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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
Renata Barbosa
Avaliação estrutural e bioquímica por imagem de ressonância
magnética em modelo de epilepsia do lobo temporal em ratos com estado de
mal epiléptico
Structural and biochemical evaluation by magnetic resonance
imaging in temporal lobe epilepsy model in rats with status epilepticus
CAMPINAS
2020
Renata Barbosa
Avaliação estrutural e bioquímica por imagem de ressonância
magnética em modelo de epilepsia do lobo temporal em ratos com estado de
mal epiléptico
Structural and biochemical evaluation by magnetic resonance
imaging in temporal lobe epilepsy model in rats with status epilepticus
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção
do título de Doutora em Ciências.
Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of the University of
Campinas in partial fulfilment of the requirements for the degree of
Doctor in Science.
ORIENTADOR: FERNANDO CENDES
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
RENATA BARBOSA E ORIENTADA PELO PROF.
DR. FERNANDO CENDES
CAMPINAS
2020
Agência(s) de fomento e n°(s) de processo(s): FAPESP e CAPES, processo FAPESP n°:
((2014/11277-6) / (2017/25029-2)), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP).
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
RENATA BARBOSA
ORIENTADOR: PROF. DR. FERNANDO CENDES
MEMBROS:
1. PROF. DR. FERNANDO CENDES
2. PROF. DR. FÁBIO ROGERIO
3. PROF. DR. ENRICO GHIZONI
4. PROF. DR. MARINO MUXFELDT BIANCHIN
ATA]caso haja
5. PROF. DRA. CARLA ALESSANDRA SCORZA BAHI
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema
de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Data da Defesa: 20/02/2020
DEDICATÓRIA
A minha tão querida e amada avó Ilza (in memorian) por toda demonstração de
amor em vida. Te amarei eternamente.
A minha família por toda paciência e compreensão em tantos momentos de minha
ausência.
A todos os meus colegas de profissão, profissionais de saúde, que neste momento
estão na linha de frente no combate da pandemia da doença respiratória COVID-19.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador o Prof. Dr. Fernando Cendes pelo exemplo admirável e
inspirador de pesquisador e pela oportunidade e confiança em poder realizar este projeto
pioneiro e desafiador. Obrigada por todos os ensinamentos e por contribuir nesse meu processo
de amadurecimento.
Aos meus colaboradores por todo o esforço e empenho. A Mônica, a Juliana, ao
Raphael e ao Brunno por toda a dedicação nas aquisições das imagens cerebrais dos ratos, pelas
noites que deixaram suas famílias e estiveram ao meu lado repetindo inúmeras vezes os
protocolos para que pudéssemos obter as melhores imagens possíveis e claro; por todas as
caronas após os nossos experimentos noturnos.
A Luciana Ramalho por toda colaboração e amizade durante todo o
desenvolvimento deste projeto.
Ao Alexandre e ao André por compartilharem suas experiências com modelos
animais e contribuírem significativamente para o desenvolvimento deste projeto.
Ao Laboratório de Controle de Qualidade Sanitária do Centro Multidisciplinar para
Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) da Unicamp
por disponibilizarem o espaço para que pudéssemos alojar nossos animais e realizarmos todos
os experimentos necessários.
A Elayne Vieira por toda colaboração e amizade, meu exemplo de humildade,
inteligência e amor pela ciência.
A minha tão querida amiga Tânia, por me ensinar todos os dias o verdadeiro
significado de amizade e estar ao meu lado em todos os momentos da minha vida. Nesse
momento, sempre me amparando e se fazendo presente nos momentos de angústia e cansaço
extremo durante essa jornada.
Ao Prof. Dr. Luiz Concha Loyola do Laboratório de Conectividade Cerebral
(Universidad Nacional Autónoma de México – Campus Juriquilla) e ao seu aluno Omar por
todo o conhecimento compartilhado e auxílio durante todos os meses em que estive em seu
laboratório realizando as análises das imagens.
Ao Hospital São Francisco de Americana, em especial, a Márcia e a Lucilene, por
compreenderem este momento difícil de conclusão de um doutorado e facilitarem para que eu
pudesse finalizar essa etapa da minha trajetória profissional.
A todas as pessoas que eu conheci e convivi no laboratório de neuroimagem da
Unicamp, vocês fazem parte desta história.
A Deus por permitir que mais esse sonho se tornasse realidade e por ser o meu
alicerce hoje e sempre.
O presente trabalho foi realizado com auxílio financeiro da Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Processos: (2014/11277-6) / (2017/25029-2)) e
com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES)
– Código de Financiamento 001.
EPÍGRAFE
“Tudo posso naquele que me fortalece.”
Filipenses 4:13
RESUMO
O hipocampo é a região cerebral mais investigada em pacientes e modelos experimentais de
epilepsia. A esclerose hipocampal está particularmente associada com a epilepsia do lobo
temporal e compõe um conjunto de alterações que ocorrem durante o processo epileptogênico
em consequência de um insulto precipitante e ainda discutido no sistema nervoso central. De
fato, os mecanismos fisiopatológicos envolvidos neste processo seguem não totalmente
esclarecidos. O presente estudo teve como objetivo avaliar alterações estruturais e metabólicas
no hipocampo dorsal de ratos Wistar através de técnicas de neuroimagem antes e após a indução
de status epilepticus com pilocarpina. Os animais foram divididos em dois grupos: grupo sham
(n=13) e grupo pilocarpina (n=25). Foram adquiridas imagens basais e posteriormente nos
períodos de 48 horas, 15 dias e 30 dias pós-tratamento utilizando um aparelho de 3 Tesla da
Philips e uma bobina dedicada para ratos. Imagens ponderadas em T2, por tensor de difusão
(DTI) e metabólicas e bioquímicas (espectroscopia de prótons) foram adquiridas. A taxa de
mortalidade após indução de status epilepticus foi de 41,67%. Os dados de neuroimagem
demonstraram dano no hipocampo dorsal pós-tratamento com pilocarpina. Esses danos foram
caracterizados por redução do volume hipocampal, diminuição de anisotropia fracionada 15
dias pós-tratamento e aumento da difusividade radial 15 e 30 dias pós-tratamento sugerindo
dano neuronal; desmielinização e dano axonal. Os níveis metabólitos de N-acetil-aspartato +
N-acetil-aspartil-glutamato/Creatina e Glumato + Glutamina/Creatina estiveram reduzidos em
48 horas pós-tratamento podendo indicar dano neuronal e/ou disfunção do metabolismo
energético. Portanto, nossos achados demonstraram danos significativos no hipocampo dorsal;
evidenciando alterações longitudinais estruturais e metabólicas pós-tratamento com
pilocarpina.
Palavras-chave: epilepsia do lobo temporal; neuroimagem; modelo animal.
ABSTRACT
The hippocampus is the brain region most investigated in patients and experimental models of
epilepsy. Hippocampal sclerosis is particularly associated with temporal lobe epilepsy and
comprises a set of changes that occur during the epileptogenic process as a result of an initial
insult and still discussed in the central nervous system. Indeed, the pathophysiological
mechanisms involved in this process remain unclear. The present study aimed to evaluate
strucutural and metabolic changes in the dorsal hippocampus of Wistar rats using neuroimaging
techniques before and after induction status epilepticus with pilocarpine. The animals were
divided into two groups: sham group (n=13) and pilocarpine group (n=25). Baseline and
subsequent images were acquired at 48 hours, 15- and 30-days post-treatment using a 3 Tesla
scanner (Philips) and a special coil for rats. T2-weighted, diffusion tensor (DTI), and metabolic
and biochemical (proton magnetic resonance spectroscopy) images were acquired. The
mortality rate after pilocarpine-induced status epilepticus was 41.67%. Neuroimaging data
demonstrated damage to the dorsal hippocampus after pilocarpine-treatment. These damages
were characterized by hippocampal volume reduction, decreased in fractional anisotropy 15
days post-treatment and increased in radial diffusivity 15- and 30-days post- treatment
suggesting neuronal damage, demyelination and axonal damage. Metabolic levels of N-acetyl-
aspartate + N-acetyl-aspartyl-glutamate/Creatine and Glutamate + Glutamine/Creatine were
reduced at 48 hours post-treatment, which may indicate neuronal damage and/or dysfunction of
energy metabolism. Therefore, our findings demonstrated significant damage in the dorsal
hippocampus; showing longitudinal structural and metabolic changes after pilocarpine-
treatment.
Key-words: temporal lobe epilepsy; neuroimaging; animal model.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ILAE: do inglês, International League Against Epilepsy, ou Liga Internacional Contra Epilepsia
SE: status epilepticus
ELT: epilepsia do lobo temporal
CA: Cornu Ammonis
GABA: do inglês, Gamma-AminoButyric Acid, ou ácido gama-aminobutírico
ELTM: epilepsia do lobo temporal mesial
EEG: eletroencefalograma
RM: ressonância magnética
DTI: do inglês, diffusion tensor imaging, ou imagem por tensor de difusão
ADC: do inglês, apparent diffusion coefficient, ou coeficiente de difusão aparente
FA: do inglês, fractional anisotropy, ou anisotropia fracionada
MD: do inglês, mean diffusivity, ou difusividade média
AD: do inglês, axial diffusivity, ou difusividade axial
RD: do inglês, radial diffusivity, ou difusividade radial
ROI: do inglês, region of interest, ou região de interesse
ERM: espectroscopia por ressonância magnética
NAA: N-acetil-aspartato
ppm: partes por milhão
Cr: creatina
PCr: fosfocreatina
Cho: colina
Glu: glutamato
Gln: glutamina
TE: tempo de eco
ms: milissegundo
NAAG: N-acetil-aspartil-glutamato
GPC: glicerofosfocolina
PCh: fosfocolina
Glx: glutamato mais glutamina
FOV: field of view, campo de visão
TR: tempo de repetição
TSE: turbo spin eco
VOI: voxel of interest
FWHM: do inglês, full width at half maximum, ou largura à meia altura do pico
PFA: paraformaldeído
vs: versus
SUMÁRIO
1.0 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 15
1.1 EPILEPSIA.................................................................................................................. 15
1.2 EPILEPTOGÊNESE.................................................................................................... 17
1.3 EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL E ESCLEROSE HIPOCAMPAL................... 19
1.4 MODELO EXPERIMENTAL DE EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL
INDUZIDO PELA PILOCARPINA.................................................................................
21
1.5 EPILEPSIA E NEUROIMAGEM............................................................................... 23
1.6 JUSTIFICATIVA........................................................................................................ 31
1.7 OBJETIVOS................................................................................................................ 32
1.7.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................. 32
1.7.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................... 32
2.0 METODOLOGIA........................................................................................................ 32
2.1 INDUÇÃO DE STATUS EPILEPTICUS COM PILOCARPINA............................... 34
2.2 AQUISIÇÃO DAS IMAGENS CEREBRAIS POR RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA....................................................................................................................
35
2.3 ANÁLISES DAS IMAGENS CEREBRAIS POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA 35
2.4 ALTERAÇÃO DE VOLUME VENTRICULAR DE RATOS DA LINHAGEM
WISTAR..............................................................................................................................
39
2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................................... 39
3.0 RESULTADOS........................................................................................................... 40
3.1 VOLUMETRIA HIPOCAMPAL DORSAL............................................................... 42
3.2 DADOS DO TENSOR DE DIFUSÃO........................................................................ 44
3.3 DADOS METABÓLICOS.......................................................................................... 47
4.0 DISCUSSÃO GERAL................................................................................................. 53
5.0 LIMITAÇÕES DO ESTUDO E PERSPECTIVAS FUTURAS................................. 60
6.0 CONCLUSÃO............................................................................................................. 61
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................
8.0 ANEXO........................................................................................................................
62
77
15
1.0 INTRODUÇÃO
1.1 EPILEPSIA
A epilepsia é caracterizada por uma predisposição persistente a gerar crises
epilépticas espontâneas, com impacto neurobiológico, cognitivo, psicológico e social. É
importante ressaltar que a epilepsia não é uma condição única, mas pode corresponder a
transtornos de etiologias diversas e que compartilham um aumento anormal da predisposição
às crises epilépticas [1].
As crises epilépticas são eventos clínicos determinados por sinais e/ou sintomas
característicos devido à atividade neuronal síncrona ou excessiva no cérebro. A apresentação
das crises depende do foco de início no cérebro, padrões de propagação, maturidade cerebral,
tratamento farmacológico e uma diversidade de outros aspectos. A função sensorial, motora e
autonômica, nível de consciência, estado emocional, memória, cognição e comportamento
podem ser comprometidos [1].
De acordo com a Liga Internacional Contra Epilepsia (International League Against
Epilepsy – ILAE), a epilepsia pode ser definida pela presença de pelo menos uma das seguintes
condições clínicas: (a) duas crises epilépticas espontâneas (ou reflexas) ocorrendo num
intervalo maior que 24 horas; (b) uma crise espontânea (ou reflexa) e probabilidade de novas
crises semelhantes ao risco de recorrência (ao menos 60%) após duas crises espontâneas,
ocorrendo nos 10 anos seguintes e (c) diagnóstico de uma síndrome epiléptica [2]. Contudo,
com o intuito de coordenar estudos populacionais, a Comissão de Epidemiologia da ILAE
sugere que a epilepsia seja definida como duas ou mais crises epilépticas espontâneas que
ocorram com pelo menos 24 horas de intervalo [3].
Ainda nesta nova classificação proposta pela ILAE, a epilepsia pode ser
considerada como resolvida em pacientes que tiveram uma síndrome epiléptica idade-
dependente, mas que agora ultrapassaram a faixa etária vulnerável ou que não apresentaram
crises nos últimos 10 anos e não utilizaram drogas antiepilépticas nos últimos 5 anos [2].
A etiologia da epilepsia é dividida em idiopática, adquirida (sintomática) e
criptogênica (presumida sintomática) [4-6]. A epilepsia idiopática é caracterizada pela ausência
de lesão estrutural subjacente no cérebro ou outro sinal ou sintoma neurológico, no qual
acredita-se ser de origem genética e geralmente tem seu início na infância. A epilepsia adquirida
apresenta crises epilépticas como uma consequência de uma ou mais lesões estruturais
visualizadas no cérebro. Já a epilepsia criptogênica refere-se a epilepsia que se acredita ser
sintomática, porém com causa não identificada [4-5].
16
As crises, por sua vez, segundo seu foco de início, de maneira simplificada podem
ser divididas em focal, generalizada e de origem desconhecida. As crises focais são originadas
em um hemisfério do cérebro, enquanto as crises generalizadas envolvem os dois hemisférios
cerebrais simultaneamente [7].
O status epilepticus (SE) é considerado a forma mais extrema de uma crise. Em
2015 uma nova definição conceitual foi proposta pela Comissão de Classificação e
Terminologia e a Comissão de Epidemiologia da ILAE, onde o SE foi definido como uma
condição decorrente da falha dos mecanismos responsáveis por cessar uma crise convulsiva ou
do início de mecanismos que desencadeiam crises irregularmente prolongadas (mais que 5
minutos). Tal condição pode ter consequências após longa duração (após 30 minutos), como
morte e lesão neuronal, alteração nas redes neuronais dependendo do tipo e duração das crises
[8].
A epilepsia é um transtorno cerebral frequente que afeta cerca de 46 milhões de
pessoas ao redor do mundo [9]. Sua prevalência diferencia-se entre os países conforme aspectos
considerados, como fatores de risco e etiológicos, número de crises ao diagnóstico, epilepsia
ativa ou casos de remissão.
A epilepsia ativa é estabelecida pelo tratamento medicamentoso regular com drogas
antiepilépticas ou quando a última crise epiléptica ocorreu nos últimos 5 anos [3].
Em uma revisão sistemática e meta-análise de estudos internacionais a prevalência
da epilepsia ativa foi de 6,38 por 1000 indivíduos, ao passo, que a prevalência ao longo da vida
foi de 7,60 por 1000 indivíduos. A incidência cumulativa anual de epilepsia foi de 67,77 por
100.000 indivíduos e a taxa de incidência foi de 61,44 por 100.000 indivíduos/ano. A idade, o
sexo ou a qualidade do estudo não divergiram na prevalência da epilepsia entre os trabalhos.
As epilepsias idiopáticas e aquelas com crises generalizadas foram as mais prevalentes. Os
países de baixa e média renda demonstraram maior prevalência e incidência. [10].
Estudos epidemiológicos brasileiros determinaram a prevalência de epilepsia em
diferentes cidades brasileiras no país. Em São Paulo, a prevalência foi de 11,9 para cada 1000
indivíduos, todavia esse estudo não determinou dados epidemiológicos distintos de epilepsia
ativa e inativa [11]. Em Porto Alegre, a taxa foi de 16,5 para cada 1000 indivíduos para a
epilepsia ativa e 20,3 para cada 1000 indivíduos para epilepsia inativa [12]. Já em São José do
Rio Preto a prevalência foi de 18,6 para cada 1000 indivíduos, sendo 8,2 para epilepsia ativa
(ao menos uma crise nos últimos dois anos) [13].
Apesar da alta prevalência e do impacto decorrente da epilepsia, até o presente
momento, o mecanismo da epileptogênese segue apenas parcialmente compreendido e a falta
de biomarcadores confiáveis são fatores limitantes para intervenções efetivas [14-15].
17
1.2 EPILEPTOGÊNESE
A epileptogênese é caracterizada por um processo complexo que pode transcorrer
de meses a anos. Um cérebro normal torna-se funcionalmente alterado e passa a gerar atividade
elétrica que desencadeia crises epilépticas crônicas, como na epilepsia do lobo temporal (ELT)
[16].
Esse processo é dividido em três fases: o insulto inicial precipitante, o período
latente (ausência de crises) e o desenvolvimento da ELT caracterizada por episódios de crises
espontâneas recorrentes.
A fase inicial da lesão é caracterizada por um insulto ao cérebro, como por exemplo:
uma lesão traumática cerebral, um processo infeccioso, exposição à neurotoxina, acidente
vascular cerebral, entre outros. Esses insultos ativam cascatas celulares, como inflamação,
oxidação, apoptose, neurogênese e plasticidade sináptica, levando a alterações estruturais e
funcionais nos neurônios, desencadeando a epileptogênese [17].
A fase latente é representada por um subsequente rearranjo do circuito sináptico,
dano neuronal, neurogênese e hiperexcitabilidade sincronizada. Essa fase tem duração variável,
ausência de manifestações clínicas e é considerada a principal oportunidade para uma
intervenção preventiva [17-18]. Estudos evidenciam que alterações neurobiológicas que
ocorrem na fase latente são progressivas mesmo após o diagnóstico de epilepsia [19-20].
Alterações latentes acabam resultando em atividade convulsiva espontânea,
marcando o início da fase crônica [17]. A fase crônica é estabelecida como o estado de
hiperexcitabilidade neuronal crônica e hipersincronia. É indicada por crises focais complexas
espontâneas recorrentes com ou sem generalização secundária [21] e está associada com
reorganização sináptica, brotamento axonal, inflamação, perda celular variável nas regiões de
Cornu Ammonis (CA) 1, CA3 e astrocitose reativa [22].
A epileptogênese segue como alvo de investigação. Os modelos experimentais têm
contribuindo fortemente ao longo dos anos para uma melhor compreensão dos seus
mecanismos. Em uma revisão sobre a patogênese da epilepsia, Hui e colaboradores (2013)
descreveram sobre as diversas vias biológicas e moleculares e alterações estruturais e funcionais
envolvidas na epileptogênese [23].
A hiperexcitabilidade neuronal na epilepsia é decorrente do desequilíbrio entre a
excitação mediada pelo neurotransmissor glutamato e a inibição mediada pelo neurotransmissor
ácido gama-aminobutírico (Gamma-AminoButyric Acid - GABA) [23-24].
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no cérebro, gera potenciais
pós-sinápticos excitatórios despolarizando os neurônios [23,25-26].
18
A regulação dos receptores do glutamato [23,27-29], elevação da sua concentração
extracelular [23,30-31], anormalidades no transporte glutamatérgico [23,31-32] e mecanismo
autoimune [23,33] são processos moleculares envolvidos no início e na progressão da epilepsia.
Esses processos cooperam para a atividade glutamatérgica excessiva que desencadeia a
hiperexcitabilidade na epilepsia [23,24].
Em contrapartida, O GABA é o principal neurotransmissor inibitório; gera
potenciais pós-sinápticos inibitórios hiperpolarizando os neurônios [23,34-35].
O sistema GABAérgico tem um papel marcante em suprimir as descargas
epileptiformes [23,34]. Supõe-se que, com a redução ou perda da inibição GABAérgica haja
um aumento da possibilidade de geração de potenciais de ação favorecendo a epileptogênese
[23-24,36].
Os processos GABAérgicos sugeridos incluem: comprometimento na liberação do
GABA [23,37], alterações nos receptores GABAérgicos [23,38-39], comprometimento na
síntese do GABA [23,40-41] e perda neuronal [23,42-43].
A neurogênese hipocampal aberrante também foi proposta como importante na
patogênese da epilepsia [23,44-45]. Inúmeras alterações estruturais, neuroquímicas e celulares
podem ocorrer após crises agudas [23,46].
A perda dos neurônios do hilo do giro denteado e dos neurônios piramidais em CA1
e CA3, o brotamento axonal aberrante e sinaptogênese das fibras musgosas e a perda de
interneurônios GABAérgicos inibitórios são descritos após as crises agudas [23,46].
O brotamento das fibras musgosas, que são axônios das células granulares do giro
denteado, abrange sua reorganização sináptica para formar novos contatos sinápticos com
localização anormal, a terceira camada molecular do giro denteado ou região supra granular
[47-48]. Essa reorganização estrutural seria atribuída à eliminação de sinapses devido a morte
neuronal das células musgosas, que são os principais neurônios excitatórios no hilo denteado
[23,48-49].
Como resultado do brotamento axonal e da sinaptogênese na via das fibras
musgosas, os novos circuitos neuronais passam a integrar um circuito excitatório recorrente nas
células granulares denteadas que aumenta o impulso (entrada) excitatório e promove a
epileptogênese [23,48-49].
Alterações celulares também estão presentes no hipocampo após crises agudas,
como aumento da neurogênese, migração anormal das células granulares recém-geradas para o
hilo denteado e a camada molecular denteada, e também a ocorrência de dendritos basais hilares
recém-adicionados nas células granulares [23,44-46]. Essas alterações podem criar um circuito
aberrante que favorece a geração da atividade epileptiforme [23].
19
A apoptose é um processo de morte celular programada para manter a homeostase
celular [23,50]. Estudos experimentais e clínicos sugerem que a perda neuronal ocorre após
insultos cerebrais e a via apoptótica, além de outros mecanismos como a neurotoxicidade
mediada pelo glutamato, pode estar envolvida nessa perda celular [23,51-54].
1.3 EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL E ESCLEROSE HIPOCAMPAL
A ELT pode ser classificada de acordo com a origem anatômica do foco epiléptico,
sendo dividida em epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) e epilepsia do lobo temporal
lateral (neocortical). A ELTM envolve as estruturas anatômicas mais internas do lobo temporal
como o hipocampo, o giro para-hipocampal e a amígdala. Essa é a forma mais comum de crises
no lobo temporal e frequentemente é secundária à esclerose hipocampal [55].
As epilepsias de origem focal correspondem a uma taxa de 60% de todas as
epilepsias, sendo a originada no lobo temporal o tipo mais frequente. Em torno de 48 a 56%
desses casos ocorrem bilateralmente [55-56].
As causas mais comuns das crises no lobo temporal são: a esclerose hipocampal,
processos infecciosos, tumores, lesão traumática no cérebro, anomalias vasculares, fatores
genéticos e fatores desconhecidos [55].
A ELTM é o tipo mais frequente de epilepsia focal, tendo a esclerose hipocampal o
achado neuropatológico mais frequente na maioria dos pacientes. Crises febris prolongadas, um
período sem crises, crises com início na metade para o fim da infância, auras que podem
inicialmente ocorrer isoladas, períodos de remissão de crises durante a adolescência e início da
vida adulta são rotineiramente descritos na ELTM com esclerose hipocampal. Com esse
processo em curso, crises epilépticas estão associadas a uma grande parcela de refratariedade
ao tratamento medicamentoso e alterações cognitivas [57].
Como já descrito na epileptogênese, toda essa condição neurológica desordenada,
particularmente em consequência de um desequilíbrio de neurotransmissores excitatórios e
inibitórios, com foco primário no lobo temporal, desencadeia a epileptogênese [23].
Alguns estudos demonstraram que a taxa de remissão de crises está em torno de
60% a 80% nos pacientes pós-cirúrgicos com ELT e esclerose hipocampal [58-61]. Todavia,
alguns pacientes não são submetidos a cirurgia devido a critérios clínicos, como por exemplo,
foco bilateral, ou até mesmo pela vontade do paciente em não querer realizar a cirurgia.
Em roedores, o hipocampo é subdividido em dorsal (septal) e ventral (temporal)
correspondendo em humanos aos eixos posterior e anterior [62-63]. De maneira generalizada,
20
a porção dorsal do hipocampo está localizada próxima ao córtex retrosplenial e a porção ventral
está localizada próxima ao complexo amigdaloide [64].
A esclerose hipocampal é o achado neuropatológico mais frequentemente
observado e mais investigado ao longo dos anos e apresenta uma variedade de subtipos. A perda
neuronal predominantemente em CA1, CA3, CA4 e giro denteado, brotamento de fibras
musgosas e gliose são comumente observados nos espécimes cirúrgicos [55,65].
Em 2013 uma nova classificação histopatológica baseada nos achados de perda
neuronal e gliose da esclerose hipocampal foi proposta pela ILAE. Esta classificação é dividida
em três subtipos: a) tipo 1: compromete os setores de CA1 e CA4; b) tipo 2: compromete
predominantemente CA 1 e c) tipo 3: compromete predominantemente CA4. Essa
categorização pode contribuir na classificação de resultados pós-cirúrgicos e no controle de
crises epilépticas. Um tipo 4 adicional foi descrito sendo identificada gliose, mas não perda
neuronal [66].
A incidência de esclerose hipocampal ou ELTM não está definida na população em
geral devido a maior parte dos estudos serem baseados em dados pós-cirúrgicos [67]. A
porcentagem de pacientes com ELTM com esclerose hipocampal com poucas crises ou crises
controladas também é desconhecida [68]. Todavia, crises relacionadas com esclerose
hipocampal geralmente são resistentes ao tratamento farmacológico [69-70].
A relação entre a esclerose hipocampal e ELTM refratária tem sido bastante
abordada ao longo dos anos, no entanto, sua etiologia e os mecanismos responsáveis pelos
quais a esclerose hipocampal influencia nas crises epilépticas ainda são obscuros [71].
Existem várias hipóteses fisiopatológicas sobre a esclerose hipocampal, já que o
hipocampo é frequentemente envolvido em crises epilépticas, mesmo que essas crises não
sejam geradas nessa estrutura. Se a esclerose hipocampal é uma causa ou efeito das crises, é
algo discutível na literatura [72], no entanto, acredita-se que sua causa seja multifatorial; a
contribuição de crises febris, predisposição genética, fatores inflamatórios e neurológicos são
discutidos [73]. A inibição GABAérgica comprometida, a neurotoxicidade do glutamato,
disfunção mitocondrial, excitação sináptica via brotamento axonal, alterações na função ou
distribuição dos canais iônicos também são discutidos [74-75].
A neuroimagem e o eletroencefalograma (EEG) são instrumentos extremamente
relevantes para o diagnóstico de ELT, pois podem contribuir para a identificação do foco
epiléptico e possivelmente desvendar possíveis redes epilépticas.
A atrofia cerebral na esclerose hipocampal pode afetar as redes anatômicas e
funcionalmente conectadas ao hipocampo [76-77]. Devido as crises convulsivas estarem
21
associadas a redes neurais sincronizadas, outras regiões corticais e subcorticais, tanto ipsi
quanto contralaterais ao foco epileptogênico podem ser comprometidas [78-79].
1.4 MODELO EXPERIMENTAL DE EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL INDUZIDO
PELA PILOCARPINA
Como um modelo experimental de ELT, o modelo induzido pela pilocarpina, droga
extraída do Pilocarpus jaborandi foi proposto inicialmente há 36 anos por Turski e
colaboradores (1983) e tem sido amplamente utilizado para investigar os mecanismos
fisiopatológicos da ELT. A pilocarpina atua nos receptores colinérgicos muscarínicos como um
agonista parcial, induzindo uma atividade epiléptica de longa duração seguida de dano cerebral
[80]. A epileptogênese é desencadeada pelo SE induzido pela administração da pilocarpina [80-
81].
A administração da pilocarpina para indução de SE pode ser por via intraperitoneal
ou intra-hipocampal. A via intra-hipocampal tem a vantagem de uma redução significativa na
taxa de mortalidade, em torno de 71% [82]. O uso do lítio tem sido amplamente aceito e
viabiliza diminuir a dose de pilocarpina necessária para indução de SE em ratos, isso, porque
ele parece elevar a sensibilidade da pilocarpina em ratos pré-tratados [83].
Esse modelo experimental reproduz várias características da ELT em humanos,
desde similaridades com a patologia, alterações comportamentais e a ocorrência de crises
parciais e generalizadas. Danos neuronais na formação hipocampal, córtex piriforme e
entorrinal, tálamo, neocórtex e substância nigra foram descritos [84].
É importante ressaltar algumas características deste modelo: a indução de SE por
administração intraperitoneal de pilocarpina é mais rápida do que no modelo de ácido caínico.
É também caracterizado pela presença de um período latente seguido pelo aparecimento de
crises espontâneas recorrentes (fase crônica) [85] e pela ocorrência de lesões generalizadas em
áreas cerebrais semelhantes à de pacientes com ELT. A reorganização das redes neuronais nas
regiões hipocampal e para-hipocampal (brotamento das fibras musgosas, perda neuronal e
proliferação ectópica de células granulares denteadas) é um fenômeno observado em pacientes
com ELT e em animais tratados com pilocarpina [86]. Essa droga também induz uma elevação
na concentração de glutamato no hipocampo após o surgimento de crises epilépticas [87].
O SE neste modelo pode desencadear um insulto excitotóxico resultando em danos
celulares imediatos que transcorrem dentro de minutos a algumas horas e também em um
processo prolongado de neurodegeneração que pode se desenvolver de semanas a meses após
o insulto inicial [80-81,85,88]. As taxas de mortalidade estão entre 30-40% para ratos Wistar
22
machos tratados com 300-400mg/kg de pilocarpina [80,84,89].
As alterações comportamentais e eletroencefalográficas podem ser divididas em
três fases: o período agudo que evolui gradualmente para um SE límbico que dura até 24 horas,
o período latente que pode variar de 4 a 44 dias e o período crônico com a presença de crises
espontâneas recorrentes [88].
Devido a diferentes dosagens de pilocarpina administradas para indução de SE, a
duração do período latente pode variar dependendo do protocolo utilizado. Em ratos Wistar
tratados com 380mg/kg de pilocarpina, o período latente pode durar de 1 a 6 semanas, com um
intervalo de tempo médio de 14,8 dias [89]. As doses de 380-400mg/kg induzem pequenas
diferenças no tempo de início das crises espontâneas [90]. Contudo, é importante ressaltar
também que a duração de SE influencia na duração do período latente. Os ratos submetidos a
SE por 30 minutos e tratados com uma única injeção intraperitoneal de diazepam (10mg/kg) e
pentobarbital (30mg/kg) não desenvolveram crises espontâneas. Em contrapartida, os animais
que foram submetidos a SE por uma, duas, seis ou várias horas, o período latente foi bastante
variado (entre 14 a 52 dias) [90].
As alterações neuropatológicas também podem variar de acordo com a dose de
pilocarpina administrada. As doses mais altas de pilocarpina podem aumentar a chance de
indução da síndrome completa e redução do período latente para SE, porém aumentam a taxa
de mortalidade [83].
No período latente, os animais que recebem pilocarpina geralmente não apresentam
alterações comportamentais e eletroencefalográficas [89]. Todavia, acredita-se que durante o
período latente fenômenos fisiopatológicos relacionados a epileptogênese podem ocorrer, como
o brotamento das fibras musgosas, perda neuronal, religação dos circuitos sinápticos, ativação
de células da glia e proliferação celular ectópica [19,91].
Salami e colaboradores (2014) descobriram que a transição da fase latente para a
fase crônica é paralela a mudanças dinâmicas no pico inter-ictal e na expressão de oscilações
de alta frequência no córtex entorrinal e CA3 [92].
As crises espontâneas, caracterizando a fase crônica, são semelhantes às crises
parciais complexas em humanos, com frequência geralmente de 2 a 3 vezes por semana [88].
Entretanto, a frequência destas crises também pode variar de acordo com a metodologia
utilizada para o monitoramento destes animais (inspeção visual, monitoramento por vídeo ou
EEG) e o tipo de crises (parciais ou generalizadas) [89-90].
23
1.5 EPILEPSIA E NEUROIMAGEM
A ressonância magnética (RM) é uma ferramenta de imagem com a capacidade de
identificar alterações estruturais e funcionais no cérebro. Ao gerar um campo magnético, pulsos
de radiofrequência e gradientes de campo, uma máquina de RM pode fornecer imagens
radiológicas do cérebro e de outros órgãos do corpo [17].
As imagens anatômicas geralmente são obtidas por tempos de relaxamento únicos
(T1 e T2). Os tempos de relaxamento podem ser obtidos regulando os parâmetros da sequência
de pulso na RM [17]. Imagens ponderadas em T1 são rotineiramente utilizadas em humanos
para avaliar detalhes anatômicos e as imagens ponderadas em T2 para investigar lesões
patológicas. Os tempos de relaxamento de T1 e T2 são baseados no tempo de relaxamento da
água em diferentes tecidos. Os tecidos com maior quantidade de água têm um tempo maior de
relaxamento [17].
Em modelos animais de SE, o tempo de relaxamento em imagens ponderadas em
T1 e T2 aumenta após o início de SE e atinge o pico em 24 horas [93-94], com normalização
do contraste dentro de 48 a 72 horas.
Com o avanço tecnológico e ferramentas de neuroimagem cada vez mais eficientes
nos processos clínicos de investigação na epilepsia, a RM tem sido considerada a ferramenta
padrão-ouro para essas avaliações, pode revelar sinais de esclerose hipocampal, caracterizada
por uma redução volumétrica, perda da estrutura interna e hipersinal (T2) no hipocampo [95],
além de outras alterações subjacentes, como tumores e malformações corticais [95-97]. Ainda
assim, a RM qualitativa e quantitativa pode não detectar a esclerose hipocampal leve, observada
em análises histopatológicas [98].
A atrofia hipocampal em humanos é descrita em quase 90 a 95% dos pacientes
quando técnicas volumétricas são utilizadas [99], podendo ser simétrica bilateralmente, mas é
frequentemente unilateral ou assimétrica [98]. Em torno de 80 a 85% dos pacientes apresentam
aumento do sinal em T2, 10 a 95% apresentam sinal em T1 diminuídos e a perda da estrutura
interna é observada em 60 a 95% dos casos [98].
As alterações no sinal em T2 na RM tem sido rotineiramente descritas em várias
fases do processo epileptogênico em modelos animais, tendo o edema, a gliose e a perda celular
as alterações patológicas mais comuns [93,100-101]. Alterações na volumetria e morfologia do
hipocampo e outras estruturas límbicas também são descritas em modelos de SE [102-105]. As
imagens ponderadas em T2 são altamente eficazes para identificar edema, micro hemorragias,
extensão de lesão e atrofia microestrutural em modelos animais de epilepsia [102,106-108].
24
O desenvolvimento progressivo de atrofia pode ser observado com aumento
ventricular, diminuição no tamanho do hipocampo e afinamento cortical dentro de semanas a
meses após indução de SE em animais [102,108-109].
Uma outra modalidade de imagem de RM, a imagem por tensor de difusão
(Diffusion Tensor Imaging – DTI) foi apresentada por Basser e colaboradores (1994) e tornou-
se umas das técnicas de RM mais utilizadas em estudos do cérebro e na prática clínica [110].
O DTI calcula a magnitude e a direção da difusão da água ao longo de três auto
vetores principais (direções x, y e z) e permite a quantificação não invasiva sobre a
microestrutura da substância cinzenta e branca no cérebro [111]. Observou-se que o movimento
ou difusão das moléculas de água é mais rápido ao longo das fibras da substância branca do que
perpendicular a elas. A diferença entre esses dois movimentos (paralelo e perpendicular às
fibras, denominado anisotropia por difusão) é a base do DTI [110,112]. A difusão da água é
restrita perpendicularmente aos axônios mielinizados e propaga-se mais livremente
paralelamente aos feixes de fibras mielinizadas, fornecendo o método pelo qual a substância
branca é caracterizada [113].
Estudos prévios com modelos experimentais de ELT induzido por pilocarpina ou
ácido caínico ressaltaram a sensibilidade de imagens por difusão na constatação de dano
cerebral precoce [114-116].
A integridade axonal pode ser propriamente avaliada por essa técnica que é baseada
na difusão da água e em sua direcionalidade em três dimensões. Devido a organização paralela
das fibras nervosas, a difusão da água é prejudicada perpendicularmente pelas membranas ao
eixo principal (anisotrópico) [117-119]. Em contrapartida, em um meio que não possui barreiras
ao movimento da água, como o líquido cefalorraquidiano, a difusão da água é isotrópica.
O DTI proporciona estrutura para aquisição, análise e quantificação da difusão na
substância branca [112]. Ele quantifica a difusão em várias direções e usando a decomposição
do tensor, obtém as difusividades paralela e perpendicular às fibras [110,112,120]. Essas
difusividades são utilizadas, por exemplo, para o cálculo do coeficiente de difusão aparente
(Apparent Diffusion Coefficient – ADC) ou a anisotropia fracionada (Fractional Anisotropy –
FA) [112].
Uma das principais vantagens do DTI é que ele pode mensurar as principais
difusividades independente do posicionamento das fibras. Existe um esquema de cores
rotineiramente utilizado para avaliar a orientação das fibras. Neste esquema, a cor vermelha
indica as fibras que cruzam da esquerda para a direita; cor verde: as fibras que cruzam antero-
posteriormente e cor azul: as fibras estão cruzadas infero-superiormente (Figura 1) [121].
25
Figura 1: Imagem ilustrativa do presente estudo, sequência coronal de cérebro de rato Wistar
por mapa de cores. A orientação das fibras é representada frequentemente pelas cores
vermelha, verde e azul, outras cores visualizadas são decorrentes da junção entre essas cores.
Cores intensas expressam maior difusão local.
A anisotropia pode ser quantificada por voxel usando a FA, variando de 0
(totalmente anisotrópico) a 1 (a difusão é favorecida em um eixo e dificultada nos outros dois)
[112,117]. O índice de FA é alto quando os tratos das fibras estão normais, a difusão da água é
anisotrópica. Já o índice diminuído de FA está relacionado com fibras degeneradas [117,122-
123].
A difusividade média (Mean Diffusivity – MD) é composta pela difusividade axial
(Axial Diffusivity – AD) e difusividade radial (Radial Diffusivity – RD) que correspondem a
difusividade paralela e perpendicular [124-125]. O aumento da MD é indicativo de uma
desorganização na estrutura, a RD é um bom indicador de dano na mielina e AD é um indicador
de dano axonal, como inchaço axonal, degeneração walleriana e dano axonal [126].
O edema citotóxico e extracelular pode alterar a difusão da água em processos
patológicos subjacentes à epilepsia. Estudos experimentais demonstraram que o edema
26
citotóxico diminui inicialmente a difusão e é decorrente da inabilidade em manter uma alta
concentração de sódio extracelular e uma baixa concentração de sódio intracelular. O gradiente
de osmolaridade transfere a água para as células, desencadeando em inchaço celular. Uma
diminuição no ADC é inicialmente observada, seguida posteriormente por um aumento que é
específico para a resolução do edema citotóxico. As alterações no ADC estão correlacionadas
com hiperexcitabilidade crônica nos modelos de epilepsia pós-trauma cerebral e pilocarpina
[127-128]. Além disso, alterações no ADC foram descritas em ratos que desenvolveram crises
límbicas espontâneas no modelo de epilepsia de estimulação elétrica hipocampal [129].
As modificações específicas na camada do hipocampo após vários insultos
cerebrais epileptogênicos podem ser evidenciadas com DTI de alta resolução. O aumento de
FA no giro denteado de ratos vários meses após indução de SE foi associado com brotamento
de fibras musgosas e reorganização axonal na camada molecular externa. Sugerindo desta
forma a potencialidade do DTI em identificar a plasticidade estrutural no nível axonal no
processo epileptogênico [130].
Estudos em humanos utilizando regiões de interesse (Region Of Interest – ROI)
demonstraram alterações no hipocampo unilateral na ELTM com esclerose hipocampal.
Geralmente o índice de FA está reduzido e o índice de MD aumentado no foco ipsilateral, mas
alterações contralaterais também são descritas [131-135]. As mudanças no DTI também podem
ser evidenciadas em outras estruturas, além do hipocampo ipsilateral, como cápsula externa,
corpo caloso, entre outras [136-137]. Além disso, sugere-se que o DTI pode auxiliar na
localização do foco das crises na ELT [131-132,138-139].
A espectroscopia por ressonância magnética (ERM) de prótons é uma outra técnica
de neuroimagem que se diferencia por sua capacidade de quantificar metabólitos cerebrais de
forma não invasiva. É um método que pode ser adicionado ao protocolo tradicional de aquisição
de imagens de RM convencional. Por meio da ERM é possível comparar metabólitos
provenientes de tecidos patológicos e normais e identificar alterações que geralmente precedam
as alterações anatômicas. É utilizada para auxílio em diagnósticos, monitorar e investigar a
progressão e patogênese da doença e tratamentos terapêuticos [140].
Quanto aos metabólitos quantificados por essa técnica, em um cérebro normal os
principais metabólitos são: o N-acetil-aspartato (NAA) que representa o pico mais proeminente
na posição 2.0 partes por milhão (ppm), a creatina (Cr)/fosfocreatina (PCr) na posição 3.0ppm,
compostos contendo colina (Cho) na posição 3.2ppm e glutamato (Glu)/glutamina (Gln) na
posição aproximada de 2.4ppm (Figura 2). Na Figura 3 é possível visualizar os metabólitos
cerebrais em cérebro de rato Wistar após indução de SE com administração de pilocarpina
intraperitoneal.
27
Figura 2: Imagem ilustrativa do presente estudo. Espectroscopia de voxel único de cérebro de
rato Wistar de ressonância magnética basal com tempo de eco (TE) longo (135 milissegundo
(ms)) analisado pelo programa LCModel.
Figura 3: Imagem ilustrativa do presente estudo. Espectroscopia de voxel único de cérebro de
rato Wistar de ressonância magnética 15 dias após indução de status epilepticus com tempo de
eco (TE) longo (135 milissegundo (ms)) analisado pelo programa LCModel.
28
O metabólito mio-inositol geralmente é quantificado em TE curto e está localizado
aproximadamente na porção 3.5ppm do espectro. Em condições cerebrais normais, um outro
metabólito, o lactato, não pode ser visualizado, devido a sua concentração baixa em um cérebro
adulto [140].
A importância desta técnica na epilepsia se deu devido a possibilidade de uma
melhor compreensão da fisiopatologia metabólica das redes hiperexcitáveis e da necessidade
de melhor identificar o foco epiléptico, visto que muitos pacientes com epilepsia podem
apresentar imagens estruturais de RM sem alterações. Na epilepsia, a escolha do voxel único é
priorizada em especial quando o foco epiléptico já foi determinado [141]. O tamanho e o
posicionamento adequado do voxel para obter as informações da região específica de interesse
sem contaminação das áreas adjacentes podem fornecer dados valiosíssimos.
A força da intensidade do sinal depende da concentração dos metabólitos. Por
exemplo, metabólitos como o NAA tem cerca de 1/10.000 de intensidade do sinal de água nos
espectros de prótons. A presença de um grande sinal de água, em especial, na ERM de prótons,
é um problema, porque dificulta na detecção de sinais espectroscópicos menores. Desta forma,
para que a intensidade do sinal da água seja reduzida é necessário utilizar técnicas para a
supressão da água. Um pulso de pré-saturação seletivo de deslocamento químico é comumente
utilizado [142].
O NAA é um aminoácido encontrado em altas concentrações no sistema nervoso
central e periférico. Sua função não está totalmente esclarecida, todavia, acredita-se que atue
como um osmólito, uma forma de armazenamento de aspartato e seja um precursor do N-acetil-
aspartil-glutamato (NAAG). Também é considerado um marcador de densidade e
viabiabilidade neuronal [140-141]. Sua síntese ocorre apenas nas mitocôndrias neuronais e está
vigorosamente correlacionada com o metabolismo oxidativo [141]. Por outro lado, o NAAG
tem como função modular a transmissão glutamatérgica e parece ter um papel de neuroproteção
e plasticidade sináptica [143].
A creatina como um elemento chave da fosfocreatina é altamente adequada como
um fator de normalização para parâmetros energéticos. Também é encontrado nos neurônios,
mas sua maior concentração está nos astrócitos. Além disso, é sugestiva na identificação de
regiões com disfunção energética e neuronal [141].
O pico da colina surge do sinal de vários componentes, principalmente da
glicerofosfocolina (GPC), fosfocolina (PCh) e colina [140,142]. A colina está sobretudo
relacionada com a síntese e decomposição das membranas celulares, degradação da mielina ou
gliose. Níveis aumentados de colina e creatina também estão correlacionados com astrócitos e
oligodendrócitos [142].
29
O mio-inositol usualmente elevado em edema leve, o glutamato, como o principal
neurotransmissor excitatório e o GABA como o principal neurotransmissor inibitório são outros
metabólitos quantificados pela ERM e investigados na epilepsia. Muitos estudos em epilepsia
consideram a creatina, o NAA e a colina os principais compostos químicos relevantes para
investigação [141].
A função do mio-inositol também não está totalmente compreendida. Considera-se
que ele seja essencial para o crescimento celular, um osmólito e uma fonte de armazenamento
de glicose. Está localizado principalmente na glia e o seu aumento pode ser considerado como
um marcador de gliose [140].
O excesso de glutamato nas células neurais pode ser tóxico e desencadear morte
neuronal. A glutamina é uma forma precursora e de armazenamento do glutamato e está
localizada principalmente nos astrócitos. A glutamina e o glutamato são muito semelhantes e
difícil de serem separados em campo magnético de baixa intensidade [140].
Para identificar o metabólito GABA é necessário um campo magnético de 3 Tesla
ou superior. Os picos pequenos dos espectros interligados ao GABA estão localizados na porção
3.02ppm, sobrepostos pelo NAA, creatina e glutamato + glutamina (Glx), lamentavelmente,
dificultando seu estudo na ERM de prótons in vivo pela sobreposição destes metabólitos.
Algumas sequências especiais foram elaboradas ao longo dos anos para evitar a sobreposição
de sinal, mesmo assim, a implementação técnica permanece difícil. A concentração do GABA
na substância cinzenta cortical é muito baixa, sendo extremamente difícil uma quantificação
fidedigna. O GABA é um neurotransmissor inibitório que previne e finaliza as crises
epilépticas. O GABA e Glx seguramente determinam o foco epiléptico em termos bioquímicos
[142].
Um estudo realizado por Hugg e colaboradores (1993) já evidenciava a capacidade
da ERM de prótons em localizar corretamente o foco epiléptico na ELT em humanos. Este
estudo demonstrou níveis reduzidos de NAA na formação do hipocampo afetado. Esse achado
corroborrou com os dados histopatológicos de esclerose mesial temporal, caracterizada com
perda neuronal seletiva e gliose no foco epileptogênico. Comparativamente, a ERM identificou
corretamente o foco das crises epilépticas em todos os oito pacientes investigados, em
contrapartida, a RM localizou corretamente sete dos oito pacientes investigados e a tomografia
computadorizada detectou corretamente dois de cinco pacientes investigados [144].
Níveis reduzidos de NAA podem ser um marcador precoce de tecido cerebral
cronicamente epileptogênico em humanos e de morte neuronal. A concentração de colina é duas
a três vezes maior nas células da glia do que nos neurônios [143].
Na epilepsia, o achado mais descrito é a redução de NAA nas regiões
30
hipocampal/temporal. Reduções de NAA/Cr, NAA/Cho e NAA/(Cr+Cho) expressam disfunção
ou perda neuronal e gliose reativa de astrócitos [146-148].
O NAA geralmente está reduzido na região de esclerose hipocampal e ELTM
[147,149], mas também pode estar reduzido em regiões distantes dos focos epileptogênicos
[149] e no hipocampo contralateral normal [150-152]. O pico reduzido de NAA na ELTM,
especialmente na esclerose hipocampal pode também ser decorrente de disfunção mitocondrial,
não correlacionada com perda de células neuronais [153].
Não existe um consenso sobre os picos de colina e creatina na literatura. Há relatos
de níveis aumentados e níveis reduzidos na ELTM [150-151,154-155].
Níveis aumentados de Glx na ELT considera-se que seja reflexo de
hiperexcitabilidade do foco epiléptico [156].
Considera-se que picos significativamente elevados de mio-inositol na ELTM estão
associados com gliose no hipocampo [147].
Quanto aos modelos animais, estudos com o modelo animal de ácido caínico
demonstraram redução de NAA no córtex piriforme, amígdala e hipocampo [157], aumento
significativo no período ictal e posteriormente diminuição na fase inter-ictal e pós-ictal. O
aumento de lactato também foi evidenciado [158]. No modelo da pilocarpina, estudos também
demonstraram diminuição do NAA na fase aguda [159], latente [160] e crônica [161]. Níveis
aumentados de lactato e diminuição da colina também são descritos no modelo da pilocarpina.
É possível que a diminuição da colina seja decorrente da depleção do sistema colinérgico [100].
Em uma revisão sobre distúrbios nas interações astrócitos-neurônio na fase aguda,
latente e crônica de modelos animais de ELT, Hadera e colaboradores (2015) descreveram sobre
o potencial do glutamato, glutamina e NAA como marcadores da epileptogênese. Esta revisão
expõe dados analisados por ERM de tecidos cerebrais que receberam glicose (um substrato para
neurônios e astrócitos) e acetato (um substrato apenas para astrócitos) [162].
Alterações metabólicas não foram observadas imediatamente após SE no modelo
de pentilenotetrazol, porém a rotatitivade do glutamato diminuiu. No modelo de ácido caínico,
um dia após SE os níveis metabólitos não foram alterados, mas os astrócitos estavam reagindo,
aumentando a rotavidade da Gln, resultando em mais rotulagem do glutamato e GABA. Neste
modelo, o NAA estava diminuído na fase latente [162].
Uma diminuição progressiva de NAA/Cr após SE foi observada no modelo da
pilocarpina, atingindo um platô no segundo dia após SE (25% abaixo do controle). Essa redução
foi mantida durante a epileptogênese em ratos epilépticos [162].
No modelo de ácido caínico, os astrócitos normalizaram o metabolismo quando os
níveis de NAA não estavam alterados e o metabolismo neuronal aumentou, mas o metabolismo
31
diminuiu quando os níveis de NAA também diminuiram na formação hipocampal e o glutamato
aumentou no neocórtex [162].
Na fase crônica, nos modelos de pilocarpina e ácido caínico, o metabolismo
neuronal esteve extremamente diminuido, como resultado da morte neuronal evidenciada pela
redução de NAA, mas o metabolismo dos astrócitos parecia normal [162].
A função dos astrócitos na epileptogênese está longe de ser compreendida. Sabe-se
que os astrócitos podem exercer uma função compensatória nas fases iniciais em resposta ao
sofrimento neuronal. A fase latente parece ser o momento primordial para uma intervenção para
prevenir morte neuronal e hipermetabolismo astrocitário [162].
Os distúrbios neurológicos estão cada vez mais sendo descritos como os principais
motivos de morte e incapacidade ao redor do mundo. Com a prevalência de distúrbios
neurológicos incapacitantes aumentando com o envelhecimento progressivo da população
mundial, sistemas que visam o tratamento, reabilitação e apoio a distúrbios neurológicos serão
cada vez mais necessários. Na epilepsia, uma melhor compreensão dos mecanismos
fisiopatológicos da epileptogênese e consequentemente a elaboração de estratégias eficazes de
prevenção e tratamento serão cada vez mais necessárias ao longo dos anos.
Um biomarcador de epilepsia pode mensurar características de um processo
epileptogênico patológico ou normal. O diagnóstico e tratamento na epilepsia sofrem a falta de
biomarcadores. A identificação de biomarcadores confiáveis poderia facilitar o diagnóstico,
contribuir com ajustes de doses de medicações em uso, auxiliar nas avaliações pré-cirúrgicas e
melhorar o custo-efetividade de novos medicamentos e ensaios clínicos para tratamento,
prevenção e controle da epilepsia [163].
Estudos longitudinais de neuroimagem em modelos animais são essencialmente
úteis, pois permitem a possibilidade de induzir, avaliar e monitorar processos patológicos ao
longo do tempo. Desta forma, esses estudos podem contribuir para a descoberta de
biomarcadores confiáveis para epileptogênese através da neuroimagem.
1.6 JUSTIFICATIVA
A epilepsia é uma das condições neurológicas mais frequente e desafiadora ao redor
do mundo. O tratamento geralmente é farmacológico e/ou cirúrgico, mas as drogas
antiepilépticas costumam desencadear efeitos colaterais adversos, e em torno de 30% dos
pacientes não respondem ao tratamento farmacológico. Mesmo em caso de resposta ao
tratamento, esses medicamentos podem não interromper ou interferir no processo da
epileptogênese [14,164]. Desta maneira, terapias que possam prevenir ou reverter a
32
epileptogênese são necessárias. Nesse sentido, os modelos animais de epilepsia têm contribuído
de forma significativa na expansão do conhecimento dos mecanismos e desafios propostos pela
doença, pois oferecem a possibilidade de investigar diferentes estágios da epileptogênese, algo
que até o momento ainda não é possível em seres humanos.
1.7 OBJETIVOS
1.7.1 OBJETIVO GERAL:
Determinar alterações de neuroimagem no hipocampo dorsal antes e durante os
primeiros trinta dias após indução de status epilepticus e comparar com o grupo sham, a fim de
procurar um possível marcador de neuroimagem para avaliar alterações estruturais e
metabólicas relacionadas com a epileptogênese e consequentemente uma melhor compreensão
das suas fases progressivas.
1.7.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
✓ Quantificar a volumetria do hipocampo dorsal bilateral para identificar atrofia
hipocampal;
✓ Avaliar os valores de anisotropia fracionada (FA), difusividade radial (RD) e
difusividade axial (AD) para verificar alterações microestruturais no hipocampo dorsal;
✓ Mensurar os valores de N-acetil-aspartato+ N-acetil-aspartil-glutamato (NAA+NAAG),
Glutamato+Glutamina (Glx) e Glicerofosfocolina+Fosfocolina (GPC+PCh) in vivo para
caracterizar alterações metabólicas no hipocampo dorsal.
2.0 METODOLOGIA
Este projeto foi avaliado e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da
Universidade Estadual de Campinas – CEUA/Unicamp (Protocolo n° 3620-1). O projeto está
de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotados pela Sociedade
Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e com a legislação vigente, lei n°
33
11.794 de 8 de outubro de 2008, que estabelece procedimentos para o uso científico de animais
e o decreto n° 6899 de 15 de julho de 2009.
Trata-se de um estudo longitudinal e experimental com ratos Wistar adultos jovens,
machos e livres de agentes patogênicos específicos (Specific Pathogen Free (SPF)) oriundos
do Biotério do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em
Animais de Laboratório (CEMIB) da UNICAMP e do Centro de Inovação e Ensaios Pré-
clínicos (CIEnP) de Florianópolis -SC e mantidos no Laboratório de Controle de Qualidade
Sanitária (CEMIB) com condições controladas de iluminação (ciclos de 12 horas (luz/escuro),
alojados em gaiolas de acrílico (um animal por gaiola) para observação e com acesso a comida
e água durante todo o processo experimental.
O hipocampo dorsal foi definido como a estrutura cerebral de interesse para
investigação devido a sua maior facilidade para visualização em imagens estruturais de
ressonância magnética e posteriormente a quantificação dos dados de neuroimagem,
principalmente após danos induzidos pela administração da pilocarpina intraperitoneal.
Todos os animais foram submetidos aos exames de RM (antes e após indução de
SE) para aquisições de imagens com uma bobina volumétrica especial de 8 canais (Rapid
Biomedical GmbH, Würzburg, Alemanha) integrada com recursos para posicionamento,
fixação e anestesia desses animais, utilizando um scanner de 3 Tesla Intera Achieva Scanner
(Philips, Best, Netherlands) (Figura 4).
As aquisições das imagens foram adquiridas em quatro pontos temporais: no
primeiro momento sem nenhuma intervenção (com média de idade de 8 semanas do animal) e
posteriormente 48 horas, 15 dias e 30 dias após a indução de SE com administração de
pilocarpina intraperitoneal.
Existem poucos estudos em neuroimagem com modelos animais. Estes pontos
temporais foram definidos por meio de uma revisão na literatura de estudos científicos
longitudinais com neuroimagem e modelos animais de epilepsia e também por um estudo piloto
(dados não mostrados) do grupo de neurogenética da Faculdade de Ciências Médicas/Unicamp
que identificou que ratos da linhagem Wistar apresentaram crises epilépticas espontâneas em
torno de 13-15 dias após indução de SE com administração de pilocarpina intraperitoneal (dose
similar ao presente estudo).
Após a aquisição da primeira RM sem intervenção (RM basal), todos os animais
foram induzidos SE com pilocarpina em uma data aproximadamente de uma semana após a
aquisição da imagem cerebral basal.
34
Figura 4: Bobina especial de 8 canais específica para ratos, integrada com recursos para
posicionamento, fixação e anestesia (Rapid Biomedical GmbH, Würzburg, Alemanha).
2.1 INDUÇÃO DE STATUS EPILEPTICUS COM PILOCARPINA
Para indução de SE, os animais foram pré-tratados com brometo de metil-
escopolamina (1mg/kg; intraperitoneal; Sigma) para limitar os efeitos colinérgicos periféricos,
possibilitando a ação da pilocarpina somente no sistema nervoso central, especificamente nos
receptores muscarínicos. Trinta minutos após, estes animais receberam uma injeção sistêmica
de hidrocloreto de pilocarpina (320mg/kg; intraperitoneal; Merck) diluída em 0,9% de solução
salina estéril em temperatura ambiente (17°C) e 4 horas após o SE, 4mg/kg de diazepam
(intraperitoneal) foram injetados para interrupção das crises com normalização da temperatura
ambiente em 22°C. Animais que não desenvolveram SE foram excluídos do nosso estudo.
Imediatamente, após a administração de diazepam e nas primeiras 48 horas após
indução de SE, todos os animais sobreviventes receberam solução salina por via subcutânea e
também quando isso se fez necessário no decorrer do acompanhamento desses animais com o
objetivo de auxiliar na recuperação do animal.
O mesmo protocolo foi realizado para o grupo controle (sham), no entanto, esses
animais receberam solução salina estéril ao invés de pilocarpina.
35
2.2 AQUISIÇÕES DAS IMAGENS CEREBRAIS POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
Os animais foram pré-anestesiados inicialmente em um suporte de acrílico por uma
mistura gasosa de isofluorano/oxigênio (4%/96%) administrados a um fluxo de 2 litros por
minuto. Em seguida, estes foram posicionados em posição prona na bobina dedicada para ratos
com máscara adaptada e redução da mistura gasosa de isoflurano/oxigênio (2%/98%)
administrado a um fluxo de 2 litros por minuto até o final das aquisições das imagens cerebrais.
O tempo total para aquisição de todos os protocolos foi de 25 minutos, porém,
algumas vezes houve a necessidade de repetir o protocolo de ERM de prótons pela má qualidade
visual dos espectros decorrente de artefatos de movimento do animal (dispneia) e pela limitação
do equipamento (máquina de RM não ser dedicada para roedores e ser uma bobina adaptada).
O protocolo final seguiu os seguintes parâmetros para aquisições:
Imagem T2 Turbo Spin Echo (TSE): utilizando os parâmetros de tamanho do
voxel (aquisição): 0.3 x 0.3 x 1mm3; tamanho do voxel (reconstruído): 0.1 x 0.1 x 1 mm; Field
of View (FOV) englobando todo o encéfalo do animal: 40 x 40 x 28 mm; número de fatias: 28;
TR (tempo de repetição): 645 ms; TE (tempo de Eco): 138 ms; Fator TSE: 23.
DTI: Tamanho do voxel (aquisição): 0.8 x 0.8 x 1.5mm; Tamanho do voxel
(reconstruído): 0.7 x 0.7 x 1.5 mm; FOV: 55 x 38 x 40 mm; Número de fatias: 27; TR: 3988
ms; TE: 58 ms; max b-factor: 1000; Número de direções: 16; Número de médias: 7.
ERM de prótons: (voxel único com o centro posicionado sobre a posição central
da formação hipocampal): Tamanho do VOI (Voxel of Interest): 5 x 8.5 x 9 mm3; TE = 135;
TR = 2000; Número de médias: 96.
2.3 ANÁLISES DAS IMAGENS CEREBRAIS POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
As análises das imagens ponderadas em T2 e por tensor de difusão foram realizadas
utilizando os programas MRtrix 3.0 (Brain Research Institute, Melbourne, Australia) e FSL
5.0.6 em sistema Linux no Laboratório de Conectividade Cerebral da Universidad Nacional
Autónoma de México (UNAM) sob supervisão do Prof. Dr. Luis Concha Loyola.
As imagens por tensor de difusão foram convertidas em formato mif com o objetivo
de habilitar as funções do MRtrix e também foram alinhadas a uma imagem b0 de referência e
as transformações lineares resultantes das matrizes foram aplicadas a essas imagens seguindo
cada imagem b0 inicial. Todas as imagens foram corrigidas quanto à presença de
irregularidades e/ou artefatos.
36
Foi utilizada a ferramenta eddy correct para correção de movimento com o objetivo
de unir todas as imagens por tensor de difusão em uma única posição e posteriormente três
repetições foram calculadas para melhorar a relação sinal-ruído.
Uma máscara binária permitiu a diferenciação entre o cérebro e a calota craniana.
As regiões de interesse (ROIs) dos hipocampos dorsais direito e esquerdo foram manualmente
delineadas nas imagens ponderadas em T2 após um corregistro com o atlas de cérebro de rato
BRAIN Imaging Resources (Instituto de Desenvolvimento, Envelhecimento e Câncer,
Universidade de Tohoku) (Figura 5).
Posteriormente, um novo corregistro foi realizado a partir da imagem T2 delineada
com as ROIs na imagem DTI. Após esse corregistro a matriz de transformação foi utilizada
para que as ROIs estivessem no mesmo espaço nas duas imagens cerebrais.
Todavia, correções manuais foram necessárias nas ROIs nas imagens por tensor de
difusão. O mapa vetorial de cores do corpo caloso foi utilizado como ponto de referência para
uma delimitação mais precisa dos hipocampos dorsais.
A volumetria do hipocampo foi determinada pelo número total de voxels nas ROIs
em três fatias do hipocampo dorsal (uma ROI por fatia) pelo programa MRtrix. A anisotropia
fracionada (FA), assim como os outros valores do tensor de difusão, difusividade radial (RD) e
difusividade axial (AD) foram gerados de duas ROIs (uma ROI por fatia).
37
Figura 5: Comparação do hipocampo dorsal do mesmo rato antes e após indução de status
epilepticus com pilocarpina em sequência coronal ponderada em T2. (A): Região de interesse
do animal antes da indução (B): Região de interesse do animal 48 horas após a indução. (C):
Região de interesse do animal 15 dias após a indução. (D): Região de interesse do animal 30
dias após a indução.
Para a aquisição, quantificação e análise dos metabólitos cerebrais in vivo foram
adquiridos espectros oriundos de voxel único com o centro posicionado sobre a posição central
da formação hipocampal (Figura 6) utilizando a sequência PRESS (Point Resolved
Spectroscopy) para supressão do sinal da água. Para a análise dos espectros foi utilizado o
programa LCModel – Versão 6.3-0D & LCM-gui-2012 onde o laboratório de Física Médica/
Unicamp adquiriu a licença para as análises. O LCModel é um programa de quantificação
automática que tem como parâmetro uma combinação linear entre a concentração real
quantificada dos metabólitos e um banco de dados com os mesmos metabólitos quantificados
em condições ideais com o mesmo TE. Foi utilizado um script em Matlab com o intuito de
analisar e extrair os dados metabólicos oriundos dos espectros e organizá-los em um único
arquivo automaticamente.
38
Figura 6: Visualização do sistema de aquisição de ressonância magnética basal mostrando a
espectroscopia de voxel único realizada no hipocampo de rato. Na porção superior da figura
está indicada, em corte coronal e sagital do encéfalo, a localização do voxel em que foi realizada
a espectroscopia. O maior pico indica o metabólito N-acetil-aspartato (NAA) no nível 2.0 ppm.
Como critérios de confiabilidade e qualidade foram considerados os metabólitos em
que apresentaram valores com erro padrão expressos em porcentagens <15% (limite inferior de
Cramer - Rao Lower Bounds) conforme orientação do programa LCModel e sua proporção em
relação à Creatina + Fosfocreatina (Cr). A normalização dos metabólitos pela creatina diminui
a falta de correção entre o dado bruto e a força de magnetização que gera esses dados, já que
não existe um fator de escala em sistemas de aquisição de corpo inteiro.
A largura da linha do espectro in vivo, o sinal ruído e o FWHM (largura à meia
altura do pico, do inglês, full width at half maximum) também foram considerados como
critérios de qualidade. Quanto maior o sinal ruído e menor o valor de FWHM (picos mais
estreitos), os espectros são obtidos com melhor qualidade. Picos mais estreitos separam os
metabólitos compostos de forma mais segura. Não existe um valor de referência para esses
parâmetros. Frequentemente valores de FWHM < 0,1 HZ são considerados. O LCModel
concede esses valores de forma única para cada espectro como um todo e não valores para cada
39
metabólito. Uma análise visual de todos os espectros também foi realizada por dois
pesquisadores distintos para controle de qualidade. Posteriormente foram selecionados os
metabólitos N-acetil-aspartato + N-acetil-aspartil-glutamato (NAA+NAAG), Glutamato +
Glutamina (Glx) e Glicerofosfocolina + Fosfocolina (GPC+PCh) seguindo os critérios de
qualidade e confiabilidade descritos.
2.4 ALTERAÇÃO DE VOLUME VENTRICULAR DE RATOS DA LINHAGEM
WISTAR
O aumento dos ventrículos cerebrais e eventualmente dos espaços subaracnóideos
pode ser resultado do fluxo alterado de líquido cefalorraquidiano e consequentemente pode
desencadear uma hidrocefalia. [165-166].
Ratos da linhagem Wistar são frequentemente utilizados em estudos experimentais
em doenças neurológicas e pressupõe que esses animais não apresentam alterações cerebrais
basais. Todavia, em seu estudo, Tu e colaboradores (2014) identificaram um aumento
ventricular leve de origem espontânea em 43% de ratos Wistar [165] utilizando técnicas de
neuroimagem. Esses animais apresentaram padrões de dilatação ventricular leve a moderada.
Em geral, o aumento ventricular leve não manifesta alterações externas visíveis, como o
aumento do crânio do animal, porém, é possível identificá-lo em imagens estruturais de RM
[165].
Alterações neuropatológicas como malformações arteriovenosas; aneurismas;
cistos; necrose tecidual; lesões de substância branca e astrogliose em torno dos ventrículos e
vasos sanguíneos foram associadas com o aumento dos ventrículos. Contudo, nenhuma análise
foi realizada na formação hipocampal [165].
O presente estudo encontrou alterações visuais no tamanho dos ventrículos laterais
(vide resultados) na RM basal, todavia, a análise de alteração ventricular espontânea neste
momento foge do escopo do presente trabalho, desta forma, foram analisadas apenas a
frequência estatística somente para garantir que esse achado não fosse um fator confundidor.
2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os programas SPSS (Statistical Package for the Social Science, SPSS, Inc.,
Chicago, IL) (Versão 21) e R (Versão 3.6.2) https://www.r-project.org/ foram utilizados para
tabular e analisar todos os dados de neuroimagem.
40
O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as imagens dos animais com e
sem alterações ventriculares espontâneas evidenciadas na RM basal.
O teste ANOVA de medidas repetidas com delineamento misto foi utilizado para
as análises longitudinais intra-grupos e inter-grupos (sham versus (vs.) pilocarpina) dos dados
das imagens T2 e DTI.
Considerando que os níveis dos metabólitos cerebrais quantificados ao longo dos
tempos pela espectroscopia de prótons (RM basal, 48 horas, 15 dias e 30 dias pós-tratamento)
sofreram variações, sendo que em muitos casos não houve a quantificação em determinados
momentos, optou-se pelo teste de Wilcoxon-signed rank a fim de comparar diferenças nos
valores dos metabólitos cerebrais ao longo dos quatro momentos do experimento de cada grupo
separadamente, e o teste de Wilcoxon rank sum foi utilizado para comparar a coorte dos grupos
pilocarpina e sham em cada tempo separadamente.
Os resultados estatísticos foram corrigidos por Bonferroni considerando 6 testes
para a análise longitudinal (intra-grupos) e quatro testes para a análise de coorte (inter-grupos).
Os valores corrigidos de p ≤ 0,05 foram considerados resultados que evidenciam diferenças
entre os grupos que estão além do acaso e podem estar relacionadas com a indução de SE com
pilocarpina.
3.0 RESULTADOS
Os animais foram divididos em dois grupos: grupo sham (n=13) e grupo pilocarpina
(n=25). Nós incluímos nesse estudo somente os animais que apresentaram dados de
neuroimagem com qualidade ao menos em dois pontos temporais para efeito de comparações.
A taxa de mortalidade após indução de SE foi de 41,67%.
Por meio de uma análise visual prévia nas imagens cerebrais ponderadas em T2 na
RM basal, nós identificamos que 14 de 38 ratos apresentaram alterações espontâneas no
tamanho dos ventrículos laterais, conforme ilustrado (Figura 7).
Todavia, os nossos dados de neuroimagem dos animais com alteração ventricular
espontânea não apresentaram diferença estatística (p=1,000; Qui-quadrado de Pearson: 0,022)
quando comparado com os animais sem alteração ventricular espontânea (Tabela 1). Desta
forma, todos os trinta e oito animais foram incluídos neste estudo.
41
Figura 7: Alteração ventricular espontânea em ventrículos laterais (setas) em rato da linhagem
Wistar com 8 semanas de idade. Sequência coronal de imagem ponderada em T2.
Tabela 1: Comparação de alterações ventriculares espontâneas entre o grupo sham e o grupo
pilocarpina.
Grupo Com Alteração Sem Alteração Total Qui-Quadrado Valor de p
Sham 5 8 13 0,022 1,000
Pilocarpina 9 16 25
Total 14 24 38
42
3.1 VOLUMETRIA HIPOCAMPAL DORSAL
Na análise intra -grupos do grupo sham não houve diferença significativa do volume
hipocampal ao longo do tempo, tanto para o hipocampo direito (p=1,000), quanto para o
hipocampo esquerdo (p=1,000) (Figura 8A e Figura 9A).
Já na análise do grupo pilocarpina (intra-grupos), no hipocampo direito, todos os
pontos temporais após indução de SE apresentaram menor volume quando comparado com a
RM basal (Figura 8B e Tabela 2). Todavia, no hipocampo esquerdo, houve uma diferença
significativa somente com 48 horas e 15 dias pós-tratamento que apresentaram menores
volumes quando comparados com a RM basal (Figura 9B e Tabela 2).
Figura 8: Comparação longitudinal do volume hipocampal dorsal direito entre o grupo sham
(A) e o grupo pilocarpina (B).
Figura 9: Comparação longitudinal do volume hipocampal dorsal esquerdo entre o grupo sham
(A) e o grupo pilocarpina (B).
A B
A B
43
Tabela 2: Resultados estatísticos da comparação longitudinal do volume hipocampal dorsal
direito e esquerdo no grupo pilocarpina entre os quatro pontos temporais de aquisição das
imagens ponderadas em T2 (RM).
Comparação
(RM)
Hipocampo
Direito
(Valor de p
nominal)
Hipocampo
Direito
(Valor de p
corrigido)
Hipocampo
Esquerdo
(Valor de p
nominal)
Hipocampo
Esquerdo
(Valor de p
corrigido)
Basal vs. 48 horas 0,000 0,000 0,000 0,000
Basal vs. 15 dias 0,000 0,000 0,001 0,006
Basal vs. 30 dias 0,006 0,036 0,027 0,162
48 horas vs. 15 dias 0,417 1,000 0,898 1,000
48 horas vs. 30 dias 0,010 0,060 0,101 0,606
15 dias vs. 30 dias 0,012 0,072 0,025 0,150
Na comparação entre os grupos sham e pilocarpina (análise inter-grupos), o grupo
pilocarpina apresentou um volume do hipocampo dorsal reduzido em relação ao grupo sham
nos tempos 48 horas, 15 dias e 30 dias pós-tratamento em ambos os hipocampos (Figura 8 e
Figura 9, Tabela 3).
Tabela 3: Resultados estatísticos da comparação longitudinal do volume hipocampal dorsal
direito e esquerdo entre o grupo sham e o grupo pilocarpina entre os quatro pontos temporais
de aquisição das imagens ponderadas em T2 (RM).
Comparação
(RM)
Hipocampo
Direito
(Valor de p
nominal)
Hipocampo
Direito
(Valor de p
corrigido)
Hipocampo
Esquerdo
(Valor de p
nominal)
Hipocampo
Esquerdo
(Valor de p
corrigido)
Basal 0,581 1,000 0,068 0,272
48 horas 0,001 0,004 0,000 0,000
15 dias 0,000 0,000 0,000 0,000
30 dias 0,003 0,012 0,001 0,004
44
3.2 DADOS DO TENSOR DE DIFUSÃO
Anisotropia Fracionada (FA):
A análise intra-grupos do grupo sham não apresentou diferença estatística de FA ao
longo dos quatro pontos temporais (p=1,000) em ambos os hipocampos (Figura 10A).
No entanto, o grupo pilocarpina (análise intra-grupos) apresentou valores reduzidos
de FA 15 dias pós-tratamento quando comparado com 48 horas (p=0,042) e 30 dias (p=0,030)
em ambos os hipocampos (Figura 10B).
Não houve diferença significativa dos valores de FA, entre os grupos sham e
pilocarpina (análise inter-grupos) entre todos os pontos temporais: RM basal (p=0,592); 48
horas (p=0,112), 15 dias (p=0,124) e 30 dias (p=1,000) em ambos os hipocampos (Figura 10).
Figura 10: Comparação longitudinal de anisotropia fracionada (FA) entre o grupo sham (A) e
o grupo pilocarpina em ambos os hipocampos dorsais (B).
A B
45
Difusividade Axial (AD):
A análise intra-grupos do grupo sham não apresentou diferença estatística de AD
nos quatro pontos temporais (p=1,000) em ambos os hipocampos (Figura 11A).
Todavia, no grupo pilocarpina (análise intra-grupos) apresentou menores valores de
AD na RM basal quando comparado com 30 dias pós-tratamento (p=0,006) em ambos os
hipocampos (Figura 11B).
Figura 11: Comparação longitudinal de difusividade axial (AD) entre o grupo sham (A) e o
grupo pilocarpina em ambos os hipocampos dorsais (B).
A B
46
Difusividade Radial (RD):
Na análise intra-grupos do grupo sham não houve diferença estatística de RD ao
longo do tempo, tanto para o hipocampo direito (p=1,000) quanto para o hipocampo esquerdo
(p=1,000) (Figura 12A e Figura 13A).
Já na análise do grupo pilocarpina (intra-grupos) foi observado maiores valores de
RD 15 dias e 30 dias pós-tratamento quando comparado com a RM basal (Figura 12B e Figura
13B, Tabela 4). Quando comparado com 48 horas; 15 dias e 30 dias pós-tratamento também
apresentaram maiores valores de RD. Esses resultados foram observados em ambos os
hipocampos (Figura 12B e 13B, Tabela 4).
Figura 12: Comparação longitudinal da difusividade radial (RD) no hipocampo dorsal direito
entre o grupo sham (A) e o grupo pilocarpina (B).
Figura 13: Comparação longitudinal da difusividade radial (RD) no hipocampo dorsal
esquerdo entre o grupo sham (A) e o grupo pilocarpina (B).
A B
A B
47
Tabela 4: Resultados estatísticos da comparação longitudinal dos valores de RD no hipocampo
dorsal direito e esquerdo no grupo pilocarpina entre os quatro pontos temporais de aquisição
das imagens DTI (RM).
Comparação
(RM)
Hipocampo
Direito
(Valor de p
nominal)
Hipocampo
Direito
(Valor de p
corrigido)
Hipocampo
Esquerdo
(Valor de p
nominal)
Hipocampo
Esquerdo
(Valor de p
corrigido)
Basal vs. 48 horas 0,148 0,888 0,073 0,438
Basal vs. 15 dias 0,003 0,018 0,001 0,006
Basal vs. 30 dias 0,001 0,006 0,004 0,024
48 horas vs. 15 dias 0,007 0,042 0,002 0,012
48 horas vs. 30 dias 0,002 0,012 0,001 0,006
15 dias vs. 30 dias 1,000 1,000 0,914 1,000
Na comparação entre os grupos sham e pilocarpina (análise inter-grupos) para o
hipocampo direito, os valores de RD estiveram maiores na RM basal (p=0,000) no grupo sham,
em contrapartida, 30 dias (p=0,024) apresentou maiores valores de RD no grupo pilocarpina
(Figura 12). Para o hipocampo esquerdo, os valores de RD estiveram significativamente
maiores somente na RM basal (p=0,02) no grupo sham (Figura 13).
3.3 DADOS METABÓLICOS
NAA+NAAG/Cr:
Na análise longitudinal intra-grupos não houve diferença estatística no grupo sham
ao longo de todos os pontos temporais (Figura 14A, Tabela 5). No grupo pilocarpina foi
observada uma redução do metabólito NAA+NAAG/Cr em 48 horas pós-tratamento quando
comparado com a RM basal (p=0,018) (Figura 14B, Tabela 5).
48
Figura 14: Comparação longitudinal da concentração dos metabólitos N-acetil-aspartato+N-
acetil-aspartil-glutamato (NAA+NAAG/Cr) entre o grupo sham (A) e o grupo pilocarpina (B)
no hipocampo dorsal.
Tabela 5: Resultados estatísticos da comparação longitudinal da concentração dos metabólitos
N-acetil-aspartato+N-acetil-aspartil-glutamato (NAA+NAAG/Cr) do grupo sham e pilocarpina
(análise intra-grupos) no hipocampo dorsal.
Grupo Comparação
(RM)
Valor de p
nominal corrigido
Sham
Basal vs. 48 horas 0,375 1,000
Basal vs. 15 dias 0,187 1,000
Basal vs. 30 dias 0,312 1,000
48 horas vs. 15 dias 0,625 1,000
48 horas vs. 30 dias 0,156 0,936
15 dias vs. 30 dias 0,078 0,468
Pilocarpina
Basal vs. 48 horas 0,003 0,018
Basal vs. 15 dias 0,375 1,000
Basal vs. 30 dias 0,437 1,000
48 horas vs. 15 dias 0,125 0,750
48 horas vs. 30 dias 0,250 1,000
15 dias vs. 30 dias 0,937 1,000
A B
49
Na análise inter-grupos, apesar dos valores de NAA+NAAG/Cr no grupo
pilocarpina estarem menores do que no grupo sham (Figura 14), esta redução se mostrou
significativa somente 48 horas pós-tratamento no grupo pilocarpina (p=0,004) (Tabela 6).
Tabela 6: Resultados estatísticos da comparação longitudinal da concentração dos metabólitos
N-acetil-aspartato+N-acetil-aspartil-glutamato (NAA+NAAG/Cr) entre o grupo sham e o
grupo pilocarpina, incluindo o tamanho amostral disponível para comparação no hipocampo
dorsal.
Tempo Tamanho da amostra Valor de p
Sham Pilocarpina Nominal corrigido
Basal 7 13 0,096 0,384
48 horas 7 12 0,001 0,004
15 dias 10 11 0,062 0,248
30 dias 10 9 0,093 0,372
Glu+Gln/Cr:
Na análise longitudinal intra-grupos, apesar de uma redução visual nos valores do
Glu+Gln/Cr no grupo pilocarpina em relação a RM basal (Figura 15B), não foi observado uma
redução significativa em ambos os grupos (Figura 15, Tabela 7). Na análise inter-grupos foi
observada uma redução nos valores do Glu+Gln/Cr no grupo pilocarpina 48 horas (p=0,004)
pós-tratamento em relação ao grupo sham (Figura 15; Tabela 8)
50
Figura 15: Comparação longitudinal da concentração dos metabólitos Glutamato+Glutamina (
Glu+Gln/Cr) entre o grupo sham (A) e o grupo pilocarpina no hipocampo dorsal (B).
Tabela 7: Resultados estatísticos da comparação longitudinal da concentração dos metabólitos
Glutamato+Glutamina (Glu+Gln/Cr) do grupo sham e pilocarpina (análise intra-grupos) no
hipocampo dorsal.
Grupo Comparação Valor de p
nominal corrigido
Sham
Basal vs. 48 horas 0,250 1,000
Basal vs. 15 dias 0,187 1,000
Basal vs. 30 dias 0,097 0,582
48h vs. 15 dias 0,125 0,750
48h vs. 30 dias 0,062 0,372
15 dias vs. 30 dias 0,562 1,000
Pilocarpina
Basal vs. 48 horas 0,023 0,138
Basal vs. 15 dias 0,625 1,000
Basal vs. 30 dias 0,125 0,750
48h vs. 15 dias 0,125 0,750
48h vs. 30 dias 0,500 1,000
15 dias vs. 30 dias 0,625 1,000
A B
51
Tabela 8: Resultados estatísticos da comparação longitudinal da concentração dos metabólitos
Glutamato+Glutamina (Glu+Gln/Cr) entre o grupo sham e o grupo pilocarpina, incluindo o
tamanho amostral disponível para comparação no hipocampo dorsal.
Tempo Tamanho da amostra Valor de p
Sham Pilocarpina Nominal corrigido
Basal 7 13 0,067 0,268
48 horas 6 11 0,001 0,004
15 dias 9 9 1,000 1,000
30 dias 10 6 1,000 1,000
GPC+PCh/Cr:
Não foram encontradas diferenças significativas nos valores de GPC+PCh/Cr tanto
nas análises intra-grupos, quanto nas análises inter-grupos para os quatro pontos temporais
avaliados (Figura 16, Tabela 9 e Tabela 10).
Figura 16: Comparação longitudinal da concentração dos metabólitos Glicerofosfocolina +
Fosfocolina (GPC+PCh/Cr) entre o grupo sham (A) e o grupo pilocarpina no hipocampo dorsal
(B).
A B
52
Tabela 9: Resultados estatísticos da comparação longitudinal da concentração dos metabólitos
Glicerofosfocolina + Fosfocolina (GPC+PCh/Cr) do grupo sham e pilocarpina (análise intra-
grupos) no hipocampo dorsal.
Grupo Comparação
(RM)
Valor de p
nominal corrigido
Sham
Basal vs. 48 horas 0,875 1,000
Basal vs. 15 dias 0,100 0,600
Basal vs. 30 dias 1,000 1,000
48 horas vs. 15 dias 1,000 1,000
48 horas vs. 30 dias 1,000 1,000
15 dias vs. 30 dias 0,050 0,300
Pilocarpina
Basal vs. 48 horas 1,000 1,000
Basal vs. 15 dias 0,500 1,000
Basal vs. 30 dias 0,125 0,750
48 horas vs. 15 dias 0,812 1,000
48 horas vs. 30 dias 0,750 1,000
15 dias vs. 30 dias 0,687 1,000
Tabela 10: Resultados estatísticos da comparação longitudinal da concentração dos metabólitos
Glicerofosfocolina + Fosfocolina (GPC+PCh/Cr) entre o grupo sham e o grupo pilocarpina,
incluindo o tamanho amostral disponível para comparação no hipocampo dorsal.
Tempo Tamanho da amostra Valor de p
Sham Pilocarpina Nominal corrigido
Basal 7 12 0,340 1,000
48 horas 7 12 0,150 0,600
15 dias 10 10 0,089 0,356
30 dias 10 8 0,247 0,988
53
4.0 DISCUSSÃO GERAL
Neste estudo, identificamos alterações estruturais e metabólicas nas imagens de RM
no hipocampo dorsal de ratos após indução de SE com pilocarpina, um modelo experimental
da ELTM humana.
A epilepsia em humanos é diagnosticada após o início de crises recorrentes
espontâneas, correspondendo ao período em que todos ou parte dos eventos essenciais da
epileptogênese já teriam ocorrido, implicando assim na dificuldade em compreender o processo
epileptogênico precoce no contexto clínico [96]. O SE é uma emergência neurológica médica
frequente e está associado com lesão hipocampal e subsequente desenvolvimento de epilepsia.
Todavia, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à lesão seguem não totalmente
esclarecidos [104].
A neuroimagem é capaz de identificar biomarcadores precoces envolvidos na
epilepsia e monitorar a progressão da doença de forma longitudinal [96]. Além do mais, análises
quantitativas utilizando várias técnicas de neuroimagem podem contribuir para aprimorar a
eficácia preditiva na RM no que diz respeito a esclerose temporal mesial [104].
Os modelos animais de epilepsia proporcionam a possibilidade de explorar
minuciosamente todas as fases da epileptogênese e podem contribuir para a identificação de
mecanismos ainda não totalmente esclarecidos e biomarcadores precoces da doença. O modelo
da pilocarpina é um dos modelos mais utilizado e validado na literatura científica na ELT,
especialmente pela semelhança fisiopatológica com a ELT em seres humanos.
A análise volumétrica do hipocampo utilizando a RM estrutural é amplamente
utilizada para identificar atrofia hipocampal em pacientes com epilepsia. Todavia faltam
estudos comparativos de RM em modelos animais para investigarmos os mecanismos
patológicos progressivos no hipocampo.
Em nosso estudo, o volume do hipocampo dorsal esteve reduzido no grupo
pilocarpina quando comparado ao grupo sham em todos os pontos temporais após indução de
SE em ambos os hipocampos. Além disso, houve uma diferença estatística no volume do
hipocampo direito, em que 48 horas, 15 dias e 30 dias pós-tratamento com pilocarpina
apresentaram menor volume hipocampal quando comparados com a RM basal. Contudo, no
hipocampo esquerdo, essa diferença significativa foi observada somente com 48 horas e 15 dias
após indução de SE quando comparados também com a RM basal. Alterações na volumetria e
morfologia do hipocampo e outras estruturas límbicas são descritas em modelos de SE [102-
105,167].
54
Diferentes metodologias são empregadas em estudos experimentais e isso pode
refletir nos resultados obtidos. Os estudos transversais e longitudinais com modelos animais de
ELT demonstraram redução volumétrica do hipocampo em diferentes períodos do processo
epileptogênico [102,104-105,109].
Um estudo longitudinal no modelo de lítio-pilocarpina com ratos que foram
submetidos por um período de 21 dias a aquisição de imagens de RM nos tempos 0 (iniciando
1 hora após administração de diazepam), 1, 2, 3, 7, 14 e 21 dias após SE demonstrou alterações
transitórias em várias estruturas cerebrais e o tempo para o pico de alteração variou dependendo
da região cerebral. No geral, o volume hipocampal esteve significativamente reduzido 21 dias
após SE e esteve relacionado com dano neuronal, respectivamente, maior dano em CA1 e CA3
[104]. Embora não tenhamos quantificado a intensidade do sinal em nosso estudo para efeito
de comparações, Choy e colaboradores (2010) descreveram que as alterações na intensidade do
sinal observadas na RM suportam a hipótese de poderem predizer a gravidade da lesão no
hipocampo observada em 21 dias após SE [104].
O volume hipocampal obtido por imagens de RM reforçam a hipótese de que, este,
pode ser um bom indicador de dano neuronal no hipocampo de modelos animais [104]. Roch e
colaboradores (2002) descreveram que o aumento progressivo da intensidade do sinal no
hipocampo em imagens em T2 estava correlacionado com dano neuronal progressivo no
hipocampo. O dano neuronal em CA1 e CA3 tornou-se significativo 14 dias após SE com lítio-
pilocarpina. Alterações do sinal em T2 correspondem a atrofia progressiva e gliose hipocampal
[106].
Jupp e colaboradores (2012) por meio de um estudo longitudinal, porém no modelo
de ácido caínico, adquiriram imagens cerebrais durante um período de seis semanas, sendo ele:
uma semana após implantação dos eletrodos bipolares (para confirmação de SE e crises
espontâneas recorrentes posteriores pelo EEG) antes de SE, 24 horas, 7 dias, 21 dias e 35 dias
após SE. Foi observada uma diminuição do volume hipocampal significativa a partir de 7 dias
após SE com dano progressivo nas quatro semanas seguintes quando comparado ao grupo
controle. Além disso, o aumento do volume ventricular esteve relacionado com a diminuição
da região límbica [105].
Apesar de não termos mensurado o volume ventricular em nossas imagens de RM,
nossos achados sugerem um aumento do volume ventricular. Parece que a atrofia hipocampal
geralmente está correlacionada com o aumento de ventrículos [103,105-106].
Wolf e colaboradores (2002) através de um estudo transversal de RM in vivo com
o modelo de ácido caínico demonstraram uma redução significativa no volume do hipocampo
ventral de ratos 10 dias após injeção de ácido caínico. O hipocampo dorsal apresentou somente
55
uma tendência na redução de volume [102]. Outros estudos histológicos vão de encontro com
esses resultados, sendo o hipocampo ventral mais afetado nesse modelo experimental [102,168-
169]. A hiperintensidade visualizadas nas imagens em T2 com 10 dias após indução de SE com
ácido caínico correspondiam ao padrão de ativação microglial no hipocampo, podendo refletir
em parte alteração na ativação da micróglia e edema associados [102]. Foi identificado uma
perda neuronal substancial no hipocampo nas camadas piramidais de CA3 e CA1 e hilo
denteado, indicando que mesmo após 10 dias de injeção de ácido caínico o processo
epileptogênico segue em desenvolvimento [102].
Por fim, Polli e colaboradores (2014) compararam RM in vivo entre os modelos
experimentais de ácido caínico, pilocarpina e o grupo controle no período de três a nove meses
após indução de SE e também demonstraram atrofia hipocampal entre os grupos [109]. Nesse
estudo, a atrofia hipocampal esteve em torno de 90% nos animais do modelo de ácido caínico
e em torno de 70% no modelo de pilocarpina, três meses após SE. Em seis meses após SE essa
diferença foi reduzida, a atrofia hipocampal permaneceu em torno de 90% no modelo de ácido
caínico, todavia houve um aumento para 82% no modelo da pilocarpina. Em nove meses após
SE, os volumes hipocampais entre os grupos foram relativamente semelhantes. O aumento da
intensidade do sinal foi descrito nos dois grupos, porém ocorreu inicialmente no modelo da
pilocarpina. As camadas piramidais de CA1 e CA3 foram danificadas nos dois grupos. O
modelo de ácido caínico apresentou maior dano em 6 e 9 meses após indução de SE [109].
O grupo pilocarpina demonstrou necessitar de um tempo maior para detecção de
alteração no volume hipocampal. Talvez o modelo da pilocarpina possa desencadear níveis
mais elevados de liberação de água (edema) do que no modelo de ácido caínico, resultando em
um aumento do volume hipocampal e da intensidade do sinal, justificando essa diferença inicial
nos três primeiros meses após SE [109].
Em modelos animais, o aumento dos ventrículos, a diminuição do volume
hipocampal e o afinamento cortical que podem variar de semanas a meses após indução de SE
são característicos de desenvolvimento progressivo de atrofia [102,108-109].
Duarte e colaboradores (2018) em seu estudo retrospectivo em humanos
demonstraram que a duração da epilepsia pode comprometer o hipocampo e outras estruturas
cerebrais. A atrofia hipocampal ipsilateral progressiva foi identificada em pacientes com maior
tempo de doença. Dados da volumetria hipocampal e histopatológicos sugerem que a redução
volumétrica hipocampal esteja associada com perda neuronal [170].
Com base na atrofia hipocampal, a RM volumétrica não invasiva foi eficaz em
identificar alterações no volume hipocampal dorsal em nossos animais, sugerindo lesão como
consequência do SE. Esse achado reforça a hipótese de anos de que o SE desencadeia uma lesão
56
aguda no hipocampo e que posteriormente uma esclerose temporal mesial associada à epilepsia
pode ocorrer [171].
Com a metodologia utilizada em nosso estudo, nosso modelo experimental de
pilocarpina parece necessitar de um tempo maior para manifestar uma atrofia hipocampal mais
acentuada.
Seria interessante um estudo longitudinal com mais pontos temporais com a
finalidade de novas comparações. Uma investigação minuciosa dos dados volumétricos dos
hipocampos, correlacionados com a análise da intensidade do sinal, mensurações do volume
ventricular (que parece ter relação importante com a atrofia hipocampal), análises
histopatológicas em todos os pontos temporais de aquisição das imagens cerebrais de RM e
identificação do início da fase crônica pelas análises de videomonitoramento das crises
epilépticas poderiam possibilitar uma melhor compreensão dos mecanismos da epileptogênese
em suas respectivas fases (aguda, latente e crônica) manifestadas nas alterações estruturais e
volumétricas evidenciadas na RM dos nossos animais e consequentemente contribuir para
novas descobertas sobre a esclerose hipocampal, o achado mais frequente em pacientes com
ELTM pós-cirúrgicos.
O principal motivo pelo qual o DTI tem sido utilizado é a sua alta capacidade
através da difusão da água em detectar diferenças na arquitetura microestrutural tecidual. A
interpretação dos parâmetros de DTI no âmbito clínico é complexa e deve ser realizada com
muita cautela [124].
É recomendada a análise de vários parâmetros como FA, MD, RD e AD. Somente
a FA pode não ser suficiente para caracterizar alterações no tecido. A MD pode contribuir para
uma melhor compreensão sobre as alterações no tensor de difusão [124]. Na ausência de dados
adicionais, a FA é considerada um biomarcador sensível, porém inespecífico para alterações
microestruturais e neuropatológicas. A FA reduzida é tradicionalmente descrita como um
marcador de perda da integridade da fibra, mas isso está longe de ser definido [124]. Valores
de AD podem ser um marcador mais específico para dano axonal. A AD e RD podem fornecer
informações mais específicas sobre mudanças ou diferenças no tensor de difusão. A
mielinização pode exercer uma função moduladora na RD [124].
Nós encontramos no grupo pilocarpina valores de FA diminuídos 15 dias pós-
tratamento quando comparados com 48 horas e 30 dias em ambos os hipocampos. Além disso,
índices de AD estavam menores na RM basal quando comparados com 30 dias pós-tratamento
em ambos os hipocampos dorsais.
Diferente de nós, Jiang e colaboradores (2020) em um estudo transversal com o
modelo de lítio-pilocarpina demonstraram valores de FA aumentados no hipocampo dorsal e
57
diminuídos na amígdala e córtex entorrinal quando comparado com os ratos controles, em torno
de oito semanas após indução de SE [172].
Salo e colaboradores (2017) em um estudo longitudinal de DTI com o modelo de
ácido caínico e pilocarpina observaram dano progressivo no giro denteado e CA3 após SE.
Inesperadamente, não houve diferença entres os parâmetros de DTI e histológicos entre esses
dois grupos. Valores aumentados de FA e AD foram detectados inicialmente em 34 dias após
SE, com aumento progressivo. O giro denteado se tornou mais anisotrópico após SE. Mudanças
nos valores de MD não foram identificadas [173].
Os valores aumentados de RD 15 dias e 30 dias pós-tratamento quando comparado
com a RM basal também foram identificados em nossos animais. Valores de RD 15 dias e 30
dias também estiveram maiores quando comparados com 48 horas pós-tratamento com
pilocarpina em ambos os hipocampos.
Quando comparamos o grupo pilocarpina com o grupo sham verificamos que no
hipocampo dorsal direito os valores de RD estiveram maiores na RM basal no grupo sham,
porém 30 dias apresentou maiores valores no grupo pilocarpina. No hipocampo dorsal
esquerdo, os valores de RD estiveram maiores somente na RM basal no grupo sham.
Estudos em pacientes com ELT vão de encontro com os nossos resultados. Em seu
estudo com pacientes com esclerose temporal mesial unilateral, Corrêa e colaboradores (2018)
identificaram valores de FA reduzidos e valores de RD e MD aumentados em comparação com
o grupo controle. Valores de FA reduzidos foram encontrados no lobo temporal e extra
temporal, incluindo o hipocampo unilateral comprometido. Índices de MD e RD estiveram
aumentados, porém tal resultado não foi observado no hipocampo, somente em outras estruturas
cerebrais avaliadas. Já alterações nos valores de AD também não foram identificadas entre o
grupo com esclerose hipocampal e o grupo controle. Esses resultados corroboram com a
hipótese de que a epilepsia é um fenômeno de rede [174].
Em um outro estudo, Sanches e colaboradores (2017) também evidenciaram com
uma investigação baseada em voxel os parâmetros de FA e RD com maiores anormalidades em
pacientes com ELT. Desta forma, esses valores devem ser utilizados frequentemente em estudos
para investigação dos parâmetros de difusão na ELT [175].
Esses achados corroboram com os nossos resultados, em nosso estudo após a
indução de SE também encontramos índices diminuídos de FA e valores de RD aumentados.
A densidade axonal e a mielinização diminuídas podem levar ao aumento de RD e
diminuição de FA [174,176-177], representando num maior volume extracelular e menor
densidade da membrana devida à perda de mielina e axônio e aumento do espaço axonal
[174,177-178] e redução na tortuosidade extracelular [174,177,179].Valores de AD não
58
significativamente diminuídos podem ser decorrentes de remoção de detritos celulares pela
micróglia fagocítica que restabelece a difusão paralela aos axônios restantes [174].
Com base nesses resultados, demonstramos que o DTI pode ser mais sensível para
detectar alterações microestruturais progressivas cerebrais quando comparado com a análise
volumétrica das imagens anatômicas ponderadas em T2 em nossos animais.
O NAA é um dos metabólitos mais estudados na epilepsia. Níveis reduzidos de
NAA é a anormalidade mais comum observada em pacientes com epilepsia e podem ser
resultados de perda neuronal ou axonal, bem como comprometimento do metabolismo
mitocondrial [146-148,153]. Pacientes cuja a RM parece ser normal podem, também, apresentar
disfunção neuronal no hipocampo [149,156].
Por isso, avaliamos os níves de NAA+NAAG e verificamos que estavam
reduzidos 48 horas pós-tratamento no grupo pilocarpina quando comparado com a RM basal e
também em comparação com o grupo sham. Os metabólitos Glu+Gln/Cr também estiveram
diminuídos em 48 horas pós-tratamento no grupo pilocarpina quando comparado ao grupo
sham.
Anormalidades no metabólito NAA tem sido observada em pacientes com ELTM
com ou sem atrofia hipocampal [147,149-152,180]. Estudos anteriores com modelos
experimentais de epilepsia também evidenciam déficits de NAA no hipocampo [157,160,181].
Ebisu e colaboradores (1994) em seu estudo transversal com o modelo de ácido
caínico demonstraram três dias após indução de SE níveis reduzidos de NAA no hipocampo e
em outras estruturas cerebrais. Essa redução de NAA esteve correlacionada com dados
histopatológicos confirmando lesão neuronal. A ERM demonstrou maior sensibilidade sob as
condições estudadas na identificação de dano no hipocampo, quando comparada com imagens
ponderadas em T2. Os resultados deste estudo sugerem que o NAA é sintetizado nas
mitocôndrias neuronais e seus níveis reduzidos são decorrentes de lesão ou perda neuronal
[157].
Gomes e colaboradores (2007) com o mesmo modelo experimental que o nosso
evidenciaram um declínio significativo de NAA/Cr em dois e sete dias após uma hora de SE
induzido. Para determinar se esses níveis eram decorrentes apenas de perda neuronal, uma
estimativa quantitativa do número de neurônios sete dias após indução de SE foi realizada nos
ratos mais severamente afetados e comparados com o grupo controle, porém uma pequena perda
neuronal foi identificada em CA1 e CA4. A diminuição persistente dos níveis de NAA/Cr em
sete dias após SE provavelmente foi reflexo do comprometimento persistente da síntese
neuronal do NAA [160]. O comprometimento na síntese do NAA está correlacionado com
comprometimento do metabolismo oxidativo e reduções na síntese de adenosina trifosfato
59
(Adenosine Triphosphate (ATP)) [182]. Desta forma, este estudo sugere que em seus animais
os níveis reduzidos de NAA foi decorrente do metabolismo alterado do NAA e não de perda
neuronal [160].
Um estudo longitudinal com o modelo experimental de ácido caínico demonstrou
resultados similares com os encontrados em nosso estudo. Níveis reduzidos de NAA e também
de glutamato três dias após indução de SE no hipocampo dorsal foram encontrados. Foi
observado uma recuperação de 50% nos níveis de NAA no grupo de animais que apresentou
crises epilépticas no período de um mês em comparação com os níveis de três dias após o SE
[181].
Nosso estudo demonstra níveis reduzidos de NAA+NAAG/Cr em 48 horas após
SE, com aparente recuperação desses níveis ao longo do tempo, porém essa recuperação não é
estatisticamente significativa.
Zahr e colaboradores (2009) demonstraram uma diminuição de NAA entre a RM
basal e três dias após atividade convulsiva significativa, como também, uma recuperação dos
níveis de NAA entre três dias e vinte e oito a trinta e dois dias após as crises epilépticas [181].
Acredita-se que seja improvável que a neurogênese seja responsável pelo restabelecimento dos
níveis de NAA [183].
Os níveis de NAA podem estar reduzidos em resposta a crises, mesmo com poucas
evidências histopatológicas de perda neuronal [184]. A definição de NAA somente como um
marcador de viabilidade neuronal é insuficiente. Níveis reduzidos, porém, transitórios em três
dias após SE podem ser decorrentes de disfunção mitocondrial ou comprometimento na síntese
de ATP na fase aguda [185].
Em nosso estudo tal achado parece sugerir que a maior parte de morte celular
neuronal ocorre em 48 horas em nossos animais. Todavia, crises epilépticas recorrentes também
podem causar dano progressivo [186]. Essa diminuição transitória de NAA pode ser resultado
de morte neuronal, disfunção mitocondrial ou comprometimento na síntese de ATP. Dados
histopatológicos poderiam contribuir para maiores esclarecimentos. Índices reduzidos, todavia,
transitórios, não esclarecem se essas alterações observadas ocorrem somente durante a lesão
inicial induzida por SE ou se são progressivas com a presença de crises epilépticas recorrentes.
Aquisições de novos espectros em um tempo maior após SE poderia determinar se há novas
reduções desses níveis a longo prazo em nossos animais.
Zahr e colaboradores (2009) evidenciaram níveis reduzidos de glutamato três dias
após indução de SE quando comparado com a RM basal. Esses índices permaneceram mais
baixos após um mês quando comparados com a RM basal [181].
60
Em nosso estudo os metabólitos Glu+Gln/Cr estiveram diminuídos em 48 horas
pós-tratamento no grupo pilocarpina quando comparado ao grupo sham.
Índices reduzidos de glutamato foram observados em regiões glióticas de
hipocampo humano [187], tal achado pode refletir em perda neuronal e gliose. O glutamato
reduzido pode refletir em perda de neurônios glutamatérgicos do hipocampo ou disfunção
mitocondrial dos neurônios restantes [188].
Em seu estudo, Alvestad e colaboradores (2011) retratam que a disfunção
metabólica e energética dos neurotransmissores antecede a ocorrência de crises espontâneas no
modelo de ácido caínico. Uma redução do glutamato, glutamina e GABA no hipocampo e
outras áreas cerebrais foi observada na fase latente. A rotatividade do glutamato foi reduzida
antes e após a ocorrência de crises espontâneas, cooperando possivelmente para o
desenvolvimento e manutenção das crises epilépticas. Alterações metabólicas na zona
epileptogênica podem ser elucidadas por processos complexos e interconectados; glicólise
prejudicada, perda de células neuronais, disfunção nos neurônios e astrócitos, bem como o
comprometimento do ciclo de glutamato/glutamina-GABA. No hipocampo, a síntese reduzida
do glutamato pode ser resultado da diminuição da atividade glicolítica e degradação reduzida
do glutamato. Contudo, a síntese reduzida do glutamato também pode ser decorrente de
disfunção mitocondrial, indicado por níveis reduzidos de NAA. Os astrócitos foram
relativamente responsáveis por alterações metabólicas do glutamato e do GABA,
provavelmente devido ao transporte de nitrogênio e o fornecimento de glutamina
comprometidos. Um erro nesses mecanismos pode implicar na mudança de estágio latente para
o estágio crônico na epileptogênese [189].
A ERM de prótons demonstrou ser eficiente para identificar disfunção metabólica
precoce no hipocampo.
Investigações sobre a mensuração volumétrica do hipocampo, dados metabólicos
da ERM e DTI proporcionam informações que se complementam. Os resultados deste estudo
foram associados a vários processos fisiopatológicos da doença.
5.0 LIMITAÇÕES DO ESTUDO E PERSPECTIVAS FUTURAS
Neste estudo, as alterações ventriculares identificadas nas imagens cerebrais basais
dos animais foram obtidas ao acaso. Estudos futuros devem focar no aumento do tamanho
amostral e análises adicionais para determinar a contribuição deste achado no processo da
epileptogênese.
61
A análise detalhada quantitativa das crises epilépticas por videomonitoramento não
foi realizada, foi observado apenas que os animais induzidos SE com pilocarpina apresentaram
crises espontâneas. Estudos futuros de neuroimagem correlacionados com a frequência de crises
em modelos experimentais podem ajudar a entender o processo envolvido no desenvolvimento
da epilepsia.
Análises histopatológicas correlacionadas com os dados de RM podem auxiliar para
uma melhor caracterização das fases da epileptogênese e assim permitir uma melhor
compreensão das alterações evidenciadas em neuroimagem.
Com a adaptação de uma bobina dedicada para roedores em máquina de RM clínica,
foi possível obter dados de neuroimagem confiáveis que proporcionam direcionamento para
estudos futuros. Contudo, uma máquina de ressonância magnética dedicada para animais
poderá obter dados otimizados para pesquisas com modelos experimentais de epilepsia.
6.0 CONCLUSÃO
Em conclusão, nossos achados de neuroimagem demonstraram danos significativos
no hipocampo dorsal:
- Alterações estruturais e metabólicas longitudinais até trinta dias pós-indução de
SE com pilocarpina;
- As imagens de ERM e DTI demonstraram serem ferramentas eficazes e mais
sensíveis para identificar dano precoce na região hipocampal.
62
7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8.0 ANEXO (Documentos da Comissão de Ética no Uso de Animais)
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