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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS CLÍNICOS DO COMPLEXO Cryptococcus
neoformans-C. gattii DO ESTADO DO AMAZONAS-BRASIL
BABBYNGTTONN KHELL SOUZA DA SILVA
MANAUS
2009
i
BABBYNGTTONN KHELL SOUZA DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO LABORATORIAL DE ISOLADOS CLÍNICOS DO COMPLEXO
Cryptococcus neoformans-C. gattii DO ESTADO DO AMAZONAS-BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas para obtenção do
grau de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientador (a): Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza
MANAUS
2009
Ficha Catalográfica
S586c Silva, Babbyngttonn Khell Souza da Caracterização laboratorial de isolados clínicos do
complexo Cryptococcus neoformans-C. gatti do Estado do Amazonas – Brasil / Babbyngttonn Khell Souza da Silva. -- Manaus: Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2009.
40 f.: il.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical – UEA/FMT, 2009.
Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza.
1. Micose – Diagnóstico e tratamento. 2. Cryptococcus neoformans-C I. Título.
CDU: 616-002.8
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Escola Superior de Ciências da Saúde – UEA Sheyla Lobo Mota.
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇÃO LABORATORIAL DE ISOLADOS CLÍNICOS DO
COMPLEXO Cryptococcus neoformans-C. gattii DO ESTADO DO
AMAZONAS-BRASIL.
BABBYNGTTONN KHELL SOUZA DA SILVA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado”.
Banca Julgadora:
_________________________________ Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.
Presidente
______________________________________ Profª. Ormenzinda Celeste Cristo Fernandes, Dra.
Membro
________________________________ Prof. Luiz Carlos de Lima Ferreira, Dr.
Membro
iii
Dedico este trabalho a minha mãe, Suely.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida! Obrigado por TUDO!!!
Ao João Vicente Braga de Souza, meu amigo, pela: oportunidade, incentivo,
dedicação, respeito, paciência, credibilidade, confiança e autenticidade, que
nortearam estes anos de trabalho e convivência. Eterna Gratidão!!!!!!!
A minha mãe Suely, por todo o amor, ensinamentos, exemplos e orações.
A minha família (Evandro, Suely, Mickel, Kellyanne, Vó Amélia, Vô
Bernardino, Tia Sid, Tio Lúcio, Estêvão, Jacqueline, Maria Fernanda (Abençoada!!!),
Andersom e Gilson pelos momentos ímpares de alegria e incentivos aos estudos.
Agradeço a Deus pela existência de todos.
A minha namorada Ingrid pelo amor, paciência, confiança, dedicação e
carinho.
Aos amigos Luiz Carlos, Marcos Fábio, Júlio César, León Fábio, Alex
Mesquita, Adson Pinto e Mauro Leandro pela caminhada árdua porém, gratificante.
Aos amigos, parentes e familiares das pessoas que nos cercam de muito
carinho e respeito, muito obrigado.
A família do João (pais, irmãs, cunhados), Esposa e Filho (Érica e João Pedro
– Féla) pela acolhida, dedicação e respeito. Obrigado pelo enorme carinho.
Aos amigos Alysson, Carlos André, Clarice do Acre, Agostinho e Zeca pelos
momentos de alegria e diversão, regados a muito churrasco e porque não... “ the
book on the table”, “Bob Marley” , rimas repentistas, jamón, rodízios de farofas…
momentos eternos!!!!
v
Aos amigos dos esportes que sempre nos ensinam que ganhar ou perder é
uma conseqüência, mas o fato mais importante é a amizade que fica.
A todo Laboratório Multicenter, em especial ao Dr. Ramirez pela
compreensão, carinho, respeito e colaboração profissional.
Aos colegas de profissão (Bioquímicos, Técnicos, Administrativos e Todos de
A-Z) de todos os empregos, que contribuíram integralmente para o sucesso deste,
muito obrigado!!!
Ao Dr. Carlos Victor e Dr. José Messias pelo companheirismo e colaboração.
A Dra. Lucimar e Dra. Flávia pela oportunidade e colaboração profissional.
A todos os alunos do Centro Universitário do Norte pelos ensinamentos
compartilhados.
Aos professores e alunos do curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical
do Amazonas pela oportunidade de aprendizado.
Aos doutores da minha banca: Dr. Luiz Ferreira Lima, Dra. Ormezinda
Fernandes, Dra. Maria Paula Gomes Mourão. Muito Agradecido.
A coordenação do curso de Pós-Graduação: Dra. Maria das Graças Vale
Barbosa, Sra. Conceição Tufi e Sr. Marcos André, pela dedicação ao apoio no curso.
Ao corpo técnico do Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas: D. Antonieta, D. Graça, D. Luiza, D. Telma e D. Jaqueline
pelos ensinamentos e disciplina.
A Bolsista de PAIC Srta. Mirlane Santos Silva, Srta. Ivanete Sampaio e ao Sr.
Roberto Leal pela incansável busca da perfeição na genotipagem das espécies.
Aos colegas de mestrado e doutorado do curso de Pós-Graduação pelo
agradável convívio e aprendizado contínuo.
vi
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -
CAPES, a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas -FAPEAM, a
FMURAKI, a Superintendência da Zona Franca de Manaus - SUFRAMA pelo apoio
financeiro.
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM) e Universidade do
Estado do Amazonas (UEA) pela parceria de sucesso.
Os que não constam nesta lista de agradecimentos.
A você que está lendo estes agradecimentos.
MUITO AGRADECIDO!!!!!!!!!!
vii
“Os ventos que às vezes tiram
algo que amamos, são os
mesmos que trazem algo que
aprendemos a amar...
Por isso não devemos chorar
pelo que nos foi tirado e sim,
aprender a amar o que nos foi
dado. Pois tudo aquilo que é
realmente nosso, nunca se vai
para sempre...”
Bob Marley
viii
RESUMO
A diferenciação e classificação de espécies patogênicas do gênero Cryptococcus
fornece dados úteis para estudos epidemiológicos, clínicos e de diagnóstico. O
objetivo deste estudo foi caracterizar 40 isolados clínicos de Cryptococcus obtidos
de pacientes na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTM), no período
de 2006-2008. Foram utilizadas metodologias de fenotípagem (características
bioquímicas, produção de enzimas e resistência antifúngica) e de biologia molecular
(URA5-RFLP) para caracterização. Resultados: Pacientes com HIV/AIDS foram os
mais afetados pela criptococose. Trinta e um (75,5%) dos isolados clínicos foram
classificados como C. neoformans e 9 (22,5%) como C. gattii. Altos níveis de
proteases e fosfolipases foram produzidos pela maioria dos isolados. Utilizando o
teste de difusão em disco (CLSI M44-A), 81, 35 e 100% dos isolados de C.
neoformans foram caracterizados como susceptíveis ao fluconazol, itraconazol e
anfotericina B, respectivamente, enquanto que 78, 56 e 100% dos isolados de C.
gattii foram sensíveis a esses antimicrobianos. A média de Concentração Inibitória
Mínima (CIM) para C. neoformans e C. gattii isolados foi de 0,26 e 0,58 µ/ml,
respectivamente. 9 isolados de C. gattii demonstram um padrão de eletroforese
compativel com o tipo molecular VGII, enquanto todos os 31 isolados de C.
neoformans apresentaram um padrão compatível com o tipo VNI. Este estudo
confirma a importância do HIV/SIDA para a epidemiologia da criptococose, a
susceptibilidade dos isolados a anfotericina B e alta prevalência dos genótipos
molecular VNI e VGII no norte do Brasil.
Palavras chave: Cryptococcus spp., Epidemiologia, Fenotipagem e Genotipagem
ix
ABSTRACT
The differentiation and classification of pathogenic Cryptococcus species provides
useful data for epidemiological studies and for the clinical diagnosis and treatment of
patients. The aim of this study was to characterize 40 clinical Cryptococcus obtained
from patients at the Tropical Medicine Foundation of Amazonas (FMTAM) from 2006
to 2008. It was used phenotypic (i.e., enzyme production and antifungal resistance)
and molecular biological (URA5-RFLP) experiments. Patients with HIV/AIDS were
the most affected with cryptococcosis. Thirty one (75.5%) of the clinical isolates were
classified as C. neoformans and 9 (22.5%) as C. gattii. High amounts of protease and
phospholipase enzymes were produced by most of the isolates. Using the disk
diffusion test (CLSI M44-A), 81, 35 and 100% of the C. neoformans isolates were
characterized as susceptible to fluconazole, itraconazole and amphotericin B,
respectively, whereas 78, 56 and 100% of the C. gattii isolates were susceptible to
these antimicrobial agents. The average of Minimal Inhibitory Concentration (MIC) for
C. neoformans and C. gattii isolates was 0.26 and 0.58 μg/mL, respectively. The 9
isolates of C. gattii had a fingerprint pattern comparable with the VGII molecular type,
while all 31 isolates of C. neoformans presented with a pattern consistent with the
VNI type. This study confirms the importance of HIV/AIDS for the cryptococcosis
epidemiology, the susceptibility of the isolates to amphotericin B and the high
prevalence of the molecular genotypes VNI and VGII in the north of Brazil.
Keys words: Cryptococcus spp., Epidemiology, Phenotyping, Genotyping
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Características epidemiológicas dos pacientes com
criptococose............................................................................................................. 17
TABELA 2- Suscetibilidade de C. neoformans e C. gattii aos compostos
antifúngicos, medida pela difusão em disco...............................................................18
xi
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
HIV Vírus da imunodeficiência humana mm Milimetro (s) BC British Columbia α Alfa vα-MAT Mating type α a-MAT Mating type a SNC Sistema nervoso central % Porcentagem UV Ultravioleta C. neoformans Cryptococcus neoformans AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida spp. Espécies CMI Concentração Mínima Inibitória µg Micrograma
mL Mililitro min Minuto ºC Graus Celsius FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas PCR Reação em cadeia de polimerase h Hora CGB Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol Pz Atividade enzimática CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute mg Miligrama
xii
μL Microlitro ATL Tissue Lysis Buffer AL Lysis Buffer rpm Rotações por minuto AE Elution buffer DNA Ácido desoxirribonucléico ng Nanograma
Tris 2- amino -2- hidroximetilpropano-1,3-diol HC ℓ Ácido Clorídrico mM Milimolar pH Potencial de hidrogeniônico KCl Cloreto de potássio MgCl2 Cloreto de magnésio
dNTP Desoxirribonucleosídeo (s) trifosfato U Unidade Taq Termus aquaticus μg Micrograma s Segundos V Volt (s) pb Pares de base var. Variedade
xiii
SUMÁRIO
1 . INTRODUÇÃO................................................................................................... 01 1.1 Epidemiologia dos pacientes acometidos por Criptococose........................... 02 1.2 Características fenotípicas dos isolados clínicos do complexo entre C.neoformans-C. gattii............................................................................................ 04 1.3 Grupos moleculares dos isolados de Cryptococcus spp.................................. 05
2. OBJETIVOS........................................................................................................ 06 2.1 Gerais................................................................................................................ 06 2.2 Específicos........................................................................................................ 06
3. METODOLOGIA................................................................................................. 07 3.1 Modelo de Estudo............................................................................................. 07 3.2 Universo de Estudo........................................................................................... 07 3.2.1 Local de Estudo............................................................................................. 07 3.2.2 Isolados do gênero Cryptococcus e linhagens de referência........................ 07 3.2.3 Aspectos éticos.............................................................................................. 07 3.2.4 Financiamento................................................................................................ 07 3.3 Procedimentos.................................................................................................. 08 3.3.1. Características epidemiologicas dos pacientes............................................ 09 3.3.2 Caracterização fenotípica ............................................................................. 09 3.4 Sensibilidade a antifúngicos............................................................................. 10 3.5 Caracterização genotípica................................................................................ 10 3.6 Análise dos resultados...................................................................................... 10 4. RESULTADOS.................................................................................................... 11
5. CONCLUSÃO..................................................................................................... 27
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 28
7. APÊNDICE.......................................................................................................... 31
1
1. INTRODUÇÃO
A criptococose, antigamente conhecida como torulose ou blastomicose
Européia, é uma micose sistêmica que acomete órgãos profundos e a pele,
decorrente da aquisição de propágulos infectantes por via inalatória das espécies de
leveduras patogênicas do complexo C. neoformans apresenta-se de forma
subaguda ou crônica, afetando pacientes imunodeprimidos ou imunocompetentes,
caracterizada pelo tropismo meningoencefálico resultando em elevada mortalidade
na ausência de tratamento 1.
O primeiro caso de infecção humana provocada por Cryptococcus sp. foi
detectado há cerca de 100 anos por Busse e Buschke na Alemanha. Entretanto a
Criptococose começou a receber atenção especial a partir da década de 60. Com o
aumento da população imunocomprometida decorrente da pandemia de HIV e uso
de agentes imunossupressores para a terapia do câncer ou transplantes de órgãos,
a criptococose oportunista transformou-se em uma infecção relativamente comum
neste começo de milênio 2.
A nomenclatura dos agentes causadores da criptococose sofreu diversas
modificações. Sendo ques as mais recentes evidenciavam a existencia das
variedades C. neoformans var. neoformans, C. neoformans var. grubii e C.
neoformans var. gatti e, mais recentemente, entendeu-se a existencia do complexo
C. neoformans que engloba duas espécies de interesse patogênico: C. neoformans
e C. gattii 3,4.
Historicamente a criptococose por espécies do complexo C. neoformans foi
descoberta, descrita e estudada através de sua face oportunística associada a
sarcomas, corticóides, drogas imunossupressoras e co-morbidade. A criptococose
por C. gattii foi identificada pela primeira vez em uma criança com
meningoencefalite e sem fator predisponente na África Central 5.
A infecção criptocócica é adquirida por inalação das leveduras ressecadas
(<3mm) presentes na natureza. A patogenicidade é determinada pela cápsula do C.
2
neoformans que impede a fagocitose e ativação do sistema complemento, e pela
presença da enzima fenil-oxidase dá-se o neurotrofismo do fungo no organismo 5.
O diagnóstico laboratorial é baseado em três fundamentos, todos tendo como
base a demonstração do fungo no material biológico: 1) o isolamento do fungo em
meio de cultura; 2) identificação microscópica; 3) a pesquisa de antígenos
plasmáticos circulantes 1.
Os melhores rendimentos de obtenção da positividade dos resultados para o
diagnóstico laboratorial da criptococose disseminada com acometimento do sistema
nervoso central foram obtidos da análise de Líquor (97,8%), já a forma disseminada
sem o acometimento meníngeo, o espécime biológico de melhor rendimento foi a
urina com 71,6%, superando os índices de hemocultura com 58,8% 6
O conhecimento da criptococose e dos seus agentes (espécies do complexo
C. neoformans) no Norte do Brasil ainda é muito limitado quando comparado às
regiões Sul e Sudeste do país e outras regiões do mundo 7.
1.1 Epidemiológia dos pacientes acometidos por Criptococose
C. neoformans possui distribuição geográfica mundial, enquanto que o C.
gattii é encontrado com maior freqüência em regiões tropicais e subtropicais. Há um
grande interesse em determinar as variedades e sorotipos das espécies do
complexo C. neoformans isolados de pacientes no Brasil, onde todas as espécies
são endêmicas 5.
Um recente surto de infecção por C. gattii, no clima temperado da Ilha de
Vancouver, BC, Canadá, deflagrou o início e a colaboração de pesquisadores no
esforço de investigação deste distúrbio em relação a descrições geográficas,
demográficas, microbiológicas e referenciando as características clínicas dos casos
de criptococose, como também identificar possíveis reservas ambientais
responsáveis pelo surto. Como a maioria dos pacientes eram imunocompetentes, a
infecção criptococcica foi listada como doença notificável em British Columbia,
Canadá. A incidência de infecção por C. gattii entre as pessoas da Ilha de
3
Vancouver, de 1999 para 2003, ficou entre um intervalo de 8,5 a 37 casos por
milhão de residentes por ano. Esta incidência é significativamente grande, quando
comparada à infecção tropical de C. gattii observada na Austrália (0.94 casos por
milhão de residentes por ano) onde o C. gattii é endêmico 8.
Em pacientes hígidos a resposta imunológica celular e humoral delimita a
contaminação por espécies do complexo C. neoformans, caracterizando um quadro
assintomático da criptococose. A resistência da infecção depende da sensibilização
prévia de linfócitos e posterior ativação de macrófagos e neutrófilos, além de uma
resposta humoral mediada por anticorpos opisonizantes 1.
Uma maior susceptibilidade de infecção pelo fungo é manifestada por
alterações da imunidade celular ou humoral, ocasionando a penetração do
microorganismo nas vias respiratórias. A infecção pulmonar é o sintoma preliminar
da aquisição da criptococose, resultando em doença pulmonar progressiva ou foco
pulmonar assintomático, que pode conduzir à disseminação hematogênica e mais
freqüentemente a infecção do SNC ou comprometimento cutâneo. A infiltração
nodular pulmonar é o achado clínico mais freqüente da criptococose pulmonar 3,5.
A criptococose é a micose de caráter sistêmico mais freqüente em pacientes
com AIDS e a terceira causa de doença oportunista do sistema nervoso central
(SNC). Sua prevalência varia de 2,9 a 13,3% representando importante causa de
mortalidade na aids, apesar do tratamento específico. Estudos multicêntricos
internacionais realizados entre 1999 e 2001 demonstraram que a taxa de
mortalidade dos pacientes acometidos de HIV aproximou-se de 69%, sendo que a
maioria dos pacientes que foram ao óbito, ocorreu nos primeiros 30 dias de co-
infecção 9. Estudos prospectivos realizados na região Sudeste do Brasil no período
entre 1998 e 2003, relataram a presença de 96 pacientes com diagnóstico clínico-
laboratorial de criptococose, sendo que destes a maior predominância (81,3%) foi
de pacientes portadores de AIDS 10.
Husain et al11 determinaram que a média de infecção por espécies do
complexo C. neoformans em pacientes transplantados varia de 2,8 a 5,0% e que a
taxa de mortalidade é de 42%. Quanto as manifestações clínicas, os pacientes
4
transplantados apresentaram infecção do Sistema Nervoso Central (SNC) (55%),
seguidos de acometimentos cutâneos (13%) e osteoarticulares (6%).
A literatura descreve que a adoção de terapia antifúngica em casos de
criptococose disseminada reduz a taxa de mortalidade para 20% dos casos e na
ausência da terapêutica o índice de mortalidade atinge 100% dos casos 11.
1.2 Características fenotípicas dos isolados clínicos do complexo entre C.
neoformans-C. gattii
Quatro classes foram identificadas pela reatividade de antígenos capsulares
a soros hiperimunes, denominados sorotipos A, B, C e D 1. C. neoformans
(sorotipos A, D e AD) de distribuição cosmopolita e encontrada com facilidade em
habitat de pombos (Columba sp.) e C. gattii (sorotipos B e C) predominante em
regiões tropicais e subtropicais e originalmente encontrado em restos vegetais de
Eucalyptus camaldulensis.
Espécies patogênicas do complexo C. neoformans são capazes de elaborar
uma estrutura adicional de polissacarídeos fora da parede celular, embora outros
fungos não-patogênicos e outras espécies do complexo C. neoformans também
possam produzir. A cápsula polissacarídica é um fator de virulência do C.
neoformans atuando na resistência à fagocitose mediada por macrófagos,
neutrófilos, sendo decorrente do potencial zeta negativo dos componentes
capsulares, o que provoca repulsão eletrostática 12.
As metodologias de caracterização utilizadas para a caracterização de
isolados de Criptococcus spp. são análise de proteases, fosfolipases, sorotipagem e
sensibilidade a antifúngicos 13.
Enzimas proteolíticas são produzidas pelo fungo em condições naturais e
patológicas, funcionando como fator de virulência das espécies do complexo C.
neoformans. As fosfolipases estão correlacionadas com a penetração tecidual. Os
sorotipos são discriminantes das linhagens prevalentes. A sensibilidade a
antifúngicos determina a evolução terapêutica do paciente frente
antibiótico/quimioterápico utilizado 13.
5
1.3 Grupos moleculares dos isolados de Cryptococcus spp.
Métodos moleculares têm sido desenvolvidos para diagnóstico e
monitoramento de infecções fúngicas, bem como para tipificação dos isolados,
visando principalmente, estudos epidemiológicos. A reação em cadeia de
polimerase (PCR) tem sido a principal ferramenta utilizada no desenvolvimento de
protocolos de detecção de DNA de C. neoformans e C. Gatti i 8.
Além dos sorotipos de C. neoformans e C. gatti, análises moleculares,
incluindo impressões digitais M13, URA5-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), identificaram
oito genótipos moleculares: VNI e VNII (sorotipo A); VNIII AD (híbrido); VNIV
(sorotipo D) e B VGI, VGII VGIII e VGIV (sorotipos e C) 14. A genotipagem molecular
contribui para uma melhor e mais preciso o diagnóstico clínico e caracteriza a
diversidade genética de realização de estudos epidemiológicos15.
Estudos de caracterização molecular em isolados clínicos de pacientes com
meningite criptococcica foram desenvolvidos no Estado do Pará – Brasil,
evidenciando uma prevalência absoluta de tipos , pertencente a espécies de C.
neoformans, além de contribuir com um possível novo perfil de híbridos desta classe
7.
6
2. OBJETIVOS
2.1 Gerais
Investigar as características laboratoriais de isolados clínicos do complexo
Cryptococcus neoformans-C. gattii do Estado do Amazonas - Brasil
2.2 Específicos
• Estudar as características epidemiológicas dos pacientes acometidos
por Criptococose.
• Investigar as características fenotípicas e de sensibilidade a
antifúngicos dos isolados clínicos de Cryptococcus spp causadores de Criptococose
no estado do Amazonas.
• Investigar quais os grupos moleculares dos isolados clínicos de
Cryptococcus spp causadores de Criptococose no estado do Amazonas.
7
3. METODOLOGIA
3.1 Modelo de estudo
Foi realizado um estudo laboratorial e experimental com a finalidade de
caracterizar laboratorialmente isolados do complexo Cryptococcus neoformans-C.
gattii oriundos de pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas – FMTAM.
3.2 Universo de estudo
3.2.1 Local de estudo
Este projeto de pesquisa foi realizado no Laboratório de Micologia da
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
3.2.2 Isolados do gênero Cryptococcus e linhagens de referência
Os 40 isolados foram obtidos de pacientes com Criptococose atendidos
entre março de 2006 a fevereiro de 2008. Estes isolados encontravam-se
preservados na coleção de fungos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.
Para a reativação das culturas foi utilizado o cultivo em Ágar Sabouraud a 30 oC por
48h.
Para genotipagem molecular, as seguintes estirpes padrão foram utilizadas:
WM 148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII),
WM 629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 ( sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII),
WM 161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Essas cepas de
referência foram gentilmente cedidas pela Micoteca da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-
Brasil. Além disso, as amostras de referência WM WM 148 e 178, foram utilizadas
como referência para os ensaios de determinação de espécies com o meio
Canavanina Glicina Azul de Bromotimol (CGB), produção de enzimas e
susceptibilidade a antifúngicos.
8
3.2.3 Aspectos éticos:
Este projeto de pesquisa foi registrado e aprovado pelo CEP-FMT/AM,
Processo n°. 626/2007-FMT-AM, CAAE – 0007.0.114.000-10 (Apendice 1).
3.2.4 Financiamento:
Este estudo foi financiado pela FAPEAM, através do edital N°.014/2006
PPSUS 2006.
3.3 Procedimentos
3.3.1 Características epidemiológicas dos pacientes acometidos por
Criptococose
O perfil epidemiológico dos pacientes (idade, gênero, imunocomprometimento
e procedência) foi obtido através da análise das solicitações de exame existentes no
Laboratório de Micologia da FMTAM.
3.3.2 Caracterização fenotípica
Para diferenciar as espécies de C. neoformans e C. gattii foi utilizado o
meio Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol (CGB) como proposto por Kwon-
Chung 5. As colônias de C. gattii utilizam a glicina como fonte de carbono e
nitrogênio e são resistentes à canavanina, produzindo durante sua incubação em
meio CGB uma coloração azul-cobalto, enquanto que C. neoformans não demonstra
mudança na coloração do meio.
A produção de proteinase e fosfolipase foi verificada segundo Ruchel et al.
16 e Price17, respectivamente. Os isolados foram inoculadas em pontos eqüidistantes
em placas de Ágar proteinase e Ágar fosfolipase e a atividade enzimática (Pz) foi
medida através da razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro da colônia mais a
zona de precipitação.
A prova de sensibilidade foi realizada de acordo com o método de Bauer 18,
recomendado pela Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) documentos
9
M44-A19. Foram utilizados discos impregnados com Fluconazol, Itraconazol e
Anfotericina B. A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para a
Anfotericina B foi realizada pela metodologia E-test-AB BIODISK 20.
3.3.3 Caracterização genotípica
Extração do DNA
Utilizou-se a metodologia de membrana de sílica, a extração do DNA foi
realizado com o kit comercial QIAamp Tissue and Blood – Qiagen. A metodologia foi
realizada como descrita pelo fabricante. As linhagens de Cryptococcus sp. foram
semeadas em meio de cultura contendo Ágar Sabouraud, com antecedência de 48
horas ao início da extração. A biomassa de Cryptcoccus sp. (90 mg) foi retirada dos
meios de cultura e adicionada em microtubo (1,5 mL) contendo 180 μL de tampão
ATL (Tissue Lysis Buffer) e 20 μL de proteinase K (20 mg/mL). Esta mistura foi
incubada por 30 minutos a 56 oC o residual foi macerado com esferas de vidro de
0,5mm até se obter uma mistura homogênea. 200 μL de tampão AL (Lysis Buffer)
foram adicionados e a mistura foi incubada a 70 oC durante 10 minutos. 200 μL de
etanol foram adicionados a mistura que, em seguida, foi transferida para o
microtubo contendo a coluna de sílica. O conjunto foi centrifugado a 8.000 rpm por
um minuto e a coluna foi lavada com 500 µL das soluções AW1 (8.000 rpm por 1
min) e AW2 (12.000 g por 3 min). O DNA foi eluído pela adição de 100 μL de
tampão AE (Elution buffer).
PCR-RFLP doGene URA5
A caracterização genotípica foi realizada conforme previamente descrito
Meyer et al. 8. A PCR do gene URA5 foi realizada em um volume final de 50 uL de
solução e em cada reação continha: 50 ng de DNA, tampão PCR 1X (10 mM Tris-
HCl, pH 8,3, 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2), 0,2 mM de cada um dos dATP, dCTP,
dGTP e dTTP, 3 mM de acetato de magnésio, 1,5 U AmpliTaq DNA polimerase
(Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e 50 ng de cada primer URA5
(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') e SJ01
(5'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC3'). A PCR foi realizada em um termociclador
10
Perkin Elmer-térmico (modelo 480), foi realizada uma desnaturação inicial de 2 min
a 94 °C, e em seguida foram realizados 35 ciclos de, 45 s desnaturação a 94 °C, 1
min de anelamento a 61 °C e 2 min de extensão a 72 °C, seguido por um ciclo de
extensão final por 10 min a 72 °C. Os produtos de PCR foram digeridos com dupla
Sau96I (10 U / mL) e HhaI (20 U / mL) por 3 horas ou durante a noite e separados
por 3% agarose eletroforese em gel de 100 V por 5 h.
.
Eletroforese
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel-
agarose 1,4%, por 6 h à 60 V, corados com brometo de etídio (0,5 μg/ml) e
visualizados sob a luz ultravioleta do transluminador de UV Safe Imager ™
Invitrogen. O marcador O'RangeRuler™50bp DNA Ladder (Fermentas) foi utilizado
para determinação do tamanho dos produtos de PCR fingerprinting. Duas amostras
padrão previamente caracterizadas FMT1733 (C. neoformans-VNI) e FMT1827 (C.
gattii B- VGII) foram utilizadas como amostras padrão.
3.4 Análise dos resultados
Os dados epidemiológicos (idade, gênero, imunocomprometimento e
procedência), obtidos das solicitações de exame, foram tabulados no Programa
Excel – Office Microsoft co objetivo de calcular as freqüências.
Os ensaios de caracterização fenotípica foram feitos em triplicata. No caso
da atividade enzimática e de sensibilidade, o dados quantitativos foram tratados
com o objetivo de determinar média e desvio padrão.
A PCR-fingerprinting foi realizada em duplicata e em triplicata, quando foram
obtidos resultados divergentes.
11
4. RESULTADOS
Os resultados estão apresentados na forma de Artigo Científico que foi
publicado na Revista Iberoamericana de Micología, v. 29, p. 40-43, 2011
(Apêndice 2) e as Normas de formatação dessa revista estão descritas no
Apêndice 3.
Caracterização laboratorial de isolados clínicos do complexo Cryptococcus
neoformans-C. gattii do Estado do Amazonas no Brasil
Babbyngttonn Khell da Silvaa, Ana Karla Freirea, Amaury dos Santos Bentesb,
Ivanete de Lima Sampaioa, Lucilaide Oliveira Santosa, Mirlane Silva dos Santosa and
João Vicente de Souzab
a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas , Manaus/AM, Brasil
b Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus/AM, Brasil
Corresponding Author: Prof. João Vicente Braga de Souza, Laboratório de
Micobacteriologia, Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde, Instituto de
Nacional de Pesquisas da Amazônia, AM . Av. André Araújo, 2936, 69060-001,
Manaus, AM, Brasil.
Tel: 55 92 3643-3057; Fax: 55 92 3643-3057
e-mail: [email protected]
Running title:
Characterisation of clinical isolates of the Cryptococcus sp.
Caracterización de aislados clínicos del Cryptococcus sp.
12
INTRODUÇÃO
A criptococose é uma doença fúngica oportunista causada por leveduras
encapsulada espécies C. neoformans e C. gattii [17]. A infecção é adquirida pela
inalação das leveduras ou esporos dessecados e pode desenvolver para o cérebro
ou outros órgãos sistêmicos [18]. A infecção por Cryptococcus spp. é a principal
causa de meningite por fungos em pacientes imunocomprometidos, resultando em
elevada morbidade e mortalidade [21]. O status de imunocomprometimento é o fator
de risco mais comuns para a infecção com C. neoformans. Além disso, há um
número crescente de pacientes imunocompetentes com meningite causada por C.
gattii [21,32]. O tratamento preferido para a meningite criptocócica é a anfotericina
B, no entanto, a nefrotoxicidade desta droga limita seu uso clínico e aumenta a
importância dos testes de suscetibilidade antifúngica [10,12].
Baseado em estudos sorológicos, utilizando anticorpos contra a cápsula de fungos,
sete sorotipos de Cryptococcus foram identificados: A, B, C, D, AB, AD e BD
[3,5,20]. C. neoformans sorotipos A, D e AD encontram-se nas cidades, enquanto o
C. gattii sorotipos B e C estão predominantemente localizados em regiões tropicais
e subtropicais [1,13,19]. Em 1999, um surto de C. gattii ocorreu no Canadá,
destacando a possibilidade de que ele possa ser localizados em climas tropicais e
temperados [11].
Além dos sorotipos de C. neoformans e C. gatti, análises moleculares, incluindo
impressões digitais M13, URA5-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), identificaram oito genótipos
moleculares: VNI e VNII (sorotipo A); VNIII AD (híbrido); VNIV (sorotipo D) e B VGI,
VGII VGIII e VGIV (sorotipos e C) [17]. A genotipagem molecular contribui para uma
13
melhor e mais preciso o diagnóstico clínico e caracteriza a diversidade genética de
realização de estudos epidemiológicos [24].
O objetivo deste trabalho foi caracterizar isolados Cryptococcus obtidos de
pacientes da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTM), durante 2006-
2008, usando ferramentas fenotípicas e moleculares.
MATERIAIS E MÉTODOS
Isolados e linhagens
Quarenta isolados foram obtidos de pacientes com criptococose, que foram
internados na FMTM entre março de 2006 e fevereiro de 2008. Uma única amostra
foi coletada de cada paciente e os isolados foram armazenados a 4 oC, na coleção
de fungos FMTM. Os isolados foram reativados em ágar Sabouraud a 30 º C por 48
h. Para genotipagem molecular, as seguintes estirpes padrão foram utilizadas: WM
148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII), WM
629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 ( sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII), WM
161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Essas cepas de referência
foram gentilmente cedidas pela Micoteca da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-Brasil. Além
disso, as amostras de referência WM WM 148 e 178, foram utilizadas como
referência para os ensaios de determinação de espécies com o meio Canavanina
Glicina Azul de Bromotimol (CGB), produção de enzimas e susceptibilidade a
antifúngicos.
Informações ao paciente
O perfil epidemiológico dos pacientes (idade, sexo, estado imunológico e de
residência) foi obtida pela análise da requisição de exame.
14
Identificação das espécies
Agar CGB foi utilizado para diferenciar as espécies C. neoformans e C. gattii, como
descrito anteriormente [13]. C. gattii utiliza a glicina como fonte de carbono e
nitrogênio, são resistentes à canavanina e produzem uma cor azul cobalto, durante
a incubação, ao passo que C. neoformans não promove alteração de cor no meio.
Quantificação enzimatica
A produção de proteases e fosfolipases foram quantificadas como previamente
descrito [23,25,33]. Os fungos isolados foram inoculados em pontos eqüidistantes
em placas de agar protease e Agar fosfolipase e atividade enzimática (Pz) foi
calculada a relação entre o diâmetro da colônia (dc) e o diâmetro da colônia e na
zona de precipitação (DCP) . Os resultados foram classificados como negativos (Pz
= 1), positiva (0,64 ≥ Pz <1) ou fortemente positiva (Pz <0,64).
Suscetibilidade aos antifúngicos
Os testes de suscetibilidade foram realizados de acordo com o Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI), documento M44-A [4]. Discos impregnados
com fluconazol (25 mg), itraconazol (10 mg) ou anfotericina B (100 mg) (Cecon-
Sensifungidisc, São Paulo, Brasil) foram utilizados nos ensaios. O diâmetro dos
halos de inibição foi utilizado para determinar a susceptibilidade das leveduras aos
compostos antifúngicos valores de corte foram os seguintes: anfotericina B> 10 mm
- suscetível (S), <10 mm-resistente (R);> itraconazol 20 mm - S, 19 -12 mm -
intermediário (I), <11 mm - R e fluconazol> 19 mm - S; 19-14 mm - I; <14 mm - R. A
determinação do CIM para anfotericina B foi realizada usando o método BIODISK E-
test-AB, como descrito anteriormente [14].
15
Caracterização molecular de genotipagem
A caracterização genotípica foi realizada conforme previamente descrito [17]. O
DNA fúngico foi extraído com o Tissue Kir QIAamp (Qiagen, Alemanha), de acordo
com o protocolo do fabricante para a extração de DNA de levedura, incluindo a
digestão com lyticase e RNAase. A PCR do gene URA5 foi realizada em um volume
final de 50 uL de solução e em cada reação continha: 50 ng de DNA, tampão PCR
1X (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl e 1,5 mM MgCl2), 0,2 mM de cada um dos
dATP, dCTP, dGTP e dTTP, 3 mM de acetato de magnésio, 1,5 U AmpliTaq DNA
polimerase (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e 50 ng de cada primer URA5
(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') e SJ01
(5'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC3'). A PCR foi realizada em um termociclador
Perkin Elmer-térmico (modelo 480), foi realizada uma desnaturação inicial de 2 min
a 94 °C, e em seguida foram realizados 35 ciclos de, 45 s desnaturação a 94 °C, 1
min de anelamento a 61 °C e 2 min de extensão a 72 °C, seguido por um ciclo de
extensão final por 10 min a 72 °C. Os produtos de PCR foram digeridos com dupla
Sau96I (10 U / mL) e HhaI (20 U / mL) por 3 horas ou durante a noite e separados
por 3% agarose eletroforese em gel de 100 V por 5 h
RESULTADOS
As características epidemiológicas dos pacientes com criptococose foram avaliadas.
Os homens foram mais comumente infectados (70%) que o sexo feminino, e a faixa
etária mais acometida foi entre 16-30 anos (53%, mediana = 28,5 anos) (Tabela 1).
A maioria dos pacientes com criptococose estavam também infectados com o HIV
(72%) e residiam na zona leste da cidade de Manaus (25%) (Tabela 1). Na maioria
16
dos pacientes (93%) os microrganismos foram isolados do líquido cefalorraquidiano
(LCR). Os isolados foram inoculados em meio CGB, sendo que 9 foram
caracterizados como C. gattii e 31 como C. neoformans.
Todos os isolados apresentaram alta produção de proteases (Pz <0,64) e média de
Pz = 0,3 para ambas as espécies Cryptococcus. Todos, com exceção de um
isolado, foram positivod para a produção de fosfolipases (Pz média = 0,53). Vinte e
seis isolados de C. neoformans (83,8%) apresentaram resultados forte positivos (Pz
<0,64) e 4 isolados (12,9%) apresentaram resultados positivos (Pz ≥ 0,64 e <1,0),
enquanto todos os 9 isolados de C. gattii foram classificados como fortes produtores
de fosfolipase.
Utilizando o teste de difusão em disco (CLSI M44-A), 81, 35 e 100% dos isolados de
C. neoformans foram identificados como suscetíveis ao fluconazol, itraconazol e
anfotericina B, respectivamente, e 78, 56 e 100% dos isolados de C. gattii foram
sensíveis a esses compostos antifúngicos (Tabela 2). O MIC média para a
anfotericina B foi avaliada pela metodologia E-test, foi de 0,26 ± 0,22 mcg/mL para
C. neoformans e 0,58 ± 0,53 mcg/mL para C. gattii.
17
Tabela 1 - Características epidemiológicas dos pacientes com criptococose.
C. neoformans C. gattii Total %
Gênero
Feminino 9 3 12 30
Masculino 22 6 28 70
Idade (Anos)
0 – 15 0 3 3 8
16 – 30 18 3 21 53
31 – 45 8 2 10 25
46 – 60 3 1 4 10
> 60 1 1 2 5
Infecção pelo HIV
Negativa 0 4 4 10
Positiva 24 5 29 73
Desconhecida 7 0 7 18
Áreas da Cidade de Manaus
Norte 4 1 5 12
Sul 2 1 3 8
Leste 8 2 10 24
Oeste 1 0 1 2
Centro Sul 2 1 3 8
Centro Oeste 4 1 5 12
Desconhecida 10 3 13 33
Amostra Biológica
Líquido cefalorraquidiano 29 8 37 92
Hemocultura 2 0 2 5
Escarro 0 1 1 3
18
Tabela 2- Suscetibilidade de C. neoformans e C. gattii aos compostos
antifúngicos, medida pela difusão em disco.
Antifúngico Suceptível N Intermediário N Resistente N
C. neoformans Fluconazol 80.6% 25 16.1% 5 3.3% 1
Itraconazol 35.4% 11 64.6% 20 0
Anfotericina B 100% 31 0 0
C. gattii Fluconazol 77.7% 7 0 22.3% 2
Itraconazol 55.5% 5 44.5% 4 0
Anfotericina B 100% 9 0 0
O DNA foi extraído de todos os isolados clínicos e foi utilizado para identificar os
genótipos moleculares por URA5-RFLP. Todos os 9 isolados de C. gattii
apresentaram um padrão de eletroforese compatível com o genótipo VGII molecular
e todos os 31 isolados de C. neoformans apresentaram um perfil do tipo molecular
VNI (Figura 1).
DISCUSSÃO
O número total de habitantes no estado do Amazonas é de aproximadamente 3,5
x106 e de acordo com o Serviço de Micologia da Fundação de Medicina Tropical de
Manaus, 20-25 novos casos de criptococose ocorrem anualmente na região.
Manaus, capital do Estado do Amazonas, está localizada próximo do centro da
19
bacia amazônica, na margem esquerda do Rio Negro, constituído por sedimentos
terciários em terra areno-argilosos. A região tem uma precipitação média de 2.300
mm / ano e, portanto, possui um clima quente e úmido e uma vegetação exuberante
[31]. Neste estudo, a incidência de criptococose não foi relacionada a estas
condições meteorológicas, como o número de isolados foi semelhante ao longo do
ano. A identificação de possíveis fontes ambientais de C. neoformans e C. gatii
requer uma investigação mais aprofundada. É de se supor que as fontes de
contaminação são semelhantes às descritas em outros países: infecção humana
com o tipo Cryptoccocus VNI ocorre principalmente por contato com fezes de aves,
e infecção com o tipo VGII geralmente ocorre após o contato com a decomposição
da biomassa vegetal.
Este é um dos primeiros estudos para caracterizar a criptococose no estado do
Amazonas no Brasil. Este estudo determinou que os pacientes mais afetados pela
criptococose eram do sexo masculino, jovem (16-30 anos), o HIV-positivos e os
habitantes da zona leste da cidade de Manaus.
O número de casos de HIV/AIDS notificados anualmente no Estado do Amazonas é
de aproximadamente 700, dos quais metade receberá tratamento com HAART [30].
AIDS é o principal fator de risco para a criptococose, devido à supressão da
resposta imune pelo vírus HIV [9,13,26]. C. neoformans foi à espécie mais
freqüentemente isolada (n = 31; 77,5%), o que é consistente com os 82,3%
relatados na literatura [17,19]. C. neoformans causa quase que exclusivamente a
doença em pacientes imunocomprometidos, e a maioria dos isolados que obtivemos
foi de pacientes com AIDS [17,19]. Entre os nove isolados de C. gattii, três foram
obtidos de pacientes imunocompetentes, quatro de pacientes com AIDS e dois
pacientes sem caracterização quanto ao estado imunológico.
20
Neste estudo, foram obtidos três isolados de crianças com idades entre 0-15 anos.
C. gattii foi o principal agente causador de meningite nestes pacientes. Em um
estudo anterior no Estado Amazonas de 1988-1998, Martins et al. [15] relatou que a
freqüência de criptococose em crianças representavam 33% do total de casos. No
estado do Pará, vizinho do Estado do Amazonas, 19-24% dos casos de
criptococose foram relatados em crianças nos últimos 10 anos [28,29]. Esses
estudos demonstram que na Amazônia, a prevalência da criptococose em crianças
é alta e também está associada com o tipo molecular VGII. Outros estudos
epidemiológicos e amostras ambientais são necessários para definir a importância
das condições ambientais na incidência de casos de criptococose em crianças.
A produção de lipases e proteases está relacionada com a virulência de
Cryptococcus spp [7,8]. Essas enzimas estão envolvidas na destruição das
estruturas celulares do hospedeiro com a finalidade de obter nutrientes para o fungo
e para facilitar a disseminação pelos tecidos. Tanto C. neoformans e C. gattii
produziram proteases e lipases em quantidades semelhantes.
Os testes de sensibilidade antifúngica revelaram que 80 e 77% de sensibilidade ao
Fluconazol de C. neoformans e C. gattii, respectivamente. Essa droga é comumente
usada em pacientes com AIDS, para o tratamento de doenças fúngicas oportunistas
e evitar o surgimento de infecções fúngicas [6,9]. C. neoformans e C. gattii
apresentaram 35 e 55% de sensibilidade para Itraconazol, respectivamente, e de
todos os isolados clínicos foram sensíveis a Anfotericina B. Estes resultados são
consistentes com estudos anteriores [14,22,27]. A Anfotericina B é considerada
padrão-ouro para o tratamento da criptococose [2]. Em um estudo determinação de
resistência a Anfotericina B foi observado que 10% dos isolados clínicos eram
resistentes [5], mas outros estudos demonstram baixa resistência in vitro a este
21
composto [14,27]. Embora todos os isolados tenham sido considerados sensíveis à
Anfotericina B (MIC <2 mg / ml), o MIC média do C. gattii isolados (0,56 mcg / mL)
foi maior que a de C. neoformans isolados (0,26 mcg/mL). Este resultado foi
relatado previamente [14] e destaca a necessidade de diferenças na terapêutica de
infecções por C. neoformans e C. gattii.
A identificação das espécies patogênicas Cryptococcus e sub-espécies são
importantes para a orientação clínica e para a epidemiologia a doença.
Recentemente, resultados falso-positivos para identificação de C. gattii foram
reportados utilizando o método de diferenciação CGB convencionais, devido à
existência de C. neoformans isolados que são resistentes a canavanina [13].
Enquanto isso, a PCR fingerprinting e PCR-RFLP estão sendo utilizadas com mais
freqüência [9,20,24]. No presente estudo, a PCR-RFLP caracterizou os
Cryptococcus isolados como o tipo molecular VNI e VGII. Estes resultados são
consistentes com estudos anteriores que identificaram C. neoformans VNI como o
principal agente da criptococose [13,16,19]. Em um estudo que caracterizaram 63
isolados brasileiros, observou-se a prevalência dos tipos molecular VNI (82,3%),
VGII (13,6%) e VNII (3,0%) [17] e estudos mais recentes no estado do Pará
reforçam a prevalência de VNI e VGII como sendo os principais tipos moleculares
de C. neoformans e C. gattii, respectivamente, na região norte do Brasil [17].
Os dados deste estudo podem ajudar com a gestão atual e futura de criptococose
no Norte do Brasil, identificando a freqüência de C. neoformans e C.gattii em
pacientes bem como a sua suscetibilidade a drogas antifúngicas comumente
usadas. Estes dados também contribuem para estudos epidemiológicos sobre a
distribuição dos diferentes tipos molecular de Cryptococcus spp, na Amazônia
brasileira.
22
AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas
(FAPEAM) pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
1. Bernardo FM, Martins HM, Martins ML. Urban sources of Cryptococcus spp –
Lisbon. Ver Port Clin 2001; 96: 157–160.
2. Brasil, Ministério da Saúde. Documentos e publicações em DST e AIDS.
Coordenação do programa nacional de DTS/AIDS. Epidemiologic Vigilance.
2004; 1 [consulted on 03-22-2009]. Available at: http://www.aids.gov.br.
3. Bovers M, Hagen F,Boekhout T. Diversity of the Cryptococcus neoformans-
Cryptococcus gattii species complex. Rev Iberoam Micol 2008; 25:4-12
4. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for
antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; Approved guideline.
NCCLS document M44-A. Wayne, PA, National Committee for Clinical
Laboratory Standards; 2004.
5. De Bedout C, Ordóñez N, Gómez BL, Rodríguez MC, Arango M, Restrepo A,
Castañeda E. In vitro antifungal susceptibility of clinical isolates of
Cryptococcus neoformans var. neoformans and C. neoformans var. gattii. Rev
Iberoam Micol. 1999; 16: 36–39.
6. Espinel-Ingroff A. Comparison of three commercial assays and a modified
disk diffusion assay with two broth microdilution reference assays for testing
zygomycetes, Aspergillus spp., Candida spp., and Cryptococcus neoformans
with posaconazole and amphotericin B. J Clinical Microbiology 2006; 44:
3616–3622.
23
7. Henry J, Guillotte A, Luberto C, Del Poeta M. Characterization of inositol
phospho-sphingolipid-phospholipase C 1 (Isc1) in Cryptococcus neoformans
reveals unique biochemical features. FEBS Letters. 2011; 585: 635–640.
8. Heung LJ, Kaiser AC, Luberto C, Poeta MD. The role and mechanism of
diacylglycerol-protein kinase C1 signaling in melanogenesis by Cryptococcus
neoformans. J Biol Chem 2005; 280: 28547–28555.
9. Jain N, Wickes BL, Keller SM, Fu J, Casadevall A, Jain P, Ragan MA,
Banerjee U, Fries BC. Molecular epidemiology of clinical Cryptococcus
neoformans strains from India. J Clin Microbiol. 2005; 43: 5733–5742.
10. John RP, Gary MC. Drug resistance in Cryptococcus neoformans. J. Clin.
Microbiol. 1999; 2: 259–269.
11. Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL, Huynh M, Bartlett KH, Fyfe M, Macdougall L,
Boekhout T, Kwon-Chung KJ, Meyer W. A rare genotype of Cryptococcus
gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British
Columbia, Canada). Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 172: 58–63.
12. Kotwani RN, Gokhale PC, Bodhe PV, Kirodian BG, Kshirsagar NA. Safety and
efficacy of liposomal amphotericin B in patients with cryptococcal meningitis.
Assoc Physicians India. 2001; 49: 1086–1090.
13. Kwon-Chung KJ, Sorrell TC, Dromer F, Fung E, Levitz SM. Cryptococcosis:
clinical and biological aspects. Med Mycol. 2000; 38: 205–213.
14. Lozano-Chiu M, Paetznick VL, Ghannoum MA, Rex JH. Detection of
resistance to amphotericin B among Cryptococcus neoformans clinical
isolates: performances of three different media assessed by using E-test and
National Committee for Clinical Laboratory Standards M27-A methodologies.
J Clin Microbiol. 1998; 36: 2817–2822.
24
15. Martins LMS. Epidemiologia da criptococose em crianças e adultos jovens e
diversidade de Cryptococcus neoformans no meio Norte do Brasil. MSc
thesis, Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz, Rio de Janeiro, 2003.
16. Matsumoto MT, Fusco-Almeida AM, Baeza LC; Melhem MSC; Medes-
Giannini MJS. Genotipagem, sorotipagem e determinação de mating-type de
isolados clínicos de Cryptococcus neoformans do Estado de São Paulo,
Brasil. Rev Inst Med Trop S Paulo. 2007; 39: 3–6.
17. Meyer WE, Kidd S, Castañeda A, Jackson S, Huynh M, Latouche GN.
Molecular typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerg
Infect Dis. 2003; 9: 189–195.
18. Moreira TA, Ferreira MS, Ribas RM, Borges AS. Criptococose: estudo clínico-
epidemiológico, laboratorial e das variedades do fungo em 96 pacientes. Rev
Soc Bras Med Trop. 2006; 39: 255–258.
19. Nishikawa MM, Lazera SM, Barbosa GG, Trilles L, Balassiano BR, Macedo
RCL, Bezerra CCF, Pérez MA, Cardarelli P, Wanke B. Serotyping of 467
Cryptococcus neoformans isolates from clinical and environmental sources in
Brazil: analysis of host and regional patterns. J Clin Microbiol. 2003; 41: 73–
77.
20. Ohkusu M, Hata K, Takeo K. Serotype, mating type and ploidy of
Cryptococcus neoformans strains isolated from patients in Brazil. Rev Inst
Med Trop S Paulo. 2002; 44: 299–302.
21. Pappalardo MCSM, Melhem MSC. Criptococose: revisão sobre a experiência
brasileira sobre a doença. Rev Inst Med Trop S Paulo. 2003; 45: 73-78
22. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. In
vitro susceptibilities of clinical isolates of Candida species, Cryptococcus
25
neoformans, and Aspergillus species to itraconazole: global survey of 9,359
isolates tested by clinical and laboratory standards institute broth microdilution
methods. J Clin Microbiol. 2005; 43: 3807–3810.
23. Price MF, Wilkinson ID, Gentry IO. Plate method for detection of
phospholipase activity in Candida albicans. Sabouraudia. 1982; 20: 15–20.
24. Ribeiro MA, Ngamskulrungroj P. Molecular characterization of environmental
Cryptococcus neoformans isolated in Vitoria, ES, Brazil. Rev Inst Med Trop S
Paulo. 2008; 50: 25-28
25. Ruchel R, Uhlemann K. A comparison of secretory proteinases from different
strains of Candida albicans. Sabouraudia. 1982; 20: 233–244.
26. Rude TH, Toffaletti DL, Cox GM, Perfect JR. Relationship of the glyoxylate
pathway to the pathogenesis of Cryptococcus neoformans. Infect Immun.
2002; 70: 5684–5694.
27. Salgal G, et al. Unusual presentation of central nervous system Cryptococcal
infection in an immunocompetent patient. Am J Neuroradiol. 2005; 26: 2522–
2526.
28. Santos WR, Meyer W, Wanke B, Costa SPSC, Luciana T, Nascimento JLM,
Medeiros R Primary endemic Cryptococcosis gattii by molecular type VGII in
the state of Pará, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008; 103: 813–818.
29. Santos WR, Meyer W, Wanke B, Costa SPSC, Luciana T, Nascimento JLM,
Medeiros R Caracterização dos isolados clínicos de espécies do complexo
Cryptococcus neoformans em Belém do Pará, Norte do Brasil. Congresso
Brasileiro de Micologia; 2007.
26
30. Silva LCF, Santos EM, Silva NAL, Miranda AE, Talhari S, Toledo LM. Padrão
da infecção pelo HIV/AIDS em Manaus, Estado do Amazonas, no período de
1986 a 2000. Rev Soc Bras Med Trop. 2009; 42: 543–550.
31. Silva ML, Silva MSR Perfil da qualidade das águas subterrâneas de Manaus.
Holos Environment. 2007; 1: 1–13.
32. Sorrell TC. Cryptococcus neoformans variety gattii. Med Mycol. 2001; 39:
155–168.
33. Vidotto V, Melhem M, Pukinskas S, Aoki S, Carrara C, Pugliese A.
Extracellular enzymatic activity and serotype of Cryptococcus neoformans
strains isolated from AIDS patients in Brazil. Rev Iberoam Micol. 2005;22:29-
27
5. CONCLUSÕES
Este estudo confirma a importância do HIV/AIDS para a frequência da criptococose,
demonstrou a susceptibilidade dos isolados a Anfotericina B e a prevalência dos
genótipos molecular VNI e VGII no norte do Brasil.
28
6. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS
1. Lacaz CS. Tratado de Micologia médica. 9a. ed. São Paulo. Elsevier, 2002.
2. John RP, Gary MC Drug resistance in Cryptococcus neoformans. American
Journal of Epidemiology. 1999; 2: 259–269.
3. Kwon-Chung KJ, Bennett JE Epidemiologic differences between the varieties
of Cryptococcus neoformans. American Journal of Epidemiology. 1984; 120:123-
130.
4. Andrade G A aspectos fenotípicos e genotípicos de isolados ambientais da
região de Araraquara. Dissertação de Mestrado da USP - Ribeirão Preto – São
Paulo. 2003.
5. Kwon-Chung KJ, Bennett JE Cryptococcosis In: Camilo-Coura L, Febiger (eds)
Medical Mycology. Philadelphia 1992; 397-446.
6. Ribeiro MA, Ngamskulrungroj P. Molecular characterization of environmental
Cryptococcus neoformans isolated in Vitoria, ES, Brazil. Rev Inst Med Trop S
Paulo. 2008; 50: 25-28
7. Santos LO. Criptococose no estado do Amazonas: estudo de 75 casos
diagnosticados na Fundação de Medicina Tropical/FMT/IMTM, Manaus, AM
(1988-1998), Dissertação de Mestrado, Instituto Oswaldo Cruz-Fiocruz, Rio de
Janeiro 154 pp. 2000.
8. Meyer WE, Kidd S, Castañeda A, Jackson S, Huynh M, Latouche GN. Molecular
typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerg Infect Dis.
2003; 9: 189–195
9. Staib F. Cryptococcus neoformans and cryptococcosis. Peculiarities and
challenge: opening lecture of second International Conference on
29
Cryptococcus and cryptococcosis. Milan (Italy), September 19-23, 1993. Journal
Mycology Medical 1994; 4:56-60.
10. Moreira TA, Ferreira MS, Ribas RM, Borges AS. Criptococose: estudo clínico-
epidemiológico, laboratorial e das variedades do fungo em 96 pacientes. Rev
Soc Bras Med Trop 2006; 39(3):255-258.
11. Husain S, Wagener MM, Singh N Cryptococcus neoformans in organ
transplant recipients: Correlates of variability in clinical characteristics and
outcome. Emerg Infect Dis 2001;7:375-381.
12. Doering T L How does Cryptococcus get its coat? Trends in Microbiology
2000; 8:547.
13. Lengeler KB, Cox GM, Heitman J. Serotype AD strains of Cryptococcus
neoformans are diploid or aneuploid and are heterozygous at the mating-type
locus. Infect Immun 2001; 69:115–22.
14. Fries BC, Goldman LD ,Casadevall A Phenotypic switching in Cryptococcus
neoformans. Review Microbes and Infection 2002; 4: 1345–1352.
15. Ribeiro MA, Ngamskulrungroj P. Molecular characterization of environmental
Cryptococcus neoformans isolated in Vitoria, ES, Brazil. Rev Inst Med Trop S
Paulo. 2008; 50: 25-28
16. Ruchel R, Uhlemann K A comparison of secretory proteinases from different
strains of Candida albicans. Sabouraudia. 1982; 20: 233–244.
17. Price MF, Wilkinson ID, Gentry IO. Plate method for detection of
phospholipase activity in Candida albicans. Sabouraudia. 1982; 20: 15–20.
18. Bauer A W & et al - Antibiotic Susceptibility testing by a Standardized single
disc method; Amer. J. Clin. Pathol., 45: 493-496, 1966
30
19. CLSI. Reference method for antifungal disk diffusion susceptibility testing
of yeasts; Approved Guideline. NCCLS document M44-A. Wayne, PA: National
Committee for Clinical Laboratory Standards; 2004
20. Lozano-Chiu, M. & et al - Detection of resistance to amphotericin B among
Cryptococcus neoformans clinical isolates: performances of three different
media assessed by using E-test and National Committee for Clinical
Laboratory Standards M27-A methodologies. J. Clin. Microbiol., 36: 2817-2822,
1998
31
7 APÊNDICES
7.1 Parecer do Comitê de Ética 1
APROVAÇAO Nº 1852
Registro CEP Nº 0626-07
Ao se proceder à análise relativo do Projeto em questão, o Comitê de Ética em
Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
(FMT-AM), em sessão ordinária do dia 24 de agosto de 2007 e de acordo com as
atribuições definidas na Resolução CNS 196/96, manifesta-se pela aprovação do
projeto de pesquisa proposto, bem como o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido.
Situação do Protocolo: APROVADO
Manaus, 24 de agosto de 2007.
Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira
Coordenador de Ética em Pesquisa FMT-AM
Obs: Cabe ao pesquisador elaborar e apresentar ao CEP, os relatórios parciais e final sobre a pesquisa (Resolução do Conselho Nacional de Saúde nº196, de 10.10.1996, inciso IX.2, letra “c”) conforme o
Formulário de acompanhamento dos Projetos aprovados no CEP, disponível em nossa home Page.
CAAE – 0009.0.114.000-07
Processo Nº0626/2007-FMT-AM
Projeto de Pesquisa: Avaliação da concentração mínima de Anfotericina B,
Fluconazol, Intraconazol e Voriconazol necessária para inibição de linhagens de
Cryptococcus neofarmans causadoras de neurocriptococose..\
Pesquisador responsável: João Vicente Braga de Souza
Instituição Sediadora: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
Instituição Vinculada: Não se aplica
Área Temática Especial: Não se aplica
Patrocinador: FAPEAM/PAIC
Registro para armaz. de mat. Biológico humano: Não se aplica
Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas
Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos
Av. Pedro Teixeira, 25 – Dom Pedro
Cep: 69040-000
Manaus – Amazonas - Brasil
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7.2 Artigo Publicado
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7.3 Normas para publicação na Revista Ibero Americana de
Micologia
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