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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA in vitro DO VENENO DAS SERPENTES AMAZÔNICAS Bothrops atrox (LINNAEUS, 1758) E Crotalus durissus ruruima (HOGE, 1965) MARCELO DOS SANTOS NEVES MANAUS 2008

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA in vitro DO VENENO DAS SERPENTES AMAZÔNICAS Bothrops atrox (LINNAEUS, 1758) E Crotalus

durissus ruruima (HOGE, 1965)

MARCELO DOS SANTOS NEVES

MANAUS 2008

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MARCELO DOS SANTOS NEVES

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA in vitro DO VENENO DAS SERPENTES AMAZÔNICAS Bothrops atrox (LINNAEUS, 1758) E Crotalus

durissus ruruima (HOGE, 1965)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas para a obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr. Jorge Luis López Lozano Co-orientadora: Profa. MSc. Maria Zeli Moreira Frota

MANAUS 2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

NEVES, Marcelo dos Santos Avaliação da atividade antifúngica in vitro do veneno das serpentes amazônicas Bothrops atrox (LINNAEUS, 1758) e Crotalus durissus ruruima (HOGE, 1965) xiv. 36 pág. Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. 1. Venenos de serpentes 2. Bothrops atrox 3. Crotalus durissus ruruima 4. Atividade antifúngica

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FOLHA DE JULGAMENTO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA in vitro DO VENENO DAS SERPENTES AMAZÔNICAS Bothrops atrox (LINNAEUS, 1758)

E Crotalus durissus ruruima (HOGE, 1965)

MARCELO DOS SANTOS NEVES “Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.

Banca Julgadora:

______________________________________________ Profº. Jorge Luiz López Lozano, Dr.

Presidente

______________________________________________ Profª. Maria Rosa Lozano Borras, Dra.

______________________________________________ Profº. José Camilo Hurtado Guerrero, Dr.

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Aos meus pais Greicy e Manoel.

Às minhas irmãs Ingrid e Inger.

Dedico-lhes esta conquista.

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AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Jorge Luis López Lozano pelo estímulo constante, pelos ensinamentos, por este presente e pela realização deste sonho.

À minha co-orientadora Profa MSc. Maria Zeli Moreira Frota pela amizade, apoio e colaboração neste trabalho. A Universidade do Estado do Amazonas e a Fundação de Medicina Tropical pela oportunidade de realização deste curso. A Superintendência da Zona Franca de Manaus pelo apoio ao Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. A Profa Dra. Maria das Graças do Vale Barbosa, coordenadora do Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas pelo apoio prestado no decorrer do curso. A todos os colegas que auxiliaram na realização das análises laboratoriais com os fungos, Ivaneide Lima Maciel, Edilamar, Fabiano de Souza Vargas, Luciana Paula de Amaral Coelho, em especial a Maria Zeli Moreira Frota pela paciência e por ter acreditado no trabalho desde a sua elaboração.

Ao Prof. Dr. Emerson Silva Lima do Laboratório de Bioquímica Clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UFAM, por disponibilizar as drogas e equipamentos que foram indispensáveis na realização das análises laboratoriais.

A Ana Claudia Cortez e Augusto Almendros de Oliveira do Laboratório de

Micologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) por disponibilizarem a cepa padrão de Candida albicans. Aos colegas do Laboratório de Toxinologia Molecular da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Fabiana Oliveira da Rocha, André Miasato Higa, Thiago Ferreira de Araújo, Maria das Dores Nogueira Noronha e Emiro Gnutzmann Muniz pelo apoio prestado na análise dos venenos. Aos colegas de Mestrado, Fabiane Giovanella Borges, Suiane da Costa Negreiros do Valle, Maria das Graças Gomes Saraiva, Kleber Pinheiro de Oliveira, Débora Laís dos Santos Justo, Laura Patrícia Viana Maia, Jander Tôrres da Silva, Flávio Silveira de Barros e Rosilene Viana de Andrade, pela convivência e companheirismo.

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Aos professores do Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas pelos ensinamentos. Aos Professores Doutores Maria Rosa Lozano Borrás e José Camilo Hurtado Guerrero por participarem da banca de defesa contribuindo para o desenvolvimento desta dissertação. A Emanuella Corrêa Alves pelo estímulo e companhia fundamental nesta jornada. Aos funcionários do Mestrado Maria da Conceição dos Santos Tufic, Samantha Teixeira Vasconcelos, Marcos André de Oliveira e Casta e Lucilene Guerra Pinheiro pelo carinho e colaboração. A amiga Andréia Queiroz de Camargo pelo apoio e colaboração na execução deste trabalho. A todos aqueles, que de forma direta ou indireta, me incentivaram a concluir este trabalho. Agradeço em especial, a minha família, sem a qual não teria conquistado esta vitória.

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“Nada é supérfluo na natureza”

Averróis

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RESUMO

Em conseqüência do desenvolvimento de microrganismos antibiótico-resistentes, peptídeos antibacterianos e antifúngicos despertaram o interesse nos últimos anos para estudos sobre novos agentes terapêuticos. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade inibitória in vitro de venenos brutos de duas serpentes amazônicas das espécies Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima frente ao crescimento de Candida albicans em meio de cultura líquido YPD. Os ensaios de inibição foram realizados a partir de uma adaptação do protocolo M27-A2 (NCCLS-CLSI, 2002) para macro e microdiluição. Perfil molecular dos constituintes protéicos dos venenos foi obtido por cromatografia líquida de alta performance em fase reversa (high performance liquid chromatografy-reversed phase, HPLC-RP) e eletroforese utilizando dodecil sulfato de sódio/gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os resultados obtidos mostraram discreta inibição para ambos os venenos estudados e não haver diferença estatisticamente significante ao nível de 5% entre as médias obtidas das diferentes concentrações testadas tanto para o veneno de Bothrops atrox quanto para o de Crotalus durissus ruruima, todavia os mesmos apresentaram diferenças quanto ao perfil molecular segundo análise cromatográfica e eletroforética. O procedimento técnico empregado mostrou-se de simples execução, de baixo custo além de ter acurácia e reprodutibilidade satisfatórias para a avaliação in vitro da atividade antifúngica de venenos de serpentes.

Palavras-chaves: Venenos de serpentes; Bothrops atrox; Crotalus durissus ruruima; Atividade antifúngica.

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ABSTRACT

As a consequence of the development of antibiotic-resistant microorganisms, antibacterial and antifungal peptides woke up the interest in the last years for studies on new therapeutic agents. The objective of this study was to evaluate the inhibitory activity in vitro of rude venoms of two amazonian snakes, Bothrops atrox and Crotalus durissus ruruima, in the growth of Candida albicans in liquid culture middle YPD. The inhibition rehearsals were accomplished starting from an adaptation of the M27-A2 protocol (NCCLS-CLSI, 2002) for macro and microdilution. The molecular profile of the proteics representatives of the venoms was obtained by high performance liquid chromatography-reversed phase (HPLC-RP) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The obtained results showed discreet inhibition for both studied venoms and there not to be differentiates statistically significants at the level of 5% among the obtained averages of the different concentrations tested so much for the venom of Bothrops atrox as for the one of Crotalus durissus ruruima, though the same ones presented differences as for the molecular profile second chromatography and electrophoresis analysis. The technician employed procedure was shown of simple execution, of low cost besides having accuracy and satisfactory reproducibility for the evaluation in vitro of the antifungal activity of snake venoms.

Key-words: Snake venoms; Bothrops atrox; Crotalus durissus ruruima; Antifungal activity.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Perfil cromatográfico de veneno de Bothrops atrox – 4mg/500µl, velocidade de fluxo de 1mL/minuto, Solução A – 0,1% de TFA, Solução B - 0,1% de TFA em acetonitrila, Coluna – RP C18. .................................................................................... 24

Figura 2. Perfil cromatográfico de veneno de Crotalus durissus ruruima – 4mg/500µl, velocidade de fluxo de 1mL/minuto, Solução A – 0,1% de TFA, Solução B - 0,1% de TFA em acetonitrila, Coluna – RP C18. .................................................................................... 25

Figura 3. Perfil SDS/PAGE dos venenos em condições redutoras onde: 1. Controle de B.atrox (10µg/µl); 2. Controle de C.d.r (10µg/µl); 3. C.d.r (0,4 µg/µl); 4. B.atrox (0,2 µg/µl).................................. 26

Figura 4. Perfil SDS/PAGE dos venenos em condições não-redutoras: 1. Controle de B.atrox (10µg/µl); 2. Controle de C.d.r (10µg/µl); 3. B.atrox (0,2 µg/µl); 4. C.d.r (0,4 µg/µl). ................................................. 26

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Percentuais de inibição do crescimento de Candida albicans obtidos em testes de microdiluição em caldo YPD a 35oC de dois derivados triazólicos com ação antifúngica. ..................................... 20

Tabela 2. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em macrodiluição, do veneno de Bothrops atrox sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM. .......................................................................................... 21

Tabela 3. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em macrodiluição, do veneno de Crotalus durissus ruruima sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM. .......................................................................................... 21

Tabela 4. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em microdiluição, do veneno de Bothrops atrox sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM. .......................................................................................... 22

Tabela 5. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em microdiluição, do veneno de Crotalus durissus ruruima sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM. .......................................................................................... 23

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% Percentagem µg Micrograma µl Microlitros µm Micrômetro AgNO3 Nitrato de prata ATCC 3632 American Type Culture Collection B.atrox Bothrops atrox C. albicans Candida albicans C. d. r Crotalus durissus ruruima Ca2+ Cálcio CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CO2 Gás carbônico DP Desvio padrão ECA Enzima conversora de angiotensina FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FUAM Fundação de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da

Matta g Grama GLP1 Glucagon like peptide 1 H+ Hidrogênio hERG Gene humano regulador de éter HIV Vírus da imunodeficiência humana HPLC- RP high performance liquid chromatography-reversed phase K+ Potássio kDa Kilodalton L Litro M27-A2 Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo mg Miligrama min Minutos mL Mililitros mm Milímetro Na2S2O3 Tiossulfato de sódio NaCl Cloreto de sódio NaCO3 Carbonato de sódio NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards nm Nanômetro ºC Grau Celsius p Nível de significância estatística pH Potencial hidrogênio iônico SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SIDA Síndrome da Imunodeficiência adquirida TEM Células T mieloproliferativas TFA Acido trifluoracético UEA Universidade do Estado do Amazonas UFAM Universidade Federal do Amazonas YPD Yeast peptone dextrose agar

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

1.1 Constituintes dos venenos .................................................................................. 1 1.2 Peptídeos antimicrobianos .................................................................................. 2 1.3 Aperfeiçoamento de peptídeos de venenos ........................................................ 3 1.4 Farmacologia dos peptídeos de venenos ............................................................ 4 1.4.1 Peptídeos de canais de cálcio ............................................................................. 4 1.4.2 Toxinas de Canais de sódio ................................................................................ 4 1.4.3 Toxinas de canais de potássio ............................................................................ 5 1.4.4 Toxinas de canais de cloro .................................................................................. 5 1.4.5 Peptídeos de venenos utilizados em doenças cardiovasculares......................... 5 1.4.6 Inibidores de transportadores de noradrenalina .................................................. 6 1.4.7 Peptídeos de venenos úteis em diabetes ............................................................ 6 1.4.8 Peptídeos com atividade antifúngica ................................................................... 6 1.4.9 Possíveis mecanismos de ação .......................................................................... 7 1.5 Importância dos Fungos em Saúde ..................................................................... 9 1.5.1 Candida ............................................................................................................. 10

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 12

2.1 Geral ................................................................................................................. 12 2.2 Específicos ........................................................................................................ 12

3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 13

3.1 Modelo de Estudo ............................................................................................. 13 3.2 Obtenção das amostras .................................................................................... 13 3.2.1 Venenos ............................................................................................................ 13 3.2.2 Drogas ............................................................................................................... 14 3.2.3 Fungo ................................................................................................................ 14 3.3 Preparação das culturas e efeito dos venenos no crescimento fúngico ............ 14 3.3.1 Cultivo do fungo ................................................................................................ 14 3.3.2 Preparação do inóculo ...................................................................................... 15 3.3.3 Técnica de macrodiluição em caldo .................................................................. 15 3.3.4 Técnica de microdiluição em caldo ................................................................... 16 3.4 Obtenção e caracterização molecular ............................................................... 17 3.4.1 Por métodos cromatográficos ........................................................................... 17 3.4.2 Por eletroforese ................................................................................................. 17

4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................... 19

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 20

5.1 Teste com drogas .............................................................................................. 20 5.2 Testes de inibição em macrodiluição ................................................................ 20 5.3 Testes de inibição em microdiluição .................................................................. 22 5.4 Caracterização molecular dos venenos testados .............................................. 24 5.4.1 Por cromatografia .............................................................................................. 24 5.4.2 Por eletroforese ................................................................................................. 25

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6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 27

7 CONCLUSÃO......................................................................................................... 30

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 31

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1 INTRODUÇÃO

Os venenos de animais evoluíram dando origem a um vasto grupo de toxinas

peptídicas, para captura da presa e defesa. Estes peptídeos encontram-se

direcionados contra uma ampla variedade de alvos farmacológicos, tornando-os uma

inestimável fonte de protótipos de drogas, para estudar as propriedades destes alvos

em diferentes processos experimentais. Uma parte desses peptídeos tem sido usada

in vivo para estudos de comprovação de eficácia, sendo submetidos a diversos

ensaios pré-clinicos ou clínicos no intuito de desenvolver tratamentos para dor,

diabetes, esclerose múltipla e doenças cardiovasculares (Garcia e Lewis, 2003).

A maioria dos venenos compreende uma mistura de peptídeos altamente

complexa, geralmente com farmacologia diversa e seletiva. Diante desta

diversidade, os peptídeos de venenos parecem ter evoluído a partir de um número

relativamente pequeno de estruturas que são particularmente bem ajustadas para

atender problemas cruciais de potência e estabilidade. É esta biodiversidade

desenvolvida que faz dos peptídeos de venenos uma fonte única de precursores e

modelos estruturais, dos quais novos agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos

(Garcia e Lewis, 2003).

1.1 Constituintes dos venenos

De acordo com Tu (1977), o veneno de serpentes peçonhentas é composto

de substâncias simples e complexas, cuja proporção e características específicas

variam entre as diferentes espécies conhecidas. A toxicidade do veneno das

serpentes deve-se à presença de enzimas e proteínas, e sua ação letal é atribuída

principalmente às neurotoxinas.

Os venenos de serpentes, em especial da família Crotalidae, que comporta os

gêneros Bothrops, Crotalus e Lachesis, contêm um grande número de proteínas

farmacológica e bioquimicamente ativas, são mais complexos que os de outras

famílias e contêm proteínas de maior massa molecular. São ainda particularmente

importantes, pois os gêneros acima citados são abundantes na América do Sul e

causam a maior parte dos acidentes ofídicos em humanos (Varanda e Giannini,

1999).

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Cerca de 90% a 95% do peso seco dos venenos de serpentes consiste de

proteínas, onde tanto as frações protéicas quanto as não-protéicas são

biologicamente importantes. Os componentes não-protéicos podem ser divididos em

orgânicos: aminoácidos livres e peptídeos, nucleotídeos, carboidratos, lipídios e

aminas biogênicas; e inorgânicos: cátions e ânions (Varanda e Giannini, 1999).

Segundo Varanda e Giannini (1999), dentre os constituintes orgânicos

destacam-se os aminoácidos e pequenos peptídeos por serem biologicamente

ativos. Os venenos contêm somente uma pequena quantidade de aminoácidos livres

e 11 desses foram detectados no veneno da Trimeresurus mucrosquamatos. Em

Vipera ammodytes foram encontrados histidina, ácido aspártico, glicina, ácido

glutâmico, serina, alanina e espermina.

Nos venenos de serpentes estão presentes também vários peptídeos ricos

em prolina que potenciam a ação da bradicinina. Uma seqüência de três peptídeos

potenciadores da bradicinina foi identificada no veneno de Agkistrodon halys

blomhoffi e um desses peptídeos foi isolado do veneno de Bothrops jararaca por

Ferreira et al. (1970).

1.2 Peptídeos antimicrobianos

Os peptídeos antimicrobianos representam um grupo extremamente diverso

de pequenas proteínas assim conhecidas devido a suas atividades antimicrobianas

naturais. A existência de tais proteínas é conhecida há diversas décadas, no entanto

apenas recentemente foram reconhecidas como essenciais à resposta imunitária

animal. Participam primariamente no sistema imunológico inato atuando como

barreira inicial de imuno defesa em muitos organismos, incluindo plantas, insetos,

bactérias e vertebrados (Broekaert et al., 1997; Bulet et al., 1999; Metz-Boutigue et

al., 2003).

Estes peptídeos atuam como primeira linha de defesa do sistema imunológico

à agressão por bactérias na forma de resposta induzida, como no caso das

defensinas de insetos (Hofmann et al., 1992), ou estão presentes de forma

constitucional, como as magaininas na pele de Xenopus laevis (Zaslof, 1987).

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Como efetores da imunidade inata, tais peptídeos atuam diretamente em um

amplo espectro de microrganismos, incluindo bactérias gram-positivas e gram-

negativas, fungos e certos vírus. Além disso, estes peptídeos interagem com o

próprio hospedeiro, desencadeando eventos que complementam seu papel como

antibióticos. Combinadas, as funções destes peptídeos sugerem que os mesmos

são importantes, e anteriormente subestimados, componentes da imunologia animal

(Gallo et al., 2002).

Steiner et al. (1981) identificaram os primeiros peptídeos antimicrobianos, as

cecropinas em Hyalophora cecropia. Nos anos seguintes, tais peptídeos com

atividade antibacteriana foram encontrados em todo o reino animal e vegetal, em

bactérias, diferentes ordens de insetos, anfíbios, mamíferos e humanos (Boman,

1991; Broekaert et al., 1997; Stefanie et al., 2000).

Diferentes grupos de peptídeos antimicrobianos podem ser produzidos

baseados em diferenças estruturais (Haeberli et al., 2000), como por exemplo: as

cecropinas (Boman, 1991); defensinas de insetos e plantas (Lehrer et al., 1991;

Hofmann et al., 1992; Cammue et al., 1992); dois peptídeos ricos em prolina, a

apidaecina e a abaecina (Casteels et al., 1989, 1990); diferentes polipeptídeos

antibacterianos induzíveis: atacinas (Kockum et al., 1984), sarcotoxina, diptericina

(Dimarcq et al., 1988), coleoptericina (Bulet et al., 1991); e magainina, de Xenopus

laevis (Duclohier et al., 1989; Matsuzaki et al., 1997).

1.3 Aperfeiçoamento de peptídeos de venenos

Segundo Chen et al. (1988), simultaneamente ao achado de peptídeos

antimicrobianos em diferentes classes de animais, peptídeos análogos e híbridos

foram sintetizados, por vezes até mais potentes.

Peptídeos de venenos precisam estar suficientemente estáveis para suportar

à degradação química em solução à temperatura ambiente e à degradação

enzimática por proteases presentes no próprio veneno (Milne et al., 2003), assim

como nos tecidos das diferentes espécies de presa. Esta estabilidade usualmente é

adquirida de forma natural por meio de modificações estruturais e/ou ligações

dissulfídicas as quais rearranjam o peptídeo a uma estrutura quimicamente estável.

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Enzimas específicas são usadas durante a produção destes peptídeos para

introduzir modificações em locais específicos, as quais podem aumentar a

biodisponibilidade, potência e estabilidade (Garcia e Lewis, 2003).

Todos estes compostos compartilham aspectos comuns como carga catiônica

e habilidade para formar estruturas anfipáticas (Maloy e Kari, 1995).

Apesar destas modificações, não é sempre que tais peptídeos de venenos

preenchem todos os requisitos associados a potenciais aplicações terapêuticas.

Discussões envolvendo o uso terapêutico de peptídeos incluem formulação, custo

de produção, estabilidade, seletividade e mecanismo de ação. A síntese química de

análogos permite que relações estrutura-atividade sejam desenvolvidas de forma

que possam levar a melhoria coordenada destes aspectos (Garcia e Lewis, 2003).

1.4 Farmacologia dos peptídeos de venenos

Peptídeos de venenos têm como alvo uma ampla variedade de canais

protéicos de membrana e receptores, conforme descrição abaixo.

1.4.1 Peptídeos de canais de cálcio

Estudos investigando o papel de canais de cálcio voltagem-dependente, na

liberação de neurotransmissores, têm apontado que a liberação de um

neurotransmissor específico está ligada à atividade de diferentes subtipos de canais

de cálcio em diferentes neurônios. Além do que, múltiplas junções variantes de

canais de cálcio existem em tecidos centrais e periféricos. Devido a esta diversidade,

oportunidade considerável existe para se desenvolver inibidores seletivos de canais

de cálcio voltagem-dependente (Lin et al., 1997).

1.4.2 Toxinas de Canais de sódio

Canais de sódio voltagem sensíveis são cruciais ao funcionamento do

sistema nervoso (Goldin et al., 2000). Alguns subtipos estão envolvidos em estados

clínicos tais como dor, apoplexia e epilepsia (Akopian et al., 1996; Rabert et al.,

1998).

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1.4.3 Toxinas de canais de potássio

Os canais de potássio representam uma família ampla e diversa de proteínas

envolvidas na regulação de muitas funções celulares, tais como, excitabilidade da

musculatura lisa e neuronal, proliferação, secreção de eletrólitos e regulação do

volume de líquidos corporais. Peptídeos inibidores têm auxiliado a elucidar o papel

fisiológico de alguns canais de potássio em tecidos naturais, incluindo canais de

potássio presentes no sistema de inervação entérico (Suarez-Kurtz et al., 1999).

Em humanos, células T mielo-reativas (TEM) ativadas de pacientes com

esclerose múltipla expressam níveis significativamente mais altos de canais de

potássio em relação a células T de memória centrais ou simples, além do que,

alguns inibidores de canais de potássio suprimem a proliferação de células TEM.

Logo, inibidores seletivos de canais de potássio podem representar uma terapia

apropriada para o tratamento de doenças auto-imunes como esclerose múltipla, bem

como, diabetes tipo 1, psoríase e artrite reumatóide (Beeton et al., 2001; Beeton et

al., 2003; Wulff et al., 2003).

Bloqueadores seletivos de canais de potássio também podem ter potencial

efeito no tratamento de câncer. Semelhante ao gene humano relacionado à entrada

e saída de éter (hERG), canais de potássio parecem estar presentes em diferentes

tumores (Pardo et al., 1999; Bianchi et al., 1998).

1.4.4 Toxinas de canais de cloro

Canais de cloro também estão entre as muitas proteínas de membrana

expressas na superfície de diferentes tipos de câncer. Uma Clorotoxina isolada do

escorpião Leiurus quinquestriatus (Debin et al., 1993) liga-se a canais de cloro

específicos e a certos tumores e gliomas, podendo assim representar potencial

agente no tratamento deste tipo de câncer (Ullrich et al., 1995).

1.4.5 Peptídeos de venenos utilizados em doenças cardiovasculares

O primeiro exemplo de uma droga de sucesso que teve como protótipo um

veneno é o captopril, o qual inibe a enzima conversora de angiotensina (ECA), uma

enzima essencial para a produção de angiotensina, a qual por sua vez é um

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vasoconstritor associado à hipertensão. O Teprotide, peptídeo isolado do veneno de

Bothrops jararaca, foi escolhido como modelo estrutural de referência devido sua

atividade de longa duração in vivo, mesmo mostrando não ser oralmente ativo

(Ondetti et al., 1971; Ondetti, 1988).

1.4.6 Inibidores de transportadores de noradrenalina

Transportadores de noradrenalina (NET) são importantes na redução da

concentração de noradrenalina liberada nos neurônios, como conseqüência influindo

no aprendizado e memória, bem como nas funções endócrinas e autônomas

(Ressler e Nemeroff, 1999).

Drogas que inibem os NET têm efeitos antidepressivos e/ou

psicoestimulantes (Charney, 1998), produzem exacerbação de efeitos nas vias

inibitórias descendentes na medula espinhal (Millan, 2002), o que representa

possível utilidade no tratamento de desordens cardiovasculares e incontinência

urinária (Andersson, 1999).

Conopeptídeos–χ (peptídeos tóxicos encontrados na casca dos caracóis) são

inibidores não competitivos e altamente específicos da captação de noradrenalina

por NET de humanos e ratos (Sharpe et al., 2001).

1.4.7 Peptídeos de venenos úteis em diabetes

O peptídeo 1 similar ao glucagon (GLP1) é um hormônio insulinotrópico,

secretado por células endócrinas do intestino grosso e delgado, de forma nutriente-

dependente. O GLP-1 inibe o fluxo interno e esvaziamento gástrico, e controla os

níveis sanguíneos de glicose. Um peptídeo relacionado ao GLP, a exendina - 4 do

veneno do monstro de Gila Heloderma suspectum (Eng et at., 1992), mostrou ser

ativo in vivo (Szayna et al., 2000). Com base nesta atividade, exendina - 4 passa por

ensaios clínicos de Fase III visando tratamento de diabetes tipo 2.

1.4.8 Peptídeos com atividade antifúngica

Um peptídeo com atividade antifúngica foi encontrado no veneno de uma

serpente brasileira. Estudos utilizando veneno de Bothrops jararaca revelaram que o

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composto denominado Pep5Bj, isolado de uma fração peptídica (FV), possui alta

atividade inibitória sobre o crescimento dos fungos fitopatogênicos Fusarium

oxysporum e Colletotrichum lindemuthianum e das leveduras Candida albicans e

Saccharomyces cerevisiae (Gomes et al., 2005).

A concentração inibitória mínima deste peptídeo encontrado no veneno de

Bothrops jararaca foi comparável ao de outros peptídeos antifúngicos como

defensinas de insetos e cecropinas encontradas em uma ampla diversidade de

animais (Sitaram e Nagaraj, 1999; Moerman et al., 2002).

Segundo Garcia e Lewis (2003), como conseqüência de sua alta seletividade,

peptídeos de veneno têm provado que são úteis particularmente para estudos de

comprovação de eficácia in vitro e in vivo. Todavia, para aplicações terapêuticas,

vários aspectos associados à segurança, farmacocinética e liberação precisam ser

esclarecidos. A otimização da liberação de peptídeos em alvos periféricos e centrais

ajudará a determinar se estes podem ser considerados candidatos ao

desenvolvimento de novas drogas. Permanecem a serem estudados quantos dos

peptídeos presentes em venenos animais podem vir a ter utilidade clínica.

1.4.9 Possíveis mecanismos de ação

Segundo Egorov et al. (2005), tornou-se muito nítido nos últimos anos que

peptídeos antimicrobianos desempenham um papel importante na proteção contra

infecções associadas a diferentes microorganismos e que estudos envolvendo estes

compostos contribuem de forma significante ao desenvolvimento de resistência a

diferentes patógenos.

Muitos destes peptídeos têm sido exaustivamente estudados no intuito de

elucidar seus mecanismos de ação. Diferentes modelos para este tipo de atividade

já foram propostos: peptídeos podem formar poros, seja por desorganização ou

desestabilização da membrana celular do patógeno. De maneira geral, os resultados

destes modelos mostram aumento na permeabilidade da membrana e lise da célula

patogênica (Gazit et al., 1995; Heller et al., 2000; Brogden, 2005).

As tioninas foram os primeiros peptídeos para os quais uma atividade

antipatogênica foi relatada, mostrando alterar a permeabilidade da membrana

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celular. São tóxicas tanto para bactérias gram-positivas quanto negativas, fungos,

leveduras e vários tipos de células de mamíferos. A toxicidade requer uma interação

eletrostática das tioninas com fosfolipídios de membrana carregados negativamente,

seguida ou pela formação de poros ou uma interação específica com certo domínio

na membrana (García-Olmedo et al., 1989; Theevissen et al., 1996).

Thevissen et al. (1996) também afirmam que as tioninas inibem crescimento

fúngico como resultado direto de interações proteína-membrana, agindo por

mecanismos possivelmente mediados por receptores.

Todos estes dados são consistentes com a noção de que tioninas afetam o

crescimento de fungos filamentosos, mais provavelmente devido à ligação à

superfície da membrana e o distúrbio de sua organização do que a formação de

poros. Além disso, a interação entre tioninas e células fúngicas também leva a

efeitos secundários tais como o influxo de Ca 2+, o qual possivelmente pode resultar

da ativação de um canal de cálcio endógeno (Thevissen et al., 1996).

Peptídeos antimicrobianos como a gramicidina A e alameticina já foram

utilizados para descrever interações peptídeo-membrana. Por serem pequenos e de

fácil disponibilidade têm tornado possível estudar interações com lipídios de

membrana a fundo por uma variedade de técnicas biofísicas. Estudos também

apontam que estes peptídeos apresentam habilidade para modular o fluxo de íons

através de membranas, tornando-se conseqüentemente modelos populares para

compreensão de como proteínas de canais de íons funcionam (Sitaram e Nagaraj,

1999).

Gomes et al. (2005) demonstraram que a inibição do crescimento de fungos

fitopatógenos e de leveduras como Candida albicans, por uma fração peptídica

chamada FV presente no veneno de Bothrops atrox, pode ter sido mediada pela

inibição da enzima ATPase H+ ou pelo aumento na permeabilidade de H+ da

membrana plasmática destes fungos.

Cociancich et al. (1993) demonstraram que defensinas de insetos rompem a

permeabilidade da membrana citoplasmática de Micrococcus luteus, resultante a

formação de canais de íons voltagem dependentes na membrana citoplasmática.

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Defensinas de plantas induzem o fluxo de íons pela membrana plasmática de

hifas fúngicas in vivo. Diferente de defensinas de insetos e mamíferos, as de plantas

não formam poros permeáveis a íons em membranas artificiais nem mudam as

propriedades elétricas de bicamadas lipídicas artificiais. Este achado indica uma

interação direta com componentes lipídicos da membrana plasmática (kagan et al.,

1990; Cociancich et al.,1993; Thevissen et al., 1996).

Provavelmente estas respostas de membrana são iniciadas através de

interação com um receptor que poderia traduzir um sinal para canais endógenos de

íons na membrana ou, alternativamente, facilitar inserção da defensina de planta na

membrana com subseqüente formação de canais de íons (Thevissen et al., 1996).

De acordo com Theevissen et al. (1996), dois diferentes membros da família

de peptídeos antifúngicos oriundos de defensinas de plantas, Rs-AFP2 e Dm-AMP1,

induziram a uma resposta de membrana em Neurospora crassa, incluindo captação

de Ca2+, saída de K+, alcalinização do meio e alterações no potencial de membrana.

Segundo Galo et al. (2002), análises estruturais da sequência de

aminoácidos, estudos diacrônicos circulares bem como estudos farmacológicos da

ação em diferentes patógenos, auxiliam a elucidar os mecanismos de ação de

peptídeos antimicrobianos presentes em venenos de serpentes.

1.5 Importância dos Fungos em Saúde

Nas últimas décadas, mudanças relevantes na epidemiologia das infecções

fúngicas humanas são observadas nas diferentes regiões do mundo, em especial,

no que concerne ao aumento na freqüência e espectro clínico das mesmas. Algumas

espécies fúngicas figuram atualmente entre as principais causas de infecções

disseminadas em pacientes imunodeprimidos internados, tais como diferentes

espécies de Candida, Aspergillus, Cryptococcus neoformans, dentre outras (Pfaller e

Yu, 2001).

Tais mudanças são resultantes principalmente do aumento das populações

mais suscetíveis a infecções oportunistas, dentre as quais, se destacam os

indivíduos portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA); indivíduos

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com imunossupressão iatrogênica devido ao uso prolongado de corticoesteróides,

antibióticos e outras drogas imunomoduladoras; pacientes neoplásicos, pós-

transplantados e portadores de outras doenças graves e debilitantes, os quais

tiveram sobrevida aumentada pelos modernos recursos terapêuticos (Sidrim e

Moreira, 1999).

1.5.1 Candida

A candidíase ou candidose é uma infecção primária ou secundária causada

por microrganismos do gênero Candida, comprometendo pele e anexos, mucosas e

semimucosas, podendo ocasionalmente disseminar-se produzindo lesões em órgãos

distintos, em pacientes com algum tipo de imunodepressão (Negroni et al., 2001).

Ocupa lugar de destaque entre as doenças tropicais, pois vem sendo relatada

como uma das principias infecções que acometem predominantemente pacientes

imunossuprimidos (Ferreira e Ávila, 2001).

Apesar deste gênero compreender 163 espécies, mais de 60% das infecções

são causadas por Candida albicans. A Candida faz parte da microbiota de

indivíduos sadios e está amplamente distribuída no meio ambiente, na fauna, na

flora, no solo e na água (Ferreira e Ávila, 2001; Negroni et al., 2001). O clima quente

e úmido da região Amazônica contribui favoravelmente para o desenvolvimento

desta infecção fúngica.

Estudos realizados por Negroni et al. (2001), evidenciaram que nas infecções

causadas pelo gênero Candida, C. albicans foi a espécie mais freqüente (70%).

Outras espécies descritas são C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. glabrata, C.

stelladoidea, C. guilliermondii e C. dubliniensis.

A candidíase é a infecção fúngica mais freqüente e de ocorrência mais

precoce em indivíduos HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) positivos, sendo a

C. albicans a espécie mais comumente encontrada (Trope, 1995), o que também foi

comprovado por Cruz (2004), ao estudar pacientes HIV positivos na Fundação de

Medicina Tropical do Amazonas, onde o gênero Candida também foi o mais

freqüentemente isolado.

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Outro aspecto que tem aumentado a predominância de infecções fúngicas,

principalmente a candidíase, é o desenvolvimento de mecanismos de resistência

primária e secundária aos antimicóticos, podendo ser explicada, em parte, pela ação

fungistática e pela terapêutica prolongada, o que permite a seleção de clones

resistentes (Arango et al., 2004).

Apesar da disponibilidade no mercado de fármacos para o tratamento da

candidíase cutânea, cutâneomucosa ou sistêmica, tais como Anfotericina B,

Fluconazol, Cetoconazol, entre outros, existem limitações à utilização dos mesmos,

como problemas com cepas resistentes, efeitos adversos (hepatoxicidade,

nefrotoxicidade) além do custo elevado (Sidrim e Moreira, 1999; Arango et al., 2004).

Nas últimas décadas houve não só um notável aumento das infecções

fúngicas em todo o mundo, mas também um incremento na resistência

farmacológica de diversas espécies de fungos, entre eles o gênero Candida aos

diferentes antimicóticos que se utiliza na prática médica (Arango et al., 2004).

Diante do exposto, é de total relevância a busca de novos antifúngicos de

origem natural, para o tratamento das candidíases, objetivando aliar menores efeitos

secundários, maior espectro de ação e menor custo que os fármacos disponíveis

atualmente.

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2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar a atividade antifúngica dos venenos de serpentes amazônicas por

meio de ensaios in vitro sobre o crescimento de cepa de levedura de interesse

clínico.

2.2 Específicos

• Testar uma metodologia simplificada de diluição em caldo adaptada do protocolo

M27-A2 (CLSI – Clinical and Laboratory Standard Institute) para avaliação da

atividade inibitória in vitro de venenos de serpentes amazônicas sobre o

crescimento de levedura do gênero Candida.

• Detectar, por meio de técnica de diluição em caldo, a atividade inibitória dos

venenos de serpentes amazônicas das espécies Bothrops atrox e Crotalus

durissus ruruima sobre o crescimento de cepa clínica de Candida albicans.

• Determinar a concentração inibitória mínima dos venenos de Bothrops atrox e

Crotalus durissus ruruima sobre o crescimento de cepa clínica de Candida

albicans.

• Caracterizar molecularmente, por meio de métodos cromatográficos e

eletroforéticos, os venenos das serpentes amazônicas Bothrops atrox e Crotalus

durissus ruruima.

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Modelo de Estudo

Estudo experimental descritivo, onde se avaliou a atividade inibitória in vitro

de moléculas com potencial antifúngico, provenientes de venenos de serpentes

amazônicas, sobre cepa de Candida albicans.

Foram realizados seis testes utilizando a técnica de macrodiluição e quinze

testes utilizando a técnica de microdiluição em caldo, em que foi testada a ação

inibitória de diferentes concentrações dos venenos sobre o crescimento fúngico.

Foram realizados ainda testes utilizando-se drogas antifúngicas como controle de

eficácia do método utilizado.

3.2 Obtenção das amostras

3.2.1 Venenos

As amostras de veneno de exemplares adultos das serpentes Bothrops atrox

e Crotalus durissus ruruima foram obtidas de espécimes provenientes de diferentes

localidades da Amazônia, mantidas nos serpentários do Centro de Ofidismo “Prof.

Paulo Friedrich Bührnhein” da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas

(FMTAM), por meio de pressão manual sobre as glândulas de veneno, após

anestesiar as serpentes com gás carbônico (CO2). O sobrenadante das amostras

coletadas foi centrifugado, filtrado utilizando-se filtro de 0,45 μm, liofilizado e

estocado a -20ºC.

A concentração inicial (ou estoque) do veneno de Bothrops atrox utilizada

para os testes de inibição em macrodiluição foi de 16.000 µg/mL, e 20.000 µg/mL

para os testes de inibição em microdiluição. Do veneno de Crotalus durissus

ruruima, as concentrações iniciais utilizadas para os testes de inibição em

macrodiluição e microdiluição foram respectivamente 10.000 µg/mL e 20.000 µg/mL.

A partir destes valores iniciais e de diluições sucessivas de cada um dos

venenos amostrados foram selecionadas as concentrações teste (em µg/mL) de

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0,78125; 1,25; 1,5625; 2,5; 3,125; 5; 6,25; 10; 12,5; 20; 25; 40; 50; 100; 200; 250 e

400 para realização dos ensaios de inibição.

3.2.2 Drogas

No intuito de avaliar a eficiência do método simplificado de diluição em caldo

YPD empregado no presente estudo foram realizados ensaios com duas drogas

antifúngicas da família dos triazóis, sintetizadas no Laboratório de Química da

Universidade Federal Fluminense, fornecidas pelo Laboratório de Bioquímica da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UFAM. Estas drogas foram identificadas

com os códigos IVS-0320 e IVS-0322 e foram testadas nas concentrações de 8 e 16

µg/mL.

3.2.3 Fungo

Foi utilizada nos testes in vitro para avaliação da atividade antifúngica dos

venenos, cepa de Candida albicans isolada de paciente com diagnóstico clínico e

laboratorial de candidíase vulvovaginal de evolução crônica ou recorrente, que

apresentava resistência clínica à terapêutica convencional, atendida no centro de

referência para Doenças Sexualmente Transmissíveis - Fundação de Dermatologia

Tropical e Venereologia Alfredo da Matta (FUAM). Esta cepa foi identificada com o

código KL-07. Como amostra padrão foi utilizada cepa de Candida albicans ATCC

3632, fornecida pelo Laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia (INPA).

3.3 Preparação das culturas e efeito dos venenos no crescimento fúngico

A preparação das culturas de leveduras utilizadas nos testes de inibição, a

padronização dos inóculos e o ensaio quantitativo foram realizadas a partir de uma

adaptação do protocolo M27-A2 (NCCLS, 2002) para macro e microdiluição.

3.3.1 Cultivo do fungo

Das cepas de levedura isoladas de material clínico foram realizadas

subculturas (repiques), em tubos estéreis com ágar YPD, incubando-os em estufa a

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35°C durante 24 horas. Durante todo o período que envolveu os ensaios foram

executadas passagens para assegurar pureza e viabilidade das cepas.

3.3.2 Preparação do inóculo

Dos repiques de 24 horas foram retiradas colônias com diâmetro aproximado

de 1 mm. As colônias foram então suspensas em 5mL de solução salina estéril

0,145 mol/L (8,5g/L NaCl; salina a 0,85%).

A suspensão resultante foi homogeneizada em agitador vortex por 15

segundos e a densidade celular ajustada com espectrofotômetro, acrescentando-se

solução salina suficiente para obter absorbância equivalente a de uma solução-

padrão de 0,5 na escala de Mc Farland (no caso, 0,1 de absorbância), em

comprimento de onda de 530 nanômetros (nm).

Esse procedimento permitiu a obtenção de uma suspensão-padrão de

levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 células por mL.

3.3.3 Técnica de macrodiluição em caldo

Para a técnica de macrodiluição foi realizada uma diluição 1:100 seguida de

uma diluição de 1:20 da suspensão-padrão em meio líquido YPD, obtendo-se assim

uma concentração de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 células por mL2 na suspensão teste após

a mistura com o veneno.

Foram transferidos 0,2 mL das diferentes concentrações do veneno

previamente diluído em solução salina, em tubos de ensaio 12 x 75mm. Os testes

foram realizados em triplicata utilizando-se concentrações que variaram entre

0,78125 e 400 µg/mL. Para controle de crescimento do inóculo fúngico utilizou-se

0,2 mL do diluente dos venenos, sem veneno. Acrescentou-se 1,8 mL do inóculo

ajustado, a cada tubo de ensaio da série de concentrações, homogeneizando-se em

vortex por 15 segundos. Este procedimento resultou em diluição 1:10 de cada

concentração de veneno testada e uma diluição do inóculo em 10%.

Os tubos foram incubados sem agitação em estufa a 35°C, durante um

período de 24 horas. Leituras ópticas foram realizadas em espectrofotômetro com

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comprimento de onda de 530nm, no intuito de avaliar o crescimento do inóculo

fúngico nos diferentes tubos contendo os venenos diluídos. Os percentuais de

crescimento e de inibição do crescimento nos tubos teste foram estimados

comparando-se com as leituras obtidas nos tubos controle usados em cada série de

análises.

3.3.4 Técnica de microdiluição em caldo

Os testes foram realizados em placas de microdiluição estéreis de 96 poços

com fundo plano.

A suspensão padrão de levedura foi homogeneizada durante 15 segundos em

vortex, e depois diluída na proporção de 1:50. Desta última foi obtida uma diluição

de 1:20 subsequentemente com o meio de cultura YPD, obtendo-se assim um

inóculo 2X concentrado na suspensão teste (de 1 x 103 a 5 x 103 células por mL).

As diferentes concentrações de veneno foram dispensadas em quadriplicata

nos poços da microplaca em volumes de 100µL, iniciando-se na fileira 1 com a

diluição mais concentrada (400 µg/mL), concluindo-se na fileira 5 com a diluição de

menor concentração do veneno (0,781µg/mL).

Para os controles positivos foram adicionados 100µL de meio de cultura,

isento de veneno, nos quais foram acrescentados 100µL das suspensões 2X

concentradas dos inóculos. Realizou-se ainda o controle negativo inoculando-se em

uma das fileiras da placa apenas o meio de cultura com solução salina, isento de

veneno e de inóculo.

Desta maneira, o inóculo 2X concentrado foi então acrescentado na

proporção 1:1 ao ser inoculado nos poços, obtendo-se assim uma concentração final

de 0,5 x 103 a 2,5 x 103 células por mL.

Uma vez misturados veneno e meio com inóculo, as placas de microdiluição

foram incubadas em estufa a 35° C por 24 horas. Após a incubação, leituras ópticas

a 630 nm foram realizadas do conteúdo dos poços com os venenos em diferentes

concentrações e os controles, em leitora de placa (Thermo Plate TP Reader)

obtendo-se os valores em absorbância.

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3.4 Obtenção e caracterização molecular

A obtenção e caracterização do perfil molecular das frações protéicas dos

venenos com atividade inibitória sobre o crescimento dos fungos amostrados foram

realizadas conforme técnicas descritas abaixo.

3.4.1 Por métodos cromatográficos

As frações protéicas dos venenos utilizados nos testes de inibição foram

obtidas utilizando-se método cromatográfico convencional de fase reversa,

associado a fracionamento por solventes orgânicos e soluções tampão segundo

López-Lozano (2002).

A detecção do perfil molecular dos constituintes protéicos dos venenos das

serpentes foi obtida usando-se cromatografia líquida de alta performance em fase

reversa (high performance liquid chromatografy-reversed phase, HPLC-RP), com

coluna semipreparativa ODS Shim-Pack C18 (10 mm x 250 mm, 10 µm), equilibrada

com 0,1% de ácido trifluoracético (TFA, solução A). A eluição dos constituintes dos

venenos era iniciada com fluxo da solução A por 10 min e continuada com gradiente

0,1% de TFA em acetonitrila (solução B), de 0 a 60% em 70 minutos (min). A

velocidade de fluxo para eluição dos constituintes era de 2,5 ml/min, monitorando-se

com detector analítico sob radiação luminosa a 216 nm. Para cada processo

cromatográfico eram aplicadas 4 mg de amostra e, para cada amostra, realizavam-

se duas análises cromatográficas.

3.4.2 Por eletroforese

Foi utilizada técnica descrita por Laemmli (1970) utilizando dodecil sulfato de

sódio/gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), conforme descrito a seguir.

A concentração do gel de corrida foi de 15%, enquanto que a do gel de

empilhamento foi de 4%. As amostras de venenos foram diluídas volume a volume

com tampão da amostra Tris 0,125M, SDS 2%, glicerol 10% e azul de bromofenol

0,05%, com e sem β – mercaptoetanol, resultando frações reduzidas e não

reduzidas respectivamente, e aquecidas por 5 minutos a 100°C (reduzidas) 40ºC por

30 minutos (não reduzidas).

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Foram submetidas à eletroforese amostras de veneno de Bothrops atrox na

concentração de 0,2 µg/µl (diluição equivalente a 200 µg/ml) e Crotalus durissus

ruruima na concentração de 0,4 µg/µl (diluição equivalente a 400 µg/ml), juntamente

com dois controles de corrida para Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima

ambos com concentração de 10 µg/µl.

As amostras aplicadas no gel foram submetidas a uma corrente elétrica

constante de 20 mA / gel, usando Tris-glicina pH 8,3 (Tris 0,025M, glicina 0,192M,

SDS 0,1%) como tampão de corrida.

Após a corrida os géis foram corados com Nitrato de Prata conforme descrito

abaixo.

Os géis foram lavados durante 5 minutos com água destilada e em seguida

imersos em 150 ml de solução fixadora (composta por metanol 50%, ácido acético

12% e formaldeído 0,1%) por 24 horas. Após este período, os géis foram submetidos

a três lavagens com etanol. Cada lavagem durou 20 minutos, sob agitação,

utilizando-se 300 ml de solução de etanol 50%. A próxima etapa foi deixar os géis

imersos em 300 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,02% por 1 hora. Os géis

foram então submetidos a três ciclos de lavagem com água destilada, sob agitação,

por cerca de 20 minutos cada ciclo. Após lavagem, os géis foram imersos em

solução de nitrato de prata (AgNO3 0,2% e formaldeído 0,075%) e água destilada,

por 30 minutos, sob agitação. Logo em seguida, foram lavados com água destilada

por não mais que 1 minuto e imersos em solução reveladora (Na2CO3 6%;

formaldeído 0,008%; Na2S2O3) sob agitação até surgimento das bandas e spots.

Evidenciadas as bandas, os géis foram então imersos em solução de interrupção

(composta de ácido acético 5%) por 10 minutos finalizando assim o processo de

coloração.

O perfil molecular obtido nos géis foi registrado utilizando-se Image Scanner

(GE) com auxílio do software Platino 6.0 (GE).

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4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e os dados obtidos

utilizados para cálculo das médias das leituras, medianas e desvio-padrão (DP).

Na comparação das medianas dos diferentes níveis de diluição utilizou-se o

teste Não-paramétrico de Kruskal-Wallis com nível de significância de 5%.

O software utilizado na análise foi o programa Epi-Info 3.3 for Windows

desenvolvido e distribuído pelo CDC (www.cdc.org/epiinfo).

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5 RESULTADOS

5.1 Teste com drogas

Ensaios realizados com duas drogas antifúngicas da família dos triazóis, (IVS

– 0320 e IVS – 0322) visando demonstrar eficiência do método de microdiluição em

caldo YPD, mostraram potente atividade inibitória sobre o crescimento de Candida

albicans. Foi possível observar correlação positiva entre concentração e atividade

inibitória

Tabela 1. Percentuais de inibição do crescimento de Candida albicans obtidos em testes de microdiluição em caldo YPD a 35oC de dois derivados triazólicos com ação antifúngica.

Drogas *Concentração

(µg/mL)

Atividade Inibitória (%)

DP Mediana

IVS-0320 8 50,08 3,01 50,88 IVS-0320 16 81,23 1,37 80,49 IVS-0322 8 99,70 0,58 100

IVS-0322 16 100 0,00 100

DP – desvio padrão, * concentrações obtidas a partir de diluições da droga purificada.

5.2 Testes de inibição em macrodiluição

Nos ensaios utilizando-se diluições do veneno de Bothrops atrox, obteve-se

maior atividade inibitória (16,05%) sobre a cepa clínica KL-07 com uma

concentração de 10 µg/mL de veneno e menor atividade (3,61%) com

concentração de 2,5 µg/mL, conforme apresentado na Tabela 2. Com relação à cepa

padrão ATCC observou-se maior atividade inibitória (14,26%) com uma

concentração de veneno de 400 µg/mL e menor (5,45%) com concentração de

veneno de 1,25 µg/mL. Nossos dados sugerem similar efeito inibitório, nas

concentrações testadas, do veneno de B. atrox sobre ambas as cepas de Candida

albicans.

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Tabela 2. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em macrodiluição, do veneno de Bothrops atrox sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM.

Concentração* (µg/mL) Atividade Inibitória (%)

KL-07 ATCC

DP KL- 07 ATCC

Mediana KL-07 ATCC

400 12,32 14,26 1,33 1,05 9,42 8,43

40 5,21 12,71 2,57 1,51 3,23 7,87

20 5,56 10,93 8,52 1,48 3,65 6,39

10 16,05 14,07 11,72 1,06 10,50 9,70

5 12,64 7,8 20,48 1,17 8,46 3,87

2,5 3,61 7,07 25,56 1,14 3,16 4,70

1,25 13,93 5,45 26,99 1,20 10,39 3,54

DP - desvio padrão, * concentrações obtidas a partir de diluições do veneno bruto de Bothrops atrox, p-valor = 0,785(KL-07) e p-valor = 0,220 (ATCC) - (Teste de Kruskal-Wallis).

Ao testar o veneno de Crotalus durissus ruruima, observou-se frente à cepa

clínica KL-07 maior atividade inibitória (9,19%) com concentração de 12,5 µg/mL e

menor atividade (0,35%) com 1,5625 µg/mL. Frente a cepa padrão ATCC a maior

atividade inibitória (13,21%) foi obtida na concentração de 3,125 µg/mL e a menor

(2,84%) na concentração de 250 µg/mL. Em vista destes dados, observa-se

atividade inibitória semelhante para este veneno sobre ambas as cepas analisadas

(Tabela 3).

Tabela 3. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em macrodiluição, do veneno de Crotalus durissus ruruima sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM.

Concentração* (µg/mL)

Atividade Inibitória (%) KL-07 ATCC

DP KL-07 ATCC

Mediana KL-07 ATCC

250 2,98 2,84 8,14 1,02 2,85 2,84

25 1,01 12,73 5,03 4,50 1,01 12,73

12,5 9,19 12,0 24,44 1,95 9,19 12,0

6,25 1,34 8,69 1,68 3,76 1,34 8,69

3,125 5,91 13,21 7,00 2,0 5,91 13,21

1,5625 0,35 9,34 13,51 2,23 0,35 9,34

0,78125 7,50 9,26 5,65 1,03 7,50 9,26

DP – desvio padrão, * concentrações obtidas a partir de diluições do veneno bruto de Crotalus durissus ruruima, p-valor = 0,785 (KL-07) e 1 (ATCC) - (Teste de Kruskal-Wallis).

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5.3 Testes de inibição em microdiluição

De acordo com os dados apresentados na Tabela 4, ao se testar o veneno da

espécie Bothrops atrox, a maior atividade inibitória alcançada (9,09%) sobre a cepa

KL-07 foi observada com concentração de 200 µg/mL, e a menor (1,86%) com

concentração de 3,125 µg/mL. Não houve inibição pelo veneno de B. atrox, em

nenhuma das concentrações testadas, frente à cepa ATCC.

Tabela 4. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em microdiluição, do veneno de Bothrops atrox sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM.

Concentração* (µg/mL) Atividade Inibitória (%) KL-07 ATCC

DP KL-07 ATCC

Mediana KL-07 ATCC

400 5,54

0,00

7,04

0,00

2,73

0,00

200 9,19 9,79 7,03 100 5,88 6,56 3,27 50 4,96 5,47 4,93 25 6,87 10,12 2,91 12,5 4,31 3,57 5,80 6,25 6,08 5,01 5,37 3,125 1,86 5,06 1,19 1,5625 4,32 10,04 2,0 0,78125 5,45 5,58 4,57

DP – desvio padrão, * concentrações obtidas a partir de diluições do veneno bruto de Bothrops atrox, p-valor = 0,785 (KL-07) e 0,20(ATCC) - (Teste de Kruskal-Wallis).

A Tabela 5 mostra que ao se testar o veneno da espécie Crotalus durissus

ruruima frente à cepa clínica KL-07, a atividade inibitória mais elevada (7,88%) foi

obtida com concentração de 400 µg/mL e a menor (1,91%) com 25 µg/mL e que

diante da cepa padrão ATCC não foi observada atividade inibitória em nenhuma das

concentrações utilizadas do veneno supramencionado.

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Tabela 5. Efeito das diferentes concentrações analisadas, em microdiluição, do veneno de Crotalus durissus ruruima sobre o crescimento de Candida albicans em meio YPD a 35º C, Manaus – AM.

Concentração* (µg/mL) Atividade Inibitória (%) KL-07 ATCC

DP KL-07 ATCC

Mediana KL-07 ATCC

400 7,88

0,00

2,38

0,00

6,61

0,00

200 5,29 2,25 4,07 100 4,29 0,53 4,05 50 6,47 1,87 7,49 25 1,91 2,84 2,13 12,5 2,83 4,12 1,42 6,25 3,30 1,08 3,19 3,125 5,42 1,73 6,35 1,5625 3,14 0,41 3,09 0,78125 4,25 1,91 4,86

DP – desvio padrão, * concentrações obtidas a partir de diluições do veneno bruto de Crotalus durissus ruruima, p-valor = 0,785(KL-07) e 0,04(ATCC) - (Teste de Kruskal-Wallis).

Na análise dos resultados obtidos nos testes de inibição, realizados em macro

e microdiluição, observou-se não haver diferença estatisticamente significante ao

nível de 5% entre as médias obtidas segundo as diferentes concentrações testadas

tanto para o veneno da espécie Bothrops atrox (Tabelas 2 e 4), como da espécie

Crotalus durissus ruruima (Tabelas 3 e 5).

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5.4 Caracterização molecular dos venenos testados

5.4.1 Por cromatografia

A análise comparativa dos perfis cromatográficos HPLC-RP-C18 dos venenos

de Bothrops atrox (Figura 1) e Crotalus durissus ruruima (Figura 2), obtidos segundo

procedimento cromatográfico descrito no item 4.6.1, mostrou diferenças quanto ao

número, intensidade e tempo de retenção dos picos.

Minutes

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Vol

ts

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

Vol

ts

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

Detector A - 1 (214nm)B.atroxteste2

Ace

toni

trila

(%)

A

bsor

bânc

ia (λ

216

nm

)

100

80

60

40

20

0

Figura 1. Perfil cromatográfico de veneno de Bothrops atrox – 4mg/500µl, velocidade de fluxo de 1mL/minuto, Solução A – 0,1% de TFA, Solução B - 0,1% de TFA em acetonitrila, Coluna – RP C18.

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Minutes

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Vol

ts

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Vol

ts

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Detector A - 1 (216nm)cdrthiacasam10.dat

5.4.2 Por eletroforese

Segundo o perfil por SDS-PAGE dos venenos testados (Figuras 3 e 4),

observaram-se variações quanto ao perfil molecular, tanto em condições redutoras

(presença de β mercaptoetanol) quanto em condições não redutoras (ausência de β

mercaptoetanol), com ausência de algumas bandas protéicas nas amostras mais

diluídas e predomínio das bandas com 14, 23 e 50 kDa (kiloDaltons) em ambos os

venenos analisados.

A

bsor

bânc

ia (λ

216

nm

)

Ace

toni

trila

(%)

0

20

40

60

80

100

Figura 2. Perfil cromatográfico de veneno de Crotalus durissus ruruima – 4mg/500µl, velocidade de fluxo de 1mL/minuto, Solução A – 0,1% de TFA, Solução B - 0,1% de TFA em acetonitrila, Coluna – RP C18.

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1 2 3 4

1 2 3 4

MM (kDa) 50

23

14

MM (kDa) 50

23

14

Figura 3. Perfil SDS/PAGE dos venenos em condições redutoras onde: 1. Controle de B.atrox (10µg/µl); 2. Controle de C.d.r (10µg/µl); 3. C.d.r (0,4 µg/µl); 4. B.atrox (0,2 µg/µl).

Figura 4. Perfil SDS/PAGE dos venenos em condições não-redutoras: 1. Controle de B.atrox (10µg/µl); 2. Controle de C.d.r (10µg/µl); 3. B.atrox (0,2 µg/µl); 4. C.d.r (0,4 µg/µl).

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6 DISCUSSÃO

Nos últimos anos, diversos peptídeos antimicrobianos têm sido encontrados

em venenos de diferentes fontes animais e intensamente estudados no sentido de

elucidar suas habilidades em inibir o crescimento de potenciais microorganismos

patógenos (Gallo et al., 2002).

No presente estudo foi avaliada a atividade inibitória in vitro de venenos

brutos de duas serpentes amazônicas das espécies Bothrops atrox e Crotalus

durissus ruruima frente o crescimento de Candida albicans, empregando-se uma

metodologia simplificada de diluição em caldo YPD, a partir do protocolo M27A -

CLSI.

De uma maneira geral, a atividade inibitória foi discreta em ambos os venenos

testados. As médias de inibição relativas as diferentes concentrações selecionadas

para os ensaios, com veneno de Bothrops atrox e de Crotalus durissus ruruima, não

mostraram diferenças estatísticamente significativas entre si, sugerindo que os

níveis de concentração não interferiram no grau de inibição ao se utilizar o veneno

bruto.

O perfil molecular, segundo as análises cromatográficas, mostrou diferenças

quanto ao número, intensidade e tempo de retenção dos picos nos dois venenos

estudados. Nas análises eletroforéticas foi possível observar ausência de algumas

bandas protéicas nas amostras mais diluídas e predomínio das bandas com 14, 23 e

50 kDa em ambos os venenos analisados.

Nos ensaios realizados em macrodiluição foi possível notar médias de

inibição mais elevadas que as obtidas nos ensaios em microdiluição para ambos os

venenos utilizados, entretanto estes valores distribuiram-se em diferentes níveis de

concentração. Por conseguinte não foi possível se evidenciar uma correlação entre

concentração e atividade inibitória.

Ao se analisar a atividade inibitória nos ensaios realizados em microdiluição

nota-se similaridade com os ensaios macro, tendo em vista a distribuição das

médias de inibição onde não foi possível estabelecer correlação entre concentração

e atividade inibitória. Observou-se também, discreta inibição frente a cepa clínica

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identificada como KL-07, e curiosamente a ausência de efeito inibitório sobre a cepa

padrão ATCC 3632.

Com base nestes dados, é possível inferir se no veneno bruto a concentração

de princípios ativos pode ser inferior ou não ideal se comparada a de venenos

fracionados (Ribeiro et al., 2007) ou que talvez os compostos presentes no veneno

bruto venham a sofrer algum tipo de interferência quanto à atividade inibitória por

não se encontrarem plenamente ativos, uma vez que o veneno é constituído por um

“pool” de proteínas e peptídeos, que apresentam diferenças no que se referem à

quantidade e natureza química, e que desta forma ao interagirem em uma mesma

reação podem gerar efeitos antagônicos entre si, anulando assim algum tipo de

atividade biológica (Haeberli et al., 2000; Konno et al., 2001; Moerman et al., 2002).

Estudos de Gomes et al. (2005) podem corroborar estes achados ao

demonstrarem que uma fração peptídica (FV) isolada, presente no veneno de

Bothrops jararaca, apresentou maior atividade inibitória sobre o crescimento de

Candida albicans quando comparada ao efeito do veneno bruto.

Sugere-se ainda, segundo os dados obtidos, a hipótese de que os venenos

avaliados podem ter sofrido proteólise advinda de mecanismos de defesa do fungo,

no caso a Candida albicans, haja vista a existência de cepas providas de genes

específicos ligados à resistência clínica como MDR1 e CDR1 codificadores de

proteínas que provocam a eliminação de um fármaco, com isso reduzindo seu

acúmulo intracelular (Hernáez et al., 1997).

Importante frisar a ausência de inibição frente à cepa padrão ATCC,

levantando-se o questionamento se não existiriam diferenças entre as duas cepas

testadas no que diz respeito a interações proteína-membrana mediadas por

receptores (Thevissen et al., 1996), sugerindo que a cepa padrão em nosso estudo

apresente mecanismos de defesa que impedem a ligação de proteínas específicas

presentes no veneno a receptores na membrana da célula fúngica, levando assim a

neutralização de um possível efeito inibitório.

Uma outra hipótese a cerca dos resultados apresentados no presente

trabalho seria a de que os venenos testados podem ter sido auto-degradados

durante a fase de incubação com a suspensão de leveduras por proteases próprias

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num processo conhecido como autoproteólise (Milne et al., 2003). Tanto o veneno

de Bothrops atrox como o de Crotalus durissus ruruima apresentam na sua

composição altas concentrações de serino e metaloproteases (Muniz, 2002; López-

Lozano, 2002).

Em referência aos métodos de avaliação da atividade antifúngica empregados

neste estudo, verificou-se que os procedimentos técnicos, oriundos de adaptação do

protocolo M27-A2 (NCCLS-CLSI, 2002), demonstraram boa reprodutibilidade,

eficiência e acurácia, haja vista os resultados obtidos ao se testar as drogas

antifúngicas IVS-0320 e IVS-0322, além de simplicidade quanto à execução, uma

vez que não houve necessidade de aparato técnico de grande complexidade e o

baixo custo que envolveu a realização dos mesmos.

A complexidade metodológica; o alto custo; a demora do teste; e a dificuldade

na leitura, são as principais limitações apontadas por diferentes autores em relação

ao método padrão-ouro preconizado no protocolo M27-A do referido Comitê. Deste

modo, através dos experimentos realizados sugere-se a aplicação de um protocolo

alternativo que possibilita testar princípios ativos outros, além dos de serpentes,

oriundos de fontes animais ou vegetais com potencial atividade antifúngica.

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7 CONCLUSÃO

• Os venenos de Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima mostraram discreta

inibição in vitro frente ao crescimento de Candida albicans em meio de cultura

líquido YPD;

• Não foi possível estimar a concentração inibitória mínima dos venenos de

Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima sobre o crescimento das cepas de

Candida albicans empregadas nos testes.

• Não houve diferença significativa no grau de inibição entre as concentrações

selecionadas para análise em ambos os venenos testados tanto em macro

quanto em microdiluição;

• Os venenos de Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima mostraram diferenças

quanto ao perfil molecular segundo análise cromatográfica e eletroforética;

• Por meio deste estudo foi possível demonstrar que as técnicas de macro e

microdiluição em caldo são eficazes para se avaliar a taxa de inibição de

substâncias como venenos animais.

• Com o presente trabalho surge a possibilidade de isolar e averiguar se frações

protéicas e peptídicas, presentes em venenos de serpentes das espécies

Bothrops atrox e Crotalus durissus ruruima, apresentam alguma atividade

inibitória frente a cepas de Candida albicans.

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