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UNIVERSIDAD DEL TURABO
EFECTO DE UN DISTURBIO NATURAL EN EL PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS DE COMUNIDADES MICROBIANAS EN EL BOSQUE
EXPERIMENTAL DE LUQUILLO EN PUERTO RICO
Por
Francisco J. Rivera Figueroa B. S., Biología, Universidad del Turabo, Gurabo
TESIS
Escuela de Ciencias y Tecnología Universidad del Turabo
Requisito parcial para el grado de
Maestría en Ciencias Ambientales
Con Especialidad en Manejo Ambiental
Gurabo, Puerto Rico
mayo, 2008
ii
UNIVERSIDAD DEL TURABO
Una tesis sometida como requisito parcial para el grado de Maestría en Ciencias Ambientales
Efecto de un Disturbio Natural en el Perfil de Ácidos Grasos de Comunidades Microbianas en El Bosque Experimental de Luquillo
Francisco J. Rivera Figueroa
Aprobado: __________________________ Sharon A. Cantrell, Ph.D. Asesor de Investigación __________________________ D. J. Lodge, Ph.D. Miembro __________________________ Wanda Rodriguez, M.S. Miembro __________________________ Samuel Flores, Ph.D. Miembro
© Copyright 2008 Francisco J. Rivera Figueroa. Todos los derechos reservados
iii
Dedicatoria
Quiero dedicar este esfuerzo a cada una de las personas que caminaron
conmigo en esta aventura. Primeramente a ustedes mis padres (Javier y Amada)
por su inmenso amor y comprensión, ustedes son mi orgullo y mi modelo. En
ustedes he aprendido a amar a mi ser y a mi patria. Les doy las gracias por
siempre editar en rojo mi camino. A mis hermanas Laura y Liza y a mi nuevo
hermano David, que son mis ojos y manos cuando pierdo dirección. A mis viejos
amigos, en especial a Erico y Jorge por su incondicional amistad. A los nuevos
amigos, Carlos y Luis, por su ejemplo, dedicación y solidaridad cuando necesité
ayuda.
También y de manera muy especial quiero dedicar mi trabajo a mi nueva
familia en un lugar de Juncos, donde tengo paz y aire fresco todos los días. Les
agradezco mucho a mis suegros Carmen y Julio por darme un espacio en su
tierra y permitirme tener un lugar para pensar y escribir. A mis dos hijas, Elisa y
Saeli, que son mi inspiración todos los días. A ti mi amor, Carmen, por toda tu
paciencia y apoyo incondicional en todos los momentos que hemos pasado
juntos. Por último quiero dedicarte este trabajo a ti Diego, que has llegado para
sumarte a este hermoso núcleo. Espero que puedas disfrutar tanto de la vida
como la he disfrutado yo, y aprendas a ver con sensibilidad y admiración todo lo
que te rodea. Tú serás el futuro de esta patria, que va a necesitar de manos
valientes para llevarla a un mejor camino de decencia, respeto y libertad.
iv
Agradecimientos
Durante las distintas etapas de esta investigación, fueron muchas las
personas que colaboraron y me ayudaron grandemente. Quisiera primeramente
dar las gracias al Luquillo LTER y a la Universidad del Turabo por proporcionar
los fondos para conducir esta investigación y los gastos de traslados dentro y
fuera de Puerto Rico. También, agradezco al personal del Instituto Internacional
de Dasonomía Tropical (IITF) del Servicio Forestal de Estados Unidos, en
especial a la Dra. Jean Lodge, y al Instituto de Estudios Ecológicos Tropicales
de la Universidad de Puerto Rico por la ayuda en los muestreos de campo y por
proveerme la información bibliográfica de éstas áreas de estudio. De manera
muy especial quisiera agradecer al Sr. Aaron Shields por ser pilar desde el
comienzo de este proyecto tan complejo, y a todo el personal de la Estación del
Verde por su incansable apoyo.
Quisiera agradecer grandemente a la Dr. Marirosa Molina y a todo su
equipo de estudiantes y colaboradores de la Agencia para la Protección del
Medio Ambiente (EPA) en Athens, Georgia, por haberme ayudado en el análisis
de los ácidos grasos en el GC-MS y por refrescar con nuevas ideas este
proyecto. Dentro de este grupo quiero extender un agradecimiento muy especial
a las estudiantes graduadas Becky y Yolima, quienes me ayudaron a terminar
los análisis finales de las muestras del post-tratamiento.
También, quiero agradecer a mis estudiantes (en especial a Hoover
Zamora), profesores (en especial a la profesora Wanda Rodríguez, Dr. Samuel
v
Flores, Dr. Carlos Ríos, Dr. José Pérez, Dr. Ángel Rivera, Dra. Teresa Lipsette,
Prof. Adalberto Bosque, Prof. Pedro Modesto y al Prof. Antonio González), a mis
compañeros de estudio y amigos (en especial, Luis Manuel García y Carlos
Cruz), a mis compañeros de trabajo en la escuela de ciencias y tecnología y muy
especial a la Dra. Sharon Cantrell, por ser guías en el desarrollo profesional,
educativo y humano de mi persona. A ti Sharon te agradezco la oportunidad de
confiarme un proyecto tan importante y por darme la oportunidad de aprender
más sobre mi isla.
Por último, quiero darle gracias a mi familia por todo su apoyo y
comprensión. Pero sobre todo, les agradezco el haberme enseñado a bailar con
el pánico.
vi
Tabla de Contenido página
Tabla de Contenido .............................................................................................. vi
Lista de Tablas ..................................................................................................... ix
Lista de Apéndices .............................................................................................. xii
Abstract .............................................................................................................. xiii
Resumen ............................................................................................................. xv
Capítulo Uno. Introducción ................................................................................... 1
Trasfondo y Problema ........................................................................... 1
Justificación ........................................................................................... 2
Pregunta e Hipótesis ............................................................................. 4
Meta y Objetivos .................................................................................... 7
Capítulo Dos. Revisión de Literatura .................................................................... 9
Métodos para Estudiar Microorganismos y su Diversidad en
Muestras Ambientales ......................................................................... 12
Lípidos Como Biomarcadores .............................................................. 16
Lípidos microbianos ............................................................... 16
Biomarcadores funcionales y taxonómicos ............................ 19
Estudios en muestras ambientales ......................................... 23
Capítulo Tres. Material Y Métodos ...................................................................... 26
Descripción del Lugar de Estudio y Diseño Experimental ................... 26
vii
Procedimiento para la Toma y el Manejo de las Muestras .................. 28
Análisis de los Lípidos ......................................................................... 30
Nomenclatura ......................................................................... 30
Capítulo Cuatro. Análisis de Resultados ............................................................. 36
Perfiles de El-FAME en Suelo y Hojarasca en las Muestras
Antes de la Aplicación de los Tratamientos ......................................... 36
Concentración de EL-FAME en Suelo y Hojarasca (Pre- y Post-
Tratamiento) ........................................................................................ 48
Suelo y Hojarasca en el tratamiento control ........................... 48
Suelo ...................................................................................... 49
Hojarasca ............................................................................... 60
Comparación entre la Proporción Hongo: Bacteria en
Suelo y Hojarasca .................................................................. 65
Comparación entre la proporción Gram +: Gram – en
Suelo y Hojarasca .................................................................. 70
Diferencias en Comunidades Microbianas en Base al Análisis de
Componente Principal ......................................................................... 76
Suelo ...................................................................................... 76
Hojarasca ............................................................................... 82
Capítulo Cinco. Discusión ................................................................................... 87
Perfil y Estructura de la Comunidad Microbiana en el Bosque de
Tabonuco ............................................................................................. 87
viii
Concentración de Lípidos Entre Suelo y Hojarasca Previo al
Disturbio............................................................................................... 89
Efecto de la Manipulación del Bosque en la Concentración de
Ácidos Grasos ..................................................................................... 91
Composición de la Comunidad Microbiana en el Suelo y
Hojarasca luego del Efecto de la Manipulación ................................... 94
El Efecto de las Perturbaciones Naturales en los Suelos y
Hojarasca del Yunque ......................................................................... 95
El Uso De Señales De Lípidos Como Bioindicadores En El
Manejo Y Monitoreo De Ecosistemas Naturales .................................. 97
Conclusión ........................................................................................... 99
Literatura Citada ............................................................................................... 101
Apéndice A ....................................................................................................... 121
Apéndice B ....................................................................................................... 122
Apéndice C ....................................................................................................... 123
ix
Lista de Tablas página Tabla 2.01. Resumen de las ventajas y desventajas de los métodos
bioquímicos ................................................................................... 15
Tabla 2.02. Resumen de los ácidos grasos empleados como biomarcadores encontrados en la literatura .................................. 21
Tabla 2.03. Estudio realizados en distintos ambientes para medir los cambios y composición de las comunidades microbianas. ........... 24
Tabla 3.01. Grupos de ácidos grasos y sus fracciones junto con sus abreviaciones. ............................................................................... 32
Tabla 3.02. Proporciones de EL-FAME utilizados en el análisis de datos. ...... 34
Tabla 4.01. Promedio de abundancia relativa de los EL-FAME para cada bloque en muestras de suelo del periodo de pre-tratamiento.. .................................................................................. 38
Tabla 4.02. Promedio de abundancia relativa de los EL-FAME para cada bloque en muestras de hojarasca del periodo de pre-tratamiento.. .................................................................................. 43
Tabla 4.03. Promedio de concentración (µmol g-1 peso seco) de grupos taxonómicos en suelo durante los meses en los periodos del pre- y post-tratamiento. ................................................................. 55
Tabla 4.04. Promedio de concentración (µmol g-1 peso seco) de grupos taxonómicos en hojarasca durante los meses en los periodos del pre- y post-tratamiento. ............................................. 63
x
Lista de Figuras
página Figura 4.01. Promedio de abundancia relativa (+ error estándar) de
clases de ácidos grasos en suelo (n = 16) obtenidas durante el periodo de pre-tratamiento.. ...................................................... 41
Figura 4.02. Promedio de abundancia relativa (+ error estándar) de
clases de ácidos grasos en hojarasca (n = 16) obtenidos durante el periodo de pre-tratamiento.. ......................................... 47
Figura 4.03. Comparación de la variación de la concentración promedio
total (± error estándar) de EL-FAME en el control entre suelo y hojarasca (n = 3) durante el pre- y post-tratamiento. ................. 49
Figura 4.04. Concentración promedio (± error estándar) del total de EL-
FAME (n = 3) en suelo para cada tratamiento durante el periodo del pre- y post-tratamiento.. ............................................. 52
Figura 4.05. Variación de la concentración promedio (± error estándar)
del marcador de hongos 18:2ω6 (n = 3) a través del tiempo.. ...... 57 Figura 4.06. Variación a través del tiempo de la concentración promedio
(± error estándar) de la suma promedio de los marcadores de actinomicetos 10Me 16:0 y 10Me 18:0 (n = 3).. ....................... 59
Figura 4.07. Variación de la concentración promedio total (± error
estándar) de EL-FAME (n = 3) en hojarasca para cada tratamiento durante el periodo del pre- y post-tratamiento. ........... 61
Figura 4.08. Variación promedio (± error estándar) de la proporción
hongo: bacteria (n = 3) en suelo para cada tratamiento en el periodo del pre- y post-tratamiento.. ............................................. 66
Figura 4.09. Promedio (+ error estándar) en cada tratamiento (n = 12) de
proporción hongo: bacteria durante el periodo de pre- y post-tratamiento.. .................................................................................. 68
Figura 4.10. Variación promedio (± error estándar) de la proporción
hongo: bacteria (n = 3) en hojarasca para cada tratamiento en el periodo del pre- y post-tratamiento.. ..................................... 70
Figura 4.11. Variación promedio (± error estándar) en suelo de
proporción de Gram +: Gram - (n = 3) a través del periodo del pre- y post-tratamiento.. .......................................................... 72
xi
Figura 4.12. Promedio (+ error estándar) en cada tratamiento (n = 12) de
proporción Gram +: Gram – en suelo durante el periodo de pre- y post-tratamiento.. ................................................................ 73
Figura 4.13. Variación promedio (± error estándar) en hojarasca de
proporción de Gram +: Gram - (n = 3) a través del periodo del pre- y post-tratamiento.. .......................................................... 75
Figura 4.14. Promedio (+ error estándar) en cada tratamiento (n = 12) de
proporción Gram +: Gram - durante el periodo de pre- y post-tratamiento. ........................................................................... 76
Figura 4.15. Análisis de componente principal de la estructura de la
comunidad microbiana (% Mol) en suelo con respecto a los bloques en el pre-tratamiento.. ..................................................... 77
Figura 4.16. Análisis de componente principal de la estructura de la
comunidad microbiana (% Mol) en suelo con respecto a la temporada de muestreo en el pre-tratamiento.. ............................ 79
Figura 4.17. Análisis de componente principal de la estructura de la
comunidad microbiana (% Mol) en suelo por cada tratamiento durante el pre (color blanco) y post (color negro) tratamiento. ................................................................................... 81
Figura 4.18. Análisis de componente principal de la estructura de la
comunidad microbiana (% Mol) en hojarasca con respecto a los bloques en el pre-tratamiento.. ................................................ 83
Figura 4.19. Análisis de componente principal de la estructura de la
comunidad microbiana (% Mol) en hojarasca con respecto a la temporada de muestreo en el pre-tratamiento.. ........................ 84
Figura 4.20. Análisis de componente principal de la estructura de la
comunidad microbiana (% Mol) en hojarasca por cada tratamiento durante el pre- y post-tratamiento.. ............................ 86
xii
Lista de Apéndices
página Apéndice A. Foto aérea del área de estudio en la estación El Verde,
Luquillo, PR ................................................................................. 121 Apéndice B. Posición y elevación de los tratamientos en área de estudio
en la estación El Verde, Luquillo, PR .......................................... 122 Apéndice C. Contornos de elevación y posición de los bloques en la
estación El Verde, Luquillo, PR ................................................... 123
xiii
Abstract
Francisco J. Rivera Figueroa. (M.S., Environmental Science, Environmental
Management)
The effect of a natural disturbance in the microbial community’s fatty acid profiles
in the Luquillo Experimental Forest. May/2008
Abstract of a master dissertation at the Universidad del Turabo.
Dissertation supervised by Professor Sharon Cantrell, Ph.D.
No. of pages in text 123
Natural disturbances such as hurricanes can open the forest canopy and
produced large pulses of litter fall and woody debris. Microorganisms play an
important role in the forest’s restoration through their detritus dynamics. Our
objective was to determine how the canopy openings and debris pulses affect the
soil microbial community structure and composition in the forest. The canopy
trimming experiment at the Luquillo Experimental Forest (LEF) simulates some
aspects (canopy openness and biomass redistribution) of hurricane disturbances.
Soil samples and leaf litter were gathered from three blocks each with four
treatment plots in Tabonuco Forest at the LEF. Biochemical analysis approaches
such as Ester Linked Fatty Acid Methyl Ester (EL-FAME) were used to determine
microbial community shifts in the forest floor.
About 45 different fatty acids were found during the study. Principal
Component Analysis (PCA) suggested that the soil microbial community
structure changed significantly after the treatments were applied. In contrast, we
xiv
did not detect a difference in the microbial community in leaf litter in respect to
treatments. In soil, Fatty acid such as 18:2w6 which is a fungal marker, were
proportionally more abundant in non-trimmed than trimmed plots. The fungal to
bacteria ratios followed the same pattern. No differences were observed in the
leaf litter fraction. PCA also show that the microbial community of the soil was
different from that in leaf litter and they were affected by season. Bacterial
markers were more abundant in soil than in leaf litter. The fatty acids cy19 and
10 ME18:0 (Gram negative and Actinomyces respectively) decreased
considerably in the litter fraction while the 18:2w6 increased.
The changes in microclimate (openness) and structure (redistribution of
biomass) created by disturbances such as hurricanes and silvicultural operations
may alter the soil microbial community structure and dynamics but significant
changes were not detected but control in leaf litter layer. The differences in
response of the microbial community between litter and soil may be due to the
differences in bacterial versus fungal dominance they mediate that comprise
these compartments or systems.
xv
Resumen
Los disturbios naturales tales como los huracanes, pueden abrir el dosel
de los bosques produciendo grandes pulsos de hojarasca y madera. Los
microorganismos desempeñan un papel importante en las dinámicas de
descomposición que es importante en la restauración del bosque. Nuestro
objetivo es determinar cómo las aberturas del dosel y los pulsos de detritos,
afectan la estructura y la composición de las comunidades microbianas de suelo
y hojarasca en el bosque. El experimento de poda de dosel llamado en inglés
como: Canopy Trimming Experiment (CTE), simula algunos aspectos (aberturas
del dosel y redistribución de la biomasa) asociados a los disturbios de un
huracán en el Bosque Experimental de Luquillo (BEL).
Las muestras de suelo y de hojarasca fueron recolectadas en tres
bloques divididos en cuatro parcelas sometidas a tratamientos en el bosque de
Tabonuco en el BEL. La técnica de análisis de ácidos grasos ligados a un enlace
ester (EL-FAME), fue utilizado para determinar los cambios de las comunidades
microbianas en el suelo y hojarasca del bosque.
Alrededor de 45 ácidos grasos fueron encontrados a lo largo de las áreas
de estudio. El análisis del componente principal (ACP) sugiere que los cambios
microbianos en la estructura de la comunidad del suelo ocurrieron después que
los tratamientos fueron aplicados. Sin embargo, encontramos que en hojarasca
la comunidad microbiana no se afectó debido a los tratamientos. En suelo, el
ácido graso 18:2ω6, que es un marcador para hongos, era proporcionalmente
xvi
más abundante en las parcelas con dosel cerrados que en los abiertos.
Similarmente, este patrón se repitió en la proporción hongo: bacteria. En la
fracción de hojarasca no se observó ninguna diferencia. EL ACP también
demuestra que la comunidad microbiana del suelo es diferente a la de hojarasca
y en ambos existe una variación con respecto al tiempo. Los marcadores
bacterianos son más abundantes en suelo que en la hojarasca. Los ácidos
grasos tales como cy19 y 10ME18:0 (Gram negativo y actinomicetos
respectivamente) disminuyeron considerablemente en la fracción de hojarasca
mientras que el 18:2ω6 aumentó.
Los cambios en el microclima (aberturas) y la estructura (redistribución de
la biomasa) creada por los disturbios similares a los huracanes y operaciones
de silvicultura, pueden alterar la estructura y las dinámicas en las comunidades
microbianas del suelo y en la capa de hojarasca. Las diferencias en la
respuesta de la comunidad microbiana entre la capa de hojarasca y el
suelo, pueden ser debido a las diferencias en la dominancia entre
bacterias y hongos que abarcan estos compartimientos o sistemas.
1
Capítulo Uno
Introducción
Trasfondo y Problema
Los huracanes son los principales causantes de disturbios naturales en los
bosques del Caribe. Los mismos se originan en la costa occidental de África
ganando fuerza una vez se dirigen hacia el Océano Atlántico. Estos tienen
efectos profundos no tan solo en los aspectos cotidianos de una sociedad, sino
también tienen efectos en las plantas, animales, geografía y el suelo. Según los
estudios realizados en Puerto Rico por Doyle (1981), Weaver (1986), Lugo y
Rivera-Battle (1987) y Crow (1980), se sugiere que los huracanes tienen un
efecto mayor en la estructuración de los bosques tropicales, en términos de la
distribución de los árboles, la biomasa y la diversidad de especies. Estos
estudios se suman a la evidencia acumulada, la cual sugiere que los sistemas
naturales están organizados grandemente por disturbios (Pickett y White 1985,
Denslow 1987).
Durante el Huracán Hugo hubo defoliación y pérdida masiva de ramas
acompañada de una pérdida de árboles en el bosque en el Yunque. En el área
de estudio del Verde, 56% de los árboles fueron víctimas de defoliación, 9%
fueron desraizados y 11% tenían sus troncos partidos (Walker, 1991). Además,
los huracanes Hugo y Georges abrieron el dosel del bosque y produjeron un
incremento en la cantidad de hojarasca y madera acumulada sobre el suelo
(Lodge et al 1991, Silver et al 1996). De acuerdo a estudios realizados por
2
Lodge et al (1991), el Huracán Hugo depositó 1 kg/m2 de hojarasca sobre el
suelo del bosque. En un periodo de dos años, la combinación de detritos y
aberturas en el dosel del bosque aumentó los niveles de luz, humedad, entrada
de nutrientes y el reciclaje de nitrógeno y fósforo en el suelo y los ríos (McDowell
et al1996, Silver et al 1996); se redujo la humedad, la diversidad funcional de
comunidades microbianas (Willig et al 1996) y el efecto diferencial de
supervivencia de hongos en la hojarasca (Lodge y Cantrell, 1995). Sin embargo,
la importancia de la abertura del dosel y la entrada de detritos para regular estos
efectos aún tienen que ser determinados, particularmente la importancia en las
interacciones de las comunidades microbianas en el suelo y la hojarasca.
Justificación
La gran mayoría de los estudios se han enfocado en los efectos de los
disturbios en las poblaciones y las comunidades de plantas y animales, con poca
atención en las comunidades microbianas (Willing et al 1996). Los
microorganismos presentan roles importantes en los diferentes ecosistemas de
nuestro planeta. Estos son responsables del reciclaje de materiales y nutrientes
indispensables para la supervivencia de otros organismos. Este reciclaje de
nutrientes ocurre por las interacciones de las comunidades microbianas, las
cuales proveen mecanismos metabólicos para reciclar las sustancias químicas
en el ambiente. La generación de materia orgánica muerta, lo cual es una fuente
de nutrientes, es una de las características de los disturbios naturales como los
huracanes. Esta materia orgánica es procesada por los microorganismos como
parte de su respuesta a los disturbios.
3
El análisis de los ácidos grasos en microorganismos se ha convertido en
una técnica usada con frecuencia para identificar y caracterizar comunidades
microbianas en sistemas naturales (Schutter y Dick 2000). Los ácidos grasos
son una unidad en los lípidos que se componen de cadenas largas de carbono y
enlazados mayormente a un grupo glicerol en la membrana celular. Los ácidos
grasos en el suelo se derivan de células vivas y muertas, como también de
materiales húmicos de plantas y de la exudación de raíces (Ibekwe y Kennedy
1998). Teóricamente, cada ácido graso es característico y único para cada grupo
de organismo. Con la extracción directa de estos lípidos en muestras, podemos
diseñar un perfil de las comunidades que se encuentran en ese lugar. Esta
técnica es menos tediosa y de bajo costo económico en comparación con otras
técnicas moleculares (Cavigelli et al 1995). Este estudio pretende identificar y
resaltar la importancia de los microorganismos como agentes que contribuyen a
la recuperación del bosque luego de un disturbio natural como lo es un huracán.
El mismo estará enfocado en caracterizar y medir los cambios en sucesión de
las comunidades de microorganismos presentes en el suelo y en la hojarasca,
basados en la composición de sus ácidos grasos.
4
Pregunta e Hipótesis
El proyecto de la poda del dosel conocido en inglés como Canopy
Trimming Experiment (CTE), tiene como uno de sus objetivos determinar como
los cambios en el microclima (temperatura del aire, humedad de suelo y luz) y
en los detritos (carbono y nutrientes) promueven cambios en el ecosistema
(productividad, composición de especies, transporte y almacenaje de carbono y
nutrientes). Este proyecto de investigación se enfoca principalmente en como
ciertos componentes de un disturbio natural (aberturas del dosel y redistribución
de la biomasa) afectan las comunidades microbianas en el suelo y la hojarasca
en un bosque tropical. La siguiente pregunta e hipótesis han sido planteadas
para poder entender el complejo enlace entre los microorganismos y las
dinámicas que ocurren en los bosques tropicales.
Pregunta I - ¿Qué efecto tiene la manipulación de la estructura y el microclima
del bosque en la variabilidad y abundancia de ácidos grasos asociados a
comunidades microbianas en el suelo y hojarasca?
Las aberturas en el dosel pueden reducir las actividades microbianas
debido a los cambios en temperatura e irradiación de luz que ocurren en la capa
de suelo y hojarasca (Quishui y Zak 1995). Los huracanes y las tormentas
tropicales pueden causar una deposición repentina y masiva de nutrientes en el
suelo del bosque lo que resulta en importantes cambios en el ciclo de nutrientes
(Lodge y McDowell 1991). Consecuentemente las aberturas en el dosel causan
cambios en la composición de comunidades de basidiomicetos en hojarasca y
una disminución de riqueza en especies (Hedger 1985; Lodge y Cantrell 1995).
5
Por otra parte se ha documentado respuestas positivas de los hongos
(basidiomicetos) en la acumulación de detritos (Lodge et al 2008), lo cual
respalda la respuesta positiva de los hongos en la descomposición de hojarasca.
Hipótesis I
Ho: Los movimientos de materia orgánica y las aberturas en el dosel mantendrán
invariable la abundancia y diversidad relativa de ácidos grasos asociados a
microorganismos presentes en la hojarasca y el suelo del bosque.
Ha: Los movimientos de materia orgánica y las aberturas en el dosel cambiarán
la abundancia y la diversidad relativa de ácidos grasos asociados a
microorganismos presentes en la hojarasca y el suelo del bosque.
Además de la pregunta principal para ésta investigación, otras
interrogantes se han levantado que abordan detalles acerca de la diversidad y
abundancia de los ácidos grasos antes y después de un disturbio.
Previo al disturbio
1. ¿Cuán diverso es el suelo y hojarasca en término de ácidos grasos antes
de la manipulación del bosque?
2. ¿Existirá una variación espacial y de temporada en los ácidos grasos para
cada sustrato?
3. ¿Será la composición de ácidos grasos microbiana diferentes entre el
suelo y la hojarasca?
4. ¿Podrá ser distinta la concentración total de ácidos grasos (biomasa)
durante diferentes épocas del año, entre los sitios de estudio y entre los
sustratos?
6
Después del disturbio
1. ¿Cuáles son los efectos de la manipulación del dosel en la concentración
total de ácidos grasos microbiana del suelo y la hojarasca?
2. ¿Cuáles son los efectos de la manipulación del dosel en la composición
de la comunidad microbiana del suelo y la hojarasca?
7
Meta y Objetivos
El propósito del estudio es caracterizar y medir los cambios en
comunidades de microorganismos (hongos, bacterias y protozoarios) presentes
en el suelo y la hojarasca luego del paso de un huracán. El estudio se realizará
en tres áreas del Bosque Experimental de Luquillo (El Bosque Nacional El
Yunque) donde se recrearán los efectos de un huracán podando
sistemáticamente el dosel y redistribuyendo la vegetación acumulada en
distintas áreas. El cambio en las comunidades se analizará estableciendo
distintas condiciones y simulando el movimiento de fuentes orgánicas como
hojas y ramas durante el paso de un huracán. Con este estudio se pretende
medir los cambios en la biomasa y estructura microbiana en respuesta a los
tratamientos y sus efectos relativos en la descomposición del material orgánico.
La meta es relacionar la información a nivel molecular, con la actividad de
descomposición a una escala ecológica. Los objetivos de este estudio son:
1. Extraer los ácidos grasos del suelo y hojarasca, y analizar la composición
y estructura de las comunidades microbianas de hongos, bacterias y
protozoarios.
2. Determinar la diferencia en la estructura de comunidades microbianas en
el suelo y hojarasca de acuerdo con la composición de ácidos grasos.
3. Traducir la información molecular obtenida del suelo y hojarasca para
determinar la estructura microbiana antes y después del movimiento de
biomasa.
8
4. Determinar cuáles son los grupos más frecuentes de ácidos grasos
asociados a microorganismos y su distribución en espacio y tiempo en los
tres bloques de estudios, y entre las parcelas con los tratamientos.
9
Capítulo Dos
Revisión de Literatura Los Disturbios Naturales y Antropogénicos en Bosques Tropicales y sus
Efectos en Comunidades Microbianas
Los microorganismos controlan muchos de los procesos vitales para la
supervivencia y mantenimiento de los bosques tropicales (Hawksworth y Colwell
1992). Según Lodge et al (1996), existen grupos funcionales indicadores que
son sensitivos en los bosques tropicales y ejercen roles fundamentales en los
procesos de los ecosistemas. Mucho de estos organismos se relacionan con
otros en interacciones mutualistas como lo son: las micorrizas, los fijadores de
nitrógeno en los nódulos de las plantas, aquellos relacionados con los
artrópodos y posiblemente hongos endofíticos. Algunos procesos en los bosques
tropicales relacionados con estos microorganismos y sus interacciones son
vulnerables a disturbios, ya que los grupos funcionales de microorganismos y
sus actividades están confinados a ambientes restringidos y son sensitivos a
cambios.
Los disturbios son agentes de cambio que afectan la estructura y las
funciones en la naturaleza. Los mismos se manifiestan a niveles de población,
comunidades y ecosistemas desde un punto de vista ecológico. En ecosistemas
caribeños, los disturbios antropogénicos y naturales juegan un papel crítico,
donde los huracanes y las actividades humanas, como la agricultura,
representan un factor importante en el diseño y la modificación del suelo en sus
10
componentes abióticos y bióticos. Según Willig et al (1996), los disturbios en el
suelo, que son resultado del estrés natural y antropogénico, tienen un fuerte
impacto en la organización espacial y la diversidad funcional de las comunidades
bacterianas. Las variaciones en la temperatura, humedad y características de la
materia orgánica e inorgánica en el suelo, influencian la composición taxonómica
en el arreglo, densidad y estado fisiológico de las bacterias. Esos cambios, que
suelen ser abruptos en el microclima, son el resultado de las aberturas causadas
por la defoliación y la mortalidad de la vegetación a consecuencia del impacto de
un huracán. Otros tipos de disturbios como lo son la radiación, provocan
cambios en la dominancia relativa de algunos componentes de las poblaciones
microbianas como lo son los hongos (Holler y Cowley 1970; Cowley 1970).
Cowley (1970) encontró que las comunidades de micro-hongos que
descomponen la hojarasca en El Verde, son sensitivas a estrés y se afectan
cuando ocurren aberturas en el dosel del bosque y hay radiación. Los disturbios
que rompen el dosel del bosque contribuyen con cambios espaciales y
temporales en poblaciones y comunidades de hongos descomponedores.
Estudios realizados en el Bosque Experimental de Luquillo han
demostrado, que las aberturas en el dosel del bosque causan cambios en la
composición de comunidades de basidiomicetos en hojarasca y una disminución
de riqueza en especies (Hedger 1985; Lodge y Cantrell 1995). Además, estas
aberturas en el dosel pueden reducir las actividades microbianas debido a los
cambios en temperatura e irradiación de luz que ocurren en el suelo (Quishui y
Zak 1995).
11
Antropogénicamente, el uso del suelo afecta la estructura del ecosistema
que incluye características como: profundidad, composición química,
concentración de materia orgánica, disponibilidad de agua, entre otros. Sin
embargo, todos estos factores se pueden correlacionar y por la falta de
manipulaciones experimentales, no se puede determinar cuál de estos factores
es el más importante en la estructuración de las comunidades del suelo (Willig et
al 1996). Este trabajo establece que la heterogeneidad espacial caracteriza la
diversidad funcional de las comunidades del suelo en el bosque tropical. El
grado de daño del huracán a las comunidades de plantas sobre el suelo está
positivamente relacionado a la actividad, riqueza, uniformidad, y diversidad del
sustrato.
El tamaño de la abertura creada en el dosel del bosque luego del paso de
un huracán, es crítico en las actividades de descomposición de hojarasca la cual
es influenciada por los microorganismos presentes. Quishui y Zak (1995) han
relacionado el tamaño de la abertura del dosel y la descomposición de la
hojarasca. Estos establecen que la temperatura, humedad y la radiación solar,
más allá de la composición química de las hojas en suelos de bosques
subtropicales, pueden ser factores que median las actividades microbianas. Las
aberturas de gran tamaño que causan grandes entradas de radiación, provoca
que la evaporación baje la humedad rápidamente en el suelo y hojarasca. Es por
esta razón que se crea un ambiente inapropiado para la actividad de algunos
descomponedores primarios, en especial algunas bacterias y hongos. Esta
situación afecta significativamente la razón de descomposición, que está
12
grandemente relacionada con la disminución de las actividades microbianas en
el suelo. Por el contrario, aquellas aberturas más cerradas sugieren una mayor
actividad microbiana, ya que debajo de este dosel semi-cerrado, la humedad y la
temperatura del suelo y hojarasca se mantiene alta y estable (Quishui y Zak
1995).
Métodos para Estudiar Microorganismos y su Diversidad en Muestras
Ambientales
En la naturaleza, los microorganismos raramente existen como
monocultivos, sino viven en comunidades con otros microorganismos (Vestal y
White 1989). Todos los ciclos bioquímicos esenciales de carbono, hidrógeno,
nitrógeno, oxígeno y azufre están mediados por comunidades de
microorganismos. Durante las últimas tres décadas, el estudio de la estructura
de estas comunidades, se ha realizado utilizando medios selectivos enriquecidos
con una o más fuentes de energía. Sin embargo, el aislamiento e identificación
de las colonias y el uso de técnicas básicas, como tinción, observación de
morfología y pruebas bioquímicas para la clasificación taxonómica resultan
costosas, consumen tiempo y solamente revelan la presencia de aquellos
microorganismos que pueden ser cultivados en un medio seleccionado. El otro
problema que revelan estas técnicas de cultivo es que solo se expresan aquellos
organismos que están presentes pero no indican nada acerca de su actividad en
el sustrato. Muchos autores afirman que el 1-10% de los microorganismos en el
ambiente son cultivables y el otro 99-90% permanecen en un estado fisiológico
que no permite su cultivo (Borneman et al 1996; Rondon et al 1999; Tiedje y
13
Stain 1999; Torvik y Øvereås 2002). Para superar los problemas asociados con
los microorganismos que no se pueden cultivar, varios métodos se han
desarrollado para estudiar la diversidad de microorganismos en ambientes
naturales.
En la literatura la diversidad de especies consiste en riqueza de especies,
el número total de especies presentes, igualdad de especies y su distribución
(Kirk et al 2004). Los métodos más comunes para medir la diversidad microbiana
en suelos se categorizan en dos grupos: técnicas bioquímicas (Tabla 2.01) y las
moleculares. Tradicionalmente, los estudios de diversidad relativa incluyen la
observación de comunidades a través de un gradiente de estrés, de disturbios y
otras diferencias bióticas o abióticas (Hughes et al 2001). Sin embargo, es difícil
con técnicas actuales estudiar la diversidad verdadera, puesto que no sabemos
que está presente y siempre existe la incertidumbre en determinar la exactitud
de nuestros métodos de extracción o de detección. Los investigadores procuran
a menudo reducir la información recolectada de los estudios de diversidad en
medidas discretas y numéricas tales como índices de diversidad (Atlas y Bartha
1993).
Los métodos de análisis de diversidad, aunque son útiles en estos
estudios, no proveen detalles absolutos y de forma aislada sobre la estructura de
la comunidad microbiana y el impacto de la variación en la composición de la
comunidad. Muchos estudios se han conducido utilizando la combinación de
procedimientos para brindar un mejor y claro entendimiento de las comunidades
y sus dinámicas. Un ejemplo de eso se presenta en el trabajo de Fritze et al
14
(1997), en donde no se encontró un efecto, basado en estudios de diversidad
metabólica utilizando fuentes de carbono, en la estructura de la comunidad
microbiana luego de la fertilización de bosques contaminados con metales. Sin
embargo, según el análisis de ácidos grasos, estas comunidades si se afectaron
por los tratamientos aplicados en el bosque.
Aunque se han mejorado los métodos para estudiar la diversidad
(numérica, taxonómica, estructural), aún no está clara la asociación entre
diversidad y función. Actualmente existe un debate sobre si la diversidad
genética o taxonómica es importante mientras la diversidad funcional se
mantiene en el ecosistema. La habilidad actual para estudiar y entender la
diversidad microbiana está forjada con limitaciones taxonómicas y
metodológicas. Sin embargo, el conocimiento entre las dinámicas de los
microorganismos en las plantas y suelos va en aumento a medida que nuevas
técnicas son desarrolladas y afinadas.
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16
Lípidos Como Biomarcadores
Lípidos microbianos
Los lípidos son moléculas orgánicas presentes en células eucariotas y
procariontes que son insolubles en soluciones acuosas, pero son solubles en
solventes orgánicos. En los microorganismos los lípidos actúan como almacén
de materiales, son responsables de la estructura y la organización de las
membranas celulares principalmente como fosfolípidos, y están asociadas con
procesos fotosintéticos (Ratledge y Wilkinson 1988a).
Los lípidos se pueden clasificar como lípidos neutrales o polares. Los
lípidos neutrales incluyen los lípidos en los cuales la función hidrofílica tiene
relativamente poco impacto en las características moleculares totales. Los
lípidos neutrales incluyen los hidrocarburos simples, los carotenos, los esteres
de la cera, los esteres del esterol, los ácidos grasos, y los esteroles. Los lípidos
polares contienen un grupo principal polar, que tiene una influencia importante
en las características de solubilidad. Los lípidos polares incluyen los fosfolípidos,
los glicolípidos, los sulfolípidos, algunos esfingolípidos, los carotenoides
oxigenados y las clorofilas (Ratledge y Wilkinson 1988a).
Según Lechevalier (1977), los lípidos de las bacterias constituyen menos
del 5% de su peso seco, y los mismos son funcionales y estructuralmente
diversos. Estos lípidos celulares se pueden clasificar en: gliceroles, alcoholes
grasos, glicolípidos, sulfolípidos, y peptidolípidos; fosfolípidos, ceras e
hidrocarburos. Muchos de los ácidos grasos en eubacterias están derivados de
las membranas de fosofolípidos. Muchos de éstos ácidos grasos son
17
sintetizados a partir de acetil-coA y malonil-coA como sustrato. La familia de
cadenas largas de ácidos grasos que existe está distribuida entre los
procariontes y eucariotas. En eubacterias, las células tienen cadenas de ácidos
grasos monoinsaturadas, ramificadas, alicíclicas y poliinsaturados. Sin
embargo, en eucariotas, raramente se consiguen grupos ramificados y
alicíclicos. En eucariotas las membranas están compuestas mayormente de
ácidos grasos poliinsaturados los cuales no son encontrados en la mayoría de
los procariontes (Madigan et al 1997).
Los fosfolípidos de las membranas pueden ser clasificados en dos grupos:
(1) ácidos grasos de fosfolípidos con enlace éster y (2) ácidos grasos de
fosfolípidos sin enlace éster.
Técnicas empleadas en el estudio de los biomarcadores
El análisis de los lípidos como biomarcadores ha demostrado que provee
una vista cuantitativa y cualitativa dentro del mundo complejo de los
microorganismos en ambientes naturales. Este análisis es sensitivo y puede
medir la biomasa, la estructura de una comunidad y el estado fisiológico de las
comunidades microbianas (Kaur et al 2005). Usando esta metodología se puede
estudiar los cambios a través del tiempo de las comunidades microbianas,
producidos por perturbaciones químicas o físicas en el ambiente.
En la aplicación de la técnica de análisis de ácidos grasos de fosfolípidos o
conocida en inglés como Phospholipid Fatty Acid (PLFA), los lípidos presentes
en los microorganismos son aislados de muestras ambientales en una fase
mixta de cloroformo, metanol y agua (Bligh y Dyer 1959) luego, los fosfolípidos
18
son extraídos después del fraccionamiento de los lípidos totales (lípidos
neutrales, fosfolípidos y glicolípidos) asociados a una fase orgánica, en una
columna de silicio. Los residuos en la interfase orgánica: acuosa pueden ser
separados en lipopolisacáridos, ácidos tecóicos y ácido murámico (Vestal y
White 1989). Más tarde, un método más simple se desarrolló para extraer los
ácidos grasos directamente del suelo. Este protocolo llamado MIDI (Microbial ID,
Inc.) fue diseñado para extraer los ácidos grasos de cultivos puros de bacterias,
pero también ha sido utilizado para la extracción de los mismos en suelo (Sasser
1990). Con este método, las células en el suelo son saponificadas con calor y
con la adición de una base fuerte. En ambos métodos (PLFA y MIDI) los ácidos
grasos son sometidos a una metilación para formar los ácidos grasos metilados
o FAME (Fatty Acid Methyl Esther) por sus siglas en inglés, para ser
posteriormente analizados en un cromatógrafo de gas.
Recientemente, un método más simple que los anteriores se desarrolló
para economizar el esfuerzo empleado en el método de PLFA y resolver la
incertidumbre sobre la procedencia (organismos vivos o ácidos grasos libres) de
los ácidos grasos basados en el método MIDI. Este nuevo método emplea un
reactivo alcalino moderado para provocar la destrucción de las células y liberar
los ácidos grasos de sus lípidos una vez los enlaces esteres estén rotos. El
método conocido como EL (Ester Linked), ha podido exitosamente caracterizar
comunidades microbianas en suelos y agrupar dichas comunidades de forma
similar a aquellas generadas por métodos moleculares de ADN (Ritchie et al
2000). De igual manera, el método de extracción EL ha sido utilizado por
19
Schutter y Dick (2000) para caracterizar comunidades de suelos en distintas
condiciones tales como: tiempo de almacenamiento, temperatura y humedad.
Bajo este método se pudieron extraer ácidos grasos de cadenas largas
saturadas y cadenas ramificadas, insaturados y con grupos alicíclicos y metilos.
Este método demostró que se puede determinar la estructura microbiológica de
un suelo utilizando protocolos más simples y menos costosos. Además, pudieron
determinar que pueden ocurrir cambios en la composición del suelo a través del
tiempo si hay un almacenamiento apropiado de la muestra.
Biomarcadores funcionales y taxonómicos
Muchos lípidos están asociados con grupos taxonómicos o funcionales de
microorganismos y pueden proveer detalles de los tipos de organismos
presentes en una muestra ambiental (Frostergard y Bååth 1996). En la
publicación científica de Zelles (1997), se hace un examen de la composición
ácidos grasos de fosfolípidos en diferentes bacterias. Algunas de los propuestos
biomarcadores y su interpretación han sido colocadas en la tabla 2.02. Una
compilación similar se encuentran en las publicaciones de Findlay y Dobbs
(1993), Tunlid y White (1992), White et al (1997b) y Kaur et al (2005).
Los biomarcadores más efectivos están relacionados a ácidos grasos
raros los cuales son específicos a grupos particulares de organismos (Green y
Scow 2000). Es decir, que el uso de ácidos grasos individuales como
biomarcadores específicos para cada grupo microbiano presume, en el mejor de
los casos, que todos los miembros de ese grupo contienen ese lípido y los
miembros de otros grupos no. La mayoría de los estudios de los biomarcadores
20
han sido propuestos basados en el estudio de grupos de cultivos puros de
organismos específicos. De esta forma la decisión para asignar un biomarcador
es siempre tentativa, debido a que los ácidos grasos en los fosfolípidos se
pueden repetir en varios grupos de organismos (White et al 1997b). Para
superar esta debilidad, muchos estudios analizan los biomarcadores en conjunto
con otras técnicas moleculares como amplificación del gen 16s rDNA (Balkwill et
al 1998; Fredrickson et al 1995a) y la electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización conocida en inglés como denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) (White et al 1999). Además, también se han utilizado
técnicas bioquímicas como número más probable (NMP) (Ludvigsen et al1999) y
a través del análisis perfiles fisiológicos a nivel de comunidad (Lehman et al
1995).
21
Tabla 2.02. Resumen de los ácidos grasos empleados como biomarcadores
encontrados en la literatura (modificado de Zelles, 1999; Kaur et al 2005).
Grupo Biomarcador Referencia
Bacteria
Gram-positivos
Ácidos grasos ramificados: br 17:0,
br 18, i 17:0, a 17:0, i16:0, i16:1, 10
Me16:0, 10 Me17:0), isomeros iso y
anteiso de 15:0.
MUFA (ácidos grasos mono
insaturados < 20%: 16:1ω7c,
16:1ω5, 18:1ω7 y 19:1.
Zelles 1999; Paul y Clark
(1996); y O´Leary et al (1988)
Gram-negativas Ácidos grasos ciclopropanos: cy
17:0, cy 19:0
MUFA > 20% (16:1ω9, 16:1ω7c,
16:1ω5, 18:1ω7 y 19:1)
Ácidos con grupo hidróxido: 10:0
2OH, 12:0 2OH , 14:0 3OH, 15:0
3OH , 16:1 2OH y 18:1 2OH
Zelles (1999); Paul y Clark
(1996); O´Leary et al (1988);
Kieft et al (1994); Olsson et al
(1999), Ohtonen et al (1999);
White (1994); Parker et al
(1982).
Anaeróbios cy 17 :0 y cy 19:0 Vestal y White (1989)
Actinomicetos 10 Me 16:0, 10 Me 17:0 y 10 Me
18:0
Zelles (1999)
22
Tabla 2.02. Continuación.
Metanógenas
Tipo I
Tipo II
16:1ω8
18:1ω8
Nichols et al (1985); Bowman
et al (1993); Makula, (1978)
Sulfato reductoras cy 17:0 y 10 Me 16:0 sin altos
niveles de 10 Me18:0
Findlay et al (1990)
Eucariótas
Hongos
PUFA (Ácidos grasos
poliinsaturados): 18:2ω6 (ácido
linoleico)
Paul y Clark (1996); Federle,
(1986)
Hongos arbusculares
micorrizales
16:1ω5c Olsson et al (1999)
Protozoo 20:4w6,9,12,15c
20:2ω6, 20:3ω6, 20:4ω6
Paul and Clark (1996)
White (1983), White (1988)
Diatomeas 20:5ω3, 20:5ω5, Vestal y White (1989)
Procariotas y
Eucariotas
18:1ω7c Olsson et al (1999); Ohtonen
et al (1999)
Amplio espectro (no se
asignan a ningún grupo
taxonómico)
12:0, 15:0, 16:0, 17:0, 18:0, 20:0
Ratledge and Wilkinson
(1988); Niklaus et al (2003)
23
Estudios en muestras ambientales
Los biomarcadores de lípidos han sido ampliamente analizados en
muestras ambientales. La técnica PLFA y ácidos grasos con grupos de
hidróxidos fueron aplicadas por primera vez en comunidades acuáticas como
sedimentos así como también en suelos (Bobbie and White 1980; Federle et al
1983; King et al 1977; Odham et al 1985; Parker et al 1982;, Tunlid et al 1985;
White et al 1979). Desde entonces se ha aplicado la técnica para reportar como
los cambios ambientales afectan las comunidades microbianas. Actualmente se
han extendido las investigaciones a otros lugares como ambientes aéreos
cerrados (Sebastian y Larsson 2003), ambientes acuáticos (Forney et al2001;
Keinänen et al 2002) y hojarasca (Bray 2005 y Wilkinson et al 2002) donde aún
no existe mucha literatura. La siguiente tabla 2.03 resume algunas aplicaciones
y estudios realizados con los biomarcadores en distintos ambientes.
24
Tabla 2.03. Estudio realizados en distintos ambientes para medir los cambios y
composición de las comunidades microbianas.
Ambiente Estudio Referencias
Suelo Procesos geoquímicos Bull et al (2000)
Composición vegetal Borga et al (1994); Ibekwe and Kennedy, (1998);
Priha et al (1999)
Prácticas de manejo Bai et al (2000); Bossio and Scow, (1998);
Ibekwe et al (2001); Peacock et al (2001);
Steenwerth et al (2003); Yao et al (2000); Zelles
et al (1992); Zelles et al (1994); Zelles et al
(1995a); Zelles et al (1995b)
Sucesión en transectos
de bosques
Merilä et al (2002)
Distribución de árboles Saetre and Bååth, (2000)
Fertilidad de suelos Pennanen et al (1999)
Cambios climáticos Insam et al (1999); Ronn et al (2002);
Steinberger et al (1999); Zak et al (1996)
Calentamiento Pietikäinen et al (2000)
Cambios en pH Bååth et al (1992); Bååth et al (1995);
Frostegård et al (1993a); Pennanen et al
(1998ª); Pennanen et al (1998b)
25
Tabla 2.03.Continuación.
Contaminación de metales Fritze et al (2000); Frostegård et al (1993b);
Frostegård et al (1996); Khan y Scullion (2000);
Pennanen et al (1996)
Sedimentos Procesos geoquímicos Coleman et al (1993)
Diferentes profundidades Lehman et al (1995); Ringelberg et al (1997)
Trinchera de un volcán Guezennec and Fiala-Medioni, (1996)
Variación espacial y de
temporada
Smooth and Findlay, (2001)
Eutroficación Pinturier- Geiss et al (2002)
Contaminación con
mercurio
Macalady et al (2000)
Contaminación con
hidrocarburos
Fang y Barcelona (1998); Langworthy et al
(2002)
Aire Biomasa, composición y
estado fisiológico de
microbios aéreos
Macnaughton et al (1999); Sebastian y Larsson
(2003)
Sistemas de
agua
Plantas de tratamiento
para desechos
Forney et al (2001)
Patógenos en agua
potable
Alugupalli et al (1992); Slosárek et al (1996);
Walker et al (1993)
Hojarasca descomposición Bray (2005); Nakamura et al (2002); Wilkinson
et al (2002); Keinänen et al (2002)
26
Capítulo Tres
Material Y Métodos
Descripción del Lugar de Estudio y Diseño Experimental
El Bosque Nacional el Yunque conocido también como el Bosque
experimental de Luquillo, está localizado en la esquina noreste de Puerto Rico y
comprende cuatro zonas de vida que resultan de los cambios en elevación,
clima y características de suelo (Willig et al 1996). El estudio propuesto se
realizó en el bosque de tabonuco (Dacryodes excelsa) en la estación El Verde,
el cual está localizado en una de las zonas de vida clasificada como bosque
subtropical húmedo (ver apéndice A). La temperatura promedio mensual es de
21˚C en enero a 25˚C en septiembre (Brown et al1983). La precipitación anual
es poco cambiante (375.95 ± 79.47 cm) con valores bajos entre enero y abril
(19.57 ± 23.71 cm) y valores altos (35.01 ± 45.99 cm) en los meses restantes
(Brown et al 1983).
En El Verde se localiza el proyecto conocido en inglés como Canopy
Trimming Experiment. En este proyecto, auspiciado por la Fundación Nacional
de Ciencias, se establecieron tres bloques con cuatro parcelas de 30 x 30 m, los
cuales se eligieron de acuerdo a su similaridad en pendiente, características de
suelo, composición de especies y cobertura del dosel. Este tamaño de parcela
fue escogido para proveer suficiente espacio para tener un efecto de abertura
del dosel, y de esta manera estudiar las respuestas abióticas y bióticas en un
largo periodo de tiempo. El nivel de replicación ha probado ser suficiente para
medir las respuestas del ecosistema a manipulaciones de detritos en trabajos
27
previos conducidos en el bosque de Tabonuco (Zimmerman et al 1995b, Walker
et al 1996b). Las ramas de los árboles fueron cortadas sistemáticamente (ramas
de más de 10 centímetro de diámetro) por arbolistas profesionales en dos de las
parcelas para abrir el dosel del bosque. Con esta apertura del dosel, hubo un
aumento en la intensidad de luz y temperatura con una disminución en la
humedad relativa. Esta manipulación simuló el equivalente a la acción de un
huracán con vientos sostenidos de más de 150 km/h o un huracán categoría tipo
2 según la escala Saffir-Simpson. La recurrencia de este tipo de huracán es de
55-60 años en el Bosque Experimental de Luquillo (El Yunque) (Scatena &
Larsen 1991). Las otras parcelas no experimentaron ninguna manipulación del
dosel pero a uno se le añadió el detrito removido de otra de las parcelas donde
hubo poda.
A continuación se describen los tratamientos aplicados para cada parcela
(apéndice A):
1. El dosel fue podado y la biomasa removida, fue redistribuida en el suelo
del bosque. Esto simuló los cambios en el microclima (aberturas) y
redistribución de la materia orgánica creados por un huracán dentro de la
parcela (P+D).
2. El dosel fue podado y la biomasa removida fue eliminada. Esto simuló los
cambios en el microclima (aberturas) creados por el huracán sin la
asociación de cambios en la redistribución de biomasa (P-D).
3. El dosel no fue podado y la biomasa de aquella área podada (tratamiento
2), se añadió sobre el suelo del bosque. Esto simuló los cambios en la
28
redistribución de biomasa creados por el huracán sin la asociación de los
cambios del microclima (NP+D).
4. El dosel no fue podado y no se añadió biomasa al suelo del bosque. Esto
mantuvo las condiciones del bosque sin cambios como resultados de los
disturbios de un huracán. Esta última es la parcela control.
En cada una de las parcelas se realizaron medidas en un área de 20 x 20
m para minimizar el efecto de borde. De cada parcela se seleccionaron al azar
cinco sub-parcelas de 5 x 5 m. Estas consideraciones ayudaron a obtener una
mejor representación ecológica del área.
Los bloques fueron establecidos en octubre de 2002. Desde esta fecha
hasta mayo de 2004 se le considera como el periodo de pre-tratamiento (Pre).
La aplicación de los tratamientos comenzó en octubre de 2004 en el bloque B
seguido por bloque C en enero de 2005 y finalmente bloque A en marzo de
2005. La aplicación de los tratamientos duró aproximadamente dos meses y
medio. A este periodo se le conoce como post-tratamiento (post) y ocurrió desde
marzo 2005 hasta junio 2006.
Procedimiento para la Toma y el Manejo de las Muestras
Un total de 96 muestras de suelo y 96 de hojarascas fueron tomadas
durante el pre-tratamiento y el post-tratamiento. Se tomó una muestra de suelo
en cada sub-parcela, utilizando un tubo de carbono de polivinilo (5 cm de
diámetro por 10 cm de largo) previamente lavado con jabón y alcohol para
eliminar los ácidos grasos libres. Las cinco muestras se mezclaron para tener
una muestra representativa de cada parcela. Para poder extraer mejor los ácidos
29
grasos de las muestras y relacionar los resultados con otros estudios bajo los
mismos parámetros, se le removieron las rocas y raíces al suelo. Las muestras
fueron colocadas en bolsas estériles y se mantuvieron frías (-4˚C) en el campo
hasta que fueron colocadas en un refrigerador a -20˚C para evitar cambios en
composición de ácidos grasos (Shutter y Dick 2000). De igual forma se tomaron
alrededor de 20 g de hojarasca por cada punto de muestreo y se unieron en una
sola bolsa estéril la cual se colocó a una temperatura de -20˚C. Las hojas verdes
fueron eliminadas, solo aquellas con avanzado estado de descomposición
fueron utilizadas. Las muestras estuvieron almacenadas en un periodo menor de
dos meses antes de ser procesadas, para evitar cambios en la composición de
ácidos grasos en ambos sustratos. A cada muestra de suelo se le hizo pruebas
de humedad relativa y pH.
Extracción de Lípidos
Los lípidos se extrajeron directamente del suelo y la hojarasca utilizando
el método de extracción de ácidos grasos unidos a un enlace ester conocido en
inglés como Ester Linked Fatty Acid Methyl Ester (EL-FAME) descrito por
Schutter y Dick (2000). El procedimiento de extracción de lípidos emplea una
metilación alcalina moderada, la cual teóricamente, extrae los ácidos grasos
unidos al enlace ester y no lo ácidos grasos libres. Luego de extraer los ácidos
grasos, se limpiaron los mismos de componentes húmicos con una columna de
amilopropil (NH2). Las muestras se mantuvieron congeladas a -20 º C y en
oscuridad hasta el momento de su análisis en el cromatógrafo de gas.
30
Análisis de los Lípidos
Las muestras fueron analizadas en un cromatógrafo de gas (CG) marca
(Hewlett Packard 6890) con espectro de masas en las facilidades de
NERL/Ecosystem Research División de la EPA en Athens, Georgia. El CG fue
equipado con un detector de ionización de flama y una columna capilar HP5 (5%
phenyl methyl siloxane) con un diámetro de 200 μm y un largo de 50 m. El helio
fue utilizado como el gas portador a una razón de flujo de 0.9 ml min -1, y las
inyecciones fueron hechas en el modo Splitless. El Programa de temperatura
para la columna fue de 50 ºC por 1 min, 4 ºC min -1 por 40 min hasta 160 ºC y 93
ºC min -1 por 3 min hasta 280 ºC. La identificación inicial preliminar se realizó
acompañada de estándares conocidos de ácidos grasos. Además se utilizó en
las muestras un estándar interno (ácido araquídico o 20:0 EE a una
concentración de 25 ppm) para estimar la concentración de los ácidos grasos.
Nomenclatura
Los ácidos grasos son nombrados de acuerdo a la conversión X: Y ω Z,
donde X representa el número de carbonos en la cadena, seguido por un doble
punto donde la Y representa el número de instauraciones. El símbolo ω y Z
representan la posición del doble enlace relativo al terminal de la cadena
alifática. Los sufijos c y t representan los isómeros geométricos de instauración
cis y trans, respectivamente (Peacock et al 2001). Los prefijos i, a y 10Me se
refieren a las ramas en la posición iso, anteiso y el grupo metilo en el carbono
diez a partir del grupo carboxilo. Los ácidos grasos ciclo-propano y aquellos que
son ramificados con posición desconocida tienen los prefijos cy y br
31
respectivamente. El grupo hidróxido y su posición en la cadena son
representados por un OH precedido de un número el cual ubica su posición en la
cadena alifática.
Los grupos de EL-FAME identificados fueron agregados en grupos
principales: (1) ácidos grasos saturados (EL-SATFA) y (2) no saturados (EL-
UNSATFA). La siguiente tabla 3.01 resume la organización y la abreviación de
los ácidos grasos según su naturaleza estructural.
32
Tabla 3.01. Grupos de ácidos grasos y sus fracciones junto con sus
abreviaciones.
Grupos de EL-FAME Fracción Abreviación Ejemplos
Ácidos grasos saturados
(EL-SATFA)
Saturación normal EL-SA 11:0 ; 12:0 ; 13:0 ;
14:0; 15:0; 16:0
Ramificación en la
mitad de la cadena
(Me)
EL-MET 10Me16:0; 10Me17:0;
10Me18:0
Ramificación terminal
en la cadena (a o iso)
EL-BR i15:0; a15:0; i16:0;
i17:0; a17:0
Ramificación terminal
desconocida en la
cadena (br)
EL-UNBR Br16:0; Br18:0
Ramificación terminal
Hidroxilo
EL-HY 10:0 3OH
Ácidos grasos insaturados
(EL-UNSAFTA)
Ciclopropil (cy) EL-CICLO cy19:0
Cadenas
Monoinsaturadas
EL-MUFA 16:1ω9c
Cadena
Poliinsaturadas
EL-PUFA 18:2ω6
33
Cálculos y Análisis Estadísticos
Se escogieron dos medidas estadísticas para determinar si las
comunidades microbianas y la concentración de sus ácidos grasos, difierian
entre el período antes y después de la aplicación del tratamiento en el bosque, y
si difierian entre los bloques y sustratos observados (suelo versus hojarasca). El
análisis de varianza (ANOVA) fue utilizado para determinar la diferencia
significativa entre la abundancia total (µmol g-1 de sustrato seco) y relativ (%
Mol) de cada ácido graso observado entre los tratamientos a lo largo del periodo
antes y después de la manipulación. Además, el análisis de varianza se aplicó
para determinar si existían diferencias significativas entre la de proporción
hongo: bacteria, grupos taxonómicos, proporción Gram+: Gram- durante el
periodo de pre- y post-tratamiento (Tabla 3.02). Cuando los grupos de datos no
cumplían con la curva normal de distribución se utilizó la prueba de Diferencia
Honestamente Significativa (DHS) Kruskal-Wallis. También se utilizaron las
pruebas t para grupos de datos pareados para determinar los efectos de la
manipulación en cada tratamiento en el periodo antes y después de la aplicación
de los mismos.
Para los datos de composición de comunidad microbiana, se aplicó el
análisis de componente principal (PCA) utilizando la fracción molar de los ácidos
grasos que fueron encontrados consistentemente en todas las muestras, y que
representan grandemente grupos microbianos. Los ácidos grasos que en la
suma total aparecían en menos de 1% Molar, fueron eliminados del análisis. Una
vez adquirido el primer y segundo componente principal, se aplicó un ANOVA
34
para determinar si las puntaciones de las muestras en los ejes de los
componentes principales son significativamente distintas.
Tabla 3.02. Proporciones de EL-FAME utilizados en el análisis de datos.
Organismos Definición Referencia
Hongo/Bacteria 18:2ω6 / i15:0 + a15:0 + 15:0 +
i16:0 + 16:1ω7t + i17:0 + a17:0 +
cy17 + 17:0 + 18:1ω7c + cy19:0
Frostergard y Bååth
(1996)
Gram + i15:0 + a15:0 + i16:0 + i17:0 +
a17:0
Zelles 1997); White et
al (1996)
Gram - cy17:0 + cy19:0 + 18:1ω7c +
17:1ω7 + 16:1ω7t
White et al (1996);
Zelles, (1997)
Hongo 18:2ω6 Frostegard et al
(1993); Zelles (1997)
Actinomicetos 10Me16:0 + 10Me18:0 Zelles et al (1994)
Protozoarios 20:3ω6 White et al (1996)
35
Los cálculos para las medidas estadísticas fueron realizados utilizando
los Programas MINITAB® Release 14 (© Minitab inc, 1972-2003) y Microsoft®
Office Exell 2003 (© Corporación Microsoft, 1985-2003) desarrollado para el
sistema operativo Microsoft Windows XP Profesional.
36
Capítulo Cuatro
Análisis de Resultados
Perfiles de El-FAME en Suelo y Hojarasca en las Muestras Antes de la
Aplicación de los Tratamientos
En la tablas 6 y 7 se presenta la distribución de los promedios (% Mol)
para los EL-FAME encontrados en suelo y hojarasca en los bloques A, B y C
durante la etapa de pre-tratamiento. Un total de 47 y 49 ácidos grasos fueron
encontrados en las fracciones de suelo y hojarasca, respectivamente. El ácido
palmítico (16:0) fué el más abundante en ambas fracciones con un gran
porciento molar (entre los bloques) de 19.8 ± 1.15 (promedio ± desviación
estándar) en suelo y 29.8 ± 3.86 en hojarasca. Además del ácido palmítico, otros
ácidos grasos comunes fueron encontrados en ambas fracciones como por
ejemplo, 12:0, 14:0, i15:0, i16:0, 16:1ω5, 18:2ω6, 18:1ω9, 18:1ω7 y 18:0. Éstos
a su vez representan el 40.1% y 48.7% de la totalidad de ácidos grasos en las
muestras de suelo y hojarasca, respectivamente.
En la figura 4.01 se presenta la abundancia relativa de los grupos de
ácidos grasos encontrados en suelo. En este sustrato, los ácidos grasos
saturados clasificados como EL-SA, fueron encontrados en grandes cantidades
seguidos por los EL-MUFA y EL- BR, en donde el promedio se encuentra por
encima del 15 % de la abundancia relativa total. Sin embargo, por debajo del 11
% se encontraron los siguientes grupos de ácidos grasos en este orden: EL-
CICLO (11.5%), EL-MET (5.4%), EL-UNBR (4.6%), EL-PUFA (3.9%) y EL-HY
37
(0.18%). Según el análisis de varianza Kruskal-Wallis de una vía realizado
individualmente para cada uno de los ácidos grasos, existen diferencias variadas
en términos de temporada y entre los bloques (tabla 4.01 y figura 4.01). En este
sustrato los resultados de esta prueba estadística en el promedio (n = 16) de
grupos de ácidos grasos revela que existen diferencias significativas entre las
fechas muestreadas pero no en el bloque muestreado en EL-SA (temporada H3
= 22.1, p < 0.01; bloque H2 = 1.05, p = 0.54), EL-BR (temporada H3= 18.4, p <
0.01; bloque H2 = 1.98, p = 0.37), EL-CICLO (temporada H3 = 10.9, p = 0.01;
bloque H2 = 2.95, P = 0.23) y EL-UNBR (temporada H3 = 10.5, P = 0.02; bloque
H2 = 2.26, p = 0.32). Sin embargo, sí existen diferencias significativas en
términos de bloque y no de temporada para los grupos de ácidos grasos EL-
MET (temporada H3 = 0.86, p = 0.83; bloque H2 = 6.56, p = 0.04) y EL-PUFA
(temporada H3 = 0.88, p = 0.83; bloque H2 = 16.0, p < 0.01). En el caso de EL-
HY no existen diferencias significativas en términos de temporada o bloque
(temporada H3 = 3.72, p = 0.29; bloque H2 = 1.08, p = 0.58).
38
Tabla 4.01. Promedio de abundancia relativa de los EL-FAME para cada bloque
en muestras de suelo del periodo de pre-tratamiento. (promedio ± desviación
estándar; n = 16).
Factores a
(Valores)
Bloques
Bloque Temporada
EL-FAME A B C H2 (p) H3 (p)
EL-SA
11:00
0.56 ± 0.23 0.75 ±0.46 1.14 ± 1.00
5.71(0.06) 1.0(0.80)
12:00
2.96 ± 0.53 2.49 ± 0.52 2.42 ± 0.55
3.82(0.15) 3.08(0.38)
13:00
0.03 ± 0.07 0.05 ± 0.10 0.03 ± 0.05
0.43(0.81) 2.83(0.42)
14:00
1.75 ± 0.22 1.88 ± 0.36 1.82 ± 0.30
3.93(0.14) 4.58(0.21)
15:00
1.15 ± 0.13 1.11 ± 0.13 1.18 ± 0.21
6.23(0.04)b 1.64(0.66)
16:00
19.9 ± 1.12 19.5 ± 1.13 20.0 ± 1.23
7.74(0.02)b 5.65(0.13)
17:00
0.63 ± 0.08 0.59 ± 0.05 0.65 ± 0.14
8.96(0.01)b 4.07(0.25)
18:00
4.39 ± 0.21 4.17 ± 0.30 4.34 ± 0.33
7.75(0.02)b 5.90(0.12)
19:00
0.16 ± 0.01 0.18 ± 0.08 0.16 ± 0.06
2.73(0.26) 3.11(0.38)
20:00
0.73 ± 0.14 1.00 ± 0.20 0.81 ± 0.33
8.12(0.02)b 7.66(0.05)
b
22:00
1.49 ± 0.58 1.82 ± 0.45 1.72 ± 0.43
5.48(0.07) 16.9(0.00)b
24:00:00 0.83 ± 0.46 1.73 ± 2.05 0.85 ± 0.17 2.62(0.27) 16.5(0.00)b
EL-BR
i15:0
6.15 ± 0.56 7.25 ± 0.61 6.92 ± 0.69
15.3(0.00)b 2.43(0.49)
a15:0
2.71 ± 0.25 2.43 ± 0.21 2.62 ± 0.33
14.0(0.00)b 1.83(0.61)
39
Tabla 4.01. Continuación.
i16:0
4.95 ± 0.32 5.01 ± 0.39 4.82 ± 0.48
4.50(0.11) 2.28(0.52)
i17:0
3.64 ± 0.49 3.55 ± 0.32 3.26 ± 0.39
3.26(0.20) 3.83(0.28)
a17:0
2.02 ± 0.23 1.98 ± 0.20 1.90 ± 0.26
5.56(0.06) 1.92(0.59)
i19:0 0.12 ± 0.04 0.15 ± 0.04 0.14 ± 0.05 8.76(0.01) 3.39(0.34)
EL-CICLO
cy17:0
0.26 ± 0.07 0.38 ± 0.04 0.38 ± 0.11
19.4(0.00)b 2.69(0.44)
cy19:0 10.9 ± 1.51 11.6 ± 1.24 11.0 ± 1.27 6.89(0.03)b 2.40(0.49)
EL-MET
10Me 16:0
3.23 ± 0.68 2.45 ± 0.92 3.16 ± 0.79
13.8(0.00)b 2.44(0.49)
10Me 18:0 2.48 ± 0.28 2.53 ± 0.25 2.36 ± 0.21 5.18(0.08) 2.22(0.53)
EL-UNBR
br 14:0
0.39 ± 0.02 0.40 ± 0.04 0.55 ± 0.67
9.93(0.01) 0.79(0.85)
br16:0
0.17 ± 0.02 0.10 ± 0.07 0.12 ± 0.07
11.2(0.00)b 0.60(0.90)
br 17:0
0.45 ± 0.16 0.44 ± 0.09 0.49 ± 0.49
0.07(0.97) 4.19(0.24)
br 18:0a
1.44 ± 0.32 1.51 ± 0.23 1.21 ± 0.35
0.03(0.98) 3.79(0.29)
br 18:0b
0.79 ± 0.09 0.87 ± 0.10 0.80 ± 0.11
4.21(0.12) 2.22(0.53)
br 19:0
1.06 ± 0.31 0.90 ± 0.16 0.90 ± 0.28
4.77(0.09) 3.18(0.37)
br 20:0 0.38 ± 0.15 0.47 ± 0.15 0.39 ± 0.13 2.55(0.28) 2.64(0.45)
EL-HY
2OH-10:0
0.05 ± 0.08 0.04 ± 0.08 0.05 ± 0.09
0.09(0.95) 1.05(0.79)
2OH-12:0
-- -- -- -- -- --
na na
3OH-12:0
-- -- 0.01 ± 0.03 -- --
na na
2OH-14:0
0.07 ± 0.06 0.10 ± 0.11 0.09 ± 0.09
1.46(0.48) 6.24(0.100)
40
Tabla 4.01. Continuación.
3OH-14:0
-- -- 0.01 ± 0.04 -- --
na na
2OH-16:0
0.01 ± 0.06 0.06 ± 0.24 -- --
1.02(0.60) 2.04(0.56)
2OH-cy19:0 -- -- 0.02 ± 0.05 0.05 ± 0.19 2.00(0.37) 3.71(0.29)
EL-MUFA
16:1w7c
1.03 ± 0.04 1.14 ± 0.22 1.14 ± 0.08
10.8(0.01)b 3.06(0.38)
16:1w7t
0.13 ± 0.07 0.20 ± 0.22 0.16 ± 0.09
6.19(0.05)b 0.38(0.94)
16:1w5
3.89 ± 0.42 3.82 ± 0.30 4.07 ± 0.32
12.7(0.00)b 2.19(0.53)
17:1w7c
0.20 ± 0.09 0.22 ± 0.03 0.23 ± 0.10
3.32(0.20) 4.39(0.22)
18:1w9
9.30 ± 1.23 7.98 ± 0.80 9.02 ± 1.25
9.69(0.01)b 6.08(0.01)
b
18:1w7
3.78 ± 0.31 4.27 ± 0.61 3.80 ± 0.49
7.26(0.03)b 4.60(0.03)
b
18:1w5
1.31 ± 0.22 1.45 ± 0.32 1.41 ± 0.25
7.90(0.02)b 5.40(0.15)
22:01 -- -- -- -- -- -- na na
EL-PUFA
18:3w6
0.29 ± 0.09 0.37 ± 0.17 0.23 ± 0.04
1.02(0.60) 5.47(0.14)
18:2w6
3.25 ± 0.62 2.61 ± 0.40 3.07 ± 0.50
13.9(0.00)b 4.28(0.23)
20:5w3
0.24 ± 0.19 0.12 ± 0.07 0.19 ± 0.25
5.31(0.07) 10.9(0.01)b
20:3w6
0.51 ± 0.50 0.19 ± 0.04 0.19 ± 0.02
4.44(0.11) 1.74(0.63)
20:3w3 0.19 ± 0.12 0.11 ± 0.12 0.18 ± 0.21 6.44(0.04)b 3.03(0.39)
aANOVA de un factor Kruskal-Wallis
bdiferencia significativa
-- = por de debajo de los límites de detección
na = no aplica
41
Figura 4.01. Promedio de abundancia relativa (+ error estándar) de clases de
ácidos grasos en suelo (n = 16) obtenidas durante el periodo de pre-tratamiento.
El asterisco (*) en el grupo de columnas, representa que no existen diferencias
significativas (ANOVA de un factor Kruskal-Wallis) en términos de bloque (p >
0.05) pero sí en términos de temporada (p < 0.05). Dos asteriscos (**) seguidos
representa que existen diferencias significativas (ANOVA de un factor Kruskal-
Wallis) en términos de bloque (p < 0.05) y no en términos de temporada (p >
0.05).
Los ácidos grasos en hojarasca EL-SA son más abundantes que en el
suelo con un promedio de distribución mayor al 45% (figura 4.02). El promedio
de los EL-MUFA está alrededor del 24% seguido por los EL-PUFA con un 15%.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
SA BR MET UNBR HY MUFA PUFA CICLO
EL-SATFA EL-UNSATFA
% M
ol
Categorías de ácidos grasos
Bloque A Bloque B Bloque C*
*
*
**
*
*
****
42
Este último representa un 11% mayor que el mismo grupo en el sustrato de
suelo. Gran parte de la diferencia en EL-PUFA es debido a la presencia del EL-
FAME 18:2ω6, el cual es representativo de hongos. Por debajo del 10% se
encuentran el resto de los grupos de ácidos grasos en el siguiente orden:
ELSATFA BR (6.1%), EL-HY (2.2%), EL-MET (1.4%), EL-CICLO (1.0%) y EL-
UNBR (0.95%). En esta fracción de sustrato, estos últimos grupos de ácidos
grasos mencionados excepto EL-HY, disminuyeron dramáticamente en
comparación con la fracción de suelo. Esta variación entre las fracciones (suelo
y hojarasca) concuerda con la naturaleza intrínseca de cada sustrato y la
distribución de los microorganismos de acuerdo con su afinidad al sustrato.
43
Tabla 4.02. Promedio de abundancia relativa de los EL-FAME para cada bloque
en muestras de hojarasca del periodo de pre-tratamiento. (Promedio ±
desviación estándar; n = 16).
Factores a
(Valores)
Bloques
Bloque Temporada
EL-FAME A B C H2 (p) H3 (p)
EL-SA
11:00
1.05 ± 0.91 1.12 ± 0.95 1.48 ± 0.87
30.0(0.22) 11.3(0.01)b
12:00
2.67 ± 1.05 2.42 ± 1.63 2.81 ± 1.56
0.73(0.69) 12.2(0.01)b
13:00
0.16 ± 0.08 0.52 ± 1.38 0.20 ± 0.08
5.06(0.08) 20.0(0.00)b
14:00
4.43 ± 1.45 3.56 ± 1.12 3.68 ± 0.43
0.11(0.95) 15.0(0.00)b
15:00
1.09 ± 0.18 1.03 ± 0.31 1.23 ± 0.25
1.73(0.42) 14.9(0.00)b
16:00
30.5 ± 4.94 28.6 ± 3.07 28.5 ± 2.60
1.08(0.58) 13.7(0.00)b
17:00
1.24 ± 0.31 1.06 ± 0.35 1.10 ± 0.24
0.18(0.92) 16.0(0.01)b
18:00
5.24 ± 1.60 5.33 ± 1.00 5.07 ± 2.09
1.26(0.53) 13.0(0.01)b
19:00
0.24 ± 0.24 0.28 ± 0.36 0.17 ± 0.05
0.89(0.64) 18.2(0.00)b
20:00
1.04 ± 0.52 1.38 ± 0.61 1.51 ± 0.53
5.25(0.07) 10.4(0.02)b
22:00
1.33 ± 0.76 1.10 ± 0.45 1.46 ± 0.57
3.38(0.19) 11.9(0.01)b
24:00 0.99 ± 0.60 2.02 ± 3.32 1.30 ± 0.95 3.15(0.21) 14.6(0.00)b
EL-BR
i15:0
2.63 ±1.20 2.36 ± 0.72 2.56 ± 0.67
1.570.50) 8.33(0.04)b
44
Tabla 4.02. Continuación.
a15:0
0.76 ± 0.69 0.55 ± 0.28 0.67 ± 0.24
0.76(0.68) 14.37(0.00)b
i16:0
1.84 ± 1.06 1.46 ± 0.46 1.78 ± 0.46
1.29(0.53) 9.04(0.03)b
i17:0
0.80 ± 0.84 0.59 ± 0.22 0.59 ± 0.18
0.65(0.72) 7.07(0.07)
a17:0
0.71 ± 0.49 0.49 ± 0.13 0.47 ± 0.09
1.18(0.55) 10.5(0.02)
i19:0 0.07 ± 0.06 0.07 ± 0.05 0.07 ± 0.06 1.08(0.58) 7.00(0.07)
EL-CICLO
cy17:0
0.33 ± 0.12 0.31 ± 0.12 0.38 ± 0.10
1.81(0.18) 1.66(0.19)
cy19:0 0.73 ± 0.55 0.75 ± 0.64 0.60 ± 0.73 0.26(0.77) 0.72(0.55)
EL-MET
10Me 16:0
0.93 ± 0.77 1.06 ± 0.50 1.13 ± 0.56
0.93(0.41) 5.47(0.00)b
10Me 18:0 0.42 ± 0.61 0.25 ± 0.08 0.33 ± 0.20 0.84(0.44) 1.19(0.33)
EL-UNBR
br 14:0
0.31 ± 0.12 0.30 ± 0.12 0.34 ± 0.10
0.63(0.54) 7.43(0.00)b
br16:0
0.02 ± 0.04 0.01 ± 0.05 0.02 ± 0.09
0.11(0.89) 1.06(0.38)
br 17:0
0.14 ± 0.15 0.10 ± 0.10 0.17 ± 0.20
0.97(0.39) 4.33(0.01)b
br 18:0a
0.14 ± 0.33 0.11 ± 0.09 0.11 ± 0.05
0.18(0.83) 1.04(0.39)
br 18:0b
0.25 ± 0.19 0.23 ± 0.14 0.30 ± 0.14
1.02(0.37) 1.62(0.20)
br 19:0
0.09 ± 0.21 0.05 ± 0.05 0.13 ± 0.32
0.61(0.55) 3.65(0.02)b
br 20:0 0.02 ± 0.07 -- -- 0.01 ± 0.03 1.21(0.31) 0.76(0.52)
EL-HY
2OH - 10:0
0.05 ± 0.09 0.03 ± 0.05 0.07 ± 0.10
1.48(0.24) 2.19(0.11)
2OH - 12:0
0.04 ± 0.08 0.06 ± 0.10 0.09 ± 0.13
1.06(0.36) 3.45(0.03)b
3OH - 12:0
0.04 ± 0.07 0.06 ± 0.09 0.05 ± 0.08
0.19(0.83) 1.60(0.21)
45
Tabla 4.02. Continuación. 2OH - 14:0
1.12 ± 0.78 1.28 ± 0.53 1.16 ± 0.53
0.68(0.51) 15.6(0.00)b
3OH - 14:0
0.02 ± 0.05 0.02 ± 0.05 0.07 ± 0.21
1.35(0.27) 1.96(0.14)
2OH - 16:0
-- -- -- -- 0.01 ± 0.03
na na
2 OH - cy19:0 0.27 ± 0.73 1.06 ± 1.29 1.05 ± 1.63 2.16(0.13) 2.76(0.06)
EL-MUFA
16:1w7c
1.37 ± 0.39 1.63 ± 0.41 1.74 ± 0.31
6.45(0.00)b
5.48(0.00)b
16:1w7t
0.08 ± 0.06 0.11 ± 0.04 0.13 ± 0.03
5.35(0.01)b
0.06(0.98)
16:1w5
2.47 ± 1.44 1.77 ± 0.70 1.61 ± 0.92
1.2(0.00)b
32.4 (0.00)b
17:1w7c
0.50 ± 0.21 0.48 ± 0.10 0.55 ± 0.12
1.37(0.27) 8.28(0.00)b
18:1w9
10.3 ± 3.36 12.4 ± 2.56 12.3 ± 1.68
3.17(0.05)b
0.27(0.85)
18:1w7
5.95 ± 4.58 5.63 ± 2.94 4.49 ± 2.35
1.19(0.32) 3.77(0.02)b
18:1w5
3.13 ± 1.91 4.17 ± 3.16 1.94 ± 1.15
5.94(0.01)b
6.15(0.00)b
22:01 0.02 ± 0.03 0.03 ± 0.04 0.27 ± 0.99 0.98(0.39) 1.14(0.35)
EL-PUFA
18:3w6
0.18 ± 0.09 0.23 ± 0.08 0.24 ± 0.09
9.18(0.00)b
35.4(0.00)b
18:2w6
13.2 ± 6.82 13.0 ± 4.50 15.2 ± 5.23
0.77(0.47) 2.64(0.06)
20:5w3
0.15 ± 0.09 0.37 ± 0.33 0.27 ± 0.29
7.91(0.01)b
18.8(0.00)b
20:3w6
0.26 ± 0.09 0.22 ± 0.10 0.23 ± 0.10
0.65(0.53) 0.24(0.87)
20:3w3 0.40 ± 0.34 0.36 ± 0.19 0.35 ± 0.19 0.19(0.83) 3.96(0.02)b
aANOVA de un factor Kruskal-Wallis
bdiferencia significativa
-- = por de debajo de los límites de detección
na = no aplica
Según el ANOVA de una vía Kruskal-Wallis realizado en los datos de
hojarasca, existen diferencias significativas en el promedio (n = 16) de grupos de
46
ácidos grasos en términos de temporada pero no en bloque, en cual se incluyen
EL-BR (temporada H3 = 11.6, p < 0.011; bloque H2 = 2.57, p = 0.26), EL-MET
(temporada H3 = 10.46, p = 0.02; bloque H2 = 3.84, p = 0.15), EL-UNBR
(temporada H3 = 18.5, p < 0.01; bloque H2 = 1.67, p = 0.43), EL-PUFA
(temporada H3 = 8.58, p = 0.04; bloque H2 = 2.39, p = 0.30) y EL-HY (temporada
H3 = 8.07, p = 0.05; bloque H2 = 0.09) (figura 4.02). No se encontraron
diferencias significativa en los grupo EL-SA (temporada H3 = 6.50, p = 0.09;
bloque H2 = 0.97, p = 0.62), EL-CICLO (temporada H3 = 2.31, p = 0.51; bloque
H2 = 0.19, p = 0.91) y EL-MUFA (temporada H3 = 4.17, p = 0.24; bloque H2 =
5.50, p = 0.06).
******a100%
***b******a100%
***b******a100%
***b******a100%
***b******a***b50******a***b
47
Figura 4.02. Promedio de abundancia relativa (+ error estándar) de clases de
ácidos grasos en hojarasca (n = 16) obtenidos durante el periodo de pre-
tratamiento. El símbolo (*) en el grupo de columnas, representa que existen
diferencias significativas en términos de temporada (ANOVA de un factor
Kruskal-Wallis, p < 0.05) pero no en términos de bloque (p > 0.05)
0
10
20
30
40
50
60
SA BR MET UNBR HY MUFA PUFA CICLO
EL-SATFA EL-UNSATFA
% M
ol
Categorías de ácidos grasos
Bloque A Bloque B Bloque C
**
* *
**
*
**
*
48
Concentración de EL-FAME en Suelo y Hojarasca (Pre- y Post-Tratamiento)
Suelo y Hojarasca en el tratamiento control
La concentración promedio total de EL-FAME (n = 24) en hojarasca (1.69
± 0.76 µmol g-1 peso seco) durante el periodo de pre- y post-tratamiento en el
control es mayor que en suelo (0.62 ± 0.13 µmol g-1 peso seco) (figura 4.03). El
ANOVA de una vía nos indica que la variación de la concentración promedio
total en el suelo es significativa en términos de bloque, pero no se observó un
efecto de temporada (bloque F2, 21 = 5.11, p = 0.02; temporada F7, 16 = 1.23, p =
0.34). En este sustrato, el bloque C es significativamente mayor en la
concentración promedio total (0.72 ± 0.14, n = 8) seguido por los bloques B (0.59
± 0.10, n = 8) y A (0.54 ± 0.09, n = 8). En hojarasca ocurre todo lo contrario, bajo
el mismo análisis de ANOVA la diferencia significativa se observa en temporada
pero no en bloque (temporada F7, 16 = 2.80, p = 0.04; bloque F2, 21 = 0.21, p =
0.82). El mes más bajo en concentración promedio en este sustrato lo fue
noviembre de 2002 (0.93 ± 0.51 µmol g-1 peso seco, n = 3) y el mes con mayor
concentración lo fue junio de 2006 (2.61 ± 0.55 µmol g-1 peso seco, n = 3). En la
figura 4.03 se observó que la concentración total en hojarasca aumenta luego de
agosto de 2005. Estos datos nos sugieren que puede existir un efecto de
temporada sobre la biomasa microbiana en la descomposición de la hojarasca,
pero que la misma no varía según la localidad en el bosque.
49
Figura 4.03. Comparación de la variación de la concentración promedio total (±
error estándar) de EL-FAME en el control entre suelo y hojarasca (n = 3) durante
el pre- y post-tratamiento. La línea entrecortada divide el periodo pre del post-
tratamiento.
Suelo
La variación de la concentración a través del tiempo de EL-FAME de
suelo entre los tratamientos se muestra en la figura 4.04. Los meses con menor
concentración promedio entre los tratamientos fueron diciembre de 2005 y
marzo de 2006 (0.54 ± 0.17 y 0.45 ± 0.08, n = 12 respectivamente). Para
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
pro
me
dio
(u
mo
l/g
por
peso
se
co
)
Mes y Año
Suelo
Hojarasca
50
conocer el efecto de la temporada y el tratamiento sobre la variación del
promedio total de la concentración de lípidos (n = 3) durante el periodo antes y
después de la manipulación, se realizó un análisis de varianza Kruskal-Wallis
de una vía. En general, se encontró que en las muestras del pre-tratamiento, no
hay diferencias significativa entre los meses de observación ni entre los
tratamientos (temporada H3 = 2.10, p = 0.55; tratamiento H3 = 4.09, p = 0.25, n
= 12). Sin embargo, durante el periodo del post-tratamiento, sí se encontraron
diferencias significativas en términos de temporada, pero no entre los
tratamientos (temporada H3 = 18.8, p < 0.01; tratamiento H3 = 0.63, p = 0.89, n
= 3). Esto nos sugiere que la concentración total de lípidos de microorganismos
en el suelo puede variar con respecto al tiempo y esa concentración no es
distinta entre los tratamientos. En el análisis individual de cada grupo de
parcelas en tratamiento, se encontró que las áreas de poda y adición de
biomasa vegetal (P+D) existen diferencias significativas entre las temporadas
(ANOVA de una vía, F7, 16 = 6.77, p < 0.01), siendo los meses de diciembre de
2005, marzo y junio de 2006 los más bajos en promedio (0.41± 0.13, 0.41 ±
0.02 y 0.58 ± 0.14 µmol g-1 peso seco respectivamente). En el resto de los
tratamientos, no se encontró diferencia significativa en temporada (ANOVA de
una vía; Control F7, 16 = 1.23, p = 0.34; NP+D F7, 16 = 1.19, p = 0.36; P-D F7, 16 =
1.03, p = 0.45). No obstante, y pese a que no se encontraron estas diferencias
en P-D, si existen diferencias significativas en términos de bloque (ANOVA de
una vía, F2, 21 = 4.04, p = 0.03), donde el bloque C es más alto en la
concentración promedio (0.83 ± 0.31, n = 8) sobre el bloque B y A (0.63 ± 0.18
51
y 0.51 ± 0.16 respectivamente) durante el periodo de pre- y post-tratamiento.
Este hallazgo nos indica la variabilidad que existe y ha sido observada desde
principio de este estudio entre los bloques, el cual impide hasta cierto punto,
ver el efecto de temporada debido al amplio error en las muestras. En él
tratamiento P+D, se observó una disminución significativa de la concentración
luego del mes de agosto 2005, específicamente en el mes de diciembre 2005
(prueba t de dos vías T3 = 4.62, p = 0.02, n = 3). A pesar de esto, para el mes
de junio de 2006 ocurrió un aumento donde el promedio de la concentración de
EL-FAME total alcanzó 0.58 ± 0.14 µmol g-1 peso seco. Por último, en el
tratamiento poda menos biomasa vegetal (P-D), no reflejó diferencia
significativa en términos de temporada (ANOVA de una vía F7, 16 = 1.03, p =
0.45), ocurrió un patrón similar a P+D donde la concentración promedio (n = 3)
mostró una disminución en los meses de diciembre de 2005 (0.49 ± 0.29 µmol
g-1 peso seco) y marzo de 2006 (0.48 ± 0.11 µn mol g-1 peso seco) y un
aumento en junio 2006 (0.60 ± 0.20 µmol g-1 peso seco).
52
Figura 4.04. Concentración promedio (± error estándar) del total de EL-FAME (n
= 3) en suelo para cada tratamiento durante el periodo del pre- y post-
tratamiento. Barras de error representan el error estándar de la media. La línea
entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del post (derecha) tratamiento.
En la tabla 4.03 se muestran los promedios de concentración de El-FAME
(µmol g-1 peso seco) para cada grupo taxonómico durante el periodo pre- y post-
tratamiento en suelo. Según la prueba t de datos pareados realizada sobre los
promedios de los tratamientos en los periodos pre y post para los protozoos,
Gram + y Gram -, no existen diferencias significativas en términos del periodo de
muestreo. Por el contrario, los actinomicetos y los hongos reflejaron diferencias
significativas bajo el mismo análisis. En actinomicetos la diferencia significativa
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
µm
ol g
-1 s
uelo
se
co
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
53
se observó en las parcelas P+D, (t = 2.50, p = 0.03) y en hongos las diferencias
se observaron en las parcelas P+D (t = 3.58, p < 0.01) y P-D (t = 3.21, p = 0.01).
En la figura 4.05 se presenta la variación de la concentración del marcador de
hongos 18:2ω6 a través del tiempo. Durante los dos periodos de tratamiento, no
se observó diferencias significativas en la concentración total promedio del
marcador de hongos entre los meses de muestreo en las parcelas control,
NP+D, P-D (ANOVA de una vía F7, 16 = 0.93, p = 0.51, F7, 16 = 1.72, p = 0.17 y F7,
16 = 2.21, p = 0.09, respectivamente). Sin embargo se encontró diferencias en el
tratamiento P+D (ANOVA de una vía, F7, 16 = 3.81, p = 0.01), donde la
concentración más baja para este marcador ocurrió en los meses de diciembre
2005 a junio de 2006 (promedio 0.01 ± 0.00, µmol g-1 peso seco). En el
tratamiento control fue el único donde se observó que el bloque B es
estadísticamente más distinto en comparación con los otros bloques en el
promedio (n = 3) total de concentración de la concentración del ácido graso
18:2ω6 (0.02 ± 0.00 µmol g-1 peso seco). No obstante, las parcelas con el
tratamiento P-D, aunque no mostraron diferencias entre sus bloques ni en
temporada (ANOVA de una vía F7, 16 = 2.48, p = 0.11 y F7, 16 = 2.21, p = 0.09,
respectivamente), se distingue una reducción de la concentración durante los
meses de agosto 2005 a junio de 2006 a un promedio (n = 12) de 0.01 ± 0.00
µmol g-1 peso seco. Este patrón se repite similarmente en las parcelas P+D. En
general, no existen diferencias significativas en la concentración del ácido graso
18:2𝜔6 entre los tratamientos durante el periodo de pre-tratamiento (Kruskall-
Wallis de una vía, H3 = 5.40, p = 0.15) pero sí en el periodo de post-tratamiento
54
(Kruskall-Wallis de una vía, H3 = 9.16, p = 0.03). Esta diferencia ocurre en
especial en los tratamientos P+D y P-D, los cuales disminuyen en el mes de
diciembre de 2005 luego de la aplicación de los tratamientos en el bosque.
55
Tab
la 4
.03.
Pro
med
io d
e c
on
ce
ntr
ació
n (
µm
ol g
-1 p
eso s
eco
) d
e g
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re-
y p
ost-
tra
tam
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pro
me
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± d
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n e
stá
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n =
12
).
NP
+D
T(p
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0
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-0
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0.9
4)
1
.69
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-0
.08 (
0.9
4)
1
.92
(0
.08)
a P
rue
ba t
para
dato
s p
are
ados
b D
ifere
ncia
sig
nific
ativa
PO
ST
0
.12
2 ± 0
.03
1
0
.11
1 ± 0
.03
0
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5 ± 0
.00
3
0
.00
2 ± 0
.00
1
0
.02
9 ± 0
.00
9
PR
E
0
.13
1 ±
0.0
27
0
.11
0 ± 0
.02
8
0
.01
8 ± 0
.00
4
0
.00
2 ± 0
.00
2
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.03
5 ± 0
.00
6
Co
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ol
T
(p)a
-0
.37 (
0.7
2)
-1
.41 (
0.1
9)
1
.93
(0
.08)
-0
.76 (
0.4
7)
0
.03
5 ± 0
.01
4
PO
ST
0
.12
1 ± 0
.03
2
0
.11
7 ± 0
.03
5
0
.01
7 ± 0
.00
3
0
.00
3 ± 0
.00
5
0
.03
5 ± 0
.01
4
PR
E
0
.11
8 ± 0
.02
1
0
.10
4 ± 0
.02
1
0
.01
9 ± 0
.00
4
0
.00
2 ± 0
.00
2
0
.03
3 ± 0
.00
8
Taxó
n
Gra
m +
G
ram
-
H
ong
os
P
roto
zo
a
A
ctin
om
ice
tos
56
Tab
la 4
.03.
Contin
ua
ció
n.
P-D
T(p
)a
0
.38
(0
.71)
-0.3
1 (
0.7
7)
3.2
1 (
0.0
1)b
-0.8
9 (
0.3
9)
1.5
5 (
0.1
5)
a P
rue
ba t
para
dato
s p
are
ados
b D
ifere
ncia
sig
nific
ativa
PO
ST
0
.12
8 ± 0
.05
0.1
17
± 0
.05
0.0
14
± 0
.00
4
0.0
03
± 0
.00
3
0.0
31
± 0
.01
1
PR
E
0
.13
5 ± 0
.04
3
0.1
12
± 0
.03
5
0.0
25
± 0
.01
2
0.0
02
± 0
.00
1
0.0
38
± 0
.01
1
P+
D
T
(p)a
1
.26
(0
.23)
0.2
5 (
0.8
1)
3.5
8 (
0.0
0)b
0.8
1 (
0.4
3)
2.5
0 (
0.0
3)b
PO
ST
0
.12
6 ± 0
.04
8
0.1
20
± 0
.04
8
0.0
13
± 0
.00
5
0.0
02
± 0
.00
2
0.0
28
± 0
.01
2
PR
E
0
.14
4 ±
0.0
23
0.1
24
± 0
.02
5
0.0
18
± 0
.00
4
0.0
02
± 0
.00
2
0.0
38
± 0
.00
6
Taxó
n
Gra
m +
G
ram
-
H
ong
os
P
roto
zo
a
A
ctin
om
ice
tos
57
Figura 4.05. Variación de la concentración promedio (± error estándar) en suelo
del marcador de hongos 18:2ω6 (n = 3) a través del tiempo. La línea
entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del post (derecha) tratamiento.
0.0E+00
5.0E-03
1.0E-02
1.5E-02
2.0E-02
2.5E-02
3.0E-02
3.5E-02
4.0E-02
4.5E-02
5.0E-02
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
18:2
ω6
(µ
mo
l g
-1 p
eso
se
co)
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
58
La figura 4.06 muestra la variación de la suma de la concentración total
de los marcadores de actinomicetos 10Me 18:0 y 10Me 16:0 a través del periodo
de pre- y post-tratamiento. Ninguno de los tratamientos reflejó diferencias
significativas en términos de bloque. Sin embargo el tratamiento P+D fue el
único que mostró diferencias con respecto a temporada (ANOVA de una vía F7,
16 = 8.04, p = 0.26). Esta variación ocurrió específicamente durante el post-
tratamiento en los meses de diciembre de 2005 hasta junio de 2006. Durante
éstos meses la disminución de la concentración promedio (n = 3) fue más bajo
durante el mes de marzo de 2006 (0.01 ± 0.00 µmol g-1 de peso seco). Luego
ocurre una recuperación en el mes de junio de 2006 (0.03 ± 0.01 µmol g-1 de
peso seco).
59
Figura 4.06. Variación a través del tiempo de la concentración promedio (± error
estándar) en suelo de la suma promedio de los marcadores de actinomicetos
10Me 16:0 y 10Me 18:0 (n = 3). La línea entrecortada divide el periodo pre
(izquierda) del post (derecha) tratamiento.
0.0E+00
1.0E-02
2.0E-02
3.0E-02
4.0E-02
5.0E-02
6.0E-02
7.0E-02
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
10M
e 1
6:0
+ 1
0M
e 1
8:0
(µ
mo
l g
-1 p
eso
se
co)
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
60
Hojarasca
En la figura 4.07 se presenta la variación promedio total de la
concentración de EL-FAME (n = 12) a través del tiempo en la hojarasca. Según
ANOVA de un factor, no existen diferencias significativas en términos de
temporada ni de bloque para cada tratamiento excepto en el tratamiento control
(temporada F7, 16 = 2.80, p = 0.04). Para este último, hay un aumento en el
promedio de la concentración en los meses de diciembre de 2005 (2.44 ± 0.49
µmol g-1 de peso seco), marzo (1.94 ± 0.63 µmol g-1 de peso seco) y junio (2.61
± 0.55 µmol g-1 de peso seco) de 2006. Esto nos sugiere que puede existir
variabilidad de la concentración total de ácidos grasos como producto del efecto
de temporada. El análisis de varianza Kruskal-Wallis realizado para las muestras
en el pre- y post-tratamiento, nos indica que la variación por el efecto de
temporada ocurre en los meses del pre-tratamiento (H3 = 12.68, p = 0.01) y H3 =
2.95, p = 0.40). No se observó diferencias entre los tratamientos en ambos
periodos.
61
Figura 4.07. Variación de la concentración promedio total (± error estándar) de
EL-FAME (n = 3) en hojarasca para cada tratamiento durante el periodo del pre-
y post-tratamiento. La línea entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del
post (derecha) tratamiento.
0.0E+00
5.0E-01
1.0E+00
1.5E+00
2.0E+00
2.5E+00
3.0E+00
3.5E+00
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
µm
ol g
-1 p
eso
se
co
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
62
En la prueba t para datos pareados se encontró, que en el promedio de
biomasa en grupos taxonómicos en hojarasca, existen diferencias significativas
en grupos como Gram - , actinomicetos y protozoarios en los tratamientos
CONTROL, NP+D y P-D durante el periodo pre- y post-tratamiento (tabla 4.04).
La concentración de grupos Gram- fue significativamente distinta en el
tratamiento control, donde el promedio del post-tratamiento es mayor que el pre-
tratamiento (tabla 9). Similarmente este patrón ocurrió en el tratamiento NP+D,
donde los protozoarios y actinomicetos obtuvieron un promedio mayor de
concentración de su ácidos grasos en el post-tratamiento que el pre. Por último,
en el tratamiento P-D los protozoarios fueron más altos en promedio en el
periodo post que el pre.
63
Tab
la 4
.04.
Pro
med
io d
e c
on
ce
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ació
n (
µm
ol g
-1 p
eso
se
co
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r, n
= 1
2).
N
P+
D
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-1
.91(0
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-0.8
5(0
.41)
-0.8
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.02)b
-2.6
2(0
.02)b
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are
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b D
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ativa
PO
ST
0
.12
5 ± 0
.05
5
0.1
95
±
0.1
75
0.2
86
± 0
.13
8
0.0
06
± 0
.00
3
0.0
26
± 0
.01
3
PR
E
0
.08
2 ± 0
.04
8
0.1
55
±
0.1
21
0.2
45
± 0
.13
5
0.0
03
± 0
.00
2
0.0
17
± 0
.00
9
Co
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ol
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(p)a
0
.26
(0.8
0)
-2.5
1(0
.03)b
-2.1
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.05)
-2.1
9(0
.05)
-0.6
8(0
.51)
PO
ST
0
.09
2 ± 0
.05
2
0.1
62
± 0
.06
3
0.3
08
± 0
.15
1
0.0
06
± 0
.00
3
0.0
26
± 0
.01
7
PR
E
0
.09
7 ± 0
.08
5
0.1
00
± 0
.05
0.1
80
± 0
.11
7
0.0
03
± 0
.00
2
0.0
22
± 0
.02
5
Taxó
n
Gra
m +
G
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-
H
ong
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P
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a
A
ctin
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64
Tab
la 4
.04.
Contin
ua
ció
n.
P-D
T(p
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-1
.20(0
.25)
-1.7
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.11)
-2.0
4(0
.06)
-2.6
7(0
.02)b
-1.5
1(0
.16)
a P
rue
ba t
para
dato
s p
are
ados
b D
ifere
ncia
sig
nific
ativa
PO
ST
0
.09
9 ± 0
.07
2
0.1
85
± 0
.14
7
0.2
70
± 0
.13
7
0.0
05
± 0
.00
3
0.0
22
± 0
.01
4
PR
E
0
.06
7 ± 0
.03
4
0.1
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± 0
.10
9
0.1
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± 0
.11
9
0.0
02
± 0
.00
2
0.0
15
± 0
.00
9
P+
D
T
(p)a
-1
.27(0
.23)
-2.1
8(0
.05)
-1.1
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.26)
-0.7
2(0
.49)
-0.4
4(0
.67)
PO
ST
0
.10
6 ± 0
.06
6
0.1
66
± 0
.11
3
0.2
13
± 0
.10
7
0.0
04
± 0
.00
2
0.0
20
± 0
.01
1
PR
E
0
.07
7 ± 0
.04
2
0.0
99
± 0
.04
9
0.1
58
± 0
.09
1
0.0
03
± 0
.00
2
0.0
18
± 0
.01
3
Taxó
n
Gra
m +
G
ram
-
H
ong
os
P
roto
zo
a
A
ctin
om
ice
tos
65
Comparación entre la Proporción Hongo: Bacteria en Suelo y Hojarasca
En la figura 4.08 se presenta la variación de la proporción hongo: bacteria
de suelo a través del tiempo durante el periodo antes y después de la
manipulación del bosque. Durante los dos periodos de tratamiento, no se
observó diferencias significativas en la proporción promedio entre los meses de
muestreo en las parcelas control y NP+D (ANOVA de una vía F7, 16 = 1.59, p =
0.21 y F7, 16 = 1.28, p = 0.32, respectivamente). Sin embargo si se encontraron
diferencias entre los bloques (ANOVA de una vía F2, 21 = 3.74, p = 0.04 y F2, 21 =
3.91, p = 0.04 respectivamente). En estos tratamientos se observó que el bloque
B es más distinto entre los otros bloques en el promedio (n = 3) de la proporción
(0.07 ± 0.01 y 0.06 ± 0.01, respectivamente). No obstante, las parcelas con los
tratamientos P+D y P-D no mostraron diferencias entre sus bloques pero si en
temporada (ANOVA de una vía F7, 16 = 1.59, p = 0.03 y F7, 16 = 5.68, p < 0.01,
respectivamente). El cambio con respecto al tiempo ocurre de forma más
evidente entre el tratamiento P-D, donde la proporción promedio de hongo:
bacteria (n = 3) ocurre luego del mes de agosto 2003 y se mantiene bajo durante
los meses de agosto 2005 hasta junio de 2006 a un promedio (n = 12) de 0.05 ±
0.01. En general, no existen diferencias significativas en la proporción hongo:
bacteria entre los tratamientos durante el periodo de pre-tratamiento (Kruskall-
Wallis de una vía, H3 = 5.40, p = 0.15) pero sí en el periodo de post-tratamiento
(Kruskall-Wallis de una vía, H3 = 9.16, p = 0.03). Esta diferencia ocurre en
especial en los tratamientos P+D y P-D, los cuales son distintos al control y a
NP+D.
66
Figura 4.08. Variación promedio (± error estándar) de la proporción hongo:
bacteria (n = 3) en suelo para cada tratamiento en el periodo del pre- y post-
tratamiento. La línea entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del post
(derecha) tratamiento.
Durante el periodo del pre-tratamiento las comparaciones múltiples
posteriores a ANOVA (prueba Tukey) mostraron que la manipulación P+D es
significativamente distinta (p < 0.05) al control (CONTROL) y a P-D, pero no es
distinta al NP+D (p > 0.05), excepto en marzo 2006 (Figura 4.08). Sin embargo,
en el periodo de post-tratamiento, el promedio total (n = 12) de la proporción
hongo: bacteria reflejó diferencias significativas en término de temporada (F3, 44 =
3.84, p = 0.02) y tratamiento (F3, 44 = 7.57, p = 0.02). Usando la prueba Tukey se
encontró, que los tratamientos con el dosel cerrado no difieren significativamente
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
Pro
po
rció
n H
ong
o: B
acte
ria
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
67
(p > 0.05) entre ellos pero difieren del P+D, el cual está abierto (figura 4.09).
Mientras tanto el tratamiento P-D no es significativamente distinto al tratamiento
NP+D ni al P+D. Esto quiere decir que los tratamientos abiertos en el dosel
tienden a ser más bajos en la proporción hongo: bacteria que en los cerrados.
68
Figura 4.09. Promedio (+ error estándar) en cada tratamiento (n = 12) de
proporción hongo: bacteria en durante el periodo de pre- y post-tratamiento. El
asterisco (*) sobre las barras representan diferencias significativas (prueba t
para datos pareados, p < 0.05). Las letras distintas sobre las barras representan
diferencias significativas entre los tratamientos por cada periodo (PRE y POST)
determinado por DHS Tukey (p < 0.05).
En la figura 4.10 se presenta la variación promedio de la proporción
hongo : bacteria durante el periodo de pre- y post-tratamiento en hojarasca. La
variación del promedio total (n = 12) de la proporción no varió en términos de
tiempo ni en términos de bloque para cada tratamiento durante el periodo de
estudio (ANOVA de una vía, tratamiento p > 0.10; bloque p > 0.10). Sin
embargo, si tomamos individualmente cada periodo y utlilizamos el mismo
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
Control NP+D P+D P-D
Pro
po
rció
n (
Ho
ng
o:B
acte
ria
)
Tratamientos
PRE POST
*
*
A
AB
A
B
a
ab
ccb
69
analisis estadístico, encontramos que solamente existe variación significativa
entre las temporadas del post-tratamiento (F3, 8 = 6.36, p = 0.02, n = 3) en las
parcelas P-D. Durante este periodo de manipulación, la proporción promedio
más baja se registró en agosto de 2005 (0.68 ± 0.11). Luego ocurre un ascenso
gradual de la proporción hasta junio de 2006 (1.44 ± 0.11). Esta parcela es
aquella a la cual se le ha removido el dosel y la biomasa vegetal del suelo del
bosque. Los datos pueden sugerirnos que la proporción se mantuvo baja debido
a los cambios microclimáticos inmediatos luego de la abertura del dosel y a la
poca disponibilidad de sustrato para colonizar.
70
Figura 4.10. Variación promedio (± error estándar) de la proporción hongo:
bacteria (n = 3) en hojarasca para cada tratamiento en el periodo del pre- y post-
tratamiento. La línea entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del post
(derecha) tratamiento.
Comparación entre la proporción Gram +: Gram – en Suelo y Hojarasca
Los cambios de la proporción promedio de Gram+: Gram – en suelo por
cada temporada (n = 3) y los promedios para cada tratamiento (n = 12) en cada
periodo de manipulación se aprecian en la figura 4.11 y 4.12, respectivamente.
Durante el periodo antes y después de la manipulación, no se encontró
diferencias significativas en temporada en cada uno de los tratamientos excepto
en P-D (ANOVA de una vía F2, 21 = 2.62, p = 0.05). En este tratamiento las
variaciones significativas ocurren luego de la aplicación de los tratamientos
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
Pro
po
rció
n (
Ho
ng
o:B
acte
ria
)
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
71
donde la proporción más baja ocurre en los meses de marzo y junio de 2006
(1.09 ± 0.14 y 1.09 ± 0.01 respectivamente). En el factor bloque ocurre algo
similar, donde no existen diferencias significativas en cada uno de los
tratamientos evaluados individualmente excepto en el control (F7, 16 = 11.18, p <
0.01). En esta área, el bloque A es el más distinto al bloque C y B, lo que nos
sugiere que en estas parcelas puede existir variabilidad.
En la figura 4.12 se observó que el promedio entre los tratamientos en
cada periodo de manipulación no reflejan diferencias. No obstante, el análisis t
para datos pareados refleja que el promedio de proporción en cada tratamiento
es significativamente distinto, donde los tratamientos en el periodo de proporción
en el pre son más altos que en el post. Donde más fuerte se observa este efecto
es en el tratamiento P+D, lo que nos sugiere que la comunidad de bacterias
Gram – en el periodo post es mayor sobre los otros tratamientos particularmente
para los tratamientos de poda.
72
Figura 4.11. Variación promedio (± error estándar) en suelo de proporción de
Gram +: Gram - (n = 3) a través del periodo del pre- y post-tratamiento. La línea
entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del post (derecha) tratamiento.
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
1.3
1.35
1.4
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
Pro
po
rció
n p
rom
edio
(
Gra
m +
: G
ram
-)
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
73
Figura 4.12. Promedio (+ error estándar) en cada tratamiento (n = 12) de
proporción Gram +: Gram – en suelo durante el periodo de pre- y post-
tratamiento. El asterisco (*) sobre las barras representa diferencias significativas
(prueba t para datos pareados, *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
1.3
Control NP+D P+D P-D
Pro
po
rció
n p
rom
edio
(G
ram
+: G
ram
-)
Tratamientos
PRE-TRT POST-TRT
**
***
***
74
Las figuras 4.13 y 4.14 presentan el comportamiento de los promedios de las
proporciones de Gram +: Gram – en hojarasca a través del tiempo durante el
periodo antes y después del tratamiento. El ANOVA realizado para cada uno de
los tratamientos reflejó que no existen diferencias significativas entre los
bloques. Sin embargo solamente se encontró diferencias significativas en
términos del tiempo en los tratamientos NP+D y P-D (F3, 44 = 2.66, p = 0.05 y
F3,44 = 5.44, p < 0.01 respectivamente), siendo el efecto más fuerte en P-D. En
NP+D la proporción alcanza un promedio máximo (n = 3) de 1.21 ± 0.07 en el
mes de agosto 2005, luego ocurre una disminución gradual hasta junio de 2006
(0.54 ± 0.60). En P-D la variación significativa ocurre específicamente en el post
periodo, donde la proporción promedio (n = 3) disminuyó en los meses de
marzo (0.38 ± 0.17) y junio (0.43 ± 0.22) de 2006. Esta variación en términos de
tiempo se hace más evidente durante el periodo de post-tratamiento (ANOVA
Kruskal-Wallis de un factor, H3 = 20.9, p < 0.01). En este periodo el promedio de
proporción (n = 12) tiende a disminuir desde agosto de 2005 (1.13 ± 0.19) a
junio de 2006 (0.43 ± 0.37). En general, no existe diferencias significativas
(Kruskal-Wallis, p > 0.50) entre los tratamientos cuando se evalúan en cada
periodo por separado. Similarmente, en el análisis de t para datos pareados, no
se encontró diferencias significativas entre el periodo pre y post en términos del
promedio de proporción en todos los tratamientos.
75
Figura 4.13. Variación promedio (± error estándar) en hojarasca de proporción
de Gram +: Gram - (n = 3) a través del periodo del pre- y post-tratamiento. La
línea entrecortada divide el periodo pre (izquierda) del post (derecha)
tratamiento.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
NOV-02 FEB-03 MAY-03 AGO-03 AGO-05 DIC-05 MAR-06 JUN-06
Pro
po
rció
n P
rom
ed
io (
Gra
m +
: G
ram
-)
Mes y Año
Control
NP+D
P+D
P-D
76
Figura 4.14. Promedio (+ error estándar) en cada tratamiento (n = 12) de
proporción Gram +: Gram – en hojarasca durante el periodo de pre- y post-
tratamiento.
Diferencias en Comunidades Microbianas en Base al Análisis de
Componente Principal
Suelo
En la figura 4.15 se muestra la variación significativa (F 2, 45 = 3.51, p =
0.04, n = 16) de la comunidad microbiana entre los bloques observados. Esta
figura presenta como el bloque B es significativamente distinto al bloque A
(ANOVA Tukey p < 0.05) en términos de la comunidad microbiana. Alrededor del
34% de la variación en PC1 está representada en este eje y 20% para PC2.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
Control NP+D P+D P-D
Pro
po
rció
n p
rom
edio
(G
ram
+: G
ram
-)
Tratamientos
PRE POST
77
Figura 4.15. Análisis de componente principal de la estructura de la comunidad
microbiana (% Mol) en suelo con respecto a los bloques en el pre-tratamiento.
Las puntuaciones promedio (n = 12) se presentan junto con las barras de error
estándar.
A
B
C
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
PC
2 (
20%
)
PC1 (34%)
78
En la figura 4.16 se presenta el PCA con los promedios de las
puntuaciones (n = 12) con respecto a los meses de muestreo en el pre-
tratamiento, donde se puede observar que en el primer eje PC1 hay un cambio
gradual significativo de la comunidad. Esto se comprueba con ANOVA, el cual
indica que existen diferencias significativas entre los meses de muestreo
(ANOVA DHS Tukey, F7, 88 = 6.59, p = 0.01), donde la diferencia más marcada
se observa en el mes de febrero de 2003. Los meses siguientes a este, no son
significativamente distintos (Tukey, p > 0.05). Este resultado nos puede indicar
que las comunidades microbianas en el bosque de tabonuco pueden estar
influenciadas por el efecto de temporada antes de un disturbio natural.
79
Figura 4.16. Análisis de componente principal de la estructura de la comunidad
microbiana (% Mol) en suelo con respecto a la temporada de muestreo en el pre-
tratamiento. Las puntuaciones promedio (n = 12) se presentan junto con las
barras de error estándar.
Los análisis de componente principal fueron aplicados a los valores de %
Mol de ácidos grasos individuales, derivados de las muestras de suelo en los
diferentes tratamientos (figura 4.17). El primer componente explica el 30% y el
segundo componente el 19% del total de la variación en las muestras. Los datos
demuestran claramente diferencias significativas en la composición de los ácidos
Nov-02
Feb-03
May-03
Ago-03
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
-2 -1 0 1 2 3
PC
2 (
20%
)
PC1 (34%)
80
grasos entre los tratamientos y entre la temporada de muestreo. Al analizar los
tratamientos en cada periodo de manipulación, observamos que existen
diferencias significativas entre ellos (ANOVA de una vía, F7, 88 = 10.20, p < 0.01).
En general, bajo este análisis se encontró que los tratamientos del post y el pre
tienden a agruparse entre sí, lo que nos indica que la comunidad de ácidos
grasos es diferente en ambos periodos. Las distancias significativamente
mayores se encontraron en el eje PC1 en los tratamientos PRE P-D y POST
P+D. Al mismo tiempo, la comunidad del tratamiento PRE P-D y la de POST P-D
son significativamente diferentes (prueba Tukey, p < 0.05). Este patrón también
se observó en los tratamientos PRE P+D y los de POST P+D. También se
puede observar en la figura 4.17, que en aquellos datos representantes del
periodo del pre-tratamiento (color blanco), no se reflejan diferencias significativas
(prueba Tukey, p > 0.05). Por el contrario, durante el periodo POST, en los
tratamientos P+D, P-D y NP+D (color negro) no existen diferencias significativas
(prueba Tukey, p > 0.05). Sin embargo, el control (POST Control) es
significativamente distinto a POST P+D y POST P-D y a su vez no es
significativamente (prueba Tukey, p > 0.05) distinto a los tratamientos del
periodo PRE tales como: control, NP+D y P+D. Esto quiere decir que las
comunidad en las parcelas control no es muy distinta a las parcelas del pre-
tratamiento pero si a aquellas donde ocurrió manipulación.
81
Figura 4.17. Análisis de componente principal de la estructura de la comunidad
microbiana (% Mol) en suelo por cada tratamiento durante el pre (color blanco) y
post (color negro) tratamiento. Las puntuaciones promedio (n = 12) se presentan
junto con las barras de error estándar.
El primer componente principal está más fuertemente influenciado por los
EL-FAME cy 19:0 (Gram – anaeróbicos), i15:0 (Gram +) y 18:2ω6 (Hongos). El
cy 19:0 e i15:0 tienen valores negativos lo que nos indica que los mismos son
más importantes para las muestras que se encuentran en el periodo del post-
tratamiento. Mientras tanto, el marcador 18:2ω6 (hongos) es más importante en
los tratamientos del pre-tratamiento.
POST Control
POST NP+D
POST P+D
POST P-D
PRE Control
PRE NP+D
PRE P+DPRE P-D
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
-3 -2 -1 0 1 2 3
PC
2 (
19%
)
PC1 (30%)
82
Hojarasca
En la figura 4.18 y 4.19 se presentan el PCA realizado para analizar los
efectos de bloque y temporada en comunidades microbianas en hojarasca. En la
figura 4.18 se muestra cómo entre los bloques, según PC1 no existen
diferencias significativas entre ellos (p > 0.10). Esto nos siguiere que las
comunidades microbianas no son muy distintas en la fracción de hojarasca entre
los bloques observados en el bosque. Además, los datos nos sugieren la
extensa variabilidad que puede existir en los bloques en especial el bloque A.
83
Figura 4.18. Análisis de componente principal de la estructura de la comunidad
microbiana (% Mol) en hojarasca con respecto a los bloques en el pre-
tratamiento. Las puntuaciones promedio (n = 12) se presentan junto con las
barras de error estándar.
La variación a través del tiempo de la comunidad microbiana en la
hojarasca se observan en la figura 4.19. El primer componente principal explica
el 43% de la variabilidad de los datos y el segundo componente el 17%. Las
comunidades en febrero de 2003 y noviembre de 2002 son similares entre sí
pero distintas a la comunidad en mayo de 2003. Las comunidades en agosto de
A
B
C
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1
PC
2 (
17%
)
PC1 (43 %)
84
2003 son más similares a las del mes de mayo de 2003. Esto implica, que igual
que en el suelo, las comunidades de microorganismos pueden verse afectadas
por el efecto de temporada en un periodo ausente de disturbios.
Figura 4.19. Análisis de componente principal de la estructura de la comunidad
microbiana (% Mol) en hojarasca con respecto a la temporada de muestreo en el
pre-tratamiento. Las puntuaciones promedio (n = 12) se presentan junto con las
barras de error estándar.
Nov-02 Feb-03
May-03
Ago-03
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
-2 -1 0 1 2 3
PC
2 (
17%
)
PC1 (43 %)
85
Los análisis de componente principal fueron también aplicados a los
valores de % Mol de ácidos grasos individuales en cada tratamiento durante el
pre y post periodo de tratamiento (figura 4.20). Para este nuevo grupo de datos,
el primer componente explica el 46% y el segundo componente el 13% del total
de la variación en las muestras. Al analizar los tratamientos en cada periodo de
manipulación, en PC1 se observa que no existen diferencias significativas entre
ellos (p > 0.10). Por el contrario, en PC2 las variaciones significativas ocurren
entre los tratamientos (p < 0.05), donde las comunidades en pre-tratamiento
(NP+D, P-D y P+D) son significativamente distintas (p < 0.05) a las de post-
tratamiento (Control y P+D). En este componente el grupo control (PRE) tiene
relación con los grupos del post-tratamiento más que los del pre-tratamiento. En
PC2 los marcadores 16:1ω7c y 17:1ω7c, los cuales son representativos de
microorganismos Gram negativos, son más importantes en la variación de la
comunidad ente los tratamientos y la temporada de muestreo.
86
Figura 4.20. Análisis de componente principal de la estructura de la comunidad
microbiana (% Mol) en hojarasca por cada tratamiento durante el pre- y post-
tratamiento. Las puntuaciones promedio (n = 12) se presentan junto con las
barras de error estándar.
POST Control
POST NP+D
POST P+D
POST P-D
PRE Control
PRE NP+D
PRE P+D
PRE P-D
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
-2 -1 0 1 2 3
PC
2 (
13%
)
PC1 (46%)
87
Capítulo Cinco
Discusión
Perfil y Estructura de la Comunidad Microbiana en el Bosque de Tabonuco
Un gran número de ácidos grasos fueron encontrados en las fracciones
de suelo y hojarasca (alrededor de 45). En términos generales, la cantidad
encontrada entre ambos sustratos no es muy distinta, mas la variación entre
ambos sustratos ocurre en la abundancia relativa de ciertos grupos de lípidos.
Los más abundantes de este grupo de ácidos grasos en ambos sustratos son
12:0, 14:0, i16:0, 16:0, 16:1ω5, 18:1ω9, 18:2ω6c, 18:1ω7 y 18:0. En el suelo
existen variaciones entre los grupos ácidos grasos totales encontrados con
respecto al tiempo y especialmente antes de que ocurriera la manipulación del
bosque. Esto nos sugiere que existen diferencias intrínsecas entre los lugares de
muestreo y durante un espacio de tiempo los grupos de lípidos observados
cambian significativamente cuando no hay disturbios. Esta variación en la
abundancia relativa por temporada y espacio se observa mejor entre aquellos
lípidos relacionados con células procariontes. Individualmente, los ácidos grasos
de procariontes que presentan mayormente estas variaciones en temporada son
a15:0, i17:0, a17:0, cy17:0, 18:1ω7 y br19:0, los cuales son representativos de
grupos de bacterias Gram positivas y negativas. En hojarasca, un mayor
número de ácidos grasos de forma individual reflejaron cambios en su
abundancia relativa por el efecto de temporada que aquellos en suelo.
Aproximadamente el 65% de los ácidos grasos reflejaron estas diferencias. En
88
esta fracción los ácidos grasos monoinsaturados y los poliinsaturados
predominan junto con los saturados por encima de estos mismos pero en suelo.
Sin embargo, los grupos de ácidos grasos ramificados y de ciclo propilo se
encuentran por debajo de aquellos en suelo. Lo que nos indica que los ácidos
grasos de microorganismos procariontes predominan en el suelo y aquellos de
eucariotas en la fracción de hojarasca.
En términos de análisis de comunidad por localidad, la estructura de la
comunidad microbiana es distinta entre los bloques muestreados. En el suelo,
los bloques A y B son diferentes mientras que el C, posee características de
ambos. En hojarasca no se pudo observar estas diferencias espaciales, en gran
parte por la gran variabilidad que existe en la capa de detrito en el suelo. La
composición de la comunidad en el suelo del bloque C pudiera estar reflejando
condiciones (factores bióticos y abióticos) intermedias entre los otros bloques, ya
que su composición microbiana no es muy distinta entre los polos. En el bloque
B las comunidades de organismos Gram – (cy 19:0) son más importantes, y esto
nos puede indicar que sobre los otros bloques puede existir una mayor actividad
en procesos anaeróbicos. Mientras tanto en el bloque A predominan los hongos,
lo que nos sugiere que los procesos de descomposición de detritos predominan
en esta localidad. Las diferencias entre los bloques está evidenciada en la
historia natural y los disturbios pasados que han afectado de distinta forma estas
localidades. En el artículo de Willig et al (1996) se establece, que los estudios
contemporáneos en heterogeneidad espacial que no consideren aspectos de
89
patrones históricos de disturbios antropogénicos y natural, pueden llegar a
conclusiones incorrectas.
Además del cambio espacial, la estructura de la comunidad es distinta por
temporadas (entre los meses y entre los años) en suelo y hojarasca. En las
muestras analizadas en suelo, el mes de febrero 2003 es el más distinto en
términos de la composición de la comunidad con respecto a los otros meses. En
hojarasca ocurre algo similar, pero es en mayo de 2003 cuando la comunidad
cambia del resto de los meses. Esta información ayuda a afirmar la posibilidad
de que en los suelos tropicales, existe un efecto de temporada significativa
asociada a los patrones de precipitación sobre la comunidad de
microorganismos que debe ser más evaluada en estudios de disturbios a largo
plazo en el bosque.
Concentración de Lípidos Entre Suelo y Hojarasca Previo al Disturbio
Durante este estudio se ha determinado que la concentración de lípidos
es mayor en hojarasca que en suelo. Los lípidos de eucariotas (hongos) aportan
grandemente al total de lípidos en hojarasca causando esta diferencia en
comparación con el suelo. Los hongos endófitos y aquellos descomponedores
pudieran ser los responsables de las altas concentraciones de estos lípidos. En
pasados estudios (Lodge y Cantrell 1995) se ha reportado la importancia y
presencia de biomasa de hongos presente en la fracción vegetal sobre los
suelos del bosque tropicales como el de tabonuco en el Yunque. Dentro del
grupo de descomponedores que se encuentran estratificados en el suelo del
bosque de tabonuco, sobresalen los basidiomicetos y comunidades de hongos
90
microscópicos en la base vegetal. Con este estudio se ha podido demostrar la
sensibilidad de esta técnica de análisis de lípidos para observar diferencias entre
los sustratos estudiados basados en concentración.
En el suelo no existe variación significativa de la concentración de lípidos
total entre los meses durante un periodo sin disturbios en el bosque de
tabonuco. Sin embargo, al examinar los bloques por individual, el bloque B es el
único que presenta un efecto de temporada sobre los otros bloques. De igual
forma los bloques son distintos entre sí, donde el bloque C es mayor en
concentración de lípidos sobre los bloques A y B. Esto quiere decir que la
variación de los lípidos totales en el bosque puede variar según la localidad en el
bosque y pudiera variar en una escala de tiempo. Distinto al suelo, en hojarasca
se encontró variación de la concentración total promedio de lípidos en un
periodo de tiempo. En estudios en hojarasca y suelos subtropicales de Puerto
Rico, se ha encontrado que la biomasa de hongos varía de acuerdo a los
cambios de humedad en esta capa (Lodge 1993). En este estudio se ha
encontrado que la concentración del marcador de hongos 18:2ω6 varió de
noviembre de 2002 a mayo de 2003. Esta variación puede resultar en la
inmovilización y conservación de nutrientes, en contra de la lixiviación de los
mismos durante los periodos (Yang e Insam 1991) lluviosos y los pulsos de
mineralización en respuesta a la sequía (Lodge et al 1994). En el futuro se debe
analizar las comunidades de microorganismos en la capa vegetal de forma
estratificada (niveles de descomposición) y por especies de plantas desde una
91
perspectiva molecular de mayor resolución, para observar la sucesión de
organismos en la descomposición de material orgánico a distintas escalas.
Efecto de la Manipulación del Bosque en la Concentración de Ácidos
Grasos
La concentración total de ácidos grasos de microorganismos en suelo
varió luego de la aplicación de los tratamientos, en especial en P+D. En los
demás tratamientos (NP+D y P-D) no se observó el efecto debido a la gran
variabilidad en los datos entre los bloques muestreados. Esto se observó
principalmente en P-D, donde la concentración en el post periodo se mantuvo
similar al periodo del pre-tratamiento. Sin embargo, ocurre una disminución
similar a la ocurrida en P+D durante el mes de diciembre de 2005, esto permite
no descartar el efecto de las aberturas del dosel en la concentración de los
lípidos. Además esta disminución pudo atribuirse a la reducción de la capa de
hojarasca presente en esta parcela (P-D). En estudios realizados en bosques
húmedos subtropicales en India (Arunachalam et al 2000), las aberturas del
dosel disminuyen la biomasa microbiana y la humedad relativa del suelo. En
este estudio, la intensidad de luz fue significativamente alta en las áreas abiertas
del bosque que contribuyeron a elevar la temperatura y cambiaron las
condiciones físico-químicas del suelo.
Los tratamientos aplicados en el bosque de tabonuco afectaron la
concentración de ácidos grasos representativos de ciertos grupos de
microorganismos como son hongos, actinomicetos, Gram – y protozoarios. Esta
variación tomó lugar tanto en suelo como en hojarasca. En el suelo los
92
marcadores 18:2ω6, y los representativos de actinomicetos (combinación de
10Me16:0 y 10Me 18:0) mostraron diferencias principalmente en las parcelas
con tratamientos de poda más remoción y adición (P-D y P+D). La concentración
de los marcadores de actinomicetos se redujo luego de la aplicación del
tratamiento P+D. En los hongos la concentración disminuyó en las parcelas con
los tratamientos P+D y P-D. Este patrón se observó también en la proporción de
hongos: bacterias, donde esta relación disminuye en éstos tratamientos, en
especial al cabo de cuatro meses luego de la aplicación de todos los
tratamientos. Esto quiere decir que los grupos de hongos y actinomicetos son
sensibles a los cambios en el microclima y a la alteración de la estructura del
bosque. Este cambio puede atribuirse a varios factores como: poca
disponibilidad de material orgánico, humedad gravimétrica del suelo y hojarasca,
menos hojarasca depositada, gran intensidad de luz y al aumento del viento que
seca la capa de hojarasca. En estudios realizados por Aruchalan et al (2000), se
estableció que las poblaciones de microorganismos (hongos y bacterias) son
más altas debajo del dosel del bosque, el cual es atribuido a la gran cantidad de
material orgánico. En datos aún no publicados del LTER, la humedad del suelo
aumentó drásticamente en las parcelas con dosel abierto durante los primeros
meses (julio y agosto de 2005) luego de la manipulación. Este aumento súbito
pudo cambiar el balance de oxígeno en el suelo, donde el rápido crecimiento de
bacterias combinado con las altas temperaturas tornó el ambiente a uno menos
apropiado para el desarrollo de los hongos y actinomicetos que son de lento
crecimiento.
93
En hojarasca los grupos de actinomicetos, Gram negativos y protozoarios
aumentaron la concentración de sus lípidos representativos en las parcelas P-D,
P+D y NP+D. Específicamente los Gram negativos aumentaron en las parcelas
P+D y CONTROL. La combinación de abertura más biomasa vegetal
estimularon el crecimiento de este grupo. Sin embargo, la variación en el grupo
control puede indicar un efecto de la temporada en este sustrato y la
heterogeneidad de las muestras observadas. Ningún efecto de temporada o
tratamiento se observó en la proporción hongo: bacteria, esto en parte a que en
este sustrato son los hongos los que predominan. En los actinomicetos, el
aumento ocurrió en las parcelas con adición (NP+D). Similarmente, en
protozoarios hubo un aumento en las parcelas P-D y NP+D. En general, estos
hallazgos permiten la posibilidad de estudiar más afondo las dinámicas de
descomposición, y que rol desempeñan estos grupos de organismos en la
circulación e inmovilización de nutrientes en el ecosistema. Más aún, ver como
su intervención se ve afectada cuando los pulsos de nutrientes son aplicados,
cuando hay una deposición de hojarasca y la disminución de biomasa
microbiana. Ambos aspectos alteran las vías del ciclo de nutrientes que en
conjunto con los cambios en la humedad alteran las cadenas alimentarias de
detritos (Lodge et al 1994).
94
Composición de la Comunidad Microbiana en el Suelo y Hojarasca luego
del Efecto de la Manipulación
Debido a la contribución relativa de los El-FAME individuales, se ha
podido demostrar que las comunidades microbianas de suelo, reflejan grandes
diferencias significativas entre el periodo de pre-tratamiento y el post-
tratamiento. Durante el pre-tratamiento las comunidades microbianas en los
bloques son muy distintas entre sí. En esta ocasión la técnica de análisis
aplicada en este estudio fue lo suficientemente sensible como para determinar
estos cambios en las comunidades. En el periodo de post-tratamiento, la
comunidad del grupo control de suelo está más cercana a las comunidades de
las parcelas del pre-tratamiento. El resto de las comunidades de los otros
tratamientos cambiaron, en especial, aquellos donde la manipulación incluyó la
abertura del dosel. Estas parcelas abiertas se relacionaron mejor con el ácido
graso cy19:0 (Gram – anaeróbico). Con este estudio se sugiere que la
combinación de cambios de temperatura junto con humedad pudiera provocar
suelos anóxicos afectando las comunidades microbianas. Por el contrario, el
ácido graso 18:2ω6, es más común en las parcelas cerradas. Mientras el cy19:0
aumentó el marcador de hongos disminuyó, donde posiblemente se deba a los
cambios inmediatos en el ambiente del suelo que se hacen inapropiados para
que se desarrollen los hongos.
En términos generales, no se encontraron diferencias significativas en las
comunidades microbianas en hojarasca (figura 20) como en suelo entre los
tratamientos del periodo pre y post. Posiblemente, la gran heterogeneidad
95
vertical de la capa de detritos no permitió observar claramente los efectos
esperados por los tratamientos. Sin embargo, en las parcelas control existe una
separación de las comunidades (figura 20) en el PC1 que nos sugiere cambios
inter anuales que afectan la comunidad microbiana. En el análisis de
componente principal realizado solamente en el PC2, se observó que los
tratamientos tuvieron efectos en la comunidad microbiana en especial el P+D.
De esta manera, pueden existir cambios en la comunidad microbiana en
hojarasca en términos de los tratamientos y por el efecto de temporada, que
debe ser descifrado aun por métodos más sensibles de análisis de comunidades
microbianas.
El Efecto de las Perturbaciones Naturales en los Suelos y Hojarasca del
Yunque
Los huracanes y tormentas pueden depositar masivas cantidades de
material orgánico que puede alterar el ciclo de nutrientes en los suelos. Estos
cambios súbitos pueden alterar la estructura y las poblaciones de
microorganismos como los hongos (Lodge y Cantrell 1995). Las perturbaciones
antropogénicas y naturales juegan un rol crítico al afectar la estructura y función
de los ecosistemas en especial los caribeños (Willig et al 1996). En la
publicación de Wolters et al del 2000, se establece que las respuestas a nivel de
ecosistema son difíciles de determinar por los cambios en las interacciones
arriba y debajo del suelo. Las dinámicas son complejas e incluyen efectos
simultáneos directos e indirectos del diseño del ecosistema, procesos en las
redes alimenticias y las relaciones simbióticas, y antagonistas entre los
96
componentes bióticos del suelo y las plantas. Se ha demostrado que los
huracanes representan perturbaciones importantes superpuestas a un paisaje
modificado por prácticas agrícolas y forestales humanas.
En este estudio se ha rechazado la hipótesis (Ho) ya que se ha podido
presentar que los microorganismos en los suelos y de hojarasca pueden ser
afectados por los huracanes debido a las aberturas del dosel y el movimiento de
biomasa en el bosque. De este estudio se desprende que los hongos en los
bosques son sensibles a estos cambios, en especial en las aberturas del dosel.
Los grupos de actinomicetos y grupos de bacterias Gram negativas reflejan
similarmente estos cambios aunque no como en los hongos. También en este
estudio se ha podido determinar, que en el suelo del bosque de tabonuco, existe
un dinamismo que aún debe ser descifrado desde la perspectiva microbiana, y
ver que interacciones pueden existir con organismos como lo son los micro-
invertebrados. Este análisis no debe ser únicamente descifrado a nivel de
diversidad, sino de funciones y procesos. Los microorganismos en el suelo y la
hojarasca pueden servir como fuente o almacén de nutrientes de plantas
(Groffman et al 1993). La recuperación del bosque dependerá de las dinámicas
de inmovilización y competencia por nutrientes entre los microorganismos y las
plantas. Este principio aplica a estudios realizados luego del huracán Hugo,
donde la masiva acumulación de materia orgánica estimuló la inmovilización
microbiana de nutrientes, reduciendo la disponibilidad de nitrógeno y otros
nutrientes a los árboles (Zimmerman et al 1995).
97
El Uso De Señales De Lípidos Como Bioindicadores En El Manejo Y
Monitoreo De Ecosistemas Naturales
Los recientes avances en las herramientas moleculares en la ecología
microbiana, que pueden describir la diversidad funcional y fisiológica, están
ampliando nuestra comprensión de la estructura de la comunidad microbiana y
la capacidad para realizar un seguimiento de sus cambios en el conjunto
dinámico de las comunidades (Kaur et al 2005). El análisis de lípidos provee
resultados cuantitativos medibles, donde las biomoléculas en los
microorganismos se convierten rápidamente para representar la vida actual de la
comunidad. Esto se da desde un plano cualitativo y cuantitativo, que parecen
tener una importancia para evaluar y supervisar la estructura de la comunidad
microbiana, su estado fisiológico y de estrés. Los análisis de comunidades se
han aplicado a distintos sustratos en sistemas naturales que incluyen agua, aire,
suelo, sedimentos y material vegetal entre otros. Sin embargo existen algunas
limitaciones asociadas en el análisis de lípidos como biomarcadores, los cuales
limitan su uso a distintas escalas. Por ejemplo, a nivel de especies, no se pude
utilizar ya que la base de datos para la interpretación de los biomarcadores se
basa en los ácidos grasos obtenidos de cultivos puros. La interpretación de los
ácidos grasos puede ser equivocada si no se conoce el sistema que se estudia,
ya que ciertos ácidos grasos son compartidos entre procariontes y eucariotas, e
incluso entre grupos taxonómicos. No obstante, la técnica de lípidos no deja de
ser importante en el monitoreo y evaluación de sistemas naturales a una escala
de resolución más alta.
98
La técnica empleada en este estudio (EL-FAME) tiene algunas ventajas y
desventajas relacionadas a su análisis. El método de extracción de fosfolípidos
(PLFA) han sido considerado como un procedimiento estándar para obtener
perfiles de ácidos grasos en muestras ambientales. Pero, este método requiere
el fraccionamiento de los lípidos totales en lípidos neutrales, fosfolípidos y
glicolípidos a través de una columna de sílice. La ventaja de este método es que
describe la estructura específicamente de microorganismos vivos. Sin embargo,
este método es laborioso y no es directo como el EL-FAME. Este último extrae
los lípidos directamente de los sustratos y los lípidos son transformados bajo la
misma reacción alcalina suave como en el PLFA. No obstante, se ha establecido
que los FAME se forman de todos los lípidos en los microorganismos en vez de
solamente de fosfolípidos (Ferreira 2006). Dentro de éstas fuentes están los
lípidos neutrales y los glicolípidos. Pese a estas desventajas, el EL-FAME puede
igualar a PLFA como una herramienta para medir cambios relativos en la
biomasa total o biomasa de grupos específicos. De esta forma, y pese a los
cuidados en el uso de este método, este simple método podría ser útil en la
evaluación y monitoreo de ambientes naturales, y que el mismo mejore los
sistemas actuales que evalúan impactos ambientales desde una perspectiva
molecular. Tradicionalmente las evaluaciones ambientales se hacen desde el
plano superior del suelo y no se toma en cuenta el suelo y sus componentes, en
especial los bióticos. Sin embargo, el estudio solo de la diversidad no es útil si
no se tiene en cuenta la perspectiva funcional del sistema. Ya que en los
procesos y actividades se encuentra la mediación de nutrientes mediante la
99
descomposición e inmovilización de sustancias en el complejo sistema que
representa el suelo en los bosques tropicales.
Conclusión
Los suelos y la hojarasca del bosque de tabonuco en El Verde son muy
diversos en ácidos grasos. Sin embargo la composición de ácidos grasos en
cada sustrato (suelo y hojarasca) es distinta. De igual forma, ambos sustratos
pueden difierir grandemente en la concentración total de ácidos grasos
(hojarasca es mayor que suelo), principalmente por los hongos presentes en la
hojarasca. Esto particularmente sugiere que la composición microbiana para
ambos sustratos es distinta, teniendo implicaciones en los procesos como el
ciclo de nutrientes que ocurren en ambos micro-ambientes. La variación de
estos ácidos grasos puede también cambiar con respecto al tiempo y entre las
localidades dentro del bosque previo a un disturbio.
La concentración de los ácidos grasos puede variar en el suelo luego de
manipular el bosque, principalmente cuando el dosel se abre seguido por la
redistribución de la biomasa vegetal. Este fenómeno es muy notable en las
comunidades de hongos en suelo, los cuales disminuyeron cuando el dosel se
abrió. En hojarasca, los efectos de los tratamientos sobre la concentración total
comenzaron a observarse en diciembre de 2005 y junio de 2006 donde en este
último mes, la concentración disminuyó en las parcelas con dosel abierto.
Las comunidades de microorganismos pueden variar en el bosque luego
de un disturbio principalmente en el suelo. Las comunidades de
microorganismos en las parcelas con dosel abierto son muy distintas a las de
100
dosel cerrado. En estas parcelas abiertas, los microorganismos como los Gram
negativos (en especial bacterias anaeróbicas), son más abundantes debido a las
altas temperaturas y a la saturación del suelo con agua. En cambio, las
comunidades de hongos prefirieron ambientes cerrados (dosel cerrado).
Los huracanes y tormentas pueden causar cambios en las comunidades
de organismos encima del suelo y debajo de este. Aún hacen falta más estudios
para descifrar las complejas dinámicas que tienen lugar en el suelo y hojarasca
del bosque una vez han ocurrido perturbaciones. La importancia de los efectos
va más allá de los cambios en comunidades, sino en cómo esos cambios se
traducen en los procesos de mineralización e inmovilización de nutrientes que
son vitales en la recuperación del bosque.
101
Literatura Citada Alugupalli S, Larsson L, Slosárek M, Jaresova M. 1992. Application of gas
chromatography-mass spectrometry for rapid detection of Mycobacterium
xenopi in drinking water. Applied Environmental Microbiology 58:3538-
3541.
Arunachalam A, Arunachalam K. 2000. Influence of gap size and soil properties
on microbial biomass in a subtropical humid forest of north-east India.
Plant and Soil 223:185-193.
Atlas RM, Bartha R. 1993. Microbial Ecologyogy Fundamentals and Applications.
3rd ed. Benjamin Cummings Publishing, New York.
Bååth E, Frostegård Å, Fritze H. 1992. Soil bacterial biomass, activity,
phospholipid fatty-acid pattern, and pH tolerance in an area polluted with
alkaline dust deposition. Applied Environmental Microbiology 58:4026-
4031.
Bååth E, Frostegård Å, Pennanen T, Fritze H. 1995. Microbial community
structure and pH response in relation to soil organic matter quality in
wood-ash fertilized, clear-cut or burned coniferous forest soils. Soil
Biology and Biochemistry 27:229-240.
Bai Q, Gattinger A, Zelles L. 2000. Characterization of microbial consortia in
paddy rice soil by phospholipid analysis. Microbial Ecology 39:273-281.
102
Balkwill DL, Murphy EM, Fair DM, Ringelberg DB, White DC. 1998. Microbial
communities in high and low recharge environments: implications for
microbial transport in the vadose zone. Microbial Ecologyogy 35:156–17.
Bligh EG, Dyer WJ. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification.
Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37:911-917.
Bobbie R J, White DC. 1980. Characterization of benthic microbial community
structure by high-resolution gas chromatography of fatty acid methyl
esters. Applied Environmental Microbiology 39:1212-1222.
Borga P, Nilsson M, Tunlid A. 1994. Bacterial communities in peat in relation to
botanical composition as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil
Biology and Biochemistry 7:841-848.
Borneman J, Skroch PW, O’Sullivan KM, Palus JA, Rumjanek NG, Jansen JL,
Nienhuis J, Triplett EW. 1996. Molecular microbial diversity of an
agricultural soil in Wisconsin. Applied Environmental Microbiology
62:1935– 1943.
Bossio DA, Scow KM. 1998. Impacts of carbon and flooding on soil microbial
communities: phospholipid fatty acid profiles and substrate utilization
patterns. Microbial Ecology 35:265-278.
Bowman JP, Sly LI, Nichols PD, Hayward AC. 1993. Revised taxonomy of the
methacontrolrophs: description of Methylobacter gen. nov., emendation of
Methylococcus, validation of Methylosinus and Methylocystis species, and
a proposal that the family Methylococcaceae includes only the group I
103
methacontrolrophs. International Journal of Systematic Bacteriology
43:735–753
Bray SR. 2005. Interactions between plants and soil microbes in Florida
communities: Implications for invasion and ecosystem ecology
[dissertation]. University of Florida. 125p
Brown S, Lugo AE, Silander S, Liegel L. 1983. Research history and
opportunities in the Luquillo Experiental Forrest. U. S. Deparment of
Agriculture for. Serv. General Technical Report. SO-44, New Orleans,
Louisiana.
Bull ID, Parekh NR, Hall GM, Ineson P, Evershed RP. 2000. Detection and
classification of atmospheric methane oxidizing bacteria in soil. Nature
405:175-178.
Cavigelli, MA, Robertson GP, Klug MJ. 1995. Fatty acid methyl ester (FAME)
profiles as measures of soil microbial community structure. Plant Soil
170:99-113.
Coleman ML, Hedrick DB, Lovley DR, White DC, Pye K. 1993. Reduction of
Fe(III) in sediments by sulfate-reducing bacteria. Nature 361:436-438
Cowley G.T. 1970. Effects of radiation on the microfungal population of six litter
species in the Luquillo Experimental Forest. In: A tropical rain forest: a
study of irradiation and ecology at El Verde, Puerto Rico. Odum HT,
Pigeon RF, editores. US Atomic Energy Commission. US Deparment of
Commerce, Springfield, VA. p F25-28.
104
Crow TR. 1980. A rain forest chronicle: 30–year record of change in structure
and composition at El Verde, Puerto Rico. Biotropica 12:42-55
Denslow, JS. 1987. Tropical forest gaps and tree species diversity. Annual
Review of Ecology and Systematics 18:431-452.
Doyle TW. 1981. The role of disturbance in the gaps and tree species diversity of
a montane rain forest: an application of a concepts and application of a
tropical forest successional model. In: Forest succession: concepts and
applications. West DC, Shugart HH y Botkin DB, editores. Springer-Verlag
New York, Inc., New York, New York. p 56-73.
Fang J, Barcelona MJ. 1998. Biogeochemical evidence for microbial community
change in a jet fuel hydrocarbons contaminated aquifer. Organic
Geochemistry 29:899-907
Federle TW, Hullar MA, Livingston R.J, Meeter DA, White, DC. 1983. Spatial
distribution of biochemical parameters indicating biomass and community
composition of microbial assemblies in estuarine mud flat sediments.
Applied Environmental Microbiology 45: 58-63.
Federle TW. 1986. Microbial distribution in soil. In: Perspectives in Microbial
Ecologyogy. Megusar F, Ganthaer M. Solvene, editores . Society for
Microbiology, Ljubljana. p 493–498.
Ferreira Fernandez M. 2006. Fatty acid profiling of soil microbial communities: a
comparison of extraction methods and temporal dynamics in plant residue
amended soils [disertación]. Oregon State University. 154 p.
105
Findlay RH, Dobbs FC. 1993. Quantitative description of microbial communities
using lipid analysis. In: Kemp PF, Sherr BF, Sherr EB, Cole JJ, editores.
Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Lewis Publishers,
Boca Raton, FL. p271–284.
Findlay RH, Trexler MB, Guckert JB, White DC. 1990. Response of a benthic
microbial community to biotic disturbance. Marine Ecology Progress
Series 61:135-148.
Forney LJ, Liu .-T, Guckert JB, Kumagai Y, Namkung E, Nishihara T, Larson RJ.
2001. Structure of microbial communities in activated sludge: potential
implications for assessing the biodegradability of chemicals. Ecotoxical
and Environmental Safety 49:40-53.
Fredrickson JK, Balkwill DL, Drake GR, Romine MF, Ringelberg DB, White DC.
1995a. Aromatic-degrading Sphingomonas isolates from the deep
subsurface. Applied Environmental Microbiology 61:1917–1922.
Fritze H, Pennanen T, Vanhala P. 1997. Impacts of fertilizers on the humus layer
microbial community structure of Scots pine stands growing along a
gradient of heavy metal pollution. In: Microbial Communities. Functional
Versus Structural Approaches. Insam H y Rangger A, editores. Springer-
Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. p68-83.
Fritze H, Perkiömäki J, Saarela U, Katainen R, Tikka P, Yrjälä K, Karp M, Haimi
J, Romantschuk M. 2000. Effect of Cd-containing wood ash on the
microflora of coniferous forest humus. FEMS Microbial Ecology 32:43-51.
106
Frostegård Å, Bååth E, Tunlid A. 1993a. Shifts in the structure of soil microbial
communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty-acid
analysis. Soil Biology and Biochemistry 25:723-730.
Frostegård Å, Tunlid A, Bååth E. 1993b. Phospholipid fatty acid composition,
biomass, and activity of microbial communities from two soil types
experimentally exposed to different heavy metals. Applied Environmental
Microbiology 59:3605-3617.
Frostegård Å, Tunlid A, Bååth E. 1996. Changes in microbial community
structure during long-term incubation in two soils experimentally
contaminated with metals. Soil Biology and Biochemistry 28:55-63.
Frostergard Å, Bååth E. 1996. The use of phospholipids fatty acids analysis to
estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biology and Fertility of Soils
22:59-65.
Green CT, Scow KM. 2000. Analysis of Phospholipids fatty acids (PLFA) to
characterize microbial communities in aquifers. Hydrogeology Journal
8:126-141.
Groffman PM, Zak DR, Christensen S, Mosier A, Tiedje JM. 1993. Early spring
nitrogen dynamics in a temperate forest landscape. Ecology 74:1579-
1585.
Guezennec J, Fiala-Medioni A. 1996. Bacterial abundance and diversity in the
Barbados Trench determined by phospholipid analysis. FEMS Microbial
Ecology 19:83-93.
107
Hawksworth DL, Colwell RR. 1992. Microbial Diversity 21: biodiversity amongst
microorganisms and its relevance. Biodiversity and Conservation 1: 221-
226.
Hedjer J.1985. Tropical agarics, resource relations and fruiting periodicity. In:
Developmental biology of higher fungi. Moore D, Casselton LA, Wood DA,
Frankland JC , Editores. Cambridge Univ Press, Cambridge. p41-86.
Holler JR, Cowley GT. 1970. Response of soil, root, and litter microfungal
population to radiation. In: A tropical rain forest: a study of irradiation and
ecology at El Verde, Puerto Rico. Odum HT y Pigeon RF, Editores. US
Atomic Energy Commission. US Deparment of Commerce, Springfield, VA
22161. p35-39.
Hughes JB, Hellmann JJ, Ricketts TH, Bohannan BJM, 2001. Minireview:
counting the uncountable: statistical approaches to estimating microbial
diversity. Applied Environmental Microbiology 67:4399–4406.
Ibekwe AM, Kennedy AC. 1998. Phospholipid fatty acid profiles and carbon
utilization patterns for analysis of microbial community structure under
field and greenhouse conditions. FEMS Microbial Ecology 26:151-163.
Ibekwe AM, Papiernik SK, Gan J, Yates SR, Yang C-H, Crowley DE. 2001.
Impact of fumigants on soil microbial communities. Applied Environmental
Microbiology 67:3245-3257.
Insam H, Bååth E, Berreck M, Frostegård Å, Gerzabek MH, Kraft A, Schinner F,
Schweiger P, Tschuggnall G. 1999. Responses of the soil microbiota to
108
elevated CO2 in an artificial tropical ecosystem. Journal of Microbiologycal
Methods 36:45-54.
Kaur A, Chaudhary A, Kaur A, Choudhary R, Kaushik R. 2005. Phospholipid fatty
acid- A bioindicator of environmental monitoring and assessment in soil
ecosystem. Current Science. 89:1103-1112.
Keinänen MM , Leena K, Korhonen, Markku J, Lehtola, Ilkka T. Miettinen, Pertti
J. Martikainen, Terttu Vartiainen, and Merja H. Suutari. 2002. The
Microbial Community Structure of Drinking Water Biofilms Can Be
Affected by Phosphorus Availability. Applied Environmental Microbiolpgy
68:434-439.
Khan M, Scullion J. 2000. Effect of soil on microbial responses to metal
contamination. Environmental Pollution 110:115-125.
Kieft TL, Ringelberg DB, White DC. 1994. Changes in ester-linked phospholipid
fatty acid profiles of subsurface bacteria during starvation and desiccation
in a porous medium. Applied and Environmental Microbiology 60: 3292-
3299.
King JD, White DC, Taylor CW. 1977. Use of lipid composition and metabolism to
examine structure and activity of estuarine detrital microflora. Applied
Environmental Microbiology 33: 1177-1183.
Kirk JK, Beaudette LA, Hart M, Moutoglis P, Klironomos JN, Lee H, Trevors JT.
2004. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of
Microbiological Methods 58:169-188.
109
Langworthy DE, Stapleton RD, Sayler GS, Findlay RH. 2002. Lipid analysis of
the response of a sedimentary microbial community to polycyclic aromatic
hydrocarbons. Microbial Ecology 43:189-198.
Lechevalier P. 1977. Lipids in bacterial taxonomy a taxonomist's view. Crc crit.
Rev. Microbiol 5:109-210.
Lehman RM, Colwell FS, Ringelberg DB, White DC. 1995. Combined microbial
community level analyses for quality assurance of terrestrial subsurface
cores. Jounal of Microbiological Methods 22:263–281.
Lodge DJ, Cantrell S. 1995. Fungal communities in wet tropical forests: variation
in time and space. Canadian Journal of Botany 73:1391-1398
Lodge DJ, Hawksworth, Richie BJ. 1996. Microbial diversity and tropical forest
functioning. Ecological Studies 122:71-100.
Lodge DJ, McDowell WH, McSwiney CP. 1994. The importance of nutrient
pulses in tropical forest. Trend in Ecology and Evolution. 9: 384-387.
Lodge DJ, Scatena FN, Asbury CE, Sánchez MJ. 1991. Fine litterfall and related
nutrients inputs resulting from Hurricane Hugo in subtropical wet and
lower montane rain forests of Puerto Rico. Biotropica 23:336-342.
Lodge DJ. 1993. Nutrient cycling by fungi in wet tropical forest. In: Aspects of
tropical mycology. Isaac S, Frankland JC, Watling R, y Whalley AJS,
editores. British Mycological Society Symposium Series. Vol. 19.
Cambridge University Press. Cambridge. p37-58.
Lodge DJ, McDowell WH, Macy J, Ward SK, Leisso R, Claudio-Campos K,
Kühnert K. 2008. Distribution and role of mat-forming saprobic
110
basidiomycetes in a tropical forest. In L. Boddy, J. C. Frankland, and P. V.
West, editors. Ecology of Saprotrophic Basidiomycetes. British
Mycological Society Symposia Series, Academic Press, Elsevier Ltd.
p197-209
Ludvigsen L, Albrechtsen HJ, Ringelberg DB, Ekelund F, Christensen TH. 1999.
Composition and distribution of microbial biomass in a landfill leachate
contaminated aquifer (Grindsted, Denmark). Microbial Ecology 37:197-
207.
Lugo AE, Rivera-Battle CT. 1987. Leaf production, growth rate, and age of the
palm Prestoea montana in the Luquillo Experimental Forest, Puerto Rico.
Journal of Tropical Ecology 3: 151-162.
Macalady JL, Mack EE, Nelson DC, Scow KM. 2000. Sediment microbial
community structure and mercury methylation in mercury-polluted Clear
Lake, California. Applied Environmental Microbiology 66:1479-1488.
Macnaughton SJ, Cormier MR, Jenkins TL, Davis GA, White DC. 1999.
Quantitative sampling of indoor air biomass by signature lipid biomarker
analysis. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 22:80-87.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 1997. Brock biology of microorganisms.
Prentice hall, Upper Saddle River, New Jersey Makula RA (1978)
Phospholipid composition of methaneutilizing bacteria. Journal of
Bacteriology 134: 771–777.
Makula RA. 1978. Phospholipid composition of methane-utilizing bacteria. J
Bacteriol 134:771–777.
111
McDowell WH, McSwiney CP, Bowden WB. 1996. Effects of hurricane
disturbance on groundwater chemistry and riparian function in a tropical
rain forest. Biotropica 28:577-584.
Merilä P, Strömmer R, Fritze H. 2002. Soil microbial activity and community
structure along a primary succession transect on the land-uplift coast in
western Finland. Soil Biology and Biochemistry 34:1647-1654.
Nakamura A, Tun CC, Asakawa S, Kimura M. 2003. Microbial community
responsible for the decomposition of rice straw in a paddy field: estimation
by phospholipid fatty acid analysis. Biology and Fertility of Soils 38:288-
295.
Nichols PD, Smith GA, Antworth CP, Hanson RS, White DC. 1985. Phospholipid
and lipopolysaccharide normal and hydroxyl fatty acids as potential
signatures for the methaneoxidizing bacteria. FEMS Microbiology
Ecology 31:327–335.
Niklaus PA, Alphei J, Ebersberger D, Kampichler C, Kandeler E, Tscherko D.
2003. Six years of in situ CO2 enrichment evoke changes in soil structure
and soil biota of nutrient-poor grassland. Global Change Biology 9:585–
600.
O´Leary WM, Wilkinson SG. 1988. Gram-positive bacteria. In: Microbial lipids.
Ratledge C y Wilkinson SG, editors. Vol. 1. London, Great Britain:
Academic Press. p117-201.
Odham G, Tunlid A, Westerdahl G, Larsson L, Guckert JB, and White, DC.
(1985). Determination of microbial fatty acid profiles at femtomolar levels
112
in human urine and the initial marine microfouling community by capillary
gas chromatography-chemical ionization mass spectrometry with negative
ion detection. Journal of Microbiologycal Methods 3: 331- 344.
Ohtonen R, Fritze H, Pennanen T, Jumpponen A, Trappe J. 1999. Ecosystem
properties and microbial community changes in primary succession on a
glacier forefront. Oecologia 119: 239–246.
Olsson PA, Thingstrup I, Jakobsen , Bååth, F. 1999. Estimation of the biomass of
arbuscular mycorrhizal fungi in a linseed field. Soil Biology and
Biochemistry 31:1879–1887.
Parker JH, Smith GA, Fredrickson HL, Vestal JR, White DC. 1982. Sensitive
assay based on hydroxy fatty acids from lipopolysaccharide lipid A, for
Gram-negative bacteria in sediments. Environmental Microbiology 44:
1170–1177.
Paul EA, Clark FE. 1996. Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press,
San Diego.
Peacock AD, McNaughton SJ, Cantu JM, Dale VH, White DC. 2001. Soil
microbial biomass and community composition along an anthropogenic
disturbance gradient within a long-leaf pine habitat. Ecological Indicators
1:113– 121.
Pennanen T, Fritze H, Vanhala P, Kiikkilä O, Neuvonen, S, Bååth, E. 1998a.
Structure of a microbial community in soil after prolonged addition of low
levels of simulated acid rain. Applied Environmental Microbiology 64:
2173-2180.
113
Pennanen T, Frostegård Å, Fritze H, Bååth E. 1996. Phospholipid fatty acid
composition and heavy metal tolerance of soil microbial communities
along two heavy metal-polluted gradients in coniferous forests. Applied
Environmental Microbiology 62:420-428.
Pennanen T, Liski, J, Bååth, E, Kitunen, V, Uotila, J, Westman, C. J, Fritze, H.
1999. Structure of the microbial communities in coniferous forest soils in
relation to site fertility and stand development stage. Microbial Ecology
38:168-179.
Pennanen T, Perkiömäki J, Kiikkilä O, Vanhala P, Neuvonen S, Fritze H. 1998b.
Prolonged, simulated acid rain and heavy metal deposition: separated and
combined effects on forest soil microbial community structure. FEMS
Microbial Ecology 27:291-300.
Pickett ST y White PS. 1985. The ecology of natural disturbance and patch
dynamics. Academic. Press, New York.
Pietikäinen J, Hiukka R, Fritze H. 2000. Does short-term heating of forest humus
change its properties as a substrate for microbes? Soil Biology and
Biochemistry 32:277-288.
Pinturier-Geiss L, Méjanelle L, Dale B, Karlsen DA. 2002. Lipids as indicators of
eutrophication in marine coastal sediments. Journal of Microbiologycal
Methods 48:239-257.
Priha O, Grayston SJ, Pennanen T, Smolander A. 1999. Microbial activities
related to C and N cycling and microbial community structure in the
rhizospheres of Pinus sylvestris, Picea abies and Betula pendula
114
seedlings in an organic and mineral soil. FEMS Microbial Ecology 30:187-
199.
Qishui Z, Zak JC. 1995. Effects of gap size on litter decomposition and microbial
activity in subtropical forest. Ecology 78:2196- 2204
Ratledge C, Wilkinson SG. 1988a. Microbial lipids. In: An overview of microbial
lipids. Ratledge. C y Wilkinson SG. Editores. Vol 1. London, Great Britain:
Academic Press. p3-22.
Ringelberg DB, Sutton S, White DC. 1997. Biomass, bioactivity and biodiversity:
Microbial Ecologyogy of the deep subsurface: analysis of ester-linked
phospholipid fatty acids. FEMS Microbiology Review. 20:371-377.
Ritchie NJ, Shutter ME, Dick RP, Myrold DD. 2000. Use of length heterogeneity-
PCR and FAME to characterize microbial communities in soil. Applied
Environmental Microbiology 66:1668-1675.
Rondon MR, Goodman RM, Handelsman J. 1999. The earth’s bounty: assessing
and accessing soil microbial diversity. Trends in Biotechnology 17:403–
409.
Ronn R, Gavito M, Larsen J, Jakobsen I, Frederiksen H, Christensen S. 2002.
Response of free-living soil protozoa and microorganisms to elevated
atmospheric CO2 and presence of mycorrhiza. Soil Biology and
Biochemistry 34: 923-932.
Sasser M. 1990. Technical note 102. Tracking a strain using the Microbial
Identification System. MIS, Newark, Delaware.
115
Saetre P, Bååth E. 2000. Spatial variation and patterns of soil microbial
community structure in a mixed sprucebirch stand. Soil Biology and
Biochemistry 32:909-917.
Schutter ME, Dick RP. 2000. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME)
methods for characterizing microbial communities. Soil Scientists of
America Journal 64:1659-1668.
Sebastian A, Larsson L. 2003. Characterization of the microbial community in
indoor environments: a chemicalanalytical approach. Applied
Environmental Microbiology 69:3103-3109.
Silver WL, Scatena, FN, Johnson AH, Siccama, TG, Watt F. 1996. At what
temporal scale does disturbance affect belowground nutrient pools.
Biotropica 28:441-458.
Slosárek M, Alugupalli S, Kaustóva J, Larsson L. 1996. Rapid detection of
Mycobacterium kansasii in water by gas chromatography/ mass
spectrometry. Journal of Microbiologycal Methods 27:229-232.
Smooth JC y Findlay RH. 2001. Spatial and seasonal variation in a reservoir
sedimentary microbial community as determined by phospholipid analysis.
Microbial Ecology 42:350-358.
Steenwerth KL, Jackson LE, Calderón FJ, Stromberg MR, Scow KM. 2003. Soil
microbial community composition and land use history in cultivated and
grassland ecosystems of coastal California. Soil Biology and Biochemistry
35:489-500.
116
Steinberger Y, Zelles L, Bai QY, von Lützow M, Munch JC. 1999. Phospholipid
fatty acid profiles as indicators for the microbial community structure in
soils along a climatic transect in the Judean Desert. Biology and Fertility of
Soil 28:292-300.
Tiedje JM, Stein JL. 1999. Microbial Biodiversity: Strategies for its recovery. In:
Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain AL y Davies
J, Editores. Amer. Soc. Microbiol., Washington, DC. p682-692.
Torsvik V, Øvreas L. 2002. Microbial diversity and function in soil: from genes to
ecosystems. Current Opinion in Microbiology 5:240-245.
Tunlid A, Baird BH, Trexler MB, Olsson S, Findaly RH, Odham G, White DC.
1985. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly
β−hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in
the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Cannadian Journal
of Microbiology 31:1113-1119.
Tunlid A, White DC .1992. Biochemical analysis of biomass community structure,
nutritional status and metabolic activity of microbial communities in soil. In:
Stotzky G, Bollag J-M, editores. Soil biochemistry. Marcel Dekker, New
York. p229–262.
Vestal JR y White DC. 1989. Lipid analysis in Microbial Ecology. BioScience 39:
535–541.
Walker LR. 1991. Tree damage and recovery from Hurricane Hugo in Luquillo
Experimental Forest, Puerto Rico. Biotropica 23:379-385.
117
Walker JT, Sonesson A, Keevil CW, White DC. 1993. Detection of Legionella
pneumophila in biofilms containing a complex microbial consortium by
gas- chromatography mass- spectrometry analysis of genusspecific
hydroxy fatty-acids. FEMS Microbial Letters 113:139-144.
Walker LR, Zarin DJ, Fetcher N, Myster RW, Johnson AH. 1996b. Ecosystem
development and plant succession on landslides in the Caribbean.
Biotropica 28:566-576.
White D, Stair J, Ringelberg D. 1996. Quantitative comparisons of in situ
microbial biodiversity by signature biomarker analysis. Journal of Industrial
Microbiology and Biotechnology 17:185–196.
White DC . 1983. Analysis of microorganisms in terms of quantity and activity in
natural environments. Symposium of the Society for General Microbiology
34:37–66.
White DC . 1988 Validation of quantitative analysis for microbial biomass,
community structure, and metabolic activity. Advance Limnology 31:1-18.
White DC, Davis WM, Nickels JS, King JD, Bobbie RJ. 1979. Determination of
the sedimentary microbial biomass by extractable lipid phosphate.
Oecologia 40:51-62.
White DC, Pinkart HC, Ringelberg DB . 1997b. Biomass measurements:
biochemical approaches. In: Manual of environmental microbiology. Hurst
CJ, Knudsen GR, McInerney MJ, Stetzenbach LD y Walter MV, editores.
ASM Press, Washington, DC. p 91–101.
118
White DC, Stephen JR, Chang YJ, Gan YD, Peacock A, Pfiffner SM, Barcelona
MJ y Macnaughton SJ. 1999. Molecular characterization of microbial
communities in a JP-4 fuel contaminated soil. In: Alleman BC, Leeson A
editores. In situ remediation of petroleum hydrocarbon and other organic
compounds, vol 3. Battelle Press, Columbus, Ohio. p345–350.
White DC. 1994. Is there anything else you need to understand about the
microbiota that cancontrol be derived from analysis of nucleic acids?
Microbiology Ecology. 28:163–166.
Wilkinson SC, Anderson JM, Scardelis SP, Tisiafouli M, Taylor A, Wolters V.
2002. PLFA profiles of microbial communities in decomposing conifer
litters subject to moisture stress. Soil Biology & Biochemistry. 34:189-200.
Willig MR, Moorehead DL, Cox SB, Zak JC. 1996. Functional diversity of soil
bacteria communities in the tabonuco forest: the interaction of
anthropogenic and natural disturbance. Biotropica 28:471-483.
Wolters V, Silver WL, Bignell DE, Coleman DC, Lavelle P, Van Der Putten WH,
De Ruitter P, Rusek J, Wall DH, Wardle DA, Brussard L, Dangerfield JM,
Brown VK, Giller KE, Hooper DU, Sala O, Tiedje J, Van Veen JA. 2000.
Effects of global Changes on Above- and belowground biodiversity in
terrestial ecosystems: Implications of ecosystem functioning. BioScience.
50:1089-1098.
Yang JC y Insam H. 1991. Microbial biomass ans relative contributions of
bacteria and fungi in soil beneath tropical rain forest, Hainan Island,
China. Journal of Tropical Ecology 7:385-393.
119
Yao H, Wilson MJ, Campbell CD. 2000. Microbial biomass and community
structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land
use. Microbial Ecology 40:223-237.
Zak DR, Ringelberg DB, Pregitzer KS, Randlett DL, White DC, Curtis, PS. 1996.
Soil microbial communities beneath Populus grandidentata crown under
elevated atmospheric CO2. Ecol Appl 6: 257-262.
Zelles L, Bai QY, Beck T, Beese F. 1992. Signature fatty acids in phospholipids
and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and
community structure in agricultural soils. Soil Biology and Biochemistry
24:317-323.
Zelles L, Bai QY, Ma RX, Rackwitz R, Winter K, Beese F. 1994. Microbial
biomass, metabolic activity and nutritional status determined from fatty
acid patterns and poly-hydroxybutyrate in agriculturally-managed soils.
Soil Biology and Biochemistry 26:439-446.
Zelles L, Bai QY, Rackwitz R, Chadwick D, Beese F. 1995a. Determination of
phospholipid- and lipopolysaccharide-derived fatty acids as an estimate of
microbial biomass and community structures in soils. Biology and Fertility
of Soil 19:115-123.
Zelles L, Rackwitz R, Bai QY, Beck T, Beese F. 1995b. Discrimination of
microbial diversity by fatty acid profiles of phospholipids and
lipopolysaccharides in differently cultivated soils. Plant Soil. 170: 115-122.
Zelles L. 1997. Phospholipid fatty acid profiles in selected members of soil
microbial communities. Chemosphere 35:275-294.
120
Zelles L. 1999. Fatty acid patterns of phospholipids abd lipopolysaccharides in
the characterization of microbial communities in soil: a review. Biology and
Fertility of Soils 29:111-129.
Zimmerman JK, Pulliam WM, Lodge DJ, Quiñones Orfila V, Fetcher N, Guzmán
Grajales S, Parrotta JA, Asbury CE, Walker LR, Waide RB. 1995b.
Nitrogen immobilization by decomposing woody debris and the recovery of
tropical wet forest from hurricane damage. Oikos 72:314 322.
121
Apéndice A
Foto aérea del área de estudio en la estación El Verde, Luquillo, PR (foto por USGS 2000).
BBllooqquuee AA
NNPP++DD
PP--DD
PP++DD
CCoonnttrrooll
NN BBllooqquuee CC
NNPP++DD
PP++DD
PP++DD
CCoonnttrrooll
NNPP++DD
PP--DD
CCoonnttrrooll PP++DD
BBllooqquuee BB
122
Apéndice B
Posición y elevación de los tratamientos en área de estudio en la estación El Verde, Luquillo, PR.
NN PP--DD
NNPP++DD
PP++DD
PP++DD
CCoonnttrrooll
NNPP++DD
PP++DD
CCoonnttrrooll
NNPP++DD
PP--DD
CCoonnttrrooll
PP++DD
123
Apéndice C
Contornos de elevación y posición de los bloques en la estación El Verde, Luquillo, PR.
Bloque A
Bloque C
Bloque B
NN
1047
67
Altura (m)
