universidad de talca instituto de quimica de recursos
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UNIVERSIDAD DE TALCA
INSTITUTO DE QUIMICA DE
RECURSOS NATURALES
ESTUDIO DE METABOLITOS SECUNDARIOS Y PROTEOMICA DE ALGUNAS
ESPECIES DEL GÉNERO AZORELLA LAM. (APIACEAE)
ADRIANA PAOLA JARA BERMEO
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS, MENCION
INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
DE PRODUCTOS BIOACTIVOS.
Directora: Dra. Margarita Gutiérrez Cabrera
Codirector: Dr. Raúl Herrera Fáundez
2018
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ESTUDIO DE METABOLITOS SECUNDARIOS Y PROTEOMICA DE ALGUNAS
ESPECIES DEL GÉNERO AZORELLA LAM. (APIACEAE)
ADRIANA PAOLA JARA BERMEO
Fecha inicio tesis: Marzo, 2013
Fecha término tesis: Julio, 2018
Director de tesis: Margarita Gutiérrez Cabrera, Universidad de Talca, Instituto de Química de
Recursos Naturales, Casilla 747, Talca, Chile. Fax: (56-71) 200 448. E-mail:
Codirector de tesis: Raúl Herrera Faúndez, Universidad de Talca, Instituto de Ciencias
Biológicas, Talca, Chile. Fax: (56-71) 2200200. E-mail: [email protected]
Integrantes de la comisión de Tesis:
1. Dr. Aurelio San Martín
2. Dr. Jaime Tapia
3. Dr. Patricio Peñailillo
iii
A mis padres: Patricio y Ruth
a mis hermanas: Elizabeth y Priscila
por todo el amor y soporte incondicional en cada momento que se llevó acabo esta tesis
a mi esposo Hugo por la paciencia y comprensión.
iv
Agradecimientos:
A Dios por la sabiduría, salud y fortaleza de permitirme llegar hasta este momento especial en
mi vida profesional a la Santísima Virgen María por cuidarme y protegerme en todo momento
A CONICYT, por la beca doctoral que me permitió desarrollar mi investigación y difusión en
congresos y estadías.
Al Doctor Luis Astudillo (Q.E.P.D.) por invitarme a formar parte de su grupo de investigación,
y su valiosa ayuda en mi llegada a Chile en el año 2013, además de su gran acogida durante ese
año.
A la Doctora Margarita Gutiérrez, por la dirección en el desarrollo de esta tesis.
Al Doctor Raúl Herrera, por su gran ayuda y colaboración en el desarrollo de la técnica utilizada
en Proteómica en el Laboratorio de Fisiología Vegetal Molecular, igualmente por su excelente
disposición a cada momento para solucionar problemas.
Al Doctor Patricio Peñailillo, por su apoyo en las recolecciones de las especies vegetales en:
Constitución, Paso Vergara y Laguna del Maule.
A los Doctores Luis Fernando Echeverri, Winston Quiñonez, Fernando Torres, Gustavo
Escobar, Rosendo Archbold, por permitirme realizar mi pasantía en su laboratorio de Química
Orgánica de Productos Naturales de la Universidad de Antioquia, Medellín, por contribuir con
sus conocimientos en la elucidación estructural de los compuestos obtenidos, además de
brindarme grandes momentos en el ámbito profesional y personal.
A los integrantes del Grupo de Química Orgánica de Productos Naturales por su gran ayuda y
su sentido de compañerismo en mi estadía en Medellín.
A la Sección de Química Básica Aplicada de la Universidad Técnica Particular de Loja, Ecuador,
en especial a los Doctores Omar Malagón, Gianluca Gilardoni, por su cooperación en el análisis
de los espectros de aceites esenciales.
v
A la Dra. María Elena Cazar por su gran apoyo y ayuda desde Ecuador, con sus palabras de
ánimo como amiga, madre y profesional, siempre con alegría y buena disposición en todo
momento. Por su colaboración en la realización de los ensayos nematicidas en el laboratorio de
Biotecnología de Productos Naturales de la Universidad de Cuenca, Ecuador.
Al Doctor Aurelio San Martín, por su gran colaboración y palabras de apoyo en el primer y
segundo año de doctorado.
Al personal docente y administrativo del Instituto de Química de los Recursos Naturales de la
Universidad de Talca, por su amistad y apoyo en todo momento.
A las instituciones públicas: Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) y Conaf por su importante
colaboración en la autorización para la recolección del materia vegetal.
A todos los amigos y amigas que de alguna u otra manera contribuyeron en todo momento con
la elaboración de esta tesis en especial: Felipe, Eugenio, Janine, Marisol, Daniela y Wilson.
vi
La ciencia viene, la sabiduría se queda. -Alfred Tennyson
vii
Índice General Página
1 Introducción 1
1.1 Planteamiento del problema 1
1.2 Generalidades de la familia Apiaceae 2
1.2.1 Características morfológicas y clasificación taxonómica del género
Azorella 3
1.2.2 Usos económicos y etnobotánicos de la familia Apiaceae 4
1.2.3 Constituyentes químicos mayoritarios de la familia Apiaceae 4
1.2.4 Poliacetilenos 5
1.2.5 Flavonoides 5
1.2.6 Furanosesquiterpenos 7
1.3 El género Azorella 7
1.3.1 Características morfológicas 7
1.3.2 Distribución 9
1.3.3 Estudio fitoquímico 11
1.3.4 Actividad biológica de los metabolitos secundarios del género Azorella 15
1.4 Aceites esenciales: Generalidades 16
1.4.1 Actividad biológica de aceites esenciales 17
1.5 Estudio proteómico de especies del género Azorella 17
1.5.1 Introducción 17
1.5.2 Proteómica 18
1.6 Metabolitos secundarios de especies del género Azorella en el tratamiento
de enfermedades tropicales desatendidas 19
1.7 Potenciales aplicaciones de extractos y compuestos de especies del
género Azorella en el tratamiento de enfermedades metabólicas 20
1.8 Propuesta de estudio 21
1.9 Hipótesis y objetivos 23
1.9.1 Hipótesis 23
1.9.1.1 Objetivos generales 23
1.9.1.2 Objetivos específicos 24
2
Materiales y métodos 24
2.1 Materiales 24
2.1.1 Solventes, reactivos químicos, equipos. 24
2.1.2 Organismos modelo para evaluación de actividad biológica 27
2.1.3 Recolección del material vegetal en Ecuador 28
2.1.4 Recolección del material vegetal en Chile 29
2.2 Métodos 31
2.2.1 Obtención de extractos vegetales 31
2.2.1.1 Aislamiento de compuestos del extracto DCM de A. pedunculata 32
2.2.1.2 Fracción K 32
2.2.1.3 Fracciones 1 - 25 33
viii
2.2.2 Aislamiento de compuestos del extracto DCM de A. spinosa 33
2.2.3 Obtención de aceites esenciales de las especies de A. spinosa y A.
monantha recolectas en diferentes hábitats y estaciones del año 34
2.2.4 Determinación de las propiedades físicas aceite esencial de A. spinosa 35
2.2.5
Determinación de la composición química del aceite esencial de A.
spinosa y A. monantha recolectas en diferentes hábitats y estaciones del
año
35
2.2.6 Obtención de proteínas totales (extracción y cuantificación) 36
2.2.7 Electroforesis SDS-PAGE y revelado de gel 37
2.2.8 Bioensayos de extractos, compuestos y aceites esenciales de especies de
Azorella 37
2.2.8.1 Determinación de la actividad antioxidante de extractos de Azorella 37
2.2.8.1.1 Contenido de Fenoles Totales (TPC) 37
2.2.8.1.2 Contenido de Total de Flavonoides (TFC) 38
2.2.8.1.3 Ensayo de DPPH 38
2.2.8.1.4 Ensayo de ABTS·+ 39
2.2.8.2 Actividad antibacteriana del aceite de A. spinosa 39
2.2.8.3 Actividad citotóxica 39
2.2.8.4 Actividad anti Tripanozoma cruzi de extractos y aceites esenciales de
especies de Azorella 41
2.2.8.5 Actividad anti - Leishmania de extractos y aceites esenciales de especies
de Azorella 42
2.2.8.6 Actividad antiplasmodial de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella 43
2.2.8.7 Actividad antibacteriana quorum sensing (QS) de extractos de especies de
Azorella 44
2.2.8.8 Actividad hipoglicemiante de extractos y compuestos de especies de
Azorella 44
2.2.8.9 Actividad nematicida 45
3 Resultados y Discusión 46
3.1 Fraccionamiento del extracto de DCM y purificación de moléculas de
A. pedunculata 46
3.1.1 Fracción K 46
3.1.2 Fracciones 1 - 25 53
3.1.3 Fracción 8 - 16 53
3.1.4 Fracción 8 - 16 (9 – 10) 54
3.1.5 Fracción 8 - 16 (15 - 18) 58
3.2 Fraccionamiento del extracto de DCM y purificación de moléculas de
A. spinosa 65
3.2.1 Fracción 10 - 15 65
3.2.2 Fracción 18 - 20 72
3.3 Obtención de aceites esenciales de las especies de A. spinosa y A.
monantha recolectas en diferentes hábitats y estaciones del año 76
ix
3.3.1 Propiedades físicas aceite esencial de A. spinosa 77
3.3.2 Composición química del aceite esencial de A. spinosa 78
3.3.3 Composición química del aceite esencial de A. monantha 86
3.4 Obtención de proteínas totales (extracción y cuantificación) 92
3.4.1 Extracción y cuantificación de proteína 92
3.4.2 Electroforesis SDS - PAGE y revelado de gel 94
3.5 Bioensayos de extractos, compuestos y aceites esenciales de especies de
Azorella 95
3.5.1 Determinación de la actividad antioxidante de extractos de Azorella 95
3.5.1.1 Contenido de Fenoles Totales (TPC) 95
3.5.1.2 Contenido Total de Flavonoides (TFC) 96
3.5.1.3 Ensayo de DPPH 96
3.5.1.4 Ensayo ABTS•+ 97
3.5.2 Actividad antibacteriana del aceite esencial de A. spinosa 101
3.5.3 Actividad citotóxica de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella. 101
3.5.4 Actividad anti T. cruzi de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella. 103
3.5.5 Actividad anti-Leishmania de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella. 106
3.5.6 Actividad antiplasmodial de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella. 108
3.5.7 Quorum sensing (QS) de extractos de especies de Azorella. 110
3.5.8 Actividad hipoglicemiante de extractos y compuestos de especies de
Azorella. 111
3.5.9 Actividad nematicida de extractos de especies de Azorella. 113
4 Conclusiones y Proyecciones de la Tesis 116
5 Anexos 118
6 Referencias bibliográficas 132
x
Abreviaturas
ABTS (ácido 2,2'-azino-bis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfonico)
AChE Acetilcolinesterasa
AcOEt Acetato de etilo
ADP Adenosindifosfato
BSA Suero Fetal Bovino
BuChE Butirilcolinesterasa
CC Cromatografía en columna
CCD Cromatografía en capa delgada
CG Cromatografía de gases
CDCl3 Clororformo deuterado
CG-MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masa
COSY Homonuclear Correlation Spectroscopy
d Doblete
dd Doble doblete
DDT Ditiotreitol
DCM Diclorometano
DEPT Distortionlessenhacementbypolarization transfer
DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
EP Éter de Petróleo
EM Espectrometría de Masa
EqSI Equipo de separación Isolera
EtOH Etanol
HMQC 1H-Detected HeteronuclearMultiple Quantum Coherence
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia
xi
Hz Hertz
IE Ionización por impacto electrónico
IK Índice de Kovatz
J Constante de acoplamiento
MeOH Metanol
MIC Concentración mínima inhibitoria
mL 10-3 litro (mililitro)
mg 10-3 gramo
mm milímetro
m n.s.m metros sobre el nivel del mar
MTT Bromuro de 3-(4,5.dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
m/z Relación masa / carga
NMR Espectroscopia Resonancia Magnética Nuclear
NMR 13C Resonancia Magnética Nuclear de carbono 13
NMR 1H Resonancia Magnética Nuclear de hidrógeno 1
NP Nonidept P-40
Rf factor de retención
RP-18 Separación Cromatográfica Fase Reversa
RS Solución de Resuspensión 7M urea, 2M tiourea, 2%v/v NP-40
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute médium (medio de cultivo)
SDS Dodecilsulfato sódico
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con docecilsulfato sódico
s Singlete (en conexión con los datos de RMN)
t Triplete (en conexión con los datos de RMN)
TR Tiempo de retención
xii
CCD Cromatografía en capa fina
CCDP Cromatografía en capa delgada preparativa
TMS Tetrametilsilano
UV Ultravioleta
v/v Porcentaje volumen/volumen
δ Desplazamiento en NMR
λ Longitud de onda
°C Grados Celsius
µL 10-6 Litro
[α] Rotación óptica
xiii
Tablas
Tabla 1. Posición taxonómica de la familia Apiaceae
Tabla 2 Algunos compuestos aislados del género Azorella
Tabla 3.Microrganismos utilizados en los bioensayos
Tabla 4. Coordenadas de recolección Azorella, estación, fecha. (Fuente Autora)
Tabla 5. Datos RMN HSQC compuesto 1
Tabla 6. Datos RMN 7-hidroxi-6-metoxicumarina 1H (300 MHz) CDCl3 (compuesto 1)
Tabla 7. Datos NMR de 7-hidroxi-6-metoxicumarina 1H (300 MHz) CDCl3 y referencia
escopoletina
Tabla 8. Datos RMN 1H Stigmasterol- β -sitosterol (300 MHz) en CDCl3 (compuesto 2)
Tabla 9. Datos RMN DEPT compuesto 3
Tabla 10. Datos RMN HSQC compuesto 3
Tabla 11. Datos RMN HSQC compuesto 4
Tabla 12. Datos RMN 7-metoxi-6-hidroxicumarina(300 MHz, MeOD)
Tabla 13. Datos RMN HSQC compuesto 5
Tabla 14. Datos RMN del compuesto 7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromeno-4-
ona
Tabla 15. Coordenadas, Fecha, cantidad de recolección Azorella
Tabla 16. Resultados de la composición física del aceite esencial de A. spinosa.
Tabla 17. Resultados del Índice de refracción
Tabla 18. Resultados de la composición química de A. spinosa
Tabla 19. Resultados de la composición química de A. spinosa (Enladrillado)
Tabla 20. Resultados de la composición química de A. monantha
Tabla 21. Valores de proteína total de Azorella
xiv
Tabla 22. Contenido de Fenoles Totales (TPC)
Tabla 23. Contenido Total de Flavonoides (TFC)
Tabla 24. Resultado Ensayo DPPH
Tabla 25. Ensayo ABTS•+
Tabla 26. Resultados de citotoxicidad de Azorella
Tabla 27. Determinación actividad anti T. cruzi de Azorella
Tabla 28. Determinación actividad anti-Leishmania de Azorella
Tabla 29. Determinación actividad antiplasmodial de Azorella
Tabla 30. Determinación actividad hipoglucemiante de Azorella
Tabla 31. Determinación actividad nematicida
xv
Figuras
Figura 1. Distribución geográfica de la familia Apiaceae tomado de Global Biodiversity
Information Facility (Global Biodiversity Information Facility, 2017a)
Figura 2. Acetilenos alifáticos aislados a partir de plantas alimenticias Apiaceae
Figura 3. Flavonas e isoflavonas presentes en diferentes especies de la familia Apiaceae
Figura 4. Principales furanosesquiterpenos aislados del aceite esencial de Smyrnium
olusatrum L.
Figura 5. Azorella spinosa (Foto Autora)
Figura 6. Azorella monantha (Foto Autora)
Figura 7. Distribución geográfica de Azorella Lam tomado de Global Biodiversity
Information Facility (Global Biodiversity Information Facility 2017)
Figura 8. Distribución mundial de A. pedunculata tomado de Global Biodiversity
Information Facility (Global Biodiversity Information Facility 2017).
Figura 9. Distribución mundial de Azorella spinosa tomado de Global Biodiversity
Information Facility (Global Biodiversity Information Facility, 2017a)
Figura 10. Distribución mundial de Azorella monantha Clos tomado de Global Biodiversity
Information Facility (Global Biodiversity Information Facility, 2017a)
Figura 11. Estructura de los diterpenos Mulinano, Azorellano, Yaretano y Madreporano.
Figura 12. Porcentajes mundiales de enfermedades tropicales desatendidas (Tomado de
OMS)
Figura 13. Sitios de recolección de Azorella en la Región del Maule, Chile
Figura 14. Hidrodestilación de Azorella en aparato Clevenger.
Figura 15. Representación gráfica del ensayo de Bradford tomada de Labome.com
Figura 16. a. Verificación de crecimiento de celular promonocitico U-937 en microscopio
invertido b. Preparación de las muestras de extractos y aceites c. Placa 96 pocillos para ensayo
de citotoxicidad (Foto Aurora)
Figura 17. Reducción del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-,5difeniltetrazol)
Figura 18. Amastigotes de L. paramensis a. forma libre b. Parasito infestando a macrófagos
c. Parasito transfectado con proteína verde fluorescente y d. proteína roja fluorescente
(Foto Aurora)
Figura 19. a. Tubos con células infestadas de Plasmodium falciparum b. Tinción de gram
para identificación de P falciparum c. Eritrocitos con parasito coloreado (Foto Autora)
xvi
Figura 20. Ensayo inhibición de Quorum Sensing con extractos de Azorella (Foto Aurora)
Figura 21. Fracción FK (15 - 19)
Figura 22. Comparación de Fracciones K(15 – 19), C Total, CFR, uv corto, uv largo
Figura 23. 7-hidroxi-6-metoxicumarina (compuesto 1)
Figura 24. CCD sistema 85 % EP: 15% AcOEt
Figura 25. Stigmasterol
Figura 26. β-sitosterol
Figura 27. CCD sistema 85 % EP: 15 % AcOEt
Figura 28. CCDP fracción 8-16 (15-18) luz uv corto 254 nm
Figura 29. Propuesta de fragmentos pertenecientes al compuesto 3.
Figura 30. 2-(2-hidroxi-6,7-dimetoxi-3a,5a,8-trimetil-1,10-dioxo-
1,2,3,3a,4,5,5a,10,10a,10b-decahidrociclohepta[e]inden-3-yl) ácido propanoico (Compuesto
3)
Figura 31. Purificación fracción 10-15 Equipo de Separación Isolera 70 % EP: 30 %
AcOEt
Figura 32. Monitoreo mediante CCD de la fracción 20-27 sistema 10 % EP: 90 % AcOEt a.
luz uv corta b. uv largo c. revelado
Figura 33. Equipo de vacío para Cromatografía en Fase Reversa
Figura 34. 7-hidroxi-6-metoxi-2H-1-benzopiran-2-ona
Figura 35. CCD fracción purificada 18-20
Figura 36. 7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona
Figura 37. Cromatograma del aceite de A. spinosa
Figura 38. Cromatograma del aceite A. spinosa (Enladrillado)
Figura 39. Cromatograma del aceite de A. monantha
Figura 40. Spots de proteína en gel poliacrilamida. MW= Peso Molecular; Recolección
Azorella 5=dic 2014 6= ene2015 7= abr 2015 8= abr 2015 10= nov 2014 2= feb 2015
P= Pasto (Pennisetum purpureum) A= Apio (Apium graveolens)
Figura 41. Microplaca 96 pocillos con extractos de Azorella para ensayo QS
Figura 42. a. extracto con DCM (insoluble) b. extracto con Pluronic F127 (solución lechosa)
c. extracto soluble y transparente
Figura 43. a. Microplaca 96 pocillos con extractos de Azorella y b gusanos Panagrellus
redivuvus inmóviles e aglutinados
xvii
Esquemas
Esquema 1. Fraccionamiento del extracto de DCM (Fuente Autora)
Esquema 2. Fraccionamiento de la fracción K (Fuente Autora)
Esquema 3. Fraccionamiento en columna de sephadex extracto de
DCM (Fuente Autora)
Esquema 4. Fraccionamiento del extracto de Azorella spinosa
DCM (Fuente Autora)
Esquema 5. Protocolo de extracción de proteína
Esquema 6. Resultado del fraccionamiento del extracto de DCM
Esquema 7. Resultado de la purificación de la fracción K (15 - 19)
Esquema 8. Resultado de la separación en RP - 18 de la fracción K- 24-29
Esquema 9. Resultado del fraccionamiento del extracto crudo DCM mediante
Sephadex
Esquema 10. Resultado del fraccionamiento del extracto crudo DCM
mediante Sephadex
Esquema 11. Obtención del compuesto 3
Esquema 12. Resultado del fraccionamiento del extracto DCM de A. spinosa
Esquema 13. Resultado de la purificación en EqSI de la fracción 10-15
xviii
Resumen
La medicina tradicional ha proporcionado a la humanidad remedios con fines de sanación a sus
dolencias desde tiempos inmemoriales, algunas de estas propiedades terapéuticas han sido
encontradas en ciertos registros empíricos egipcios, la mayoría de estos remedios provienen de
plantas. En la actualidad los productos naturales son una fuente directa e importante para la
búsqueda de compuestos bioactivos, a la vez son útiles en la industria farmacéutica, cosmética,
alimenticia y agrícola (como biocontroladores).
Las especies del género Azorella Lam., pertenecientes a la familia Apiaceae, se encuentran
ampliamente distribuidas en la región Andino-Patagónica, desde Costa Rica hasta el sur de
Chile y Argentina, y son una fuente potencial de compuestos bioactivos con diversas
estructuras de tipo azorellano, yaretano y diterpenos mulinanos. Estos compuestos han sido
aislados por métodos clásicos e instrumentales a partir de extractos de diferentes polaridades,
como también, de especies recolectadas en diferentes zonas biogeográficas. La variedad de
estos núcleos químicos que se encuentran en Azorella spp. han sido reportados como
compuestos activos con diversas actividades biológicas, tales como antiinflamatoria, anti
tuberculosis, entre otras. En este contexto resulta interesante ampliar el número de especies
estudiadas químicamente.
Las especies de Azorella estudiadas químicamente, provienen de la Región Andino -
Patagónica de Chile, no conociéndose la química de las especies que habitan los Páramos de
los Andes del Norte. En este trabajo se aislaron, e identificaronmetabolitos secundarios
mayoritarios de la especie Azorella pedunculata (Spreng.) Matthias&Constance recolectada en
los páramos de los Andes del Ecuador, de la cual se tenía poca información sobre su
fitoquímica. Adicionalmente, se recolectaron dos especies en Chile Central, A. spinosa (Ruiz
et Pav.) Pers. y A. monantha Clos., de las cuales se extranjeron aceites esenciales por arrastre
de vapor. El análisis de los aceites esenciales por cromatografía gaseosa asociada a
xix
espectrometría de masas permitió obtener la composición química, asociándola con la
variación estacional en producción de compuestos mayoritarios en el caso de la especie A.
spinosa fueron de tipo monoterpenos y monoterpenos oxigenados, y para la especie A.
pedunculata compuestos mayoritarios de tipo sesquiterpenos y sesquiterpenos oxigenados.
Los resultados obtenidos permitieron ampliar el conocimiento sobre la producción de
metabolitos secundarios de la especie A. pedunculata como son: cumarina, flavonoides,
esteroles, diterpenos además de su actividad biológica: screening de actividad antibacteriana,
quorum sensing, ensayos antiparasitarios, anti Tripanosoma cruzi, anti leishmanicida,
antiplasmodial, antioxidantes, anti in vitro, actividad nematicida.
xx
Abstract
Traditional medicine has provided humanity remedies for healing ailments since ancient times.
Some of these therapeutic properties have been found to be registered in Egyptian data; the
majority of these remedies come from plants. Currently, natural products are direct and
important sources in the search for bioactive compounds as well as being useful in the
pharmaceutical, cosmetic, food, and agricultural industries (as biocontrollers).
The genus of the species Azorella Lam. belongs to the Apiaceae family, which is found widely
distributed throughout the Andean-Patagonian regions from Costa Rica until the south of Chile
and Argentina, and is a potential source of bioactive compounds with diverse structures such as
azorellane, yaretane and mulinane diterpenes. These compounds have been isolated through
classical and instrumental methods from extracts of different polarities as well as species
collected in different biogeographical zones. The variety of these chemical nuclei that are found
in Azorella spp. have been reported as active compounds with diverse biological activity such
as inflammatory, anti-tuberculosis, among others. In this context, it would be interesting to
broaden the number of species studied chemically.
The chemically studied species of Azorella are from the Andean-Patagonian Region of Chile,
not knowing the chemistry of the species that inhabit the Northern Andean Moors. In the present
research, the isolation and identification of main secondary metabolites of the species Azorella
pedunculata (Spreng.) Matthias and Constance collected in the moors of the Ecuadorian Andes,
of which there is little known about its phytochemicals. Additionally, two species collected in
central Chile, A. spinosa (Ruiz et Pav.) Pers. and A. monantha Clos. Essential oils were extracted
from both species. The analysis of the essential oils by gas chromatography and mass
spectrometry allows obtaining the chemical composition, associating it with the seasonal
variability in the production of main compounds. In the case of the species A. spinosa, the main
xxi
compounds were monoterpenes and oxygenated monoterpenes; and for the species A.
pedunculata, the main compounds were sesquiterpenes and oxygenated sesquiterpenes.
The results obtained allowed to broaden the knowledge about the synthesis of secondary
metabolites in the species A. pedunculata such as: coumarin, flavonoids, sterols and diterpenes.
In addition, the biological activity was described as: antibacterial screening, quorum sensing,
anti-parasite assays, anti-Tripanosoma cruzi, anti-leishmania, anti-plasmodial, nematicide
activity and antioxidant capacity.
xxii
Palabras Clave
Azorella pedunculata, Azorella spinosa, Azorella monantha, proteína total, aceites esenciales,
metabolitos secundarios.
1
1 Introducción
1.1 Planteamiento del problema
Los productos naturales son un área con diversas aplicaciones en química orgánica. Por muchos
años las investigaciones se centraron en el aislamiento e identificación de metabolitos
secundarios de plantas, pero en la actualidad las investigaciones están orientadas a la búsqueda
de sustancias que pueden ser utilizadas por el hombre en diferentes áreas (Gechev et al., 2014).
Actualmente, el estudio de los productos naturales permite avances valiosos en diferentes
campos, principalmente en la industria farmacéutica, agrícola, y alimenticia, esto conlleva a
implementar diferentes estrategias para su aislamiento, como también el uso de la síntesis
orgánica (Newman et al., 2003).
Los productos naturales que provienen de microorganismos, plantas y animales son una de las
fuentes más importantes para el desarrollo y obtención de nuevos fármacos (Butler, 1991), al
presentar estructuras de alta complejidad y diversidad química (Abraham, 1998). En los últimos
años se han reportado el 60 % y 75 % de los nuevos medicamentos empleados para el tratamiento
de cáncer y enfermedades infecciosas respectivamente, fueron obtenidos de fuentes naturales
(Newman et al., 2003).
Un grupo de especies que crecen en la región Altoandina de Chile y que representan a los géneros
Mulinum, Laretia y Azorella pertenecientes a la familia de las Apiaceae (tribu Mulineae) han
sido motivo de interés, debido a su homogeneidad y especificidad desde el punto de vista
químico de sus extractos de éter de petróleo, la potencialidad de las actividades biológicas
detectadas y por sus usos en la medicina folklórica (Loyola et al., 2001).
Ecuador cuenta con una gran diversidad florística, se han documentado más de 17000 especies
de plantas vasculares, de éstas 5172 especies son utilizadas con diferentes fines: el 60 %
medicinales, el 55 % como fuente de materiales de construcción, el 30 % comestibles y el 20 %
2
en usos sociales (ritos religiosos), todo estos porcentajes sobrepasan el 100 % cifra que indica
que una misma especie tiene más de un solo uso. La ventaja del uso de los recursos depende del
grupo étnico y la región geográfica de la cual proviene (de la Torre et al., 2008)
Cañar, provincia situada en el centro sur del Ecuador, presenta una altura promedio de 3.200 m
n.s.m., una temperatura fría con una mínima inferior a 0 °C, y dos estaciones lluviosas (febrero
- mayo y octubre - noviembre), la precipitación en los valles interandinos varía entre 800 y 1.500
mm/año (Cedeño & Donoso, 2010). Su población se dedica principalmente a la agricultura, la
cual se desarrolla en los páramos y pajonales andinos, donde el clima frío y húmedo es apto para
cultivos de alimentos como arroz (Oryza sativa L.), maíz (Zea mays L.), papa (Solanum
tuberosum L.), melloco (Ullucus tuberosus C.), habas (Vicia faba L.), quinoa (Chenopodium
quinoa W.). Existen también especies leñosas (maderables) y herbáceas autóctonas como son
las azorellas, musgos y líquenes (Quinde, 2001). Las etnias indígenas han logrado conservar
conservar su conocimiento ancestral, su tradición y cultura en relación con la naturaleza, una de
ellas es la comunidad de Quilloac, que continua con su medicina tradicional basada en plantas
medicinales.
1.2 Generalidades de la familia Apiaceae
La familia Apiaceae es conocida también como Umbellifereae, conformada de 434 géneros
aproximadamente y más de 3700 especies (Encyclopædia Britannica, 2017). Su distribución
mundial es cosmopolita y común en regiones templadas y relativamente rara en latitudes
tropicales (Global Biodiversity Information Facility, 2017a) (figura 1).
3
Figura 1. Distribución geográfica de la familia Apiaceae tomado de Global Biodiversity Information Facility
(Global Biodiversity Information Facility, 2017a)
La familia Apiaceae pertenece al orden Apiales, clase Magnoliopsida o Dicotiledóneas y a la
división Magnoliophyta o Angiospermas, es decir, plantas con flores (Tabla 1).
Tabla 1. Posición taxonómica de la familia Apiaceae
1.2.1 Características morfológicas de la familia Apiaceae
Algunas de las especies que conforman esta familia tienen el tallo, articulado en nudos y
entrenudos, portan hojas alternas y en su mayoría poseen láminas compuestas. Una de las
características más sobresaliente de la familia es la inflorescencia en forma de umbela, simple o
compuesta (una umbela con varias umbélas en cada extremo). La inflorescencia también puede
adquirir la forma de capítulo, por acortamiento del pedúnculo de la umbela como en Eryngium
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Apiales
Familia Apiaceae
Plantae > Tracheophyta > Magnoliopsida > Apiales >
Apiaceae > Azorella
Familly Apiaceae
434 géneros, 3780 especies
4
lassauxii Decne. Las flores en su mayoría son actinomorfas, con nectarios y generalmente,
bastante pequeñas y de color blanco. El verticilo del cáliz queda reducido a 5 dientecillos y en
algunos casos, puede ser completamente inconspicuo. La corola, dialipétala, está formada por 5
pétalos, en algún caso bilobulados
y su fruto es un esquizocarpo formado por dos mericarpos (Furnari et al., 2017).
La familia Apiaceae se encuentra dentro de las plantas con flores (Angiospermas), pertenece al
orden Apiales, y presenta la siguiente clasificación taxonómica:
1.2.2 Usos económicos y etnobotánicos de la familia Apiaceae
Esta familia se caracteriza por la producción de frutos aromáticos que constan de mericarpos, y
generalmente contienen aceites esenciales, por ejemplo algunas de las semillas se emplean como
aromatizantes: anís (Pimpinella anisum L.), comino (Cuminum cyminum L.), hinojo
(Foeniculum vulgare Mill.). Además, se usa para el arte culinario como la zanahoria (Daucus
carota L.) y en elaboraciones cosméticas y licores (Hill F. Albert, 1965) (Shelef, 2003).
Muchas especies son venenosas, como ejemplo la cicuta (Coniumm maculatum L.) empleada
por Sócrates para su muerte (Heywood, 1983). Algunas especies pertenecientes a esta gran
familia han sido empleadas en medicina tradicional para el tratamiento de enfermedades, como
es el uso de infusiones de eneldo (Anethum graveolens L.) y anís (P. anisum L.) para la
eliminación de gases y dolores intestinales; la zanahoria rallada se empleada en aplicaciones
locales para curar peladuras y quebraduras de la piel (Martinez Crovetto, 1981) (Area de
Botánica, Departament de Biología, 2014).
1.2.3 Constituyentes químicos mayoritarios de la familia Apiacae
Como se ha mencionado anteriormente esta familia contiene plantas aromáticas con frutos con
olor agradable, constituidos por componentes volátiles en sus partes como: hojas o semillas
5
(compuestos aromáticos, ácidos grasos y ácidos orgánicos) por ejemplo: cilantro (Coriandrum
sativum L.), comino (C. cyminum L.) y perejil (Petroselinum crispum (Mill.) Fuss) (Hill, 1965).
A continuación se describen los principales constituyentes químicos de la familia Apiaceae.
1.2.4 Poliacetilenos
Existe compuestos bioactivos alifáticos como poliacetilenos C - 17 (figura 2) en algunas partes
de las plantas alimenticias como por ejemplo zanahoria, (D. carotal), apio (Apium graveolens
L.) y perejil (P. crispum). Los ensayos biológicos han demostrado que estos compuestos son
biocidas para organismos como hongos, bacterias y altamente tóxicos para células de mamíferos,
siendo neurotóxicos, anti-inflamatorios, anti plaquetarios entre otros (Zidorn et al., 2005)
(Christensen & Brandt, 2006).
Figura 2. Acetilenos alifáticos aislados a partir de plantas alimenticias de la familia Apiaceae
1.2.5 Flavonoides
Otros compuestos presentes en esta familia de plantas son los flavonoides, que se caracterizan
por ser difenilpropanos, es decir, su esqueleto básico está conformado por 15 átomos de carbono,
6
se caracterizan por un sistema C6-C3-C6 y biosintéticamente proviene de la ruta del acetato y
ácido Shikimico (Gros et al., 1985).
Estos compuesto se presentan a lo largo de diferentes especies pertenecientes a esta familia, las
cuales han servido para dividir la familia Apiaceae en dos grandes grupos: el primer grupo está
compuesto por nueve tribus en el que las flavonas (3A) son raras o están ausentes y el segundo
grupo de cuatro tribus (Apieae, Dauceae, Laserpitieae y Scandiceae) en el que las flavonas son
comunes o predominantes (Zech, 1999) (Saleh et al.,1983).
Lv y colaboradores en el año 2013 reportaron en dos representantes del género Bupleurum L.
(Lv et al., 2013) flavonas con un número limitado de isoflavonas (3B) (figura 3).
Figura 3. Flavonas e isoflavonas presentes en diferentes especies de la familia Apiaceae
7
1.2.6 Furanosesquiterpenos
Del aceite esencial de la especie Smyrnium olusatrum L. (apio silvestre) se identificaron
diferentes compuestos furanosesquiterpenos (4A – 4B – 4C) (figura 4). Quassiti y colaboradores
en el año 2013, determinaron el efecto citotóxico de este aceite en líneas celulares tumorales.
Figura 4. Principales furanosesquiterpenos aislados del aceite esencial de Smyrnium olusatrum L.
1.3 El género Azorella
Azorella Lam. es un género conformado por 70 especies. La mayoría de las especies de Azorella
son conocidas comúnmente como “yareta” (Andersson et al., 2006) (Wickens, 1995) ( Muñoz
et al., 2001) (Hernández et al., 2014).
1.3.1 Características morfológicas
Planta arbustiva que crece en forma de cojínes copactos y resinosos, de color amarillo verdoso
que depende de la época del año (Lariushin, 2012).
Existen características morfológicas únicas de cada especie y considerando este estudio se
enfocará en tres especies que son: I) Azorella pedunculata; II) Azorella spinosa; y III) Azorella
monantha:
I) Azorella pedunculata Esta especie tiene forma de almohadilla, de color verde
oscuro, su tamaño es grande puede llegar hasta los 2 mm, las flores son verde a amarillas
8
pequeñas (Missouri Botanical Garden Research, 2017) (Peñafiel Cevallos, 2003) (Garden,
2017).
II) Azorella spinosa. Tallos de 10 - 15 cm de largo. Hojas con lámina rómbica, de segmentos
foliares triangulares, márgenes espinosos y venas blanquecinas muy marcadas, de 7 - 15 mm de
longitud. Los frutos son de contorno oblongo (Calviño, Fernández, & Martínez, 2016) (figura
5).
Figura 5. Azorella spinosa (Foto Autora)
III) Azorella monantha. La consistencia de esta especie es dura, color verde claro a amarillo
depende de la época de año, se presenta en forma de cojines o colchones de 2,5 a 10 cm de
tamaño. Las flores son de color amarillo y su característica está en forma de umbelas de 1 a 5
flores y están presentes en el verano (Biodiversidad, 2017) (figura 6).
Figura 6. Azorella monantha (Foto Autora)
9
1.3.2 Distribución
El género Azorella Lam se distribuye desde América Central y Occidental, hasta………,
Falklands, e Islas Antárticas (Wickens, 1995). Su presencia es muy característica en alta
cordillera de Los Andes (Global Biodiversity Information Facility, 2017b) (figura 7).
Figura 7. Distribución geográfica de Azorella Lam tomado de Global Biodiversity Information Facility (Global
Biodiversity Information Facility 2017)
En el caso de las tres especies en estudio, ellas se distribuyen:
I) Azorella pedunculata. Crece desde el sur de Colombia hasta el Ecuador.
En Ecuador crece 2.700 m n.s.m. en la provincia del Azuay, es común visualizarla en el Páramo
del Parque Nacional el Cajas (Missouri Botanical Garden Research, 2017). (Global Biodiversity
Information Facility, 2017d) (figura 8).
Plantae > Tracheophyta > Magnoliopsida >
Apiales > Apiaceae > Azorella
Azorella Lam.
10
Figura 8. Distribución mundial de A. pedunculata tomado de Global Biodiversity Information Facility (Global
Biodiversity Information Facility 2017).
II) Azorella spinosa. Al igual que las otras especies de su género, crece en la precordillera (3600 m
n.s.m.) en roquerios y lugares secos (Hernandez et al., 2014). Algunas de estas crecen incluso a nivel
del mar (Global Biodiversity Information Facility, 2017e) (figura 9).
Figura 9. Distribución mundial de Azorella spinosa tomado de Global Biodiversity Information Facility
(Global Biodiversity Information Facility, 2017a)
III) Azorella monantha Como se ha mencionado anteriormente, el habitad de las diferentes
especies de Azorella, son generalmente terrenos rocosos secos o arenosos, también la alta
montaña 2000 - 4000 m n.s.m. (Biodiversidad, 2017).
Plantae > Tracheophyta > Magnoliopsida >
Apiales > Apiaceae > Azorella spinosa
Azorella spinosa
Plantae > Tracheophyta > Magnoliopsida > Apiales >
Apiaceae > Azorella pedunculata
Azorella pedunculata
11
Esta especie se encuentra en Argentina desde los Andes hasta la Patagonia y en Chile desde la
Región Metropolitana hasta Tierra del Fuego (Lariushin, 2012) (figura 10). Distribución
mundial de A. monantha Clos (Global Biodiversity Information Facility, 2017c) .
Figura 10. Distribución mundial de Azorella monantha Clos tomado de Global Biodiversity Information Facility
(Global Biodiversity Information Facility, 2017a)
1.3.3 Estudio fitoquímico
Es característico del género Azorella la presencia de diferentes esqueletos de tipo mulinano
(6A) y azorellano (6B), además, de otras estructuras tipo yaretano (6C) y madreporano (6D)
(Wachter et al., 1999) (figura 11).
Plantae > Tracheophyta > Magnoliopsida > Apiales >
Apiaceae > Azorella monantha
Azorella monantha Clos.
12
Figura 11. Estructura de los diterpenos Mulinano, Azorellano, Yaretano y Madreporano.
En la tabla 2 se presenta compuestos diterpenos tipo mulinano y azorellano.
13
Tabla 2. Algunos compuestos aislados del género Azorella
Especie Estructura de compuestos aislados
Nombre de compuestos /
Referencia bibliográfica
A. compacta Phil.
ácido 11,13-dien-mulin-20-oico
(7A)
(Loyola et al., 1997),
ácido 11,12-epoximulin-13-en-20-
oico (7B) (Loyola et al., 1998) y
mulinol (7C)
(Loyola et al., 1997)
14
A. madreporica Clos
17-acetoxi-13α-hidroxiazorellano
(8A)
(Loyola et al., 2001)
9,11-dihidroxi-8,13-epoxiyaretano
(8B)
(Loyola et al., 2001)
11,13-dihidroxi-8,9-epoxiyaretano
(8C)
(Loyola et al., 2001)
A. yareta Hauman
13β-hidroxiazorellano (8D)
(Loyola et al., 2001)
15
1.3.4 Actividad biológica de los metabolitos secundarios del género Azorella
Diferentes estudios biológicos han sido reportados, uno ellos es la actividad tripanocida de
compuestos como: 7-acetilyaretol y ácido mulin-11,13-dien-20-oico (Luis; Loyola et al., 1998),
otra actividad del primer compuesto mencionado ha sido su efecto anti-Leishmania (Barrano,
Poma, & Spadaro, 2016) (Loyola et al., 1997), también Wächter y colaboradores en 1998, han
descrito actividad antituberculosa para este género (Wächter et al., 1998).
Otras actividades biológicas del género Azorella, tales como agentes tricomonicida (Luis Loyola
et al., 2001) (Bórquez et al., 2014), actividad antituberculosis (Molina - Salinas et al., 2010).
Diversos extractos en forma de infusiones se utilizan comúnmente como estimulante gástrico,
diuréticos, analgésicos, para el tratamiento de migraña y neuralgia, neumonía y reumatismo
(Muñoz et al., 2001) (Barrano et al. 2016). Extractos acuosos de yareta se han notificado de ser
eficaz para combatir la diabetes asociada con obesidad (Fuentes et al., 2005). Infusiones de toda
la planta se utilizan en la medicina popular en el tratamiento de la diabetes, así como para asma,
resfriados, bronquitis, enfermedades del riñón y útero (Wickens, 1995) (Villagrán et al., 2003),
actividad antibacteriana (Wächter et al., 1998), anti - inflamatoria (Delporte et al., 2003).
I) A. pedunculata La actividad bilógica de esta especie, Abad en el año 2015 reportó la
actividad anti fúngica del extracto metanólico, contra hongos fitopatógenos tales como especies
de los géneros: Acremonium y también Alternaria, demostró la capacidad antioxidante del
extracto equivalente a 488,28 µg/moles de trolox/mg de extracto, considerando la actividad
antioxidante moderada (Abad, 2015).
II) A. spinosa Quesada y colaboradores en el año 2013 realizaron la evaluación enzimática de
AChE y BuChE del extracto metanólico, reportando como activo el extracto metanólico para
AChE, e inactivo para BuChE (38) también, reportó la evaluación anti plaquetaria del extracto
metanólico de A. spinosa; inhibiendo la agregación plaquetaria inducida por ADP (Quesada et
al., 2012). Por otro lado, los autores Jara - Bermeo y colaboradores (2017), realizaron la
16
evaluación de la actividad antibacterial del extracto metanólico mediante el ensayo de micro
dilución en placa con las cepas bacterianas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Estafilococos aureus y Acinetobacter baumanni, reportando el resultado negativo para ensayo
(Jara-Bermeo et al., 2016).
III) Azorella. monantha En el análisis biológico de esta especie los autores Quesada y
colaboradores en el año 2012 evaluaron la actividad antibacteriana mediante el ensayo de micro
dilución en placas (E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y A. baumanni), ensayos antioxidantes, anti
plaquetarios y enzimáticos frente a AChE y BuChE; ellos demostraron que el extracto
metanólico de A. monantha fue el más activo en el ensayo de la actividad anti plaquetaria en
comparación con otras especies de Azorella (Quesada et al., 2012).
1.4 Aceites esenciales: Generalidades
Las plantas han aportado a las civilizaciones parte de sus componentes, que han sido utilizados
como alimentos, sus semillas como saborizantes, algunas especies de forma antiséptica,
fungicida (Bakkali et al., 2008), otro uso ha sido empleado para remediar algunas enfermedades
producidas por bacterias y virus, además de ser utilizadas en ceremonias religiosas, y sus
esencias olorosas para el cuerpo como perfume (Oil, 2016) (Bakkali et al., 2008). Los primeros
registros de estas evidencias, están documentados en el papiro de Ebers, donde se describe el
uso de extractos aromáticos en la gastronomía y común de los egipcios (Ellie Crystal, 1995).
Los aceites esenciales se carcterizan por su aroma fuerte y persistente (Martínez, 2003) (Bakkali
et al., 2008). Algunos generos de plantas producen estos aceites con diversos propósitos
biólogicos: defensa, reproducción y dispersión. Su rol en el metbolismo vegetal se asocia a
estrategias de protección de virus, bacteroas, hongos, además de factores abióticos como
radiación solar y evapotrasnpiracion. (Niemeyer et al., 2007) (Gerhard, 2010) (Oil, 2016).
17
Para su obtención a escala de laboratorio e insdustrial se aplican diferentes métodos de
extracción, siendo la más utilizada la destilación por arrastre de vapor. Este método consiste en
hacer pasar vapor de agua a través del material vegetal arrastrando los compuestos volátiles
(Bakkali et al., 2008). Otro método es la hidrodestilación, su forma de extracción es mediante el
contacto del material vegetal y agua un prensado en frío, y el método de extracción con fluidos
súper críticos (Gerhard, 2010).
1.4.1 Actividad biológica de aceites esenciales
Uno de los primeros usos en la antigüedad reportado de aceites esenciales por las civilizaciones
egipcias ha sido como un agente antibacteriano en heridas de batalla (Oils, 2017). Los aceites
esenciales son ampliamente utilizados como aditivos y conservantes en la industria de alimentos
por su actividad antibacteriana ante bacterias Gram positivas y negativas (Burt, 2004)
(Santander, 2012). Son activos fungicidas en alimentos y en fase post-cosecha previniendo el
ataque de Botrytis cinerea, Penicillium expansum, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus y
Rhizoctonia solani (Nikkhah et al., 2017) (Angioni et al.,2006). La industria farmacéutica utiliza
aceites esenciales en la preparación de formas farmacéuticas de aplicación local como
antibacterianos y antivirales (Santander, 2012) (Young Living Essential Oils, 2005).
Los estudios actuales se han enfocado en el uso de aceites esenciales en aromaterapia. Filiptsova
y colaboradores, en el año 2017, demostraron que el uso de aceite esencial de romero
(Rosmarinus officinalis L.) obtuvo un efecto significativo en el desarrollo de la memoria corta
en estudiantes secundarios. Sayorwan y colaboradores en el año 2012 también reportaron efectos
en sistema nervioso debido a la inhalación de este aceite esencial.
1.5 Estudio proteómico de especies del género Azorella
1.5.1 Introducción
18
Actualmente la investigación biológica se dirige al estudio de la expresión y función de los
genes, esto se conocen como aproximaciones “ómicas” y está dividido en 3 ramas:
Transcriptómica, Proteómica y Metabolómica (Pallas et al., 2008).
1.5.2 Proteómica
En el año de 1995 se utilizó por primera vez la palabra proteoma, como término para describir
a las PROteínas que han sido expresadas mediante un genoma (Girotti, 2010) de esa manera
nace la palabra proteoma, que da inicio a la estrategia de estudiar y comparar la gran población
de proteínas de un individuo, tejido o cultivo celular en condiciones experimentales (Ferandez
Acero, 2006).
En los últimos años, los estudios de proteómica permiten el estudio de las proteínas de tejidos,
siendo hoy, una herramienta muy útil en la identificación de las proteínas de grupos de células,
pues ellas son las encargadas de ejecutar una función específica en vías metabólicas,
biosintéticas y enzimas como en proteínas estructurales tanto en plantas y animales (Jacobs et
al., 2005) (Jorrín et al., 2006) (Trindade, 2010) (Choudhury et al., 2017).
En el pasado reciente, se han obtenido importantes logros en el conocimiento del genoma de
organismos modelo: Arabidopsi thaliana, Oryza sativa, Zea mays y Medicago. Esta información
ha permitido evaluar los procesos bioquímicos a nivel protéico y asociarlos con funciones
enzimáticas, de regulación y estructurales, codificadas por el genoma y transcriptoma (Qureshi
et al., 2007).
Se denomina era post-genómica a la proteómica desarrollada actualmente, son varios los
resultados bibliográficos que han utilizado esta herramienta biológica (Jacobs et al., 2000). Sin
embargo, aún queda mucho por conocer en referencia a familias y géneros de plantas, un ejemplo
es el caso de la familia Apiaceae, género Azorella.
19
1.6 Metabolitos secundarios de especies del género Azorella en el tratamiento de
enfermedades tropicales desatendidas
La leishmaniasis, el mal de chagas y la malaria son un grupo de enfermedades tropicales
desatendidas que afectan a las poblaciones en desarrollo en entornos con pocos recursos. Estas
son ligadas a la pobreza, generando un ciclo vicioso, siendo un importante problema de salud,
estas condiciones facilitan la transmisión de vectores y patógenos, contribuyendo a la
disminución de la productividad por muerte temprana, discapacidad y estigma social provocado
por las lesiones corporales en el desarrollo de ésta (Bhutta et al.,2014) (Londoño et al., 2016).
Los diferentes brotes epidemiológicos no siempre se limitan a una zona geográfica determinada,
situación que implica redoblar esfuerzos de control para su eliminación (Bhutta et al., 2014).
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) se estima que las enfermedades tropicales
desatendidas están presentes en más de 1.000 millones de personas que padecen de una o más
de estas enfermedades y viven en zonas de alto riesgo de contraerlas (figura 12) (OMS, 2017).
Figura 12. Porcentajes mundiales de enfermedades tropicales desatendidas (Tomado de OMS)
20
La baja disponibilidad de medicamentos para el tratamiento de estas enfermedades, se debe, en
parte a la falta de inversión y estímulo a investigaciones orientades al descubrimiento de nuevos
núcleos químicos, para el desarrollo de fármacos.
El tratamiento actual para la Leishmaniasis cutánea incluye drogas antimoniales pentavalentes
(antimoniato de meglumina y estibogluconato de sodio). Para enfermedad de Chagas se dispone
de compuestos nitroaromáticos (benznidazol y nifurtimox).
Infecciones con Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax son tratadas con amodiaquina,
sulfadoxina / pirimetamina, generando casos de resistencia (Londoño et al., 2016). En este
contexto, es necesario un replanteamiento del enfoque de nuevos agentes a partir de varias
especies de plantas medicinales, que constituyen una alternativa viable en un gran número de
países en vías de desarrollo.
Del género Azorella, Loyola y colaboradores en el año 2004 aislaron dos diterpenos tipo
mulinano de A. compacta Phil, estos fueron evaluados in vivo como agentes antiplasmodiales en
la especie Plasmodium berghei NK 65, los autores reportaron un porcentaje de inhibición de
crecimiento del 60 %. De igual manera Araya y colaboradores en el año 2003, evaluaron la
actividad tripanocida de compuestos aislados de A. compacta, estos inhibieron el 60 % del
desarrollo de amastigotes intracelulares de T. cruzi.
Estos resultados aportan a la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos obtenidos de plantas
medicinales para enfermedades tropicales desatendidas.
1.7 Potenciales aplicaciones de extractos y compuestos de especies del género Azorella en
el tratamiento de enfermedades metabólicas.
Desde 1975, la obesidad se ha casi triplicado en todo el mundo, siendo esta condición asociada
con el desarrollo de enfermedades metabólicas como la diabetes mellitus. El crecimiento de esta
21
patología es alarmante, según la OMS esta enfermedad será la séptima causa de muerte en el año
2030 (Mathers & Loncar, 2006) (OMS, 2016).
La diabetes mellitus engloba varios problemas metabólicos que a su vez causan patología en
diferentes partes del cuerpo: corazón, nervios, vasos sanguíneos, ojos, pies, riñones. Su agente
causal es la elevación de niveles de azúcar en la sangre, causados por la deficiencia de insulina
producida en las células beta del páncreas, o por la falta de respuesta de células del cuerpo a la
insulina producida (Bourne et al., 2013) (Saran et al., 2015) (Sarwar et al., 2010).
Se presenta 3 variedades: diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, diabetes gestacional. Los factores que
incrementan la tasa personas con esta enfermedad son: el sedentarismo, mala alimentación, y
causas hereditarias (Panagiotopoulos et al., 2013) (OMS, 2017).
Según el reporte de la OMS del año 2016, Chile es el país con más sobrepeso de Latinoamérica,
bajo el estudio "Panorama de la Seguridad Alimentaria y Nutricional en América Latina 2016"
(El Mostrador, 2017). El número de muertes por diabetes anual en personas de: 30 - 69 años es
640 en hombres y 420 en mujeres; para personas de 70 años o más: es 1.000 en hombres y 1.150
en mujeres (Organización Panamerica de la Salud, 2016).
Se ha descrito varios ensayos in vitro e in vivo, con el objetivo en una búsqueda de nuevas
moléculas activas de origen vegetal, teniendo un rol importante algunas especies en particular,
por ejemplo Fuentes y colaboradores en el año 2005 demostraron el efecto anti hiperglucémico
de compuestos tipo diterpenos aislados de la especie A. compacta en ratas de compuestos tipo
diterpenos aislados de la especie A. compacta.
1.8 Propuesta de estudio
Se conoce que las especies del género Azorella de Chile y Argentina, producen metabolitos
secundarios con núcleos únicos de tipo diterpeno mulinano, azorellano, yaretano y madreporano,
22
con promisorias actividades biológicas. Con este fundamento se propone realizar el estudio de
la especie Azorella pedunculata de Ecuador, cuyas características químicas se desconocen.
Además, se propone comparar el perfil de compuestos volátiles de aceites esenciales y proteínas
totales de dos especies de Azorella recolectadas en la Región del Maule.
23
1.9 Hipótesis y objetivos
1.9.1 Hipótesis
La especie A pedunculata colectada en la comunidad de Quilloac, Cañar - Ecuador comparte
núcleos químicos característicos del género Azorella, así como las bio-actividades de estos.
Existe relación entre la composición de volátiles y la cuantificación del perfil proteico, de las
especies de A. spinosa y A. monantha recolectadas en Chile y analizadas en diferente época del
año.
1.9.1.1 Objetivos generales:
1. Aislar e identificar metabolitos secundarios mayoritarios presentes en la especie
A.pedunculata recolectada en Ecuador, a fin de evaluar la actividad biológica frente a diferentes
blancos terapéuticos.
2. Analizar la variación de componentes volátiles y proteicos de dos especies de Azorella
recolectadas en épocas diferentes.
1.9.1.2 Objetivos Específicos:
1. Obtener extractos de diferente polaridad de la especie A. pedunculata.
2. Aislar y purificar los diferentes metabolitos secundarios característicos del género presentes
en A. pedunculata.
3. Elucidar las estructuras de los metabolitos aislados de A. pedunculata.
4. Evaluar la actividad antioxidante y antibacteriana de los extractos y metabolitos secundarios
aislados de la especie A. pedunculata.
5. Obtener y analizar los componentes volátiles de dos especies de Azorella en diferentes
épocas del año.
6. Analizar la variación en la composición proteica de dos especies de Azorella recolectadas
en Chile en diferentes épocas del año.
24
2. Materiales y métodos
2.1 Materiales
2.1.1 Solventes, reactivos químicos, equipos
En la extracción del material vegetal se utilizó los siguientes solventes: EP, AcOEt, DCM,
MeOH de grado técnico destilados, en proporciones diferentes estableciéndose, mezclas entre
ellos.
En cromatografía de capa delgada (CCD), se utilizaron cromatofolios de sílica gel F254 tamaño
20 x 20 cm y 0,20 mm de espesor (Merck, Darmstadt, Germany). Los cromatogramas fueron
revelados con agentes crómoforos Revelado Universal: ácido sulfúrico concentrado al 5 % y
etanol 95 %. Revelado vainillina: vainillina al 1 % en ácido sulfúrico al 5 %.
En cromatografía en columna (CC), la fase estacionaria utilizada fue sílica gel 60 (Merck,
Darmstadt, Germany). En las separaciones desarrolladas con el sistema de purificación flash
IsoleraTM, se utilizó sílica gel 0,40 - 0,20 nm (Merck, Darmstadt, Germany). Las fases móviles
fueron preparadas mezclando solventes con grado técnico en polaridad creciente.
En cromatografía de capa delgada preparativa (CCDP), se utilizaron placas de vidrio cubierta
con sílica gel F254 con yeso (Merck, Darmstadt, Germany). Como fase móvil se utilizaron
sistemas de solventes descritos anteriormente. Los patrones de separación se analizaron bajo
lámpara UV a 254nm.
Se realizaron permeaciones en Sephadex LH-20 (Merck, Darmstadt). Como fase móvil se
empleó un sistema de solventes EP - DCM -MeOH (grado analítico destilados), equilibrando la
25
columna antes del uso. Las fracciones obtenidas se analizaron en CCD bajo lámpara UV a 254
y 365 nm.
En cromatografía en Fase reversa (RP- 18), se utilizó sílica gel RP -18 (40 - 63 µm) (Merck,
Darmstadt). La fase móvil se preparó usando solventes polares MeOH, Acetona (grado analítico
destilados) y agua destilada, equilibrando la columna antes del uso. Las fracciones obtenidas se
analizaron en CCD bajo lámpara UV a 254 y 365 nm.
Para la elucidación estructural de compuestos puros se aplicó espectroscopia de Resonancia
Magnética Nuclear (RMN), en la Universidad de Antioquia – Medellín, en un equipo Bruker
Avance 300 MHz. Se usó como referencia interna la señal del TMS, para protón 1H y carbono
13C. Los compuestos fueron disueltos en cloroformo deuterado CDCl3, acetona deuterada A -
D6, metanol deuterado me-D4 (grado analítico, Merck, Darmstadt). Los valores de
desplazamiento químico (δ) se reportan como ppm; las constantes de acoplamiento (J) en Hz.
La obtención de aceites esenciales de las especies de Azorella, se realizó en el laboratorio de
Plantas Aromáticas de la Universidad de Talca. Se utilizó una trampa tipo Clevenger y sulfato
de sodio anhidro (Merck, Darmstadt).
La determinación de la composición química de aceites esenciales de las especies de Azorella,
se realizó mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas GC- MS, en el
departamento de Química Básica de la Universidad Técnica Particular de Loja - Ecuador. Se
usó un equipo Agilent Technologies 6890N equipado con detector (GC/MS), acoplado a una
columna DB-5 MS, con columna capilar (30 m x 0.25mm i,d, espesor 0.25µm), utilizando helio
como gas trasportador a (49,6 psi). Las muestras fueron diluidas en 5 % DCM grado analítico
26
HPLC. Además se utilizó una mezcla de alcanos (C9 – C28) grado analítico marca Merck,
Darmstadt.
En la determinación de las propiedades físicas de aceite esencial, se utilizó un picnómetro (marca
Boeco Germany) 20 ºC de temperatura y agua destilada para la determinación de la densidad.
Además se determinó el Índice de refracción con un refractómetro ABBE, (marca Boeco
Germany)
La extracción y cuantificación de proteína de las especies de Azorella, se realizaron el laboratorio
de Laboratorio de Fisiología Vegetal Molecular, del Instituto de Biología de la Universidad de
Talca, en estos protocolos se utilizaron: solución a 10mM de DTT para la extracción de proteína.
En la cuantificación de proteínas totales se utilizó el reactivo de Bradford y una solución de
BSA, (anexo 23, 24).
En la electroforesis SDS - PAGE y revelado de gel, se utilizaron las siguientes soluciones:
running buffer 1X2 litros, solución de 30 % acrilamida / 0,8 % bisacrilamida, solución de
running buffer 1X2 litros, solución de tinción de gel, solución de destinción de gel (anexo 1).
Los siguientes ensayos de actividad antioxidante “in vitro” realizados en el Laboratorio de
Plantas Aromáticas en la Universidad de Talca. La absorbancia de las muestras fue medida en
un espectrofotómetro (Thermo Spectronic Genesys 10 UV).
Para evaluar contenido de Fenoles Totales (TPC), se utilizó el Reactivo de Folin - Ciocalteu
grado analítico, acido gálico y Carbonato de Sodio (marca Merck, Darmstadt).
En la cuantificación de flavonoides totales (TFC). Los reactivos utilizados fueron; cloruro de
aluminio, quercetina y metanol, grado analítico (Merck, Darmstadt). En la evaluación de la
27
captura del radical libre estable DPPH los reactivos utilizados fueron: 2,2-difenil-1-
picryhydrazyl, Trolox®, y metanol grado analítico (Merck, Darmstadt).
Para evaluar el potencial de captura del radical libre estable ABTS•+ los reactivos utilizados
fueron 2,2'-azino-bis(3-etillbenzotazolin-6-sulfónico), persulfato potásico, ácido ascórbico y
etanol grado analítico (Merck, Darmstadt).
2.1.2 Organismos modelo para evaluación de actividad biológica
Los microorganismos utilizados en la actividad bacteriana fueron obtenidos de infecciones de
plantas y clasificados en el laboratorio de Fitopatología: Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis, obtenida del tomate (Solanum lycopersicum); Erwinia carotova subsp.
carotova, obtenido del ají (Capsicum annuum L.); Xanthomonas sp. obtenido del fréjol
(Phaseolus vulgaris L.) y Pseudomona syringae obtenida del tomate (Solanum lycopersicum
L.).
La taxonomía, origen y aplicación de organismos modelo usados en los bioensayos desarrollados
en este trabajo de investigación se presenta en la siguiente tabla:
28
Tabla 3. Microrganismos utilizados en los bioensayos
Microorganismos Bioensayo Origen
Bacterias Fitopatógenas
Gram positivas:
Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis
Gram negativas:
Erwinia carotova subsp.
carotova
Xanthomonas sp.
Pseudomona syringae
Screening de actividad
antibacteriana
Laboratorio de Fitopatología
Universidad de Talca
Parásitos:
Amastigotes de Tripanosoma
cruzi
Amastigotes de Leishmania.
Paramensis
Plasmodium falciparum
Ensayos antiparasitarios
anti Tripanosoma cruzi
anti leishmanicida
anti plasmodial
Laboratorios del
Programa de estudio y control de
enfermedades tropicales, (PECET)
Universidad de Antioquia - Medellín -
Colombia
Bacteria anaerobia:
Chromobaterium violaceum
mutante CV026
Quorum sensing (QS)
Grupo de Química Orgánica de
Productos Naturales Universidad de
Antioquia – Medellín - Colombia
Nematodo:
Panagrellus redivuvus
Actividad nematicida
Laboratorio de Biotecnología de
Productos Naturales
Universidad de Cuenca – Ecuador
2.1.3 Recolección del material vegetal en Ecuador
Partes áreas de A. pedunculata fueron recolectadas en la Comunidad de Quilloac, Cañar,
Ecuador, en 2014 a 3.778 m n.s.m. (coordenadas geográficas 2º34’24’S y 78’59’30’W).
También se obtuvieron muestras de A. pedunculata en Sayausí, Azuay a 2.771 m n.s.m.
29
(coordenadas geográficas 2°52′24″S y 79°04′22″W) y la Comunidad Cebadas Comunidad
Cebadas, Chimborazo a 3800 m n.s.m. (coordenadas geográficas 1°56′00″S y 78°28'00.0"W).
Un ejemplar botánico reposa en el Herbario de la Universidad del Azuay (HA) (voucher No.
2705).El material fue seleccionado, secado y pulverizado en el Laboratorio de Biotecnología de
la Universidad de Cuenca.
2.1.4 Recolección del material vegetal en Chile
Se recolectaron 2 especies de Azorella, en 3 épocas diferentes del año (primavera - verano -
otoño) comprendido entre el tercer trimestre del año 2014 y el primer - segundo trimestre del
año 2015. Solamente A. spinosa fue recolectada por única vez en mes de Abril del 2015 en
Vilches (coordenadas geográficas 35°36’07.0’’S y 70°56’49.0’’W) (Enladrillado).
La especie A. spinosa fue recolectada en la localidad de Pantanillos a 23 km de Constitución
(coordenadas geográficas 35º 12‘S y 70º 31‘ W). (Prov. Talca, Región del Maule, Chile),
depositada con número de voucher 3360 en el Herbario de la Universidad de Talca.
De igual forma se recolectó la especies A. monantha, en Paso Vergara ubicado a 96 km de
Curicó (coordenadas geográficas 35º 12‘S y 70º 31‘ W). (Prov Curicó, Región del Maule,
Chile) y en la Laguna del Maule ubicada a 150 km de Talca (coordenadas geográficas 35°59’S
y 70°24’ W ). (Prov. Talca, Región del Maule, Chile), depositado con número de voucher 3361
en el Herbario de la Universidad de Talca.
Igualmente se recolectó la especie A. spinosa en Altos de Vilches (Sector Enladrillado y Piedra
del mono) ubicado a 53 kilómetros de Talca (Prov. De Talca, Región del Maule, Chile)
depostiado con número de voucher 3360, Herbario de la Universidad de Talca.
El material vegetal recolectado fue procesado en el Laboratorio de Síntesis Orgánica y Actividad
Biológica de la Universidad de Talca, obteniendo extractos y aceites esenciales.
30
En el mapa de la figura 13 se observa el lugar de recolección del material vegetal de cada especie
de Azorella.
Figura 13. Sitios de recolección de Azorella en la Región del Maule, Chile
Las muestras de A .spinosa y A. monantha, usadas en la extracción y cuantificación de proteínas
totales, fueron colocadas en contacto con nitrógeno líquido en el sitio de recolección, y
trasladadas al congelador - 80 ºC, para evitar la degradación de proteínas.
En la tabla 4 se indica la especie de Azorella, coordenadas geográficas, fechas de salida de
recolección de campo.
Área de recolección de Azorella Chile
Región de Maule
Azorella spinosa Azorella monantha
Constitución Paso Vergara
Vilches Laguna del Maule
31
Tabla 4. Coordenadas de recolección Azorella, estación, fecha. (Fuente Autora)
2.2 Métodos
2.2.1 Obtención de extractos vegetales
Las partes aéreas de las especies de Azorella fueron seleccionadas y limpiadas en estantes de
aluminio. El secado se realizó en un ambiente fresco y seco: posteriormente el material vegetal
fue pulverizado y empaquetado para su traslado al laboratorio de Síntesis Orgánica en el Instituto
de Química de los Recursos Naturales de la Universidad de Talca.
Especie
Lugar de
recolección
Estación del
año
Fecha de
recolección
A) Azorella spinosa
Constitución,
Pantanillos
310 m n.s.m.
Primavera 21-11-14
Verano
27-02-15
Otoño 14-04-15
B) Azorella spinosa
Reserva Nacional
Altos de Lircay
Enladrillado
2200 m n.s.m.
Verano 12-02-15
C) Azorella monantha Laguna del Maule
2553 m n.s.m.
Primavera 19-12-14
Paso Vergara
2505 m n.s.m.
Verano 22-01-15
Otoño 07-04-15
32
El material vegetal de Azorella, fue colocado en contacto con solventes de diferente polaridad,
desarrollándose la extracción solido - líquido con EP a temperatura ambiente durante 48 horas.
Los sobrenadantes fueron concentrados a presión reducida en rotavapor (40 ºC), este
procedimiento se ejecutó por triplicado. Este proceso se realizó con solventes DCM, AcOEt, y
MeOH.
2.2.1.1 Aislamiento de compuestos del extracto DCM de A. pedunculata
El extracto diclorometánico de A. pedunculata fue sometido a una separación en columna
flash. La fase móvil utilizada fue una mezcla de solventes EP:AcOEt: MeOH. Las condiciones
de separación se presentan en el Esquema 1.
Esquema 1. Fraccionamiento del extracto de DCM (Fuente Autora)
2.2.1.2. Fracción K
Esta fracción proviene de la extracción con 100% AcOEt (esquema 1).
En el esquema 2 se describe el procedimiento de obtención de esta fracción.
100%
EP
columna flash
polaridad creciente
EP : AcOEt
90%
EP
80%
EP
70%
EP
60%
EP
30%
EP
50%
EP 40%
EP
20%
EP 10%
EP
100%
AcOEt 50% AcOEt
50% MeOH
100%
MeOH
extracto
DCM
33
Esquema 2. Fraccionamiento de la fracción K (Fuente Autora)
2.2.1.3 Fracciones 1 - 25
Esquema 3. Fraccionamiento en columna de sephadex extracto de DCM (Fuente Autora)
2.2.2 Aislamiento de compuestos del extracto DCM de A. spinosa
Mediante separación cromatográfica por Sephadex, fue separado el extracto de DCM de A.
spinosa, se utilizó el mismo procedimiento descrito en el esquema 4.
10: 90
Fracción K
1,64 gramos
Columna flash, polaridad
creciente
EP : AcOEt
90:10 75:25 55:45 25:75 100%
AcOEt
0:10
Extracto
DCM
Columna sephadex
500gramos
Sistema isocrático
50 % EP: 25% DCM: 25 % MeOH
34
Esquema 4. Fraccionamiento del extracto de A. spinosa DCM (Fuente Autora)
2.2.3 Obtención de aceites esenciales de las especies de A. spinosa y A. monantha recolectas
en diferentes hábitats y estaciones del año
Una consideración importante en la extracción de aceite esencial es el tiempo al procesar las
muestras vegetales, esto puede afectar su rendimiento y composición, de esta manera la técnica
para extraer sus componentes volátiles es la destilación.
Las especies vegetales que fueron sometidas al proceso de hidrodestilación (figura 15), según
la metodología de López y colaboradores 2014 (Lopez et al., 2014) en la trampa tipo Clevenger,
aproximadamente 300 gramos de material vegetal durante 1 hora, al destilado se colocó sulfato
de sodio anhidro, se filtró y almacenó a 4 °C para su posterior uso.
Figura 14. Hidrodestilación de Azorella en aparato Clevenger.
Extracto
DCM
Separación columna
Sistema isocrático
50 % EP: 25% DCM: 25 % MeOH
35
2.2.4 Determinación de las propiedades físicas aceite esencial de A. spinosa
La densidad del aceite esencial de Azorella fue calculado con la siguiente fórmula:
Donde; P = densidad m = masa v = volumen
Este parámetro depende de la especie, lugar de origen y condiciones atmosféricas en el cual se
desarrolle la planta (Silva et al., 2011).
El índice de refracción es una propiedad física de control de pureza y calidad a una determinada
temperatura, está basado en la fórmula: 𝑛𝐷𝑡 - 𝑛𝐷
𝑡 + 0,0004 (t’ - t)
Donde: 𝑛𝐷𝑡 = valor de lectura a la temperatura
0.0004 = factor de corrección
t’= temperatura a la que se efectuó la temperatura
t = 20 ° C
2.2.5 Determinación de la composición química del aceite esencial de A. spinosa y A.
monantha recolectas en diferentes hábitats y estaciones del año
Para el análisis del aceite se procedió de la siguiente manera: se disolvieron 5 µL de aceite en 1
mL de DCM, se inyectó en modo Split 1 µL, fue inyectado automáticamente en Split 50:1, en
un cromatógrafo de gases, temperatura inicial 50 ° C durante 5 minutos, la rampa de 5 °C por
minuto hasta llegar a 220 °C durante 10 minutos y finalmente una rampa de 60 ° C por minuto
hasta llegar a 250 ° C durante 10 minutos, utilizando helio (49,6 psi) como gas de arrastre.
La composición relativa del aceite esencial fue basada en las áreas relativas de cada peak, la
identificación de cada componente se realizó mediante el análisis de los espectros de masas
comparándolos con los espectros almacenados en librería Wiley 7n.1 del equipo, el análisis del
tiempo de retención (TR) fue identificado con una mezcla del alcanos
36
1. Selección de planta fresca (solo Hojas, tallo)
2. Pulverizar la especie vegetal con nitrógeno líquido
3. Tomar 200 mg de polvo fino en un eppendorf
4. Colocar 1,5 mL 10 mM DTT en etanol
5. Centrifugar 15 minutos a 3 °C, 13000 rpm
6. Sacar los eppendorf y homogenizar manualmente
7. Incubar 3 horas a - 80 °C
8. Colocar en el voltrex durante 5 segundos
9. Descartar sobrenadante añadir 1,5 mL 10 mM DTT en etanol, (2 veces)
10. Homogenizar rn voltrex y centrifugar (repetir el procedimiento 2 veces)
11. Incubar 3 -16 horas a -80 °C
12. Desechar el sobrenadante, centrifugar 15 minutos a 3 °C, 13000 rpm
13. Secar al vacío 10 minutos a temperatura ambiente
14. Colocar 1mL de RS
15. Centrifugar 10', 13000 rpm, temperatura ambiente
16. Tomar el sobrenadante que contiene la proteína
(C9 – C28) utilizando la ecuación de Van den Dool and Kratzy, estos valores y sus espectros de
masa fueron comparados con los reportados en el compendio: Identification of Essential Oil
components by Gas Chromatography/ Mass Spectroscopy de Adams 2007 (Adams, 2007).
2.2.6 Obtención de proteínas totales (extracción y cuantificación)
En el esquema 5 se describe el procedimiento realizado para la extracción de proteína de las
especies A. monantha y A. spinosa recolectadas en la cordillera y en la costa de la Región del
Maule.
Esquema 5. Protocolo de extracción de proteína
La cuantificación de la concentración de proteína se realizó por el método de Bradford descrito
por Ashoub y colaboradores 2011 (Ashoub et al., 2011).
Este método se basa en el cambio de color del azul de coomasie al unirse con la proteína
(Labome.com, 2017). La medición y cuantificación se realiza en un espectrofotómetro modelo
Jenway 6300.
37
Figura 15. Representación gráfica del ensayo de Bradford tomada de Labome.com
Para calcular la concentración de proteína de las especies de Azorella, se usa una curva
estándar a partir de patrones de referencia de la proteína albumina de suero bovino (BSA).
2.2.7 Electroforesis SDS-PAGE y revelado de gel
Para la separación de proteínas se utilizó el método de electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato (SDS - PAGE), condiciones denaturantes. Este fue preparado usando un gel
discontinuo de poliacrilamida (12 % separación y 4 % concentración) de acuerdo con el método
de Ashoub y colaboradores 2011 (Ashoub et al., 2011) utilizando el equipo mini Protein II
(Biorad). Se colocó 20 µL de proteína obtenida de cada una de las diferentes especies de
Azorella, junto con el marcador de peso molecular (marca Merck) fueron colocados en el gel,
también se colocó los patrones de referencia: Pasto (Pennisetum purpureum) y Apio (A.
graveolens L.). El voltaje utilizado fue constante de 100 mV durante 120 minutos.
Para la visualización del gel se realizó una tinción de 24 horas con azul de coomassie según
Blakesley y colaboradores 1977 (Blakeskey & Boezi, 1977).
2.2.8 Bioensayos de extractos, compuestos y aceites esenciales de especies de Azorella
2.2.8.1 Determinación de la actividad antioxidante de extractos de Azorella
2.2.8.1.1 Contenido de Fenoles Totales (TPC)
El contenido de fenoles totales fue determinado mediante el método de Folin-Ciocalteu descrito
por Singleton y colaboradores 1965 (Singleton & Rossi, J. A., 1965). En este ensayo se utilizó,
38
el extracto de Azorella (100 µg/mL) standard (ácido gálico), estos fueron mezclados con agua
destilada junto con el reactivo de Folin - Ciocalteu. La reacción fue homogenizada por 8 minutos,
después se adicionó Carbonato de Sodio al 20 %. Finalmente, se incubó durante 2 horas en una
habitación en ausencia de luz, temperatura ambiente, la absorbancia fue medida por un
espectrofotómetro a longitud de onda de 765 nm.
2.2.8.1.2 Contenido de Total de Flavonoides (TFC)
El contenido de flavoniodes fue determinado mediante el método de Zhishen y colaboradores
1999 (Zhishen et al., 1999) basado en la formación de un complejo flavonoide - aluminio,
mediante espectrofotometría, la absorbancia fue obtenida medida en un espectrofotómetro a
longitud de onda de 510 nm.
2.2.8.1.3 Ensayo de DPPH
El método fue el empleado por Brand-Williams y colaboradores (1995) y Molyneux (2004. Se
empleó una alícuota de cada extracto de las especies de Azorella (10, 50 y 100 µg/mL) y un
control (80 % MeOH), estos fueron mezclados con el reactivo de DPPH a concentración de 20
μg/mL. Después se homogenizó vigorosamente y se dejó en reposo durante 30 minutos en la
oscuridad. La mezcla fue medida por espectrofotometría a longitud de onda 515 nm. La
captación de radicales libres se calculó como porcentaje de decoloración del DPPH, utilizando
la siguiente ecuación: % DPPH radical libre = 100 × (1 - AE/AD), donde: AE, es la absorbancia
de la solución después de adicionar el extracto o la fracción.
AD es la absorbancia del blanco de la solución de DPPH.
Quercetina fue usado como compuesto de referencia.
39
2.2.8.1.4 Ensayo de ABTS+
El método utilizado para este ensayo fue de Re y colaboradores en el año 1999 (Re et al., 1999),
se preparó una solución madre de 7 mM de ABTS junto con 2,45 mM de persulfato potásico,
esta mezcla se incubó durante 12 horas a temperatura ambiente en oscuridad, el resultado de este
paso fue la producción de radicales libres ABTS+. El control fue preparado con metanol con
2900 µL de solución madre y 100 µL de etanol/ H2O (1:1).
Se empleó una alícuota de cada extracto de las especies de Azorella (300 μL) junto con 3 mL de
solución estándar de trabajo de ABTS. La absorbancia fue medida 1 minuto después de realizar
la mezcla, y la observación final a los 6 minutos. Ácido ascórbico fue utilizado como control
positivo, valor de IC50 de 35 µg/mL. Se utilizó la siguiente fórmula: % radical libre = [(A0 - As)/
A0] x 100, donde: A0, es la absorbancia del control y As es la absorción de la solución del
extracto. La absorbancia fue medida en un espectrofotómetro a longitud de onda de 732 nm.
2.2.8.2 Actividad antibacteriana del aceite de A. spinosa
Se determinó la actividad antibacteriana del aceite de A. spinosa (Constitución), metodología
utilizada en este ensayo se describe en Jara - Bermeo y colaboradores (2016), las bacterias
fitopatógenas utilizadas fueron: Erwinia carotova subsp. carotova, Capsicum annuum,
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Solanum lycopersicum, Xanthomonas,
Pseudomona syringae.
2.2.8.3 Actividad citotóxica
Se evaluó la actividad citotóxica de extractos y aceites esenciales del género Azorella, mediante
células humanas promonocíticas U - 937 con MTT (bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)2,5
difeniltetrazolio) mediante la metodología descrita por Pulido y colaboradores 2012 (Pulido et
al., 2012).
40
Las células fueron previamente cultivadas en frascos plásticos de 25 mL y lavadas con Buffer
fosfato salino (PBS), fueron ajustadas a un valor de 1x106 con suplemento RMPI 1640 y 10 %
de suero fetal bovino (FBS) y doxorrubicina (1 g/mL) (figura 16) los extractos y aceites
esenciales del género Azorella, se ensayaron concentraciones de 200 µg/mL. Se colocó en cada
pocillo 0,4 µL de cada muestras, junto con 0,8 mL de células preparadas, el control positivo
(doxorrubicina) 5 µL, y el control negativo solo células.
Figura 16. a. Verificación de crecimiento de celular promonocitico U-937 en microscopio invertido b. Preparación
de las muestras de extractos y aceites c. Placa 96 pocillos para ensayo de citotoxicidad (Foto Aurora)
Las placas de 96 pocillos fueron incubadas por 72 horas a temperatura 37 º C, ambiente de 5 %
de CO2 junto cada extractos y aceites esenciales de Azorella; la efectividad fue medida por el
método enzimático de la enzima mitocondrial succinato - deshidrogenasa. A cada pocillo se
adicionó 10 µL (0,5 mg/mL) y se incubó 37 º C por 3 horas. La reacción enzimática fue detenida
con 100 µL de solución de 50 % de isopropanol y 10 % de SDS (sodio dodecil sulfato) durante
30 minutos de incubación.
La variabilidad de las células fue determinada mediante la formación de cristales de
formazán (figura 17), que fueron medidos por densidad óptica (OD) a 570 nm en un
espectrofotómetro. El control del ensayo se desarrolló en ausencia de extractos y aceites
esenciales del género Azorella. El control positivo que contenía doxorrubicina se utilizó como
control de citotoxicidad. Los ensayos se realizaron por duplicado.
a b c
41
Figura 17. Reducción del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-,5difeniltetrazol)
2.2.8.4 Actividad anti Tripanozoma cruzi de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella
La actividad anti T. cruzi de los extractos y aceites del género Azorella, fue realizado en
amastigotes intracelulares de T. cruzi transfectada con gen de β-galactosidasa. La actividad fue
determinada mediante la capacidad de extractos y aceites esenciales del género Azorella, para
reducir la infección de células U - 937 como se describe en la metodología propuesto por
Londoño y colaboradores en (2016). La actividad inicialmente fue analizada en una
concentración de 20 mg/mL, se colocó 100 µL de células U - 937 a una concentración de 2,5 x
105 células/mL en RPMI - 1640, junto 10 % suero fetal bovino y 0,1 µL de PMA todo ello fue
colocado en placas de 96 pocillos para luego adicionar epimastigotes de crecimiento en relación
5:1, se incubó a 37 º C en una atmosfera de CO2 durante 72 horas, luego se añadió 0,56 µL de
cada muestra a las células infectadas. Luego las células son analizadas mediante revelado de la
42
de β-galactosidasa que es colorimétrico a 570 nm. En el control negativo se incubó solo células
y como control positivo se colocó Benznidazol, el ensayo se realizó por duplicado.
2.2.8.5 Actividad anti - Leishmania de extractos y aceites esenciales de especies de
Azorella.
La actividad anti leishmanicida de extractos y aceites esenciales del género Azorella, fue
evaluada en amastigotes de Leishmania paramensis transfectadas con proteína verde y roja
fluorescente (figura 18 a, b c, d). En este ensayo se evaluó la disminución de los parásitos en las
células infectadas.
Las placas se incubaron a 37 º C, en ambiente 5 % de CO2 por 3 horas, después se lavó las
células con buffer fosfato (PBS) y se retiró los parásitos que no infestaron el macrófago y fueron
descartados para incubarlo nuevamente. Después de 24 horas las células infectadas se colocaron
en contacto con cada muestra durante 72 horas. Se retiró las células con una solución de tripsina
/ EDTA y se lavó con (PBS). Se centrifugó a 1100 rpm, temperatura 4 º C. Luego las células
fueron analizadas mediante citometría de flujo. En el control negativo fue incubado solo células
y como control positivo se colocó anfotericina B. El ensayo se realizó por duplicado (figura 18).
43
Figura 18. Amastigotes de L. paramensis a. forma libre b. Parasito infestando a macrófagos c. Parasito
transfectado con proteína verde fluorescente y d. proteína roja fluorescente (Foto Aurora)
2.2.8.6 Actividad antiplasmodial de extractos y aceites esenciales de especies de Azorella
La actividad antiplasmoidal de las extractos y aceites esenciales del género Azorella, fueron
evaluadas en Plasmodium falciparum, mediante la cuantificación de ADN del parásito coloreado
con Bromuro de Etidio (EtBr). Los cultivos que no contenían P. falciparum fueron sincronizados
al 1,5 - 2 % de parasitemia y 5 % de hematocrito en medio RPMI con suero humano al 10 %
(figura 19).
Figura 19. a. Tubos con células infestadas de Plasmodium falciparum b. Tinción de gram para identificación de
P falciparum c. Eritrocitos con parasito coloreado (Foto Autora)
a b
c d
a b c
44
Se utilizó placas de 24 pocillos, se colocó una concentración de 2,5 x 105 células/mL en RPMI
- 1640, de solución de parásitos y 500 µL de cada muestras platos fueron incubados por 72 horas
a 37 º C en atmósfera N2 (90 %), CO2 (5 %) y O2 (5 %). Para el control del ensayo se utilizó
parásitos cultivados sin compuestos (control negativo), para el control positivo se utilizó
parásitos con cloroquina. Este ensayo fue realizado por duplicado.
2.2.8.7 Actividad antibacteriana quorum sensing (QS) de extractos de especies de Azorella
Se determinó el rango biocida de los extractos de A. pedunculata y A. spinosa sobre la bacteria
Chromobaterium violaceum mutante CV026, se utilizó en los ensayos de inhibición de Quorum
Sensing una concentración inferior a 25 µg/mL garantizando el crecimiento de la bacteria, de la
metodología descrita por Gallego y colaboradores ( 2016) con modificaciones. (figura 20).
Figura 20. Ensayo inhibición de Quorum Sensing con extractos de Azorella (Foto Aurora)
2.2.8.8 Actividad hipoglicemiante de extractos y compuestos de especies de Azorella
Para la captación de glucosa in vitro en células de hígado, se utilizaron células hepatocitos
(HepG2), estas células se prepararon y lavaron, luego se reemplazó con el medio DMEM de alta
glucosa que contiene 2 % (FCS), se prepararon diferentes concentraciones (12,5; 25; 50; 100 µg
/ mL) junto con los extractos, el control positivo fue (Exendina, Metformina) y un control
45
negativo. El nivel de glucosa fue medido por espectrofotometría a 570 nm, se utilizó la
metodología descrita por Granados y colaboradores (2015) con modificaciones.
2.2.8.9 Actividad nematicida
Panagrellus redivuvus se utilizó como organismo para determinar el efecto letal de los extractos
de Azorella como posibles agentes nematicida.
El ensayo fue realizado con la metodología descrita por Simpkin y Coles (Simpkin & Coles,
1981). Los nematodos fueron cultivados en harina de avena y en levadura de panadería (Graf et
al., 2016), se determinó la letalidad de la lombriz intestinal a través de la motilidad en una placa
de 96 pocillos. Sulfato de cobre (15 mg/mL) fue el control positivo.
46
3 Resultados y Discusión
3.1 Fraccionamiento del extracto de DCM y purificación de moléculas de A. pedunculata
En el esquema 6 se ecuentra el detalle de la cantidad en el fraccionamiento de la
cromatografía flash del extracto:
Esquema 6. Fraccionamiento del extracto de DCM
3.1.1 Fracción K
La fracción K proviene del esquema 2, del cual se obtuvieron 40 fracciones, se reunieron en 6
fracciones según su características en CCD denominadas FK (1 - 40).
La subfracción FK (15 - 19), masa 219,5 mg (Figura 21).
fracción M
283,1
mg
Fracción L
4,74
g
Fracción A
38,7
mg
Extracto
DCM
Columna flash, polaridad
creciente
EP : AcOEt
Fracción B
758,8
mg
Fracción C
4,22
g
Fracción D
3,5
mg
Fracción E
2,8
mg
Fracción F
436,5
mg
Fracción G
694
mg
Fracción H
534
mg
Fracción J
615,1
mg
Fracción I
75,5
mg
Fracción K
1,64
g
47
Figura 21. Fracción FK (15 - 19)
La purificación de esta fracción se realizó en el Equipo de Separación Isolera, (EqSI), sistema
de solventes 70 % EP: 30 % AcOEt.
Purificación de la fracción K (15 - 19)
Esquema 7. Resultado de la purificación de la fracción K (15 – 19)
70 % EP: 30 % AcOEt
70 % EP : 30 % AcOEt
Fracción K (15 - 19)
219,5 mg
Separación en (EqSI) 100 mg
sistema 70 % EP: 30 % 7AcOEt
Fracción K-2
57,7 mg
Fracción K-T1
5,2 mg
Fracción K-T2
6,5 mg
Fracción K-1
2 mg
Fracciones
RP-18
sistema
H2O : MeOH 84 fracciones
Fracciones
K-28 - 29
5 mg
Fracciones
K- 24-27
7 mg
Sistema
87 % H2O: 13 % MeOH
48
Se realizó RP – 18 de la fracción K-2 y se obtuvo 80 fracciones, las fracciones K- 24 -27 y K- 28-29
tenían la presencia de fluorescencia.
Purificación de la muestra
Se juntaron todas las fracciones K 24-29 y se realizó una columna en sílica gel, recolectándose
104 fracciones que fueron monitoreadas mediante CCD, detectándose la presencia de
compuestos fluorescentes con el sistema 40 % EP: 60% AcOEt, las fracciones obtenidas se
visualizaron en luz uv (254 - 366 nm), estas fueron reveladas con vainillina, la cantidad obtenida
fue 4 mg.
Figura 22. Comparación de Fracciones K(15 – 19) , C Total, CFR, uv corto 254, uv largo 365
C Total= Compuesto cumarina todas las fracciones CFR= Cumarina obtenida Fase Reversa
Esquema 8. Resultado de la separación en RP – 18 de la fracción K- 24-29
K- 24-29
109 mg
RP-18
Sistema
H2O: MeOH 104
fracciones
Fracción
K-22-40
4 mg
K(15-19) C TOTAL CFR K(15-19) C TOTAL CFR
Sistema
75 % H2O: 25 % MeOH
49
La fracción K- 22-40 se obtuvo mediante una separación RP - 18, sistema de solvente 75 % H2O:
25 % MeOH, Rf de 0,35; es incoloro, soluble en cloroformo deuterado.
Espectro de RMN 1H
En el espectro RMN 1H (Anexo 2) aparecen dos señales tipo doblete, una más desplazada a
campo bajo en δH 7,65 (d, J = 9,3, 1H) ppm, y otra señal con δH 6,32 (d, J = 9,6, 1H) ppm.
A campo alto se observan dos singletes desplazados en δH 3,99 ppm y y δH 3,54 ppm.
En el espectro COSY (Anexo 3), se observa la presencia de protones con desplazamiento en el
espectro de RMN 1H en δH 6,3 32 (d, J = 9,6, 1H) ppm y δH 7,65 (d, J = 9,3, 1H) ppm.
Espectro de RMN 13C
El espectro de RMN 13C (Anexo 4) mostró 10 señales, en este se diferenció la presencia de
metilos.
Existen una señal en δC 161,52 ppm que corresponde a un carbonilo de un éster, otra señal en δC
56,44 ppm que corresponde al grupo metoxilo.
La señal del carbono que porta el metoxilo está en δC 144,24 ppm y la señal del carbono que
porta el grupo hidroxi está en δC 149,52 ppm.
El espectro de carbono DEPT 135 (Anexo 5) mostró 5 señales que identifican los carbonos
cuaternarios en δC 150,24 ppm y δC 144,24 ppm esta última señal está más desplazada por estar
unido a un grupo metoxilo y la señal de δC 113,44 ppm correspondiente a un carbono metileno.
El espectro HSQC (Anexo 6) se confirmó correlación que existe entre protones vinílicos y
protones aromáticos junto con sus carbonos respectivos como se observa en la tabla a
continuación.
50
Tabla 5. Datos RMN HSQC compuesto 1
En el espectro HMBC (Anexo 7) se ubicó la posición de los sustituyentes en el anillo
aromático, 4 carbonos cuaternarios siendo 1 de ellos oxigenados.
El protón H3 tiene acoplamiento a larga distancia con el grupo carbonilo del anillo de lactona
que tiene un desplazamiento en δC 161,52 ppm (C2), además, de un carbón aromático en δC
143,37 ppm (C4).
El protón H4 igualmente tiene acoplamiento a larga distancia con el grupo carbonilo del anillo
de lactona y también con los carbonos aromáticos en δC 107,51 ppm (C8) y δC 150,24 ppm (C9).
Tabla 6. Datos RMN 7-hidroxi-6-metoxicumarina 1H (300 MHz) CDCl3 (compuesto 1)
Asignación δC DEPT HMQC HMBC
1 - - - -
C2 C=O 161,52 C - 6,33- 7,66
C3 113,44 CH 6,33 6,97 - 6,33
C4 143,37 CH 7,64 6,89
C5 103,21 C 6,97 -
C6 144,24 C - -
C7 149,52 C - 6,89
C8 107,51 CH 6,89 -
C9 113,38 C - 7,66 - 6,96 - 6,89
C10 150,24 C - 7,66
11 -OCH3 56,44 CH3 3,99 -
Carbono
ppm Hidrógeno δC ppm, Int, multi, JHz
56,44 11 3,98, 1H, s
113,44 3 6,33, 1H, d , J = 9 Hz,
143,37 4 7,66, 1H, d, J = 9 Hz,
107,51 8 6,88, 1H, s
103,21 5 6,96, 1H, s
51
Como resultado del análisis espectroscópico de RMN 1H - 13C 1D y 2D se obtiene el
compuesto 6-metoxi-7-hidroxicumarina llamado escopoletina, el cual se observa en la figura
23.
Figura 23. 7-hidroxi-6-metoxicumarina (compuesto 1)
Darmawan en el año 2012 (Darmawan et al.,2012), obtiene escopoletina de la especie
Macaranga grandifolia (Blanco) Merr., pertenece a la familia Euphorbieacea en la siguente tabla
se describe este compuesto solubilizado en Acetona deuterada, para demostrar la similitud de
los diferentes desplazamientos químicos caracteristicos de la molècula se realizó esta
comparación con el compuesto obtenido de A. pedunculata solible en Cloroformo deuterado.
Tabla 7. Datos NMR de 7-hidroxi-6-metoxicumarina 1H (300 MHz) CDCl3 y referencia escopoletina
Posición
7-hidroxi-6-
metoxicumarina
δH (mult., J Hz)
CDCl3
δC
Referencia (Darmawan,
2012) δH (mult., J Hz)
AcetonaD
δC
1 - 161.52 - 160.8
2 6.32 (d, 1H, 9.4) 113.44 6.25 (d, 1H, 9.75) 113.3
3 7.65 (d, 1H, 9.4) 143.37 7.84 (d, 1H, 9.75) 144.7
4 - 111.52 - 112.1
5 6.95 (s, 1H,) 103.23 7.19 (s, 1H) 109.9
6 - 144.04 - 146.0
7 - 149.52 - 151.9
8 6.88 (s, 1H) 107.51 6.79 (s, 1H) 103.7
9 - 113,38 - 112,1
10 - 150.28 - 151.2
11 3,99 (s, 1H) 56,44 3,90 (s, 1H) 56,73
52
João - Matos y colaboradores en el año 2001, describen varias familias de plantas que presentan
compuestos derivados de cumarinas, entre ellas están las siguientes familias, con varios de
compuestos cumarínicos descritos en: Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae, Fabaceae, Oleaceae,
Moraceae, Thymelaeaceae. (Matos et al., 2015), siendo la primera de ellas en la cual se observa
que la mayor cantidad de especies más representativas son Anethum graveolens y Pimpinella
anisum contienen esopolentina como parte de sus metabolitos secundarios y han sido utilizadas
en la medicina y como alimentos (Matos et al., 2015).
Riveros y colaboradores en el año 1984, asilaron Scopoletin del extracto etanólico de la especie
Mulimun crassifolium Phil.
Para el género Azorella no se ha descrito en la literatura, el compuesto 7-hidroxi-6-
metoxicumarina; sin embargo, Quesada en el año 2012 reporta la presencia del compuesto 7-
hidroxicumarina, aislado de la especie A. spinosa, estos compuestos tienen relación entre sí, pues
presentan el mismo núcleo benzo 2 pirona, con excepción en la posición 6 del grupo metoxi
que está presente en escopoletina.
Uno de los factores importantes en la producción de metabolitos secundarios es la distribución,
situación climática de crecimiento en estrés hídrico, exposición lumínica y altitud (Wickens,
1995), son condiciones idóneas que afectan en la concentración de metabolitos secundarios.
Las especies A. spinosa y A. pedunculata provienen de lugares geográficamente muy diferentes,
la primera crece sobre los 310 m n.s.m. esta especie particularmente crece rodeada de arbustos
y árboles que la protegen de los rayos UV y cercana a la costa donde la vaguada costera se hace
presente (Jara-Bermeo et al., 2016); la segunda especie crece sobre los 3.778 m s.n.m.; expuesta
100 % a la radiación UV debido a su ubicación en alta montaña (Lorente, 2001) (Abad, 2015) .
Se explica la presencia de dos sustituyentes químicos en el anillo benzo 2 pirona en la especie
A. pedunculata y la presencia de un sustituyente en la especie A. spinosa.
53
Nota: La descripción detallada anteriormente será la misma aplicada para los compuestos
siguientes de este trabajo.
3.1.2 Fracciones 1 - 25
De la separación en columna de sephadex de A. pedunculata, obtuvo 25 fracciones como se
describe en el esquema 9.
Esquema 9. Resultado del fraccionamiento del extracto crudo DCM mediante Sephadex
3.1.3 Fracción 8 - 16
Esquema 10. Protocolo de extracción fracción 8 – 16
Del fraccionamiento 8 - 16 se recolectaron 22 fracciones (figura 24).
Fracciones
22 Fracción
8 -16
Sistema de solvente
gradiente
67 % EP: 33 % AcOEt
Separación
columna
CCD sistema de solvente
85 % EP: 15 % AcOEt
Fracciones reunidas según
características en CCD
Extracto
DCM
2 g
Columna sephadex
50% EP: 25% MeOH: 25% DCM
25
fracciones
CCD
sistema de solvente
80 % EP: 20 % AcOEt
Fracción 1-7 (357,5 mg)
Fracción 8-16 (295,4 mg)
Fracción 17-25 ( 74,6 mg)
54
Figura 24. CCD sistema 85 % EP: 15% AcOEt
En las fracciones 8 - 16 (9 – 10) se observó la presencia de cristales estas fueron reunidas masa
10 mg para su análisis.
3.1.4 Fracción 8 - 16 (9 – 10)
A la fracción 8 -16 (9 – 10), descrita anteriormente se realizó análisis de RMN 1H.
Espectro de RMN 1H
En el espectro de RMN 1H (Anexo 8) se observan señales intensas a campo alto, estas se asociana
la presencia de metilos, además existen señales de protones vinílicos en δH 5,06 (1H, dd, J = 21
Hz) ppm y en δH 5,20 (1H dd, J = 24 Hz) ppm. También, se observan las señales en δH 5,39
(1H, d,
J = 5,1 Hz) ppm; un protón de un grupo hidroxilo que aparece en δH 3,57 (1H, m) ppm.
Fraccionamiento 8 - 16
55
Espectro de RMN 13C
En el espectro de RMN 13C (Anexo 9) se observa señales en δC 161,52 ppm; esta región del
espectro es asignable al carbono carbonílico que corresponde a un carbonilo de un éster. Al
mismo tiempo, se observa la señal desplazada en δC 121,76 ppm y δC 140,76 ppm que
corresponde a la presencia de un doble enlace entre los carbonos C5 - C6, de igual manera, las
señales en δC 129,29 ppm y δC 138,36 ppm, como se observa en la tabla 8.
Tabla 8. Datos RMN 1H Stigmasterol- β-sitosterol (300 MHz) en CDCl3 (compuesto 2)
Posición δC ppm δH ppm, multi, JHz
C
1 37,27 - CH2
2 29,15 - CH2
3 71,85 3,57 (m, 1H) CH
4 42,34 - CH2
5 140,76 - C=C
6 121,76 5,40(s, 1H) C=CH
7 31,92 - CH2
8 29,24 - CH
9 50,14 - CH
10 36,17 - C
11 24,32 - CH2
12 39,79 - CH2
13 40,53 - C
56
14 56,88 - CH
15 24,32 - CH2
16 28,95 - CH2
17 56,06 - CH
18 12,07 1,29 (d, 1H) CH3
19 19,05 0,74 (d, 1H) CH3
20 39,79 - CH
21 23,08 1,19 (d, 1H) CH3
22 138,36 5,0 5(m, 1H)
C=C 23 129,29 5,19 (m, 1H)
24 51,26 - CH
25 33,95 - CH
26 21,11 0,86(d, 1H) CH3
27 23,07 0,97(d, 1H) CH3
28 25,34 - CH2
29 12,06 1,05 (t, 1H) CH3
En los espectros de RMN 1H y RMN 13C aparecen las señales típicas de compuestos terpénicos
esteroidales (fitoesteroles) que son β-sitosterol (compuesto a) y stigmasterol (compuesto b) y
concuerdan con los reportados por Luhata y Munkombwe en la año 2015, estos compuestos β-
sitosterol y stigmasterol están siempre en forma de mezcla donde siempre la mayor proporción
esta stigmasterol; la diferencia característica entre estos compuestos es la presencia del doble
57
enlace de C22 = C 23 en stigmasterol (Luhata & Munkombwe, 2015) (figura 25) y C22 - C23 enlace
simple en β-sitosterol (figura 26).
Figura 25. Stigmasterol
Figura 26. β-sitosterol
Zlatanov y Ivanov en el año 1995 reportaron la composición de esteroles en 9 especies de la
familia Apiaceae comúnmente utilizadas en el arte culinario como: hinojo (F. vulgare Mill.),
perejil (P. crispum (Mill.) Fuss), anís (P. anisum L.), comino alemán (Carum carvi L.), Mill.),
comino (C. cyminum), eneldo (A. graveolens), cilantro (C. sativum), apio (A. graveolens), y
zanahoria (D. carota), los autores utilizaron cromatografía de gases bidimensional. Ellos
describieron el contenido de esteroles de estas especies que fue 0,2 - 0,7 % los principales
componentes fueron (β - sitosterol 33 – 58,4 % y estigmasterol 26,6 - 47,5% ) y otros
compuestos minoritarios.
58
Sharaf y colaboradores en el año 2016, también describieron la presencia de esteroles mediante
un screening fítoquímico en ocho de las especies mencionadas anteriormente, este hecho
corrobora la presencia de estos metabolitos secundarios en especies de la familia Apiaceae. En
referencia al género Azorella hasta el momento no existe reportes de β – sitosterol y
estigmasterol en la literatura, este es el primer reporte de estos metabolitos secundarios en A.
pedunculata.
3.1.5 Fracción 8 - 16 (15 - 18)
La fracción 8-16 (15-18) fue obtenida por separación en CC de la fracción 8-16, posteriormente
fue monitoreada en CCD, el sistema de solvente utilizado fue
85 % EP: 15 % AcOEt (figura 27). La masa de fracción 8-16 (15-18) fue 5,4 mg además se realizó
RMN 1H
Figura 27. CCD sistema 85 % EP: 15 % AcOEt
Purificación de la fracción 8 - 16 (15 - 18)
En la figura 28 se observa el proceso de separación en CCDP de esta fracción, sistema de
solvente 20 % EP: 80 % AcOEt, se obtuvo como resultado un sólido amarillento (1,5 mg), este
fue analizado en RMN 1H.
Fraccionamiento 8-16
59
Figura 28. CCDP fracción 8-16 (15-18) luz uv corto 254 nm
Purificación de la fracción 8 - 16 (15 - 18)
Esquema 11. Obtención del compuesto 3
4AcOEt:1EP 4AcOEt:1EP
CCDP
5 - 10
22 mg
11 - 14
6,3mg
15 - 18
5,4 mg
19 - 22
92,1 mg 1 - 4
153 mg
Fracción 8 -16 (15-18)
295,4 mg
Separación CC
sistema 85 % EP: 15 % AcOEt
Fracciones
Separación CCDP sistema
45 % EP: 55 % AcOEt
Compuesto 3
1,5 mg
60
La escasa cantidad obtenida en este compuesto, dificultó de manera considerable su elucidación
estructural afectando en la repetición de los espectros bidimensionales, sin embargo se realizó
de tal manera que fuera posible obtener espectros de calidad, que se describen a continuación.
Espectro de RMN 1H
En el espectro RMN 1H (Anexo 10) aparece un singlete desplazado a campo bajo en δH 5,35
ppm, señal que pertenece a un protón vinílico, de igual manera se observa otro singlete
desplazado en δH 4,32 ppm, cada señal integra para un protón.
Otras señales presentes son: dos singletes desplazados en δH 3,70 ppm y δH 3,62 ppm, cada señal
integra para tres protones correspondiente al grupo metoxi.
A campo alto se observa dos dobletes, que integran para 1H, además una señal multiplete con
desplazamiento δH 2,56 ppm; y un doblete en δH 2,13 ppm (d, 1H, 12,59 Hz).
A campo alto se observan singletes desplazados en: δH 1,92 ppm (s, 1H); δH 1,87 ppm (d, 1H,
12,75 Hz); δH 1,60 ppm (s, 1H); δH 1,29 ppm (s, 1H); δH 1,24 ppm; δH 1,17 ppm (d, 1H, 6,67 Hz),
cada una de estas señales integran para 1H.
En el espectro COSY (Anexo 11), se confirma el acoplamiento entre los protones: δH 1,87 ppm
con δH 2,13 ppm; δH 3,03 ppm con δH 2,65 ppm; δH 2,65 ppm con δH 2,44 ppm; δH 3,03 ppm
con δH 1,17 ppm.
Con el espectro de RNM 13C (Anexo 12); espectro DEPT (Anexo 13) señales de carbonos:
metilo, metilenos, metino y cuaternario y se realizó la asignación protón - tipo de carbono (tabla
9).
61
Tabla 9. Datos RMN DEPT compuesto 3
Asignación
C
δC ppm
DEPT
1 169,1 C
2 45,88 C
3 31,20 CH
4 82,1 CH
5 46,28 CH
6 25,87 CH2
7 46,64 CH
8 191,0 C
9 43,25 CH
10 137,6 C
11 197,9 C
12 116,3 CH
13 31,70 CH2
14 148,01 C
15 148,36 C
16 19,50 CH3
17 12,78 CH3
18 22,39 CH3
19 37,12 C
20 15,40 CH3
En el espectro HSQC (Anexo 14), conjuntamente con el espectro HMBC (Anexo 15) se
identificó cada protón con su respectivo carbono, además de los acoplamientos a larga distancia
como se observa en la (tabla 10).
62
Tabla 10. Datos RMN HSQC- HMBC compuesto 3
Los siguientes acoplamientos a larga distancia son : δH 5,33 ppm (s, 1H) con el carbono C16 –
C8 - C14 - C9; δH 3,03 ppm (d, 1H, 7,88 Hz) con el carbono C8 - C15- C17 – C18; δH 2,44 ppm
con el carbono C20 – C18 – C19 – C5 - C10 - C14; δH 1,87 ppm (d, 1H, 12,75 Hz) con el carbono
C10, C14, C17, C5; δH 1,60 ppm con el carbono C9 – C2 – C8; δH 1,16 ppm con el carbono
C12 - C9 – C8; δH 1,24 ppm con el carbono C4 – C19 – C7; δH 2,65 ppm con el carbono C10
- C15.
Asignación
H δH (mult., J Hz)
Asignación
C
δC ppm
DEPT
HMBC
- - 1 169,1 C -
- - 2 45,88 C -
G 2,52 (s, 1H, 10,93 Hz) 3 31,20 CH -
K 4,32 (s, 1H) 4 82,1 CH -
H 3,03 (d, 1H, 7,88 Hz) 5 46,28 CH
12,87 - 22.39 -
37,12 - 45, 88 -
169,16 - 191, 07 -
197,85
P 2,13 (d, 1H, 12,59Hz) 6 25,87 CH2 15,36
N 2,44 (s, 1H, ) 7 46,64 CH
15,36 - 22,39 -37,
11 - 46,24 - 137,
57 - 148,37
- - 8 191,0 C -
Dº 1,87 (d, 1H, 12,75 Hz) 9 43,25 CH 137,57 - 12, 78 -
46,64 - 147,71
- - 10 137,6 C -
- - 11 197,9 C -
L 5,33 (s, 1H) 12 116,3 CH 19,50 - 43,25 -
148,01 - 197, 87
M 2,65 (m, 1H, 9,87 Hz)
13 31,70 CH2 137, 89 - 169,01
- - 14 148,01 C -
- - 15 148,36 C -
A-B 1,16 (d, 1H, 6,67 Hz) 16 19,50 CH3 31,2 - 43,25 -
116,30
E 1,60 ( s, 1H,) 17 12,78 CH3 197,9 - 45,88 -
43,31
C 1,24 (s, 1H) 18 22,39 CH3 82,10
- - 19 37,12 C -
F 1,92 (s, 1H,) 20 15,40 CH3 137, 89 - 148,01 -
46,64
63
Para la asignación estructural del compuesto 3, se propone los siguientes fragmentos A, B, C.
Figura 29. Propuesta de fragmentos pertenecientes al compuesto 3.
Desafortunadamente como se mencionó en los párrafos anteriores, la calidad de los espectros y
la escasa cantidad de este no fue la adecuada para obtener una acertada elucidación estructural
completa de este compuesto, sin embargo se propone la estructura (figura 30).
64
Figura 30. 2-(2-hidroxi-6,7-dimetoxi-3a,5a,8-trimetil-1,10-dioxo-1,2,3,3a,4,5,5a,10,10a,10b-
decahidrociclohepta[e]inden-3-yl) ácido propanoico (Propuesta del Compuesto 3)
La descripción del esqueleto mulinano en la sección 1.3.3 fue utilizada como referencia para
verificar las diferentes posiciones asignadas en el compuesto 3, además de los compuestos (7A,
7B, 7C, 8A) de la tabla 2.
En la figura 29 se describen 3 fragmentos: A, B, C correspondientes a los anillos fusionados:
ciclo pentano, ciclo hexano y ciclo heptano.
En el anillo C, se verifica el grupo metilo, en comparación con los compuestos (7A, 7B) de la
tabla 2, los cuales tienen el grupo metilo en la misma posición. De igual manera en la posición
11 está presente un grupo carbonilo, pero en el compuesto (7B) existe un epóxido en esa
posición.
En el anillo B en la figura 30 se observa dos grupos metoxilo en la posición 14 y 15 sobre doble
enlace, además en el anillo A en la posición 1 está presente un grupo carbonilo, estos
sustituyentes son inusuales en estas posiciones, por lo que pueden ser artefactos en el proceso
de extracción y purificación del compuesto 3.
65
3.2 Fraccionamiento del extracto de DCM y purificación de moléculas de A. spinosa
En el esquema 12 se describe el resultado de del fraccionamiento del extracto de DCM de A.
spinosa.
Esquema 12. Resultado del fraccionamiento del extracto DCM de A. spinosa.
3.2.1 Fracción 10 – 15
Se observó un compuesto con fluorescencia en luz uv (365 nm) en CCD con el sistema de
solvente 60 % EP: 40 % AcOEt, se reunió las fracciones 10 - 15 (1257 mg). Se realizó una
separación en el EqSI, sistema de solvente 30 % EP: 70 % AcOEt (figura 31).
40 fracciones
38 gramos DCM
Separación columna
sistema isocrático
50 % EP: 25 % DCM: 25 % MeOH
Fracciones reunidas según características CCD
sistema 62 % EP: 38% AcOEt
66
Figura 31. Purificación fracción 10-15 Equipo de Separación Isolera 70 % EP: 30 % AcOEt
Esquema 13. Resultado de la purificación en EqSI de la fracción 10-15
Se monitoreó todas las fracciones en CCD, con el sistema de solvente 10 % EP: 90 % AcOEt,
y se reunió todas las fracciones según sus características similares (figura 32).
27
fracciones
400 mg
fracción
10 - 15
Sistema
70% EP: 30% AcOEt EqSI
67
Figura 32. Monitoreo mediante CCD de la fracción 20-27 sistema 10 % EP: 90 % AcOEt a. luz uv corta b. uv
largo c. revelado
Se observa en la figura 32 (b) la fracción 20 - 27 (38,5 mg), compuesto fluorescente además se
realizó el análisis en RMN 1H, la muestra fue solubilizada en acetona deuterada.
Purificación de la fracción 10 - 15 (21 - 27)
Mediante CCD se verifica todas las fracciones provenientes del EqSI, la masa total de las
fracciones fue 45,5 mg.
La fracción 10 - 15 (21-27) fue separada mediante CCDP con el sistema de solvente 10 % EP: 90
% AcOEt fue verificada en CCD, después este compuesto fue purificado mediante RP - 18
(figura 33) sistema 95 % H2O: 5 % MeOH, compuesto soluble en metanol deuterado, Rf 0,6.
Figura 33. Equipo de vacío para Cromatografía en Fase Reversa
M 1-8 17-19 20-27 M
M 1-8 17-19 20-27
M
M 1-8 17-19 20-27
M
M 1-8 17-19 20-27
M
10 % EP: 90 % AcOEt
b c a
68
Esquema 13. Resultado de la purificación de la fracción 10 – 15 (21-27) en RP - 18
Espectro de RMN 1H
El espectro RMN 1H (Anexo 16) se observan 4 señales: dos singletes y dos dobletes. La señal
desplazada a campo bajo en δH 7,75 (d, J = 9, 1H) ppm, esta acopla entre sí con el doblete en
δH 5,86 (d, J = 9, 1H) ppm.
Los singletes que están desplazados en campo alto en: δH 3,83 ppm, integran para un tres
protones y corresponde al grupo metoxi. La señal desplazada en δH 6,80 ppm que se atribuye a
un protón unido a un oxígeno por la ubicación de la señal en el espectro.
Espectro de RMN 13C
En el espectro de RMN 13C (Anexo 17), mostró 10 señales y se destaca la señal en δC 165,66
ppm que corresponde a un carbonilo de un éster, además, otra señal en δC 54,45 ppm
corresponde a un grupo metoxilo.
La señal del carbono que porta el metoxilo está en δC 150,56 ppm y la señal del grupo hidroxi
está en δC 150,15 ppm.
El espectro de RMN DEPT 135 (Anexo 18) se observa 5 señales de carbonos cuaternarios
desplazados en δC 150,31 ppm y δC 145,67 ppm.
El espectro HSQC se confirmó correlación que existe entre protones vinílicos y protones de los
aromáticos junto con sus carbonos respectivos, como se observa en la siguiente tabla:
Sistema
H2O: MeOH
50
fracciones
38,5
mg
RP-18
reversa
Compuesto
1,5 mg
Sistema
95 % H2O: 5 % MeOH
69
Tabla 11. Datos RMN HSQC compuesto 4
En el espectro HMBC se ubicó la posición de los sustituyentes en el anillo aromático y 4
carbonos cuaternarios y uno de ellos es oxigenado.
El protón H3 tiene acoplamiento a larga distancia con el carbono carbonilico C2 δC 165,75 ppm
y con el carbono C4, δC 145,51 ppm.
El protón H5 tiene acoplamiento a larga distancia con C8, δC 102,86 ppm de igual manera, con
el C9 δC 103,28 ppm.
Como resultado del análisis espectroscópico de RMN 1H - 13C se obtiene el compuesto 6-metoxi-
7-hidroxicumarina soluble en MeOD, los valores de cada desplazamiento y acoplamiento entre
carbono y protón se describen en la tabla 12.
Carbono ppm Hidrógeno δC ppm, Int, multi, JHz
54,45 - 3,83,1H, s
106,87 3 5,86 1H, d , J = 9 Hz,
145,20 4 7,75, 1H, d, J = 9 Hz,
103,21 8 6,45, 1H, s
105,91 5 6,80, 1H, s
70
Tabla 12. Datos RMN 7-metoxi-6-hidroxicumarina (300 MHz, MeOD)
Figura 34. 7-hidroxi-6-metoxi-2H-1-benzopiran-2-ona
Los datos presentados en la tabla 12 han sido corroborados en referencia a Darmawan 2012
descritos en la tabla 7, en donde se describen dichos desplazamientos de carbono de la molécula
7-hidroxi-6-metoxi-2H-1-benzopiran-2-ona.
Existen desplazamientos muy similares con los datos presentados de nuestro compuesto 4, que
confirma que el compuesto 4 es el 7-metoxi-6-hidroxicumarina.
Como se describe al final de la sección 3.1.1, el compuesto 4 está presente también en la especie
A.pedunculata recolectada en Ecuador comparte la presencia de compuestos cumaricos
presentes en la familia Apiaceae (Matos et al., 2015).
Posición δ DEPT HMQC HMBC
1 - - - -
C2 C=O 165,75 C - 6,80 - 7,75
C3 106,87 CH 5,86 7,75 - 5,83
C4 145,51 CH 7,75 6,80
C5 105,91 C 6,80 5,83
C6 150,30 C - 6,80
C7 150,56 C - 3,80
C8 103,21 CH 6,45 -
C9 103,28 C - 6,80
C10 152,96 C - 6,80 – 7,75
11 -OCH3 54,10 CH3 3,80 -
71
La composición química de las dos especies de Azorella, las cuales fueron analizadas bajo las
mismas condiciones de trabajo, sin embargo, puede variar la concentración de ciertos
metabolitos secundarios de acuerdo con las necesidades básicas de la planta y el hábitat donde
crecen (Wickens, 1995) (Méndez, 2011).
3.2.2 Fracción 18 - 20
La fracción 18 - 20 procedente de la separación CC del extracto de DCM de A. spinosa masa
400 mg, esta fracción fue monitoreada en CCD y se observó un compuesto de color amarillo al
momento de revelar con vainillina. Se realizó una SEqI sistema de solvente 38 % EP: 62 %
AcOEt y se obtuvo 3 fracciones.
La subracción T2, masa 4 mg fue monitoreada mediante CCD (figura 35) y analizó con RMN
1H - 13C.
Figura 35. CCD fracción purificada 18-20
Espectro de RMN 1H
El espectro de RMN 1H (Anexo 19) se observa una señal singlete con desplazamiento en δH 3,97
ppm que corresponde a un grupo metoxilo, y dos doblete en δH 6,27 ppm (d, J = 1,4 Hz, 1H) y
δH 6,57 ppm (d, J = 3,3 Hz, 1H),
A campo bajo se observa una señal singlete en δH 7,40 (s, 2H) ppm.
18-20 T2
38% EP 62%AcOEt
72
En el espectro RMN COSY1 H- 1 H no existe ninguna correlación de protones acoplados entre
sí.
En el espectro de RMN 13C (Anexo 20) se observa la señal de tipo carbonilo su desplazamiento
en δc 162,37 ppm, además se identifica el carbono del grupo metoxilo cuyo desplazamiento es
δc 55,81 ppm, igualmente, los carbonos que tiene grupos hidroxilos en el anillo B.
El espectro HSQC (Anexo 21) se confirmó correlación de ciertos protones junto sus carbonos
respectivos como se observa en la tabla a continuación.
Tabla 13. Datos RMN HSQC compuesto 5
En el espectro HMBC (Anexo 22) mostró la correlación a larga distancia entre protón y carbono.
El carbono (C7) porta el grupo metoxi con desplazamiento δC 55,81 ppm. El protón δH 3,97
ppm corresponde a las señales del protón H11 con el oxígeno del carbono que lo contiene.
El protón H6 con desplazamiento δH 6,57 ppm tiene acoplamiento a larga distancia con el
carbono (C4) cuyo desplazamiento es δC 162,33 ppm; de igual manera este protón tiene
acopamiento con el carbono (C9) desplazamiento δC 158,37 ppm y también con el carbono
carbonilico (C2) desplazamiento δC 161,52 ppm.
El resultado del análisis espectroscópico de RMN 1H 13C se describe en la siguiente tabla 14,
obteniéndose el compuesto 5: 7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona (figura 36).
Carbono ppm Hidrógeno δC ppm, Int, multi, JHz
55,81 - 3,97, 1H, s
98,78 8 6,27, d , 1H, J = 1,4 Hz,
103,76 3 6,57, d, 1H, J = 3.3 Hz,
93,94 6 6,76, s, 1H,
73
Figura 36. 7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona
Tabla 14. Datos RMN del compuesto 7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona
Posición
7-metoxi-2-(3,4,5-
trihidroxifenil)-4H-cromen-
4-ona δH (mult., J Hz)
AcetonaD6
δC ppm
1 - - -
2 - 161,41 C
3 6,76(s, 1H,) 103,84 CH
4 - 162,09 C
5 7,70(s, 1H,) 126,57 CH
6 6,57 (s, 1H,) 93,94 CH
7 - 148,20 C
8 6,27 (s, 1H,) 98,78 CH
9 - 157,76 C
10 - 116.17 C
11 3,79 (s, 1H,) 55,97 CH3
1’ - 121,50 C
2’ 7,40(s, 1H,) 104,27 CH
3’ - 146,65 C
4’ - 134,77 C
5’ - 146,65 C
6’ 7,40(s, 1H,) 104,27 CH
74
Los desplazamientos de los sustituyentes en el núcleo flavonoide (anillo B) de la molécula 3-
hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona descritos por Sobottka y colaboradores 2000
(Sobottka et al., 2000) y nuestra molécula 7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona,
son los mismos, estas moléculas comparten esta característica, están solubilizadas en solventes
diferentes, sin embargo se realiza esta comparación con fines de ubicación de los
desplazamientos descritos en la tabla 14, además se observa que la ubicación del sustituyente
hidroxi en la posición 3.
El valor de desplazamiento de carbono en posición 3 de la molécula, corresponde a 103,16 ppm.
Sobottka y colaboradores en el año 2000, reportan para esta posición un valor de 139,81 ppm;
este desplazamiento corresponde a la presencia del grupo hidroxilo en la molécula 3-hidroxi-2-
(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona.
De igual manera en la posición 7 de la molécula, el desplazamiento de carbono está en 163,84
ppm, mayormente desplazado a campo bajo por la presencia del grupo metoxi, en comparación
con la molécula de Sobottka y colaboradores (2000) que reportan el desplazamiento de carbono
de esta posición en 134,4 ppm.
La asignación de carbono en la posición 9, 10 y 1’ de la molécula es 158,37 ppm; 121,1 ppm;
121,4 ppm respectivamente, datos similares con el reportado por Sobottka y colaboradores 2000
cuyos valores son 155 ppm; 121,6 ppm; 121,9 ppm corroborando la asignación de estas
posiciones.
El grupo carbonilo de la molécula se encuentra desplazada en 161,32 ppm en comparación con
el grupo carbonilo reportado por Sobottka y colaboradores (2000), está se encuentra más
desplazada a campo bajo en 173,4 ppm debido a la vecindad del grupo hidroxi del carbono en la
posición 3.
Esta molécula no ha sido reportada en la especie A. spinosa
75
Granados y colaboradores en 2015 obtuvieron el compuesto 5,7,4'-trihidroxi-3',5'-
dimetoxiflavanona aislado de la especie Jatropha gossypifolia L que pertenece a la familia
Euphorbiaceae, este compuesto está conformado por tres anillos A, B y C. En el primer anillo
está presente dos sustituyentes en la posición 7 (grupo hidroxilo) y en la posición 5 (grupo
hidroxilo); en el anillo B está presente el grupo metoxi en la posición 3' y 5'; y el grupo hidroxilo
en la posición 4'.
En referencia al compuesto 3-hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona en el anillo A
existe un sustituyente metoxilo en la posición 7 de carbono, desplazamiento 163,84 ppm
(Granados et al., 2015); en comparación con la molécula aislada por Granados y colaboradores,
la cual presenta dos grupos sustituyentes: posición del carbono 7 presenta un grupo hidroxilo,
desplazamiento 177,70; de igual manera existe la presencia del grupo hidroxilo en la posición
5 del anillo A.
En el anillo C de la molécula 3-hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona existe una
instauración entre los carbonos 2 y 3, sus correspondientes desplazamientos son los siguientes
respectivamente 161,52 ppm y 103,76 ppm; en comparación con la molécula de 5,7,4'-trihidroxi-
3',5'-dimetoxiflavanona en la cual no existe la insaturación, por lo tanto, los valores del
desplazamiento de los carbonos 2 y 3 son respectivamente 79,65 ppm y 194,96 ppm; por lo tanto
la presencia de la insaturación cambia el desplazamiento del carbono.
En el anillo B de la molécula 3-hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona se observa la
sustitución del grupo hidroxilo en la posición 3',4',5'; en comparación con la molécula aislada
por Granados y colaboradores en la cual solo la posición 4' tiene la sustitución del grupo
hidroxilo, su desplazamiento químico está en 129,43 ppm y en la molécula 5 se encuentra en
136,88 ppm, debido al ambiente químico en el cual está presente.
La molécula 3-hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona no ha sido reportada para la
especie A. spinosa.
76
3.3 Obtención de aceites esenciales de las especies de A. spinosa y A. monantha recolectas
en diferentes hábitats y estaciones del año
En la tabla 15, se presenta los resultados de las especies A. spinosa y A. monantha recolectadas
en Chile.
Tabla 15. Coordenadas, Fecha, cantidad de recolección Azorella
Especie Lugar de
recolección
Estación del
año
Masa
kg
Aceite
mL
Rendimiento
(%)
A) A. spinosa
Constitución
Pantanillos
310 m n.s.m.
Primavera 2,7 0,2 0,011
Verano 1,8 0,3 0,017
Otoño
1,6 0,5 0,031
B) A. spinosa
Enladrillado
2200
m n.s.m.
Verano 2,9 0,5
0,017
C) A. monantha
Laguna del
Maule
2553
m n.s.m.
Primavera 10
0,001
0
Paso
Vergara
2505
m n.s.m.
Verano 18 0,3
0,001
Otoño 22 0,35
0,001
77
3.3.1 Propiedades físicas del aceite esencial de A. spinosa
La densidad del aceite esencial de la especie A. spinosa está directamente afectada por su
composición química por monoterpenos, sesquiterpenos.
Tabla 16. Resultados de la composición física del aceite esencial de A. spinosa.
Los índices de refracción del aceite de A. spinosa están descritos en la tabla 17, el valor más alto
del índice de refracción fue de la tercera recolección el más bajo fue de la segunda.
Tabla 17. Resultados del Índice de refracción
Este parámetro es particular de cada aceite, el valor cambia si este es diluido o es mezclado con
otra sustancia (Atti-Santos et al., 2005).
Muestra Fecha de
recolección
Masa
gramos
Volumen
Cm3
Densidad
G/ cm3
1 Noviembre
2014
0,0174 20 µL 0,87
2 Enero 2015 0,0951 110 µL 0,86
3 Abril 2015 0,1310 155 µL 0,84
Muestra Índice de
refracción
Temperatura º
c
1 1,482 20
2 1,48 20,5
3 1,498 20,4
78
3.3.2 Composición química del aceite esencial de A. spinosa
(A) De la especie A. spinosa recolectado en Constitución, se identificó 114 componentes de este
aceite descritos en la siguiente tabla 18.
Tabla 18. Resultados de la composición química de A. spinosa
compuesto
fecha de recolección
RT
noviembre
2014
enero
2015
abril
2015
% % %
1 <α> tujeno 4,16 0,39 0,61 0,62
2 Tricyclene 4,39 10,81 12,40 16,99
3 α pinene 4,86 0,52 0,71 0,98
4 pino-2,4(10)-dieno 4,99 0,02 0,02 0
5 sabineno 5,70 9,10 10,14 11,49
6 <β> pineno 5,86 7,40 9,06 0
7 mirceno 6,34 3,09 3,87 3,59
8 silvestrene <iso-> 7,01 1,83 1,48 1,67
9 <β>α terpineno 7,37 0,27 0,57 0,51
10 <p> cimeno 7,72 1,77 1,03 1,49
11 limoneno 7,93 12,30 11,53 10,77
12 (Z)-β ocimeno 8,27 0,11 0,10 0,10
13 (E)-β ocimeno 8,70 0,50 0,40 0,27
14 <ϒ> terpineno 9,14 1,24 1,77 1,41
15 <p-> menta-2,4(8)-dieno 10,32 0,48 0,50 0,38
16 <6-> camphenone 10,70 0,05 0,10 0,05
17 Linalool 11,21 0,27 0,40 0,19
18 <n-> nonanal 11,41 0,24 0,28 0,42
19 <cis-p-> menth-2-en-1-ol 12,19 0,12 0,19 0,00
20 pinocarveol <trans-> 12,84 0,14 0,04 0,04
21 <cis-> verbenol 13,05 0,07 0,13 0,07
22 Isopulegol 13,19 0,08 0,10 0,11
79
23 nerol óxido 13,81 0,08 0 0,00
24 pirazina <2,acetil-3-etil-> 13,89 0,00 0,05 0,19
25 Borneool 14,35 0,03 0,02 0,02
26 Pinocamfenol 14,42 0,10 0,03 0,01
27 terpinen-4-ol 14,75 1,91 3,67 0,00
28 Mirtenal 15,36 0,03 0,05 0,16
29 <neo-> dihidro carveol 15,51 0,31 0,71 0,54
30 <iso-> dihidro carveol 16,17 0,12 0,19 0,19
31 carvacrol, éter metílico 17,61 0,06 0 0,00
32 Timoquinona 17,88 0,04 0,04 0,10
33 acetato de isobornilo 19,42 0,10 0,06 0,06
34 Undecanona 20,06 0,38 0,04 0,05
35 acetato nonenol 20,59 0,49 0,09 0,10
36 acetato de mirtenilo 21,20 0,07 0,03 0,03
37 <cis> acetato de piperitol 21,63 0,04 0,04 0,05
38 <δ-> elemene 22,09 0,04 0,05 0,08
39 <α->acetato de terpinilo 21,60 0,08 0 0,00
40 <α-> cubebene 22,31 0,06 0,12 0,22
41 <α-> copaene 23,26 0,43 0,81 1,03
42 <β-> panasinsene 23,83 0,42 0,47 0,76
43 modheph-2-ene 23,95 2,59 1,60 3,95
44 <α-> chamipinene 24,54 0,05 0,05 0,08
45 <2-epi-β> funebrene 25,06 2,90 3,33 2,69
46 <β-> cedreno 25,46 0,16 0,07 0,12
47 <β-> duprezianenen 25,83 1,71 0,03 0,08
48 <α-> guaiene 26,14 0,17 0,13 0,21
49 adromandendrene 26,34 0,09 0,11 0,08
50 santalene <2epi-β> 26,56 3,88 2,50 2,02
51 spirolepechinene 26,69 0,25 0,07 0,10
52 <cis-> muurola-4(14),5diene 27,35 0,21 0,10 0,22
53 dauca-5,8-diene 27,47 0,13 0,12 0,19
54 <ϒ-> gurjenene 27,66 5,69 8,47 5,48
80
55 <ϒ-> mururolene 27,91 0,34 0,21 0,50
56 <β-> cardin-1(6),4-diene 28,02 0,21 0,13 0,18
57 <ϒ-> curcumene 28,22 2,41 2,09 1,60
58 <epi-> cubebol 28,32 0,15 0,10 0,19
59 <ϒ-> amorphene 28,46 0,39 0,29 0,27
60 Viridiflorene 28,70 4,70 2,53 4,79
61 <ϒ-> amorfeno 28,95 0,17 0,14 0,15
62 Cubebol 29,10 0,10 0,09 0,09
63 <ϒ-> cardinene 29,23 0,85 1,87 1,46
64 calamenen (cis) 30,08 0,07 0,05 0,27
65 Elemol 30,62 0,15 0,10 0,08
66 germacreno b 30,74 0,04 0,06 0,15
67 <trans-> dauca-4(11),7-dieno 30, 87 0,65 0,04 0,08
68 longicamphenylone 31,02 0,25 0,09 0,20
69 norpathchoulenol 31, 30 0,19 0 0
70 Spatulenol 31,46 1,39 0,73 2,10
71 Palustrol 31,54 0,66 0,97 2,23
72 <α-> cedreno epóxido 31,80 3,37 0,61 0,63
73 óxido de cariofileo 32,08 0,42 0,20 0,00
74 mayurone <cis-dihydro-> 32,21 0,31 0,20 0,33
75 cubeban-11-ol 32,39 0,39 0,20 0,22
76 Cedrol 32,63 0,53 0,52 1,20
77 eudesmol < 5-epi-7-epi-α-> 33,04 0,15 0,30 0,40
78 <cis-> isolongifolanona 33,77 0,00 0,00
79 cedrol epi 33,40 0,25 0,51 0,63
80 helifolen-12al-D <syn-syn-syn> 33,53 0,26 0,10 0,22
81 eudesmol <10-epi-ϒ-> 33,62 0,29 0,37 0,40
82 <trans-> isolongifolanona 33,76 0,21 0,28 0,23
83 Eremoligenol 34,00 0,14 0,20 0
84 cadin-4-en-7-ol <cis-> 34,07 0,21 0,23 0,25
85 Hinesol 34,20 0,34 0,34 0,53
86 muurol <α-> (=torreyol) 34,54 0,99 1,05 1,42
81
87 cedr-8(15)-en-9-α-ol 34,64 0,17 0 0,41
88 Gymnomitrol 34.88 0,25 0,40 0,46
89 ageratocromeno 35,04 0,31 0,48 1,10
90 jumicedranonoe 35,11 0,16 0 0
91 Occidenol 35,53 0,25 0,73 0,46
92 eudesmia-4(15),7-dien-1β-ol (impureza) 35,75 0,13 0,14 0,25
93 <cis-> thujopseno 36,90 0,24 0,27 0,69
94 Nd 37,18 0,32 0,35 0,40
95 acetato khusinol 40,60 0,06 0,07 0,05
96 ciclopentadecanolida 41,11 0,46 0,65 0,25
97 eudesm-7(11)-en-4-ol, acetato 41,80 0,14 0,35 0,59
98 <epi> laurencene 43,07 0,03 0,06 0,14
99 Rimuene 43,50 0,03 0,05 0,11
100 Fitol 44,75 0,08 0,08 0,10
101 Doloabradiene 45,64 0,08 0,17 0,51
102 kaur-15-ene 46,33 0,10 0,23 0,76
103 Kaureno 48,66 0,09 0,17 0,36
104 <13-epi-> manool 49,11 0,10 0,20 0,37
105 Abietadieno 50,08 0,09 0,05 0,00
106 < n > heneicosano 50,47 0,42 0,61 0,33
107 sandaracopinmarinal 52,00 0,03 0,25 0,62
108 Larixol 55,47 0,03 0,14 0,31
109 oxido de incensole 55,88 0,05 0,18 0,00
110 Abietal 56,87 0,05 0,10 0,08
111 Nd 56,91 0,08 0,22 0,18
112 labd-7,13,dien,15,ol, acetato 58,04 0,02 0,06 0,14
113 Nd 58,09 0,04 0,10 0,00
114 Nd 59,55 2,19 0,09 0,49
Los porcentajes para cada época son: Monoterpenos: noviembre 40 %, enero 40 %, abril 32 %.
Sesquiterpenos noviembre 60 %, enero 60 %, abril 60 %. Monoterpenos Oxigenados noviembre
10 %, enero 10 %, abril 0 %. Sesquiterpenos Oxigenados noviembre 33,33 %, enero 33,33 %,
82
abril 33,33 %, en la tabla 18 se puede observar los compuestos mayoritarios están distribuidos
en la primera parte del el cromatograma (figura 37).
Figura 37. Cromatograma del aceite de A. spinosa
(B) De la especie A. spinosa recolectado en el sector Enladrillado, se identificó 93 componentes
de este aceite descritos en la siguiente tabla 19.
Tabla 19. Resultados de la composición química de A. spinosa (Enladrillado)
RT Compuesto Fecha de recolección
abril 2015 / %
1 4,17 <α> tujeno 2,76
2 4,43 tricyclene 22,74
3 4,87 α pinene 1,17
4 5,00 thuja-2,4(10)-diene 0,14
5 5,67 nd 2,52
83
6 5,84 <β> pineno 3,63
7 6,34 mircene 2,77
8 7,05 s<iso-> silvestrene 9,26
9 7,72 <p> cimeno 2,20
10 7,90 limoneno 5,82
11 8,28 (Z)-β ocimene 0,12
12 8,72 (E)-β ocimene 0,13
13 9,15 <ϒ> terpineno 0,06
14 10,32 <p-> menta-2,4(8)-diene 0,34
15 10,77 <6-> camphenone 0,11
16 11,25 linalool 0,14
17 11,42 <n-> nonanal 2,67
18 12,26 <cis-p-> menta-2-en-1-ol 0,39
19 12,85 <trans-> pinocarveol <trans-> 0,20
20 12,99 <cis->verbenol 0,18
21 13,16 isopulegol 0,38
22 13,81 nerol oxido 0,07
23 14,42 pinocamphenol 0,01
24 15,35 mirtenal 0,34
25 15,51 <neo-> dihidro carveol 0,33
26 16,13 <iso-> dihidro carveol 0,32
27 17,88 timoquinona 0,07
28 19,42 acetato de isobornilo 0,15
29 20,60 undecanona 4,51
30 20,10 <(2E)-> acetato nonenol 1,85
31 21,20 acetato de mirtenilo 0,09
32 22,08 <δ-> elemene 0,11
33 22,29 <α-> acetato de mirtenilo 0,06
34 22,37 <α-> cubebene 0,06
35 23,24 <α-> copaene 0,64
36 23,55 cyclosativene 0,38
37 23,82 <β-> panasinsene 0,20
84
38 23,93 modheph-2-ene 1,05
39 24,50 <α-> chamipinene 0,07
40 25,02 <2-epi-β> funebrene 0,68
41 25,49 <β-> cedrene 0,26
42 25,79 <β-> duprezianenen 0,04
43 26,34 <α->guaiene 0,03
44 26,51 santalene <2epi-β> 0,12
45 26,66 spirolepechinene 0,21
46 27,33 muurola-4(14),5diene <cis-> 0,05
47 27,46 dauca-5,8-diene 0,50
48 27,65 <ϒ-> gurjenene 7,18
49 27,90 <ϒ-> mururolene 0,30
50 28,00 cardin-1(6),4-diene <β-> 0,15
51 28,19 <ϒ->curcumene 0,37
52 28,30 cubebol <epi-> 0,08
53 28,42 <ϒ-> amorfene 0,34
54 28,64 viridiflorene 0,80
55 28,94 <ϒ-> amorfene 0,36
56 29,09 cubebol 0,05
57 29,21 <ϒ-> cardinene 0,54
58 30,05 calamenen (cis) 0,24
59 30,62 elemol 1,47
60 30,73 germacrene B 0,85
61 31,01 longicamphenylone 0,85
62 31,47 spatulenol 3,03
63 31,54 palustrol 0,90
64 31,82 <α> cedreno epóxido 0,58
65 32,63 cedrol 0,59
66 33,04 eudesmol < 5-epi-7-epi-α-> 0,75
67 33,40 cedrol epi 0,26
68 33,62 eudesmol <10-epi-ϒ-> 0,34
69 33,76 isolongifolanone <trans-> 0,68
85
70 34,00 eremoligenol 0,45
71 34,07 cadin-4-en-7-ol <cis-> 0,56
72 34,20 hinesol 0,61
73 34,64 cedr-8(15)-en-9-α-ol 1,05
74 34,87 gymnomitrol 1,15
75 35,03 ageratochromene 0,26
76 35,10 jumicedranonoe 0,25
77 35,52 occidenol 0,40
78 35,74 eudesmia-4(15),7-dien-1β-ol (impure) 0,47
79 36,90 thujopseno <cis-> 0,38
80 37,18 Nd 0,19
81 40,59 Acetato de khusinol 0,75
82 41,11 Ciclopentadecanolida 0,17
83 43,49 rimuene 0,62
84 44,75 fitol 0,06
85 45,63 doloabradiene 0,36
86 46,33 Kaur-15-ene 0,07
87 49,79 <n> heneicosano 0,18
88 52,00 sandaracopinmarinal 0,04
89 54,37 abietal 0,15
90 56,90 nd 0,28
91 58,03 labd-7,13,dien,15,ol, acetate 0,11
92 58,09 nd 0,12
93 59,54 nd 0,21
En la figura 38 se observa el cromatograma del aceite esencial de A. spinosa (Enladrillado), los
compuestos mayoritarios se encuentran ubicados en la primera parte del cromatograma.
86
Figura 38. Cromatograma del aceite A. spinosa (Enladrillado)
3.3.3 Composición química del aceite esencial de A. monantha
En el aceite de A. monantha se identificó 96 componentes que se describe en la siguiente tabla
20.
Tabla 20. Resultados de la composición química de A. monantha
Compuesto
Fecha de recolección
RT
Noviembre
2014
Enero
2015
Abril
2015
% % %
1 crisantenol <cis-> 14,14 0,00 0,07 0,00
2 decanal 16,14 0,00 0,16 0,00
3 acetato de crisanteno 18,26 0,63 0,00 0,00
4 mentol <8-hidroxi-neo-> 21,43 0,00 0,45 0,17
5 <δ-> acetato de terpinilo 21,60 0,00 0,19 0,42
6 silfinene 22,10 0,00 0,08 0,00
7 ciclosativene 23,27 0,30 0,49 0,47
8 oxido de piperitenona 23,42 0,00 0,14 0,19
9 <α-> copaene 23,63 0,00 0,14 0,00
10 daucene 23,85 0,00 0,16 0,14
11 <β-> panasinsene 23,97 0,00 1,59 0,90
12 <α->chamipinene 24,25 0,20 0,00 0,00
13 <α-> funebrene 24,85 0,00 2,49 5,76
87
14 longifolene 24,90 17,69 0,00 0,00
15 funebrene <2-epi-β-> 25,06 2,90 0,00 0,00
16 cariofilene <(E)-> 25,26 0,00 23,74 24,05
17 <β-> duprezianene 25,42 0,00 0,14 0,23
18 <cis-> thujopseno 25,84 0,00 0,63 0,58
19 <β-> barbatene 26,15 0,00 0,30 0,48
20 lavandulil isobutanoate 26,53 1,84 0,00 0,00
21 santalene <epi-β-> 26,68 0,36 13,72 13,97
22 amorfa-4,11-dieno 26,76 0,00 0,20 0,21
23 farneseno <(E)-β-> 26,80 0,52 0,00 0,00
24 <α-> patchoulene 26,83 0,00 0,34 0,41
25 sesquisabinene 27,04 1,24 0,17 0,40
26 <α-> acoradiene 27,38 0,00 0,14 0,19
27 dauca-5,8-dieno 27,48 0,00 0,19 0,23
28 cadina-1(6),4-dieno <trans-> 27,65 0,00 2,22 1,51
29 gurjunene 27,80 0,00 0,17 0,00
30 <υ-> muurolene 27,93 0,00 0,38 0,39
31 himachala-1,4-dieno <11-αh-> 28,17 1,07 0,00 0,00
32 <β-> selinen 28,37 0,00 17,96 21,04
33 Viridiflorene 28,69 0,00 0,66 1,11
34 farneseno <(E,E)-α-> 29,03 0,00 1,20 1,06
35 <δ-> amorfeno 29,28 0,33 0,99 0,96
36 <β-> curcumeno 29,53 0,00 0,14 0,25
37 <υ-> cuprenene 30,24 0,00 0,11 0,00
38 cedranoxide <8,14-> 30,38 0,50 0,41 0,45
39 <α-> epóxide cedreno 31,56 7,76 0,00 0,00
40 eter cadineno <cis-> 31,63 7,57 0,18 0,21
41 silphiperfol-5-en-3-ol a 31,33 0,00 0,28 0,00
42 espatulenol 31,60 0,00 10,93 9,22
43 hidrato de sesquisabineno <trans-> (IPP vs OH) 31,78 1,25 0,73 0,76
44 thujopsan-2-α-ol 32,15 2,01 0,85 0,65
45 óxido de cariofileno 32,23 0,64 0,35 0,41
88
46 rosifoliol 32,67 4,69 1,99 2,63
47 guaiol 32,87 0,50 0,19 0,00
48 guaia-3,10(14)-dieno <9,11-epoxi-> 33,05 0,39 0,20 0,23
49 bisabolaladien-4-ol <2, (7Z)-> 33,42 0,33 0,13 0,27
50 <β-> biotol 33,54 0,00 0,66 0,63
51 eudesmol <10-epi-υ> 33,65 0,00 0,81 0,88
52 <β-> cedren-9-one 33,78 0,00 0,30 0,35
53 <υ-> eudesmol 33,85 1,90 0,22 0,49
54 muurolol <epi-υ> 34,07 0,25 0,65 0,52
55 V muurolol (= torreyol) 34,50 0,69 0,57 0,57
56 cedr-8(15)-en-9-α-ol 34,65 0,00 0,55 0,65
57 vulgarona b 34,70 1,70 0,00 0,00
58 alcohol pachulí 34,88 0,00 0,24 0,00
59 allohimachalol 35,09 0,82 0,60 0,78
60 valeranona 35,36 0,24 0,00 0,00
61 occidenol 35,44 0,46 0,00 0,00
62 mustakone 35,53 0,00 0,19 0,00
63 <β-> bisabolol 35,60 0,50 0,00 0,00
64 guaya-3,10(14)-dien-11-ol 35,70 0,95 0,31 0,00
65 nootkatol 36,81 0,38 0,19 0,00
66 <β-> davanona-2-ol 36,97 1,08 0,28 0,33
67 tasmanona 37,12 0,00 0,23 0,00
68 zerumbone 37,50 0,00 0,23 0,00
69 eremophilone 37,63 0,00 0,31 0,00
70 amorfa-4,9-dieno <7,14-anhidro-> 38,33 0,00 0,21 0,21
71 dodecanoato de butilo 39,23 2,30 0,00 0,08
72 Nootkatona 40,06 0,36 0,00 0,00
73 acetato de khusinol 40,51 0,41 0,15 0,00
74 ciclopentadecanolide 41,12 0,00 0,37 0,17
75 acetato de farnesil <(2E,6E)-> 41,32 1,16 0,47 0,42
76 eremophilone <8-hydroxy-> 41,50 0,36 0,00 0,00
77 amorfa-4,7-dieno <2-α-acetoxi-11-metoxi-> 42,47 0,57 0,00 0,00
89
78 <n-> hexadecanol 42,74 3,72 2,60 0,95
79 cedranediol <8s,14-> 42,91 0,65 0,17 0,00
80 sclarene 43,53 0,28 0,27 0,20
81 hexadecanoato de etilo 46,15 14,94 0,06 0,00
82 brasilato de etileno 46,82 0,36 0,20 0,00
83 pseudo fitol <(6E,10E)-> 47,16 0,36 0,00 0,12
84 <n-> octadecanol 49,16 1,60 0,79 0,64
85 acetato de fitol <(E)-> 49,80 0,00 0,30 0,00
86 abietal <dehidro-> 50,74 0,35 0,13 0,00
87 oxido de incensole 50,96 0,57 0,00 0,00
88 tricosano 54,39 1,81 0,67 0,50
89 hinokienona 55,72 0,18 0,09 0,00
90 hinokiol 55,77 0,53 0,22 0,16
91 sugiol 56,12 0,56 0,02 0,00
92 ferruginol <cis-> 56,91 1,99 0,63 0,48
93 heyderiol 57,21 0,00 0,08 0,00
94 abietal 58,04 0,47 0,13 0,00
95 labd-(13E)-8,15-diol 58,10 0,37 0,59 0,59
96 taxodione <c6-deoxy-> 59,57 3,38 0,00 0,00
Se observa la distribución de los compuestos mayoritarios en la figura 39, (segundo
cromatograma, recolección en Enero 2015).
90
Figura 39. Cromatograma del aceite de A. monantha
Varias especies se han adaptado con el pasar del tiempo y cada vez han mejorado su producción
de sustancias vegetales, con el objetivo de su propio beneficio, y en este campo los aceites
esenciales sirven como repelentes de insectos depredadores inclusive algunos agentes
patogénicos, con la actividad biológica que presentan (Gerhard, 2010).
La determinación de la composición química de A. spinosa y A. monantha demuestra la
variabilidad de compuestos mayoritarios y minoritarios presentes en cada aceite, esto depende
de cada época de colecta (Angioni et al., 2006).
A. spinosa recolectada cerca de la costa de Constitución presenta compuestos mayoritarios de
tipo monoterpeno oxigenado compuestos de bajo peso molecular y por ello se observan en la
primera parte del cromatograma (figura 37), su tiempo de retención es de 5 - 20 minutos (Jara-
Bermeo et al., 2016).
Tempo de retención
91
Los datos obtenidos del aceite A. spinosa fueron comparados con los compuestos de otra
especie del género Azorella como A. trifuncata, descritos por López y colaboradores (2014).
En el reporte se destacan algunos compuestos por ejemplo: cimeno < p> % composición 1,8
sin embargo en A. spinosa su % composición fue 1,77 valor muy cercano al obtenido en la otra
especie de Azorella, de igual manera sucede con limoneno con valores similares en ambas
especies. Otros compuestos mayoritarios presentes en A. trifuncata: α-thujeno, α-fencheno, α-
fellandreno, limoneno, α-terpineol, acetato de mirtenilo, α-guaiene, espatulenol este último un
valor de composición muy alto 38,2 % en relación a la especie A. spinosa cuyo valor es apenas
1,39 %.
En el análisis químico de A. monantha recolectada en la Cordillera de los Andes se observó la
presencia de compuestos sesquiterpenos, sesquiterpenos oxigenados de característica
mayoritarios: <α-> funebrene, longifolene, cariofileno <(E)->, santalene <epi-β->, <β->
selinene, espatulenol, hexadecanoato de etilo, tiempo de retención 24,85; 24,90; 25,26; 26,66;
28,37; 31,60; 46,15 respectivamente, se observa en el cromatograma (figura 39), aparecen estos
compuestos que se observan a partir desde el tiempo de retención de 25 - 45 minutos en
comparación con los compuestos de A. spinosa que en su mayor parte están presentes en la
primera parte del cromatograma y su tiempo de retención 5 - 15 minutos, por lo tanto hay
diferencia de sus compuestos mayoritarios.
En comparación del análisis de A. spinosa recolectada en la cordillera (Enladrillado) y la especie
recolectada en la costa (Constitución) se observa la ausencia del compuesto terpinen-4-ol TR
14,75 minutos en A. spinosa de la cordillera (Enladrillado), pero existe la presencia de
undecanone TR 20,10 minutos, la ausencia de los compuestos: funebrene <2-epi-β>, <β->
duprezianenen, santalene <2epi-β> con tiempo de retención 25,06; 25,83 y 26,50 minutos,
respectivamente, se manifiesta por factores ambientales, características quimiotaxonómicas
(Gerhard, 2010). Cabe destacar que la recolección de A. spinosa de la cordillera (Enladrillado)
92
se realizó una vez, debido a las condiciones climáticas del lugar (cubierto de nieve) que existen
en las fechas de recolección.
Bakkali y colaboradores (Bakkali et al., 2008) describen parte de los componentes de aceites
esenciales de diferentes especies vegetales, frente bacterias y hongos, esto representa un gran
contribución en el control biológico.
3.4 Obtención de proteínas totales (extracción y cuantificación)
3.4.1 Extracción y cuantificación de proteína
La extracción de proteína, metodología descrita anteriormente con el protocolo de las diferentes
especies de Azorella, permitió obtener entre 4,7 - 8,5 µg/mL de proteína.
En la tabla 21 se reportan los valores de proteína en cada muestra colectada de las especies de
Azorella.
93
Tabla 21. Valores de proteína total de Azorella
Azorella
Época de
colecta /
Lugar
Código Masa
mg
Lectura
Bradford
µg/mL
proteína
Promedio
µg/mL
A. spinosa
196,6 0,351 7,6
nov-14 10 209,1 0,346 7,3 7,5
Constitución 223,8 0,349 7,5
feb- 15
Constitución
208,7 0,349 7,5
2 200,4 0,351 7,6 7,8
218,6 0,359 8,2
220,1 0,355 7,9
abr-15 9 223,7 0,364 8,5 7,4
Constitución 214,4 0,325 5,9
204,5 0,35 7,6
abr-15 8 205,3 0,368 8,8 8,0
Enladrillado 218,8 0,351 7,6
196,6 0,307 4,7
A. monantha
dic-14 5 209,1 0,311 5,0 4,7
Laguna Maule 223,8 0,301 4,3
208,7 0,325 5,9
ene-15 6 200,4 0,304 4,5 5,4
Paso Vergara 218,6 0,324 5,8
220,1 0,314 5,2
abr-15 7 223,7 0,322 5,7 5,6
Paso Vergara 214,4 0,325 5,9
202,7 0,344 7,2
Pasto P 229,7 0,403 11,1 8,5
(P. purperum) Patrones 208,1 0,346 7,3
230,4 0,319 5,5
Apio A 210,1 0,321 5,6 4,7
(A. graveolens L.) 204 0,359 4,9
94
3.4.2 Electroforesis SDS - PAGE y revelado de gel
El sistema de voltaje empelado en la electroforesis SDS - PAGE fue 50 mV durante 30 minutos
y 75 mV durante 120 minutos.
Existen diversos factores que influyen en la concentración del color de las bandas de proteína
como por ejemplo, la cantidad de proteína introducida en el gel, la potencia empleada en el
protocolo (70 mW a 50 mW), la tinción del gel debido que el colorante Comassie tiene 2
variantes Comassie R y Comassie G, el primero es el más utilizado siendo el más sensible de los
dos.
Según el protocolo de Ashoub y colaboradores, en 2011, el tiempo de tinción consultado en la
bibliografía es generalmente 2 horas, en nuestra investigación este período de tiempo fue muy
poco, por lo que se extendió esta etapa en un shakker por 24 horas. Finalmente el gel, se destiñó
con tres a cuatro lavados de la solución de destinción por 15 minutos. Se obtuvo un gel con
mejor resolución de las bandas de proteína de las diferentes especies de Azorella (figura 40).
Figura 40. Spots de proteína en gel poliacrilamida.
MW= Peso Molecular; Recolección Azorella 5=dic 2014 6= ene2015 7= abr 2015 8= abr 2015 10= nov 2014
2= feb 2015 P= Pasto (Pennisetum purpureum) A= Apio (Apium graveolens)
95
En el perfil proteico de Azorella obtenido mediante electroforesis SDS - PAGE de Azorella se
encontraron proteínas de alto peso molecular para la especie colectada en la Cordillera (A.
monantha) en la región del Maule, de 55 – 100 KDa, además, de otras bandas de menor
intensidad correspondiente a proteínas de 70 – 55 KDa. Las muestras colectadas en la segunda
y tercera salida presentan consistencia en el tamaño de las bandas.
Para la especie de A. spinosa (Constitución) se observa la presencia de bandas de proteínas entre
70 - 55 KDa en las tres recolecciones, hay una diferencia con la muestra recolectada en el sector
del Enladrillado en la cual no se observa bandas de proteínas.
Este es el primer reporte de caracterización de proteínas totales del género Azorella. Se observan
diferencia en el perfil de proteína, A. monantha presenta bandas más abundantes de mayor peso
molecular.
3.5.1 Determinación de la actividad antioxidante de extractos de Azorella
3.5.1.1 Contenido de Fenoles Totales (TPC)
El contenido total de fenoles fue expresado como equivalentes de ácido Gálico (GAE) en
miligramos por gramo de extracto, se expresa en la tabla 22 a continuación.
Tabla 22.Contenido de Fenoles Totales (TPC)
mg Acido Gálico/g
A. pedunculata
Ecuador
A. spinosa
Chile
Azuay Cañar Chimborazo Enladrillado
DCM MeOH DCM MeOH DCM MeOH DCM MeOH
443,2 1187,7 272 828,5 579,3 912,8 128,3 2040,6
96
3.5.1.2 Contenido Total de Flavonoides (TFC)
Los resultados fueron reportados como equivalentes de Quercetina (QE) en miligramos por
gramo de extracto, para el extracto de metanólico de A. pedunculata fue 23,05 mg QE/g y 19,86
QE/g para el extracto DCM.
Tabla 23. Contenido Total de Flavonoides (TFC)
3.5.1.3 Ensayo de DPPH
La determinación de la capacidad antioxidante de los extractos de A. pedunculata, se expresó
como el IC50, (concentración del extracto que provoca la pérdida del 50 % de la actividad del
reactivo DPPH, es decir una disminución del color).
El extracto con mejor resultado fue el extracto de MeOH de las especies de A. pedunculata y A.
spinosa, mostrando mayor capacidad para atrapar radicales libres a alta concentración, como se
muestra en la tabla 24.
QEmg/g
A. pedunculata
Ecuador
A. spinosa
Chile
Azuay Cañar Chimborazo Enladrillado
DCM MeOH DCM MeOH DCM MeOH DCM MeOH
60 66,99 19,86 23,05 13,28 22,13 33,23 50,81
97
Tabla 24. Resultado Ensayo DPPH
% Decoloración
Concentración
µg/mL
A. pedunculata
Ecuador
A. spinosa
Chile
Azuay Cañar Chimborazo Enladrillado
DCM MeOH DCM MeOH DCM MeOH DCM MeOH
10 4,82 8,29 8,88 10,15 1,78 13,83 6,87 54,02
50 15,99 40,28 13,32 32,36 14,97 29,95 14,25 79,27
100 24,37 75,13 74,62 52,92 25,51 53,81 10,10 94,43
3.5.1.4 Ensayo ABTS•+
El extracto metanólico de la especie A. spinosa (Enladrillado) posee alta capacidad de
neutralización del radical catiónico ABTS•+, en comparación con las especies de Ecuador.
Tabla 25. Ensayo ABTS•+
% Decoloración
Concentración
µg/mL
A. pedunculata
A. spinosa
Ecuador Chile
Azuay Cañar Chimborazo Enladrillado
DCM MeOH MeOH DCM MeOH DCM MeOH
33,33 13,50 23,55 21,05 10,55 19,55 16,55 49,50
41,67 16,55 22,75 20,25 16,10 22,75 22,45 57,50
50 22,55 33,05 30,55 16,60 29,45 23,40 81,05
83,33 32,60 52,20 49,70 32,55 59,65 37,35 80,50
125 49,20 68,20 65,70 47,95 57,50 40,50 71,25
166,6 54,90 58,05 55,55 61,40 29,60 75,90 72,30
98
Los resultados presentados en las tablas anteriores se observa al extracto de MeOH de Azorella
presenta el mayor contenido de fenoles totales en comparación con los extractos de DCM, debido
a la polaridad del solvente utilizado. Según Barchan y colaboradores en el año 2014
comprobaron el efecto de la polaridad de los diferentes solventes en la actividad antioxidante y
el contenido total de fenoles en tres especies de menta, los resultados indican que los extractos
obtenidos con metanol y agua son solventes adecuados para ensayos de actividad antioxidante
(Barchan et al., 2014).
En referencia a los valores presentados en la tabla 22, el extracto con valor alto de contenido
total de fenoles es A. spinosa, como se mencionó en la sección 1.2.1.1 esta especie permanece
expuesta a la radiación luz uv en constante estrés biótico y abiótico situación que favorece a la
producción de compuestos antioxidantes en esta especie (Wickens, 1995). En referencia con la
literatura Quesada y colaboradores en el año 2013, reportaron el contenido total de fenoles de
dos especies de Azorella, siendo el extracto metanólico de A. spinosa el cual presentaba el
mayor contenido total de fenoles, en relación con el resultado de este trabajo de A. spinosa de
igual manera fue el cual presentó el mayor valor.
En relación con los resultados de TFC el extracto de A. spinosa tiene un valor mayor 50,81 mg
QE/g, este resultado tiene relación con los resultados de la tabla 22, que corresponde al
Contenido Total de Fenoles.
Los flavonoides están presentes en la mayor parte de familias de plantas, como se describe en la
sección 1.1.5, estos compuestos han sido importantes por su contribución en la clasificación y
distribución de la familia Apiaceae, por lo tanto las especies que la conforman contienen este
metabolito secundario (Saleh et al., 1983).
En un reciente estudio de A. compacta, Tůmová y colaboradores en el año 2017, determinaron
el contenido total de fenoles, flavonoides y taninos en infusión de A. compacta, cuyo contenido
fue respectivamente 5,40 mg/100 mg, 1,79 mg/100 mg, and 1,76 mg/100 mg, demostrando la
99
capacidad de eliminación de radicales libres en células inmunes humanas (Tůmová et al., 2017).
En comparación con el estudio de Tůmová y colaboradores en el año 2017 este trabajo analizó
extractos de DCM y MeOH, al no contar con el extracto acuoso de las mismas.
En el ensayo de DPPH, Abad en el año 2015 (Abad, 2015), evaluó la actividad antioxidante del
extracto metanólico de la especie A. pedunculata, a través del método de atrapamiento del radical
DPPH (2,2-difenil-1-picryhydrazyl), patrón compuesto Trolox, rango (0 - 800 µg/mL), reportó
la actividad antioxidante de 488,25 µg/moles por mg de extracto, en referencia al ensayo
descrito en la sección 3.1.3.3 el cual se realizó con diferentes concentraciones 10 - 50 - 100
µg/mL, el extracto metanólico obtuvo mayor porcentaje de decoloración en todas las
concentraciones, concordando con el análisis de Abad en el año 2015.
El ensayo de ABTS•+ de las especies de Azorella constituye el primer reporte de atrapamiento
de radicales libres, donde la actividad está directamente relacionada con la concentración de la
muestra como se observa en la tabla 25.
Varios autores han evaluado la actividad antioxidante de especies utilizadas en el arte culinario,
con el objetivo de conocer fuentes potenciales de antioxidantes de origen natural destacando el
trabajo de Yingy y colaboradores en el año 2015, quienes realizaron el análisis de nueve especies
de extractos metanólicos y etanólicos: anís estrellado (Illicium verum Hook. F.), pimienta de
sichuan (Zanthoxylum bungeanum Maxim.), canela (Cinnamomum verum), laurel (Laurus
nobilis), hinojo (F. vulgare Mill.), fruto tsaoko (Amomum tsao-ko Crevost & Lemarié), jengibre
azul (Alpinia officinarum Hance), jengibre (Zingiber officinale Roscoe), cáscara de mandarina
(Citrus reticulata Blanco); la especie canela (C. verum) mostró la mayor capacidad antioxidante
en los ensayos de ABTS; esta especie es comúnmente utilizada como saborizante, y en ciertas
100
actividades biológicas como antimicrobiano, antitumoral, antihipertensivo, gastroprotectora
siendo esta la principal razón de su uso (Ying et al., 2015).
Otros autores como Chatatikun & Chiabchalard (2013) evaluaron la actividad antioxidante de
las mini zanahorias (D. carota) como resultado el extracto etanólico presenta la mayor actividad
antioxidante, medido por el ensayo ABTS, los autores proponen a esta especie como un
candidato para el desarrollo de nuevos compuestos para prevenir el efecto del daño celular
provocado por radicales libres.
Los solventes utilizados en la obtención de extractos de Azorella fueron EP, DCM y MeOH, los
dos últimos extractos fueron utilizados en la determinación de la actividad antioxidante, sin
embargo, es importante mencionar que el uso del extracto acuoso de las especies de A.
pedunculata y A. spinosa puede contribuir al estudio de la actividad antioxidante de estas
especies, otro factor importante se debe al uso de infusiones del género Azorella en la Región
del norte del país (Wächter et al., 1998) (Barrano et al., 2016).
La actividad antioxidante de los extractos de especies del género Azorella fue dependiente de
la concentración, siendo el mejor extracto el metanólico.
Todos los ensayos descritos en las secciones 2.2.8.1; 2.2.8.1.2; 2.2.8.1.3; 2.2.8.1.4; recalcan a
los extractos de las especies de Azorella como notables donadores de átomos de hidrógenos, los
resultados fueron proporcionales entre el contenido de fenoles y el potencial antioxidante de la
actividad neutralizadora de radicales libres en el ensayo de DPPH y ABTS•+.
Los resultados de este análisis son importantes ya que constituyen una base para el desarrollo de
futuras investigaciones en estas especies y aplicar su capacidad antioxidantes en diferentes
actividades biológicas de interés común.
101
3.5.2 Actividad antibacteriana del aceite esencial de A. spinosa
El aceite de A. spinosa (Enladrillado) fue evaluado como agente antibacterial, contra
Pseudomona syringae, presentando actividad moderada con CMI fue 130 µg/mL (Jara-Bermeo
et al., 2016).
López y colaboradores en el año 2014 (López et al., 2014), evaluaron la actividad antibacterial
y repelente del aceite esencial de A. trifurcata (San Juan Provincia de Argentina), reportando la
actividad antibacterial contra Pseudomona sp. Staphylococcus coagulasa negativa 968, con
valores de CMI de 500 µg/mL y 1000 µg/mL respectivamente. En comparación con la actividad
antibacteriana del aceite de A. spinosa que también tiene actividad contra una bacteria Gram
negativa (P. syringae), este aceite compuesto principalmente por monoterpenos (40 %) y
sesquiterpenos: (60 % ); el compuesto más abundante fue el tricicleno (16,99 %) (Jara-Bermeo
et al., 2016) sin embargo López y colaboradores indicaron los componentes principales del aceite
de A. trifurcata: monoterpenos (49,5 %); sesquiterpenos: (48,7 %) el compuesto más abundante
fue espatulenol (38,2 %), los autores atribuyen la actividad antibacteriana al compuesto
mayoritario del aceite.
3.5.3 Actividad citotóxica de extractos y aceites esenciales de especies de Azorella.
La determinación del porcentaje de citotoxicidad de los extractos y aceites esenciales del género
Azorella, fue evaluado en relación al porcentaje de la variabilidad y mortalidad presente en cada
concentración y su condición experimental (ej. doxorrubicina y el medio de cultivo empleado).
Los resultados obtenidos se expresaron en concentración letal media CE50.
El porcentaje de la viabilidad (% V) se calculó con la siguiente ecuación en donde: (OD)
representa la densidad óptica de las células no expuestas es decir el control negativo y
corresponde al 100 % de la viabilidad celular.
El porcentaje de mortalidad es 100 % - % de viabilidad
102
% Viabilidad = (OD células no expuestas) / (OD Control células) x 100
La escala de los valores de citotoxicidad corresponde a:
CL50 < 100,0 µg/mL, moderadamente tóxica; CL50 > 100,0 - < 200,0 µg/mL; y
Potencialmente no tóxico CL50 > 200 µg/mL.
Tabla 26. Resultados de citotoxicidad de Azorella
Citotoxicidad Actividad
biológica Especie Solvente Recolección CL50 DS
Extractos
orgánicos
A. spinosa
Enladrillado
EP
NA
16,67 0,86
citotoxicidad
alta
DCM 28,50 3,99
MeOH 21,10 4,44
A. pedunculata
Cañar
EP 17,46 0,64
DCM 17,78 2,44
AcOEt 21,60 3,30
MeOH 23,96 3,76
A. pedunculata
Chimborazo
EP 17,03 2,69
DCM 19,20 3,65
MeOH 25,96 2,83
A. pedunculata
Azuay
EP 17,53 2,71
DCM 12,74 0,68
MeOH 20,82 3,12
A. spinosa
Piedra Mono
EP 13,31 0,70
DCM 22,58 3,53
MeOH 41,92 19,04
Aceites
Esenciales
A. spinosa
Constitución
NA
Segunda 41,63 27,41
Tercera 14,33 0,78
A. monantha
Paso Vergara Tercera 16,39 2,21
NA: No aplica DS: desviación estándar activo CE50 <20,0 µg/mL
103
Desde la antigüedad muchas plantas y especies marinas han proporcionado a la civilización
sustancias que han sido utilizadas en beneficio de varias enfermedades, por ejemplo el caso de
varias especies con alto contenido de toxicidad que han podido ser empleadas como nuevos
agentes terapéuticos (Heywood, 1983).
Diversos estudios de actividad citotóxica se han realizado en varias plantas como por ejemplo el
trabajo de Amri en el año 2014, quién describe a 24 familias de plantas, que contienen
compuestos reportados como agentes citotóxicos, detallando que la familia Apiaceae contiene
especies como: zanahoria (D. carota), apio (A. graveolens), cilantro (C. sativum L.), hinojo (F.
vulgare), con alto contenido de compuestos bioactivos descritos en la sección 1.1.2, los cuales
pueden reducir el crecimiento celular (Shelef, 2003) (Amri, 2014).
En el caso específico de especies del género Azorella, San - Martín y colaboradores en el año
2015, realizaron el estudio de la actividad antitumoral de una nueva chalcona, aislada de la
especie A. madreporica siendo este la primera aproximación a esta actividad biológica (San-
Martin et al., 2015).
Los valores correspondientes al ensayo de citotoxicidad de las especies de Azorella recolectado
en Ecuador y Chile (tabla 26); los extractos de DCM y EP de A. pedunculata y A. spinosa
respectivamente, pueden ser futuros candidatos para estudios de fraccionamiento e identificar la
molécula responsable de la citotoxicidad; este es el primer reporte de esta actividad de estas
especies de Azorella.
3.5.4 Actividad anti T. cruzi de extractos y aceites esenciales de especies de Azorella.
El extracto EP de A. spinosa (Piedra del Mono) presenta un valor de CE50 en T. cruzi de 11,02
µg/mL este resultado es promisorio en comparación con otros extractos de A. spinosa
(Enladrillado) con valor de CE50 16,02 µg/mL y A. pedunculata CE50 11,50 µg/mL.
104
Tabla 27. Determinación actividad anti T. cruzi de Azorella
Organismo objetivo: T. cruzi
Actividad
biológica
Extractos
orgánicos
Especie Solvente Recolección CL50 DS IS
A. spinosa
Enladrillado
EP
NA
16,02 2,32 1,04 alta
DCM 27,90 2,28 1,02
moderada MeOH 43,86 3,06 0,48
A. pedunculata
Cañar
EP 17,85 2,86 0,98
alta DCM 12,99 1,09 1,37
AcOEt 35,09 3,92 0,62 moderada
A. pedunculata
Chimborazo
EP 18,44 2,64 0,92
alta DCM 16,74 2,61 1,15
MeOH 33,70 3,92 0,77 moderada
A. pedunculata
Azuay
EP 15,61 1,45 1,12
alta DCM 11,50 0,25 1,11
A. spinosa
Piedra Mono
EP 11,02 1,06 1,21 alta
DCM 39,67 6,28 0,57
moderada MeOH 38,74 5,70 1,08
Aceites
Esenciales
A. monantha
Paso Vergara NA tercera 42,68 2,59 0,38 moderada
NA: No aplica DS: Desviación estándar IS: Índice de selectividad activo CE50 <20,0 µg/mL
La interpretación de los valores utilizados para la actividad antiplasmódica, antileismaniasico y
anti T. cruzi son los valores siguientes:
activo, CE50 <20,0 µg/mL;
moderadamente activo, CE50> 20 <50,0 µg/mL;
potencialmente no activa, CE50> 50,0 µg/mL.
105
Índice de selectividad es una medida relativa la cual indica las veces posibles de concentrar el
extracto o aceite esencial para obtener el efecto inhibitorio sin que se produzca un efecto toxico
(Taborda et al., 2007) se calculó con la ecuación:
IS = CL50 / CE50.
En el caso del extracto de EP de la especie A. spinosa presenta actividad alta, el valor de CL50
es 11,02 µg/mL; sin embargo, la actividad de los extractos de DCM y MeOH fue moderada. Se
señala que la solubilidad del extracto juega un papel importante en la actividad biológica
(Barchan et al., 2014).
El extracto de DCM de la especie A. pedunculata tiene un valor similar de CL50 11,50 µg/mL y
también presenta actividad alta, dado que son dos especies de procedencia diferentes.
En comparación con otras especies que han sido estudiadas, Muñoz y colaboradores en el año
2003 evaluaron la actividad anti T. cruzi de 31 diferentes plantas medicinales utilizadas en Chile,
pertenecientes a las familias: Asteraceae, Laureceae Mirtaceae, Saxifragaceae, Lamiaceae,
Winteraceae, Onagraceae, Euforbiaceae, Amarullidaceae, Rutaceae, Podocarpaceae,
Philesiaceae, Anacardiaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Solanaceae, Berberidaceae, Celastraceae,
Apocinaceae y Ariliaceae. Los autores reportaron 2 compuestos activos de la especie Drimys
winteri perteneciente a la familia Winteraceae frente a T. cruzi (Muñoz et al., 2001), en el mismo
año Araya y colaboradores, evaluaron la misma actividad de compuestos de A. compacta (Araya
et al., 2003), iniciando el estudio de esta actividad biológica en especies del género Azorella.
En el año 2014, Azeredo y colaboradores evaluaron la actividad biológica de ocho aceites
esenciales frente a T. cruzi, las especies utilizadas en este ensayo fueron canelo (Cinnamomum
verum), limón (Citrus limon), citronela (Cymbopogon nardus), eucalipto olor limón (Corymbia
citriodora), eucalipto (Eucalyptus globulus), grosella (Eugenia uniflora), incienso (Myrocarpus
frondosus), y romero (Rosmarinus officinalis). Los aceites de canelo (C. verum), incienso (M.
106
frondosus) y grosella (E.uniflora), fueron reportados como activos contra T. cruzi, cada uno con
valor de IC50 24,13 μg/mL; 60,87 μg/mL y 70 μg/mL respectivamente (Azeredo et al.,2014).
En comparación el aceite de A. monantha demostró actividad moderada. Este es el primer
análisis en extractos y aceites esenciales, de A. pedunculata y A. spinosa, siendo los resultados
promisorios con estos exactos dando inicio a futuros protocolos de aislamiento de las moléculas
responsables de la actividad anti T. cruzi.
3.5.5 Actividad anti-Leishmania de extractos y aceites esenciales de especies de Azorella.
El extracto EP de A. pedunculata (Chimborazo), valor de CE50 en T. cruzi es de 11,88 µg/mL,
promisorio para este ensayo; otro valor interesante es el que presenta A. spinosa y A. monantha,
este último con el valor más bajo CE50 10,21 µg/mL en relación con 11,50 µg/mL que tiene A.
spinosa (3ra recolección).
En la tabla 28, no se describen los extractos que tiene una actividad no determinada debido a su
citotoxicidad.
107
Tabla 28. Determinación actividad anti-Leishmania de Azorella
Organismo objetivo: Leishmania Actividad
biológica Especie Solvente Recolección CE50 DS IS
Extractos
orgánicos
A. spinosa
Enladrillado DCM
NA
26,13 1,62 1,09 moderada
A. pedunculata
Cañar EP 42,94 6,66 0,41 moderada
A. pedunculata
Chimborazo
EP 11,88 1,95 1,43 alta
DCM 15,21 2,40 1,26
A. pedunculata
Azuay EP 28,08 1,06 0,62 moderada
A. spinosa
Piedra Mono
EP 17,03 3,16 0,78 alta
MeOH 30,48 4,19 1,38 moderada
Aceites
Esenciales
A. spinosa
Constitución NA
segunda 18,89 1,56 2,20
alta tercera 11,50 2,37 1,25
A .monantha
Paso Vergara
tercera 10,21 1,66 1,60
NA: No aplica DS: desviación estándar IS: Índice de selectividad activo CE50 <20,0 µg/mL
El uso de aceites esenciales ha sido fundamental en la medicina tradicional, su composición
compleja de compuestos orgánicos, como se describe en la sección 1.3. Es producido en varias
especies vegetales aromáticas con diversos propósitos como defensa, reproducción y dispersión;
actualmente han sido utilizados para actividades como antiparasitario, bactericida, fungicida y
antinflamatoria como se describe en la literatura (Martínez, 2003) (Bakkali et al., 2008) (Oil,
2016).
Leite y colaboradores en el año 2013 (Leite et al., 2013), reportaron la actividad antiparasitaria
in vitro de compuestos eugenol y cariofileno en Leishmania brasilensis. Los autores señalan al
compuesto cariofileno el cual inhibió 100 % al parásito en concentraciones de 100 - 50 µg/mL,
108
además no manifiesta citotoxicidad a concentración de 12 µg/mL. También demostraron que el
compuesto eugenol inhibió el 40 % del parásito y no presentó citotoxicidad a concentración de
50 µg/mL (Leite et al., 2013); otros autores como Santos Sales y colaboradores en el año 2018
(Santos Sales et al., 2018), también describieron la actividad antiparasitaria contra Leishmania,
pero sus resultados fueron obtenidos desde el aceite esencial de Piper tuberculatum Jacq;
revelando la composición principal de aceite: α- pineno (26,54 %), β-pineno (27,74 %),
espatulenol (1,02 %), β-cariofileno (14,38 %), β-ocimene (12,45 %), germacreno D (1,09%),
óxido de cariofileno (2,82 %), limoneno (3,02 %) y mirceno (1,45 %), los autores señalan que
el efecto de la actividad antiparasitaria tiene relación debido a la presencia de compuestos
monoterpenos y sesquiterpenos del aceite esencial (Santos Sales et al., 2018).
En referencia a los valores presentados en la tabla 28, es necesario continuar con las evaluaciones
in vitro de las especies de Azorella con potencial antiparasitario.
3.5.6 Actividad antiplasmodial de extractos y aceites esenciales de especies de Azorella.
En referencia a los aceites de A. spinosa y A. monantha se muestran valores promisorios, su
valor promedio de CE50 es 10,00 µg/mL (tabla 29).
Sedaghat y colaboradores en el año 2011 (Sedaghat et al., 2011), determinaron que el LC50 y
LC90 del aceite esencial del hinojo (F. vulgare Mill.) fue el más tóxico en larvas de Aedes
aegypti, esta actividad atribuida a la presencia de los compuestos mayoritarios de p-anisaldehído
y (+, -) – fenchone. Además, Choi en 2006 (Choi et al., 2006) reportó la presencia de
monoterpenos α-pineno y β-pineno siendo estos compuestos uno de los varios constituyentes
comunes de muchos aceites esenciales de la familia Apiaceae Evergetis y colaboradores en el
año 2012 (Evergetis, Michaelakis, & Haroutounian, 2012)(Evergetis, Michaelakis, &
Haroutounian, 2012)(Evergetis, Michaelakis, & Haroutounian, 2012) señala que el control
biológico del mosquito mediante aceites esenciales constituye una categoría especial dentro de
109
productos naturales, debido a su amplio alcance de acción sin afectar a los otros animales en el
ecosistema, siendo un gran aporte de sus constituyentes debido que no ha presentado resistencia
(Evergetis et al., 2012).
Tabla 29. Determinación actividad antiplasmodial de Azorella
NA: No aplica DS: desviación estándar IS: Índice de selectividad activo CE50 <20,0 µg/mL
Los extractos metanólicos de todas las especies no tienen actividad antiplasmodial, el extracto
de AcOEt de la especie A. pedunculata tampoco presentó actividad. El extracto EP de A. spinosa
(Piedra del Mono) presentan un valor CE50 10,74 µg/mL y del extracto DCM presenta un valor
de CE50 10,26 µg/mL.
Organismo objetivo : P. Falciparum Actividad
biológica Especie Solvente Recolección CE50 DS IS
Extractos
orgánicos
A. spinosa
Enladrillado
EP
NA
47,68 6,02 0,35 moderada
DCM 11,35 0,78 2,51 alta
A. pedunculata
Cañar
EP 19,66 1,22 0,89
alta DCM 20,1 1,6 0,84
MeOH 49,1 6,0 0,52 moderada
A. pedunculata
Chimborazo
EP 14,0 0,65 1,2
alta DCM 20,2 1,93 0,95
MeOH 49,1 6,1 0,52 moderada
A. pedunculata
Azuay
EP 20,6 3,1 0,9
alta DCM 21,40 3,08 0,60
A. spinosa
Piedra Mono
EP 10,74 0,58 1,7
alta DCM 10,26 0,00 10,3
MeOH 28,39 5,58 1,48 moderada
Aceites
Esenciales
A. spinosa
Constitución
NA
segunda
10,26 0,00 4,16
alta
tercera 10,00 0,00 1,43
A. monantha
Paso Vergara
tercera
10,00 0,00 1,63
110
3.5.7 Quorum sensing (QS) de extractos de especies de Azorella.
Las especies de Azorella fueron evaluados como candidatos para la actividad antibacteriana de
QS (mecanismo de comunicación de bacterias tanto Gram positivas y Gram negativas para
regularizar su comportamiento) (figura 41) (Gallego et al., 2016).
Figura 41. Microplaca 96 pocillos con extractos de Azorella para ensayo QS
El porcentaje de inhibición QS en los diferentes extractos de Azorella son los siguientes: extracto
AcOEt de A. pedunculata, porcentaje de inhibición en este ensayo fue el más alto % Inh 33,68;
a continuación el extracto metanólico de A. spinosa (Vilches Alto), % Inh 15,37; finalmente el
extracto de EP de la especie A. pedunculata (Azuay) % Inh 8,92.
Actualmente se conoce la forma de comunicación molecular entre bacterias Gram positivas y
Gram negativas, mediante la síntesis de moléculas llamadas autoinductores, uno de ellos es la
Acil homoserina lactona (AHL) utilizado por bacterias Gram negativas (Gallego et al., 2016),
desde el punto de vista clínico esta comunicación molecular, se ha tornado preocupante por
formación de biopelículas, situación que origina la resistencia de bacterias frente a antibióticos,
debido a ello varios son los grupos trabajan en la búsqueda de nuevos compuestos químicos o
naturales que inhiban el QS (Gallego et al., 2016) .
111
Los resultados obtenidos en la investigación no se observó la coloración de violaceína
característica de la bacteria Gram negativa Chromobacterium violaceum, el porcentaje de
inhibición descrito anteriormente es significativo en relación a los pocos resultados de este
ensayo con plantas medicinales, sin embargo, existe datos de Al-Haidari y colaboradores en el
año 2016 (Al-Haidari et al., 2016), quienes realizaron detección de QS con extractos alcohólicos
de plantas medicinales procedentes de varias familias: Citrus sinensis, Laurus nobilis, Elettaria
cardamomum, Allium cepa y (cilantro) C. sativum L., esta última pertenece a la familia
Apiaceae; todas estas especies exhibieron un efecto atenuador frente a QS; en comparación con
las especies del género Azorella, la especie A. pedunculata mostró un efecto biocida en todos
los extractos.
Este resultado contribuye al estudio de nuevos compuestos químicos para ser utilizados en
ensayos de QS.
3.5.8 Actividad hipoglicemiante de extractos y compuestos de especies de Azorella.
Este ensayo fue modificado por que la mayor parte de los extractos no eran solubles en los
agentes solubilizantes utilizados (figura 42), por ello, se incorporó en el protocolo sustratos
hidrofóbicos en micelas de Pluronic F127.
Figura 42. a. extracto con DCM (insoluble) b. extracto con Pluronic F127 (solución lechosa) c. extracto
soluble y transparente
a b c
112
Tabla 30. Determinación actividad hipoglucemiante de Azorella
NA: No aplica
Los extractos que presentaron mejores resultados en los ensayos de ensayo de control de insulina
y ensayo de captación de glucosa fueron los extractos de DCM de las especies de A. pedunculata
y A. spinosa, las otras muestras no demostraron ninguna actividad.
En el ensayo de control de insulina cuyo valor de control fue 20,5 %; los extractos de DCM de
A. pedunculata y A. spinosa a concentración de 100 µg/mL obtuvieron los siguientes valores
respectivamente 18,1 % y 20,4 %.
En el ensayo de captación de glucosa, cuyo valor del control fue 68,1 %; los extractos de DCM
de A. pedunculata y A. spinosa a concentración de 100 µg/mL obtuvieron los siguientes valores
respectivamente 84 % y 65,6 %.
Especie Compuesto Lugar Solvente Masa
Mg Codificación
Ecuador
Azuay DCM 10,9 2
MeOH 5,9 3
Chimborazo
EP 7 4
DCM 6 5
MeOH 5,2 6
Cañar
EP 6 7
DCM 7,1 8
AcOEt 6,6 8,1
MeOH 5,6 8,2
A. spinosa
3-hidroxi-2-(3,4,5-
trihidroxifenil)-4H-
cromen-4-ona
Chile
Enladrillado
EP 7 9
DCM 6,2 10
MeOH 8,7 11
NA 8 flv
6-hidroxy-7-metoxi-
2H-1-benzopyran-2-
ona
Piedra
Mono
EP 8,5 10,2
DCM 6,5 10,1
MeOH 7,1 10,3
NA 5 18-20
113
Los otros extractos de las especies de Azorella no mencionados en este ensayo no obtuvieron
resultados significativos, el compuesto 6-hidroxi-7-metoxi-2H-1-benzopirano-2-ona no obtuvo
resultados satisfactorios para este ensayo.
Granados y colaboradores en el año 2015 (Granados et al., 2015) demostraron la estimulación
in vivo de la captación de glucosa en células C2C12 por parte del compuesto 5,7,4'-trihidroxi-
3',5'-dimetoxiflavanona, actividad que fue dependiente de la concentración. En comparación con
el compuesto 5 ‹3-hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona› que no obtuvo resultado
positivo en el ensayo, debido las diferencias estructurales presentes en sus anillos que son la
sustitución en el anillo A (C7 y C5 del grupo hidroxilo) y en el anillo B (C4' el grupo hidroxilo
y en C3' y C5' el grupo metoxilo) en la flavanona, además la presencia de la instauración en el
C2 y C3, situación que remarca la diferencia estructural de ambas moléculas, razón por la cual
el compuesto 5 ‹3-hidroxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromen-4-ona› no presentó resultados en
este ensayo.
3.5.9 Actividad nematicida de extractos de especies de Azorella.
Se utilizó Panagrellus redivuvus como organismo modelo para determinar el efecto letal de los
diferentes extractos de la especie Azorella.
El ensayo fue calificado de manera cualitativa con una escala de 0 a 3, correspondiendo 0 =
(control negativo), es decir, hay actividad, los gusanos estaban móviles vigorosamente; la escala
3 = (control positivo) los gusanos aparecieron inmóviles; los pocillos que mostraron actividad
baja- moderada se clasificó como 1 o 2 dependiendo de la evaluación visual subjetiva.
114
Figura 43. a. Microplaca 96 pocillos con extractos de Azorella y b gusanos Panagrellus redivuvus inmóviles e
aglutinados
En la siguiente tabla 31 se observa los resultados del ensayo
Tabla 31. Determinación actividad nematicida
Lugar Especie Código Solvente Masa
mg
Calificación
cualitativa
A. pedunculata
Azuay
1 EP 95 2
Ecuador
2 DCM 100 2
3 MeOH 100 3
A. pedunculata
Chimborazo
4 EP 100 0
5 DCM 90,5 0
6 MeOH 100,9 0
A. pedunculata
Cañar
7 EP 100,1 0
8 MeOH 100,8 3
A. spinosa
Enladrillado
9 EP 100,4 0
Chile 10 DCM 90,5 0
11 MeOH 101,8 0
a b
115
Los extractos con actividad nematicida fueron los extractos de EP, DCM, MeOH de A.
pedunculata (Azuay) además, el extracto MeOH recolectado en Cañar.
Diferentes alternativas en control de plagas que afectan el sector agrícola, por ejemplo, los
nemátodos fitoparásitos que causan pérdidas económicas considerables (Chauzat & Faucon,
2007), últimamente, el uso de compuestos de origen químico para esta patología vegetal se ha
incrementado, siendo perjudiciales tanto para los seres vivos y para el medio ambiente (Aballay
& Insunza, 2002). Una alternativa ecológica y amigable con el ambiente es el uso de
biocontroladores de origen natural, que pueden ser biocidas e interferir el ciclo vital del
nematodo (Caboni et al., 2015).
Varias familias de plantas medicinales han sido evaluadas con el objetivo de verificar su
actividad nematicida como por ejemplo, mayoritariamente especies de las familias Solanaceae
(Nandakumar et al., 2017), Lamiaceae (Wiratno et al., 2009), Asteraceae (Aballay & Insunza,
2002) pero en referencia a la familia Apiaceae solo existe un reporte del perejil (P. crispum
(Mill.) Fuss) (Caboni et al., 2015) y de aceites esenciales de diferentes especies de esta familia
(González et al., 2012) siendo estos los únicos. Otros ensayos han tomado a los hongos como
agentes biocontroladores (Sufiate et al., 2017) y entre otras varias familias han sido reportadas
en la literatura (Al-Marby et al., 2016).
116
4. Conclusiones y Proyecciones de la Tesis
Los resultados obtenidod mediante la apliacacion de métodos de sseparación cromatografica y
elucidación estructural, en A. pedunculata y A. spinosa) además, de la información bibliográfica
obtenida por diferentes grupos de investigación como Laboratorio de Biotecnología de
Productos Naturales de la Universidad del Azuay y Laboratorio de Síntesis Orgánica y actividad
biológica de la Universidad de Talca, en otras especies del mismo género se ratifica la presencia
de compuestos esteroidales, cumarínicos y un flavonoide presentes en el género Azorella.
Los compuestos encontrados en la especie A. pedunculata representan el primer reporte de un
análisis fitoquímico, con ello un aporte quimiotaxonómico a la familia Apiaceae en especial al
género Azorella.
Los ensayo biológicos realizados en esta investigación son un aporte en la evaluación de las
especies de Azorella de Ecuador y Chile, con ello se profundizó el estudio de la especie A.
pedunculata en el aspecto quimio taxonómico encontrándose una fuente promisoria de
compuestos bioactivos en los diferentes extractos y compuestos obtenidos. Además de la
evaluación de la actividad anti: T. cruzi; plasmodial y leishmanicida de las muestras
correspondientes a extractos y aceites de las especies de Azorella.
Los siguientes compuestos fueron aislados e identificados a partir del extracto de diclorometano
de A.pedunculata:
1.Cumarina (7-hidroxi-6-metoxicumarina)
2.Esteroles (β-sitosterol y Stigmasterol)
El compuesto 1 (7-hidroxi-6-metoxicumarina) es un marcador quimi taxonómico de la familia
Apiaceae, compuesto no reportado en la especie A. pedunculata.
El compuesto 2 (β-sitosterol y stigmasterol) son compuestos químicos presente ampliamente en
el reino vegetal, los esteroles identificados en esta investigación, contribuyen al estudio
117
fitoquímico y quimio taxonómico de esta especie, siendo este el primer reporte en
A.pedunculata.
3. La propuesta estructural para el compuesto 3 no ha sido descrito en la especie A. pedunculata,
además que puede ser considerada como fuente esqueletos de diterpenos pero lamentablemente,
la pequeña cantidad aislada no permitió realizar otros ensayos espectroscópicos.
Los compuestos aislados en este trabajo son reportados por primera vez para la especie A.
spinosa.
4. Cumarina (7-hidroxi-6-metoxicumarina)
5. Flavonoide (7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromeno-4-ona)
El compuesto 5 (7-metoxi-2-(3,4,5-trihidroxifenil)-4H-cromeno-4-ona) flavonoide, este
metabolito secundario es un marcador quimio taxonómico de la familia Apiaceae, está
compuesto es el primer reporte de esta especie vegetal, al ser una molécula con presencia de
varios grupos hidroxilo en su estructura puede contribuir a ser una molécula con capacidad
antioxidante.
118
5. Anexos
Anexo 1
Preparación de Reactivos Utilizados durante el desarrollo de esta investigación
10mM DTT
Pesar 154,24 mg de DTT
Aforar en 100 mL
Colocar en el Refrigerador.
SDS PAGE
Running Buffer 1X2 litros
6,04 gramos de tris-base
28,8 gramos de glicina
Añadir 2 litros de agua destilada
Diluir y ajustar pH a 8,3
Añadir 2 gramos de SDS
Dejar solución a
temperatura ambiente
30 % acrilamida /
0,8 % bisacrilamida
Acrilamida es tóxica
Preparación del reactivo en cámara de
extracción, con guantes, mascarilla y
protección de ojos.
30 gramos de acrilamida
0,8 gramos de N-N’- metilen-bisacrilamida
Añadir 100 mL de agua destilada
Filtrar con filtro de cápsula de 0,45 estéril
Proteger de la luz (aluza)
Almacenar a 4°C
Solución de tinción
50 % metanol
10% ácido acético glacial
0,1 % de Comassie brillante blue
R-250
Solución de destinción
40 % metanol
10% ácido acético glacial
Diferencia enrasar con agua destilada hasta
100 mL
119
Reactivo de Bradford
20 mg azul de Coomassie
10 mL etanol
20 mL ácido orto-fosfórico
Agua destilada hasta 200 mL
Agitar bien
Filtrar guardar 4 °C
Proteger de la luz
Preparación de BSA
10 mg
Añadir en 10 mL agua destilada
concentración (1 mg/mL)
120
Anexo 2
Espectro de RMN 1H (300MHz, CDCl3) compuesto 1
Anexo 3
Espectro COSY (300MHz, CDCl3) compuesto 1
H3 H5 H8
H4
H2
H5
H8
H3
121
Anexo 4
Espectro RMN 13C (300MHz, CDCl3) compuesto 1
Anexo 5
Espectro RMN DEPT 135 (300MHz, CDCl3) compuesto 1
122
Anexo 6
Espectro RMN HSQC (300MHz, CDCl3) compuesto 1
Anexo 7
Espectro RMN HMBC (300MHz, CDCl3) compuesto 1
123
Anexo 8
Espectro de RMN 1H (300MHz, CDCl3) compuesto 2 (compuesto a - compuesto b)
Anexo 9
Espectro de RMN 13C (300MHz, CDCl3) compuesto 2 (compuesto a - compuesto b)
124
Anexo 10
Espectro de RMN 1H (300MHz, CDCl3) compuesto 3
Anexo 11
Espectro COSY (300MHz, CDCl3) compuesto 3
125
Anexo 12
Espectro de RMN 13C (300MHz, CDCl3) compuesto 3
Anexo 13
Espectro de RMN DEPT (300MHz, CDCl3) compuesto 3
126
Anexo 14
Espectro de RMN HSQC (300MHz, CDCl3) compuesto 3
Anexo 15
Espectro de RMN HMBC (300MHz, CDCl3) compuesto 3
127
Anexo 16
Espectro de RMN 1H (300MHz, MeOD) compuesto 4
Anexo 17
Espectro de RMN 13C (300MHz, MeOD) compuesto 4
H5
H3 H4
C2 C10 C7 C4 C3 C5 C8 C11
128
Anexo 18
Espectro de RMN 1H (300MHz, Acetona D) compuesto 5
Anexo 19
Espectro de RMN 13C (300MHz, AcetonaD) compuesto 5
129
Anexo 20
Espectro de RMN HSQC (300MHz, AcetonaD) compuesto 5
Anexo 21
Espectro de RMN HMQC (300MHz, AcetonaD) compuesto 5
130
Anexo 22
Espectro de RMN HMQC (300MHz, AcetonaD) compuesto 5
131
Anexo 23
Extracción de proteína de Azorella
Anexo 24
Cuantificación de proteína - método de Bradford
132
6. Referencias bibliográficas
1. Abad, D. (2015). Caracterización fitoquímica y actividad biológica de especies del género
Azorella, presentes en la sierra sur ecuatoriana. Universidad del Azuay.
2. Aballay, E., & Insunza, V. (2002). Evaluación de plantas con propiedades nematicidas en el
control de Xiphinema index en vid de mesa Thompson seedless en la zona central de Chile.
Agricultura Técnica (Chile), 63(3), 357 - 365.
3. Abraham, D. J. (1998). Burger’s Medicinal Chemistry, Drug Discovery. (Wiley Ed) (7 th
ed).
4. Adams, R. (2007). Identification of essential oil components by gas Chromatography/ Mass
Spectroscopy. (Allured Pub Corp, Ed.) (4th ed).
5.Al-Haidari A, R., Shaaban, I. M., Ibrahim, S. R. M., & Mohamed Gamal A. (2016). Anti-
Quorum sensing activity of some medicinal plants. African Journal Traditional
Complementary and Alternative Medicines, 13(5), 67 - 71.
6. Al-Marby, A., Ejike, C. E., Nasim, M. J., Awadh-Ali, N. A., Al-Badani, R. A., Alghamdi,
G. M., & Jacob, C. (2016). Nematicidal and antimicrobial activities of methanol extracts of 17
plants, of importance in ethnopharmacology, obtained from the Arabian Peninsula. Journal of
Intercultural Ethnopharmacology, 5(2), 114 - 21.
7. Amri, E. (2014). The role of selected plant families with dietary ethnomedicinal species
used as anticancer. Journal of Medicinal Plants Studies, 2(1), 28 – 39.
8. Andersson, L., Kocsis, M., & Eriksson, R. (2006). Relationships of the genus Azorella
(Apiaceae) and other hydrocotyloids inferred from sequence variation in three plastid markers.
Taxon, 55(2), 270 - 280.
9. Andrés, M. F., González-Coloma, A., Sanz, J., Burillo, J., & Sainz, P. (2012). Nematicidal
activity of essential oils: A review. Phytochemistry Reviews, 11(4), 371 - 390.
10. Angioni, A., Barra, A., Coroneo, V., Dessi, S., & Cabras, P. (2006). Chemical
composition, seasonal variability, and antifungal lactivity of Lavandula stoechas L. ssp.
stoechas essential oils from stem/leaves and flowers. Agric. Food Chem, (54), 4364 - 4370.
11. Araya, J. E., Neira, I., Da Silva, S., Mortara, R. A., Manque, P., Cordero, E., … González,
J. (2003). Diterpenoids from Azorella compacta (Umbelliferae) active on Trypanosoma cruzi.
Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 98(3), 413 - 418.
Area de Botánica, Departament de Biología, U. de L. I. B. (2014). Umbelliferae (Apiaceae).
Retrieved from http://herbarivirtual.uib.es/cas-uv/familia/1948.html
12. Ashoub, A., Berberich, T., Beckhaus, T., & Brüggemann, W. (2011). A competent
extraction method of plant proteins for 2-D gel electrophoresis. Electrophoresis, 32(21), 2975–
2978.
13. Atti-Santos, A. C., Rossato, M., Pauletti, G. F., Rota, L. D., Rech, J. C., Pansera, M. R., …
Moyna, P. (2005). Physico-chemical evaluation of Rosmarinus officinalis L. Essential oils.
Brazilian Archives of Biology and Technology, 48(6), 1035–1039.
14. Azeredo, C. M. O., Santos, T. G., Maia, B. H. L. de N. S., & Soares, M. J. (2014). In vitro
biological evaluation of eight different essential oils against Trypanosoma cruzi, with emphasis
on Cinnamomum verum essential oil. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14(1), 1
- 8.
15. Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., & Idaomar, M. (2008). Biological effects of
essential oils - A review. Food and Chemical Toxicology, 46(2), 446–475.
16. Barchan, A., Bakkali, M., Arakrak, A., Pagán, R., & Laglaoui, A. (2014). The effects of
solvents polarity on the phenolic contents and antioxidant activity of three Mentha species
extracts. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 3(11), 399–412
Barchan, A. et al., 2014. The effects of so.
133
17. Barrano, C. de F., Poma, I., & Spadaro, V. (2016). Evaluación etnobotanica de la Yareta (
Azorella compacta ) en Arequipa ( Perú ) y sus posibles aplicaciones. Quad. Bot. Amb. Appl.,
23(2012), 15 - 30.
18. Bhutta, Z. A., Sommerfeld, J., Lassi, Z. S., Salam, R. A., & Das, J. K. (2014). Global
burden, distribution, and interventions for infectious diseases of poverty. Infectious Diseases of
Poverty, 3(1), 21.
19. Biodiversidad, S. de I. (2017). Azorella monantha. Retrieved June 7, 2017, from
https://www.sib.gov.ar/#!/especie/azorella-monantha
20. Blakeskey, R. W. ., & Boezi, J. A. (1977). A new technique for protein precipitacion
methods for sample preparation prior to proteomic analysis. Analytical Biochemistry, 2(82),
580–582.
21. Bórquez, J., Ardiles, A., Loyola, L., Peña-Rodriguez, L. M., Molina-Salinas, G. M.,
Vallejos, J., … Simirgiotis, M. J. (2014). Further mulinane and azorellane diterpenoids isolated
from mulinum crassifolium and Azorella compacta. Molecules, 19(4), 3898–3908.
22. Bourne, R. R. A., Stevens, G. A., White, R. A., Smith, J. L., Flaxman, S. R., Price, H., …
Taylor, H. R. (2013). Causes of vision loss worldwide, 1990-2010: A systematic analysis. The
Lancet Global Health, 1(6), 339–349.
23. Brand-Williams, Cuvelier, M. E., & Berset, C. (1995). Use of a free radical method to
evaluate antioxidant activity. Food Sci. Technol., 28, 25–30.
24. Burt, S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in
foods—a review. International Journal of Food Microbiology, 94(3), 223–253.
Butler, M. S. (1991). Natural products to drugs: natural product derived compounds in
clinical trials.
25. Caboni, P., Saba, M., Oplos, C., Aissani, N., Maxia, A., Menkissoglu-Spiroudi, U., …
Ntalli, N. (2015). Nematicidal activity of furanocoumarins from parsley against Meloidogyne
spp. Pest Management Science, 71(8), 1099–1105.
26. Calviño, C. I., Fernández, M., & Martínez, S. G. (2016). Las especies de Azorella
(Azorelloideae, Apiaceae) con distribución extra-Argentina. Darwiniana, 4(1), 57–82.
27. Cedeño, J., & Donoso, M. C. (2010). Atlas Pluviométrico del Ecuador. Año 2010.
Documento Técnico Número 21: Retrieved from
http://unesdoc.unesco.org/images/0021/002163/216357s.pdf
28. Chatatikun, M., & Chiabchalard, A. (2013). Phytochemical screening and free radical
scavenging activities of orange baby carrot and carrot (Daucus carota Linn.) root crude
extracts. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 5(4), 97–102.
29. Chauzat, M., & Faucon, J. (2007). Nematicidal activity of anion transportblockers against
Meloidogyne incognita, Caenorhabditis elegans and Heterorhabditisbacteriophora. Pest
Management Science, 1106(December 2006), 1100–1106.
30. Choi, W. S., Park, B. S., Lee, Y. H., Jang, D. Y., Yoon, H. Y., & Lee, S. E. (2006).
Fumigant toxicities of essential oils and monoterpenes against Lycoriella mali adults. Crop
Protection, 25(4), 398–401.
31. Choudhury, M., McCleary, R. J. R., Kesherwani, M., Kini, R. M., & Velmurugan, D.
(2017). Comparison of proteomic profiles of the venoms of two of the ‘Big Four’ snakes of
India, the Indian cobra (Naja naja) and the common krait (Bungarus caeruleus), and analyses
of their toxins. Toxicon, 135(1), 33–42.
32. Christensen, L. P., & Brandt, K. (2006). Bioactive polyacetylenes in food plants of the
Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 41(3), 683–693.
134
33. Darmawan, A., Kosela, S., Kardono, L. B. S., & Syah, Y. M. (2012). Scopoletin, a
coumarin derivative compound isolated from Macaranga gigantifolia Merr. Journal of Applied
Pharmaceutical Science, 2(12), 175–177.
34. de la Torre, L., Navarrete, H., Muriel, P., Marcia, M., & Balslev, H. (2008). Enciclopedia
de plantas utiles del Ecuador. Herbario QCA de la Escuela de Ciencias Biológicas de la
Pontífica Universidad Católica del Ecuador & Herbario AAU del Departameto de Ciencias
Biológicas de la Universidad de Aarhus. Quito & Aarhus. (Vol. 1).
35. Delporte, C., Backhouse, N., Salinas, P., San-Martín, A., Bórquez, J., & Loyola, L. (2003).
Pharmaco-toxicological study of diterpenoids. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 11(7),
1187–1190.
36. dos Santos Sales, V., Monteiro, Á. B., Delmondes, G. de A., do Nascimento, E. P.,
Sobreira Dantas Nóbrega de Figuêiredo, F. R., Rodrigues, C. K. de S., … Kerntopf, M. R.
(2018). Antiparasitic activity and essential oil chemical analysis of the piper Tuberculatum
Jacq fruit. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 17(1), 268–275.
37. El Mostrador. (2017, January 19). OMS: Chile es el país con más sobrepeso de
Latinoamérica. El Mostrador. Santiago. Retrieved from
http://www.elmostrador.cl/noticias/pais/2017/01/19/oms-chile-es-el-pais-con-mas-sobrepeso-
de-latinoamerica/
38. Ellie Crystal. (1995). Ancient Egyptian Medicine. Retrieved June 8, 2017, from
http://www.crystalinks.com/egyptmedicine.html
39. Encyclopædia Britannica, inc. (2017). List of plants in the family Apiaceae. Retrieved
June 6, 2017, from https://www.britannica.com/topic/list-of-plants-in-the-family-Apiaceae-
2038061
40. Evergetis, E., Michaelakis, A., & Haroutounian, S. A. . (2012). Essential oils of
Umbelliferae (Apiaceae) family Taxa as emerging potent agents for mosquito control. In I. O.
A. Publisher (Ed.).
41. Ferandez Acero, F. J. (2006). Aplicacion de la proteómica a la caracterización de
patogenicidad en Botrytis cinerea. Utilización y evaluación de nuevos fungicidas. Universidad
de Cádiz.
42. Filiptsova, O. V., Gazzavi-Rogozina, L. V., Timoshyna, I. A., Naboka, O. I., Dyomina, Y.
V., & Ochkur, A. V. (2017). The effect of the essential oils of lavender and rosemary on the
human short-term memory. Alexandria Journal of Medicine, 4(2), 110–111.
43. Fuentes, N. L., Sagua, H., Morales, G., Borquez, J., San Martin, A., Soto, J., & Loyola, L.
A. (2005). Experimental antihyperglycemic effect of diterpenoids of llareta Azorella compacta
(Umbelliferae) phil in rats. Phytotherapy Research, 19(8), 713–716.
44. Furnari, G., Guglielmo, A., Longhitano, N., Pavone, P., Salmeri, C., & Scelsi, F. (2017).
Tabla de Botánica Sistemática. Retrieved June 7, 2017, from
http://www.dipbot.unict.it/sistematica_es/Index.html
45. Gallego, A., Giordano, W., Rosero, E., & Echeverri, F. (2016). Effect of furans and pyran
on several quorum sensing factors in Ralstonia solanacearum. Journal of Microbial &
Biochemical Technology, 8(6), 1–5.
46. Garden, S. A. (2017). The AGS online Plant Encyclopedia. Retrieved July 1, 2017, from
http://www.alpinegardensociety.net/
47. Gechev, T. S., Hille, J., Woerdenbag, H. J., Benina, M., Mehterov, N., Toneva, V., …
Mueller-Roeber, B. (2014). Natural products from resurrection plants: Potential for medical
applications. Biotechnology Advances, 32(6), 1091–1101.
48. Gerhard, C. B. B. (2010). Hand book Essential Oil: Science, technology and Applications.
Taylor and Francis Group LLC.
135
49. Girotti, M. R. (2010). Analisis proteómico de los mecanismo moleculares de progresión
tumoral relacionados con la proteina Sparc. Universidad de Buenos Aires. Retrieved from
http://digital.bl.fcen.uba.ar/
50. Global Biodiversity Information Facility. (2017a). Apiaceae.
Global Biodiversity Information Facility. (2017b). Azorella Lam. Retrieved June 6, 2017, from
Global Biodiversity Information Facility. (2017c). Azorella monantha Clos. Retrieved June 7,
2017, from https://www.gbif.org/species/3631212
Global Biodiversity Information Facility. (2017d). Azorella pedunculata (Spreng.) Mathias &
Constance. Retrieved June 7, 2017, from https://www.gbif.org/species/7508025
Global Biodiversity Information Facility. (2017e). Azorella spinosa Pers.
51. Granados, S., Balcázar, N., Guillén, A., & Echeverri, F. (2015). Evaluation of the
hypoglycemic effects of flavonoids and extracts from Jatropha gossypifolia L. Molecules,
20(4), 6181–6193.
52. Gros, E., Pomilio, A., Seldes, A., & Burton, G. (1985). Introduccion al estudio de los
Productos Naturales. (OEA, Ed.). USA.
53. Hernandez, J., Estandes, C., Faundez, L. & Herreros, J. (2014). Biodiversidad Terrestre de
la Region de Arica y Patagonia. (1th ed). Santiago.
54. Heywood, H. V. (1983). Las plantas con flores. Barcelona: Reverte.
Hill F. Albert. (1965). Botanica Económica. Plantas utiles y productos vegetales. (Omega,
Ed.).
55. Jacobs, D. I., Gaspari, M., van der Greef, J., van der Heijden, R., & Verpoorte, R. (2005).
Proteome analysis of the medicinal plant Catharanthus roseus. Planta, 221(5), 690–704.
56. Jacobs, D. I., Heijden, R. V. D., & Verpoorte, R. (2000). Proteomics in plant
biotechnology and secondary metabolism research. Phytochem. Anal., 287(June), 277–287.
57. Jara-Bermeo, A., Peñailillo, P., San-Martín, A., Malagon, O., Gilardoni, G., & Gutiérrez,
M. (2016). Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from Azorella
spinosa (Apiaceae) against wild phytopathogenic bacteria. Journal of the Chilean Chemical
Society, 61(4).
58. Jorrín, J. V., Rubiales, D., Dumas-Gaudot, E., Recorbet, G., Maldonado, A., Castillejo, M.
A., & Curto, M. (2006). Proteomics: A promising approach to study biotic interaction in
legumes. A review. Euphytica, 147(1–2), 37–47.
59. L Graf, B. ;, Rojas- Silva, P., & Bañdeon, M. (2016). Discovering the Pharmacological
Potential of Ecuadorian Market Plants using a Screens-to-nature Participatory Approach.
Journal of Biodiversity, Bioprospecting and Development, 03(01), 1–9.
Labome.com. (2017). Protein Quantitation.
60. Lariushin, B. (2012). Apiaceae Family: Volume 2. USA.
61. Leite, N. F., Sobral-Souza, C. E., Albuquerque, R. S., Brito, D. I. V, Lavor, A. K. L. S.,
Alencar, L. B. B., … Coutinho, H. D. M. (2013). Actividad antiparasitaria in vitro e citotóxica
de cariofileno e eugenol contra Trypanosoma cruzi e Leishmania brasiliensis. Revista Cubana
de Plantas Medicinales, 18(4), 522–528.
62. Londoño, F., Cardona, W., Alzate, F., Cardona, F., Vélez, I. D., Upegui, Y., … Robledo, S.
M. (2016). Antiprotozoal activity and cytotoxicity of extracts from Solanum arboreum and S .
ovalifolium ( Solanaceae ), 10(8), 100–107.
63. Lopez, S., Lima, B., Agüero, M. B., Lopez, M. L., Hadad, M., Zygadlo, J., … Tapia, A.
(2014). Chemical composition, antibacterial and repellent activities of Azorella trifurcata,
Senecio pogonias, and Senecio oreophyton essential oils. Arabian Journal of Chemistry.
64. Lorente, J. (2001). Introducción a la biogeografia en latinoamérica: Teorías, conceptos,
métodos y aplicaciones. (J. L. Bousquets & J. J. Morrone, Eds.) (primera). México.
136
65. Loyola, L. ;, Bórquez, J., Morales, G., San-Martín, A., Darias, J., Flores, N., & Giménez,
A. (2004). Mulinane-type diterpenoids from Azorella compacta display antiplasmodial
activity. Phytochemistry, 65(13), 1931–1935.
66. Loyola, L. A., Bórquez, J., Morales, G., & San Martín, A. (1997). Diterpenoids from
Azorella compacta. Phytochemistry, 44(4), 649–651.
66. Loyola, L., Bórquez, J., Morales, G., Araya, J., González, J., Neira, I., … San-Martín, A.
(2001). Diterpenoids from Azorella yareta and their trichomonicidal activities. Phytochemistry,
56(2), 177–180.
67. Loyola, L., Borquez, J., Morales, G., & Aurelio., S. M. (1998). 11,12-epoxy-mulin-13-en-
20-oic acid a diterpenoid from Azorella Compacta. Phytochemistry, 49(4), 1093–1093.
68. Loyola, L., Bórquez, J., Morales, G., & San-Martín, A. (1997). Mulinol, a diterpenoid from
Azorella compacta. Phytochemistry, 45(7), 1465–1467. Luhata, L. P., & Munkombwe, N. M.
(2015). Isolation and characterisation of stigmasterol and Β -sitosterol from Odontonema
Strictum (Acanthaceae). Journal of Innovations in Pharmaceuticals and Biological Sciences,
2(1), 88–95.
69. Lv, J., Lu, Y., Niu, Y., Whent, M., Ramadan, M. F., Costa, J., & Yu, L. (2013). Effect of
genotype, environment, and their interaction on phytochemical compositions and antioxidant
properties of soft winter wheat flour. Food Chemistry, 138(1), 454–462.
70. Martínez, A. (2003). Aceites Esenciales. Medellín.
71. Martinez Crovetto, R. (1981). Las plantas utilizadas en medicina popular en el noreste de
Corrientes. (1era Misce). Tucuman: Fundacion Miguel Lillo.
72. Mathers, C. D., & Loncar, D. (2006). Projections of global mortality and burden of disease
from 2002 to 2030. PLoS Medicine, 3(11), 2011–2030.
73. Matos, M. J., Santana, L., Uriarte, E., Abreu, O. A., Molina, E., & Yordi, E. G. (2015).
Coumarins - An important class of phytochemicals. Phytochemicals - Isolation,
Characterisation and Role in Human Health, (September).
74. Méndez, E. (2011). Clos ( Apiaceae ) en los altos Andes Centrales de in the high Central
Andes of Mendoza , Argentina, (5500), 219–229.
75. Missouri Botanical Garden Research. (2017). Azorella pedunculata (Spreng.) Mathias &
Constance; Apiaceae. Retrieved June 7, 2017, from
http://www.mobot.org/mobot/ParamoCajas/results.aspx?taxname=Azorella pedunculata
76. Molina - Salinas, G. M., Borquez, J., Said-Fernández, S., Loyola, L., Yam-Puc, A.,
Becerril-Montes, P., … Peña-Rodríguez, L. M. (2010). Antituberculosis activity of alkylated
mulinane diterpenoids. Fitoterapia, 81(3), 219–222.
77. Molyneux, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH)
for estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal of Science and Technology,
26(December 2003), 211–219. http://doi.org/10.1287/isre.6.2.144
78. Muñoz, O., Wilkomirsky, T., & Montes, M. (2001). Plantas medicinales de uso en Chile:
quimica y farmacologia. Universitaria Santiago de Chile.
79. Nandakumar, A., Vaganan, M. M., & Sundararaju, P. (2017). Phytochemical Analysis and
nematicidal activity of ethanolic leaf extracts of Datura metel , Datura innoxia and
Brugmansia suaveolens against Meloidogyne incognita. Biocatalysis and Agricultural
Biotechnology, 2(4), 1–11.
80. Newman, D. J., Cragg, G. M., & Snader, K. M. (2003). Natural products as sources of new
drugs over the period 1981-2002. Journal of Natural Products, 66(7), 1022–1037.
Niemeyer M. Hermann;, & Teillier, S. (2007). Aromas de la flora nativa de Chile. Santiago.
81. Nikkhah, M., Hashemi, M., Habibi Najafi, M. B., & Farhoosh, R. (2017). Synergistic
effects of some essential oils against fungal spoilage on pear fruit. International Journal of
Food Microbiology.
137
82. Oil, E. B. O. line E. (2016). essential oil. In Encyclopaedia Britannica On line Essential
Oil.
83. Encyclopædia Britannica, inc. Retrieved from https://www.britannica.com/topic/essential-
oil
83. Oils, A. E. (2017). Essential Oils Academy. Retrieved from
http://essentialoilsacademy.com/
84. OMS. (2016). Día Mundial de la Salud 2016: diabetes. Retrieved from
http://www.who.int/campaigns/world-health-day/2016/event/es/
85.OMS. (2017). Obesidad y sobrepeso. Retrieved from
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/es/
86. Organizacion Panamerica de la Salud, O. M. de la S. (2016). Diabetes: perfiles de los
países 2016. Retrieved from http://www.who.int/diabetes/country-profiles/es/
87. Pallas, V. ., Escobar, C. ., Rodríguez Palenzuela, P. ., & Marcos, J. F. (2008).
Herramientas Biotecnológicas en Fitopatología (1st ed.). Madrid: Mundi Prensa Libros S. A.
Retrieved from http://www.mundiprensa.com
88. Panagiotopoulos, C., Riddell, M. C., & Sellers, E. A. C. (2013). Type 2 Diabetes in
children and adolescents. Canadian Journal of Diabetes, 37(SUPPL.1), 357–362.
89. Peñafiel Cevallos, M. (2003). Flora y Vegetación de Cuicocha. Quito Ecuador: ediciones
Abya-Yala.
90. Pulido, S. A., Muñoz, D. L., Restrepo, A. M., Mesa, C. V., Alzate, J. F., Vélez, I. D., &
Robledo, S. M. (2012). Improvement of the green fluorescent protein reporter system in
Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica,
122(1), 36–45.
91. Quesada, L. (2012). Estudio químico y biológico de especies del genéro Azorella. U Talca.
92. Quinde, I. (2001). Historia Del Pueblo Cañari. Revista Yachaikuna.
93.Qureshi, M. I., Qadir, S., & Zolla, L. (2007). Proteomics-based dissection of stress-
responsive pathways in plants. Journal of Plant Physiology, 164(10), 1239–1260.
94. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, Min, A., & Evans, R.-. (1999).
Antioxidant activity applying an improved Abts radical cation decolorization assay. Free
Radical Biology & Medicine, 26(98), 1231–1237.
95. Riveros, R., Morales, G., Loyola, A., & R;, T. (1984). Scopoletin and aromatic acids from
Mulinum crassifolium. Fitoterapia, 55(4), 234–236.
96. Saleh, N. ;, El-Negoumy, S., El-Hadidi, M., & Hosni, H. (1983). Comparative study of the
flavonoids of some local members of the Umbelliferae. Phytochemistry, 22(6), 1417–1420.
97. San-Martin, A., Donoso, V., Leiva, S., Bacho, M., Nunez, S., Gutierrez, M., … Cazar, M.-
E. (2015). Molecular Docking studies of the antitumoral activity and characterization of new
chalcone. Current Topics in Medicinal Chemistry, 15(17), 1743–1749.
98. Santander, R. del P. (2012). Análisis de los componentes químicos y actividad
antibacteriana de los aceites esenciales de dos plantas endémicas: Baccahris Concava y
Haplopappus foliosus. Santiago de Chile.
99. Saran, R., Li, Y., Robinson, B., Ayanian, J., Balkrishnan, R., Bragg-Gresham, J., …
Abbott, K. C. (2015). US Renal Data System 2014 Annual Data Report: Epidemiology of
Kidney Disease in the United States. American Journal of Kidney Diseases, 66(1), Svii.
100. Sarwar, N., Gao, P., Kondapally Seshasai, S. R., Gobin, R., Kaptoge, S., Di Angelantonio,
E., … Wormser, D. (2010). Diabetes mellitus, fasting blood glucose concentration, and risk of
vascular disease: A collaborative meta-analysis of 102 prospective studies. The Lancet,
375(9733), 2215–2222.
101. Sayorwan, W., Ruangrungsi, N., Piriyapunyporn, T., Hongratanaworakit, T.,
Kotchabhakdi, N., & Siripornpanich, V. (2013). Effects of inhaled rosemary oil on subjective
138
feelings and activities of the nervous system. Scientia Pharmaceutica, 81(2), 531–542.
102. Sedaghat, M., Dehkordi, a S., Abai, M., Khanavi, M., Mohtarami, F., Abadi, Y. S., …
Vatandoost, H. (2011). Larvicidal Activity of essential oils of Apiaceae plants against malaria
vector, Anopheles stephensi. Iranian Journal of Arthropod-Borne Diseases, 5(2), 51–9.
103. Sharaf, A. E.-M. M. A., Elhaw Hassan, M., & Abdo, M. I. F. (2011). Phytochemical
analysis of some medicinal plants. Journal of Phytology 2011, 3(12), 10–14.
104. Shelef, L. A. (2003). HERBS | Herbs of the Umbelliferae. Encyclopedia of Food Sciences
and Nutrition (Second Edition), 3090–3098.
105. Silva, S. M., Abe, S. Y., Murakami, F. S., Frensch, G., Marques, F. A., & Nakashima, T.
(2011). Essential oils from different plant parts of Eucalyptus cinerea F. Muell. ex Benth.
(Myrtaceae) as a source of 1,8-Cineole and their bioactivities. Pharmaceuticals, 4(12), 1535–
1550.
106. Simpkin, K. G., & Coles, G. C. (1981). The use of Caenorhabditis elegans for
anthelmintic screening. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 31(1), 66–69.
107. Singleton, V. L. ., & Rossi, J. A., J. (1965). Colorimetry of total phenolics with
phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic., 16, 144–158.
108. Sobottka, A. M., Werner, W., Blaschke, G., Kiefer, W., Nowe, U., Dannhardt, G., …
Scriba, G. K. E. (2000). Effect of Flavonol derivatives on the carrageenin-induced paw edema
in the rat and inhibition of yclooxygenase-1 and 5-Lipoxygenase in Vitro. Archiv Der
Pharmazie, 333(7), 205–210.
109. Sufiate, B. L., de Freitas Soares, F. E., Moreira, S. S., de Souza Gouveia, A., Monteiro, T.
S. A., de Freitas, L. G., & de Queiroz, J. H. (2017). Nematicidal action of Pleurotus eryngii
metabolites. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology.
110. Taborda, N., Acevedo, Li., Patiño, C., Forero, J., & Lopez- Herrera, A. (2007). Artículos
Originales. Rev Col Cienc Pec, 20, 241–249.
111. Trindade, H. (2010). Molecular biology of aromatic plants and spices. A review. Flavour
and Fragrance Journal, 25(January), 272–282.
112. Tůmová, L., Dučaiová, Z., Cheel, J., Vokřál, I., Sepúlveda, B., & Vokurková, D. (2017).
Azorella compacta infusion activates human immune cells and scavenges free radicals in vitro.
Pharmacogn Magazine, 13(50), 260–264. h
113. Villagrán, C., Romo, M., & Castro, V. (2003). Etnobotánica Del Sur De Los Andes De La
Primera Región De Chile: Un Enlace Entre Las Culturas Altiplánicas Y Las De Quebradas
Altas Del Loa Superior. Chungará (Arica), 351. Villa(1), 73–124.
114. Wächter, G. A., Franzblau, S. G., Montenegro, G., Suarez, E., Fortunato, R. H., Saavedra,
E., & Timmermann, B. N. (1998). A new antitubercular mulinane diterpenoid from Azorella
madreporica Clos. Journal of Natural Products, 61(7), 965–968.
115. Wachter, G. A., Matooq, G., Hoffmann, J. J., Maiese, W. M., Singh, M. P., Montenegro,
G., & Timmennann, B. N. (1999). Antibacterial diterpenoid acids from Azorella compacta.
Journal of Natural Products, 62(9), 1319–1321.
116. Wickens, G. E. (1995). Llareta (Azorella compacta, Umbelliferae): A review. Economic
Botany, 49(2), 207–212.
117. Wiratno, Taniwiryono, D., Berg, H. Van den, Riksen, J. A. G., Rietjens, I. M. C. M.,
Djiwanti, S. R., … Murk, A. J. (2009). Nematicidal activity of plant extracts against the Root-
Knot nematode, Meloidogyne incognita. The Open Natural Products Journal, 2(1), 77–85.
118. Ying, L., Ying, D., Liu-juan, Z., & Xian-jin, L. (2015). Antioxidant activities of nine
selected culinary spices from China. Journal of Northeast Agricultural University (English
Edition), 22(1), 50–57.
119. Young Living Essential Oils. (2005). Raven essential oil. Retrieved from
https://www.youngliving.com/en_US/products/home
139
Zech, J. C. (1999). Flavonoid distribution of Mulinum (Apiaceae, Hydrocotyloideae,
Mulineae). Brittonia, 51(4), 415–421.
120. Zhishen, J., Mengcheng, T., & Jianming, W. (1999). The determination of flavonoid
contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry.
121. Zidorn, C., Jöhrer, K., Ganzera, M., Schubert, B., Sigmund, E. M., Mader, J., …
Stuppner, H. (2005). Polyacetylenes from the apiaceae vegetables carrot, celery, fennel,
parsley, and parsnip and their cytotoxic activities. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 53(7), 2518–2523.
122. Zlatano, M., & Ivanov, S. A. . (1995). Untersuchungen uber die Sterinzusammensetzung
der Samenole einiger Vertreter der Familie Apiaceae. Fat Science Technology, 10, 381–383.