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Universidad del Papaloapan
Campus Tuxtepec
División de Estudios de Posgrado
ESTRATEGIAS DE ESTUDIO DE ADN METAGENÓMICO DE SUELOS CULTIVADOS CON
CAÑA DE AZÚCAR EN LA REGIÓN DEL PAPALOAPAN
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA LZ. NOHEMÍ GABRIELA CORTÉS LÓPEZ
ASESOR: DRA. SANDRA TRINIDAD DEL MORAL VENTURA CO-ASESOR: DRA. DOLORES REYES DUARTE
TUXTEPEC, OAXACA. MARZO, 2015
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Éste trabajo se realizó en la Universidad del Papaloapan, campus
Tuxtepec, en el laboratorio de Biología Molecular, bajo la dirección de la Dra.
Sandra T. del Moral Ventura (UNPA) y la co-dirección de la Dra. Dolores Reyes
Duarte (UAM-C), con el financiamiento otorgado por PROMEP y CONACyT
mediante los proyectos PROMEP 2009-02 103.5/11/6149, Ciencia Básica-SEP-
CONACyT 154683 y la beca otorgada por CONACyT con el número 20254.
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DEDICATORIA
A Dios por haberme permitido el tiempo necesario para lograr grandes cosas, por
darme paciencia ante circunstancias difíciles, por darme inteligencia y sabiduría para poder
concluir esta etapa.
A mis padres Gloria López y Fortino Cortés y a mi hermano Alejandro Cortés por sus
consejos, paciencia y apoyo en todo tiempo.
A mi hermanita Getzabel Vera, a mis sobrinos Uriel y Lucia, y a mi vecina Clementina
Antonio por ser la familia que siempre me ha apoyado en todo.
A mis amigos cristianos porque que han sido verdaderos hermanos en la fe, por sus
oraciones, sus consejos, por apoyarme cuando más los he necesitado y por ser de bendición
en mi vida.
A mis asesoras, la Dra. Sandra del Moral por haberme apoyado en todo tiempo, por
transmitirme sus conocimientos y por sembrar en mí el deseo de seguir investigando, y la Dra.
Dolores Reyes por su apoyo durante la estancia en la UAM-C, por sus comentarios y
observaciones para obtener mejores resultados de este trabajo de investigación.
Cuando la sabiduría entrare en tu corazón, y la ciencia fuere grata a tu alma, la
discreción te guardará; te preservará la inteligencia. Proverbios 2:10-11.
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AGRADECIMIENTOS
A la Universidad del Papaloapan por haberme aceptado en el posgrado y permitir que
continuara mi formación profesional.
A los profesores, el Dr. Julián Peña, la Dra. Blanca Barrera y la Dra. Jacqueline Capataz
por haber resuelto mis dudas en el laboratorio y por haber estado al pendiente del avance de
mi investigación.
A las químicas Luz y Lety por su amistad, por apoyarme en todo y por facilitarme el
material requerido para mis experimentos.
A mis revisores, el Dr. Enrique Villalobos, el Dr. Eustacio Ramírez y el Dr. José Abad por
sus comentarios y sugerencias sobre el escrito de esta tesis.
Al MC Bernardo Sachman por la asesoría en el diseño de los oligonucleótidos
degenerados y en el análisis filogenético.
A la MC Bertha López por la asesoría en el análisis de datos en Excel y por sus
comentarios para mejorar la interpretación de datos.
A Carlina Peña y a Ramón Batista por haberme compartido sus conocimientos durante
la estancia en la UAM-C.
A mi amigo y compañero del laboratorio Juan José por haberme ayudado a resolver
varios problemas en las técnicas que se utilizaron en esta investigación y por sus
comentarios.
A mis amigos de la Universidad, Ana, Nancy, Heidy, Jade, Made, Jair, Fernando, Rubén y
Vany por haber compartido conmigo momentos muy lindos en su último año de carrera en la
UNPA.
A mis amigos del posgrado Don Germán, Rafael, Miguel, Ilda y Anselmo por haber
compartido conmigo los inicios de esta etapa.
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A mis amigos del laboratorio Lizeth, Alejandro, Sarahí, Yamil, Oscar, Laura, Adri y Rosa
por permitirme apoyarlos en resolver sus dudas y por su apoyo en todo momento.
A los Productores de Caña de Azúcar por haberme permitido obtener las muestras de
sus cultivos para esta investigación.
A todas las personas que directa o indirectamente hicieron posible que se realizara esta
investigación.
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ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................................... xi
ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................................... xii
ÍNDICE DE ANEXOS ..................................................................................................................... xiii
RESUMEN ................................................................................................................................... xiv
ABSTRACT ................................................................................................................................... xv
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1
CAPÍTULO I. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 3
1.1 EL SUELO ................................................................................................................................... 3
1.2 RIQUEZA MICROBIANA DEL SUELO ........................................................................................... 3
1.3 MÉTODOS DE ESTUDIO DE DIVERSIDAD DEL SUELO ................................................................ 4
1.4 METAGENÓMICA .................................................................................................................... 10
1.5 ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE UNA MUESTRA METAGENÓMICA ................................. 12
1.5.1 Consideraciones para la obtención del material genético .............................................. 12
1.5.2 Metagenómica por secuenciación .................................................................................. 14
1.5.3 Diseño de oligonucleótidos degenerados ........................................................................ 15
1.5.4 Librerías metagenómicas funcionales ............................................................................. 15
1.5.5 Obtención de enzimas mediante estudios metagenómicos ............................................ 16
1.6 LA CUENCA DEL PAPALOAPAN Y SUS SUELOS ........................................................................ 21
2.1 JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 23
2.2 HIPÓTESIS................................................................................................................................ 23
2.3 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................ 23
2.3.1 Objetivos específicos ....................................................................................................... 23
2.4 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL .................................................................................................. 24
CAPÍTULO III. CARACTERÍSTICAS DEL SUELO UTILIZADO EN EL ESTUDIO METAGENÓMICO ............ 25
3.1 LOCALIZACIÓN ........................................................................................................................ 25
3.2 CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LOS SUELOS MUESTREADOS ................................................... 26
3.3 ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DE LOS SUELOS MUESTREADOS ................................................... 26
3.4 COLECTA DE MUESTRAS ......................................................................................................... 27
CAPÍTULO IV.LIBRERÍA METAGENÓMICA EMPAQUETADA EN FAGOS LAMBDA .............................. 28
4.1 METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 28
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4.1.1 Aislamiento y purificación de ADN metagenómico ......................................................... 28
4.1.2 Digestión de ADN metagenómico ................................................................................... 28
4.1.3 Ligación de ADN metagenómico en el vector ZAP Express y transformación ................. 28
4.1.4 Empaquetamiento en fagos lambda () ......................................................................... 30
4.1.5 Evaluación de la eficiencia de la ligación y titulación de la librería metagenómica de
suelos de Oaxaca (LSO) ................................................................................................... 30
4.1.6 Escrutinio para la identificación de actividades enzimáticas .......................................... 30
4.1.7 Purificación de clonas positivos y escisión en células de E. coli XLOLR. .......................... 34
4.1.8 Métodos moleculares para verificar la construcción de la librería metagenómica. ....... 34
4.2 RESULTADOS ........................................................................................................................... 37
4.2.1 Aislamiento y purificación de ADN metagenómico ......................................................... 37
4.2.2 Digestión, clonación y empaquetamiento en fagos ..................................................... 38
4.2.3 Titulación de la librería metagenómica de suelos de Oaxaca (LSO) ............................... 38
4.2.4 Estandarización de la técnica para el escrutinio de actividad celulasa .......................... 39
4.2.5 Escrutinio de actividades enzimáticas: esterasa y celulasa ............................................ 40
4.2.6 Escisión de las clonas positivas ....................................................................................... 43
4.2.7 Evaluación molecular de la librería metagenómica ........................................................ 43
4.3 CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 46
CAPÍTULO V. ESCRUTINIO DE CELULASAS MEDIANTE EL USO DE OLIGONUCLEÓTIDOS
DEGENERADOS .............................................................................................................. 47
5.1 METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 47
5.1.1 Extracción y purificación de ADN metagenómico ........................................................... 47
5.1.2 Amplificación del gen 16S rDNA del ADN metagenómico. .............................................. 48
5.1.3 Purificación de los productos de PCR .............................................................................. 49
5.1.4 Diseño de oligonucleótidos degenerados ........................................................................ 50
5.1.5 Amplificación de genes de celulasas utilizando oligonucleótidos degenerados ............. 51
5.2 RESULTADOS ........................................................................................................................... 53
5.2.1 Purificación y determinación de la calidad del ADN metagenómico .............................. 53
5.2.2 Uso de potenciadores de la PCR. ..................................................................................... 55
5.2.3 Diseño de oligonucleótidos ............................................................................................. 58
5.2.4 Escrutinio por oligonucleótidos degenerados ................................................................. 58
5.3 CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 59
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CAPÍTULO VI. ANÁLISIS DE DIVERSIDAD A PARTIR DEL GEN 16S rDNA ........................................... 60
6.1 METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 60
6.1.1 Cultivos metagenómicos de suelo ................................................................................... 60
6.1.2 Extracción de ADN de cultivos metagenómicos enriquecidos y amplificación del gen 16S
rDNA ................................................................................................................................ 60
6.1.3 Purificación y clonación de los productos de PCR ........................................................... 61
6.1.4 Análisis ARDRA ................................................................................................................ 63
6.1.5 Secuenciación y análisis bioinformático .......................................................................... 64
6.1.6 Análisis filogenético ........................................................................................................ 64
6.2 RESULTADOS ........................................................................................................................... 65
6.2.1 Extracción de ADN de cultivos metagenómicos enriquecidos ......................................... 65
6.2.2 Amplificación, purificación y clonación del gen 16S rDNA de ADN metagenómico de los
cultivos enriquecidos ....................................................................................................... 65
6.2.3 Análisis ARDRA y filogenético ......................................................................................... 66
6.3 CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 71
CONCLUSIONES GENERALES ......................................................................................................... 72
PERSPECTIVAS ............................................................................................................................. 74
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 75
ANEXOS ..................................................................................................................................... 86
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO .......................................................................................................... 86
ANEXO 2. SUSTRATOS ........................................................................................................................ 87
ANEXO 3. SOLUCIONES....................................................................................................................... 88
ANEXO 4. INDICADORES ..................................................................................................................... 89
ANEXO 5. ARTÍCULOS PUBLICADOS ................................................................................................... 90
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Enzimas recuperadas mediante metagenómica en los años 2013 y 2014. .............................. 19
Tabla 2. Muestras colectadas durante la realización de este trabajo. ................................................... 25
Tabla 3. Diagnóstico de fertilidad de los suelos*. .................................................................................. 27
Tabla 4. Primera reacción de ligación. ................................................................................................... 29
Tabla 5. Segunda reacción de ligación. .................................................................................................. 29
Tabla 6. Sustratos para estandarizar la técnica de escrutinio para identificar actividad celulasa. ........ 32
Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados para amplificar ADN de las clonas positivas. ............................... 36
Tabla 8. Reacción de amplificación de ADN utilizando Dream Taq PCR Master Mix (2X). .................... 36
Tabla 9. Reacción de amplificación de ADN utilizando Taq DNA Polymerase recombinant. ................. 36
Tabla 10. Programa de amplificación de los fragmentos de ADN de las clonas positivas. .................... 37
Tabla 11. Características de la librería metagenómica de suelos cultivados con caña de azúcar. ........ 39
Tabla 12. Estandarización de la técnica de escrutinio para identificar actividad celulasa utilizando
enzimas comerciales en distintos sustratos celulósicos. ........................................................ 41
Tabla 13. Oligonucleótidos utilizados para amplificar ADN de los clones positivos. ............................. 48
Tabla 14. Reacción de amplificación de ADN metagenómico utilizando Platinum Taq DNA Polymerase
con diferentes concentraciones de MgCl2 y BSA. ................................................................... 48
Tabla 15. Programa de amplificación de gen 16S rDNA usando como templado ADN metagenómico. 49
Tabla 16. Endoglucanasas de Bacillus subtilis. ....................................................................................... 50
Tabla 17. Oligonucleótidos degenerados. .............................................................................................. 51
Tabla 18. Reacción de amplificación de ADN metagenómico utilizando Taq Platinum Super Mix. ...... 52
Tabla 19. Combinaciones de oligonucleótidos degenerados ................................................................. 52
Tabla 20. Programa de amplificación para los oligonucleótidos degenerados usando como templado
ADN metagenómico purificado. ............................................................................................. 52
Tabla 21. Extracción de ADN metagenómico utilizando diferentes kits. ............................................... 53
Tabla 22. Oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen 16S rDNA. ............................................... 60
Tabla 23. Reacción de amplificación de ADN de los cultivos metagenómicos enriquecidos utilizando
Platinum Taq DNA Polymerase. .............................................................................................. 60
Tabla 24. Programa de amplificación para ADN de cultivos metagenómicos enriquecidos.................. 61
Tabla 25. Oligonucleótidos utilizados para amplificar la región M13. ................................................... 62
Tabla 26. Reacción de amplificación de ADN utilizando Dream Taq PCR Master Mix (2X). .................. 63
Tabla 27. Programa de amplificación de la región M13......................................................................... 63
Tabla 28. Reacciones de digestión de las enzimas EcoRI, HindIII y XbaI. ............................................... 64
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrategias para el estudio metagenómico de muestras ambientales. .................................. 13
Figura 2. Análisis de ADN metagenómico de suelo. ............................................................................... 24
Figura 3. Ubicación y localización geográfica de los suelos muestreados. ............................................ 25
Figura 4. Mapa del vector ZAP Express. ................................................................................................. 29
Figura 5. Sitio de clonación múltiple.. .................................................................................................... 35
Figura 6. Integridad del ADN metagenómico. ........................................................................................ 37
Figura 7. Electroforesis de la digestión de ADN metagenómico con Sau3AI. ........................................ 38
Figura 8. Placas de lisis de células de E. coli XL1-Blue MRF’................................................................... 39
Figura 9. Escrutinio de actividad esterasa en placas de lisis de células de E. coli XL1-Blue MRF’. ........ 40
Figura 10. Escrutinio de actividad celulasa en placas de lisis de células de E. coli XL1-Blue MRF’. ....... 42
Figura 11. Clonas seleccionadas y recuperadas con mayor actividad celulasa. ..................................... 42
Figura 12. Placas de LB-Kanamicina ....................................................................................................... 43
Figura 13. Digestión del plásmido de la muestra 1A .............................................................................. 44
Figura 14. Digestión del plásmido de las muestras 1A, 2A, 4A, 5A Y 7A con las enzimas EcoRI y SalI ... 44
Figura 15. Amplificación de las clonas CelNC2, CelNC5 y CelNC6. ......................................................... 45
Figura 16. Amplificación de la LSO y reamplificación del fragmento del clon CelNC2. ......................... 45
Figura 17. Amplicones in silico obtenidos del programa primers4clades .............................................. 51
Figura 18. Extracción de ADN utilizando diferentes kits ........................................................................ 53
Figura 19. ADN metagenómico purificado con el segundo paso de purificación .................................. 55
Figura 20. Amplificación por PCR del gen 16S rDNA del ADN metagenómico purificado ..................... 55
Figura 21. Mecanismo de incorporación de nucleótidos por las ADN polimerasas. ............................. 57
Figura 22. (17) Oligonucleótidos degenerados que amplifican genes que codifican endoglucanasas. . 58
Figura 23. Sitio de clonación del vector pCR-XL-TOPO........................................................................... 62
Figura 24. Amplificación del gen 16SrDNA ............................................................................................. 65
Figura 25. Digestiones de los productos de PCR de la librería de 16S rDNA utilizando las enzimas de
restricción EcoRI, HindIII y XbaI (ARDRA). ............................................................................ 67
Figura 26. Análisis in silico de las secuencias de la librería de 16S rDNA con enzimas de restricción
EcoRI, Hind III y XbaI . ........................................................................................................... 68
Figura 27. Árbol filogenético de las secuencias de la librería de 16S rDNA. .......................................... 69
Figura 28. Diversidad del gen 16S rDNA. ................................................................................................ 70
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xiii
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO .............................................................................................................. 86
ANEXO 2. SUSTRATOS ............................................................................................................................ 87
ANEXO 3. SOLUCIONES........................................................................................................................... 88
ANEXO 4. INDICADORES ......................................................................................................................... 89
ANEXO 5. ARTÍCULOS PUBLICADOS ....................................................................................................... 90
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xiv
RESUMEN
El suelo es una fuente importante de recursos orgánicos e inorgánicos, los cuales
intervienen en la diversidad de microorganismos, éstos a su vez regulan los ciclos
biogeoquímicos. Existen diferentes técnicas para estudiar la diversidad microbiana del suelo,
desde las tradicionales, que utilizan medios de cultivo para el aislamiento de cepas hasta
aquellas que no requieren del aislamiento, sino que analizan el material genético de una
muestra ambiental. Una de las herramientas más novedosas en este sentido es la
metagenómica, la cual es el análisis genómico de los microorganismos presentes en una
muestra ambiental mediante distintas estrategias moleculares y funcionales no
necesariamente excluyentes. En este trabajo se utilizaron diferentes estrategias para analizar
el ADN metagenómico de suelos de cultivos de caña de azúcar en la región del Papaloapan:
funcional, diseño de oligonucleótidos y secuenciación del gen 16S rDNA. Mediante la
construcción de la librería metagenómica empaquetada en fagos lambda (análisis funcional)
se buscaron genes relacionados con celulasas, sin embargo no se obtuvieron insertos
clonados, pero se logró la estandarización de la técnica de escrutinio para identificar
actividad celulasa y esterasa, además se establecieron medidas de control moleculares para
la construcción de la LSO (Librería metagenómica de suelos de caña de azúcar del estado de
Oaxaca). Así mismo, se propuso una estrategia de aislamiento y purificación del ADN
metagenómico de la región haciendo modificaciones interesantes a los kit comerciales.
También, se determinó que el uso de compuestos como el BSA y el MgCl2 en la PCR
mejoraron la amplificación de los productos de la misma. Por otro lado, a través cultivos
metagenómicos enriquecidos con almidón al 1% y CMC al 1%, se amplificó el gen 16S rDNA.
Mediante esta librería se logró tener la primera aproximación de diversidad en suelos de la
región del Papaloapan, donde se encontraron secuencias relacionadas principalmente con
Clostridium (28.6%), Bacillus (20%), Enterococcus (14.3%), Lysinibacillus (5.7%), Shigella
(2.8%), entre otros.
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xv
ABSTRACT
The soil is an important source of organic and inorganic resources that regulate the
diversity of microorganisms and take part in the adjustment of the biogeochemical cycles.
There are different techniques to study soil microbial diversity, from the traditional
techniques that use culture media to isolation of the strain until the techniques that do not
need isolation but it analyze the genetic material of an environmental sample. In that sense,
one of most innovative tools is the metagenomics that technique involves the genomic
analysis of microorganisms in an environmental sample using both molecular and functional
strategies. In this work different strategies were used to analyze metagenomic DNA of soil
from sugarcane crops in the Papaloapan region: functional, design of oligonucleotides and
sequencing of 16S rDNA. The genes related to cellulase were screened from the construction
of metagenomic packaged library in lambda phage (functional analysis). However, cloned
inserts were not obtained. Nevertheless, the standardization of technique of screening
cellulase and esterase activity were obtained along with the molecular measurement control
settlement to the construction of the LSO (metagenomic library sugarcane soils of Oaxaca).
Besides, a strategy for isolating and purifying of the metagenomic DNA from the region was
proposed making modifications to the commercial kit. Also, the improving of the PCR
amplification products was determined using BSA and MgCl2 compounds. On the other hand,
the 16S rDNA gene was amplified using metagenomic cultures supplemented with 1% starch
and 1% CMC. Finally, with the construction of the metagenomic was possible to have the first
approximation to diversity of soils from the Papaloapan region and found sequences mainly
related to Clostridium (28.6%), Bacillus (20%), Enterococcus (14.3%), Lysinibacillus (5.7%),
Shigella (2.8%), among others.
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1
INTRODUCCIÓN
Los suelos son una fuente inagotable de recursos, los cuales sin duda tienen relación
directa con la diversidad microbiana presente en ellos. En la actualidad existen diferentes
técnicas para evaluar su diversidad, sin embargo los primeros análisis eran de tipo
microbiológico, donde se aislaban cepas mediante el uso de medios de cultivo selectivos y
pruebas bioquímicas. Estas técnicas limitaban el estudio de los organismos cultivables,
además la identificación de las cepas solo era aproximado debido a la poca información
obtenida de las pruebas bioquímicas. Con el advenimiento de la biología molecular, se han
utilizado otras técnicas moleculares para analizar la estructura y diversidad de los suelos.
Algunas de estas técnicas utilizan marcadores moleculares, como el gen 16S rDNA presente
en todas las bacterias. El análisis de este gen se puede llevar a cabo empleando técnicas
como DGGE/TTGE, SSCP, ARDRA, RFLP, RAPD, LH-PCR, RISA, algunas de éstas utilizan la
propiedad de desnaturalización de ADN en cadenas simples usando la temperatura o agentes
caotrópicos, otras analizan la estructura microbiana mediante los patrones de restricción del
gen; sin embargo aunque los estudios son más rápidos y confiables, algunos de sus
inconvenientes radican en la dificultad de discernir entre aquellos fragmentos de tamaño
muy parecido, lo que provoca un sesgo en la información obtenida.
Hace un par de décadas surgió la metagenómica, la cual es una herramienta donde se
aísla el ADN presente en una muestra ambiental. Esta técnica permite estudiar una muestra
desde diferentes perspectivas, ya que se pueden obtener desde genes, metabolitos, enzimas
hasta realizar estudios de dinámica poblacional.
Los suelos de la región del Papaloapan en el estado de Oaxaca son muy fértiles, donde
se cultivan diferentes productos agrícolas como caña de azúcar, plátano, café, piña, coco,
maíz, entre muchos otros. Sin embargo, estos suelos han sido poco analizados desde la
perspectiva microbiológica, existiendo escasa información al respecto. En trabajos previos
realizados en el grupo de trabajo de la Dra. Sandra del Moral, se identificaron en los suelos
de caña de azúcar, por métodos tradicionales, distintas cepas con actividades de importancia
biotecnológica (Montor-Antonio et al., 2014).
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Debido a las características de los suelos del Papaloapan, en este trabajo se decidió
analizar los suelos cultivados con caña de azúcar mediante metagenómica, con la finalidad de
identificar genes relacionados con enzimas de importancia biotecnológica, como celulasas y
esterasas. Además se analizó la diversidad microbiológica de los suelos mediante cultivos
metagenómicos enriquecidos a través del gen 16S rDNA.
En el primer capítulo se describen la importancia microbiana del suelo y los métodos
de estudio para este fin. También se describen los alcances y las limitaciones de la
metagenómica como herramienta de estudio. Posteriormente, se plantean los objetivos y la
estrategia experimental utilizada. Debido a las tres técnicas metagenómicas utilizadas en
este trabajo: librería metagenómica empaquetada en fagos lambda, escrutinio de celulasas
mediante el uso de oligonucleótidos degenerados y análisis de diversidad a partir del gen 16S
rDNA, por cada técnica se incluyó en un capítulo la metodología, los resultados y las
conclusiones. Al final de la tesis se incorporan las conclusiones generales. La última sección
de la tesis (anexos) incluye la preparación de soluciones, medios de cultivo y los artículos
publicados originados de este trabajo de investigación.
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CAPÍTULO I. ANTECEDENTES
1.1 EL SUELO
El suelo es una delgada capa, de pocos centímetros hasta algunos metros de espesor,
de material terroso no consolidado. En ella interactúan elementos de la atmósfera,
hidrósfera, litosfera y biósfera en la cual se realizan intercambios de materiales y energía,
entre lo inerte y lo vivo, produciéndose una enorme complejidad. Además, juega un papel
ambiental como reactor bio-físico-químico que descompone materiales de desecho y recicla
dentro de él nutrientes para la regeneración continua de la vida en la Tierra. El suelo es
considerado un ambiente complejo, en el que se alberga una gran diversidad de genes
microbianos. La complejidad de la diversidad microbiana depende de muchos parámetros
que interactúan, incluyendo el pH del suelo, el contenido de agua, la estructura del suelo, las
variaciones climáticas, la presencia o ausencia de oxígeno, la disponibilidad de nutrientes y la
actividad biótica (Jaramillo et al., 1994; Hillel, 1998; Tarbuck y Lutgens, 2005; Gutiérrez-Lucas
et al., 2014). Los microorganismos son los principales actores en los procesos ecológicos
importantes como la formación de la estructura del suelo, la descomposición de la materia
orgánica y xenobióticos, y el reciclaje de los elementos esenciales (por ejemplo, carbono,
nitrógeno, fósforo y azufre) y nutrientes. De este modo, los microorganismos desempeñan
un papel fundamental en la modulación de los ciclos biogeoquímicos globales e influyen en
todos los niveles de vida en la Tierra (Garbeva et al., 2004).
1.2 RIQUEZA MICROBIANA DEL SUELO
El suelo es un ambiente apropiado para el desarrollo de los microorganismos, tanto
eucariotas como procariotas, virus y bacteriófagos. Estos organismos establecen relaciones
entre ellos en formas muy variadas y complejas. Los microorganismos desempeñan funciones
de gran importancia en relación con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de
elementos como el carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros
metales; fertilidad de las plantas y protección frente a patógenos; y degradación de
compuestos xenobióticos (herbicidas, insecticidas, acaricidas e hidrocarburos). Los suelos
tienen una inmensa diversidad de microorganismos. Las comunidades microbianas son las
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más difíciles de caracterizar, debido a su inmensa diversidad fenotípica y genotípica, además
de las relaciones simbióticas que se establecen en los comensales (Øvreås y Tosrvik, 1998,
2002; Nogales, 2005). La diversidad microbiana en los ecosistemas del suelo excede a la de
los organismos eucariotas. Un gramo de suelo puede albergar hasta 10 mil millones de
microorganismos de miles de especies diferentes. La rizósfera puede contener hasta 1011
células microbianas por gramo de raíz y más de 30,000 especies de procariotas
(Egamberdieva et al., 2008; Mendes et al., 2011). La biosfera está dominada por
microorganismos y contiene alrededor de 4.6 × 1030 células procariotas (Whitman et al.,
1998).
Los microorganismos son una fuente importante de productos y procesos
biotecnológicos. Hasta hace unos cuantos años, estos procesos se basaban en el análisis de
las capacidades metabólicas de los microorganismos que podían ser cultivados en el
laboratorio mediante técnicas microbiológicas tradicionales. Los métodos clásicos de cultivo
sólo permiten recuperar entre el 0.1 y el 10% de los microorganismos que se pueden cultivar
en el laboratorio debido a que se desconocen los requerimientos nutricionales necesarios de
todos los microorganismos, las condiciones fisicoquímicas precisas de su ambiente natural y
la información sobre las relaciones simbióticas, comensales o parasitarias que se mantienen
en una comunidad microbiana, por lo tanto los ecosistemas del suelo son, en gran medida
desconocidos (Rondon et al., 1999; Handelsman et al., 2002; Øvreås y Tosrvik, 2002; Zengler
et al., 2002; Escalante-Lozada et al., 2004; Keller y Zengler, 2004).
1.3 MÉTODOS DE ESTUDIO DE DIVERSIDAD DEL SUELO
Tradicionalmente, los estudios de diversidad microbiana de los suelos se realizaban
mediante el cultivo de microorganismos en placas con medios de cultivo selectivos y conteos
viables. Estos métodos son rápidos, baratos y pueden proporcionar información sobre la
actividad y componentes heterótrofos de la población. Las limitaciones incluyen la dificultad
de aislar bacterias o esporas de las partículas del suelo, selección del medio de cultivo,
condiciones de crecimiento (pH, temperatura, luz), la incapacidad de cultivar un gran número
de especies bacterianas y el potencial de inhibición de colonia-colonia o de propagación de
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colonias. Además, el cultivo en placas favorece que determinados microorganismos tengan
tasas de crecimiento más altas que otros. Todas estas limitaciones pueden influir en la
aparente diversidad de la comunidad microbiana (Trevors, 1998; Tabacchioni et al., 2000;
Kirk et al., 2004).
Otro método utilizado para estudiar la diversidad de los microorganismos en el suelo es
usar fuentes únicas de carbono. Garland y Mills (1991) desarrollaron una placa de 96 pozos
con 95 fuentes de carbono diferentes y un control, la cual utilizaron para evaluar la
diversidad funcional de una población bacteriana (placas de Biolog. http://www.biolog.com).
El método se basa en la utilización de fuentes únicas de carbono (SSCU por sus siglas en
inglés, Sole Source Carbon Utilization), el cual determina diferentes patrones de consumo de
carbono por parte de bacterias, estas fuentes de carbono pueden ser para bacterias Gram
negativas y Gram positivas. En un principio las placas fueron desarrolladas para caracterizar
bacterias aisladas de casos clínicos en hospitales y no para analizar la diversidad microbiana
de muestras ambientales. Posteriormente, la empresa desarrolló una placa que contiene 31
fuentes de carbono ambientalmente relevantes. Alternativamente se han utilizado las placas
con medio de cultivo y una sal de tetrazolio, o han añadido fuentes de carbono específicas.
Este método ha sido utilizado para analizar la diversidad metabólica de comunidades
microbianas en sitios contaminados, la rizósfera, los suelos del ártico, suelos tratados con
herbicidas o suelos inoculados con microrganismos (Grayston et al., 1998; Choi y Dobbs,
1999; Derry et al, 1999; El Fantroussi et al., 1999; Yao et al., 2000).
Otro método similar al de las placas, es el kit de pruebas bioquímicas de la empresa
Biomerieux (www.biomerieux.com.mx), conocido como Índice de Perfil Analítico (API por sus
siglas en inglés, Analytical Profile Index), son tiras que contienen diversas fuentes de carbono
que pueden ser utilizadas para medir la diversidad funcional de los microorganismos. El
método es fácil de utilizar, es reproducible y produce una gran cantidad de datos que reflejan
las características metabólicas de las comunidades microbianas, aunque tienen algunas
limitantes, por ejemplo: sólo se pueden utilizar en microorganismos que pueden ser
cultivables, son favorables para los microorganismos de crecimiento rápido, es sensible a la
densidad del inóculo y puede haber ventaja competitiva in situ entre las especies, lo cual no
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se puede ver reflejado en especies con poca actividad. Otra limitante es la fuente de
carbono, por no ser representativa del suelo de donde fueron tomadas las muestras. Sin
embargo, el método puede ser utilizado para estudiar la diversidad funcional de los suelos en
conjunto con algún otro método (Torsvik et al., 1990; Kirk et al., 2004).
En el suelo, de acuerdo a la facilidad de cultivo de las bacterias en condiciones de
laboratorio, la mayoría de las cepas pertenecen a cuatro filos: Proteobacteria, Firmicutes,
Bacteroidetes y Actinobacteria. Aunque Actinobacteria constituye en promedio el 20% de las
comunidades de bacterias del suelo, sin embargo estos microorganismos son difíciles de
cultivar y están representados por pocos géneros (Schloss y Handelsman 2003).
Debido a esta problemática, se han buscado metodologías alternativas para la
determinación de la diversidad de una población que no dependan del cultivo de
microorganismos sino del estudio y análisis de su información genética. Como alternativa
surgieron las técnicas moleculares que evitan la necesidad de aislamiento y cultivo de cepas
microbianas. Un método pionero fue el análisis de genes conservados con regiones internas
variables como las regiones intergénicas del gen 16S mediante el uso de técnicas
electroforéticas como DGGE/TTGE, SSCP, ARDRA, RFLP, RAPD, LH-PCR, RISA; estas técnicas se
basan en el polimorfismo de secuencia o polimorfismo en la longitud, aparte de ser rápidas y
permiten el análisis simultaneo de varias muestras (Muyzer, 1999; Bedoya et al., 2002).
La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizantes (DGGE por sus siglas en inglés,
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) es un tipo de electroforesis que permite la
separación de fragmentos de ADN del mismo tamaño pero con diferente secuencia de
nucleótidos, los fragmentos son separados en un gel de poliacrilamida que contiene un
gradiente lineal creciente de agentes químicos desnaturalizantes del ADN (una mezcla de
urea y formamida). Durante la electroforesis se mantiene una temperatura constante (50 -
65°C) y los fragmentos de ADN migran por el gel hasta encontrar una determinada
concentración de urea y formamida a la cual las cadenas se separan localmente y el
desplazamiento de las moléculas las disminuye o se interrumpe. La electroforesis en gel de
gradiente de temperatura (TGGE por sus siglas en inglés, Temperature-gradient gel
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electrophoresis) se basa en el mismo principio de la DGGE, excepto que se aplica un
gradiente de temperatura en lugar de un desnaturalizante. A temperatura ambiente, el ADN
es estable en forma de doble cadena, pero a medida que aumenta la temperatura, las hebras
comienzan a separarse y la velocidad a la que se desplazan a través del gel, disminuye. La
temperatura a la que se produce la fusión depende de la secuencia, por lo que, la TGGE no
sólo separa las moléculas, también da información adicional acerca del comportamiento de
fusión y la estabilidad. Tanto el método de DGGE y TGGE implican el uso de 5’-GC (30-50
nucleótidos) en los oligonucleótidos usados en la PCR (Muyzer et al., 1993; Fernández y Le
Borgne, 2014). Las desventajas de estas técnicas implican que el equipo sea costoso y de uso
complejo, los iniciadores son más costosos por llevar CG, algunos reactivos son altamente
tóxicos, sólo pueden separarse por DGGE fragmentos pequeños (500 pb), también es posible
que ocurra la co-migración de fragmentos de ADN provocando la subestimación de la
diversidad, lo cual también dificulta la secuenciación de estos fragmentos (Nikolausz et al.,
2005). Ampe et al. (1999) investigaron la distribución espacial de la microbiota del pozol
durante el proceso de fermentación Dilly et al. (2004) utilizaron DGGE para analizar suelos
fertilizados con residuos agrícolas y mostraron que la diversidad bacteriana de estos suelos
depende del tipo de residuo como del tipo de suelo, clima, vegetación y microbiota nativa
presente.
El polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP por sus siglas en inglés, Single
Stranded Conformational Polymorphism) es una técnica de rastreo de mutaciones usada en
el diagnóstico molecular basada en la migración electroforética del ADN. Los productos de
PCR se desnaturalizan seguida de la separación de fragmentos de ADN de cadena sencilla en
un gel de poliacrilamida no desnaturalizante (Schwieger y Tebbe 1998). A diferencia de la
DGGE, el SSCP no requiere de oligonucleótidos sujetos a GC, ni geles con gradientes o un
equipo especial de electroforesis. El SSCP es adecuado para fragmentos pequeños entre 150
a 400 pb (Muyzer, 1999). Esta técnica se ha utilizada para diferenciar cepas puras de Bacillus
subtillis, Pseudomonas fluorescens y Sinorhizobium meliloti aisladas de muestras de suelo.
También se ha utilizado para el análisis de comunidades bacterianas de la rizósfera asociados
a dos especies de plantas, Medicago sativa (alfalfa) y Chenopodium album (quelite cenizo o
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quelite verde); los resultados mostraron que cada planta albergaba comunidades bacterianas
distintas a pesar de crecer en el mismo suelo (Schwieger y Tebbe, 1998).
El análisis de restricción del 16S ADN ribosomal amplificado (ARDRA por sus siglas en
inglés, Amplified 16S Ribosomal DNA Restriction Analysis) es un método alternativo en
estudios filogenéticos y taxonómicos. El método se compone del análisis del gen 16S rDNA
con enzimas de restricción, ya sea por el mapeo de los sitios de restricción del gen en
cuestión o mediante la estimación de fragmentos obtenidos en los patrones de restricción
observados por electroforesis después de la digestión de la amplificación del gen del 16S
rDNA (Chandna et al., 2013). Aunque esta técnica ofrece poca información sobre el tipo de
microorganismos presentes en una muestra ambiental, se sigue utilizando para analizar de
forma rápida a las comunidades microbianas, para comparar la diversidad microbiana bajo
condiciones de cambio ambiental, para identificar clones únicos y estimar las unidades
taxonómicas operacionales en librerías de clonas ambientales basados en perfiles de
restricción de las clonas. Una de las principales limitaciones del ARDRA es la complejidad de
los perfiles generados en comunidades microbianas ya que son difíciles de observar en geles
de agarosa (Smit et al., 1997).
El polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP por sus siglas en
inglés, Restriction Fragment Length Polymorphism) implica la fragmentación de una muestra
de ADN por una enzima de restricción, que puede reconocer y cortar el ADN donde se
produce una secuencia específica (Picca et al., 2004), una variante de esta técnica es el
Polimorfismo de longitud de fragmentos terminales de restricción (T-RFLP por sus siglas en
inglés, Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism), en esta técnica se utiliza un
marcador 5’ con fluorescencia durante la reacción de PCR, los productos de PCR se digieren
con enzimas de restricción y los fragmentos terminales de restricción (T-RF por sus siglas en
inglés, Terminal Restriction Fragment) se separan en un secuenciador de ADN automatizado
(Thies, 2007). Sólo los T-RFs fluorescentes se detectan, simplificando el patrón de bandas y
permite el análisis de comunidades microbianas complejas. Con el uso de la bioinformática,
se han diseñado programas de análisis de T-RFLP que permiten asignar identidades putativas
basados en una base de datos de fragmentos producidos por secuencias conocidas del gen
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16S rDNA. Una desventaja de la técnica es subestimar la diversidad de la comunidad
microbiana debido a que sólo se genera un número limitado de bandas que se pueden
observar por gel (
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pueden producir amplicones de la misma longitud (Mills et al., 2007). La LH-PCR se ha
utilizado para el estudio de la evolución bacteriana en el fermento de suero del queso Grana
Padano (Lazzi et al., 2004) y para investigar comunidades microbianas en muestras de suelo
de diferentes cultivos agrícolas (Ritchie et al., 2000).
El análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA, por sus siglas en inglés,
Ribosomal Intergenis Spacer Analysis) implica la amplificación por PCR de una porción de la
región espaciadora intergénica presente entre las subunidades ribosomales pequeñas (16S) y
grandes (23S). Mediante el uso de oligonucleótidos que amplifican regiones conservadas en
los genes 16S y 23S rRNA se pueden generar perfiles RISA para la mayoría de las bacterias
dominantes existentes en una muestra ambiental. La versión automática de RISA se conoce
como ARISA e implica utilizar oligonucleótidos fluorescentes siendo de esta forma identificar
fácilmente la región espaciadora intergénica, sin embargo, esta técnica ha demostrado
sobreestimar la riqueza y la diversidad microbiana (Fisher y Triplett, 1999). Ranjard et al.
(2001) caracterizaron comunidades bacterianas de cuatro tipos de suelo de origen
geográfico, cubierta vegetal y propiedades fisicoquímicas diferentes; sus resultados
demostraron que ARISA es un método eficaz y sensible para detectar diferencias entre las
comunidades bacterianas complejas a diferentes escalas espaciales (entre y dentro del sitio
de variabilidad).
El uso de las técnicas como la DGGE, SSCP, RFLP, RAPD, LH-PCR, RISA ha incrementado
el conocimiento de la diversidad microbiana en comunidades complejas, ya que no requiere
del cultivo de microorganismos para identificarlos, sin embargo estos métodos siguen
teniendo algunas limitantes, por lo que no es posible analizar toda la información contenida
en una comunidad microbiana y por tal motivo se requiere del uso de técnicas más
avanzadas que proporcionen más información en la investigación, es por eso que se ha
empleado el uso de la metagenómica.
1.4 METAGENÓMICA
La metagenómica es el análisis del metagenoma, el cual es el conjunto del ADN de los
diversos microorganismos presentes en un hábitat (Ferrer, 2004; Herrera y Castellanos,
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2007). La evolución metodológica de las técnicas de aislamiento y purificación de ácidos
nucleicos, secuenciación y de ensamblado de secuencias, han hecho posible el desarrollo de
esta metodología alternativa. En la última década, esta tecnología ha revolucionado el
estudio de la diversidad microbiana, la obtención de metabolitos y el entendimiento de la
dinámica de poblaciones microbianas. Desde el punto de vista biotecnológico, la
metagenómica es una herramienta importante en la búsqueda de nuevos genes y genomas,
actividades enzimáticas de interés industrial, que en conjunto con los avances en los
métodos de secuenciación, permiten el escrutinio masivo de todo el conjunto de genomas de
microorganismos presentes en una muestra (cultivables y no cultivables). El primer trabajo
donde se demostró el potencial de la metagenómica en el descubrimiento de nuevos genes
fue realizado por Rondon et al. (2000), donde a partir de muestra de suelo se identificaron
genes que codifican para diversas actividades: hemolíticas, lipolíticas y amilolíticas.
Posteriormente, se han identificado otros productos y actividades de interés biotecnológico
como antibióticos nuevos (turbomicina A y B), enzimas (lipasas, esterasas, quinasas),
proteínas de membrana, genes que codifican la ruta metabólica de síntesis de compuestos
como el poli-hidroxibutirato (PHB) y vitaminas (Rondon et al., 2000; Gillespie et al., 2002;
Handelsman et al., 2002), entre otros.
Voget et al. (2003) identificaron en muestras de suelos genes que codifican para
agarasas (de las cuales seis fueron totalmente nuevas), celulasas, amilasas, pectato-liasas,
lipasas, así como diversas proteínas desconocidas. A partir de estos primeros estudios, la
metagenómica se diversificó en la búsqueda de nuevos antibióticos, enzimas, rutas
metabólicas y estudios de dinámica de poblaciones no caracterizadas y de importancia
biotecnológica. Por lo tanto, la metagenómica es una herramienta que permite conocer
genéticamente el contenido de una muestra ambiental (suelos, muestras oceánicas,
sedimentos, piel, etc.). El estudio metagenómico de una muestra ambiental (Figura 1a)
puede llevarse a cabo desde diferentes perspectivas, utilizando diversas metodologías que
involucran no solo el análisis de las secuencias, sino también el estudio funcional. Por lo
tanto para hacer un análisis metagenómico es necesario obtener ADN de buena calidad,
seleccionar el método de análisis (secuenciación, escrutinio funcional, etc.) e integrar la
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información obtenida. A continuación se describen las ventajas y desventajas de algunas
estrategias para el estudio metagenómico de una muestra ambiental.
1.5 ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE UNA MUESTRA METAGENÓMICA
1.5.1 Consideraciones para la obtención del material genético
Este proceso es crucial, ya que la presencia de compuestos orgánicos en el ADN como
melanina, hematina, sales biliares, ácidos húmicos y fúlvicos inhibe la actividad de las
enzimas que son utilizadas posteriormente en su análisis por ejemplo ADN polimerasas,
ligasas y endonucleasas (Figura 1b). Para purificar el ADN se requiere probar diversos
productos, optimizar las técnicas de purificación, y/o utilizar resinas o sílicas (Rojas-Herrera
et al., 2008). Para la purificación de ADN de muestras de ambientes extremos, los protocolos
han tenido que modificarse, ya que los existentes han sido diseñados para ADN de muestras
mesofílicas (Simon et al., 2009). Estos problemas se han abordado con el diseño de columnas
de purificación que excluyen o atrapan a los inhibidores más comunes y al diseño de
polimerasas más eficientes. Así mismo, desde el paso de purificación es necesario tener altas
concentraciones de ADN (10-50 ng/L) porque el material genético se perderá en las
múltiples etapas de manipulación subsecuentes (Wang y Wang, 1997; Mishra et al., 2002;
Mochizuki y Wakisaka, 2007; Cortés-López et al., 2014).
Debido a que la concentración, la cantidad total y la calidad del ADN metagenómico
suele ser un factor limitante, en estudios recientes se ha optado por amplificarlo utilizando la
técnica de amplificación de desplazamiento múltiple (MDA por sus siglas en inglés, Multiple
Displacement Amplification), la cual emplea a la ADN polimerasa 29 bacteriófaga que
produce amplicones 7-10 kb de longitud con una alta fidelidad, con ello se puede obtener
cantidades suficientes de ADN (10 ng/L). Al extraer un ADN metagenómico de calidad, se
pueden seguir diferentes rutas de análisis no excluyentes (Lay et al., 2013; Lewin et al., 2013)
que se mencionan a continuación y se pueden visualizar en la Figura 1.
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Figura 1. Estrategias para el estudio metagenómico de muestras ambientales.
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1.5.2 Metagenómica por secuenciación
En los inicios de la metagenómica, a partir de ADN purificado se construían librerías
metagenómicas con la finalidad de realizar un análisis funcional (Figura 1c). Sin embargo, hoy
en día la secuenciación es el método más común de análisis, debido al bajo costo de las
técnicas post-Sanger de secuenciación, entre las que se encuentran la piro secuenciación, la
secuenciación por síntesis como Illumina y por liberación de protones como Ion Torrent
(Peña-Castro et al., 2013); por lo tanto, la tendencia es secuenciar el ADN metagenómico,
provocando que sea el método de análisis preferido (Figura 1e). Entre las ventajas que
presenta este método es la obtención de terabites de información genética, no involucra
algún proceso de selección (cultivo o enriquecimiento del medio) y minimiza el sesgo de
algunas metodologías como la amplificación de 16S rDNA (Figura 1f). Sin embargo, una
desventaja de la secuenciación es el ensamblado bioinformático de las secuencias obtenidas.
El ensamble se basa en empalmar las secuencias para reconstruir secciones completas y
contiguas de ADN (contigs), con la finalidad de armar genomas completos. Muchas veces los
“contigs” no son lo suficientemente grandes para abarcar toda una región (es como si
perdiéramos fichas internas de un rompecabezas) y, por lo tanto, no pueden ensamblarse. Es
preferible que los fragmentos producidos por la secuenciación sean grandes, ya que su
ensamblaje será más fácil que si los fragmentos fueran más pequeños. Por otro lado, una vez
obtenido el ensamble, es necesario que las secuencias que conforman una región se
encuentren secuenciadas varias veces, a esto se le conoce como profundidad de la cobertura
de secuenciación y un genoma completo se considera confiable si tiene más de seis
repeticiones (6X). El esfuerzo computacional que requiere este proceso amerita instalaciones
informáticas especiales, además, el empalme automático de las secuencias nucleotídicas
requiere frecuentemente de la asistencia humana (Bonilla-Rosso et al., 2008). Así mismo,
existe una gran cantidad de información depositada en las bases de datos (GenBank, IMG,
KEGG GENOME, GOLD, etc.) que no ha sido completamente identificada. En numerosos
estudios metagenómicos, cerca del 50% de las secuencias obtenidas no corresponde a genes
previamente identificados (Jimenez et al., 2012; Lay et al., 2013).
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1.5.3 Diseño de oligonucleótidos degenerados
Otra estrategia de análisis del ADN metagenómico es el diseño de oligonucleótidos
degenerados (Figura 1d), estos se crean mediante programas bioinformáticos, como
primers4clades, a partir de grupos de secuencias previamente alineadas del gen de interés,
sin embargo, tiene varios inconvenientes (Contreras-Moreira et al., 2009). El primero y más
importante es el sesgo y la limitación de la información, ya que el diseño de los
oligonucleótidos dependerá sólo de las secuencias reportadas en las bases de datos, por lo
que será difícil encontrar secuencias nuevas. Otra desventaja es que, en el proceso de
purificación del ADN no se eliminan por completo las sustancias inhibitorias que afectan la
PCR, generando dificultades para amplificar los genes de interés (Rajendhran y Gunasekaran,
2008; Técher et al., 2010). Finalmente, sólo un fragmento del gen se logra clonar debido a
que los programas en los que se diseñan los oligonucleótidos, sean degenerados o no,
arrojan los mejores modelos con base en el contenido de GC, Tm, longitud, etc., y muchas
veces estas características no se cumplen para que los oligonucleótidos se anclen
exactamente al inicio y al final del gen, por lo que, después hay que buscar el resto del gen
por medio de diseño de nuevos oligonucleótidos y amplificaciones sucesivas, lo que puede
tornarse complicado (Mishra et al., 2002; Myrick y Gelbart, 2002; Cowan et al., 2005). Sin
embargo, este método tiene la ventaja de requerir concentraciones bajas de ADN (35 ng/ 50
L de PCR).
1.5.4 Librerías metagenómicas funcionales
Finalmente, en el escrutinio funcional por librerías funcionales es necesario elegir un
sistema de clonación y determinar el tamaño de los insertos a clonar, los cuales dependerán
de la integridad del ADN (Figura 1c), el tamaño de los genes de interés y la estrategia de
escrutinio. Los sistemas más comunes son los plásmidos (15 kb), los fagos (hasta 20 kb), los
fósmidos y cósmidos (hasta 40 kb) y finalmente los Cromosomas Artificiales Bacterianos
(BACs por sus siglas en inglés, Bacterial Artificial Chromosomes) para fragmentos mayores
(Simon y Daniel, 2011). Generalmente, esta técnica se utiliza para el escrutinio de
metabolitos o enzimas. Para la búsqueda de actividades enzimáticas se utilizan librerías de
insertos pequeños (4-12 kb) ya que un tamaño pequeño permite que la mayoría de los genes
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sean influenciados por las señales de expresión del vector, por lo tanto, tienen buena
posibilidad de ser expresados y detectados por escrutinio funcional (Vieites et al., 2010). En
cambio para la búsqueda de “clusters” o vías metabólicas completas, se requieren librerías
con insertos de mayor tamaño (20-40 kb). Durante la elaboración de la librería es importante
colocar puntos de control, para corroborar una adecuada construcción. Una vez hecha la
ligación, y después de haber transformado bacterias competentes, es posible probar la
funcionalidad de la librería mediante expresión inducida de los genes clonados. Esto se
puede lograr mediante la detección fenotípica de la actividad deseada y/o por
complementación heteróloga de mutantes o cepas hospederas (Chen et al., 2010).
Posteriormente, las clonas que expresan la actividad deseada son caracterizadas
bioquímicamente, secuenciadas y analizadas mediante herramientas bioinformáticas. Una de
las principales desventajas de esta estrategia es el sistema de expresión, ya que muchas
proteínas que requieran un plegamiento asistido o modificaciones postraduccionales
difícilmente expresarán su actividad en sistemas procarióticos, por lo que será necesario
utilizar sistemas de expresión eucarióticos como levaduras. Además, en el escrutinio
funcional se requiere de un método robusto, reproducible y barato, ya que se requerirá
analizar millones de clonas. Así mismo, un reto de esta fase es el diseño cuidadoso del
sistema de selección, pues de ello dependerá lo novedoso de las secuencias que se aíslen, así
como, las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que se detecten. Entre las ventajas que
este método presenta es que no se requieren conocimientos previos de la secuencia de los
genes de interés, con ello hay más posibilidades de obtener secuencias novedosas
(Riesenfeld et al., 2004; Schloss y Handelsman, 2003).
1.5.5 Obtención de enzimas mediante estudios metagenómicos
El suelo (sobre todo el rizosférico), ha sido uno de los microambientes predilectos para
realizar estudios metagenómicos debido a su alta diversidad (Pathak et al., 2009; Voget et al.,
2006). No obstante, se han realizado estudios en otros nichos ecológicos como superficies de
sedimentos contaminados (Abulencia et al., 2006), agua de ríos (Uchiyama et al., 2005; Wu y
Sun, 2009), hielo glaciar (Simon et al., 2009), suelo antártico (Heath et al., 2009) y rumen de
bovinos (Duan et al., 2009), entre muchos otros. Algunos ejemplos de nuevos biocatalizadores
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con capacidades enzimáticas diferentes a las reportadas son las lipasas con aminoácidos
catalíticos distintos a los comunes en este tipo de enzimas o enzimas con actividad a
temperaturas cercanas a la congelación; o una glucosidasa que no es inhibida ni por agentes
quelantes ni por glucosa e incluso la actividad es incrementada a altas concentraciones de
glucosa (Martínez- Martínez et al., 2013; Uchiyama et al., 2013). Recientemente se reportó
una esterasa obtenida de metacultivos de naftaleno (Guazzaroni et al., 2013) altamente
promiscua, capaz de hidrolizar a 44 ésteres con diferente estructura y niveles de
enantioselectividad (Martínez-Martínez et al., 2014). Por otro lado, en suelo agrícola se
identificaron dos α-glucosidasas que no son inhibidas por producto, incluso su actividad se
incrementa a altas concentraciones de glucosa; además de ser estables a surfactantes como
SDS y tritón (Biver et al., 2014).
En el caso de estudios metagenómicos en ambientes extremos con temperaturas bajas,
se destaca la construcción de la primera librería metagenómica de suelo de la Antártica donde
se descubrió una esterasa con intervalo de actividad a temperatura muy amplia y con bajo
porcentaje de identidad aminoacídica con las esterasas ya reportadas (Heath et al., 2009). A
pesar de la aparente hostilidad ambiental de la Antártica, se reportó una amplia diversidad
filogenética (Aislabie et al., 2006). La presencia de nuevas y diversas taxas sugiere la
potencialidad de esta zona como fuente de material genético para encontrar enzimas
industriales activas a temperaturas bajas (Cowan et al., 2002). Otro caso exitoso fue la
construcción de una librería metagenómica a partir de hielo glacial, de la cual se lograron
recuperar nueve ADN polimerasas tipo I, las cuales mostraron poca identidad a las ya
reportadas (Simon et al., 2009). Aún son pocos los casos de construcción de librerías de
ambientes con condiciones extremas en comparación con los de ambientes con condiciones
moderadas.
El suelo es uno de los compartimentos ecológicos de mayor diversidad genética
microbiana (Curtis et al., 2002), debido a la riqueza de texturas y estructuras, determinadas
principalmente por el contenido de arena, limo, arcilla, materia orgánica, contenido de agua,
y pH (Robe et al., 2003). Tan solo, un solo gramo puede contener más de 4,000 especies
diferentes de microorganismos (Torsvik y Ovreas, 2002), principalmente procariotas, que a su
-
18
vez poseen miles de enzimas diferentes, constituyendo una reserva enorme de nuevas
moléculas (Robe et al., 2003).
También se puede observar en la Tabla 1 que la clonación en plásmido y el escrutinio
funcional son los métodos de análisis más frecuentes para la recuperación de enzimas. Las
enzimas que comúnmente se obtienen de metagenomas de suelos son lipasas, esterasas y α-
glucosidasas, éstas pueden hidrolizar enlaces C-C y C-O; desde una perspectiva ecológica,
pueden contribuir al ciclo del carbono y posiblemente por ello sus genes están ampliamente
distribuidos en las comunidades microbianas (Martínez-Martínez et al., 2013),
principalmente del suelo.
Del total de las enzimas aplicadas en la fabricación de productos de consumo humano,
el 36% incluye proteasas, amilasas y celulasas. Comercialmente, las celulasas son las
segundas enzimas más demandadas a nivel internacional, tan solo después de las amilasas.
Las celulasas se emplean en distintos ámbitos industriales, principalmente para la generación
de bioetanol de segunda generación, el cual se obtiene a partir de desechos agroindustriales.
Las celulasas también se emplean como aditivos en productos de limpieza y alimenticios, así
como en las industrias papelera y textil (Lorenz y Eck, 2005).
Las lipasas son demandadas principalmente en la industria farmacéutica, para resolver
mezclas racémicas, aunque dada su versatilidad de reacción en medios no convencionales son
también utilizadas en detergentes, alimentos, resolución de ésteres, aminoácidos,
agroquímicos, biosensores, biorremediación, cosméticos y perfumería. Se utilizan en la
industria de los bioenergéticos para la producción de biodiesel (Hasan et al., 2006).
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1.6 LA CUENCA DEL PAPALOAPAN Y SUS SUELOS
La Cuenca del Papaloapan está conformada por el Río Papaloapan y sus afluentes, se
ubica en el sureste de México, abarcando los estados de Puebla, Oaxaca y Veracruz. En el
estado de Oaxaca, la región del Papaloapan tiene un clima cálido semihúmedo y húmedo,
con una precipitación anual promedio de 1,300 a 3,000 mm. Esta región se encuentra al
noroeste de la Sierra de Oaxaca o Sierra Norte, con una latitud norte de 18° 05’, una longitud
oeste de 96° 08’, a una altitud promedio de 20 m.s.n.m. (metros sobre el nivel del mar). El
Río Papaloapan se forma en las selvas tropicales y bosques templados de la Sierra Mazateca
del estado de Oaxaca y vierte sus aguas hacia el norte, sobre la planicie costera del Golfo de
México. Debido a la humedad y al clima, existe una diversidad de especies vegetales y
animales, terrestres y acuáticas, nativas y exóticas. Además, los suelos de esta región son
muy fértiles, los principales cultivos son la caña de azúcar, ocupando el 30% de la superficie
cultivable, el maíz, arroz, piña, frijol, tabaco, plátano, mango, el coco y lichi el 70% de la
superficie cultivable (OEIDRUS-OAXACA, 2005). Los suelos que predominan esta región son el
ferrasol, fluvisol y phaenozems, los cuales tienen características muy particulares que
permiten la existencia de microorganismos (CODICE A.C., 2010).
Estudios realizados por el grupo de trabajo de la Dra. Sandra del Moral, han
determinado que los suelos sembrados con caña de azúcar ofrece una mayor cantidad de
microorganismos frente a otros suelos cultivados y no cultivados en la cuenca. En un primer
trabajo se aislaron 21 cepas de suelos de caña de azúcar, de las cuales se identificaron
mediantes pruebas bioquímicas y secuenciación los géneros Bacillus, Arthrobactery y
Pseudomonas (Montor et al., 2011). En el trabajo realizado en la tesis de licenciatura de Juan
José Montor Antonio en el año 2013, a partir de muestras de suelo con profundidad de 0-15
cm, tomando 1 g de muestra diluida en peptona al 1%, de la dilución 10-1 se aislaron colonias
bacterianas definidas, de las cuales se obtuvieron 12 cepas pertenecientes a los géneros
Bacillus, Lysinibacillus y Pseudomonas, además se identificaron microorganismos que podrían
ser nuevas especies de ciertos géneros debido a la baja identidad que mostraron con las
cepas más cercanas (Montor-Antonio et al., 2014). Hasta el momento no hay reportes del
análisis metagenómico de los suelos cultivados con caña de azúcar en la Cuenca del
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22
Papaloapan. Debido al gran porcentaje de siembra que ocupa la caña de azúcar en la región,
la importancia económica de dicho cultivo y a las características que presentan los suelos
cultivados con caña de azúcar de la Cuenca del Papaloapan como: riqueza orgánica,
fertilización constante y diversidad microbiana (Montor-Antonio, 2014), hemos decidido
realizar un estudio metagenómico a este tipo de suelos a través de diferentes técnicas
metagenómicas.
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23
CAPÍTULO II.
2.1 JUSTIFICACIÓN
La metagenómica es una herramienta que permite analizar desde distintas perspectivas
la diversidad y la funcionalidad de una muestra ambiental. La cuenca del Papaloapan es una
zona megadiversa, y sus suelos seguramente también lo son, sin embargo han sido poco
explorados, por lo que resulta interesante tener una aproximación de dicho hábitat mediante
la utilización de herramientas metagenómicas.
2.2 HIPÓTESIS
Es posible analizar el ADN metagenómico de suelos de cultivos de caña de azúcar de la
región del Papaloapan en el estado de Oaxaca utilizando diferentes técnicas metagenómicas
complementarias de estudio: librerías en fagos, amplificación de genes codificantes para
celulasas por oligonucleótidos degenerados y análisis de la diversidad por el gen 16S rDNA.
2.3 OBJETIVO GENERAL
Estudiar el ADN metagenómico de suelos de cultivos de caña de azúcar mediante tres
técnicas metagenómicas complementarias: librerías metagenómicas funcionales,
amplificación de genes de celulasas utilizando oligonucleótidos degenerados y análisis de la
diversidad microbiana empleando el gen 16S rDNA.
2.3.1 Objetivos específicos
Seleccionar suelos de cultivo de caña de azúcar.
Estandarizar el proceso de extracción y purificación de ADN metagenómico de suelos
de cultivo de caña de azúcar.
Construir una librería metagenómica y realizar una búsqueda funcional de clonas con
actividad celulasa y esterasa.
Amplificar genes codificantes para endoglucanasas mediante el diseño de
oligonucleótidos degenerados.
Amplificar y clonar el gen 16S rDNA de cultivos metagenómicos enriquecidos.
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24
Analizar la diversidad del suelo de caña mediante el gen 16S rDNA de las clonas
obtenidas mediante diferentes estrategias in vitro e in silico: ARDRA, secuenciación y
filogenia.
2.4 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Se hizo una selección de suelos, se colectaron muestras, las muestras se
homogenizaron y se extrajo ADN metagenómico. El ADN metagenómico se analizó mediante
tres técnicas metagenómicas diferentes: librerías funcionales (librerías metagenómicas en
fagos lambda), amplificación de genes codificantes para celulasas y análisis de diversidad
mediante la construcción de la librería del gen 16S rDNA (Figura 2).
Selección de suelos y colecta de muestras
Construcción de librerías
metagenómicas en fagos lambda
Amplificación de genes codificantes
para celulasas
Construcción y análisis in silico e in vitro de la librería del gen 16S rDNA
Extracción de ADN metagenómico
Figura 2. Análisis de ADN metagenómico de suelo.
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CAPÍTULO III. CARACTERÍSTICAS DEL