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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE MEDICINA
Avaliação da interdependência entre histidinas cinases híbridas
(BCAM0218, BCAM0227) e adesinas triméricas autotransportadas
presentes no agrupamento genético TAA do microrganismo patógeno
Burkholderia cenocepacia J2315
Eunice Jorge Penas
Curso de Mestrado em Doenças Infeciosas Emergentes
Lisboa, 2012
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE MEDICINA
Avaliação da interdependência entre histidinas cinases híbridas
(BCAM0218, BCAM0227) e adesinas triméricas autotransportadas
presentes no agrupamento genético TAA do microrganismo patógeno
Burkholderia cenocepacia J2315
Eunice Jorge Penas
Orientador: Doutor Arsénio do Carmo Sales Mendes Fialho, Instituto Superior
Técnico, Universidade Técnica de Lisboa
Co-Orientador: Professor Doutor José Augusto Gamito Melo Cristino, Faculdade de
Medicina da Universidade de Lisboa
Curso de Mestrado em Doenças Infeciosas Emergentes
Lisboa, 2012
Todas as afirmações contidas neste
trabalho são da exclusiva
responsabilidade do candidato, não
cabendo à Faculdade de Medicina da
Universidade de Lisboa qualquer
responsabilidade
I
A impressão desta dissertação foi aprovada em Conselho Cientifico da Faculdade de
Medicina da Universidade de Lisboa dia 18 de Dezembro de 2012.
II
1. Resumo
III
As bactérias do complexo Burkholderia cepacia (Bcc) apresentam capacidade de
provocar infeções graves e persistentes em doentes com Fibrose quística (CF) e em
imunocomprometidos. A sua fácil transmissibilidade, a resistência intrínseca a
antimicrobianos e o conjunto de fatores de virulência que apresentam, tornam estas
bactérias emergentes.
Deste modo, o estudo aprofundado destas bactérias torna-se necessário para o
esclarecimento da patogenicidade associada a estas estirpes bacterianas.
Burkholderia cenocepacia elemento do Bcc, é uma estirpe epidémica pertencente à
linhagem ET-12 na qual foi identificado um agrupamento de adesinas triméricas
autotransportadas (TAA) com função determinante no processo de colonização do
epitélio respiratório. A compreensão da regulação destas adesinas apresenta-se
como uma oportunidade de novos alvos antimicrobianos.
Neste projeto realizaram-se várias análises no sentido de perceber se as histinas
cinases híbridas (HKs), BCAM0218 e BCAM0227, que flanqueiam o agrupamento
TAA apresentam funções de regulação nos genes das adesinas.
O estudo envolveu inicialmente análise computacional das HKs através da qual foi
possível identificar algumas semelhanças em termos de estrutura secundária e,
diferenças em termos de percentagens de identidade, principalmente na zona
codificante para o sensor. Posteriormente, após avaliação de níveis de expressão
dos genes do agrupamento TAA em cada um dos mutantes, B. cenopecacia K56-2
BCAM0218::Tp e B. cenopecacia K56-2 BCAM0227::Tp 0227, foi verificado através
de ensaios em modelos biológicos: Galleria mellonella e células de epitélio pulmonar
humanas 16HBE14o- e CFBE41o- (fenótipo não-CF e CF, respetivamente) e, de
ensaios de hemaglutinação e resistência ao soro que existe interdependência entre
IV
as HKs híbridas e as adesinas do referido agrupamento TAA, quer a nível da
resposta transcricional quer a nível de resposta fenotípica.
Palavras-chave:
Complexo Burkholderia cepacia (Bcc), Burkholderia cenocepacia, Fibrose Quística,
Fatores de virulência, Histidinas Cinases, Adesinas triméricas autotransportadoras,
Hemaglutinação, Adesão a células do epitélio pulmonar
V
2. Abstract
VI
Bacteria of the Burkholderia cepacia complex (Bcc) have the capacity to cause
severe and persistent infections in patients with cystic fibrosis (CF) and
immunocompromised. It´s easy transmissibility, intrinsic resistance to antimicrobial
agents and the set of virulence factors present that make these bacteria emerging.
Thus, detailed study of such bacteria it is necessary for the clarification of
pathogenicity associated with these bacterial strains.
B. cenocepacia element of Bcc is an epidemic strain belonging to the ET-12 strain
was identified in which a group of trimeric autotransportadas adhesins (TAA) with
decisive role in the process of colonization of the respiratory epithelium.
Understanding the regulation of these adhesins presents an opportunity for new
antimicrobial targets.
In this project several analyzes were performed in order to understand if the hybrid
histidines Kinases (HKs), BCAM0218 and BCAM0227, flanking the TAA group have
regulatory functions in the genes of adhesins.
The first study involved computer analysis of HKS whereby it was possible to identify
some similarities in terms of secondary structure, and differences in terms of
percentages of identity, particularly in the area coding for the sensor. Subsequently
after evaluation of expression levels of genes in the cluster TAA each mutant B.
cenopecacia K56-2 BCAM0218 :: Tp and B. cenopecacia K56-2 BCAM0227 Tp ::
0227, was verified by testing in biological models: Galleria mellonella and human
lung epithelial cells 16HBE14o-and-CFBE41o (phenotype Non-CF and CF,
respectively), and hemagglutination assays and resistance to serum
interdependence that exists between the HKS and hybrid adhesins of that grouping
TAA, both at the transcriptional response both in terms of phenotypic response.
VII
Keywords
Burkholderia cepacia complex (Bcc), Burkholderia cenocepacia, Cystic Fibrosis,
Virulence factors, Histidine Kinase, Trimeric autotransporter adhesins, Adhesion of
lung epithelial cells, Hemagglutination
Índice
1. Resumo ................................................................................................................ I
2. Abstract .............................................................................................................. V
3. Abreviaturas ..................................................................................................... 15
4. Introdução ......................................................................................................... 19
4.1 Taxonomia de Burkholderia ......................................................................... 20
4.2 Complexo Burkholderia cepacia .................................................................. 21
4.2.1 Complexo Burkholderia cepacia patogénicos oportunistas ................... 24
4.2.2 Fatores e Mecanismos de Patogenicidade em Bcc .............................. 26
4.2.2.1 Pili e adesina 22KDa .............................................................................. 28
4.2.2.2 Flagelo ................................................................................................... 28
4.2.2.3 Lipopolissacarídeos ............................................................................... 29
4.2.2.4 Exopolissacarídeos ................................................................................ 30
4.2.2.5Quorum sensing ...................................................................................... 30
4.2.2.6 Biofilmes ................................................................................................ 32
4.3 Adesinas triméricas autotransportadas ....................................................... 36
4.4 Sistemas de regulação de dois componentes ............................................. 38
4.5 Histidinas Cinases ....................................................................................... 42
4.6 Modelos para estudos de infeção ................................................................ 46
5. Objetivos ........................................................................................................... 48
6. Materiais e Metodologias ................................................................................ 51
6.1 Construção do mutante de inserção B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp
52
6.2 Condições de crescimento para B. cenocepacia K56-2 e mutantes .......... 53
6.3 Linhas celulares e cultura de células ........................................................... 53
6.4 Extração de DNA e Reação em Cadeia da polimerase (PCR) .................... 54
6.5 Extração de RNA total ................................................................................. 54
6.6 Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real (RT-PCR)...................... 55
6.7 Ensaios de Infeção da Galleria mellonella ..................................................... 56
6.8 Ensaios de Hemaglutinação ........................................................................ 57
6.9 Resistência ao soro ..................................................................................... 57
6.10 Ensaios de adesão e invasão a células epiteliais 16HBE14o¯ e CFBE 410o¯
58
7. Resultados .......................................................................................................... 60
7.1 Análise computacional de HKs híbridas em membros de Bcc .................... 61
7.1.1 Histidinas Cinases BCAM0218 e BCAM0227 – Análise computacional ... 64
7.1.2 Análise da estrutura secundária e percentagem de identidade ................ 65
7.1.3 Previsão de estrutura ............................................................................ 70
7.2 Análise genética e funcional das HKs BCAM0218 e BCAM0227 de B.
cenocepacia K56-2 ................................................................................................ 76
7.2.1 Construção do mutante BCAM0227 .......................................................... 79
7.3 Análise da expressão genética dos genes do agrupamento TAA nos mutantes
deficientes para os genes BCAM0218 e BCAM0227 e na estirpe selvagem ........ 80
7.4 Avaliação fenotípica dos mutantes de B. cenocepacia K56-2 deficientes para
os genes BCAM0218 e BCAM0227, os quais codificam histidinas cinases (HK) . 85
7.4.1 Efeito na virulência no modelo animal Galleria mellonella ........................ 85
7.4.2 Efeito na capacidade de hemaglutinação ................................................. 87
7.4.3 Efeito na capacidade de adesão a culturas de células epiteliais brônquicas
........................................................................................................................... 89
7.4.4 Efeito na resistência ao soro ..................................................................... 90
8. Discussão Final ................................................................................................ 92
9. Agradecimentos ............................................................................................. 100
Índice de figuras
Figura 1. Árvore filogenética baseada nas sequências do gene 16s do rRNA de
todas as espécies do género Burkholderia………………………………………..…….22
Figura 2. Representação da localização dos fatores de virulência de B. cenocepacia
cuja função é conhecida…………………………………………………………………...27
Figura 3. Representação esquemática de uma adesina trimérica autotransportada
baseada no protótipo da YadA de Yersinnia enterocolitica
adapatado.…………………………………………………………………………...……...38
Figura 4. Representação esquemática da arquitetura modular de dois TCSs…….41
Figura 5. Árvore filogenética elaborada com base nas sequências das Histidinas
cinases híbridas de B. cenocepacia J2315 e arquitetura dos respetivos domínios
………………………………………………………………………………………………63
Figura 6. Alinhamento das sequências das Histidinas cinases BCAM0218 e
BCAM0227 com as regiões conservadas características da subfamília HPK 1b
(1)……………………………………………………………………………………….……64
Figura 7. Previsão de estrutura secundária da Histidina cinase BCAM0218 de
B.cenocepacia J2315………………………………………………………………………68
Figura 8. Previsão de estrutura secundária da Histidina cinase BCAM0227 de
B.cenocepacia J2315………………………………………………………………………69
Figura 9. Representação esquemática das percentagens de identidade entre os
vários domínios que compõem as HKs BCAM0218 e BCAM0227…………..……….70
Figura 10. Resultado obtido do alinhamento das sequências das Histidinas cinases
BCAM0218 e BCAM0227 de B. cenocepacia J2315 …………………………………73
Figura 11. A) Previsão da estrutura tridimensional das HKs em estudo segundo o
programa I-TASSER………………………………………………………………….……74
Figura 12. Organização genética do agrupamento TAA em B. cenocepacia K56-
2………………………………………………………………………………………….…..78
Figura 13. Produtos de PCR resultantes da amplificação com os iniciadores de
oligonucleotidos 227Fwd2 e 227Rev2………………………………………………….80
Figura 14. Representação gráfica dos níveis relativos da expressão genética dos
diferentes genes do agrupamento TAA…………………………………………………82
Figura 15. Representação gráfica dos níveis relativos de expressão genética dos
genes BCAM0224 e BCAM0227 em B.cenocepacia K56-2………………………….83
Figura 16. Representação gráfica do crescimento de B. cenocepacia K56-2 e B.
cenocepacia K56-2 crescida com BDSF 50 μM………………………………………..85
Figura 17. Virulência no modelo Galleria mellonella………………………………….86
Figura 18. Resultados obtidos dos ensaios de hemaglutinação de B. cenocepacia K-
56-2 e mutantes B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp e B. cenocepacia K56-2
BCAM0218::Tp ……………………………………………………………………………88
Figura 19. Representação gráfica da % média de adesão dos mutantes em estudo e
da estirpe selvagem B. cenocepacia K56-2……………………………………….…….90
Figura 20. Representação gráfica dos resultados obtidos dos ensaios bactericidas
com 30% de Soro Normal Humano (NHS)………………………………………………91
Índice Tabelas
Tabela 1. Complexo Burkholderia cepacia………………………………………………23
Tabela 2. Exemplos de alguns sistemas de regulação de dois componentes………41
Tabela 3. Nome, localização e descrição de alguns domínios encontrados em
histidinas cinases…………………………………………………………………………...45
Tabela 4. Oligonucleótido utilizados para a amplificação por PCR…………………..56
Tabela 5. Localização e tamanho das sete HK híbridas descritas em B. cenocepacia
J2315……………………………………………………………………………………..….62
Tabela 6. Descrição dos valores e estruturas que permitiram prever as estruturas
tridimensionais das KHs BCAM0218 e BCAM0227…………………………………....75
15
3. Abreviaturas
16
aa - aminoácidos
ATP – Adenosina trifosfato
BDSF – ácido cis-2-dodecanoico
CA – Domínio catalítico e de ligação ao ATP do inglês Catalytic and ATP-binding
domain
CF – Fibrose Quística do inglês Cystic fibrosis
CFTR – regulador de condutância transmembranar de fibrose quística do inglês
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
CGD – doença granulomatose crónica do inglês chronic granulomatous disease
DHp – Domínio de dimerização e fosfotransferência do inglês dimerization and
histidine phosphotransfer domain
DO – Densidade óptica
Dominio PAS - do inglês PAS domain – (Per) – period circadian protein, (Arnt) - aryl
hydrocarbon receptor nuclear translocator protein e (Sim) - single-minded protein.
ET-12 – do inglês Edinburgh-Toronto epidemic Electrophoretic Type 12 clone
FBS – Soro fetal de bovino
HAMP – do inglês histidine Kinase, adenylyl cyclase, methyl-accepting chemotaxis
proteins and phosphatase ou P-type linker
HisKA – Domínio de Histidina cinase A fosfo-recetor do inglês Histidine Kinase A
phosphoacceptor domain
17
HK – Histidina cinase do inglês Histidine Kinase
HPK – Proteína histidina cinase do inglês histidine protein kinase
Hyp – proteína hipotética do inglês hypothetical protein
LB – Meio de cultura Luria-Bertani
LPS - Lipopolissacarídeos
MEM – Meio essencial mínimo com sais Earle do inglês Minimum Essential Medium
with Earle’s salt
MOI – Multiplicidade de infeção do inglês Multiplicity infection
NHS – Soro Humano Normal do inglês Normal Human Sérum
OMP – proteína externa da membrana do inglês outer membrane protein
PBS – Solução salina tamponada com fosfato do inglês Phosphate buffered saline
PCR – Reação em cadeia da polimerase
RNA – Ácido ribonucleico
Rpm – rotações por minuto
RR – Regulador de resposta
TAA - Adesina trimérica autotransportada do inglês trimeric autotransporter adhesin
Tatac – Agrupamento de adesinas triméricas autotransportadas do inglês Trimeric
autotransporter adhesin cluster
18
TCS – Sistema de regulação de dois componentes do inglês Two-component
regulatory system
Tp – Trimetropim
U – unidades
UFC – Unidades formadoras de colónias
VIH – Vírus da imunodeficiência humana
19
4. Introdução
20
4.1 Taxonomia de Burkholderia
O primeiro isolado de Burkholderia foi descrito nos anos 40 por Burkholder como
bactéria fitopatogénica capaz de causar podridão nos bolbos de cebola (5). Devido
às características fenotípicas dos isolados estes foram, durante muitos anos,
incluídos no género Pseudomonas (5). Só em 1992, com recurso a resultados
moleculares baseados na análise do gene que codifica para a subunidade 16s do
rRNA, valores de homologia DNA-DNA, composição de lípidos celulares e ácidos
gordos e características fenotípicas dos isolados, algumas espécies do género
Pseudomonas foram transferidas para um novo género, o género Burkholderia,
sendo Burkholderia cepacia considerada a espécie tipo (6).
Vários investigadores dedicaram-se ao estudo da diversidade das estirpes de B.
cepacia e, verificaram que existe uma elevada heterogeneidade entre as mesmas
(7). Em 1997 Vandamme et al dividem as espécies de B. cepacia em cinco
genomovars, grupo de estirpes fenotipicamente semelhantes mas genotipicamente
distintas. O grupo de cinco genomovars é então mais tarde designado por Complexo
Burkholderia cepacia (Bcc- Burkholderia cepacia complex) (8)
O género Burkholderia compreende um grupo de bactérias Gram negativas, em
forma de bacilos não esporolados, móveis e aeróbios (7-9). Atualmente é constituído
por 60 espécies e candidatos a espécies, representadas na figura 1, árvore
filogenética elaborada com base no gene que codifica para a subunidade 16s do
rRNA (www.bacterio.cict.fr/b/burkholderia.html). Estas espécies apresentam uma
elevada e peculiar versatilidade no que concerne aos diferentes ambientes que
habitam, às aplicações biotecnológicas onde podem estar envolvidas e ao elevado
potencial infecioso que algumas apresentam (9, 10).
21
As espécies do género Burkholderia podem ser isoladas de diferentes ambientes
como solo, água, plantas, rizosfera, animais, equipamentos hospitalares, soluções
farmacêuticas e humanos (11).
São dois os fatores que justificam a versatilidade ecológica deste género de
microrganismos, por um lado a polivalência metabólica devido à sua elevada
capacidade de codificação e multireplicação dos grandes genomas que apresentam,
de 6 a 9 Mb e, por outro os genomas apresentarem matrizes de elementos móveis
que promovem plasticidade genómica e adaptabilidade geral (10, 12).
4.2 Complexo Burkholderia cepacia
Atualmente as bactérias do designado Complexo Burkholderia cepacia estão
distribuídas por 17 espécies aparentadas, ver tabela 1,estas partilham um elevado
grau de identidade nas sequências do gene que codifica para a subunidade 16s do
rRNA (98% a 100%), no gene recA (94% a 95%) e níveis moderados de hibridação
DNA-DNA (30% a 50%) (7-9, 13, 14).
Segundo Vandamme 2003, ainda dentro do Bcc e de acordo com análises efetuadas
ao gene RecA B. cenocepacia e B. cepacia estão ainda divididas em quatro grupos
(A, B, C e D) e dois subgrupos respetivamente (13).
As espécies de Bcc são de natureza saprófita, vulgarmente encontradas a colonizar
o solo, plantas, ambientes aquáticos e terrestres.
Contudo, para além da sua distribuição generalizada no ambiente, algumas das
espécies do Bcc apresentam a capacidade de provocar infeções graves e
persistentes em doentes com Fibrose Quística (CF – do inglês cystic fibrosis) e em
doentes imunocomprometidos (15).
22
Burkholderia andropogonis ATCC 23061
(X67037)
Burkholderia sacchari IPT101 (AF263278)
Burkholderia tropica Ppe8 (AJ420332) Burkholderia unamae MTl-641 (AY221956)
Burkholderia nodosa R-25486 (AM284972) Burkholderia oxyphila OX-01 (AB488693)
Burkholderia silvatlantica SRMrh-20 (AY965240)
Burkholderia ferrariae FeGI01 (DQ514537) Burkholderia mimosarum PAS44 (AY752958)
Burkholderia heleia SA41 (AB495123)
Burkholderia tuberum STM678 (AJ302311)
Burkholderia kururiensis KP23 (AB024310)
Burkholderia phenoliruptrix AC 1100 (AY435213)
Burkholderia acidipaludis SA33 (AB513180)
Burkholderia phymatum STM815 (AJ302312) Burkholderia sabiae Br3407 (AY773186)
Burkholderia caribensis MWAP64
(Y17009)
Burkholderia hospita LMG 20598 (AY040365) Burkholderia terrae KMY02 (AB201285)
Burkholderia bryophila LMG 23644
(AM489501)
Burkholderia fungorum LMG 16225
(AF215705)
Burkholderia megapolitana LMG 23650 (AM489502)
Burkholderia terricola LMG 20594 (AY040362) Burkholderia xenovorans
LB400 (U86373)
Burkholderia phytofirmans PsJN (AY497470)
Burkholderia graminis C4D1M (U96939)
Burkholderia caledonica LMG 19076
(AF215704)
Burkholderia sediminicola HU2-65W (EU035613)
Burkholderia phenazinium LMG 2247 (U96936)
Burkholderia sartisoli RP007 (AF061872) Burkholderia ginsengisoli KMY03
(AB201286)
Burkholderia sordidicola S5-B (AF512826) Burkholderia glathei LMG 14190 (U96935)
Burkholderia cepacia ATCC 25416 (AF097530)
Burkholderia lata R-15816
(AM905038)
Burkholderia latens R-5630 (AM747628)
Burkholderia metallica R-16017 (AM747632)
Burkholderia multivorans LMG 13010 (Y18703)
Burkholderia pyrrocinia LMG 14191 (U96930)
Burkholderia seminalis R-24196 (AM747631)
Burkholderia ubonensis EY 3383
(AB030584)
Burkholderia vietnamiensis TVV
75 (U96928)
Burkholderia ambifaria AMMD
(AF043302)
Burkholderia arboris R-24201 (AM747630)
Burkholderia diffusa R-15930 (AM747629)
Burkholderia stabilis LMG 14294 (AF148554)
Burkholderia cenocepacia LMG 16656 (AF148556)
Burkholderia anthina R-4183 (AJ420880) Burkholderia contaminans I29B (GQ397111)
Burkholderia dolosa LMG 18941 (AF175314)
Burkholderia gladioli pv. gladioli ATCC 10248 (X67038)
Burkholderia mallei ATCC 23344 (AF110188)
Burkholderia plantarii LMG 9035 (U96933)
Burkholderia thailandensis
E264 (U91838)
Burkholderia glumae LMG 2196 (U96931) Burkholderia oklahomensis C6786 (DQ108388)
Burkholderia pseudomallei ATCC 23343 (DQ108392)
Burkholderia caryophylli ATCC 25418 (X67039)
Burkholderia rhizoxinica HKI 454
(AJ938142)
Burkholderia soli GP25-8 (DQ465451)
Burkholderia endofungorum B5 (AM420302)
Bu
rkh
old
eria
cep
aci
a complex
Figura 1. Árvore
filogenética baseada nas
sequências do gene 16s
do rRNA de todas as
espécies do género
Burkholderia.
As 17 espécies do
designado complexo
Burkholderia cepacia
encontram-se delimitadas
a preto. O alinhamento
múltiplo foi efetuado
recorrendo ao programa
ClustalW2 e a árvore
filogenética através do
ClustalW2 e Neighbor
joining method (2)
23
Nos doentes com CF, as infeções do trato respiratório com estirpes de Bcc revelam-
se muito difíceis de controlar dado à sua multirresistência aos antibióticos,
conduzindo frequentemente a uma rápida deterioração da função respiratória
caracterizada por pneumonia necrotizante e septicémia fatal – Síndrome da cepacia
(16, 17).
Tabela 1. Complexo Burkholderia cepacia adaptado de Lipuma et al 2010 (15)
Espécie Ano de identificação Referência
B. cepacia 1950 Vandamme et al., 1997
B. vietnamiensis 1995 Vandamme et al., 1997
B. multivorans 1997 Vandamme et al., 1997
B. cenocepacia 1997 Vandamme et al., 2003
B. stabilis 1997 Vandamme et al., 1997
B. dolosa 2001 Vermis et al., 2004
B. ambifaria 2001 Coenye et al., 2001
B. anthinia 2002 Vandamme et al 2002
B. pyrrocinia 2002 Vandamme et al., 2002
B. ubonensis 2000 Yabuuchi et al., 2000
B. metallica 2008 Vanlaere et al., 2008
B. lattens 2008 Vanlaere et al., 2008
B. arbores 2008 Vanlaere et al., 2008
B. seminalis 2008 Vanlaere et al., 2008
B. diffusa 2008 Vanlaere et al., 2008
B. late 2009 Vanlaere et al., 2009
B. contaminans 2009 Vanlaere et al., 2009
24
4.2.1 Complexo Burkholderia cepacia patogénicos oportunistas
Todas as bactérias pertencentes ao Bcc à exceção de B. ubonensis já foram
isoladas de doentes com CF. Apesar das espécies de Bcc terem sido isoladas de
aproximadamente 10% dos adultos com CF, estes patogénicos não se limitam à
população com CF, são também agentes etiológicos de infeções em doentes com
granulomatose crónica (DGC), em doentes imunocomprometidos oncológicos e em
doentes com Vírus da imunodeficiência Humana (VIH) e, por vezes, até mesmo em
indivíduos imunocompetentes (12, 18, 19).
A DGC é uma doença hereditária rara provocada por uma mutação numa
subunidade do complexo NADPH oxidase dos fagócitos, levando à incapacidade de
formar compostos reativos de oxigénio para o combate a infeções (20). Infeções por
espécies de Bcc e pneumonia são a segunda causa de morte na DGC (20).
A CF é uma das doenças genéticas mais comuns na raça caucasiana e afeta
segundo Cystic Fibrosis Foundation 70 000 indivíduos em todo o mundo (21).
Estima-se que 1 em cada 2500 recém – nascidos seja afetado e 1 em cada 25
indivíduos seja portador do alelo mutado (22). A cada ano registam-se
aproximadamente 1000 novos casos. Sendo a esperança média de vida dos
doentes CF 37 anos e a idade média de morte de 24 anos (21).
Em Portugal, a incidência de CF estima-se ser na ordem de 1 em cada 400 recém-
nascidos (23). Um estudo recente envolvendo 506 isolados provenientes de 41
doentes CF infetados com Bcc, do Centro de tratamento de fibrose quística do
Hospital Santa Maria em Lisboa, revela que a estirpe de Bcc mais prevalente é B.
cepacia e B. cenocepacia. A CF é uma doença causada por mutações num gene
25
com 590 Kilobases (Kb), gene cftr, localizado no cromossoma sete e, o qual codifica
a proteína designada por regulador de condutância transmembranar de fibrose
quística (CFTR – do inglês cystic fibrosis transmembrane conductance regulator),
com 1480 aminoácidos (24). Trata-se de uma proteína transportadora do ião cloreto,
localizada na membrana apical das células epiteliais (15). A sua não funcionalidade
condiciona o transporte eletrolítico nas células epiteliais afetando todos os órgãos
onde a proteína CFTR é expressa: pulmões, pâncreas, trato gastrointestinal e
glândulas submucosas, conduzindo a uma diminuição do conteúdo hídrico das
secreções e consequente obstrução de ductos (25).
O pulmão é um dos principais órgãos afetados em doentes com FQ. As secreções
são desidratadas, dificultando a limpeza mucociliar e os elevados teores de cloreto
de sódio levam à inativação de proteínas relacionadas com a resposta imunológica,
formando-se deste modo um ambiente favorável à colonização de microrganismos e,
consequentemente ao aumento da suscetibilidade a infeções respiratórias (16, 17).
Nos doentes com CF, as infeções mais comuns associadas ao trato respiratório são
causadas por espécies oportunistas tais como Pseudomonas aeruginosa, espécies
pertencentes ao Complexo Burkholderia cepacia e estirpes patogénicas comuns no
Homem como Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae (15, 26). O carácter
emergente das infeções com estirpes de Bcc em doentes com CF deve-se à elevada
transmissibilidade das estirpes, à sua resistência intrínseca a um largo espectro de
compostos antimicrobianos, bem como à ação concertada de um conjunto variado
de fatores de virulência.
Algumas estirpes do Bcc apresentam uma elevada transmissibilidade entre doentes
com CF, conduzindo a infeções epidémicas. Um caso particular de elevada
26
transmissibilidade e virulência ocorreu com as estirpes epidémicas da linhagem
eletroforética tipo 12, ET-12 (Edinburgh–Toronto), estas estirpes foram responsáveis
pelo maior surto em doentes CF que ocorreu no Canadá e Reino Unido, no final dos
anos 80 início da década de 90 (27). A base para a híper-transmissibilidade das
estirpes B. cenocepacia ET-12 não é totalmente compreendida, no entanto sabe-se
que se trata de uma estirpe de Bcc, que apresenta em conjunto dois fatores de
virulência determinantes na sua colonização e transmissibilidade: pili e adesina 22-
KDa (28).
Outra estirpe também epidémica de B. cenocepacia é a B. cenocepacia PHDC que
foi isolada de doentes com CF na região média atlântica dos Estados Unidos da
América, Phyladelphia. Esta estirpe foi isolada de solos agrícolas e de doentes com
CF revelando desta forma o meio ambiente como reservatório e meio de aquisição
de estirpes de Bcc. (29)
4.2.2 Fatores e Mecanismos de Patogenicidade em Bcc
Devido à diversidade de nichos ecológicos que os membros de Bcc podem habitar e
à sua versatilidade, estas espécies têm de apresentar uma capacidade diversificada
de interações biológicas quer com o meio ambiente quer com as células hospedeiras
dos tecidos onde se tornam patogénicas.
Para a maioria das bactérias patogénicas, um passo crucial para estabelecer uma
infeção é o reconhecimento e colonização bem-sucedida do tecido do hospedeiro
(10, 12) . Desde que houve o reconhecimento das bactérias de Bcc como
27
causadoras de infeções graves em doentes CF, muitos progressos têm sido feitos
na caracterização dos determinantes de virulência.
B. cenocepacia foi a espécie mais comumente isolada de doentes CF e associada à
disseminação de epidemias entre os mesmos (19). Devido a tal B. cenocepacia é a
espécie mais representativa de Bcc e melhor caraterizada.
São a especificidade e a capacidade de conjugação de múltiplos determinantes de
virulência, ver figura 2, que permitem a esta espécie causar doença, entre os vários
determinantes destacam-se: os sistemas de secreção, os sistemas de regulação da
expressão dos genes, vias metabólicas e de aquisição de nutrientes, moléculas
necessárias para a resistência a compostos antimicrobianos e proteínas cujas
funções ainda não são bem conhecidas (30).
Figura 2. Representação da localização dos fatores de virulência de B. cenocepacia cuja
função é conhecida adaptada de Lotet e Valvano, 2010.
28
4.2.2.1 Pili e adesina 22KDa
Os pili são apêndices filiformes grandes (2-4mm), existentes na superfície das
bactérias. Alguns estudos in vitro demonstram o efeito citotóxico dos pili tendo a
capacidade de iniciar a apoptose em linhas celulares epiteliais de pulmão humanas
(31) e de se ligarem a uma outra variedade de células epiteliais como as da
cavidade bucal humana, epitélio das vias aéreas, pneumócitos alveolares do tipo II,
à traqueia, entre outras (32, 33). Devido à débil depuração mucociliar no pulmão do
doente com CF a ligação através dos pili às células do epitélio torna-se mais fácil
(16).
As bactérias do Bcc ligam-se às células epiteliais através da ligação dos pili mediada
pela adesina 22 KDa. As células epiteliais por sua vez apresentam uma proteína de
superfície designada de CK13 que permite a ligação dos pili.
Segundo Sajjan et al, 2000, foi demonstrado existir um aumento da expressão da
CK13 em vias aéreas de doentes com CF, principalmente no epitélio brônquio
alveolar e respiratório, facilitando deste modo a infeção por estes organismos (32).
Dentro de Bcc, apenas as estirpes B. cenocepacia da linhagem ET12 são capazes
de apresentar ambos elementos patogénicos, pili e adesina 22KDa, sendo que o
potencial das bactérias para causar infeção aumenta quando possuem
conjuntamente pili e adesina 22 KDa (32).
4.2.2.2 Flagelo
O flagelo é um apêndice filiforme que proporciona a mobilidade às bactérias, este é
considerado um determinante de patogenicidade importante devido ao seu
envolvimento na disseminação da bactéria do local de infeção para outros órgãos.
29
Este apêndice está envolvido na invasão de células epiteliais, na formação de
biofilmes e na indução da resposta do hospedeiro (34).
O flagelo é capaz de ligar-se e interagir com o recetor TLR5 do hospedeiro, que
reconhece padrões moleculares de microrganismos e inicia a resposta imunitária
inata. No entanto, o reconhecimento e ativação do sistema imunitário contribuem
para o aumento da inflamação e dos danos no pulmão (35).
De acordo com resultados publicados por Tomich et al, 2002 que através de
mutantes B.cenocepacia k56-2 com o flagelo bloqueado demonstrou uma redução
de 40% na morte de ratinhos C57BL/6j, foi verificado que a mobilidade é
fundamental para a invasão de células epiteliais (36).
4.2.2.3 Lipopolissacarídeos
Lipopolissacaríedos (LPS) são glicolípidos complexos compostos por três
segmentos: lípido A, polissacarídeo central e o antigénio O e estão localizados na
membrana externa das bactérias Gram negativas. Estas moléculas são
reconhecidas como importantes fatores de virulência.
Nos membros de Bcc, os LPS têm uma particularidade que os difere em parte das
outras bactérias Gram negativas. Os LPS destas bactérias segundo Albercht et al,
têm capacidade de neutralizar a carga iónica na superfície celular havendo indicação
de estarem envolvidos nos mecanismos de resistência aos antibióticos, como por
exemplo com as polimixinas e com péptidos antimicrobianos catiónicos (37).
Os LPS apresentam-se desta forma como um bom alvo para o desenvolvimento de
antimicrobianos no entanto, estudos estruturais demonstram uma grande
diversidade de LPS em estirpes de Bcc, dificultando o desenvolvimento de uma
30
vacina eficiente contra LPS do Bcc. Os anti-soros produzidos contra os LPS de uma
estirpe do Bcc são normalmente incapazes de reagir com os LPS de outras estirpes
(38).
Outra capacidade específica dos LPS do Bcc é a capacidade de estimular os
neutrófilos humanos com o aumento consequente da expressão de CD11b na sua
superfície, estimulando a fagocitose da bactéria e a libertação de espécies reativas
de oxigénio. Desta forma as enzimas dos neutrófilos induzem danos nos tecidos
pulmonares (39).
4.2.2.4 Exopolissacarídeos
A produção de exopolissacarídeos (EPS) é uma característica comum entre os
isolados clínicos do Bcc (40-42). As estirpes de Bcc têm capacidade de produzir pelo
menos quatro tipos diferentes de EPS, sendo o mais comum designado de
cepaciano (41, 43)
A produção de EPS por membros de Bcc está envolvida em vários mecanismos
associados à virulência tais como: na interação com péptidos antimicrobianos (41),
na persistência no pulmão do doente CF (42, 44) e em modelos de infeção (45), na
formação de biofilmes (40) na quimiotaxia dos neutrófilos e, na capacidade de
sequestrar espécies reativas de oxigénio, havendo nestes dois últimos uma ação
direta e fundamental na defesa pulmonar do hospedeiro (46).
4.2.2.5 Quorum sensing
O quorum sensing (QS) consiste num processo de comunicação química que
permite regular a expressão genética a partir da densidade da população bacteriana,
através da síntese e deteção de moléculas QS (30, 47)
31
Estes mecanismos permitem às bactérias uma adaptação rápida a um determinado
ambiente e tem-se demonstrado um importante fator de virulência em Burkholderia.
É responsável pela produção de toxina, protéase, produção de sideróforos, bem
como pelo fenótipo swarming e formação de biofilme (48, 49).
Para além da comunicação intra espécie, foi demonstrado que membros de Bcc têm
a capacidade de comunicar entre espécies, especificamente com Pseudomonas
aeruginosa, verificou-se que espécies de Bcc detetavam e respondiam a moléculas
de QS de P. aeruginosa, possibilitando a formação de biofilmes mistos entre duas
espécies. Esta capacidade de comunicação entre estas espécies demonstra
vantagem de adaptação por exemplo na invasão de pulmões que já foram
colonizados anteriormente por outra espécie (50).
Recentemente foi descrito que B. cenocepacia produz uma molécula de sinalização
célula-célula capaz de comunicar não só entre espécies mas também entre
organismos de diferentes reinos, designada por ácido cis- 2 dodecanoico (BDSF)
(51).
A síntese de BDSF em Burkholderia é efetuada através do gene BCAM0851, sendo
reconhecida intracelularmente através da histidina cinase BCAM0227 (51). Segundo
MacCarthy et al, 2010, uma mutação no gene BCAM0851 leva à redução da
mobilidade, à redução da capacidade de formação de biofilme e atenua a virulência
no modelo experimental Galleria mellonella.
O processo de comunicação entre as células, QS, tem levado a cabo muitos estudos
no sentido de encontrar compostos inibitórios. Já muitos compostos inibidores foram
descritos e, um crescente número de estudos demonstram a sua capacidade na
prevenção de formação de biofilmes, bem como no aumento da capacidade de
32
rutura dos mesmos, diminuição da produção de fatores de virulência e das
dificuldades de resposta ao stress oxidativo a que estão sujeitas (52-55).
4.2.2.6 Biofilmes
Biofilmes são comunidades complexas de bactérias embebidas numa matriz e
aderidas a uma superfície (56). Este processo de adesão a superfícies e formação
de comunidades foi desenvolvido pelas bactérias com o intuito de se auto
protegerem. A formação de biofilmes proporciona proteção aos elementos que o
constituem não só em termos nutricionais mas também em termos de alterações
ambientais e na defesa contra o hospedeiro. Estas comunidades apresentam
proteção não só aos antibióticos mas também ao sistema imunitário do hospedeiro
(47, 56).
Bactérias do Bcc colonizam os pulmões dos doentes com CF através de biofilmes,
podendo estes serem mistos, isto é, formados por mais do que uma espécie de
bactérias, as quais comunicam entre si por QS. P. aeruginosa é um exemplo
frequente presente em biofilmes com elementos do Bcc (57).
A formação de biofilmes é afetada pela quantidade de ferro disponível pela síntese
de exopolissacárido e pela mobilidade das bactérias (40, 58).
A interrupção do crescimento dos biofilmes de B. cenocepacia é um alvo atrativo
para o desenvolvimento de novos antibióticos e inibidores de QS (59).
4.2.2.7 Proteínas extracelulares e sistemas de secreção
B. cenocepacia tem capacidade de produzir duas metaloproteases de zinco
distintas, ZmpA e ZmpB, com capacidade para atuar em diferentes substratos. A
33
expressão das duas metaloproteases de zinco é controlada por QS e pelo regulador
ShvR sendo estas secretadas através do sistema de secreção tipo II (T2SS) (60).
Ambas as metaloproteases têm capacidade de degradar vários substratos de
importância biológica, ZmpA: neutrófilos, inibidores de proteínases, macroglobulina,
interferão ɣ, colagénio tipo IV e fibronectina e, ZmpB: transferrina, lactoferrina,
colagénio tipo IV e imunoglobulinas (61).
Em Burkholderia as duas metaloproteases atuam ao nível da destruição da
integridade do tecido hospedeiro e ao nível do sistema imunitário do hospedeiro,
levando consequentemente ao aumento da inflamação (60, 62).
A maioria dos organismos requer ferro como elemento essencial para uma
variedade de vias metabólicas celulares (63, 64).
O Pulmão possui lactoferrina intra e extracelularmente com capacidade de ligação
ao ferro. A presença desta proteína limita a disponibilidade de ferro, pois este ao
reagir com o oxigénio causa danos ao tecido pulmonar. A colonização deste órgão
por parte das bactérias implica estratégias para obtenção do mesmo uma vez que a
maioria dos organismos requer ferro como elemento essencial para uma variedade
de vias metabólicas celulares (63, 64).
Um dos potenciais fatores de virulência implicados na patogénese da infeção de B.
cepacia é a produção de sideróforos (65). Os sideróforos são moléculas de baixo
peso molecular, quelantes de ferro, utilizadas pelas estirpes de Bcc para obtenção
de ferro do meio ambiente (66).
As lípases são enzimas também secretadas por algumas espécies do Bcc. Estas
enzimas desempenham um papel importante no processo de invasão às células
34
epiteliais. Um estudo desenvolvido por Mullan et al., 2007 revelou que quando B.
cenocepacia é submetida a um pré-tratamento com um inibidor de lípase, a sua
capacidade de invasão às células epiteliais diminuiu (67)
Os sistemas de secreção de proteínas visam não só cumprir funções celulares
básicas, mas também o desenvolvimento de estratégias de virulência essenciais
para as bactérias patogénicas durante a interação com as células hospedeiras
eucarióticas (68).
A maioria das bactérias Gram negativas apresenta mecanismos de secreção, estes
mecanismos consistem na produção e transporte de moléculas efectoras proteínas,
enzimas ou toxinas do interior celular para o exterior.
Dos sete sistemas de secreção descritos em Gram negativos o Sistema de secreção
tipo IV (T5SS) é o sistema mais difundido (68).
Dentro de Bcc estão descritos cinco tipos de sistemas de secreção: tipo II, III, IV, V e
VI que contribuem para a virulência.
4.2.2.8 Resistência a antibióticos
A rizosfera é o habitat de muitos microrganismos que produzem antibióticos,
sabendo-se que membros do género Burkholderia são simbiontes de plantas, fungos
e insetos, dentro do seu ambiente natural estas bactérias são expostas a péptidos
antimicrobianos, a polimixinas e outros compostos semelhantes. Esta exposição de
forma continuada exerce pressão seletiva promovendo a evolução de elevados
níveis de resistência a este tipo de compostos (30, 69).
35
A capacidade dos membros do Bcc para resistir a vários antibióticos e compostos
antimicrobianos classifica-os como graves e preocupantes patogénicos oportunistas
(70).
Dentro dos mais variados compostos antimicrobianos aos quais os membros de Bcc
apresentam resistência, destaca-se a penicilina G a qual as bactérias deste
complexo conseguem utilizar como única fonte de carbono (71).
Do ponto de vista clínico, a resistência intrínseca a antibióticos por parte das
bactérias do Bcc é problemática no tratamento dos pacientes e no controlo da
infeção (72).
A alteração de permeabilidade da membrana foi classificada como o mecanismo de
defesa mais importante contra agentes antimicrobianos, devido à existência de LPS
modificados, bombas de efluxo, porinas e a habilidade de produzir EPS e/ou formar
biofilmes (73).
A expressão controlada de porinas conjuntamente com propriedades intrínsecas,
podem bloquear o acesso de moléculas antimicrobianas ao periplasma. A presença
de várias bombas de efluxo de antibióticos tem também implicação na resistência a
antibióticos (12).
A resistência intrínseca à polimixina, trimetoprim / sulfametoxazol, cloranfenicol,
antibióticos aminoglicósidos e a péptidos antimicrobianos catiónicos, incluindo as
defensinas parece estar associada à capacidade característica das bactérias do Bcc
apresentarem LPS com capacidade de neutralização da carga das células (37, 74-
76).
Apesar de todos os mecanismos moleculares por detrás da evolução espontânea de
resistência a antimicrobianos bem como as múltiplas vias de resistência de B.
36
cenocepacia ainda não serem bem conhecidos, os mecanismos de resistência a
antibióticos apresentados pelas estirpes do Bcc
podem ser agrupados em três categorias: modificação enzimática, alteração dos
alvos das drogas e permeabilidade limitada (77).
A fim de solucionar a problemática da resistência a antimicrobianos tem-se
desenvolvido diferentes abordagens pelas comunidades hospitalares. Atualmente
utilizando a vantagem do efeito sinergético de drogas duas ou mais combinações de
fármacos podem permitir o controlo da infeção de estirpes do Bcc, (78). Todavia, a
existência de interações antagónicas e a manifestação de efeitos secundários
associados aos antibióticos constituem um problema.
4.3 Adesinas triméricas autotransportadas
As adesinas triméricas autotransportadas (TAAs) são um grupo de proteínas
produzidas por muitos patógenos Gram negativos e constituem um fator de
virulência muito importante (79, 80).
A adesão às proteínas da matriz extracelular das células do hospedeiro parece ser o
papel mais importante desempenhado por estas proteínas (80). No entanto, estas
estruturas proteicas apresentam outras capacidades funcionais no que concerne à
virulência, apresentam intervenção na formação de biofilmes, capacidade de
agregação célula-célula, hemaglutinação, capacidade de proteção à resposta imune
do hospedeiro e capacidade de invasão das células do hospedeiro (81, 82).
Todas as TAAs apresentam uma arquitetura comum, apresentam um domínio
ancorado à membrana interna da célula C-terminal composto por quatro cadeias
37
beta, e uma superfície exposta subdividida em três domínios: pedúnculo, haste e
cabeça N-terminal (83).
Algumas TAAs de um elevado número de bactérias patogénicas já estão bem
caracterizadas em termos funcionais e estruturais são exemplos a YadA de Yersinia
enterocolitica (84), Hia de Haemophilus influenzae(85), NadA de Neissiria
meningitidis (86), Sad A de Salmonella enterica (87) entre outras.
Segundo um estudo elaborado por Mil-Homens e Fialho, 2011 a todos os genomas
do Bcc sobre a organização cromossomal das TAAs e respetivos genes vizinhos,
parece existir dentro de determinados grupos de bactérias do Bcc uma conservação
de organização genética e de regulação das TAAs, em que os genes efectores de
virulência, genes codificantes de TAAs, são regulados através de sistemas de
regulação de dois componentes.
Em B. cenocepacia J2315 estão anotadas sete TAAs. Dos sete genes que codificam
para as adesinas, cinco encontram-se no cromossoma dois: BCAM0219,
BCAM0223, BCAM0224, BCAM2418 e BCAM1115, e duas no cromossoma três:
BCAS0236 e BCAS0335 (79).
Um sistema de regulação bacteriano protótipo das TAAs de B. cenocepacia é o de
Bordetella pertussis BvgAS, que desempenha a regulação dos genes das adesinas
e de toxinas através de sistemas de regulação de dois componentes (88).
Análises de reações da polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR), revelaram
que as adesinas BCAM0219, BCAM0223 e BCAM0224 eram sobre expressas
quando as bactérias eram crescidas em condições ambientais especiais,
consideradas de stress: elevada osmolaridade, oxigénio limitado e stress oxidativo
(17).
38
Figura 3. Representação esquemática de uma adesina trimérica autotransportada baseada no
protótipo da YadA de Yersinnia enterocolitica adapatado de Mil-Homens e Fialho 2011 (79).
4.4 Sistemas de regulação de dois componentes
Os organismos coabitam em ecossistemas dinâmicos onde ocorrem constantemente
alterações de parâmetros físico-químicos: temperatura, luz, concentração de
oxigénio, entre outros. As variações quer bióticas quer abióticas no meio circundante
dos mesmos, implicam direta e indiretamente alterações metabólicas celulares de
forma a proporcionar homeostasia entre o organismo e o meio ambiente.
Dependendo da complexidade/organização celular do organismo as alterações
ambientais tornam-se mais ou menos dramáticas sendo mais difícil alcançar o
equilíbrio celular quando se fala de organismos procarióticos (89, 90).
Uma grande variedade de processos moleculares adaptativos dos seres
procarióticos têm vindo a evoluir, no entanto a resposta bacteriana a sinais
39
ambientais está concentrada maioritariamente em sistemas de regulação de dois
componentes (TCS).
A análise de diversos genomas bacterianos tem demonstrado que as bactérias
apresentam em média 52 sistemas de regulação de dois componentes, sendo estes
utilizados como mecanismos primários de resposta rápida a alterações ambientais,
ver tabela 2 (91).
Tipicamente nos TCSs estão envolvidas duas famílias de proteínas: Histidinas
Cinases (HK), dependentes de estímulo e reguladores de resposta (RR),ver figura 4,
(90, 91). A química da sinalização celular destes sistemas consiste na receção de
um sinal ambiental pela HK e o processamento deste por uma sequência de reações
que envolve a fosforilação de resíduos de histidina e aspartato (92).
Geralmente as HKs possuem uma extremidade N-terminal que recebe o estímulo
ambiental e um domínio transmissor C-terminal que se autofosforila após ser
estimulado (91).
Por seu lado os RRs possuem um domínio efetor C-terminal e um domínio recetor
N-terminal que é fosforilado após interação com o domínio transmissor da HK. Esta
fosforilação provoca alterações na conformação do RR, modulando a afinidade do
domínio efetor para os seus alvos, tipicamente, promotores de genes (93).
Estudos genéticos evolutivos têm demonstrado que ao longo dos tempos tem
existido alterações, fusões/fissões, nos genes dos sistemas de regulação de dois
componentes (91). Nos genomas bacterianos os genes das HKs e dos RRs,
separadamente, codificam para sistemas de regulação de dois componentes típicos,
todavia, em alguns casos, aparentemente, ocorre a junção de dois genes originando
40
histidinas cinases híbridas, que compreendem numa só estrutura domínios
transmissores e recetores.
Nos TCSs a ativação das HKs leva à autofosforilação de um resíduo de histidina
conservado, o grupo fosfato é transferido para um resíduo de aspartato, que está
localizado no domínio recetor de um regulador de resposta, ativando-o e tornando-o
competente para a ligação ao DNA e para a transcrição do gene alvo, ver figura 4A.
Nos TCSs híbridos o grupo fosfato é transferido de uma HK para um regulador de
resposta que está acoplado e, de seguida através de um intermediário conhecido
por histidina fosfotransferase, domínio Hpt, é transferido a um regulador de resposta
final, ver figura 4B (94). Estes sistemas híbridos ao invés de exibirem um mecanismo
de fosfotransferência simples, fazem o mecanismo designado por “phosphorelay”,
em que o grupo fosfato é transferido através de múltiplos passos até chegar ao
regulador de resposta. A complexidade global da estrutura das HKs híbridas permite
a integração de vários pontos de entrada e de controlo numa só via de sinalização
(1).
41
Figura 4. Representação esquemática da arquitetura modular de dois TCSs. A. Sistema de dois
componentes típico onde se observa uma histidina cinase e um regulador de resposta: H – resíduo de
histidina pertencente ao domínio de dimerização (DHp), P – grupo fosfato, D – resíduo de aspartato
do domínio recetor. B – Sistema de dois componentes híbrido que para além da HK típica apresenta
um domínio recetor C-terminal. Representação do sistema de “phosphorelay” adaptado de Cock,
2007 e Skeker,2004 (91, 94).
Tabela 2. Exemplos de alguns sistemas de regulação de dois componentes, função
correspondente e moléculas sinal adaptado de Krell et al, 2010 (89)
Sistema Função Molécula sinal
ArcB/ArcA Detecção de oxigénio e estados redox Quinonas que refletem o estado redox
NarX/Narl Respiração nitritato e nitrito Nitrato e nitrito
CitA/CitB Transporte e metabolismo anaeróbico de citrato Citrato
CheA/CheY Quimiotaxia Quimio-atrativos ex: serina e aspartato
FixL/FixJ Fixação de azoto O2, CO, NO
LovK/LovR Fixação às células Luz azul
42
Sistema Função Molécula sinal
TodS/TodT Degradação de derivados de benzeno Compostos monoaromáticos
NtrB/NtrC Utilização de azoto 2-cetoglutarato, glutamina
KdpD/KdpE Fornecimento de K+ K
+
VanS/VanR Antibióticos Vancomicina
EnvZ/OmpR Osmolaridade ?
KinB/Spo0F Esporulação ?ATP como co-sinal?
BvgS/BvgA Virulência Temperatura, iões sulfato, ácido nicotínico
LuxQ/LuxO Quorum sensing AI-2
DesR/DesK Modificação lipídica Temperatura
4.5 Histidinas Cinases
Em termos globais são vários os processos fisiológicos dos microrganismos que
envolvem a deteção de sinais através de HKs. Estes processos incluem a
diferenciação e regulação do ciclo celular, quimiotaxia, motilidade, homeostase de
fosfato e azoto, produção e resistência a antibióticos, quorum sensing e competência
genética, estabelecimento dos ciclos circadianos e amadurecimento dos frutos,
regulação da turgescência e do transporte de açúcar, virulência, patogenicidade
entre outros (1).
Segundo a análise das suas sequências as histidinas cinases podem ser divididas
em 11 subfamílias: HPK1-HPK11. A classificação destas proteínas em diferentes
subfamílias depende da existência e localização de grupos específicos de resíduos
conservados, que podem desempenhar funções a diferentes níveis: na ligação a
substratos, na catálise e na própria estrutura das proteínas. A divisão em subfamílias
é baseada nesses mesmos grupos de resíduos também designados por boxes: H-,
N-, G-, D- e F- (1).
43
Funcional e estruturalmente as HKs apresentam duas regiões, uma região no N-
terminal que funciona como sensor, capacitado para regular a taxa de
autofosforilação e, um núcleo cinase conservado no C-terminal que contém o
resíduo de histidina aceitador de fosfato.
Apesar da elevada conservação dos domínios funcionais destas proteínas, em
termos de arquitetura estas são muito variáveis, podem estar ligadas à membrana
celular, com uma ou mais hélices transmembranares (podendo apresentar até oito
hélices transmembranares) ou podem mesmo ser solúveis, estando dispersas no
citoplasma (1).
Todavia, a maioria das histidinas cinases é composta por um domínio sensor amino-
terminal, extra-citoplasmático variável, que está conectado a um domínio
citoplasmático, conservado, de dimerização e de fosfotransferência, denominado por
DHp (dimerization and histidine phosphotransfer) que, por sua vez, está ligado a um
domínio catalítico de ligação ao ATP, adenosina trifosfato, (CA) (95).
O domínio DHp contém um resíduo de histidina (H), local de fosforilação na boxe –
H. Este domínio forma um dímero estável e pode ser fosforilado na presença de ATP
pelo CA. Nas subfamílias HPK1-HPK4 apresenta também um resíduo de prolina
altamente conservado na quinta posição após o resíduo de histidina. O domínio CA
é o domínio onde se liga o ATP que fosforila o resíduo de histidina presente no
domínio DHp. Trata-se de um domínio monomérico e compreende as boxes (N-, G-,
D- e F-) (1, 96).
Na ligação entre a região sensor e o domínio catalítico ocorre um segmento
estrutural típico na subfamília HPK1 que é variável em comprimento e em sequência
designado por HAMP (adenilato ciclase, proteína metil-portadora de fosfatase, do
44
inglês histidine kinase, adenylyl cyclase, methyl-accepting chemotaxis proteins and
phosphatase) ou domínio PAS (97). Este segmento é constituído por 40-180
resíduos e, funcionalmente supõe-se que será responsável por transmitir sinais entre
o domínio de entrada externa e o módulo citoplasmático de saída (98).
As HKs têm uma arquitetura estrutural semelhante, todavia mediante o contexto
genético, TCSs onde se inserem e os sinais aos quais são sensíveis, estas
proteínas podem apresentar na sua constituição modular variações de domínios
como descrito na tabela 3 (99).
Funcionalmente as HKs ao receberem um sinal autofosforilam-se, num resíduo de
histidina, presente no DHp utilizando ATP como dador do grupo fosfato,
posteriormente o fosfato é transferido ao resíduo de aspartato do RR. O RR
consequentemente altera a atividade do domínio efetor, aumentando a sua atividade
catalítica, promovendo ou inibindo a sua ligação ao DNA e influenciando a
transcrição de genes alvo (1).
Nas HKs híbridas o processo de transferência do grupo fosfato é efetuado através
de múltiplos passos para o próprio regulador de resposta interno das da proteína,
sistema “phosphorelay”, em que ao invés do grupo fosfato ser transferido para um
RR, ocorre a passagem do fosfato para o domínio fosfotransferase, Hpt, e só então
posteriormente para o RR (98).
Sumariamente as HKs podem participar em três reações de fosfotransferência
distintas: autofosforilação (transferência do grupo fosfato (P) do ATP para um
resíduo de histidina), fosfotransferência, fosforilação de uma proteína reguladora
de resposta reconhecida (RR) (fosfotransferência de um P ligado a uma histidina
45
(P~His) para um resíduo de aspartato (Asp) do RR) e desfosforilação do P~RR
(fosfotransferência do P do resíduo Asp (P~Asp) para a água) (98).
Tabela 3. Nome, localização e descrição de alguns domínios encontrados em histidinas
cinases, adaptado de Mascher 2006 (99)
Domínio Nome Localização Descrição
HisKA/Dh
p
Domínio histidina cinase A /
Domínio de dimerização e
fosfotransferência Citoplasma
Domínio de dimerização e
fosforo aceitador de histidina
cinase, comporta a boxe H
com o resíduo de histidina
invariante. Local de
autofosforilação nas HK’s.
ATP-
biding
Domínio de ligação ao ATP Citoplasma
-
Hpt
Domínio de histidina
fosfotransferência
Citoplasma
Domínio presente na
extremidade N-terminal em
proteínas que se submetem a
autofosforilação, contem um
resíduo de histidina que medeia
reações de fosfotransferência
HAMP
Adenilato ciclase, proteína
metil-portadora de fosfatase Citoplasma
Domínio de ligação da zona
periplasmática para a zona
quinase citoplasmática
PAS
Per – period circadian protein
Arnt – aryl hydrocarbon
receptor nuclear translocator
protein
Sim – single-minded protein
Citoplasma
Domínio sensor redox
conservado e largamente
distribuído. Recebe os sinais
heme, flavina e adenina, é
sensível à luz e ao oxigénio
46
Domínio Nome Localização Descrição
MA Domínio envolvido na
quimiotaxia metil-aceitação Citoplasma
Domínio que sofre metilação
reversível em resposta a
atrativos ou repelentes durante
a quimiotaxia bacteriana.
4.6 Modelos para estudos de infeção
Uma variedade de modelos de infeção in vivo têm vindo a ser desenvolvidos com
vista a investigar quer mecanismos conservados quer mecanismos específicos de
patogenicidade ao hospedeiro. Modelos biológicos como nematodes: Galleria
mellonella e Caenorhabditis elegans, embriões de peixe-zebra, ratinhos, porcos e
linhas celulares eucarióticas são modelos de infeção utilizados no estudo de fatores
de virulência de bactérias do Bcc e na resposta imunitária do hospedeiro (11).
Neste trabalho serão utilizados dois modelos biológicos distintos: larvas de Galleria
mellonella e linhas celulares de epitélio pulmonar humano não CF 16HBE14o- e CF
CFBE41o-.
As linhas celulares de epitélio pulmonar humano, não CF 16HBE14o- e CF
CFBE41o-, são homozigóticas para delta F508O, mutação correspondente às vias
aéreas de doentes com CF. Ambas as linhas celulares foram
imortalizada e caracterizadas segundo Gruenert e colaboradores, 2002 (100, 101).
47
O ciclo de vida do modelo Galleria mellonella é mantido no laboratório 37ºC, estas
são alimentadas durante o decorrer do ciclo com pólen, sendo as análises/infeções
efetuadas na fase larvar do nematode (102).
48
5. Objetivos
49
A colonização pulmonar com Bcc em doentes CF é associada a um prognóstico
grave e, a um risco elevado de morte, sendo maioritariamente excluída logo de início
a consideração de transplante pulmonar (35).
Reconhecendo a extrema importância das estirpes de Bcc dentro da população de
doentes CF, o estudo destes microrganismos tornou-se emergente dentro da
comunidade científica.
Dentro do Bcc, B. cenocepacia é a espécie mais isolada de doentes com CF em
todo mundo (2, 103). Devido à sua importância dentro desta comunidade de doentes
e ao seu carácter virulento é urgente encontrar mecanismos eficazes para o
combate das infeções provocadas por esta espécie.
B. cenocepacia J2315, é uma estirpe epidémica pertencente à linhagem ET-12 que
apresenta um agrupamento de 24-Kb localizado a jusante de uma ilha genómica de
patogenicidade B. cenocepacia Island (cci) (104). Trata-se de um agrupamento de
genes único exclusivo à linhagem epidémica ET-12, constituído por três adesinas
triméricas autotransportadas (BCAM0219, BCAM0223 e BCAM0224), uma
lipoproteína (BCAM0220), duas histidinas cinases (BCAM0218 e BCAM0227) e três
reguladores de resposta (BCAM0221, BCAM0222 e BCAM0228).
Dados publicados confirmam a organização genética deste agrupamento e atribuem
a estas adesinas um papel fundamental na adesão às células epiteliais de pulmão
humano, na capacidade de resistência ao soro, na hemaglutinação das células
vermelhas do sangue e capacidade de virulência em Galleria mellonella (17, 105,
106).
Assim sendo, estando o agrupamento TAA a ser regulado através de um sistema de
dois componentes híbrido, torna-se pertinente verificar o efeito das histidinas cinases
50
BCAM0218 e BCAM0227 na regulação dos genes das adesinas triméricas
autotransportadas: BCAM0219, BCAM0223 e BCAM0224.
É então objetivo deste projeto uma análise computacional preliminar das histidinas
cinases híbridas, BCAM0218 e BCAM0227, seguida de uma avaliação de níveis de
expressão genética dos genes do agrupamento TAA, nos mutantes para cada
histidina cinase. Por último pretende-se verificar o efeito da ausência das histidinas
no fenótipo.
51
6. Materiais e Metodologias
52
6.1 Construção do mutante de inserção B. cenocepacia K56-2
BCAM0227::Tp
Um fragmento do gene BCAM0227 de 1353pb e contendo os locais de restrição
KpnI e Hind III, foi amplificado a partir de DNA genómico de B. cenocepacia K56-2,
por PCR (Platinium Taq DNA polimerase, Invitrogen) recorrendo aos
oligonucleótidos iniciadores 227Fwd1 e 227Rev1 ver tabela 4.
Posteriormente, através da utilização das enzimas KpnI e Hind III os fragmentos
resultantes da amplificação foram digeridos e, clonados no plasmídeo pDrive
(Qiagen) também previamente digerido, originando o plasmídeo pEP1.
De seguida um fragmento de 1010pb retirado do plasmídeo pUC-Tp contendo uma
cassete de resistência ao Trimetropim (Tp), foi inserido no único local de restrição da
PstI do fragmento de BCAM0227 clonado em pEP1, na mesma orientação do gene
BCAM0227, criando o plasmídeo, pEP2. Este plasmídeo foi introduzido em B.
cenocepacia K56-2 por eletroporação.
A seleção dos mutantes foi conseguida através da análise da resistência ao Tp e à
Kanamicina (Km) tendo sido utilizado placas réplicas de meio LB sólido
suplementado com Km 600 mg mL-1 e Tp 150 mg mL-1.
Os candidatos a mutantes foram confirmados recorrendo à técnica de PCR
utilizando os oligonucleótidos iniciadores 227Fwd2 e 227Rev2.
53
6.2 Condições de crescimento para B. cenocepacia K56-2 e mutantes
As condições de crescimento utilizadas para as culturas de B. cenocepacia K56-2 e
mutantes: B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp e B. cenocepacia K56-2
BCAM0227::Tp, intervenientes nos diferentes ensaios permitiram não só a
mimetização das condições fisiológicas do pulmão Humano como também segundo
Mil-Homens 2010, um aumento da expressão das adesinas triméricas
autotransportadas (17).
As culturas foram crescidas durante 17 horas em meio líquido Luria-Bertani (LB)
(Pronadisa) suplementado com NaCl 300mM e H2O2 10%, partindo de um inóculo
(DO640 0,2). A incubação realizou-se em placas de 24 poços de poliestireno, em
condições de microaerofilia (concentração de oxigénio <5%) e, temperatura de 37ºC
com agitação orbital de 60 rpm.
6.3 Linhas celulares e cultura de células
Neste trabalho foram utilizadas duas linhas celulares diferentes de epitélio pulmonar
humano: 16HBE14O- células de epitélio pulmonar humano normal com expressão
funcional do regulador de condutância transmembranar de fibrose quística e
CFBE41O- células de epitélio pulmonar humano com fibrose quística, homozigóticas
para a mutação delta F508 (100, 101).
Ambas as linhas celulares foram mantidas em frascos revestidos com fibronectina
em Meio essencial mínimo com sais Earle (MEM) do inglês Minimum Essential
Medium com sais Earle (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino
54
(FBS) (Lonza), L-Glutamine 0.292 g/L (Sigma) e Penicilina/Streptomicina 100 U/mL
(Gibco), a 37ºC em atmosfera húmida com 5% de CO2.
6.4 Extração de DNA e Reação em Cadeia da polimerase (PCR)
O DNA total foi extraído utilizando o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), de acordo
com o protocolo do fabricante.
As reações de amplificação por PCR das diferentes amostras de DNA foram
realizadas com o volume total de 50µl, tendo cada uma 20ng de DNA molde, 0,2 µM
de cada primer, 0,2 µM de cada nucleótido trifosfato, 1,5 mM de MgSO4 e 2,5
Unidades (U) de DNA polimerase Taq platinium (Invitrogen)
6.5 Extração de RNA total
Após 17h de incubação, nas condições acima descritas, das culturas de B.
cenocepacia K56-2 e dos mutantes em estudo, recolheram-se as células e fez-se o
tratamento com RNAprotect Bacteria (Qiagen).
Posteriormente procedeu-se à lise enzimática e digestão das células com lisozima e
proteinase K (Qiagen) respetivamente, tendo o RNA total sido isolado através da
utilização do sistema RNeasy Mini Kit (Qiagen) seguindo as indicações do
fabricante.
Para evitar contaminações com DNA genómico as amostras foram tratadas com
DNase do sistema RNAse-free DNA digestion set (Qiagen), no decurso do processo
de extração/purificação do RNA, tendo a enzima sido aplicada em coluna durante 1h
à temperatura ambiente.
55
Após a recolha das amostras de RNA fez-se um segundo tratamento com a mesma
DNase (Qiagen), 1h a 37ºC seguida de 5 min a 65ºC para inativação da enzima. A
concentração do RNA extraído foi determinada através de espectrofotometria de UV
(ND-1000 UV-Vis, NanoDrop Technologies, USA).
6.6 Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR)
O RNA total foi isolado segundo procedimento descrito em 6.5.
O cDNA foi sintetizado a partir de uma reação com 150ng de RNA total, 2,5 mM de
hexâmeros aleatórios, tampão de amplificação de PCR a 1x, 500 mM de cada
desoxinucleótido trifosfatado, 0,4 U/µl de inibidor de RNase e 1,25 U/µl de
transcriptase reversa (Applied Biosystems, Roche) perfazendo um volume total de
reação de 10 µl.
Para realizar os ensaios de PCR quantitativo em tempo real foram utilizados 25 ng
de cDNA de cada amostra e uma mistura de reagentes SYBR green master (Apllied
Biosystems) com os diferentes pares de oligonucleótidos (10µM) descritos na tabela
4. As reações foram desenvolvidas num sistema de PCR em tempo real Applied
Biosystems 7500 real time PCR system, tendo as curvas de fusão sido realizadas
em triplicado para cada gene e em cada ensaio, seguindo os seguintes parâmetros:
10 minutos a 95ºC seguidos de 60 ciclos de PCR a 95ºC durante 15 segundos e
60ºC durante 1 minuto. O gene endógeno utilizado foi o fator sigma – sigA
(BCAM0918).
A quantificação relativa da expressão dos diferentes genes foi calculada utilizando o
método ΔΔCT (107).
56
Tabela 4. Oligonucleótido utilizados para a amplificação por PCR. As abreviaturas A, C, G, e T
significam respetivamente Adenina, Citosina, Guanina e Timina
Gene Nome do Oligonucleótido
Sequência (5’ – 3´)
BCAM0218 218 Fwd GACGGGCAGAAGCATTTCATGACT
218 Rev ATGTTCAGGTCGGTCAACACCA
BCAM0227
227Fwd1 GGGGTACCTGCTGCTCGATCTGATCAACGACA
227 Rev1 TTTAAGCTTCATCACGAAAATGGGCTCCGGATA
227Fwd2 GGGGTACCTGCTGCTCGATCTGATCAACGACA
227Rev2 TTTAAGCTTCATCACGAAAATGGGCTCCGGATA
BCAM0219 RT0219Fwd TCTCGGGTACGCGATTGAC
RT0219Rev TGTTATACAGCTGAAACGACCYYACG
BCAM0220 RT0220Fwd CCGCAACGTGATGAACTACCT
RT0220Rev GCCTTCGGAGACGAACGA
BCAM0221 RT0221Fwd CCTATCTCCAGCGCAATCATC
RT0221Rev CGGGTTGTCGAGCATGGT
BCAM0223 RT0223Fwd GCAATCGGCCGGAACTC
RT0223Rev TCGTCTATGCCTCGGTCCAT
BCAM0224 RT0224Fwd TCACGAGGCGAATTGTCAAC
RT0224Rev GAGACGTTCACGACATCCGTATC
BCAM0228 RT0228Fwd ACACGCACGTCGCGTATCT
RT0228Rev AACCCGTACATCGTCATCATCTT
Endógeno RTSigAFwd GCGGATGCGTTTCGGTAT
RTSigARev GCGTGACGTCGAACTGCTT
6.7 Ensaios de Infeção da Galleria mellonella
As culturas de B. cenocepacia K56-2 e dos mutantes foram crescidas nas condições
acima referidas. Após as 17 horas de crescimentos as células foram recolhidas e
diluídas numa razão de 1:10, sucessivamente, em MgSO4 10mM suplementado com
1,2 mg/ml de ampicilina, até obter-se uma suspensão bacteriana de 1x104 células
por volume de injeção. Com o auxílio de uma micro-seringa foram injetadas
alíquotas de 3,5 µl da suspensão bacteriana no lado esquerdo do último segmento
(sentido anteroposterior) da G. mellonella. Para cada ensaio foram utilizados 10
larvas de G. mellonella, tendo o controlo sido efetuado com uma solução de MgSO4
10 mM suplementado com 1,2 mg/ml de ampicilina. Após a injeção as larvas foram
57
colocadas em placas de Petri de vidro e mantidas ao abrigo da luz a 37ºC. A
sobrevivência e o aspeto das larvas foram avaliados em intervalos de 24h durante
72h. Foram consideradas mortas as larvas que não apresentavam qualquer
movimento aquando o toque com uma ponta de pipeta.
6.8 Ensaios de Hemaglutinação
As culturas de B. cenocepacia K56-2 e dos mutantes foram crescidas nas condições
estabelecidas e já especificadas em 6.2.
As suspensões de bactérias foram obtidas por centrifugação durante 2 minutos a
8000 rpm, lavadas com tampão fosfato (PBS), pH 7,4 e ressuspendidas em PBS
obtendo-se uma DO640nm final de 5. Em placas de 96 poços foram colocados 30 µL
de suspensão de hemácias de sangue de carneiro a 3% (v/v), tendo estas sido
inoculadas com igual volume das suspensões bacterianas, de cada estirpe em
estudo, com 10, 5 e 0.5 de DO640nm. Com o auxílio de uma pipeta agitou-se
cuidadosamente as soluções contidas em cada poço. Após 1h de incubação à
temperatura ambiente, os poços foram observados e comparados com o controlo
negativo, poço com suspensão de hemácias e PBS.
6.9 Resistência ao soro
Os ensaios de resistência ao soro foram realizados de acordo com o descrito na
metodologia em Attia et al., 2005 (108).
As culturas das bactérias em estudos, B. cenocepacia K56-2 e mutantes, foram
recolhidas e diluídas em PBS até uma concentração final de 106 UFC/mL. Num tubo
de microcentrifuga colocou-se 10 µL da suspensão celular anteriormente preparada
58
(104 UFC/mL), 30 µL de soro humano normal (NHS do inglês Normal Human Serum)
(Sigma Aldrich) e 60 µL de PBS obtendo-se uma concentração final de soro de
30%.A mistura foi incubada em banho de água a 37ºC durante 1h, sendo de seguida
colocada em gelo. Posteriormente através de diluições seriadas e plaqueamento em
meio sólido, de 10 µL da solução determinou-se as UFC/ mL. A concentração inicial
da suspensão de bactérias foi também determinada através de diluições seriadas
seguidas de plaqueamento em meio sólido, tendo sido utilizada uma mistura igual à
acima descrita, sendo o NHS substituído por PBS. Como controlo da experiência foi
efetuado paralelamente todo o procedimento descrito utilizando NHS inativado pelo
calor (30 minutos a 56ºC). Os resultados foram expressos em percentagem de
sobrevivência das bactérias comparativamente à concentração inicial de bactéria
utilizada.
6.10 Ensaios de adesão e invasão a células epiteliais 16HBE14o¯ e CFBE
410o¯
As células foram inicialmente crescidas em placas de 24 poços (5x105 células/poço)
em meio MEM suplementado com FBS e L-Glutamina sem antibióticos, durante 24h
a 37ºC numa atmosfera húmida contendo aproximadamente 5% de CO2. Após as
24h foram lavadas com PBS e mantidas com meio MEM não suplementado. As
estirpes bacterianas foram crescidas segundo as condições acima referenciadas, em
microaerofilia durante 17h, tendo sido utilizada uma multiplicidade de infeção de 50
células bacterianas para cada célula epitelial (MOI de 50:1). Para os ensaios de
adesão as células, já infetadas, foram incubadas a 37ºC numa atmosfera com 5% de
CO2 durante 30 minutos de forma a proporcionar a adesão das bactérias às células.
59
Findo o tempo de adesão as células foram lavadas 3 vezes com PBS e lisadas com
tampão de lise (10 mM EDTA, 0.25% Triton X-100) durante 30 minutos à
temperatura ambiente. As células aderidas foram quantificadas através do
plaqueamento de diluições seriadas do lisado. Os resultados foram expressos por %
de adesão sendo estes corrigidos com base na quantidade inicial de bactérias
utilizadas para a infeção. Nos ensaios de invasão as células foram igualmente
infetadas com uma MOI de 50:1 no entanto, a fim de proporcionar a internalização
das bactérias nas células epiteliais, o tempo de incubação é maior, 2h a 37ºC com
5% de CO2. Após o tempo de incubação as células foram lavadas três vezes com
PBS e, adicionou-se uma solução de antibióticos amicacina e ceftazidina (2mg/mL
de cada) deixando-se incubar por mais 2h nas mesmas condições, a fim de eliminar
todas as bactérias que não tenham sido internalizadas. Findo este tempo 50 µL do
sobrenadante foram plaqueados para verificar a eficácia dos antibióticos na morte
bacteriana. Por último as células foram novamente lavadas três vezes com PBS e
lisadas com tampão de lise, 30 minutos à temperatura ambiente. A quantidade de
células com capacidade invasiva foi determinada através do plaqueamento de
diluições seriadas do lisado obtido. Os resultados foram expressos por % de
invasão, comparativamente à estirpe selvagem, sendo estes corrigidos com base na
quantidade inicial de bactérias utilizadas para a infeção.
60
7 .Resultados
61
7.1 Análise computacional de HKs híbridas em membros de Bcc
De acordo com o descrito no ponto 4.2 o Bcc é composto por 17 espécies de
Burkholderia nas quais existem 151 HKs híbridas.
Focando-nos apenas na espécie B. cenocepacia J2315 encontram-se 62 HKs
anotadas, dispersas pelos três cromossomas. No entanto, apenas sete destas são
HK híbridas. Analisando a localização, o tamanho e as sequências das sete HK
híbridas de B. cenocepacia J2315, ver tabela 5, verifica-se que apesar de serem
proteínas pertencentes à mesma família e com princípios catalíticos semelhantes,
genética e funcionalmente apresentam alguma variabilidade, ver figura 5.
A ausência de HKs híbridas no cromossoma 1 e a presença de sete nos
cromossomas dois e três poder-se-á relacionar com o facto do cromossoma 1 ser
composto maioritariamente por genes que codificam para funções básicas da
bactéria e, os cromossomas 2 e 3 apresentarem um elevado número de genes de
virulência (109).
Na árvore filogenética, figura 5, verifica-se a divisão das sete HKs em dois grupos,
sendo que o primeiro contém duas HKs, onde é notório apenas a presença dos
domínios DHp e CA e um domínio sensor na HK BCAS0234. Verifica-se a ausência
do domínio PAS em ambas as proteínas e ausência de RR no BCAS0234. A HK
BCAM0820 apesar de apresentar os domínios básicos de uma HK híbrida, Dhp, CA
e RR é de referir que é a única do grupo das sete que não está ancorada à
membrana celular (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html, Janeiro2012).
As HKs BACM0218 e BCAM0227 são do grupo das sete HKs as mais semelhantes
em termos de tamanho, localização e com arquitetura em termos de domínios igual.
62
Tabela 5. Localização e tamanho das sete HKs híbridas descritas em B. cenocepacia J2315
HK híbridas de B. cenocepacia de J2315 Localização Tamanho (aa)
BCAM0218 cromossoma 2 1010
BCAM0227 cromossoma 2 1011
BCAS0234 cromossoma 3 776
BCAM0820 cromossoma 2 364
BCAM2354 cromossoma 2 589
BCAS0632 cromossoma 3 1380
BCAM1505 cromossoma 2 661
63
Figura 5. Árvore filogenética elaborada com base nas sequências das Histidinas cinases híbridas de B. cenocepacia J2315 e arquitetura dos
respetivos domínios. Para o alinhamento múltiplo das sequências foi utilizado o programa ClustalW 2.0.12 e a árvore filogenética foi obtida utilizando o
método Neighbor Joining method (Fevereiro 2012), para obtenção da arquitetura dos domínios recorreu-se ao SWISS-MODEL (109).
BCAM1505
BCAS0632
0.601
1.131
BCAM2354
BCAM0218
BCAM0227
0.601
0.592
1.948
0.392
0.120
0.253
BCAM0820
BCAS0234
0.856
1.827
0.261
0.251
1010 aa
1011 aa
588 aa
1380 aa
776 aa
364 aa
588 aa
Domínio PAS
Domínio HisKa/DHp
Domínio de ligação ao ATP/CA
Domínio regulador de resposta
Domínio Hpt
Che-type
Domínio glutamato metiltransferase
Região 7TM recetor extracelular
64
7.1.1 Histidinas Cinases BCAM0218 e BCAM0227 – Análise computacional
As histidinas cinases podem ser agrupadas em 11 subfamílias, segundo a análise das suas sequências: HPK1-HPK11 (1).
Membros de diferentes subfamílias apresentam sequências específicas de resíduos conservados associados a diferentes
funcionalidades: receção de estímulo, catálise e na própria estrutura 3D das proteínas. A divisão em subfamílias é baseada nesses
mesmos grupos de resíduos também designados por boxes: H-, N-, G-, D- e F-. A boxe H- pertence ao domínio de dimerização
(DHp – dimerization and histidine phosphotransfer domain) e as restantes boxes ao domínio catalítico (CA – Catalytic and ATP-
binding domain) das Histidinas cinases (1, 96).
Na subfamília HPK1 estão incluídas todas as Histidinas cinases híbridas que apresentam as boxes altamente conservadas, tal
como é possível verificar com as duas HKs em estudo BCAM0218 e BCAM0227, ver figura 6.
BCAM0218 H-box
N-boxKFT D-box, F-box G-box
FhxxhSHEhRTPL xxh D xxx h xx hhxNL hx NAh KFT hxhxhxDxG xG hxx xxxxx h F xxF GGxGLGLxhh xxhh xx xx Gxhxh x xx xx xG xxFx hxh I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II FLATIS HEI RTPLNAM DPMRVRQIAVNLVSN AI KFT VTIRVSDSGIG MTADQLAHVFEPF GGTGIGLALSYKLAESMGGRI EADSVPGVGSTFVVTL
BCAM0227 H-box
N-boxKFT D-box, F-box G-box
Fhxxh S HEhRTPL xxh Dxxxhxxh hx NL hx NAh KFT hxhxhx DxGxG hxxxxxxx h F xxF GGxGLGL xhhxx hhxx xx Gxhxhx xx xx xG xxFx hxh I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I FLATMSH EI RTPLNAI DPTRIRQIAANLVGNAI KFT IAIGVSDTGIGMTDAQRAALFRPF GGTGLGLALTKQLTQMMHGTVDVKSEPGKGSTFVVTL
Figura 6. Alinhamento das sequências das Histidinas cinases BCAM0218 e BCAM0227 com as regiões conservadas características da subfamília HPK 1b (1), x
corresponde a resíduos variáveis e h a qualquer resíduo hidrofóbico. As regiões que flanqueiam as diferentes boxes: H, N-, G-, D- e F- foram removidas.
65
7.1.2 Análise da estrutura secundária e percentagem de identidade
A informação revelada pela previsão de estrutura secundária das proteínas permite
não só identificar, estruturalmente, a presença de regiões com funções catalíticas
especificas e a sua conformação bem como, localizar regiões estruturais que
definem a posição da proteína no contexto celular, isto é, se uma determinada zona
está intra ou extracitoplasmática.
Através da previsão da estrutura secundária das duas HKs, BCAM0218 e
BCAM0227, pôde-se verificar que ambas apresentam duas hélices
transmembranares antiparalelas, estruturas que possibilitam a coneção entre o
sensor periplasmático e a parte citosólica das HKs. Estas encontram-se assinaladas
a tracejado vermelho nas figuras 7 e 8. Entre as hélices transmembranares
encontra-se uma região variável denominada de região sensor. Nas duas HKs esta
região apresenta estrutura secundária equivalente aproximadamente nos primeiros
120 aminoácidos sendo depois notável uma variação de estrutura secundária até à
segunda hélice transmembranar.
Admitindo que a última hélice transmembranar na HK BCAM0218 termina no resíduo
373 e que na HK BCAM0227 termina no resíduo 384, constata-se que ambas as
HKs apresentam um segmento, entre a segunda hélice transmembranar e a região
catalítica, que obedece a uma estrutura secundária muito aparentada. Apesar de no
interior deste segmento ser detetado através da análise de domínios, o domínio
PAS; segundo Aravind e Pointing, 1999 é característico da subfamília HPK1, a
existência de um elemento estrutural denominado de HAMP do inglês histidine
Kinase, adenylyl cyclase, methyl-accepting chemotaxis proteins and phosphatase
que, vulgarmente, neste tipo de proteínas faz a coneção entre a região sensor
66
extracitoplasmática e dos domínios intracelulares de sinalização. Este segmento é
variável em tamanho (40-180 resíduos) e em sequência (99).
Deste modo o segmento HAMP das histidinas BCAM0218 e BCAM0227 apresenta
135 e 145 resíduos respetivamente.
Após o segmento HAMP encontra-se uma zona também conservada nas duas
proteínas que obedece a um esquema de estrutura secundária muito idêntico, o
domínio DHp. O domínio DHp apresenta a box-H, zona que possuí o resíduo de
histidina (H) (delimitado a vermelho na figura), que é o primeiro aceitador de fosfato
no processo catalítico da HK (p-His). Este domínio está em ambas as figuras
circunscrito com uma linha castanha e obedece a uma estrutura secundária
conservada, duas hélices. O domínio seguinte, CA, composto pelas restantes boxes
(N, D, F e G) apresenta-se também com uma estrutura secundária típica composta
por quatro folhas β e três hélices, estando em ambas as figuras delimitado a verde.
Apesar de existir uma conservação de estrutura secundária aparentada entre as
duas Histidinas cinases BCAM0218 e BCAM0227, em termos de sequência global
de aminoácidos é interessante verificar que apenas numa região, correspondente ao
DHp e ao CA, é detetada uma percentagem de identidade significativa, zona que
corresponde a aproximadamente 57% da sequência das proteínas (E-value 2-111),
nas restantes zonas codificantes não é detetada homologia, segundo o programa
Basic Local Alignment Search Tool NCBI Janeiro2012 (110).
Da análise comparativa dos diferentes segmentos, domínios, das duas sequências
das HKs BCAM0218 e BCAM0227 não foi detetada identidade significativa no
domínio PAS e o domínio Hpt, enquanto nos domínio HisKa, domínio de ligação ao
ATP e domínio regulador de resposta observou-se 75, 71 e 72% de identidade
67
respetivamente, o que vai de encontro ao já referido anteriormente, ver figura 9.
Refletindo a ampla variedade de sinais aos quais as HKs respondem, a região
periplasmática, região sensor, apresenta homologia reduzida em termos de
sequência, ver figura 9. No que respeita às HKs em estudo esta região está
representada sensivelmente entre o resíduo 42 e o 390.
Existe deste modo uma especificidade singular elevada em toda a região sensor e
transmembranar e uma conservação de identidade no que concerne às regiões
catalítica e de ligação ao ATP.
68
H-box
N-box-KFT
D-box – F- box G-box
Figura 7. Previsão de estrutura secundária da Histidina cinase BCAM0218 de B.cenocepacia J2315 em que: - α-hélice e outras hélices
54.26%, - folha β 13.47%, -coil 28.12%, - hélices transmembranares, - região sensor. POLYVIEW-2D:
http://polyview.cchmc.org e NPS@: Network Protein Sequence Analysis Janeiro2012.
α1 α2 α3 α4
α7
α5 α6
α8 α9 α10
α11 α12
α13 α15 α14
α17 α18
α20
α19
α16
α24 α27
α23
α29 α28
α30
α26 α25
α21 α22
69
Homologia entre as sequências BCAM0218 e BCAM0227
N-box-KFT
H-box
D-box – F- box
G-box
ox
Figura 8. Previsão de estrutura secundária da Histidina cinase BCAM0227 de B.cenocepacia J2315 em que: - α-hélice e outras hélices
52.13%, - folha β , - coil 30.96%, - hélices transmembranares, - região sensor. POLYVIEW-2D:
http://polyview.cchmc.org e NPS@: Network Protein Sequence Analysis, Janeiro 2012.
α1 α2 α3
α4 α5
α7 α9 α8
α11 α10
α12
α16 α17
α13 α14 α15
α18
α19
α23
α20
α25 α22 α24
α21
70
Figura 9. Representação esquemática das percentagens de identidade entre os vários
domínios que compõem as HKs BCAM0218 e BCAM0227, segundo alinhamento das duas
sequências no programa Basic local alignment seach tool. Domínio PAS, Domínio HisKa,
Domínio de ligação ao ATP, Domínio regulador de resposta, Domínio Hpt (110).
7.1.3 Previsão de estrutura
Para verificar a organização tridimensional das histidinas cinases em estudo foi
efetuada uma análise de previsão de estrutura utilizando o programa I-TASSER.
Através do programa foram obtidas cinco previsões de estrutura com diferentes c-
scores, tendo sido selecionada a estrutura que apresentava o c-score superior.
C-score é uma pontuação de confiança para estimar a qualidade dos modelos
previstos pelo I-TASSER. É calculado com base no significado de alinhamentos de
modelo de segmentação e com os parâmetros de convergência. O valor de c-score
pode variar entre -5 e 2, onde um c-score de valor mais elevado significa um modelo
com uma confiança também mais elevada. Na tabela 6 estão descritos os valores de
c-score, bem como as estruturas que o programa utilizou para fazer a previsão. É de
notar que as estruturas moldes utilizadas correspondem apenas a fragmentos de
HKs e, que os valores de RMSD são relativamente elevados, ambos superiores a 10
Å, significando este valor uma dissociação entre os modelos utilizados e as
estruturas em estudo.
BCAM0227
BCAM0218
75% 71% 72%
71
Com esta previsão era pretendido identificar as zonas extracitoplasmáticas e/ou
periplasmáticas, as regiões transmembranares, o domínio DHp e o domínio CA das
HKs BCAM0218 e BCAM0227 ver figura 11. Através da análise foi também possível
identificar regiões das proteínas às quais estão associadas funções especificas,
como por exemplo os domínios já anteriormente abordados PAS, HisKA, ATP-
Binding, Response – reg e Hpt.
72
73
Figura 10. Resultado obtido do alinhamento das sequências das Histidinas cinases BCAM0218 e BCAM0227 de B. cenocepacia J2315 através da utilização do programa
CLC Protein Workbench 5.5.2. As regiões com homologia mais elevada estão delimitadas com diferentes cores, respeitando aproximadamente as coordenadas dos
diferentes domínios, obtidos através da análise das sequências no SWISS-MODEL.
HisKA ATP-binding Response-reg Hpt HisKa HisKa HisKa HisKa
74
1)
2
)
A)
B)
1)
2)
α3 α10 PAS HisKA ATP-Binding Response – reg Hpt
α2 α9 PAS HisKA ATP-Binding Response – reg Hpt
Figura 11. A) Previsão da estrutura
tridimensional das HKs em estudo segundo o
programa I-TASSER. 1) BCAM0218, 2)
BCAM0227.Cada domínio identificado está
representado com uma cor, sendo a mesma
utilizada em ambas as representações. PAS –
domínio PAS (amarelo), HisKA – domínio de
Histidina cinase A fosfo-recetor (rosa), ATP-
Binding – domínio de ligação ao ATP (verde),
Response – reg – domínio regulador de
resposta (roxo), Hpt – domínio que contém um
resíduo de histidina que medeia a
fosfotransferência (azul), a vermelho estão
representadas as regiões transmembranares e a
azul-escuro as regiões extracitoplasmáticas. B)
Representação esquemática dos domínios das
HKs BCAM0218 1) e BCAM0227 2). As regiões
transmembranares (α3,α10,α2 e α9),
extracitoplasmáticas bem como os domínios
estão representados com as cores utilizadas em
A)(3, 4).
75
Tabela 6. Descrição dos valores e estruturas que permitiram prever as estruturas tridimensionais das
KHs BCAM0218 e BCAM0227. RMSD - root-mean-square deviation; PDB – Protein data bank (3, 4)
Previsão de estrutura Modelos
C-score RMSD Z-score PDB Descrição da estrutura
BCAM0218 -2.27 14.7 ± 3.6 Å
1.32
3dgeA
Regulador de resposta de
histidina cinase envolvido na
sinalização de sistema de
dois componentes de
Thermotoga maritima
2.52
3a0rA
Estrutura de Histidina cinase
ThKA (TM1359) com
complexo de regulador de
resposta TrrA (TM1360) de
Thermotoga maritima
3.79 2c2aA
Estrutura do sensor
citoplasmático de histidina
cinase de Thermotoga
maritima
BCAM0227 -2.44 15.2 ± 3.5 Å
1.31 3dgeA
Regulador de resposta de
histidina cinase envolvido na
sinalização de sistema de
dois componentes de
Thermotoga maritima
2.47 3a0rA
Estrutura do sensor
citoplasmático de histidina
cinase de Thermotoga
maritima
3.62 2c2aA
Estrutura do sensor
citoplasmático de histidina
cinase de Thermotoga
maritima
76
7.2 Análise genética e funcional das HKs BCAM0218 e BCAM0227 de B.
cenocepacia K56-2
O trabalho desenvolvido focou-se na análise genética e funcional de dois genes
BCAM0218 e BCAM0227, de Burkholderia cenocepacia K56-2 pertencentes a um
agrupamento único de adesinas triméricas autotransportadas designado por trimeric
autotransporter adhesin (79, 106).
Este agrupamento de 24-Kb está localizado a jusante de uma ilha genómica de
patogenicidade B. cenocepacia Island (cci) que alberga vários genes de virulência
(104). Trata-se de um agrupamento de genes único estrito à linhagem epidémica
ET-12, constituído por três adesinas triméricas autotransportadas (BCAM0219,
BCAM0223 e BCAM0224), uma lipoproteína (BCAM0220), duas histidinas cinases
(BCAM0218 e BCAM0227) e três reguladores de resposta (BCAM0221, BCAM0222
e BCAM0228), ver figura 12 A (79, 106).
Segundo Mil-Homens, 2012 os quatro genes de virulência efectores deste
agrupamento estão organizados em dois sub-clusters divergentes, agrupando
respetivamente, duas TAAs (BCAM0224 e BCAM0223) e uma TAA junto com a
lipoproteína (BCAM0219 e BCAM0220). Em Burkholderia cenocepacia J2315 o gene
BCAM0227 codifica uma histidina cinase, encontra-se no cromossoma 2 e é
composto por 3035 nucleótidos (284665 – 281630pb – locus BCAM0227). Este gene
está localizado na vizinhança, a jusante, de três adesinas triméricas
autotransportadas (BCAM0224, BCAM0223 e BCAM0219), ver figura 12 A.
O gene BCAM0218, também codifica para uma histidina cinase, é composto por
3032 nucleótidos (255662 – 258694pb – locus BCAM0218) e encontra-se
77
igualmente na vizinhança do agrupamento TAA mas, a montante dos genes das
adesinas, ver figura 12 A.
Em termos funcionais as HKs estão descritas como sendo responsáveis pela
receção de sinais ambientais e comunicação dos mesmos, via fosforilação, ao
regulador de resposta, o qual por sua vez irá proceder à tradução do sinal, com
consequente promoção ou repressão do(s) gene(s) alvo. De modo geral estas
proteínas estão envolvidas na repressão ou ativação de genes que direta ou
indiretamente estão associados a fenómenos de virulência. Vários estudos atribuem
à proteína HK0227 a capacidade de reconhecer uma molécula envolvida na
comunicação célula-célula entre espécies (111). Segundo McCarthy e seus
colaboradores o ácido gordo cis- 2-dodecanoico (BDSF) é produzido por B.
cenocepacia e está envolvido na sinalização de sistemas que regulam genes de
virulência (51). Uma mutação no gene BCAM0581, cuja função foi associada à
síntese de BDSF é conducente a múltiplos efeitos fenotípicos nomeadamente:
redução da capacidade de formação de biofilmes, alteração da aderência às
mucinas das células hospedeiras, redução na mobilidade e atenuação da virulência
nos modelos de infeção Galleria mellonella e peixe zebra (51).
Assim sendo, atendendo à organização do agrupamento TAA e aos resultados
publicados por Mil-Homens e Fialho 2012 propomo-nos, através de análises de
respostas fenotípicas, como virulência em Galleria mellonella, hemaglutinação,
adesão a células de epitélio pulmonar e resistência ao soro humano, comprovar que
a HK0218 participa na regulação da adesina BCAM0219 e a HK0227 participa na
regulação das adesinas BCAM0223 e BCAM0224.
78
Para verificar qual a relação, receção de sinal/efetivação de resposta, existente entre
as histidinas cinases e a expressão genética e fenotípica das adesinas triméricas
autotransportadas, foram construídos dois mutantes de inserção nos genes
sensores do agrupamento TAA, BCAM0218 e BCAM0227. Os mutantes obtidos: B.
cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp e B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp, ver
figura 12.B), foram usados em vários ensaios, comparativos, de respostas
fenotípicas.
Figura 12. Organização genética do agrupamento TAA em B. cenocepacia K56-2. A)
Organização genómica e mapa operónico do agrupamento de genes TAA. As regiões co-transcritas
estão indicadas com setas a tracejado. Hyp – do inglês hypothetical protein, HK- histidina cinase,
TAA- adesina trimérica autotransportada, OMP – proteína externa da membrana, RR – regulador de
resposta. B) Representação esquemática da estratégia utilizada para obtenção dos mutantes de
inserção das duas histidinas cinases em estudo: B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp e B.
cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp Adaptado de Mil-Homens e Fialho, 2012 (106).
79
7.2.1 Construção do mutante BCAM0227
Devido à dificuldade de manuseamento em laboratório e à resistência a antibióticos
utilizados na construção dos mutantes de B. cenocepacia J2315, todo o trabalho
experimental foi desenvolvido com B. cenocepacia K56-2 em vez de B. cenocepacia
J2315.
A estratégia experimental envolveu a utilização de dois mutantes B. cenocepacia
K56-2 BCAM0218::Tp e B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp, no entanto apenas o
mutante B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp foi construído no âmbito deste
trabalho. Tal como é representado na figura 12.B), para construção dos mutantes foi
utilizada a estratégia de inserção de uma cassete de antibiótico, Trimetropim, no
gene. A utilização desta cassete prende-se com o facto de não induzir polaridade
genética. No caso particular do gene BCAM0227 a não polaridade é reforçada pela
posição que o gene ocupa no operão sendo este gene o último.
Para obtenção de um mutante, em alternativa à metodologia utilizada, poder-se-ia
ter utilizado a estratégia de eliminação todavia, em Burkholderia torna-se muito difícil
a sua construção.
Através dos procedimentos já descritos em 6.1, foram obtidos 3 mutantes para o
gene BCAM0227: D, F e G, ver figura 13, escolheu-se o mutante D, a partir de agora
designado por B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp.
80
Figura 13. Produtos de PCR resultantes da amplificação com os iniciadores de oligonucleotidos
227Fwd2 e 227Rev2, para os diferentes candidatos a mutantes B. cenocepacia K56-2
BCAM0227::Tp.
Comparativamente à estirpe selvagem verificou-se nos dois mutantes diminuição
ligeira na capacidade de crescimento em cultura, principalmente nas condições
específicas utilizadas nos vários ensaios. Quanto ao fenótipo das colónias não
existia diferenças entre os mutantes e a estirpe selvagem.
7.3 Análise da expressão genética dos genes do agrupamento TAA nos
mutantes deficientes para os genes BCAM0218 e BCAM0227 e na estirpe
selvagem
A análise da expressão dos genes foi efetuada através da reação da polimerase em
cadeia em tempo real, do RNA extraído das culturas dos dois mutantes e da estirpe
selvagem. As condições de crescimento das culturas bem como a técnica de
81
extração de RNA foram realizadas de acordo com o descrito nos pontos 6.2 e 6.5 do
capítulo Material e Métodos.
Conforme ilustrado na figura 14 A), a eliminação do gene BCAM0218, conduz ao
aumento dos níveis de expressão genética nos genes BCAM0219, BCAM0220,
BCAM0221, BCAM0224 e BCAM0228. Esta variação apresenta-se mais significativa
para o gene BCAM0219, em que há um aumento de expressão comparativamente à
estirpe selvagem de 24 vezes. Em contraste com estes resultados verifica-se que a
inativação do gene BCAM0227 conduz a uma diminuição dos níveis de expressão
genética nos genes BCAM0219, BCAM0220, BCAM0221, BCAM0224, ver figura 14
B).
Estes resultados evidenciam uma inter-relação entre os sensores, HK BCAM0218 e
HK BCAM0227 e os genes de virulência BCAM0219 e BCAM0224, adesinas
triméricas autotransportadas. No entanto, verifica-se que através dos mutantes não
se consegue silenciar os genes das adesinas consegue-se apenas alterar os seus
níveis de expressão num ou noutro sentido.
A)
82
B)
Figura 14. Representação gráfica dos níveis relativos da expressão genética dos diferentes genes do
agrupamento TAA A) Variação da expressão genética do mutante B. cenocepacia K56-2
BCAM0218::Tp em relação à estirpe selvagem. B) Variação da expressão genética do mutante B.
cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp em relação à estirpe selvagem.
Com estes resultados a proposta de existência de dois sub-clusters publicada por
Mil-Homens e Fialho 2012, é sublinhada por eventuais processos de regulação
também eles circunscritos aos respetivos sub-clusters e coordenados por cada uma
das HK.
Deste modo pretendemos demonstrar a afetação da expressão do gene BCAM0227
quando é adicionado à cultura BDSF e por sua vez verificar se quando a expressão
do gene recetor do sinal é afetada, a expressão do gene que o recetor controla é
também afetada, neste caso a adesina BCAM0224.
83
Da avaliação da expressão genética do gene BCAM0227 e BCAM0224, das culturas
crescidas com e sem BDSF, verificou-se que às 8 horas de crescimento existiu um
aumento acentuado na expressão de ambos os genes, respetivamente 5 e 7 vezes
superior à estirpe crescida sem BDSF, ver figura 15. Constata-se deste modo uma
interligação entre a histidina cinase 227, proteína receptora do sinal BDSF e a
adesina autotransportada trimérica 224, gene efector de resposta ao estímulo
ambiental.
Figura 15. Representação gráfica dos níveis relativos de expressão genética dos genes BCAM0224 e
BCAM0227 em B.cenocepacia K56-2 crescida com e sem BDSF ao longo de 12 horas.
O crescimento de Burkholderia K56-2 com e sem adição de BDSF permitiu ainda
constatar que a presença deste ácido gordo proporcionava um aumento da
população microbiana. Conforme a representação gráfica, figura 16 foi então
possível verificar um incremento da população microbiana após a fase de
crescimento logarítmica, 12h de crescimento, o que pode ser interpretado como uma
resposta modular ambiental de virulência, uma vez que havendo maior concentração
de BDSF existe comunicação entre células no sentido de aumentar a sua população.
0
2
4
6
8
10
12
2 3 5 8 12
Nív
eis
rela
tivo
s d
e ex
pre
ssão
Tempo (h)
B. cenocepacia K56-2
B. cenocepacia K56-2 geneBCAM0224 BDSF 50µM
B. cenocepacia K56-2 geneBCAM0227 BDSF 50µM
84
Este aumento de população poderá conduzir a um aumento da capacidade da
bactéria formar biofilme, aumentando a capacidade de adesão aos tecidos do
organismo hospedeiro e em paralelo contribuindo para o incremento da resistência a
antimicrobianos.
Figura 16. Representação gráfica do crescimento de B. cenocepacia K56-2 e B. cenocepacia K56-2
crescida com BDSF 50 µM.
Após avaliação dos níveis relativos da expressão genética dos diferentes genes do
agrupamento TAA, nos mutantes em estudo, pretendeu-se verificar se as tendências
de regulação das diferentes adesinas autotransportadas, se verificavam
efetivamente, em termos fenotípicos. Para tal recorreu-se a um conjunto de ensaios
que permitiram estudar a virulência associada a cada uma das adesinas
supostamente reguladas pelas histidinas cinases em estudo.
ácido cis-2-dodecanoico
85
Os ensaios fenotípicos estudados são de acordo com os ensaios utilizados por Mil-
Homens e Fialho 2011 e 2012 para comprovar a virulência associada às adesinas
do agrupamento em estudo BCAM0224 e BCAM0223.
7.4 Avaliação fenotípica dos mutantes de B. cenocepacia K56-2 deficientes
para os genes BCAM0218 e BCAM0227, os quais codificam histidinas cinases
(HK)
7.4.1 Efeito na virulência no modelo animal Galleria mellonella
A Galleria mellonella é um modelo biológico de infeção utilizado em estudos de
fatores de virulência de membros do Bcc.
Conforme ilustrado na figura 17A os resultados obtidos evidenciam uma atenuação
significativa na virulência do mutante B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp
comparativamente com a estirpe selvagem. Após 72h de infeção aproximadamente
65% das larvas estavam vivas, demonstrando maior capacidade de sobrevivência
comparativamente à estirpe selvagem.
O mutante B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp apresentou um comportamento
similar à estirpe selvagem, o que leva a concluir que neste modelo biológico, a
mutação na histidina cinase BCAM0227 não interfere diretamente na virulência da
estirpe B. cenocepacia K56-2 (ver figura 17 B)).
Em ambos os ensaios às 72h todas as larvas infetadas (n=10) com a estirpe
selvagem estavam mortas.
86
A)
B)
Figura 17. Virulência no modelo Galleria mellonella.
Curva de sobrevivência de Kaplan Meier para a infecção de G. mellonella com estirpe selvagem B.
cenocepacia K56-2, mutantes e controlo. A) B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp e B) B.
cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp.
87
Apesar do mutante BCAM0218, levar ao aumento da expressão da adesina
BCAM0219 houve diminuição da virulência em G. mellonella. Contudo, resultados
com mutantes para a adesina BCAM0219 demonstraram que a não funcionalidade
da adesina permitia um aumento da sobrevivência da G. mellonella. Os resultados
nos ensaios com o mutante da HK0218 demonstram o contrário. Deste resultado
verifica-se que a adesina BCAM0219, de forma isolada, não contribui para a
virulência. Contudo é de salientar que em modelos biológicos ocorrem fenómenos
complexos que envolvem múltiplos fatores afetando involuntariamente o resultado
observado e, que a mutação da HK0218 poderá estar a afetar a expressão de outros
genes que poderão levar à diminuição da expressão de outros genes de virulência.
Quanto ao mutante BCAM0227 os resultados comprovam os já submetidos, por Mil-
Homens 2012, para a adesina BCAM0224, em que através do mutante da adesina,
é comprovado que esta é necessária para a virulência em Galleria mellonella.
Verificando-se através dos resultados já acima descritos que o mutante da HK227
leva à diminuição dos níveis de expressão da adesina 224, era esperado que o
mesmo mutante BCAM0227 em G. mellonella aumentasse a sobrevivência das
larvas o que foi comprovado.
7.4.2 Efeito na capacidade de hemaglutinação
De acordo com Kapperud et al, 1987 e Pearson, 2002 e como comprovado por Mil-
Homens a hemaglutinação é uma das múltiplas funções atribuídas às TAAs,
implicada na virulência de Burkholderia (112, 113). Segundo Mil-Homens, 2012 a
adesina BCAM0223 apresenta capacidade de hemaglutinar sangue de carneiro,
88
tendo sido já comprovado a perda da capacidade de hemaglutinação através do
mutante para o gene BCAM0223 (2).
Através dos ensaios efetuados com os mutantes B. cenocepacia K56-2
BCAM0227::Tp e B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp e de acordo com os
resultados expostos na figura 18, verifica-se que há um aumento da capacidade de
hemaglutinação do mutante BCAM0218 e uma diminuição da capacidade de
hemaglutinação no mutante BCAM0227 comparativamente à estirpe selvagem.
De acordo com os resultados obtidos da análise da expressão genética no mutante
B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp dos vários genes do agrupamento TAA, que
demonstraram um aumento da expressão do gene que codifica para a adesina
BCAM0219 e, tendo em conta o elevado número de motivos de hemaglutinina que a
adesina BCAM0219 apresenta, verifica-se concordância entre os resultados obtidos
nestes ensaios e a proposta apresentada neste trabalho que defende a divisão do
agrupamento em dois sub-clusters, tendo o sub-cluster BCAM0219/BCAM0220 a
intervenção da HK BCAM0218 na sua regulação.
Figura 18. Resultados obtidos dos ensaios de hemaglutinação de B. cenocepacia K-56-2 e mutantes
B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp e B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp. Foi utilizado uma
suspensão a 3% de células vermelhas de sangue de carneiro e três concentrações diferentes de
bactérias (DO:10; 5 e 2.5). Como controlo negativo foi utilizado PBS.
89
7.4.3 Efeito na capacidade de adesão a culturas de células epiteliais
brônquicas
De acordo com os resultados publicados por Mil-Homens e Fialho, 2012, existe
envolvimento das adesinas triméricas autotransportadas BCAM0223 e BCAM0224
nos processos de adesão e invasão de células epiteliais brônquicas (106).
Mais uma vez com o objetivo de avaliar a capacidade das HKs na regulação dos
dois sub-clusters (BCAM0223/BCAM0224) e (BCAM0219/BCAM0220) recorreu-se a
ensaios de adesão a células epiteliais.
Para a avaliação, in vitro, da capacidade de adesão dos mutantes BCAM0218 e
BCAM0227 de B. cenocepacia K 56-2, foram utilizadas duas linhas celulares de
epitélio pulmonar humano, 16HBE14o- e CFBE41o-, fenótipo sem CF e com CF
respetivamente. Os ensaios foram efetuados com base na diferença das contagens
de UFCs antes e após a infeção da monocamada de células.
Verifica-se um aumento da capacidade de adesão em ambos os mutantes
comparativamente à estirpe selvagem, sendo este aumento mais significativo no
mutante B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp, ver figura 19. Ao contrário do que
seria espectável, comparando as duas linhas celulares, verifica-se um aumento da
capacidade de adesão à linha celular não CF, 16HBE14o-. Segundo os resultados
publicados por Mil-Homens e Fialho, 2012 quando os genes BCAM0223 e
BCAM0224 estão inativos ocorre uma diminuição da capacidade de adesão
comparativamente à estirpe selvagem. No que respeita à HK BCAM0227, sensor do
sub-cluster onde se inserem as adesinas BCAM0223 e BCAM0224, é notório um
aumento na capacidade de adesão de cerca de 20% na linha celular não CF e de
90
35% na linha celular CF. Este resultado não é coerente com os já publicados pelos
autores acima referenciados no entanto, presume-se que o facto de se provocar
uma mutação num sensor, neste caso na HK227, pode-se também estar a induzir
alteração da expressão de genes codificantes de outras proteínas de superfície, ou
outros elementos estruturais bacterianos que poderão desempenhar função nos
processos de adesão a células eucarióticas (56, 114).
(A) (B)
Figura 19. Representação gráfica da % média de adesão dos mutantes em estudo e da estirpe
selvagem B. cenocepacia K56-2. A) Adesão às células de epitélio pulmonar –16 HBE14o- B) Adesão
às células de epitélio pulmonar mutadas -CF BE 410-ΔF.
7.4.4 Efeito na resistência ao soro
Sabendo-se da capacidade multifuncional das adesinas e do seu envolvimento na
resistência ao soro já comprovada por resultados obtidos por Mil-Homens e Fialho,
2012, para a adesina BCAM0224, pretendeu-se verificar mais uma vez a implicação
da HK0227 na regulação desta adesina (79).
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
16HBE14o- cells
% A
de
são
K56-2
Δ227
Δ218
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
CF BE 410 - ΔF
K56-2
Δ227
Δ218
91
Os resultados revelam uma sobrevivência do mutante para o gene BCAM0224 de
15% comparativamente aos 97% da estirpe selvagem o que revela um envolvimento
muito acentuado da adesina BCAM0224 na resistência ao soro (2). Apesar dos
resultados obtidos nos ensaios com o mutante B. cenocepacia K56-2
BCAM0227::Tp não serem tão evidentes, a tendência é mantida, utilizando Soro
Humano Normal (NHS) a 30% e após 1h de incubação, o mutante apresenta
capacidade de resistência ao soro inferior à estirpe selvagem com uma diferença de
aproximadamente 2%, ver figura 20.
Figura 20. Representação gráfica dos resultados obtidos dos ensaios bactericidas com 30% de Soro
Normal Humano (NHS). O mutante B. cenocepacia K56-2 BCAM0227::Tp demonstrou uma
diminuição de 2% de resistência ao soro comparativamente à estirpe selvagem. Como controlo foi
utilizado soro inativado pelo calor.
92
8. Discussão Final
93
A base da notável diversidade ecológica apresentada pelo Bcc parece residir nos
seus invulgares genomas, raros no tamanho e na organização, permitindo a estas
bactérias crescer numa grande variedade de substratos, utilizar diferentes fontes de
carbono e sobreviver nas mais diversas condições de stress. Embora as estirpes de
Bcc possam desenvolver um papel importante em termos ambientais como na
agricultura e na biotecnologia, a sua utilização nestas áreas representa risco clínico
para os membros suscetíveis da comunidade (115).
Várias estirpes de B. cenocepacia estão associadas a fugas epidémicas entre os
pacientes com CF, tais como as estirpes da linhagem ET12, que são consideradas
altamente transmissíveis e virulentas (103). Por todos estes motivos B. cenocepacia
tem sido o foco principal de muitos grupos de investigadores que procuram
compreender a patogénese destas bactérias.
As infeções provocadas por elementos do Bcc em doentes com CF podem variar
desde a eliminação espontânea das bactérias, à colonização assintomática e
declínio gradual do estado do doente até síndrome da cepacia com consequente
agravamento rápido da função pulmonar levando até à morte (116). Estima-se que a
colonização pulmonar por bactérias do Bcc em doentes com CF reduza
significativamente a sua sobrevivência e que cerca de 20 a 30% dos doentes atinjam
o estádio de síndrome de cepacia (16). Acresce a toda esta problemática o carácter
patogénico das estirpes Bcc a sua multiresistência intrínseca a antibióticos e a sua
facilidade de transmissibilidade e persistência entre doentes com CF.
Apesar de já se ter identificado vários determinantes de virulência na linhagem B.
cenocepacia ET12 e, de estudos já publicados evidenciarem a extrema importância
94
das adesinas triméricas autotransportadas na aderência às células do hospedeiro
(17, 106), é necessário identificar quais os genes que regulam a expressão dessas
mesmas adesinas. No nosso caso específico, através de dados já publicados sobre
a organização do agrupamento TAA, do conhecimento funcional das histidinas
cinases que o compõem, HKBCAM0218 e HKBCAM0227 e, do estudo
bioinformático efetuado, foi possível associar funções de regulação a estas proteínas
(106). Considerando a posição das HKs no agrupamento TAA e os resultados
obtidos através de análise computacional, foi possível verificar que apesar das duas
HK apresentarem conservação de estrutura secundária não apresentam identidade
significativa na globalidade das zonas codificantes, tendo sido apenas possível
detetar similaridade na região designada catalítica, domínio DHp e domínio CA.
Desde então, e conscientes da multiplicidade de sinais e de genes aos quais cada
uma das HK pode responder e regular respetivamente (99), verificou-se também que
a zona designada de sensor não apresentava qualquer similaridade, o que leva a
concluir que HKs diferentes rececionam sinais diferentes. Em termos de organização
funcional em ambas as histidinas foi possível identificar os mesmos domínios: PAS,
HisKA, CA, RR e Hpt. Após esta análise preliminar, pretendeu-se verificar
efetivamente qual o papel das HK 218 e 227 na regulação genética das adesinas
triméricas autotransportadas. Estando já publicado que os três genes codificantes
das TAAs do agrupamento estão organizados como dois sub-clusters, que
consistem em dois operões bicistrónico orientados divergentemente (106) e
acreditando-se que a regulação destes genes obedece a esta divisão do
agrupamento TAA, partiu-se do pressuposto que a HK218 tinha por função regular a
adesina trimérica autotransportada a jusante BCAM0219 bem como a porina
95
BCAM0220 e a HK227 regular as adesinas triméricas autotransportadas a montante
BCAM0223 e BCAM0224. Dos resultados da análise dos níveis relativos de
expressão dos mutantes da HKs verificou-se que existe, em termos de regulação,
uma tendência da expressão genética dos genes do agrupamento TAA dividida
também em dois sub-clusters. É de salientar, no entanto, que nenhum dos mutantes
permitiu o silenciamento dos genes das adesinas do agrupamento, o que torna
avaliação dos resultados mais complexa. Para além da análise dos níveis de
expressão dos genes do agrupamento, verificou-se tendo por base resultados já
publicados por McCarthy que a HK227 era sensível a uma molécula de QS, BDSF e,
que para além de aumentar a expressão da HK227 aumentava também a expressão
da adesina 224 (51). Com este resultado reforçou-se a nossa convicção sobre o
processo de regulação do sub-cluster BCAM0223/BCAM0224, todavia trabalhos
posteriores deverão ser executados no sentido de identificar qual ou quais os
demais sinais envolvidos na resposta das HKs.
Após esta primeira análise computacional e genética pretendia-se verificar se as
alterações dos níveis de expressão dos genes efectores, genes das adesinas, se
refletiam efetivamente em termos de fenótipo nos dois mutantes. Para tal recorreu-
se a um conjunto de ensaios, utilizados recorrentemente por Mil-Homens nas suas
pesquisas para as TAAs.
Começou-se por verificar no modelo biológico Galleria mellonella a virulência dos
mutantes comparativamente à estirpe selvagem onde foi verificado no mutante
BCAM0218 perda de virulência e no mutante BCAM227 níveis de virulência
semelhantes aos da estirpe selvagem. Como num modelo biológico o resultado
obtido reflete um conjunto de reações que ocorrem dentro do modelo e não apenas
96
o resultado do fator que se está a fazer variar, neste caso a mutação de uma das
histidinas, por vezes torna-se difícil interpretar isoladamente os resultados.
Sendo a hemaglutinação uma das funções atribuídas às TAAs (112, 113), foi
verificado o efeito das mutações das duas HKs individualmente na capacidade de
hemaglutinação. Nos ensaios de hemaglutinação verificou-se o fenótipo esperado
para o mutante B. cenocepacia K56-2 BCAM0218::Tp, isto é, aumento da
hemaglutinação. Quando o gene BCAM0218 é mutado aumentam os níveis de
expressão da adesina BCAM0219 que por sua vez devido ao elevado números de
motivos de hemaglutinina apresentados (2) leva a um aumento da capacidade de
hemaglutinação das células vermelhas do sangue. O mutante da HK227 comprovou
o resultado já obtido por Mil-Homens, para a adesina BCAM0224, em que a
ausência do gene BCAM0224 leva a uma diminuição na capacidade de
hemaglutinação.
Membros do Bcc são capazes de suportar os efeitos bactericidas dos componentes
do sistema imunitário inato, como péptidos antimicrobianos, lisozimas, lactoferrina e
a fosfolipase A2, entre outros (117).
Outra atividade de virulência desempenhada pelas adesinas é a fuga à capacidade
bactericida do sistema do complemento, no entanto os resultados obtidos para a
resistência ao soro evidenciam uma fraca participação da HK0227 neste fator de
virulência, uma vez que entre o resultado do mutante BCAM0227 e a estirpe
selvagem existe apenas uma diferença de resistência de 2%.
97
A ligação das bactérias às células epiteliais do pulmão é o primeiro passo para a
colonização deste órgão por estirpes de Bcc. Na adesão às células para além das já
caraterizadas adesinas triméricas estão também envolvidos os píli e a adesina
22KDa (32). Com base nos resultados é verificado um importante envolvimento da
HK0218 no processo de adesão. Para o mutante desta histidina cinase a capacidade
de adesão comparativamente à estirpe selvagem é muito superior, o que indica que
a expressão aumentada da adesina BCAM0219 leva a um aumento na capacidade
de adesão às células epiteliais. Já para HK0227 o mesmo foi constatado, mas a
níveis mais baixos.
Após análise detalhada dos vários ensaios e considerando a multiplicidade de sinais
aos quais as HKs respondem, verifica-se então que apesar de em termos genómicos
as HKs BCAM0218 e BCAM0227 parecerem estar a regular as adesinas triméricas
autotransportadas BCAM0219, BCAM0223 e BCAM0224, através de dois operões
bicistrónicos orientados divergentemente, funcionalmente estas duas proteínas
podem em simultâneo controlar outros genes, não necessariamente circunscritos
aos genes das TAAs, mas também eles envolvidos na virulência de Burkholderia
cenocepacia.
A base do tratamento da CF inclui o apoio nutricional e a limpeza dos mucos
mecanicamente, suplementado com agressivos regimes de antibióticos destinados a
suprimir ou erradicar colonizações bacterianas, agentes anti-inflamatórios, e novas
abordagens que melhoram a limpeza mucociliar (www.cff.org/treatments/pipeline/).
Do ponto de vista clínico, o Bcc apresenta as espécies bacterianas mais resistentes
encontradas na infeção humana, tornando o controlo da infeção muito difícil.
98
Bactérias do Bcc são intrinsecamente resistentes a agentes antimicrobianos, tais
como aminoglicosidios, cefalosporinas de primeira e segunda geração, penicilinas
anti-Pseudomonas e polimixinas (78). Para resolver a problemática das
multirresistências utiliza-se combinações de duas ou mais drogas para atingir
atividade bactericida e, aproveitar efeitos sinérgicos das drogas (78). Uma
abordagem mais recente e promissora é a quimioterapia fotodinâmica
antimicrobiana quimioterapia que apresenta níveis elevados de morte de bactérias
de Bcc (118).
Os sistemas de regulação de dois componentes são essenciais para a
sobrevivência, crescimento e virulência das bactérias. Sendo estes típicos ou
híbridos, as histidinas cinases neles envolvidas autofosforilam-se em resposta a
alterações ambientais e desencadeiam uma cascata de
fosforilações/desfosforilações no sentido de ativar o regulador de resposta que por
sua vez ativa ou reprime a transcrição do gene alvo (90, 119). Apesar das histidinas
cinases não serem consideradas fatores de virulência, estas estão maioritariamente
envolvidas em sistemas de regulação de fatores de virulência (tabela 2). Assim
sendo, uma opção de tratamento de infeções por bactérias do Bcc poderá passar
pela utilização de compostos inibidores da atividade de cinase das HK (119). Vários
estudos já foram desenvolvidos neste sentido, no entanto o facto de se interferir com
proteínas que também são essenciais aos Humanos, confere-lhes alguma
incapacidade para a sua utilização terapêutica (119). Apesar de todos os avanços no
que respeita aos antimicrobianos, é importante salientar que um organismo com
tanta plasticidade e versatilidade genómica dificilmente poderá ser utilizado no seu
99
todo como um recurso uma vez que o seu sucesso evolutivo como patogénico
oportunista representará sempre uma ameaça.
100
9. Agradecimentos
101
Para chegar a este momento muitas foram as Pessoas que me apoiaram e
incentivaram a continuar nos momentos de dúvidas e anseios.
Ao meu orientador Professor Arsénio Fialho pela oportunidade que me concedeu ao
permitir a minha integração na sua equipa, assim como toda a disponibilidade
demonstrada para me ajudar e orientar;
Ao Professor Melo Cristino pelo acompanhamento do processo de co-orientação
deste projeto;
À Dalila Mil-Homens pela sua permanente prontidão para me auxiliar e pelos
inúmeros conhecimentos que me foi transmitindo ao logo do projeto, pois sem a sua
amizade, ajuda e força não teria sido possível a realização deste trabalho;
A todos os colegas do BSRG que sempre se prontificaram para me auxiliar e em
especial ao Nuno Bernardes, à Bruna Mota, à Teresa Estevens, à Fátima Gil e à
Sofia Ferreira;
À minha família pelo apoio que me deu, em especial ao meu Filho que sempre me
acompanhou nas idas ao laboratório fora de horas e aos fins de semana e à minha
irmã pela força que me transmitiu;
O meu MUITO OBRIGADO.
102
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