - using an acidic medium, and TEACH - using HRP (assays B and C
respectively, from experiment 2, objective 2), and total thiol) and products of oxidative damage
(ROS, TBARS and FOX) in dogs with clinical and subclinical ehrlichiosis (CME). Thirty dogs
admitted to the Veterinary Hospital of Uludag University, Bursa, Turkey were included in the
study. The dogs, of different breeds and aged between 1 and 11 years, were divided into three
groups according to physical examination findings, haematological changes and serology: clinical
ehrlichiosis (n = 10), subclinical ehrlichiosis (n = 10) and a control group (n = 10). As inclusion
criteria, all dogs should have no evidence of concurrent vector-borne or non-infectious systemic
diseases, being negative for Dirofilaria immitis antigen, antibodies against Anaplasma
phagocytophilum and Anaplasma platys, negative for antibodies against Leishmania with the
Anigen Rapid CaniV-4 (Bionote, Korea), and not having received any previous treatment at the
time of sampling. The dogs of the control group were considered healthy after physical
examination, and haematological and biochemistry evaluations during routine check-ups or
vaccinations. In addition, they were seronegative to E. canis (Anigen Rapid CaniV-4 test kits,
Bionote).
25
Results and discussion
Oxidative stress biomarkers
CUPRAC, FRAP and total thiol were significantly lower in dogs with clinical (P ≤ 0.001)
and subclinical (P ≤ 0.05) CME when compared with healthy dogs (Fig. 3). TEACA and TEACH
were significantly lower (P ≤ 0.05) in dogs with clinical CME when compared with healthy dogs
(Fig. 3). ROS concentrations were significantly higher (P ≤ 0.01) in infected animals presenting
clinical and subclinical CME in comparison to the control group (Fig. 3). No significant
differences were observed in TBARS and FOX between the different groups (Fig. 3).
CU
PR
AC
(mm
ol
Tro
lox
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uiv
ale
nts
/L)
Clin
ical C
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Clin
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ical C
ME
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***
*
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Clin
ical C
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ical C
ME
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0 .5
0 .6
0 .7
0 .8
0 .9
**
TE
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H
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uiv
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/L)
Clin
ical C
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0 .4
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Clin
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µm
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Clin
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ME
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1 5
2 0
FO
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mo
l/L
)
Clin
ical C
ME
Su
bclin
ical C
ME
Co
ntr
ol
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
Fig. 3. Values of antioxidant markers in dogs with clinical and subclinical monocytic ehrlichiosis (CME) and healthy
dogs (control). TEACA, trolox equivalent antioxidant capacity using acidic medium; TEACH, trolox equivalent antioxidant
capacity using horseradish peroxidase; FRAP, ferric reducing ability of plasma; CUPRAC, cupric reducing antioxidant
capacity, ROS, reactive oxygen species; TBARS, thiobarbituric acid reactive substances; FOX, ferrous oxidation−xylenol
orange. Asterisks indicate significant different from the control dogs. ⁎P ≤0.05, ⁎⁎P ≤0.01, ⁎⁎⁎P ≤0.001.
26
Our results are in agreement with previous reports (Rudoler et al., 2015) which described
decreased TAC concentrations in experimentally infected dogs with E. canis. In addition, there is
evidence of the involvement of thiol in the defence mechanisms against rickettsial infections in
humans mainly because of its protective role against Rickettsia-induced injury in vascular
endothelial cells (Rydkina et al., 2004; Silverman and Santucci, 1990) which could explain the
decreased thiol concentrations found in the dogs with CME in this study.
The increased ROS observed in our study could be due to a direct release from the
ehrlichia or by an endogenous response induced by phagocytes and neutrophils (Kohen and
Nyska, 2002).
Inflammatory markers
CRP and ferritin concentrations were significantly higher in the group of dogs with
clinical and subclinical CME when compared with healthy dogs, which corroborate other studies
that demonstrated increased concentrations of positive acute phase proteins (APP) in this infection
(Karnezi et al., 2016).
It can be concluded that in dogs with CME there are changes in markers of antioxidant
defence and in free radicals indicating a situation of oxidative stress and that the detection of these
changes would depend of the assay used.
iv. Experiment 4. Selected serum oxidative stress biomarkers in
dogs with non-food-induced and food-induced atopic
dermatitis
Experimental design
It was a cohort study where a panel of various serum oxidative stress biomarkers
including TEACA (using acid medium: assay B from experiment 2, objective 2), TEACB (using
HRP: assay C from experiment 2, objective 2), CUPRAC, FRAP, thiol, PON1, and FOX was
27
evaluated in dogs having food-induced (FIAD) and non-food-induced (NFIAD) atopic dermatitis
(AD).
Dogs were diagnosed with NFIAD after exclusion of other pruritic diseases, dietary
restriction provocation-trials and fulfilment of at least five published criteria (Favrot et al., 2010;
Olivry et al., 2015). Dogs were classified in the FIAD group if (i) there was improvement during
an eight week restrictive dietary trial, (ii) worsening or relapse of the clinical signs during a two
week provocation dietary trial and (iii) subsequent improvement after returning to the initial
restriction dietary trial (Favrot et al., 2017). Routine deworming was performed if not done in the
last three months prior to admission. Dogs were excluded if: (i) a definitive diagnosis could not
be reliably achieved; (ii) they were pregnant; (iii) they had received oral, steroidal or nonsteroidal
anti-inflammatory drugs or oral antihistamines within the previous two weeks, or injectable
steroids, oral or topical fatty acids or antioxidants within the previous four weeks; or (iv) they had
received oral or injectable antibiotics or were anaesthetized within the previous week.
Forty-six healthy dogs undergoing routine check-ups or vaccination having normal
physical examination, haematological and serum biochemistry evaluation were included in the
study as a control group.
Results and discussion
Except for FRAP that was increased (P = 0.001), TEACA, TEACB, CUPRAC, thiol and
PON1 were significantly lower (P < 0.001) in atopic dogs when compared to healthy dogs. FOX
was significantly (P = 0.004) higher in atopic dogs when compared to healthy dogs.
These results are in line with previous reports in canine (Kapun et al., 2012; Plevnik et
al., 2014) and human AD (Ji and Li, 2016), and also in human food allergy (Kamer et al., 2010).
Oxidative stress can impact negatively on dermal and epidermal microenvironments promoting
inflammation and disruption of the skin barrier function. Through oxidation of proteins, lipids,
and/or DNA, can causes damage to epidermal keratinocytes, to cell membrane structures, to
stratum corneum, resulting in skin barrier dysfunction and aggravation of AD in humans (Ji and
28
Li, 2016). In addition, oxidative stress could contribute to the pathogenesis of pruritus (Liu and
Ji, 2012; Zhou et al., 2017).
These findings suggest that oxidative stress could play a role in the pathogenesis of canine
NFIAD and FIAD. In addition, the evaluation of selected antioxidant and oxidant biomarkers
could be useful for precision medicine to help to detect atopic dogs that might benefit from
antioxidant-targeted therapies.
d. OBJECTIVE 4
The objective 4 was covered by 1 experiment corresponding to Results submitted to
publication.
i. Experiment 1. Stability of biomarkers of oxidative stress in
canine serum
Experimental design
It was evaluated the influence of storage time and temperature on a profile integrated by
11 serum biomarkers of oxidative stress in dogs. Six were antioxidants biomarkers: TEAC using
acidic medium (TEACA – assay B from experiment 2, objective 2), TEAC using HRP (TEACH –
assay C from experiment 2, objective 2), CUPRAC, FRAP, total thiol and PON1. And five were
oxidants biomarkers: TOS, FOX, AOPP, ROS and TBARS. Six serum pools from healthy dogs
were divided in various aliquots and stored at 4 ºC and 25 ºC for a period of 6, 24 and 72 h, and
at -20 ºC and -80 ºC for a period of 7, 31 14, 30, 60, 180, and 360 days. In addition, the effect of
repeated freeze-thaw cycle was evaluated.
Results and discussion
TEACA, TEACH and PON1 were stable at 4 ºC and 25 ºC for 72 h, and for 360 days at -
20 ºC and -80 ºC. For CUPRAC assay, the best storage conditions were at 4 ºC for 72 h, and at -
29
80 º C for 360 days. FRAP was stable during all the short-term storage at 4ºC and 25ºC, and at -
80 ºC during 360 days. The best storage conditions for thiol were at 4 ºC for 24 h, and at -80 ºC
for 360 days.
The best short-term storage conditions for FOX and TBARS were at 4 ºC for 72 h and for
long-term storage were at -80 ºC for 360 days. For TOS, the better storage conditions were at 4
ºC for 24 h, and at -80 ºC for 360 days. AOPP was better stored at 4 ºC for 72 h and at -80 ºC for
90 days. Better storage conditions for ROS were at 4 ºC for 24 h, and at -20 ºC for 360 days.
It can be concluded that for the short-term storage of biomarkers of oxidative stress in
canine serum, use of 4 ºC is preferred to ambient temperature. In case of long-term storage, the
best stability was achieved when samples were stored at -80 ºC. Most of the biomarkers were
affected after two freeze-thaw cycles. Our results are in agreement with data from horse and
human studies (Cavalleri et al., 2004; Celi et al., 2010; Jansen et al., 2013, 2015, 2017).
30
5. CONCLUSIONS
a. The automated assays validated in this Thesis for TAC determination in canine serum
samples (TEAC - assays A, B and C, FRAP, and CUPRAC) are simple, fast, and easy to perform,
and can be easily adapted to automated biochemical analysers. In addition, they presented good
precision, sensitivity and accuracy.
b. A panel integrated by a combination of TAC assays should be used for evaluation of
antioxidant status of a sample, because the results of TAC could be markedly different depending
on the assay performed. For example, in dogs with IBD and leishmaniosis, TEACH and CUPRAC,
but not other TAC assays, showed decreased concentrations.
c. When oxidative stress biomarkers were evaluated in different diseases of the dog such as
leishmaniosis, ehrlichiosis, IBD and atopic dermatitis, it was observed that each disease had
particular changes in the biomarkers evaluated. In addition, in the case of canine leishmaniosis
some selected biomarkers such as CUPRAC and thiol were useful for treatment monitoring.
d. Oxidative stress biomarkers, such as TEAC, CUPRAC, FRAP, total thiol, PON1, TOS,
FOX, AOPP, ROS, and TBARS are stable for up 24 h at 4 ºC. In case of long-term storage, the
use of -80 ºC provides a better stability than at -20 ºC. In addition, all biomarkers are affected by
three freeze-thaw cycles.
31
ARTICLES
32
33
Article 1
Spectrophotometric assays for total antioxidant capacity
(TAC) in dog serum: an update
34
BMC Veterinary Research
Abstract
The aim of this review is to study the main spectrophotometric methods used to evaluate total antioxidant
capacity (TAC) in serum samples of dogs. Total antioxidant capacity (TAC) is an analyte frequently used
to assess the antioxidant status of biological samples and can evaluate the antioxidant response against the
free radicals produced in a given disease. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), ferric reducing
ability of plasma (FRAP), and cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC) are different assays described
to determine TAC of a sample. This review explains the basis of each assay and their application in the
determination of TAC in dogs, and also provides selected information about reports in humans for
comparative purposes. It is concluded that, ideally, various different assays integrated in a panel should be
used for TAC evaluation, since depending on the assay performed TAC results can be markedly
https://bmcvetres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-016-0792-7
35
Article 2
Validation of an automated assay for the measurement of
cupric reducing antioxidant capacity in serum of dogs
36
BMC Veterinary Research
Abstract
Background
The objective of the present study was to optimize and validate an automated method to assess the total
antioxidant capacity (TAC) in serum of dogs using the cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC)
methodology (TACc) with bathocuproinedisulfonic acid disodium salt as chelating agent, evaluating also
possible variations due to the use of two different automated analyzers. The method is based on the
reduction of Cu2+ into Cu1+ by the action of the non-enzymatic antioxidants that are present in the sample.
Results
Imprecision was low in both apparatus utilized, and the results were linear across serial Trolox and canine
serum samples dilutions. Lipids did not interfere with the assay; however, hemolysis increased the
TACc concentrations. When TACcconcentrations were determined in ten healthy (control) dogs and in
twelve dogs with inflammatory bowel disease (IBD), dogs with IBD had lower TACc concentrations when
compared with the healthy dogs.
Conclusions
The method validated in this paper is precise, simple, and fast and can be easily adapted to automated
analyzers.
https://bmcvetres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-016-0760-2
37
Article 3
Validation of three automated assays for total antioxidant
capacity determination in canine serum samples
38
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation
Abstract
We performed analytical validation of 3 automated assays of the total antioxidant capacity (TAC) in canine
serum and evaluated their use in dogs with inflammatory bowel disease. The assays were based on the
generation of a 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) radical cation (ABTS•+) in aqueous
media, which produces a blue-green color. The antioxidants present in the sample remove the chromogen
in proportion to their concentrations. The assays differed mainly in the way in which this radical was
produced. All 3 assays produced acceptable results in the analytical validation. However, only 2 of the
assays were capable of detecting significantly different TAC values in healthy and diseased animals.
http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1040638716664939
39
Article 4
Analytical validation of an automated assay for ferric-reducing
ability of plasma in dog serum
40
Journal of Veterinary Diagnostic Investigation
Abstract
We performed analytical validation of an automated ferric-reducing ability of plasma (FRAP) assay in the
serum of dogs. Intra- and interassay precision, accuracy, detection limit, and effects of hemolysis and
lipemia were evaluated. Intra- and interassay coefficients of variation were <1% and <13%, respectively.
The assay showed a high correlation with a FRAP assay described previously, and results were linear when
serial sample dilutions were tested. The detection limit was lower than the values observed in sera from
healthy dogs; decreased serum FRAP was found in dogs with leishmaniosis. Lipemia and hemolysis caused
a significant increase in the results of the assay.
http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1040638717693883
41
Article 5
Changes in serum biomarkers of oxidative stress after
treatment for canine leishmaniosis in sick dogs
42
Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases
Abstract
Canine leishmaniosis (CanL) is a zoonotic disease being endemic in several parts of the world. In this study
we investigated the behavior of a panel of biomarkers of oxidative stress in 12 sick dogs naturally infected
by CanL before and at days 30 and 180 of a successful therapy with a standard treatment. The assays total
oxidant status (TOS), trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), ferric reducing ability of plasma
(FRAP), cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), serum thiol and paraoxonase 1 (PON1) were
included in the panel. In addition, correlations between biomarkers of oxidative stress and inflammation
(C-reactive protein (CRP) and ferritin) and urinary protein:creatinine ratio (UPC) were calculated. Serum
CUPRAC, thiol and PON1 significantly increased after treatment and were negatively correlated with
CRP, ferritin and UPC. This study demonstrates that biomarkers of oxidative stress, not previously studied
in leishmaniosis such as CUPRAC and thiol, can change after a successful treatment for CanL showing a
potential for use in monitoring the treatment of this disease.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147957116300947
43
Article 6
Serum biomarkers of oxidative stress in dogs with idiopathic
inflammatory bowel disease
44
Veterinary Journal
Abstract
The objective of this work was to study and compare a panel of various serum biomarkers evaluating both
the antioxidant response and oxidative damage in dogs with idiopathic inflammatory bowel disease (IBD).
Eighteen dogs with IBD and 20 healthy dogs were enrolled in the study. Trolox equivalent antioxidant
capacity (TEAC), cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), ferric reducing ability of the plasma
(FRAP), total thiol concentrations, and paraoxonase 1 (PON1) activity were evaluated in serum to
determine antioxidant response. To evaluate oxidative status, ferrous oxidation-xylenol orange (FOX),
thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and reactive oxygen species production (ROS)
concentrations in serum were determined.
Mean concentrations of all antioxidant biomarkers analyzed, with exception of FRAP, were significantly
lower (P < 0.0001) in the sera of dogs with IBD than in healthy dogs. The oxidant markers studied were
significantly higher (P < 0.0001) in sera of dogs with IBD than in healthy dogs. These findings support the
hypothesis that oxidative stress could play an important role in the pathogenesis of canine IBD.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1090023317300448
45
Article 7
Serum antioxidant capacity and oxidative damage in clinical and
subclinical canine ehrlichiosis
46
Research in Veterinary Science
Abstract
The objective of this study was to evaluate and compare the antioxidant response and the products
of oxidative damage analysed by various assays in clinical and subclinical
canine monocytic ehrlichiosis (CME). For this purpose, four assays to measure the total serum antioxidant
capacity (TAC), such as the cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), ferric reducing ability of
plasma (FRAP), trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) using acidic medium (TEACA), and the
TEAC using the horseradish peroxidase (TEACH) were used. In addition, the serum thiol concentrations
were analysed. Reactive oxygen species (ROS), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), and
ferrous oxidation-xylenol orange (FOX) were measured to determine the concentrations of free
radical and the products of oxidative damage as result of the disease. All antioxidant markers were
significantly lower in the dogs on clinical ehrlichiosis when compared with healthy dogs; however only the
CUPRAC, FRAP and thiol were significantly lower in subclinical CME compared with healthy dogs. TBARS
and FOX showed no significant differences between dogs with CME and healthy dogs; however, a
significant increased ROS concentration was observed in dogs with clinical and subclinical CME when
compared with healthy dogs. Results showed that in CME there is a state of oxidative stress with significant
changes in markers of antioxidant defence and in concentrations of free radicals. However, the detection
of these changes would depend of the assay used.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0034528817300838
47
Article 8
Selected serum oxidative stress biomarkers in dogs with non-food-
induced and food-induced atopic dermatitis
48
Veterinary Dermatology
Abstract
Background
Oxidative stress (OS) has been shown to be involved in the pathogenesis of human and canine atopic
dermatitis (AD) through several distinct mechanisms. Selected serum biomarkers of OS (sbOS) have been
validated in normal dogs and studied in several canine diseases. To the best of the authors’ knowledge,
the sbOS evaluated in this study have not previously been described in canine AD.
Hypothesis/Objectives
The aims of the study were to evaluate a panel of sbOS in dogs with food‐induced (FIAD) and non‐food‐
induced (NFIAD) AD: cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), ferrous oxidation‐xylenol orange
(FOX), ferric reducing ability of the plasma (FRAP), paraoxonase‐1 (PON1), trolox equivalent antioxidant
capacity (TEAC) and serum total thiol (THIOL). The aim was to compare these metabolites with those in
healthy control dogs, and to correlate sbOS with validated pruritus and CADESI‐04 severity scales in dogs
with AD.
Animals
Forty six healthy, nine NFIAD and three FIAD client‐owned dogs were included.
Methods
The study was designed as a cohort study.
Results
There were significant differences in atopic dogs when compared to healthy dogs for all of the sbOS
analysed.
Conclusions and clinical relevance
These findings suggest that OS could play a role in the pathogenesis of canine NFIAD and FIAD. In addition,
the evaluation of sbOS could be useful for precision medicine to help to detect atopic dogs that might
benefit from antioxidant‐targeted therapies.
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/vde.12525
49
Results submitted to publication
Stability of biomarkers of oxidative stress in canine serum
50
Submitted to publication
Abstract
The purpose of this study was to determine the effect of storage time and temperature on the measured
concentrations of a profile of biomarkers of oxidative stress in canine serum: Trolox equivalent
antioxidant capacity (TEAC) measured by two different methods, using acidic medium (TEACA), and
horseradish peroxidase (TEACH), cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC), ferric reducing ability
of plasma (FRAP), total thiol, Paraoxonase 1 (PON1), total oxidant status (TOS), ferrous oxidation xylenol
orange (FOX), advanced oxidation protein products (AOPP), reactive oxygen species (ROS), and
thiobarbituric reactive species (TBARS). Six serum pools from healthy dogs were divided in various
aliquots and stored at 4º C and 25 ºC for a period of 6, 24 and 72 h, and at -20 ºC and -80 ºC for a period
of 7, 14, 30, 60, 180, and 360 days. In addition, the effect of repeated freeze-thaw cycle was evaluated. For
the short-term storage of biomarkers of oxidative stress in canine serum, use of 4 ºC is preferred to
ambient temperature. In case of long-term storage, the optimal stability was achieved when samples were
stored at -80 ºC. Most of the biomarkers were affected after two freeze-thaw cycles. In addition, as
individual oxidative biomarkers can show differences in stability, it is important to consider the stability of
each different analyte when it is measured in stored samples and avoid the use of samples stored in
conditions in which the analyte is not stable.
51
RESUMEN GENERAL
52
1. INTRODUCCIÓN
- ¿Qué es el estrés oxidativo?
El estrés oxidativo fue definido originalmente por Sies (1985), como "una alteración en
el equilibrio pro-oxidante-antioxidante debido a un aumento de los primeros" que conduce a "una
alteración en la señalización redox y en el control y/o daño molecular" (Sies y Jones, 2007).
Los antioxidantes son sustancias naturales o sintéticas que pueden inhibir o retrasar el
daño celular oxidativo causado por los oxidantes fisiológicos (Apak et al., 2016). Los
antioxidantes pueden ser proteínas y enzimas, mientras que otros son moléculas de menor tamaño.
Algunos ejemplos de sustancias antioxidantes son las vitaminas: -tocoferol y ácido ascórbico,
la pro-vitamina β-caroteno, o las enzimas: superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y catalasa.
Los pro-oxidantes, también conocidos como ROS (especies de reactivas de oxígeno) y/o
RNS (especies reactivas de nitrógeno), se pueden generar endógenamente como productos del
funcionamiento normal del metabolismo aeróbico o pueden surgir de interacciones con fuentes
exógenas, caso de los compuestos xenobióticos (Sies, 1986; Ray et al., 2012; Kehrer y Klotz,
2015). La concentración de los pro-oxidantes viene determinada por el balance entre la velocidad
de producción de especies reactivas y la velocidad de su eliminación por antioxidantes
enzimáticos y/o no enzimáticos (Sies, 1991). El equilibrio de estos compuestos (ROS y
antioxidantes) está fuertemente regulado y es esencial para mantener las funciones vitales
celulares y bioquímicas. Los aumentos incontrolados en las concentraciones de los oxidantes
conducen a reacciones en cadena mediados por radicales libres que pueden dañar
indiscriminadamente a proteínas, lípidos, polisacáridos y ADN (Sies, 1997; Turrens, 2003).
El estrés oxidativo participa probablemente en procesos tan diversos como la inflamación, la
aterosclerosis, el envejecimiento, la carcinogénesis, la toxicidad y actuación de fármacos, la
defensa contra protozoos, etc. (Sies, 2007).
53
- ¿Cómo se puede determinar el estado antioxidante en suero?
El estado antioxidante en suero se puede abordar de dos formas:
Ensayos globales. Se basan en determinar el parámetro conocido como Capacidad
Antioxidante Total o TAC (Total Antioxidant Capacity), en el cuál se mide de forma global la
presencia de compuestos antioxidantes en una muestra (Pryor et al., 1991; Erel, 2004). El TAC
se puede determinar mediante distintos tipos de ensayos. Dentro de los ensayos
espectrofotométricos los principales métodos utilizados son: la Capacidad Antioxidante en
Equivalentes de Trolox o TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capcity), Capacidad de
Reducción Férrica del Plasma o FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) y Capacidad
Antioxidante de Reducción del ión Cúprico o CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant
Capacityv). En relación al método TEAC indicar que éste se puede medir de diferentes formas,
usando metamioglobina y peróxido de hidrógeno (H2O2), o con H2O2 en medio ácido, o usando
el enzima peroxidasa de rábano (HRP: Horseradish Peroxidase) y H2O2.
Ensayos individuales. Miden individualmente los compuestos antioxidantes presentes en
la muestra, como ácido ascórbico, ácido úrico, α-tocoferol, bilirrubina, albúmina, grupos tiol,
catalasa, glutatión peroxidasa, etc.
- Estudios en perros
En la bibliografía se pueden encontrar distintos estudios en los que se correlaciona la
variación en los marcadores de estrés oxidativo con una enfermedad, como en ehrlichiosis canina
(Da Silva et al., 2013; Rudoler et al., 2015), enfermedad cardíaca (Hetyey et al., 2007), sarna
sarcóptica (Camkerten et al., 2009), leishmaniosis (Martínez-Subiela et al., 2014; Almeida et al.,
2013) o Babesia vogeli (Ciftci et al., 2014). Pero estos estudios se suelen centrar en un oxidante
o antioxidante en particular, existiendo en general una falta de conocimiento sobre cómo el TAC,
medido por diferentes ensayos, puede comportarse en estas enfermedades, de cómo se pueden
modificar los perfiles completos de antioxidantes y oxidantes, y de cómo éstos se correlacionan
54
con el TAC. Por otro lado, en perros y en otras especies veterinarias no hay datos sobre la
estabilidad de las muestras de suero almacenadas en diferentes condiciones.
2. OBJETIVOS
El objetivo global de esta tesis doctoral fue mejorar el conocimiento sobre los diferentes
ensayos que pueden utilizarse para la determinación del TAC en suero de perro. Se pretendió
proporcionar una visión general de cómo el TAC, medido por diferentes ensayos, y los
antioxidantes individuales como marcadores oxidantes pueden comportarse en ciertas
enfermedades seleccionadas para esta tesis. Finalmente, se buscó facilitar datos sobre la
estabilidad en la medida de los diferentes ensayos de TAC, así como de otros marcadores de estrés
oxidativo en suero canino. Con este propósito, los objetivos individuales fueron:
1. Realizar una revisión sobre los principales ensayos espectrofotométricos utilizados para
evaluar TAC en muestras de suero de perros, y compararlos con los estudios en humanos que
utilizaron metodologías TAC (Artículo 1).
2. Validar nuevos ensayos espectrofotométricos para evaluar TAC en suero de perros
(Artículos 2, 3 y 4).
3. Aplicar los ensayos validados para medir TAC en diferentes enfermedades en perros y,
además, compararlos con otros biomarcadores de estrés oxidativo (Artículos 5, 6, 7 y 8).
4. Evaluar la estabilidad de 11 biomarcadores de estrés oxidativo en suero canino bajo
diferentes condiciones de almacenamiento (resultados enviados para posible publicación).
55
3. MATERIALES Y MÉTODOS COMUNES
3.1 Ética biomédica
Los procedimientos que implicaron la manipulación de animales fueron aprobados por el
Comité de Ética de la Universidad de Murcia (España). Por otra parte, el procedimiento
experimental del artículo 6 se realizó en el Real Colegio de Veterinaria (RVC) de Londres, y fue
aprobado por el Comité de Ética y Bienestar del RVC. En el caso del artículo 7, se realizaron
procedimientos experimentales en el Hospital Veterinario de la Universidad de Uludag, Bursa,
Turquía, los cuales se llevaron a cabo según el comité de ética de la Universidad de Uludag.
3.2 Procedimiento de muestreo
Se tomaron muestras de sangre a través de punción venosa yugular, cefálica o lateral en
tubos sin anticoagulante o con un activador de la coagulación y separador de gel. Las muestras se
centrifugaron a 3000 o 3500 x g durante 5 o 10 minutos. Las muestras de suero fueron
almacenadas en viales de plástico a -20°C o -80°C hasta su posterior análisis.
3.3 Determinación de analitos en muestras de suero canino
A menos que se indique lo contrario, todos los ensayos se realizaron en los analizadores
de bioquímica automáticos Olympus AU400 y AU600 (Olympus Europe GmbH).
3.3.1 Determinación de CUPRAC
El ensayo CUPRAC se basó en el método descrito por Campos et al. (2009) y se realizó
en los analizadores de bioquímica Cobas Mira Plus (ABX Diagnostic) y Olympus AU400
(Olympus Europe GmbH). Para optimizar el ensayo se probaron diferentes concentraciones de
reactivo 1 y reactivo 2. El protocolo final que se llevó a cabo fue el siguiente:
Se pipetean 5 µL de muestra de suero o patrón (solución Trolox) y 195 µL del reactivo
1: batocuproinadisulfato de sodio 0,25 mM. Se toma una primera lectura a 480 nm, a continuación
56
se añaden a la solución 50 µL del reactivo 2: sulfato de cobre (II) 0,5 mM (CuSO4). La mezcla
se incuba a 37ºC durante 280 segundos. Se toma una segunda lectura a 480 nm y la diferencia
entre la primera y la segunda lectura se utiliza para el cálculo de la capacidad antioxidante de la
muestra.
3.3.2 Determinación de TEAC
Se determinó la actividad TEAC por tres métodos diferentes, los cuales se describen a
continuación:
Ensayo A) Kit comercial de los laboratorios Randox (Reino Unido) para la determinación
de Estado Antioxidante Total o TAS (Total Antioxidant Status), en el cual se siguieron las
instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Ensayo B) Método descrito por Erel (2004), en el cuál se mezcla una muestra o estándar
(solución Trolox) con el reactivo 1: tampón acetato 40 mM, (pH: 5,8), a continuación, se mide la
absorbancia a 600 nm. A continuación, se adiciona el reactivo 2: H2O2 2 mM y ácido 2,2'-azino-
bis (3-etilbenzotiazol-6-sulfónico (ABTS) 10 mM preparados en tampón acetato 30 mM (pH 3,6),
y se toma una segunda lectura. La diferencia entre la primera y la segunda absorbancia se usa para
calcular la capacidad antioxidante de la muestra que se expresó en milimoles de equivalentes de
Trolox por litro.
Ensayo C) Método descrito por Arnao et al. (1996), donde se pipetea el reactivo
compuesto por la mezcla de ABTS 2 mM, HRP 0,25 µM y H2O2 40 µM, en tampón fosfato 50
mM (pH 7,5), y se toma la primera lectura a una absorbancia de 700 nm. Transcurridos 18
segundos se adiciona la muestra o el estándar (solución de Trolox) y entonces se toma la segunda
lectura. La diferencia entre la primera y la segunda absorbancia se usó para calcular la capacidad
antioxidante de la muestra que se expresó en milimoles de equivalentes de Trolox por litro.
3.3.3 Determinación de FRAP
La determinación de FRAP se basó en el ensayo descrito por Benzie y Strain (1996), para
ello se adiciona 10 µL de la muestra o el estándar (solución de sulfato ferroso heptahidratado
57
(FeSO4·7H2O)) a 300 µL de la mezcla de reacción compuesto de: TPTZ (2,4,6-tri (2-piridil)-s-
triazina) 0,7 mM y FeCl3·6H2O (cloruro férrico hexahidratado) 1,5 mM, en tampón acetato 0,25
M (pH: 3,6), se toma una primera lectura a 600 nm. La mezcla ensayo se incuba a 37ºC durante
240 segundos y se toma una segunda lectura. La diferencia entre la primera y la segunda lectura
se usó para calcular la capacidad antioxidante de la muestra.
3.3.4 Determinación de tioles totales
La concentración de tioles totales se midió de acuerdo con el método descrito por Jocelyn
(1987) y Costa et al. (2006).
3.3.5 Determinación de paraoxonasa 1 (PON1)
La actividad de PON1 se midió utilizando un método previamente validado para uso en
suero de perros (Tvarijonaviciute et al., 2012).
3.3.6 Determinación del estado oxidante total o TOS (total oxidant status)
La concentración de TOS se midió usando el método descrito por Erel (2005).
3.3.7 Determinación de oxidación ferrosa en xilenol naranja o FOX (ferrous
oxidation in xylenol orange)
La concentración de FOX se midió usando el método de Arab y Steghens (2004).
3.3.8 Determinación de productos de oxidación avanzada de proteínas o AOPP
(advanced oxidation protein products)
AOPP se midió según el método descrito por Witko-Sarsat et al. (1996).
58
3.3.9 Determinación de especies reactivas del oxígeno o ROS (reactive oxygen
species)
Los niveles de ROS se estimaron mediante el ensayo de quimioluminiscencia mediado
por luminol descrito por Vong et al. (2014), para ello se utilizó un lector de microplacas (Victor
2 1420 Multilabel Counter; PerkinElmer, Finlandia) y los valores se expresaron en cuentas por
segundo (cps).
3.3.10 Determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico o TBARS
(thiobarbituric acid reactive substances)
La concentración de TBARS se determinó siguiendo el método descrito por Buege y Aust
(1978). Se utilizó un lector de microplacas (Powerwave XS, instrumentos Biotek).
3.4 Validación analítica
Para realizar la validación analítica de los métodos TAC se evaluaron los siguientes
parámetros (Kjelgaard-Hansen and Jacobsen, 2011):
3.4.1 Evaluación de precisión intra-ensayo e inter-ensayo
La precisión intra e inter-ensayo se expresó como el coeficiente de variación (CV,
desviación estándar [SD] dividida por la media) para 3 muestras o “pools” de suero canino, que
se correspondían con una concentración alta, media o baja para cada una de ellas, o bien se midió
para 4 muestras, de las cuales 2 eran de concentración alta y las otras 2 de concentración baja. La
precisión intra-ensayo se determinó realizando 5 determinaciones dentro la misma serie analítica
y en 5 diferentes días para la precisión inter-ensayo. Para la determinación de la precisión inter-
ensayos las muestras se congelaron en alícuotas y sólo se descongelaron los viales necesarios para
cada serie de análisis.
59
3.4.2 Evaluación de la exactitud del ensayo
La exactitud se determinó estudiando la linealidad mediante dilución y ensayos de
recuperación de la siguiente manera:
El estudio de la linealidad mediante dilución se realizó a partir de una muestra de suero
canino, la cual fue diluida con agua ultra pura según la siguiente serie: 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 y 1:32,
cada una de estas diluciones se midió por duplicado. Se calculó entonces la concentración del
analito y se obtuvieron las líneas de regresión a partir de la representación de las concentraciones
calculadas del analito frente a las concentraciones esperadas para dicho analito.
El ensayo de recuperación se realizó mezclando diferentes porcentajes (12,5, 25, 50, 75
y 87,5%) de 2 muestras de suero canino de concentración conocida (alta y baja). Se compararon
las relaciones de los valores de analito medidos con los valores de analito esperados y luego se
calcularon los porcentajes de recuperación.
3.4.3 Evaluación del límite de detección
El límite de detección se calculó en base a los datos de 20 determinaciones repetidas de
agua ultra pura expresado como el valor medio más tres SD.
3.4.4 Efectos del hemólisis y lipemia
Los efectos del hemólisis se estudiaron usando hemolizados frescos preparados a partir
de glóbulos rojos caninos mediante lisis de eritrocitos en agua destilada. La concentración de
hemoglobina se ajustó a 80, 40, 20, 10, 5 y 0,0 g/L añadiendo solución salina. Se añaden 10 µL
de cada concentración a 90 µL de tres muestras de suero canino, para obtener una concentración
de hemoglobina final de 8, 4, 2, 1, 0,5, y 0,0 g/L, respectivamente. La concentración 0,0 g/L se
alcanzó añadiendo 10 µL de agua destilada a 90 µL de la muestra de suero. Se analizaron las
muestras preparadas para determinar las concentraciones del analito (Martínez-Subiela et al.,
2002).
60
Los efectos de la lipemia se estudiaron mediante el uso de una emulsión lipídica comercial
con una concentración de triglicéridos de 200 g/L que se diluyó en serie a 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125
y 0,0 g/L usando agua ultra pura. Se agregaron 10 µL de cada dilución a un volumen de 90 µL de
3 muestras de suero canino que se usaron para determinar la concentración del analito. Las
concentraciones finales de triglicéridos en las muestras prueba fueron 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125
y 0,0 g/L (10 µL de agua ultra pura se añadieron a un volumen de 90 µL de muestras de suero)
(Martínez-Subiela et al., 2002).
61
4. DISEÑO EXPERIMENTAL, RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE LOS DIFERENTES OBJETIVOS
a. OBJETIVO 1
El objetivo 1 fue cubierto por una revisión de la literatura correspondiente al Artículo 1.
i. Revisión. Análisis espectrofotométricos de la capacidad
antioxidante total (TAC) en suero de perro: una actualización
Diseño experimental
Los principales ensayos espectrofotométricos utilizados para evaluar TAC en distintas
muestras de fluidos de perros se estudiaron a distintos niveles: bases metodológicas de cada tipo
de ensayo, aplicación práctica en la determinación del TAC y, búsqueda de la información
existente en humanos con un fin comparativo en animales.
Los ensayos incluidos fueron: TEAC, FRAP y CUPRAC.
El ensayo TEAC se basa en la capacidad de los antioxidantes de una muestra para reducir
o inhibir los productos oxidados generados en el ensayo, como el radical ABTS (ABTS•+). El
ABTS•+ tiene un color azul-verdoso, los antioxidantes presentes en la muestra lo reducen, lo que
ocasiona una pérdida de este color que resulta ser proporcional a la concentración de o de los
antioxidantes que hay en el medio de reacción (Miller et al., 1993; Erel, 2004). En muestras de
suero de perros, el TEAC se ha determinado en distintas situaciones clínicas como son: después
de realizar anestesia y cirugía (Lee, 2013; Lee y Kim, 2014), vacunación contra la ehrlichiosis
monocítica canina (Rudoler et al., 2015), o en perros diagnosticados de las siguientes
enfermedades: leishmaniosis visceral (Almeida et al., 2013), demodicosis (Matínez-Subiela et al.,
2014), enteritis parvoviral (Kocaturk et al., 2015), Babesia vogeli (Cifti et al., 2014), dermatitis
atópica (AD) (Kapun et al., 2012) y con enfermedades cardiacas (Hetyey et al., 2007).
El ensayo FRAP se basa en el principio de reducción del complejo férrico de la molécula
2,4,6-tri (2-piridil)-s-triazina (Fe3+-TPTZ) a su forma ferrosa (Fe2+-TPTZ) a un pH bajo. El
62
producto final (Fe2+-TPTZ) presenta un color azul con un máximo de absorción a 593 nm y el
cambio en la absorbancia está relacionado con la capacidad antioxidante del plasma. Se determinó
FRAP en perros que manifestaban diversas patologías: cardiaca (Hetyey et al., 2007), carcinoma
mamario o linfoma (Machado et al., 2015; Vajdovich et al., 2005); también se estudió el FRAP
en perros obesos sometidos a un programa de pérdida de peso (Bastien et al., 2015) y en perros
sanos sometidos a un programa de aumento de peso (Van de Velde et al., 2012), expuestos a una
dosis de cloruro de asoxime (Pohanka et al., 2011), y a lidocaína durante la ovariohisterectomía
(Mesgarani et al., 2014). También los valores proporcionados por FRAP se han utilizado para
evaluar la influencia de la edad en TAC (Blount et al., 2004).
El ensayo CUPRAC evalúa la capacidad de los antioxidantes de una muestra para reducir
Cu2+ to Cu1+ en presencia de un agente quelante que forma complejos coloreados estables con
Cu1+ (Apak et al., 2005). El CUPRAC se ha determinado en perros que presentaban enfermedad
inflamatoria intestinal (Rubio et al., 2016).
Resultados y discusión
En general, para todos los ensayos y métodos estudiados, las publicaciones existentes
evidenciaron escasos pero buenos resultados de validación. En esta revisión se pone de manifiesto
una serie de ventajas en estos métodos como son el hecho de que se llevan a cabo con reactivos
de bajo coste, que son métodos rápidos y simples de realizar, y que pueden automatizarse.
Aunque, por otro lado, también muestran como principal limitación la incapacidad para medir
antioxidantes enzimáticos. Este estudio también mostró que existe variabilidad en los resultados
de TAC según el ensayo empleado. Por lo tanto y, hasta que no se encuentre un método de
referencia ideal, se deben usar diferentes ensayos integrados en un panel para la evaluación de
TAC en perros.
63
b. OBJETIVO 2
El objetivo 2 fue cubierto por 3 experimentos correspondientes al Artículo 2 (experimento
1), Artículo 3 (experimento 2) y Artículo 4 (experimento 3).
i. Experimento 1. Validación de un ensayo automatizado
para la medición de la capacidad antioxidante de
reducción de ion cúprico (CUPRAC) en suero de perros
Diseño experimental
Se validaron las mediciones de CUPRAC para un ensayo automatizado en perros y,
además, se investigó su capacidad para discriminar entre perros sanos y enfermos, para ello se
utilizaron perros con enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). El grupo de perros sanos estaba
integrado por un total de 10 perros de varias razas (7 machos y 3 hembras) clínicamente sanos y
con edades comprendidas entre 3 y 8 años, que se presentaron para revisiones de rutina y
obtuvieron resultados de examen físico normal. El grupo de perros con IBD estaba integrado por
un total de 12 perros de diferentes razas (8 machos y 4 hembras), de edades comprendidas entre
3 y 8 años. El diagnóstico de IBD se realizó sobre la observación de distintos signos clínicos
(vómitos, diarrea y pérdida de peso) de al menos 3 semanas de duración, y la detección de
inflamación linfoplasmocítica durante el examen histológico de muestras de biopsia duodenal
siguiendo el criterio de Ohta et al. (2014). Se excluyeron otras causas de signos crónicos del tracto
gastrointestinal mediante el análisis de orina, la ecografía abdominal, el examen fecal, el
hemograma completo y la bioquímica sérica.
Resultados y discusión
Las concentraciones finales de batocuproinadisulfato de sodio (reactivo 1) y de CuSO4
(reactivo 2) que se establecieron como óptimas para el ensayo fueron de 0,25 mM para el reactivo
1 y de 0,5 mM para el reactivo 2. Con estas concentraciones de reactivos, los CVs intra- e inter-
64
ensayo fueron inferiores al 2% y al 9%, respectivamente. El método mostró una alta linealidad
tanto con Trolox como con muestras de suero canino, y los porcentajes de recuperación obtenidos
oscilaron entre 100% y 103%. Los lípidos no interfirieron con el ensayo, pero la adición de
hemoglobina causó un aumento significativo en los valores de CUPRAC, siendo este aumento
proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra. Por otra parte, las
concentraciones de CUPRAC obtenidas en perros con IBD resultaron ser significativamente más
bajas (P ≤ 0,01) que las obtenidas en perros sanos. Estos resultados son coincidentes con estudios
realizados en humanos, donde los valores en suero para TAC (evaluado por el método “crocin
bleaching”) se redujeron significativamente en pacientes con IBD en comparación con controles
sanos (Koutroubakis et al., 2004). Por tanto, estos resultados coinciden con los resultados del
presente estudio, ya que nuestro ensayo fue capaz de demostrar concentraciones disminuidas de
antioxidantes totales en respuesta al estrés oxidativo en perros con IBD.
ii. Experimento 2. Validación de tres ensayos
automatizados para la determinación de la capacidad
antioxidante total en muestras de suero canino
Diseño experimental
Se abordó la validación de 3 ensayos para la medición automatizada de TAC en suero de
perro. Los 3 métodos se diferencian en el modo de generar el radical ABTS, el primero de ellos
(ensayo A) utiliza metamioglobina y H2O2; el segundo (ensayo B) usa H2O2 en medio ácido y el
tercero (ensayo C) usa HRP y H2O2. El comportamiento de los 3 ensayos de TEAC se evaluó en
20 perros con IBD (12 machos y 8 hembras) de diversas razas, de edades comprendidas entre 1 y
12 años. La IBD se diagnosticó en base a los criterios indicados en el experimento 1. Las muestras
control se realizaron en 8 perros clínicamente sanos (5 machos y 3 hembras) de diferentes razas,
de 2 a 8 años de edad; que se presentaron para controles de rutina y exploración física y mostraron
resultados normales en las pruebas bioquímicas de laboratorio.
65
Resultados y discusión
Los CVs intra e inter-ensayo para el ensayo A fueron inferiores al 7% y al 10%,
respectivamente. Para el ensayo B, los CVs intra e inter-ensayo fueron inferiores al 4% y al 12%,
respectivamente. El ensayo C mostró CVs intra e inter-ensayo inferiores al 1% y al 11%,
respectivamente. Los 3 ensayos TEAC mostraron una alta linealidad con la muestra de suero
canino y los resultados de recuperación estuvieron entre el 94% y el 106%. En los 3 ensayos, el
límite de detección fue lo suficientemente bajo como para cuantificar TAC en todas las muestras
estudiadas. El alto grado de hemólisis disminuyó y aumentó los valores de TAC en el ensayo A
y C, respectivamente; mientras que los valores de TAC en el ensayo B disminuyeron incluso con
un bajo grado de hemólisis. La lipemia produjo una interferencia significativa solo en el ensayo
C, en el que se observaron valores de TAC disminuidos.
Se observaron valores de TAC significativamente menores (P < 0,001) en perros con IBD
comparados con perros sanos cuando se evaluaron mediante los ensayos A y C, pero no mediante
el ensayo B. En humanos, se ha sugerido que la sobreproducción incontrolada de radicales libres
durante los episodios activos de esta enfermedad causa una disminución en las concentraciones
de antioxidantes en suero (Pavlick et al., 2002). Se desconoce la razón por la cual los ensayos A
y C, pero no B, podrían detectar diferencias en TAC entre perros con IBD y perros sanos. La
principal diferencia entre los 3 ensayos es que los ensayos A y C usan un medio de pH fisiológico
(pH 7,4 y 7,5, respectivamente), mientras que el ensayo B usa un medio ácido (tampones con pH
3,6 y 5,8). Además, se usa una fuente de enzima para generar ABTS•+ en los ensayos A
(metamioglobina) y C (HRP), pero no en el ensayo B.
66
iii. Experimento 3. Validación analítica de un ensayo
automatizado para la capacidad de reducción férrica
del plasma (FRAP) en suero de perro
Diseño experimental
Se realizó la validación analítica de un ensayo automatizado de FRAP para medir TAC
en suero de perro. El comportamiento del método se evaluó en un grupo perros con leishmaniosis,
el cual estaba integrado por 47 perros que mostraron signos clínicos compatibles con la
enfermedad y serología ELISA positiva y/o PCR positiva. Se incluyó un grupo control, el cual
estaba integrado por 32 perros clínicamente sanos, que se presentaron para controles de rutina y
exploración física y que mostraron resultados normales en las pruebas bioquímicas de laboratorio.
Resultados y discusión
La variación intra e inter-ensayo mostró CVs inferiores al 1% y al 13%. El ensayo mostró
una alta linealidad con suero canino y también mostró un sesgo proporcional con un ensayo
manual previamente validado. El límite de detección estuvo por debajo del rango para las
concentraciones de FRAP en suero canino observadas en todas las muestras utilizadas en nuestro
estudio. Solamente la hemólisis severa causó interferencias sustanciales en el ensayo FRAP. En
el caso de las muestras lipémicas se debe tener precaución al interpretar los resultados. FRAP en
suero de perros con leishmaniosis fue significativamente más bajo (P = 0,01) que el observado en
perros sanos. La infección por Leishmania induce la generación de un estado oxidativo y la
producción de ROS como parte de la respuesta al parásito (Van Assche et al., 2011), por lo que
se puede esperar una disminución en la capacidad antioxidante en respuesta al estrés oxidativo en
perros con leishmaniosis (Almeida et al., 2013), lo cual coincide con los resultados obtenidos en
nuestro estudio.
67
c. OBJETIVO 3
El objetivo 3 fue cubierto por 4 experimentos correspondientes al Artículo 5 (experimento
1), Artículo 6 (experimento 2), Artículo 7 (experimento 3) y Artículo 8 (experimento 4).
i. Experimento 1. Cambios en los biomarcadores séricos
del estrés oxidativo después del tratamiento de la
leishmaniosis en perros enfermos
Diseño experimental
Se estableció un panel de biomarcadores de estrés oxidativo integrado por TEAC (en
medio ácido, ensayo B del experimento 2, objetivo 2), CUPRAC, FRAP, tiol total, PON1 y TOS,
y se estudió su comportamiento en 12 perros enfermos infectados de forma natural por
leishmaniosis canina (CanL) antes y a los días 30 y 180 tras una terapia efectiva. También se
determinó la concentración de proteína C reactiva (CRP) y de ferritina, así como el ratio
proteína:creatinina en orina (UPC).
Las muestras de suero utilizadas en este estudio procedieron de perros de diferentes razas
infectados naturalmente por L. infantum, con edades comprendidas entre 7 meses y 10 años y
clasificados en las etapas clínicas IIa, IIb y III en el momento del diagnóstico como se describió
anteriormente (Solano-Gallego et al., 2011). El diagnóstico de CanL se realizó a través de
serología cuantitativa para la detección de anticuerpos específicos de L. infantum mediante
inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) (Leiscan®Leishmania ELISA Test, Esteve
Veterinaria, Laboratorios Dr. Esteve SA, Barcelona, España) a partir de una muestra de sangre
obtenida en la visita de inclusión y tras resultar positivo en citología o PCR en tiempo real a partir
de médula ósea o ganglio linfático. Todos los animales fueron serológicamente negativos para
filariosis, ehrlichiosis, enfermedad de Lyme y anaplasmosis (SNAP 4Dx®, IDEXX Laboratories,
EE. UU.) Además, se confirmó que no recibieron ningún tratamiento dos meses antes de
comenzar este estudio. El tratamiento se inició inmediatamente después de la inclusión, el cuál
68
consistió en la administración de 50 mg/kg de antimoniato de meglumina MGA por vía
subcutánea cada 12 h durante los primeros 28 días y 10 mg/kg de alopurinol por vía oral dos veces
al día durante 6 meses. Se recogieron muestras de sangre de cada perro al inicio (antes del inicio
del tratamiento), y a los 30 y 180 días de tratamiento.
Se incluyó en el estudio un grupo control con 10 perros sanos que se sometieron a
chequeos de rutina o vacunación y que tenían una evaluación clínica patológica normal (examen
físico, evaluaciones hematológicas y bioquímicas).
Resultados y discusión
Biomarcadores del estrés oxidativo
Al inicio, los biomarcadores TEAC, CUPRAC, tiol total y PON1 fueron
significativamente menores (P < 0,01) en perros con leishmaniosis en comparación con perros
sanos, mientras que FRAP y TOS no mostraron diferencias significativas (P > 0,05).
Se observó un aumento significativo en los valores séricos de CUPRAC después de 180
días de tratamiento (P ≤ 0,0001) (Fig. 1). El tiol y PON1 en suero aumentaron (P ≤ 0,001) en los
días 30 y 180 de tratamiento en comparación con la toma inicial (Fig. 1). No se observaron
diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05) antes y después del tratamiento para TEAC,
FRAP y TOS séricos en perros con leishmaniosis (Fig. 1).
69
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Los resultados de este estudio coinciden con la disminución de las concentraciones de
antioxidantes, como ácido ascórbico, β-caroteno, ácido úrico y GSH en sangre en perros afectados
por leishmaniosis observados previamente (Bildik et al., 2004; Almeida et al., 2013). Los
antioxidantes del grupo tiol juegan un papel crucial en la protección de las células del daño
oxidativo mientras que PON1 protege a los lípidos séricos de la oxidación (Yardim-Akaydin et
al., 2003; Aviram et al., 2004) tal y como se muestra en este estudio.
Marcadores de inflamación
Al inicio, las concentraciones de CRP y ferritina fueron significativamente más altas (P
= 0,0022 y P <0,0001, respectivamente) en perros con leishmaniosis que en perros sanos. Ambos
marcadores también fueron significativamente más bajos los días 30 y 180 de tratamiento en
comparación con la toma inicial. Se ha descrito previamente una disminución de biomarcadores
inflamatorios con el tratamiento en perros con leishmaniosis (Martinez-Subiela et al., 2014). Los
tioles y PON1 séricos mostraron una relación inversamente proporcional con los marcadores
Fig. 1. Resultados de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC), capacidad de reducción férrica del plasma
(FRAP); capacidad antioxidante de reducción de ion cúprico (CUPRAC), tiol total, paraoxonasa 1 (PON1) y estado oxidante
total (TOS) en perros con leishmaniosis antes y a los 30 y 180 días después del tratamiento. Los diagramas muestran la
mediana (línea dentro de la caja), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores mínimos y máximos (bigotes). Los asteriscos
indican diferencias significativas con el tiempo 0. * P ≤ 0,001, ** P ≤ 0,0001.
70
inflamatorios (CRP y ferritina) y la enfermedad glomerular (UPC). De tal manera que podría
hipotetizarse que la capacidad de defensa antioxidante en estos animales podría mejorar a medida
que disminuye el proceso inflamatorio.
Los resultados de este estudio demostraron que CUPRAC y los tioles en suero
aumentaron después de un tratamiento exitoso contra CanL mostrando su potencial uso para
monitorizar el tratamiento de esta enfermedad.
ii. Experimento 2. Biomarcadores séricos del estrés
oxidativo en perros con enfermedad intestinal
inflamatoria idiopática (IBD)
Diseño experimental
Se evaluó un panel de varios biomarcadores de estrés oxidativo sérico que incluían TEAC
(utilizando HRP, ensayo C del experimento 2, objetivo 2), CUPRAC, FRAP, tiol, PON1, FOX,
TBARS y ROS, en perros con IBD.
En este estudio retrospectivo, se analizaron un grupo de 18 perros diagnosticados con
IBD en el RVC de Londres. Los perros presentaban antecedentes típicos de enteropatía crónica
(≥3 semanas de vómitos, diarrea o ambos, con o sin pérdida de peso), cuyo diagnóstico se
confirmó en base a los siguientes criterios establecidos: sin anomalías clínicamente relevantes en
la hematología de rutina y bioquímica sérica, negatividad a inmunorreactividad tipo tripsina
(TLI), lipasa pancreática canina (cPL) y hormona adrenocorticotrópica (ACTH) en los resultados
de la prueba de estimulación y sin presencia de anomalías en las imágenes abdominales
(radiografías, ecografía abdominal o ambas) (Allenspach et al., 2007). Los criterios
histopatológicos para la IBD se basaron en las directrices para la evaluación de la inflamación
gastrointestinal en animales de compañía, según lo establecido por Washabau et al. (2010). En
todos los casos, las biopsias fueron obtenidas y revisadas por un patólogo certificado. Se incluyó
para este estudio un grupo control de 20 perros clínicamente sanos.
71
Resultados y discusión
TEAC, CUPRAC, tiol y PON1 fueron significativamente menores (P < 0,0001) en perros
con IBD que en perros sanos (Fig. 2). El FRAP sérico no fue diferente (P > 0,05) entre perros con
IBD y perros sanos (Fig. 2). Por otro lado, los valores ROS, FOX y TBARS fueron
significativamente más altos (P < 0,0001) en perros con IBD que en perros sanos (Fig. 2).
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La disminución de la respuesta antioxidante en perros con IBD podría deberse al estrés
oxidativo severo y persistente que agota los recursos antioxidantes y supera la capacidad del
cuerpo para producir más antioxidantes (Rezaie et al., 2007). Además, se ha documentado que las
células fagocíticas (neutrófilos y macrófagos) aisladas del tejido intestinal inflamado en pacientes
humanos con IBD liberan grandes cantidades de ROS durante la estimulación, que puede actuar
Fig. 2. Comparación de biomarcadores de estrés oxidativo en perros sanos y perros con IBD. Los diagramas muestran la
mediana (línea dentro de la caja), los percentiles 25 y 75 (caja) y los valores mínimos y máximos (bigotes). TEAC, capacidad
antioxidante equivalente de Trolox; CUPRAC, capacidad antioxidante de reducción de ion cúprico; FRAP, capacidad de
reducción férrica del plasma; PON1, paraoxonasa 1; ROS, especies reactivas de oxígeno; FOX, oxidación ferrosa en xilenol
naranja; TBARS, sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
72
localmente o secretarse en la circulación para producir diferentes efectos sistémicos (Kitahora et
al., 1988; Alzoghaibi, 2013). En nuestro estudio, la mucosa intestinal inflamada en perros con
IBD contenía linfocitos y células plasmáticas, lo que podría sugerir que estas células también
podrían ser una fuente de ROS sistémica, como se observó en humanos (Lantow et al., 2006).
Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que el estrés oxidativo puede desempeñar un papel
importante en la patogénesis de la IBD canina y que un perfil que incluya los antioxidantes
seleccionados y biomarcadores oxidantes podría ser útil en la evaluación integral de la respuesta
al estrés oxidativo en perros con IBD.
iii. Experimento 3. Capacidad antioxidante sérica y daño
oxidativo en la ehrlichiosis canina clínica y subclínica
Diseño experimental
El objetivo principal de este estudio fue evaluar y comparar la capacidad antioxidante en
suero (CUPRAC, FRAP, TEACA - utilizando un medio ácido (ensayo B del experimento 2) y
TEACH - utilizando HRP (ensayo C del experimento 2, objetivo 2) así como la aparición de
productos de daño oxidativo (ROS, TBARS y FOX) en ehrlichiosis clínica y subclínica (CME).
Para este estudió se seleccionaron 30 perros ingresados en el Hospital Veterinario de la
Universidad de Uludag, Bursa, Turquía. Los perros, de diferentes razas y con edades
comprendidas entre 1 y 11 años, se dividieron en tres grupos según los hallazgos del examen
físico, los cambios hematológicos y la serología: ehrlichiosis clínica (n = 10), ehrlichiosis
subclínica (n = 10) y un grupo control (n = 10). Como criterios de inclusión para este estudio se
estableció los perros no debían presentar pruebas de enfermedades sistémicas transitorias o
infecciones concurrentes, siendo negativos para el antígeno de Dirofilaria immitis, anticuerpos
contra Anaplasma phagocytophilum y Anaplasma platys, Leishmania (determinado con Anigen
Rapid CaniV-4 [Bionote, Corea]), y no haber recibido ningún tratamiento previo en el momento
del muestreo. Los perros del grupo control se consideraron sanos después del examen físico y las
73
evaluaciones hematológicas y bioquímicas durante los chequeos de rutina o de vacunación.
Además, fueron seronegativos para E. canis (kits de prueba Anigen Rapid CaniV-4, Bionote).
Resultados y discusión
Biomarcadores del estrés oxidativo
CUPRAC, FRAP y tiol total en suero fueron significativamente más bajas en perros con
CME clínica (P ≤ 0,001) y subclínica (P ≤ 0,05) en comparación con perros sanos (Fig. 3). TEACA
y TEACH fueron significativamente menores (P ≤ 0,05) en perros con CME clínica en
comparación con perros sanos (Fig. 3). Las concentraciones de ROS fueron significativamente
más altas (P ≤ 0,01) en animales infectados que presentaron CME clínica y subclínica en
comparación con el grupo de control (Fig. 3). No se observaron diferencias significativas en
TBARS y FOX entre los diferentes grupos (Fig. 3).
74
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Nuestros resultados concuerdan con publicaciones previas (Rudoler et al., 2015) que
describen concentraciones disminuidas de TAC en perros infectados experimentalmente con E.
canis. Además, hay evidencia de la participación del tiol en los mecanismos de defensa contra las
infecciones por Rickettsia en humanos, principalmente por su función protectora contra la lesión
inducida por esta bacteria en células endoteliales vasculares (Rydkina et al., 2004; Silverman y
Santucci, 1990), lo que podría explicar la disminución de las concentraciones de tiol encontradas
en los perros con CME en este estudio.
El aumento de ROS observado en nuestro estudio podría deberse a una liberación directa
por ehrlichia o a una respuesta endógena inducida por fagocitos y neutrófilos (Kohen y Nyska,
2002).
Fig. 3. Valores de marcadores de estrés oxidativo en perros con ehrlichiosis monocítica clínica y subclínica (CME) y perros
sanos (control). TEACA capacidad antioxidante equivalente de Trolox usando medio ácido; TEACH, capacidad antioxidante
equivalente de Trolox usando peroxidasa de rábano; FRAP, capacidad de reducción férrica del plasma; CUPRAC, capacidad
antioxidante de reducción de ion cúprico; ROS, especies reactivas de oxígeno; TBARS, sustancias reactivas al ácido
tiobarbitúrico; FOX, oxidación ferrosa en xilenol naranja. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto del grupo
control. ⁎P ≤ 0,05, ⁎⁎P ≤ 0,01, ⁎⁎⁎P ≤ 0,001.
75
Marcadores inflamatorios
Las concentraciones de CRP y ferritina fueron significativamente mayores (P < 0,001) en
el grupo de perros con EMC clínica y subclínica en comparación con perros sanos, lo que
corrobora otros estudios que demostraron mayores concentraciones de proteínas de fase aguda
positiva (APP) en esta infección (Ceron et al., 2014; Karnezi et al., 2016).
Se puede concluir que en perros con CME hay cambios en los marcadores de defensa
antioxidante y en radicales libres que indican una situación de estrés oxidativo y que la detección
de estos cambios se ve afectada dependiendo del ensayo utilizado.
iv. Experimento 4. Biomarcadores de estrés oxidativo
sérico en perros con dermatitis atópica inducida (FIAD)
y no inducida por alimentos (NFIAD)
Diseño experimental
En este estudio de cohortes se evaluó un panel de diversos biomarcadores de estrés
oxidativo en suero incluyendo TEACA (utilizando medio ácido, ensayo B del experimento 2,
objetivo 2), TEACH (usando HRP, ensayo C del experimento 2, objetivo 2), CUPRAC, FRAP,
tiol, PON1 y FOX en perros con FIAD y NFIAD.
Los perros fueron diagnosticados de NFIAD después de la exclusión de otras
enfermedades pruríticas, mediante ensayos de provocación por restricción dietética y el
cumplimiento de al menos cinco criterios publicados (Favrot et al., 2010; Olivry et al., 2015). Los
perros se clasificaron en el grupo FIAD si (i) hubo mejoría durante un ensayo dietético restrictivo
de ocho semanas, (ii) empeoramiento o recaída de los signos clínicos durante un ensayo dietético
de provocación de dos semanas y (iii) mejoría subsiguiente después de regresar a la prueba inicial
del ensayo dietético de restricción (Favrot et al., 2017). La desparasitación de rutina se realizó en
todos los animales, en caso de no haber sido realizada en los últimos tres meses antes de la
inclusión. Los perros fueron excluidos si: (i) no se pudo lograr un diagnóstico definitivo; (ii)
estado gestante; (iii) habían recibido antiinflamatorios orales, esteroideos o no esteroideos o
76
antihistamínicos orales en las últimas dos semanas, o esteroides inyectables, ácidos grasos orales
o tópicos o antioxidantes en las últimas cuatro semanas; o (iv) habían recibido antibióticos orales
o inyectables o fueron anestesiados durante la semana anterior.
En el estudio se incluyeron como grupo control 46 perros sanos sometidos a chequeos de
rutina o vacunación, con examen físico, evaluación hematológica y bioquímica sérica normal.
Resultados y discusión
TEACA, TEACH, CUPRAC, tiol y PON1 fueron significativamente más bajos (P < 0,001)
en perros atópicos en comparación con perros sanos mientras que los valores de FRAP
aumentaron (P = 0,001). FOX fue significativamente (P = 0,004) mayor en perros atópicos en
comparación con perros sanos.
Estos resultados coinciden con estudios previos en perros (Kapun et al., 2012; Plevnik et
al., 2014) y humanos con AD (Ji y Li, 2016), así como en personas con alergia a alimentos (Kamer
et al., 2010). El estrés oxidativo puede tener un impacto negativo en los microambientes dérmicos
y epidérmicos que promueven la inflamación y la alteración de la función barrera de la piel. A
través de la oxidación de proteínas, lípidos y/o ADN, puede causar daño a los queratinocitos
epidérmicos, a las estructuras de la membrana celular, a estrato córneo, lo que resulta en la
disfunción de la barrera cutánea y la agravación de la AD en humanos (Ji y Li, 2016). Además,
el estrés oxidativo podría contribuir a la patogénesis del prurito (Liu y Ji, 2012; Zhou et al., 2017).
Estos hallazgos sugieren que el estrés oxidativo podría desempeñar un papel en la
patogénesis de NFIAD y FIAD canina. Además, la evaluación de antioxidantes seleccionados y
biomarcadores oxidantes podría ser útil para ayudar a detectar la AD en perros, los cuales podrían
beneficiarse de terapias mediante el uso de antioxidantes.
77
d. OBJETIVO 4
El objetivo fue llevado a cabo a través de un estudio cuyos resultados han sido enviados
a publicar (experimento 1).
i. Experimento 1. Estabilidad de biomarcadores de estrés
oxidativo en suero de perro
Diseño experimental
Se evaluó la influencia del tiempo de almacenamiento y la temperatura en un perfil
integrado por 11 biomarcadores séricos de estrés oxidativo en perros, de los cuales 6 fueron
biomarcadores de antioxidantes: TEAC usando medio ácido (TEACA –ensayo B del experimento
2, objetivo 2), TEAC usando HRP (TEACH – ensayo C del experimento 2, objetivo 2), CUPRAC,
FRAP, tiol total y PON1, y los restantes 5 eran biomarcadores de oxidantes: TOS, FOX, AOPP,
ROS y TBARS. Seis muestras de sueros de perros sanos se dividieron en varias alícuotas y se
almacenaron a 4ºC y 25ºC durante un período de 6, 24 y 72 h, y a -20ºC y -80ºC durante un
período de 7, 31 14, 30, 60, 180 y 360 días. Además, se evaluó el efecto de varios ciclos de
congelación-descongelación.
Resultados y discusión
TEACA, TEACH y PON1 se mantuvieron estables a 4ºC y 25ºC durante 72 h, y durante
360 días a -20ºC y -80ºC. Para el ensayo CUPRAC, las mejores condiciones de almacenamiento
fueron a 4ºC durante 72 h, y a -80ºC durante 360 días. FRAP se mantuvo estable durante todo el
almacenamiento a corto plazo a 4ºC y 25ºC, y a -80ºC durante 360 días. Las mejores condiciones
de almacenamiento para el tiol fueron a 4ºC durante 24 h, y a -80ºC durante 360 días.
Para FOX y TBARS, las mejores condiciones de almacenamiento a corto plazo fueron a
4ºC durante 72 h y para almacenamiento a largo plazo a -80ºC durante 360 días. Para TOS, las
mejores condiciones de almacenamiento fueron a 4ºC durante 24 h, y a -80ºC durante 360 días.
78
AOPP mostró mejores condiciones de almacenamiento a 4ºC durante 72 h y a -80ºC durante 90
días. Las mejores condiciones de almacenamiento para ROS fueron a 4ºC durante 24 h, y a -20ºC
durante 360 días.
Se puede concluir que, para un almacenamiento a corto plazo de biomarcadores de estrés
oxidativo en suero canino, es más adecuada su conservación a una temperatura de 4ºC frente a la
temperatura ambiente. En el caso de un almacenamiento a largo plazo, la mejor estabilidad se
logra cuando las muestras se almacenan a -80ºC. La mayoría de los biomarcadores se vieron
afectados después de dos ciclos de congelación-descongelación. Nuestros resultados concuerdan
con los datos de estudios previos en caballos y humanos (Cavalleri et al., 2004; Celi et al., 2010;
Jansen et al., 2013, 2015, 2017).
79
5. CONCLUSIONES
5.1 Los ensayos automatizados validados (TEAC – ensayos A, B y C, CUPRAC y FRAP)
permiten la cuantificación de TAC en suero canino de una forma fiable. Además, son métodos
simples, rápidos, sencillos de realizar, se pueden adaptar fácilmente a analizadores bioquímicos
automatizados, y presentan una buena precisión, sensibilidad y exactitud.
5.2 Para evaluar el estado antioxidante de una muestra se recomienda usar un panel integrado
por una combinación de varios ensayos TAC, ya que los resultados pueden ser marcadamente
diferentes dependiendo del método utilizado. Por ejemplo, aunque en perros con IBD y
leishmaniosis TEACH y CUPRAC mostraron concentraciones disminuidas, otros ensayos de TAC
no presentaron ninguna variación.
5.3 Cuando se evaluaron biomarcadores de estrés oxidativo en diferentes enfermedades del
perro como leishmaniosis, ehrlichiosis, IBD y AD, se observó que cada enfermedad presentaba
cambios particulares en los biomarcadores evaluados. Además, en el caso de la leishmaniosis
canina algunos biomarcadores seleccionados tales como CUPRAC y tiol fueron útiles para la
monitorización del tratamiento.
5.4 Los biomarcadores séricos de estrés oxidativo, como TEAC, CUPRAC, FRAP, tiol total,
PON1, TOS, FOX, AOPP, ROS y TBARS son estables hasta 24 horas a 4ºC. En caso de
almacenamiento a largo plazo, la congelación a -80ºC proporciona una mejor estabilidad que a -
20ºC. Además, todos los biomarcadores se ven afectados por tres ciclos de congelación-
descongelación.
80
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