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UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO
Colegio de Postgrados
Investigación de Entamoeba histolytica en dos Comunidades Ecuatorianas
Thamara Andrade Mayorga
Sonia Zapata, Ph.D., Directora de Tesis
Tesis de grado presentada como requisito para la obtención del título de Magister en Microbiología
Quito, junio de 2015
Universidad San Francisco de Quito
Colegio de Postgrados
HOJA DE APROBACIÓN DE TESIS
Investigación de Entamoeba histolytica en dos Comunidades Ecuatorianas
Thamara Grisela Andrade Mayorga
Sonia Zapata, Ph.D., --------------------------------------------------------
Director de Tesis
Gabriel Trueba, Ph.D., -------------------------------------------------------
Director de la Maestría en Microbiología y
Miembro del Comité de Tesis
Venancio Arahana, Ph.D., -------------------------------------------------------
Miembro del Comité de Tesis
Stella de la Torre, Ph.D., -------------------------------------------------------
Decano del Colegio de Ciencias
Biológicas y Ambientales
Victor Viteri Breedy, Ph.D., -----------------------------------------------------------
Decano del Colegio de Posgrados
Quito, junio de 2015
© DERECHOS DE AUTOR
Por medio del presente documento certifico que he leído la Política de
Propiedad Intelectual de la Universidad San Francisco de Quito y estoy de
acuerdo con su contenido, por lo que los derechos de propiedad intelectual del
presente trabajo de investigación quedan sujetos a lo dispuesto en la Política.
Asimismo, autorizo a la USFQ para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
Firma: _____________________________________ Nombre: Thamara Andrade Mayorga C. I.: 1705826269 Lugar: Quito, junio de 2015
5
DEDICATORIA
A mi familia.
A la comunidad ecuatoriana.
6
Resumen
Introducción: La amebiasis constituye la tercera causa de muerte por enfermedades parasitarias (después de malaria y esquistosomiasis) a nivel mundial. La mayor morbilidad y mortalidad se han reportado en regiones de Centroamérica, Sudamérica, África, y el Subcontinente Indio. Sin embargo, la prevalencia de la amebiasis podría estar sobreestimada debido a que la microscopía no permite diferenciar E. histolytica (patógena) de E. dispar (no patógena). El uso de métodos moleculares contribuye a establecer la prevalencia real de esta parasitosis. Métodos: Se realizó un estudio de casos-controles en una comunidad rural y en una urbana y se analizó 346 muestras de heces utilizando microscopía simple y amplificación del gen SREHP para identificar y diferenciar E. histolytica (553 pb) y E. dispar (567 pb). Resultados: Por microscopía la frecuencia de quistes del complejo E. histolytica/E. dispar fue del 2.6% en la población urbana y 14.4% en la población rural. Por PCR la positividad fue de 29% en la población urbana y 17.8% en la población rural. En la población urbana la frecuencia de E. histolytica fue del 13%, mientras que la de E. dispar fue del 16% y 3.5% de las muestras presentó co-infección. En la población rural la frecuencia de E. histolytica fue de 3.4%, de E. dispar 14.4% y no se encontró co-infección. E. histolytica no estuvo asociada con diarrea en ninguna de las dos comunidades (OR 2.07, IC 95% 0.87-4.89 en la población urbana y OR 4.37, IC 95% 0.70-7.24 en la población rural). Conclusiones: En concordancia con otros estudios en el Ecuador y países con características socioeconómicas similares, la frecuencia de E. histolytica es menor que la de E. dispar en las dos poblaciones estudiadas. En ambas poblaciones E. histolytica parecería no estar asociada a enfermedad diarreica. La técnica por PCR podría ser una prueba más sensible y más específica para el diagnóstico de amebiasis.
Palabras clave: Amebiasis, Colitis y enfermedad extraintestinal, Epidemiología.
7
Abstract
Introduction: Amebiasis is the third leading cause of death from parasitic disease after malaria and schistosomiasis; most morbidity and mortality have been reported in regions of Central and South America, Africa and the Indian subcontinent. However, the prevalence of amebiasis may be overestimated because most reports rely on microscopy which does not differentiate between the pathogenic E. histolytica and the commensal E. dispar. New diagnostic techniques allow the differentiation and contribute to stablish the prevalence of this parasite. Method: A case-control study was conducted in both rural and urban communities and 346 stool samples were analyzed using microscopic techniques and PCR (gene SREHP) in stool samples to identify and differentiate E. histolytica (553 bp) from E. dispar (567 bp). Results: Frequency of E. histolytica / E. dispar cysts detected by microscopy was 2.6% for the urban population and 14.4% for the rural population. When analyzed by PCR the frequency was 29% in the urban population and 17.8% of the rural population was positive for any species. In the urban population frequency of E. histolytica was 13% whereas that of E. dispar was 16% (3.5% of the samples had coinfection). In the rural population frequency of E. histolytica was 3.4% and E. dispar was 14.4% and there was not evidence of co-infection. E.histolytica infection was not associated with diarrhea in any of the two communities OR 2.07, CI 95% 0.87-4.89 in the urban population and OR 4.37, CI 95% 0.70-7.24 in the rural population. Conclusions: Consistent with similar studies in Ecuador and countries with comparable socio- economic characteristics, E. histolytica’s frequency is lower than that of E. dispar in both populations (urban and rural). E. histolytica was not associated with diarrheal disease. The PCR technique may be a more sensitive and specific diagnostic methodology in fecal testing for amebiasis.
Keywords: Amebiasis, colitis and extraintestinal disease, Epidemiology,
8
CONTENIDO
RESUMEN................................................................................................................6
ABSTRACT...............................................................................................................7
INTRODUCCIÓN....................................................................................................11
Amebiasis, concepto y epidemiología.....................................................................11
E. histolytica, E. dispar: dos especies morfológicamente idénticas........................12
Métodos diagnósticos y el impacto de su aplicación en el estudio de la epidemiología de la amebiasis................................................................................13
E. histolytica: fisiología, estructura y patogenia......................................................15
Adhesión................................................................................................................16
Lisis tisular............................................................................................................17
Factores de virulencia............................................................................................18
La respuesta inmune.............................................................................................19
Factores que influyen en el desarrollo de la amebiasis invasiva...........................20
La amebiasis en Ecuador.....................................................................................21
Referencias..........................................................................................................22
9
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN..........................................................................27
Introducción.........................................................................................................28
Materiales y métodos...........................................................................................29
Área de estudio y colección de muestras............................................................29
Transporte y conservación de las muestras........................................................30
Identificación de E. histolytica y E. dispar...........................................................31
Análisis estadístico..............................................................................................32
Resultados...........................................................................................................32
Discusión.............................................................................................................33
Conclusiones y recomendaciones........................................................................35
Referencias..........................................................................................................41
10
TABLAS
Tabla 1: Resumen de investigaciones de Entamoeba histolytica/dispar en varias
regiones del mundo...............................................................................................36
Tabla 2: Datos de área de estudio y muestreo......................................................37 Tabla 3: Mezcla de reacción para PCR.................................................................37 Tabla 4: E.histolytica/E.dispar por PCR y microscopía: sensibilidad y especificidad
del método microscópico con relación al PCR.......................................................38
Tabla 5: Frecuencia de E. histolytica y E. dispar...................................................39
Tabla 6: Riesgo Caso vs. Control...........................................................................39 Tabla 7: Resumen de investigaciones sobre E. histolytica/E. dispar en Ecuador..40
11
INTRODUCCIÓN
Amebiasis: concepto y epidemiología
El género Entamoeba integra siete especies que colonizan el intestino humano: E.
coli, E. hartmanni, E. polecki, E. dispar, E. moshkovskii, E. bangladeshi y E.
histolytica, las cuatro últimas son morfológicamente iguales y solo E. histolytica
está asociada con enfermedad en el humano como agente etiológico de la
amebiasis 1,2,3,4.
La amebiasis es de distribución mundial y se estima que 480 millones de personas
están infectadas, de las cuales 36 millones desarrollaron colitis invasiva o
abscesos extra-intestinales (en su mayoría hepáticos) que causan la muerte de
entre 40.000 a 100.000 personas anualmente 3,5,6 lo cual en una escala global,
ubica a esta enfermedad como la tercera causa de muerte por enfermedades
parasitarias después de la malaria y la esquistosomiasis 5. Noventa por ciento de
las personas infectadas son asintomáticas (portadores sanos) 1,5 quienes, en su
mayoría, habitan en países en vías de desarrollo 1. En países desarrollados los
casos de amebiasis se asocian a grupos de riesgo como inmigrantes provenientes
de áreas endémicas, viajeros recientes a regiones de alta prevalencia o prácticas
sexuales oro-anales; sin embargo hay reportes de casos de enfermedad invasiva
en personas que no pertenecen a estos grupos de riesgo 7.
La epidemiología de la amebiasis se ha estudiado clásicamente mediante la
observación microscópica (análisis coprológico), técnica que no permite la
diferenciación de E. histolytica de las otras especies morfológicamente idénticas y
consideradas no patógenas. Por esta razón se presume que su prevalencia
estaría sobreestimada 1,5,8. La baja incidencia de enfermedad invasiva (menos del
10%) en personas con amebiasis podría ser indicio de un diagnóstico equivocado
9. El uso de nuevos métodos diagnósticos que hacen posible identificar a E.
histolytica permitirían establecer una prevalencia real.
12
E. histolytica y E. dispar: Dos especies morfológicamente idénticas
En 1850 se asoció por primera vez a la Entamoeba con enfermedad cuando
Lambal la encontró en las heces de un niño con disentería en la ciudad de Praga
2. En 1913 Walker y Sellards demostraron que la forma infectiva de E. histolytica
es el quiste que causa la colitis amebiana y, que los portadores asintomáticos
transmiten y/o pueden desarrollar la enfermedad en cualquier momento 2,10. Luego
en 1925 Dobell describió 4 formas del ciclo de vida trofozoito, prequiste, quiste y
la ameba metaquística. En ese mismo año el parasitólogo francés Emile Brumpt
formuló la teoría de que la diferencia entre las infecciones asintomáticas y las que
presentan síntomas podría estar correlacionada con la existencia de dos especies
de amebas morfológicamente iguales, una capaz de causar enfermedad invasiva,
a la que denominó E. dysenteriae, y otra causante de la infección asintomática a
la que denominó E. dispar. Sin embargo, esta teoría fue rechazada por los
científicos de la época 1,2,10. En 1961 Diamond et al. lograron obtener un cultivo
axénico de E. histolytica, lo que posibilitó el desarrollo de estudios in vivo e in vitro.
Y más tarde Sargeaunt y Williams (1978) demostraron por medio del análisis
isoenzimático (zymodema), que las amebas cultivadas aisladas de pacientes con
manifestaciones clínicas y aquellas provenientes de pacientes asintomáticos
podían ser diferentes 1,2. Esta evidencia llevó a la hipótesis de si E. histolytica
puede adquirir patogenicidad, es decir la expresión de patogenicidad es inducible
y depende de las condiciones ambientales. La hipótesis contraria sería que las
amebas patógenas y no patógenas son genéticamente distintas. Posteriormente,
Tannich et al. (1989) demostraron que esta diferencia se debe a que son
genéticamente distintas 11. Las investigaciones de Petri et al. (1987) con sueros
de personas que desarrollaron absceso hepático amebiano determinaron que la
proteína de superficie GAL/GalLectina, involucrada en la adherencia amebiana a
los enterocitos, es altamente antigénica (95% de los pacientes habían desarrollado
anticuerpos contra este proteína) 12. En 1993 Diamond y Clark publicaron una
nueva descripción de E. histolytica (en base a los estudios bioquímicos, genéticos
e inmunológicos) 9. Esta nueva propuesta fue regida en el Boletín Epidemiológico
13
de la OPS de marzo de 1997, en el que se publicó las resoluciones de la Consulta
con expertos en amibiasis en Ciudad de México, en el que se establece que la
Entamoeba patógena será denominada E. histolytica y la no patógena se
denominaría E. dispar y que la observación (por microscopía) de quistes debería
reportarse como quistes del complejo E. histolytica/E. dispar. Se recomendó
además implementar métodos diagnósticos que permitan diferenciar las dos
amebas con el fin de dar tratamiento adecuado solo cuando se trate de E.
histolytica, e implementar estrategias para evaluar el riesgo de que se produzca
enfermedades invasivas 3.
Aunque E. dispar no se ha considerado patógena, el uso de los nuevos métodos
de diagnóstico han permitido establecer que también podría estar involucrada en
procesos invasivos intestinales (Parija et al. 2005)1 y extra intestinales; el ADN
extraído de 6 abscesos hepáticos mostró secuencias correspondientes a E. dispar
13, en Brasil se aisló de un paciente con colitis no disentérica la cepa ICB-ADO de
E.dispar 13. Harían falta más estudios para establecer la potencial patogenicidad
de este organismo.
Métodos diagnósticos y el impacto de su aplicación en el estudio de la
epidemiología de la amebiasis:
Durante los últimos años los estudios de la epidemiologia de la amebiasis han
hecho uso del cultivo (medio de Robinson) y posterior análisis de isoenzimas para
diferenciar las dos especies de amebas. Adicionalmente se han usado métodos
inmunológicos basados en la detección de antígenos comunes y específicos (para
las dos especies de amebas) en muestras de heces y aspirado de abscesos
hepáticos. Uno de los métodos más empleados es ELISA que utiliza anticuerpos
monoclonales contra la lectina Gal/GalNac de E. histolytica (Merlin Diagnostika,
Bornheim.Hersel, Alemania). La desventaja de los métodos inmunológicos es el
requerimiento de al menos 1.000 trofozoitos por cada pocillo para que el antígeno
sea detectado 1. Para el diagnóstico en absceso hepático se detecta anticuerpos
IgM e IgG en el suero de la persona infectada. Los métodos moleculares basados
en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido descritos para la
14
detección y diferenciación de las dos especies de ameba 1,6,10,14. Sin embargo y a
pesar de las limitaciones, la microscopia sigue siendo el único método disponible
en muchos lugares debido a los altos costos que representa la utilización de los
nuevos 1,13. Durante algún tiempo se consideró al método de cultivo y posterior
análisis de isoenzimas como la prueba de oro para la identificación de las dos
amebas en heces, tejido y aspirado de absceso; sin embargo, los métodos
inmunológicos y moleculares son actualmente los más utilizados pues han
demostrado igual o mejor sensibilidad y especificidad frente al primero; un estudio
comparativo de las técnicas de diagnóstico (cultivo y análisis de isoenzimas,
ELISA y PCR anidado) mostró una correlación de 93% entre ELISA Y PCR y una
sensibilidad de 87% y 85% de estos dos métodos respectivamente con respecto
al cultivo y posterior análisis de isoenzimas 14. Además, el porcentaje de éxito en
el cultivo de E. histolytica es de 50 a 70%; el crecimiento de bacterias, hongos u
otros protozoos son a menudo el mayor problema, y puede darse un sesgo de
selección en el que una especie puede desarrollarse más que la otra 1,2,8. Otro
estudio indica que la PCR del gen ADNr 18S, el cual presenta gran diversidad
genética en las dos amebas, fue aproximadamente 100 veces más sensible que
la mejor prueba de ELISA disponible 15. Actualmente muchas investigaciones
utilizan PCR para amplificar genes que codifican SREPH, hemolisina HLY6,
proteína 30-kDa, entre otros 1.
La PCR es una prueba de diagnóstico molecular rápida, sensible y específica; sin
embargo, estas características pueden verse disminuidas cuando se aplica la
técnica directamente a muestras biológicas como sangre y heces debido a la
presencia de compuestos inhibidores como bilirrubinas, sales biliares, complejos
de carbohidratos, el grupo hemo, que a menudo son extraídos conjuntamente con
el ADN del patógeno 1,16. A este respecto, se ha desarrollado algunos kits de
extracción de ADN de muestras fecales que han permitido obtener ADN de alta
pureza, QIAamp DNA stool kit de QIAGEN, Hilden, de Alemania 1,10.
En países de recursos económicos limitados con alta prevalencia de amebiasis se
ha realizado muchas investigaciones en las que se ha utilizado estas nuevas
técnicas de diagnóstico y los resultados han demostrado, en algunos casos, una
15
prevalencia sobreestimada y en otros lo contrario (Tabla 1). También se ha
demostrado que esta prevalencia puede variar en distintos sectores de la misma
región y en diferentes estaciones climáticas. Una investigación realizada con
16.592 muestras de heces recolectadas entre agosto de 1999 y febrero de 2002
en la zona norte, central y sudeste de Irán encontró una mayor prevalencia de E.
dispar (92.1%) sobre E. histolytica (7.9%) 17, mientras que otra investigación
realizada en 2011 en la zona sudoeste de Irán, con 655 muestras, la prevalencia
de E. histolítica (1.5%) fue mayor que la de E. dispar (0.2%) 18. En Colombia, de
100 muestras reportadas positivas para el complejo E. histolytica/E. dispar
diagnosticadas por microscopia, 8 resultaron positivas en una nueva revisión
microscópica y de éstas, 6 produjeron cultivos positivos (medio de Robinson), las
pruebas moleculares e inmunológicas indicaron que 1 correspondía a E.
histolytica y 5 a E. dispar 19, es claro que la observación microscópica inicial arrojó
una frecuencia falsamente elevada. En Tanzania, 842 muestras de portadores
asintomáticos y personas con algunos problemas gastrointestinales, mostró que la
observación microscópica del complejo E. histolytica/E. dispar frente al
diagnóstico por ELISA de las dos amebas presentó una sensibilidad de 39% y una
especificidad de 96%, lo que indica que con la observación microscópica se pasan
por alto el 61% de la parasitosis debidas a este complejo amebiano 20.
Entamoeba histolytica: Fisiología, estructura y patogenia
La forma infectiva de Entamoeba histolytica es el quiste cuyo tamaño oscila entre
10 y 20 µm con un promedio de 15 a 20 µm y presenta entre 1 y normalmente 4
núcleos. Un paciente infectado elimina en sus heces trofozoitos no infecciosos
que no sobreviven en el ambiente externo y quistes que contaminan el agua y
alimentos 21. Los trofozoitos también pueden ser infectantes en la práctica de
sexo oral - anal y cuando hay contacto de heces con laceraciones 22,23. Una vez
que los quistes son ingeridos, atraviesan el estómago donde los jugos gástricos
estimulan la liberación del trofozoito en el duodeno 21 donde se replica por fisión
binaria en el moco que recubre el intestino o también mediante el desarrollo de
numerosos trofozoitos en el interior del quiste multinucleado maduro. El trofozoito
16
tiene un diámetro de 10 - 60 µm con un promedio de 15 – 30 µm, su forma es
alargada con un único núcleo redondo que tiene un cariosoma central y presenta
una distribución uniforme de gránulos de cromatina alrededor de la membrana
nuclear. El trofozoito se moviliza mediante la extensión de un pseudópodo con la
extrusión del ectoplasma celular y posterior arrastre del resto de la célula que se
reúne con el pseudópodo 21, estos movimientos direccionales progresivos los
realiza gracias al impulso, provocado por la inestabilidad dinámica de la presión
hidrostática intracelular, que recibe del uroide (localizado en la parte posterior del
trofozoito) que está constituido de miosina y actina 24. Esta inestabilidad dinámica
de la presión hidrostática intracelular de la ameba también hace posible su
movimiento en dos y tres dimensiones gracias a la generación cíclica de vesículas
que se forman y se regeneran en la membrana del parásito con velocidades y
direcciones al azar 25. Con estos movimientos la ameba es capaz de invadir el
epitelio y avanzar a tejidos distantes 22. En el inicio de la invasión, la interacción de
los antígenos de superficie del parásito con los anticuerpos del hospedero produce
complejos de antígeno-anticuerpos que se distribuyen en toda la superficie del
parásito y, en un sorprendente y rápido movimiento estos complejos se deslizan
hacia el uroide y se van aglutinando hasta formar capas bien definidas, en un
proceso conocido como “capping” y es considerado una de las principales
estrategias que tiene el parásito para evadir la respuesta inmune del hospedador.
Esta movilización de los complejos antígeno-anticuerpo se realiza por un
mecanismo en el que se produce un deslizamiento de actina y miosina mediada
por una proteína y una cinasa de cadena ligera de la miosina 26. En un estudio se
demostró que la cantidad de miosina II está tres veces más concentrada en el
uroide que en el resto del parásito 27, lo cual podría explicar la habilidad de E.
histolytica para regenerar rápidamente cantidades sustanciales de la membrana
plasmática, lo cual junto con el proceso de capping puede contribuir a la
supervivencia del parásito durante la infección 26,27.
Adhesión: Entamoeba histolytica se considera un patógeno agresivo debido a su
actividad citotóxica y citolítica, investigaciones realizadas desde 1975 sugieren
17
que realiza un proceso de invasión muy elaborado, en el cual se secretan y
expresan proteínas que le permiten adherirse al epitelio, degradar la matriz
extracelular y producir citólisis de las células epiteliales para penetrar dentro de la
mucosa. Además, fagocita activamente bacterias y desechos de las células del
hospedador que le sirve de alimento 28. Una de las funciones de la mucosa
intestinal, es la defensa contra agentes infecciosos a través de la activación del
sistema inmunitario innato cuyos mecanismos eliminan casi todas las infecciones
intestinales con rapidez y evitan diseminación extraintestinal 29. En el inicio de la
invasión los trofozoitos, mediante la subunidad pesada 170 kDa de la lectina
Gal/GalNAc, se adhieren a oligosacáridos de las células de la mucosa del colon 30.
La acción de la mucosa intestinal puede inhibir la adherencia de la lectina Gal /
GalNAc sin embargo la ameba produce glucosidasa, manosidasa, galactosidasa,
fucocidasa, xilosidasa, glucoronidasa, y N-acetil-D.galactosaminidasa, lo cual
altera la mucosa y permite mayor acceso a las proteasas y otras sustancias
secretadas por la ameba 28. La subunidad liviana de lectina (35/31 kDa) Gal /
GalNAc parece contribuir a la regulación de la adherencia y a la señalización de
eventos asociados con la virulencia 28. La lectina Gal / GalNAc está involucrada,
también, en el proceso de adhesión a eritrocitos, neutrófilos, bacterias y células
epiteliales 28,30 y probablemente en el proceso de señalización que conduce a la
citólisis ya que la proteína purificada no mostró efectos citotóxicos aun en alta
concentración 30. Otras moléculas que se cree participan en el proceso de
adhesión del parásito son: una lectina de 220 kDa, una adhesina de 112 kDa rica
en serina (SREHP) y un lipofosfoglucano de superficie.
Lisis tisular:
Luego de la adhesión se produce un fenómeno citolítico muy rápido que resulta en
la hinchazón, agrandamiento y finalmente en la muerte de la célula blanco a causa
de la permeabilización de la membrana celular por péptidos formadores de poros
(ameboporos) 30 o a causa de la inducción de apoptosis 22. Los ameboporos son
enzimas proteolíticas solubles (contenidas en vesículas citoplasmáticas) que
tienen acción colagenasa y proteasa, lo cual facilita la invasión de los tejidos.
18
Pertenecen a la familia SAPLIP (saposin-like proteins) que se caracterizan por
tener un motivo conservado de residuos de seis cisteínas unidas por tres puentes
y comprenden tres isoformas, ameboporo A, ameboporo B y ameboporo C, y son
producidas en una proporción de 35:10:1 28,30 Se cree que los ameboporos se
agregan por medio de un reordenamiento de sus hélices y forman un canal dentro
de la membrana plasmática de la célula, a través de la cual pasan agua, iones y
otras moléculas pequeñas, ocasionando finalmente, la lisis celular 22,28,30. Se ha
demostrado que E.dispar también tiene ameboporos A y B en menor
concentración 22. Después del contacto del parásito con la célula diana, ésta sufre
una importante elevación de Ca++ que es irreversible y precede a su destrucción,
las células alrededor de éstas también sufren de esta elevación pero no mueren,
por lo que se deduce que la sola elevación de calcio no es suficiente para matar la
célula 31. Es probable que esta acción sea causada por la lectina Gal / GalNAc. La
ameba también posee una actividad fosfolipasa calcio-dependiente que parece
contribuir a la citotoxicidad 31. En cuanto a la inducción de la apoptosis, se cree
que es por medio de la vía caspasa 3 cuya activación es contacto-dependiente.
Este fenómeno se evidenció en un estudio de fagocitosis con células Jurkat
(Huston et al. 2003) en el que el 88% de las células fagocitadas por E. histolytica
fueron apoptóticas y presentaron actividad de caspasa 3. En este mismo estudio
se mostró que la apoptosis precede a la fagocitosis por el hecho de que un mayor
porcentaje de trofozoitos ingirió más células apoptóticas (62%) que células vivas
(30%) y necrosadas (8%) sin embargo, es todavía un enigma el hecho de que el
parásito sea capaz de efectuar la apoptosis en cuestión de minutos, cuando
normalmente se requiere horas para un proceso completo 27.
Factores de virulencia:
Se ha identificado 50 genes que codifican cisteína proteasas, y se ha demostrado
que éstas enzimas proteolíticas son secretadas por la E. histolytica dentro de su
microambiente y constituyen factores de virulencia esenciales que destruyen los
tejidos humanos, pues degradan distintos componentes de la matriz extracelular y
separan las células para facilitar la invasión 22,31. Más del 80% de pacientes con
19
amebiasis expresan anticuerpos contra cisteína proteasas amebianas 31. EhCP1,
EhCP2 y EhCP5 están localizadas dentro de las vacuolas digestivas y son las
responsables de aproximadamente el 90% de toda la actividad de las cisteínas
proteasas. Las EhCP5 y EhCP112 se encuentran en la superficie del trofozoito;
EhCP5 juega un papel crucial en la producción de la inflamación que lleva a la
formación de abscesos hepáticos 22.
La respuesta inmune:
La respuesta inmune del hospedador puede contribuir al daño del tejido y facilitar
el proceso de invasión. Se ha visto que, en cultivos de trofozitos con diferentes
líneas celulares, hubo un aumento de citocinas proinflamatorias; igualmente, se
ha demostrado que las cisteína proteasas estimulan la señalización
proinflamatoria 31, participan en la evasión de la respuesta inmune humoral al
degradar IgA e IgG 30 y la proteína precursora pro IL-18 responsable de la
maduración de la citocina IL-18 la cual es importante en los procesos
proinflamatorios y la respuesta Th1. Inducen también la activación de macrófagos
y la secreción de IFNγ.. Los neutrófilos no eliminan a los trofozoítos y contribuyen
al daño tisular y la diarrea mediante la liberación de sus gránulos citotóxicos22. Se
ha demostrado también que la ameba desarrolla resistencia al complemento
después de una exposición repetida al suero activo humano, y recupera la
susceptibilidad a la lisis (dependiente del complemento) después de 6 semanas de
terminados los tratamientos con suero, lo que sugiere que esta propiedad no es
debido a cambio genético sino a una adaptación al suero. En otra investigación
se demostró que la molécula de lectina Gal / GalNAc también tiene funciones
inhibidoras del complemento, pues parece que se une a C8 y C9 y previene la
formación del complejo de ataque de membrana y subsecuentemente la lisis
celular 30.
Los trofozoitos remueven células apoptóticas opsonizadas y necróticas, bacterias
y eritrocitos, que pueden ser utilizados como fuente de hierro 22; la muerte de la
célula diana del hospedero y la fagocitosis son las características centrales de la
amebiasis invasiva, la fagocitosis sigue a la muerte celular por apoptosis, una
20
investigación sobre fagocitosis demostró que el trofozoito reconoce y fagocita
células sometidas a apoptosis más eficientemente que las células vivas o
necrosadas o simplemente no apoptóticas, la adherencia a las células apoptóticas
se realiza a través de la lectina Gal / GalNAc; sin embargo, hay evidencia de que
otro receptor en la ameba con un rol pequeño en el proceso de adhesión, está
involucrado y es capaz de desencadenar la fagocitosis 27.
La apoptosis y fagocitosis de las células del hospedero por parte de E. histolytica
pueden limitar la inflamación y permitir a la ameba evadir la respuesta inmune
para lograr una infección persistente 27,28.
Factores que influyen en el desarrollo de la amebiasis invasiva:
Todas las infecciones debidas a E. histolytica deberían ser tratadas debido a su
potencial riesgo de causar enfermedades invasivas 32, las cuales no son
mutuamente excluyentes y pueden progresar a una u otra manifestación clínica o
manifestar ambas, y también para minimizar la propagación del parásito. Del 10%
de las personas infectadas que evolucionan a enfermedades invasivas, 10% a
25% desarrollan colitis amebiana, mientras que el absceso hepático amebiano
ocurre en el 1% de los casos, comúnmente en hombres adultos 31. Entre los
factores que favorecen el desarrollo de esta condición está la genética del
paciente y la genética del parásito. En un estudio en Bangladesh se realizó
ensayos para determinar diversidad genética del parásito en muestras de
pacientes asintomáticos, con disentería/diarrea y con absceso hepático; los
genotipos de la ameba encontrados fueron significativamente diferentes entre los
tres grupos. En otro estudio se determinó que el genotipo fue diferente cuando
provenía de una muestra de heces y cuando provenía de un absceso hepático en
el mismo paciente 31. En otro estudio se encontró un genotipo diferente en 2
abscesos hepáticos amebianos en el mismo paciente 31. Se ha demostrado que
factores ambientales como la malnutrición aumenta la susceptibilidad de contraer
la infección. También se ha reportado cambios en la virulencia de E. histolytica
que dependen de la presencia de diferentes especies bacterianas; en ensayos in
vitro 31, la presencia de las bacterias patógenas Escherichia coli enteropatogénica
21
(EPEC), y E. shigellae aumentaron el efecto citopático de E. histolytica y la
expresión de Gal/GalNAc lectina sobre la superficie amebiana debido a un
aumento de la actividad cisteína proteasa, la adhesión de las amebas y el daño a
las células causado por bacterias. Las monocapas epiteliales expuestas a las
bacterias enteropatógenas mencionadas, se vuelven más susceptibles al daño por
la ameba, además la fagocitosis de las bacterias patógenas por la ameba aumenta
el daño de la célula epitelial 33.
La amebiasis en Ecuador:
En el Ecuador no hay cifras oficiales de la amebiasis ni de su distribución
geográfica. La Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica no considera a E.
histolytica entre los microorganismos involucrados en el Síndrome Diarreico Agudo
ni tampoco como parte de los microorganismos causantes de enfermedades
transmitidas por agua y alimentos 34. Sin embargo, la Región Andina de América
del Sur está considerada como región endémica de amebiasis lo que ha llevado a
algunos organismos de salud al uso continuo de anti amebianos, práctica que está
contraindicada por la OMS 3. Los resultados de los estudios realizados en
diferentes regiones del país para investigar la relación de este parásito con
síndromes diarreicos 35 o su prevalencia en poblaciones rurales y urbanas
6,36,37,38,39,40,41,42 muestran un grave problema, seis de las ocho investigaciones
usan microscopía y reportan una alta frecuencia de E.histolytica/E.dispar
6,36,37,38,40,41. Las investigaciones en las que se realizan métodos de diagnóstico
para diferenciar las dos amebas, indican que la frecuencia de E. dispar es mayor
que la de E. histolytica 6,38 en una de ellas se reporta ausencia de amebiasis 38.
Dos investigaciones reportan una baja frecuencia de amebiasis por el método
microscópico (1% y 1.5%), una de estas reporta una frecuencia de 1% por el
método de PCR 38,42. Adicionalmente, E. histolytica parecería no estar asociada a
enfermedad diarreica 35; sin embargo, los portadores asintomáticos que eliminan
los quistes constituyen la principal fuente de contagio. Desde el punto de vista
epidemiológico es importante su identificación y tratamiento 21.
22
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27
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
TITULO
Investigación de Entamoeba histolytica en dos Comunidades Ecuatorianas
AUTORES
Thamara Andrade, Sonia Zapata, Gabriel Trueba, Gabriela Vasco, Richard
Atherton, Manuel Calvopiña, William Cevallos, Martha Eguiguren y Joseph N.S.
Eisenberg*
Instituto de Microbiología, Universidad San Francisco de Quito, Quito, Ecuador
Centro de Biomedicina, Universidad Central del Ecuador, Quito, Ecuador
Departamento de Epidemiología, Universidad de Michigan, Ann Arbor Michigan,
United States, Centro de Salud de Guamaní, Ministerio de Salud Pública, Quito,
Ecuador.
*Correspondencia a Joseph Eisenberg, Universidad de Michigan, Estados Unidos
de América. [email protected]
Palabras clave: Amebiasis, Colitis y enfermedad extraintestinal, Epidemiología.
28
INTRODUCCIÓN
La amebiasis es una infección causada por el protozoo intestinal Entamoeba
histolytica, cuyo único hospedador es el humano. Se estima que 480 millones de
personas de todo el mundo están infectadas, 36 millones de ellas desarrollaron
colitis invasiva o abscesos extra-intestinales y entre 40,000 a 100,000 personas
mueren anualmente a causa de esta parasitosis. Globalmente, esta enfermedad
es la tercera causa de muerte por enfermedades parasitarias (después de la
malaria y la esquistosomiasis) 1. La mayor morbilidad y mortalidad se ha reportado
en regiones de Centroamérica, Sudamérica, África, y el subcontinente Indio 2 se
ha relacionado a esta parasitosis con pobreza, insalubridad, hacinamiento y
prácticas sexuales anales-orales 3,4, mala infraestructura sanitaria, agua o
alimentos contaminados 3,5.
La amebiasis es clásicamente diagnosticada por microscopía mediante la
identificación de quistes y trofozoitos de E. histolytica en heces. Esta técnica no
permite diferenciar E. histolytica de las tres especies morfológicamente idénticas,
no patógenas E. dispar, E. moshkovskii y E. bangladeshi por lo que se presume
que la prevalencia de amebiasis está siendo sobreestimada 2,6,7.
En los países y regiones donde se ha reportado alta prevalencia de amebiasis, el
uso de nuevos métodos moleculares e inmunológicos para el diagnóstico ha
demostrado una prevalencia sobreestimada en unos casos y en otros lo contrario
(Tabla 1). También se ha demostrado que esta prevalencia puede variar en
sectores distintos de la misma región y en diferentes estaciones climáticas 10. El
método microscópico si bien tiene un bajo costo, requiere un profesional con
mucha experiencia en la observación tanto de quistes como de trofozoitos de
amebas, generalmente los trofozoitos son confundidos con macrófagos y los
quistes con leucocitos polimorfonucleares. Para que los trofozoitos puedan ser
observados, las muestras deben ser examinadas al cabo de una hora de tomada
la muestra, de lo contrario se destruyen, estas limitantes dan como resultado bajos
29
porcentajes de sensibilidad (25-60%) y especificidad (10-50%) para este método 2.
Estos datos sugieren el uso de metodologías que permitan detectar un mayor
número de infecciones y que tengan una alta especificidad para diferenciar las
especies con miras a obtener una prevalencia real de amebiasis. El presente
trabajo fue parte de un estudio de caso – control en muestras de heces de
poblaciones urbana y rural, recolectadas durante la época lluviosa. El propósito
del trabajo fue contrastar la eficacia de la microscopía y las técnicas moleculares
(PCR) en la detección de E. histolytica y E. dispar y conocer la frecuencia de
estas dos especies.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Área de estudio y colección de muestras
Se llevó a cabo un estudio de caso-control con 346 muestras de heces fecales
obtenidas de dos poblaciones, una urbana de pacientes que acudieron al Centro
de Salud de Guamaní, (100 muestras de casos y 100 muestras control); y otra
rural de habitantes de la comunidad de Borbón, (39 muestras de casos y 107 de
control). Se definió como caso de diarrea una persona que tiene tres o más
deposiciones blandas o líquidas durante un período de 24 horas1 y como control
una persona de la misma edad quien no presenta diarrea. El Centro de Salud está
ubicado en la parroquia urbana Guamaní, en la zona sur-oriental de la ciudad de
Quito, capital del Ecuador, perteneciente al Cantón Quito, provincia de Pichincha
en la región interandina ecuatoriana y su población es de 62.065 habitantes.
Borbón es una parroquia rural de 192,57 Km2 de superficie, puerto fluvial
maderero, perteneciente al Cantón Eloy Alfaro, provincia de Esmeraldas en la
región litoral ecuatoriana cuya población es de 7.696 habitantes 10. Se incluyó en
el estudio a todos los casos sin distinción de edad y género. En el Centro de
Salud de Guamaní, por cada caso se seleccionó un control que fue obtenido de
las personas de la misma edad, que acuden a esta casa de salud y que no
presentaron diarrea por lo menos dos semanas antes del momento de la
obtención de la muestra. En Borbón se realizó un estudio de caso y control de
base poblacional con una cohorte de 400 viviendas. Los casos fueron
30
identificados durante un seguimiento de 2 semanas con visitas diarias a cada
vivienda, por cada caso se seleccionó un promedio de 3 controles de la misma
edad que fueron obtenidos de los habitantes dentro del cohorte que no
presentaron diarrea por lo menos una semana antes del momento de la obtención
de la muestra. En el Centro de Salud de Guamaní las muestras fueron colectadas
en la época lluviosa entre los meses de marzo y mayo de 2012, período en el que
la temperatura ambiente promedio fue de 12.3°C y la precipitación pluvial
acumulada fue de 196.1 mm en marzo 13, 218.6 mm en abril 14 y 63.1 mm en
mayo 15, mientras que en Borbón las muestras fueron colectadas también en la
época lluviosa en los meses de julio y agosto de 2012, período en el que la
temperatura ambiente promedio fue de 26°C y la precipitación acumulada fue de
12.1 mm en julio 16 y 21.0 mm en agosto 17 (Tabla 2). El criterio de exclusión en
las dos poblaciones fue el uso de antibióticos/antiparasitarios una semana antes
de la toma de muestra de heces fecales. El protocolo de este estudio fue
aprobado por el Comité de Ética tanto de la Universidad de Michigan como de
la Universidad San Francisco de Quito. Todos los participantes mayores de edad y
los tutores de los menores de edad aceptaron su participación en esta
investigación a través de la firma del consentimiento informado.
Transporte y conservación de las muestras
Las muestras fueron colectadas y entregadas por los pacientes o sus familiares
dentro de la hora siguiente a la recolección. Las muestras de Guamaní fueron
conservadas entre 4 y 8°C y transportadas al laboratorio de Microbiología de la
Universidad San Francisco de Quito dentro de un recipiente con hielo. Una
alícuota de la muestra se diluyó en formalina al 10% para la observación
microscópica de quistes de E. histolytica/dispar y aproximadamente 200 mg de
cada muestra se almacenó en microtubos de 2 mL a -80°C. Una alícuota de las
muestras colectadas en Borbón, aproximadamente 200 mg, se introdujo en
microtubos de 2 mL los cuales se conservaron y transportaron en nitrógeno líquido
hasta el laboratorio de Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito.
31
Todas las muestras permanecieron congeladas a -80°C hasta el momento de ser
analizadas.
Identificación de E. histolytica y E. dispar
Método microscópico: Las muestras fueron examinadas al microscopio usando la
técnica de concentración formol-éter y luego se coloreó con una solución de lugol,
cada muestra se observó por duplicado con el objetivo 40X 2.
Método de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Extracción y purificación de ADN: Se utilizó el kit comercial de extracción QIAamp
DNA stool (QIAGEN®), y se siguió todas las indicaciones y recomendaciones del
fabricante. Una vez obtenido el eluído de la columna se midió la concentración de
ADN por espectrofotometría en el equipo NanoDrop de ThermoScientific y se
almacenó en alícuotas de 60 μL a -20°C hasta el momento de realizar la PCR.
Se utilizó un protocolo previamente publicado 18 ajustado a un volumen final de
reacción de 20 μL (tabla 3).
Los primers utilizados fueron sintetizados por InvitrogenTM (USA) y amplifican un
fragmento del gen SREHP que codifica para una proteína de superficie rica en
serina presente en las dos especies, pero específica para cada una de ellas. Los
primers específicos para el gen SRPEh (E. histolytica) generan un fragmento de
553 pb, mientras que los primers específicos para el gen SRPEd (E. dispar) uno
de 567 bp 2,18. Las reacciones de amplificación de la secuencia de E. histolytica se
realizó siguiendo los siguientes pasos: denaturación inicial a 96°C por 10 minutos,
luego 35 ciclos de amplificación, cada ciclo incluye una denaturalización a 94°C (1
minuto), alineamiento a 64°C (1.5 minutos) y polimerización a 72°C (2 minutos); y,
un paso final de extensión a 72°C (8 minutos). Para la amplificación de la
secuencia específica de E. dispar se cumplió con el mismo protocolo, pero con
una temperatura de alineamiento de 60°C 18.
Los productos de la PCR se corrió en un gel de agarosa al 1% en TBE buffer con
bromuro de etidio en concentración del 0.6%.
El control positivo se obtuvo de muestras de heces donadas por el Instituto
Nacional de Higiene Leopoldo Izquieta Pérez (hoy Instituto Nacional de
32
Investigación en Salud Pública I.N.S.P.I) de la ciudad de Guayaquil, positivas por
microscopía para E. histolytica/E. dispar. Se realizó la secuenciación del producto
de la PCR de una de las muestras positivas y el resultado del alineamiento,
utilizando el programa Blast que compara con las bases de datos del National
Center Biotechnology Information, confirmó E. histolytica. El control positivo para
E. dispar se obtuvo de una de las muestras analizadas en esta investigación y
para confirmar la identidad de la ameba se procedió de la misma manera que con
E. histolytica. Como control negativo se utilizó la mezcla de reacción sin ADN; para
comprobar la especificidad se utilizó ADN del control positivo de E. histolytica con
los primers para E. dispar y los primers de E. histolytica con el ADN de E. dispar.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó en el programa EpiInfo 7.1.0.6 de CDC Atlanta,
USA, un valor de p < 0,01 fue considerado como el nivel crítico de significancia.
Calculamos Odds Ratio pareado con el 95% de intervalo de confianza para
comparar el patógeno presente en las muestras de caso y control.
RESULTADOS:
La observación microscópica de las 200 muestras colectadas en el Centro de
Salud de Guamaní dio como resultado 5 muestras positivas para quistes de E.
histolytica/E. dispar que corresponde al 2.6 %. El ensayo por PCR de las mismas
muestras dio como resultado 58 muestras positivas para E. histolytica y/o dispar
que corresponde a 29%. De las 5 muestras positivas por microscopía, 3
coincidieron con pruebas positivas por PCR, 1 fue positiva para E. histolytica y 2
para E. dispar, las 2 restantes resultaron negativas por PCR. Con estos
resultados, la prueba microscópica en Guamaní mostró una sensibilidad de 51.3%
y una especificidad del 98.6%, asumiendo la PCR como prueba de referencia
(Tabla 4).
La observación microscópica de las 146 muestras colectadas en Borbón dio como
resultado 21 muestras positivas para quistes de E. histolytica/E. dispar que
corresponde al 14.4 % de las muestras. El ensayo por PCR de las mismas
33
muestras dio como resultado 26 muestras positivas para E. histolytica y/o E. dispar
que corresponde al 17.8% de las muestras. De las 21 muestras positivas por
microscopía, 5 coincidieron con pruebas positivas para E. dispar por PCR. Con
estos resultados, la prueba microscópica en Borbón mostró una sensibilidad de
55.3% y una especificidad del 88.2%, asumiendo la PCR como prueba de
referencia (Tabla 4).
No hubo diferencia estadísticamente significativa ni en sensibilidad ni en
especificidad entre el método microscópico y la PCR (p = 0.12).
La caracterización molecular dio como resultado en Guamaní 26 muestras
positivas para E. histolityca, (13% del total de muestras) y 32 muestras positivas
para E. dispar (16% del total de muestras), 7 muestras dieron positivo para las dos
especies (3.5% de co-infección del total de muestras). En Borbón, 5 muestras
fueron positivas para E. histolítyca (3.4% del total de muestras) y 21 muestras
fueron positivas para E. dispar (14.4% del total de las muestras), no hubo
coinfección (Tabla 5).
En la población de Guamaní, de las 26 muestras positivas para E. histolytica, 17
correspondieron a casos; en Borbón de las 5 muestras positivas para E.
histolytica, 3 correspondieron a casos, datos que determinan un OR de 2.07 CI
95% (0.87 - 4.89) en Guamaní y 4.37 CI 95% (0.70 - 7.24) en Borbón (Tabla 6).
DISCUSIÓN
La introducción de técnicas moleculares en el diagnóstico de amebiasis ha
demostrado que la microscopía es una técnica inadecuada para el diagnóstico; en
muchos casos ha causado sobreestimaciones y en otros subestimaciones (Tabla
1). También se ha demostrado (mediante técnicas moleculares e inmunológicas)
que esta prevalencia puede variar en sectores distintos de la misma región y en
diferentes estaciones climáticas 19.En nuestro estudio la frecuencia de E.
histolytica encontrada en Borbón fue del 3.4% y de E. dispar 14.4% lo que tiene
concordancia con los resultados obtenidos por Gatti et al. 8 en la misma zona
(18.9% de E. histolytica y 70.3% de E. dispar), pero se contrapone con otro
estudio realizado en una comunidad de la misma provincia de Esmeraldas que
34
mostró una frecuencia baja de E. histolytica tanto por microscopía (1.5%) como
por el método molecular (1%) 20 (Tabla 7). En Loja 21 otro estudio mostró ausencia
de E. histolytica y una frecuencia de 22.8% de E. dispar; sin embargo la
caracterización molecular se realizó únicamente en las muestras que resultaron
positivas por el método microscópico el cual, debido a su baja sensibilidad, es
probable que no haya detectado más muestras infectadas. En todas las
investigaciones en Ecuador que han podido diferenciar las dos amebas, la
frecuencia de E. histolytica es siempre menor que la de E. dispar.
La baja sensibilidad del método microscópico frente al método de PCR en
muestras de las dos poblaciones (51.3% y 55.3% en Guamaní y Borbón
respectivamente), concuerda con otros estudios realizados en diferentes partes
del mundo como en Brasil en donde en una investigación realizada en una
población estudiantil del sudeste del país la sensibilidad del método microscópico
frente a uno inmunológico por ELISA fue del 20% 22. Por otro lado, en una
investigación realizada en Tanzania con una muestra de 842 personas, la
sensibilidad y especificidad del método microscópico frente a uno inmunológico
por ELISA fue de 39% y 96% respectivamente, lo que indica que con la
observación microscópica se pasan por alto el 61% de la parasitosis debidas a
este complejo amebiano23. En un estudio en Vietnam y Sudáfrica la prevalencia
encontrada por el método microscópico fue de 9.2% mientras que por el método
molecular de PCR fue de 14.3% en la misma población estudiada 24.
Los resultados de las investigaciones realizadas en el Ecuador en las que se
reporta una alta prevalencia o frecuencia de E. histolytica/E. dispar 8,21,25,26,27,28
(Tabla 7) mediante el uso del método microscópico, debería analizarse con
precaución ya que podría tratarse de una sobreestimación incluso de quistes del
complejo E. histolytica/ E. dispar que suele confundirse con los de E. hartmanni, E.
coli e inclusive Dientamoeba fragilis8,21. En nuestra investigación, de las 21
muestras reportadas como positivas por microscopía en la población de Borbón,
solo 5 fueron positivas por PCR para una de las dos especies (especificidad
88.2%). Esto también concuerda con un estudio realizado en Colombia (Tabla 1)
en el que de 100 muestras reportadas positivas para el complejo E. histolytica/E.
35
dispar por microscopía, solo 6 resultaron positivas para una de las dos especies
por cultivo, ELISA y PCR 30, es claro que la observación microscópica inicial arrojó
una frecuencia falsamente elevada.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La frecuencia de E. histolytica es menor que la de E. dispar en las dos poblaciones
estudiadas, lo que tiene concordancia con otros estudios realizados en el Ecuador
y países que tienen características socioeconómicas similares como Brasil,
Colombia, Iran; la técnica PCR convencional mostró tener más sensibilidad y
especificidad que la microscopía; sin embargo, no hubo una diferencia
significativa, sería recomendable realizar otros estudios con un mayor número de
muestras.
Es necesario realizar investigaciones en diferentes regiones del país para
establecer prevalencias, pues hay evidencia de que la epidemiología puede no ser
la misma aún en regiones vecinas.
Más estudios de casos y controles permitirían determinar el riesgo que representa
la amebiasis para desarrollar enfermedad invasiva. En este estudio E. histolytica
parecería no estar asociada a enfermedad diarreica en ninguna de las dos
poblaciones, sin embargo el riesgo en Borbón es aproximadamente el doble que
en Guamaní. Finalmente, los portadores asintomáticos que eliminan los quistes
constituyen la principal fuente de contagio y desde el punto de vista
epidemiológico es importante su identificación y tratamiento.
36
Tabla 1: Resumen de investigaciones de Entamoeba histolytica/dispar en varias regiones del mundo
Autor Año publicación Región Microscopía Cultivo Isoenzimas PCR ELISA Referencia
n
Fresco/ concentración
E.dispar
E.histolytica E.dispar E.histolytica/.dispar
E.histolytica E.histolytica
% % % % % % % %
López O. et al 2012 Colombia 100* 8
1 5 1 0 30
Pereira et al 2014 Brasil 1403 5.7
15.7 3.1 22
Silva MTN et al 2014 Brasil 1195 46.27
0 31
Carneiro S et al 2104 Brasil 97 25 50**
0 25**
8.3** 32
Rivero Z et al 2009 Venezuela 204 20.58
10.78 7.84
18
Mora et al 2008 Venezuela 428 20.09
6.3 4.4
33
Hooshyar H. et al 2004 Norte, centro y
sudeste Irán 16,592 1.36
7.9ᵠᵠ 92.1ᵠᵠ
10
Pestehchian N et al 2011 Irán (Sudoeste) 655 1.7
1.5ᵠ 0.2ᵠ
19
Haque et al 1998 Bangladesh 98 7
53 28 46
45 9
Yildirim D et al 2014 Turquía 259 6.2
25.1 35
Calderaro et al 2006 Italia 8886 0.82
0.04 0.77
34
Nesbitt et al 2004 Tanzania 842 8.7
8.2 0.8 7.4 23
Blessmann et al 2002 Vietnam y Sudáfrica 491 9.2
9.4 4.9
24
Haque et al 2009 Bangladesh 3646 -
2.1
2.1 36
Shahrul Anuar et al 2012 Malasia 150 8.7
38
Shahrul Anuar et al 2012 Malasia 139 29.5
38
Shahrul Anuar et al 2012 Malasia 211 18.5
38
Zulhainan Hamzah et al 2010 Tailandia 35 35
11.4 80
37
* reportadas como positivas para el complejo E. histolytica/dispar ** con relación al 25% de positivas por microscopía
ᵠ Se hizo PCR solo en las muestras positivas por microscopía
ᵠᵠ Se hizo PCR solo en los cultivos positivos
37
Tabla 2: Datos de área de estudio y muestreo
Región T
Precipitación pluvial
acumulada Periodo año 2012 (mes) Población
Total de muestras Casos Controles
°C mm
n n n
Guamaní 12.3 159.2 marzo a mayo 62065 206 100 100
Borbón 26 16.5 julio y agosto 7696 146 39 107 Total
346 139 207
Tabla 3: Mezcla de reacción para PCR
Condiciones requeridas
Concentraciones Stock
Volumen por reacción (RX)
Buffer Go Taq 1X 5X 4.0 uL
MgCl2 2.5 mM 25mM 2.0 uL
Primer 1* 1 uM 10 uM 2.0 uL
Primer 2* 1 uM 10 uM 2.0 uL
dNTPs 0,2mM 1mM 4.0 uL
Taq 1U 5U/uL 0.2 uL
AND muestra 2.0 uL
Agua 3.8 uL
*Los primers son específicos para cada especie de Entamoeba 2,18
gen SRPEd E. dispar: fragmento de 567 pb sense: GTA GTT CAT CAA ACA CAG GTG A
antisense: CAA TAG CCA TAA TGA AAG CAA gen SRPEh E. histolytica: fragmento de 553 pb sense: CTT GAA AAG CTT GAA GAA GCT G antisense: AAC AAT GAA TGG ACT TGA TGC A
38
Tabla 4: E.histolytica/E.dispar por PCR y microscopía. Sensibilidad y especificidad del método microscópico con relación al PCR
Resultados por PCR* Resultados por Microscopía Sensibilidad Especificidad
Guamaní Borbón Guamaní Borbón Guamaní Borbón Guamaní Borbón
n % n % n % n % % % % %
E. histolytica/dispar 58 29 26 17.8 5 2.6 21 14.4 51.3 55.3 98.6 88.2
Negativo
142 71 120 82.2 195 97.4 125 85.6
Total
200 100 146 100 200 100 146 100
* Se asume la PCR como prueba de
referencia
39
Tabla 5: Frecuencia de E. histolytica y E. dispar en las dos comunidades.
Guamaní Borbón
n % n %
E. histolytica 26 13
5 3.4
E. dispar
32 16
21 14.4
Negativo
142 71
120 82.2
Total
200 100
146 100
E. histolytica y E. dispar* 7 3.5
0 0
*Ya consideradas en los totales de cada especie de Entamoeba
Tabla 6: Riesgo Caso vs. Control
Positivo E. histolytica
Guamaní
Borbón
Caso 17
3 Control 9
2
Total 26
5 OR 2.07 (0.87 - 4.89) 4.37 (0.70 - 7.24)
40
Tabla 7: Resumen de investigaciones sobre E. histolytica/E. dispar en Ecuador
Autor Año
publicación Región Provincia
Microscopía Cultivo Isoenzimas PCR ELISA Referencia
Fresco/concentración E.histolytica E.dispar E.histolytica
E.dispar
E.histolytica/E.dispar
E.histolytica
n % % % % % % % %
Weige M et al 1996 Quito Pichincha 91 88
25
Gatti et al 2002 Borbón Esmeraldas 178 27 50** 18.9 70.3
68.2 9 8
Levecke V. et al 2011 Loja Loja 674 16.2
0 22.8*
21
Jacobsen K. et al 2007 Zonas rurales Chimborazo 293 57.1
26
Guderian et al 1987 Quito Pichincha 100 1
29
Rinne S et al 2005 Santa Ana Cuenca 200 46.6
27
Cho SY et al 1990 Palmar Guayas 325 19.4
28
Mejía R et al 2013 Quinindé Esmeraldas 400 1.5
1
20
* Se hizo PCR solo en las muestras positivas por microscopía
** Del total n
41
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