UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA

MAESTRÍA EN CIENCIAS PRODUCTOS

NATURALES Y ALIMENTOS

“ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO DE

ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS,

Y LA ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS ”

PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN

PRESENTA

I.A ARMANDO TORRALBA GONZÁLEZ

24 DE MAYO DEL 2013

DIRECTORA DE TESIS

DRA. EDITH GRACIELA GONZÁLEZ

MONDRAGÓN

CO-DIRECTOR DE TESIS

DR. RAFAEL ZUBILLAGA LUNA

CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN

i. ÁCIDO FERÚLICO

ii. CICLODEXTRINAS

iii. ANÁLISIS TERMODINÁMICO Y ESTRUCTURAL DEL PROCESO

DE ACOMPLEJAMIENTO

iv. METODOS PARA DETERMINAR EL ACOMPLEJAMIENTO

(TERMODINÁMICO Y ESTRUCTURA)

2. JUSTIFICACIÓN

3. HIPÓTESIS

4. OBJETIVOS

5. METODOLOGÍA

6. RESULTADOS

7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

2

ÁCIDO FERÚLICO

• Polifenol

• Se encuentra en la pared celular de material vegetal

• Formando enlaces entre ligninas, taninos y glucósidos

3

Urbaniak, A., & Szela, M. (2013). Theoretical investigation of stereochemistry and solvent influence on antioxidant activity of ferulic acid,

1012, 33–40. doi:10.1016/j.comptc.2013.02.018

INTRODUCCIÓN

ÁCIDO FERÚLICO

Importancia

Efecto antioxidante frente a radicales

Lo proyecta como una molécula interesante con muchas aplicaciones industriales

Industria alimentaria (Precursor

de la vainillina y formulación de

alientos funcionales)

Limitantes

Sabor muy astringente y amargo

Sensible a la luz y el calor

Pobre biodisponibilidad debido principalmente a la baja solubilidad en agua

4

Munin, A. (2011). Encapsulation of Natural Polyphenolic Compounds; a Review (pp. 793–829). doi:10.3390/pharmaceutics3040793

Anselmi, C., Centini, M., Maggiore, M., Gaggelli, N., Andreassi, M., Buonocore, A., Beretta, G., et al. (2008). Non-covalent

inclusion of ferulic acid with ␣ -cyclodextrin improves photo-stability and delivery : NMR and modeling studies, 46, 645–652. doi:10.1016/j.jpba.2007.11.037

INTRODUCCIÓN

ESTABILIZACIÓN DE MOLÉCULAS

• Encapsulación con ciclodextrinas (CD)

5 INTRODUCCIÓN

CICLODEXTRINAS

• Oligosacáridos cíclicos

• De seis, siete, ocho o más unidades de glucopiranosa.

• Unidas por enlaces α-(1,4)

• α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina

6 INTRODUCCIÓN

PROPIEDADES DE LAS CICLODEXTRINAS

7

Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9

INTRODUCCIÓN

8 INTRODUCCIÓN

Interacciones de van der Waals

Interacciones hidrófobicas

Puentes de hidrógeno

Reordenamiento de las moléculas

MÉTODO DE ACOPLEJAMIENTO

Coprecipitación

Extrusión

Acomplejamiento por suspensión

Acomplejamiento por pegado

9 INTRODUCCIÓN

ACOPLEJAMIENTO

10

F ormation of complexes

Cyclodextrins in aqueous

solutions welcome “guest

molecules”, other than water, in

their hydrophobic cavities (Szejtli,

1998). The interaction of a CD

and a guest molecule has usually a

molar ratio of 1:1, but other kinds

of interactions can be found, as

showed in figure 3 (Stella et al.

2008). This complex formation

can then increase the solubility of

some drug molecules (Stella et al.

2008 and Loftsson et al. 1996).

Throughout the formation of

complexes between cyclodextrins

and drug molecules, no breakages

of covalent bonds are noticed, but

what leads to the formation of

such complexes is the release of

water molecules from the cavity

of the cyclodextrins,

hydrophobic interactions,

hydrogen bonding, among others (Loftsson 2004). Complexes formed by HP-0.6-β-CD and β-CD

with some bile salts: glycocholate (GC), glycodeoxycholate (GDC) and glycochenodeoxycholate

(GCDC) are the most relevant complexes for this report.

2.2. Bile Salts

Figure 4 : Cholesterol conversion to 7-hydroxy-Cholesterol (Stamp & Jenkins, 2008)

This section will explain the basic and important aspects of BS while also distinguishing the

difference between what is known as BS and bile acid (BA).

Figure 3: Formation of complexes

(http://www.nature.com/nrd/journal/v3/n12/images/nrd1576-f3.jpg)

Paulon H., Paula Melo R., Thomas A. Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt Interactions Using Isothermal Titration

Calorimetry Bachelor Project.

INTRODUCCIÓN

No sigue un

patrón común

Tamaño relativo

cavidad

Tamaño

molécula huésped

METODOS DE RECUPERACIÓN

DEL COMPLEJO

Centrifugación

Separación con papel filtro con un tamaño de poro de

0.45 mm

El complejo se recupera en estado sólido

11 INTRODUCCIÓN

ANÁLISIS DE LOS COMPLEJOS DE

INCLUSIÓN CON CD

• Termodinámico

• Calorimetría de titulación isotérmica (ITC)

• Espectroscopía de fluorescencia

• Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)

• Estructura

• Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

• Difractometría de Rayos X

• Espectrocopía infrarroja y Raman

• Microscopía electrónica de barrido

• Espectrofotometría UV-Vis

12 INTRODUCCIÓN

ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO

DE ACOMPLEJAMIENTO

• La variación de energía libre (ΔG)

• Describe si el proceso es espontaneo o no

• El cambio de entalpía estándar (ΔH) • Describe si el sistema absorbió o liberó energía

• El cambio de entropía estándar (ΔS) • Describe lo irreversible de los sistemas termodinámicos

13

Mediante esta ecuación se puede determinar si

el proceso de acomplejamiento entálpicamente

o entrópicamente favorable.

INTRODUCCIÓN

CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN

ISOTÉRMICA (ITC)

Equipo de ITC

14 ITC

Paulon Hansen, Paula Melo Rayner, Thomas Allan Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt Interactions Using Isothermal Titration

Calorimetry Bachelor Project.

CURVA DE TITULACIÓN

15 ITC

Paulon Hansen, Paula Melo Rayner, Thomas Allan Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt Interactions Using Isothermal Titration

Calorimetry Bachelor Project.

OBTENCIÓN DE PARAMETROS

TERMODINÁMICOS

16

Para obtener la energía libre

de gibbs y a la entropía se

utilizan modelos matemáticos

ITC

LUZ ENERGÍA ENERGÍA

ENERGÍA

ESPECTROFLUORÓMETRO

ver. 1.0 JT/HH

1

1. Introduction

Rice has been cultivated in large part of Japan for human nutrition and as one of the export

resources. In recent years, there are increasing studies focusing on the bioactive components of

rice and rice bran. Oryza Oil & Fat Chemical Co., Ltd has been involved in the research and

development on the functional benefits of bioactive components of rice bran and rice germ. Rice

derived -oryzanol, tocotrienols, sterol, squalane and ceramide are now widely used as active

ingredient in health food, food additives, pharmaceutical and cosmeceutical products. In this

instance, we have successfully developed ferulic acid, 100% extracted and purified from rice

germ and rice bran with our technology.

2. What is Ferulic Acid?

Ferulic acid is a derivative of cinnamic acid with molecular formula C10H10O4. In 1886,

Hlasiwetz Barth, an Austrian, isolated 3-methoxy-4-hydroxycinnamic acid from the genus

Ferula foetida for structure determination. Ferulic acid together with dihydroferulic acid, is a

component of lignocelluloses, conferring cell wall rigidity by cross linking lignin and

polysaccharides. It is commonly found in seeds of plant such as rice, wheat and oats. Besides,

Ferulic Acid exhibited biochemical role in the inhibition of seed germination, inhibition of

indole-acetic acid and enzyme, inhibition of decarboxylation activity & other protective effect

on micro-organisms and pets.

The syntheis of Ferulic acid was established by Dutt in 1935 when ferulic acid was used as a

precursor in the manufacturing of vanillin and malonic acid. There are vast numbers of studies

documented on the bio-medical properties of ferulic acid such as antioxidant activity,

UV-absorbing capacity & its effect of lignin as precursor in plants metabolic pathway. Ferulic

acid, being highly abundant, is indeed difficult to synthesize, Oryza Oil & Fat Chemical has

successfully developed an efficient method to extract ferulic acid from rice bran and suitable for

applications in the health and beauty arena.

Food & Cosmetic Material

FERULIC ACID

C

OH

OCH3

CH

COOH

H

Fig 1. Ferulic acid

FLUORESCENCIA

ÁCIDO FERÚLICO

Titulación con

ciclodextrinas y monitoreo

de los cambios en la

intensidad de fluorescencia

ESPECTRO

EMISIÓN

LONGITUD DE ONDA

INT

EN

SID

AD

DE

FL

UO

RE

SC

EN

CIA

ESPECTRO

ABSORCIÓN

310 nm excitación

330 nm emisión

FLUORESCENCIA

FLUORESCENCIA

Obtener la longitud de onda máxima de

excitación, para obtener la mayor señal de

intensidad de emisión de fluorescencia

OBTENCIÓN DEL VALOR DE KU

19

Ecuación modificada de Benesi–Hildebrand

FLUORESCENCIA

① Curva de titulación Fluorometríca ② Ajustar mediante un modelo

matemático la curva de titulación

③ Obtener Ku ④ Posteriormente calcular ΔGu

o

Zhang, M., Li, J., Jia, W., Chao, J., & Zhang, L. (2010). Theoretical and experimental study of the inclusion complexes of ferulic acid with

cyclodextrins. inclusiondoi:10.1080/10610270802596403

INCREMENTO EN LA INTENSIDAD DE

FLUORESCENCIA

20 FLUORESCENCIA

Zhang, M., Li, J., Jia, W., Chao, J., & Zhang, L. (2010). Theoretical and experimental study of the inclusion complexes of ferulic acid with

cyclodextrins. inclusiondoi:10.1080/10610270802596403

ESTUDIO DE RMN

21

ESTUDIO DE RMN

22

Estudio COSY Se observan los protones que están

relacionados entre si mediante acoplamientos

La relajación de los núcleos varíe como función

de dos tiempos de espera diferentes

JUSTIFICACIÓN

Es relevante acomplejar al ácido ferúlico con ciclodextrinas ya

que le brindará mayor solubilidad en soluciones acuosas y mayor

estabilidad en el transcurso de su almacenamiento.

Los parámetros termodinámicos obtenidos por las técnicas de

ITC y de espectroscopía de fluorescencia permitirán establecerán

las fuerzas intermoleculares que gobiernan el proceso de

inclusión del ácido ferúlico dentro de las ciclodextrinas.

Por otro lado el tener la estructura del acomplejamiento

proporcionará información acerca de cómo esta unido

estructuralmente el ácido ferúlico en las ciclodextrinas.

23

HIPÓTESIS

El método de ITC, fluorescencia y RMN permitirán obtener

información de la termodinámica y de la estructura del proceso de

acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas

(alfa,beta y gama).

24

OBJETIVOS

• Objetivo General

Evaluar los parámetros termodinámicos del proceso de

encapsulamiento del ácido ferúlico con ciclodextrinas, y la

elucidación estructural de los complejos.

25

• Meta 1

Determinar los parámetros termodinámicos propios de l proceso de

acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas ( )

mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

• Objetivos

1. Realizar el análisis termodinámico del proceso de acomplejamiento

entre la ciclodextrina y el ácido ferúlico utilizando la técnica de calorimetría

de titulación isotérmica

2. Obtener los parámetros termodinámicos mediante el ajuste de la

curva de titulación: la constante de unión (Ku), la entalpía (ΔHuo) y la

estequiometría de unión (n).

3. Calcular la energía libre de Gibbs (ΔGuo) y la entropía (ΔSuo) a

partir de los parámetros anteriores.

26 OBJETIVOS

• Meta 2

Determinar la contante de unión (Ku) mediante una

titulación fluorimétrica para contar con una medición alternativa.

• Objetivo

Investigar la posibilidad de determinar la constante de

unión (Ku) del ácido ferúlico acomplejado con las CD,

empleando una técnica de fluorescencia

27 OBJETIVOS

• Meta 3

Obtener la estructura de los complejos del ácido ferúlico

con las diferentes ciclodextrinas.

Objetivo

Elucidar la estructura la estructura de los complejos del

ácido ferúlico con las diferentes ciclodextrinas, mediante

resonancia magnética nuclear (RMN) unidimensional y

bidimensional homonuclear.

28 OBJETIVOS

METODOLOGÍA

Realizar el análisis

termodinámico del proceso de acomplejamiento

utilizando la técnica de calorimetría de titulación

isotérmica

Obtener los parámetros termodinámicos mediante

el ajuste de la curva de titulación: constante de

unión (Ku), entalpía (ΔHuo) y la estequiometría de

unión (n)

Calcular la energía libre de Gibbs (ΔGuo) y la entropía (ΔSuo)

mediante las relaciones

termodinámicas estándar

Determinar la constante de unión

(Ku) del ácido acomplejado

ferúlico con las CD, empleando una

técnica de fluorescencia

Elucidación estructural de los complejos ácido ferúlico-CD por

espectroscopía de RMN

Redacción del

documento del reporte

final

29

ΔGuo = -RT ln Ku

ΔSuo = (ΔHuo

- ΔGuo)/ T

Establecer condiciones de concentración y tipo de disolvente así como la

técnica de recuperación de los complejos

CONDICIONES DE LA

EXPERIMENTACIÓN CON ITC

Ácido ferúlico 1X10-3 M

Ciclodextrinas (α-CD, β-CD, γ-CD) 1X10-2 M

Las condiciones de los experimentos serán:

20 inyecciones de 1.5 μl de solución de ciclodextrina en la celda de

muestra que contiene la solución de ácido ferúlico.

El intervalo de tiempo entre las inyecciones será de 300 segundos.

La velocidad de agitación será de 310 rpm

La temperatura de la celda será de 25 ºC

30 METODOLOGÍA

CRONOGRAMA TRIMESTRAL DE ACTIVIDADES

31

GRACIAS POR SU

ATENCIÓN

32

• Clasificación de los polifenoles

• La subdivisión de polifenoles en taninos, ligninas y flavonoides

deriva de la variedad de unidades simples polifenoles derivadas

de los metabolitos secundarios de las plantas de la ruta del ácido

shikímico.

33

IMPORTANCIA DE POLIFENOLES • Los polifenoles naturales son valiosos compuestos que

poseen propiedades antiradicalarías y de acomplejación con proteínas.

34

Formulaciones

• Alimentos

• Farmacéuticos

Urbaniak, A., & Szela, M. (2013). Theoretical investigation of stereochemistry and solvent influence on antioxidant activity of ferulic acid,

1012, 33–40. doi:10.1016/j.comptc.2013.02.018

Controlan enfermedades como:

-Cáncer

-Trastornos cardiovasculares

-Aterosclerosis

-Asma

-Artritis

-Trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y demencia)

CICLODEXTRINAS

Capacidad para formar

complejos de inclusión

Se rompen y se forman enlaces no covalentes

durante la formación del

complejo.

La principal fuerza impulsora de la formación de complejos

es por la liberación de moléculas de agua de la

cavidad de ciclodextrinas.

Disminuye la tensión del anillo de ciclodextrina

ganando estabilidad por el descenso a un nivel inferior

de energía.

35

Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9

Industrias

• Alimentos

• Productos farmacéuticos

• Cosméticos

• Protección del medio ambiente

• Bioconversión

• Industria textil

Moleculas huésped

• Alifáticos de cadena lineal o ramificada

• Aldehídos

• Cetonas

• Alcoholes

• Ácidos orgánicos, ácidos grasos

• Compuestos aromáticos

• Compuestos polares tales como halógenos y aminas

36

USOS DE LAS

CICLODEXTRINAS

Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9

FACTORES QUE INTERVIENE EN EL

ACOMPLEJAMIENTO

Factor estérico

• Depende del tamaño relativo de la cavidad de la ciclodextrina y del tamaño de la molécula huésped.

Factor en las interacciones termodinámicas

• Interacciones termodinámicas entre los diferentes componentes del sistema (ciclodextrina, huésped y disolvente).

37

INTERACCIONES CD-HUESPED

• Interacciones energéticamente favorables que ayudan a la formación del complejo de inclusión:

• • El desplazamiento de las moléculas de agua desde la cavidad de la ciclodextrina.

• • El aumento del número de puentes de hidrógeno formados conforme el agua se desplazada hacia afuera de la ciclodextrina.

• • Una reducción de las interacciones repulsivas entre la molécula huésped hidrófoba y el entorno acuoso.

• • Un aumento de las interacciones hidrofóbicas entre la molécula huésped y la cavidad de la ciclodextrina.

38

CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN

ISOTÉRMICA (ITC)

Es una técnica altamente sensible que es capaz de determinar la interacción de la reacción de las especies en solución.

Hasta ahora se ha utilizado con gran éxito en el estudio de la interacción entre biomoléculas en soluciones acuosas diluidas brindando información termodinámica y cinética.

39

Krishnakumari, V., & Nagaraj, R. (2012). Biochimica et Biophysica Acta Binding of peptides corresponding to the carboxy-terminal

region of human-β-defensins-1 – 3 with model membranes investigated by isothermal titration calorimetry, 1818, 1386–1394.

doi:10.1016/j.bbamem.2012.02.016

MICROCALORIMETRÍA DE TITULACIÓN

ISOTÉRMICA (ITC)

La sensibilidad analítica de valoraciones termométricas está linealmente relacionada con la concentración.

El calor es liberado o absorbido en proporción directa a la cantidad de unión que se produce.

Cuando el anfitrión en la célula huésped se satura con agregado, la señal de calor disminuye hasta que el calor de fondo de dilución se observa.

40

Castronuovo, G., & Niccoli, M. (2013). Ac ce pt cr t. Thermochimica Acta. doi:10.1016/j.tca.2013.01.037

Termodinámica

41

La termodinámica es la rama de la física que describe los estados de

equilibrio a nivel macroscópico.

Entalpía es una magnitud termodinámica, simbolizada con la letra H

mayúscula, cuya variación expresa una medida de la cantidad de energía

absorbida o cedida por un sistema termodinámico, es decir, la cantidad de

energía que un sistema puede intercambiar con su entorno.

La entropía es una magnitud física que, mediante cálculo, permite

determinar la parte de la energía que no puede utilizarse para producir

trabajo. Es una función de estado de carácter extensivo y su valor, en un

sistema aislado, crece en el transcurso de un proceso que se dé de forma

natural. La energía libre de Gibbs es un potencial termodinámico, es decir, una

función de estado extensiva con unidades de energía, que da la condición

de equilibrio y de espontaneidad para una reacción química (a presión y

temperatura constantes).

• La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente.

• La energía total emitida en forma de luz es siempre menor a la energía total absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayoría de los casos la longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor energía- que la absorbida, sin embargo, si la radiación de excitación es intensa, es posible para un electrón absorber dos fotones; en esta absorción bifotónica, la longitud de onda emitida es más corta que la absorbida, sin embargo en ambos casos la energía total emitida es menor que la energía total absorbida.

42

FLUORESCENCIA tecnica

Realizar un escaneo y obtener los espectros de excitación y de

emisión del ácido ferúlico

Obtener la longitud de onda máxima de excitación, para obtener

la mayor señal de intensidad de emisión de fluorescencia

Realizar la titulación con ciclodextrinas y monitorear los cambios

en la intensidad de fluorescencia

Generar la curva de titulación fluorometríca (intensidad de

fluorescencia VS concentración de CD)

Ajustar mediante un modelo matemático la curva de titulación y

obtener el parametro de Ku y energía libre de Gibbs

43

RMN

• Tal y como se indicó en la introducción en un aparato de RMN tenemos más de un emisor de frecuencias con lo cual podemos irradiar con varias frecuencias diferentes si fuese necesario, pero también podemos hacer lo que se denominan secuencias de pulsos es decir irradiamos la muestra dejamos un cierto tiempo para que se relaje parcialmente y volvemos a irradiarla con frecuencias o campos diferentes antes de que acabe de relajarse. También cabe la posibilidad de considerar experiencias en las que la relajación de los núcleos varíe como función de dos tiempos de espera diferentes que van a dar lugar a unos espectros cuya representación debería ser tridimensional y que como convenio o convención representamos mediante curvas de nivel semejantes a los mapas topográficos y que conocemos como RMN bidimensionales. Dependiendo de las secuencias de pulsos usadas y de dichos tiempos de espera entre los pulsos se obtienen diferentes espectros siendo los dos mas usados el espectro COSY homonuclear y la correlación heteronuclear (HETCOR, HMQC). En el primero de ellos se observan los protones que estan relacionados entre si mediante acoplamientos y en el segundo nos indica que protones se relaciona con que carbono y viceversa

44