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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BUSCA DE NOVO PROTÓTIPO A BASE DE RUTÊNIO CANDIDATO À
UTILIZAÇÃO NA TERAPIA ANTINEOPLÁSICA
RAQUEL SANTOS FARIA
GOIÂNIA-GO
2015
RAQUEL SANTOS FARIA
BUSCA DE NOVO PROTÓTIPO A BASE DE RUTÊNIO CANDIDATO À
UTILIZAÇÃO NA TERAPIA ANTINEOPLÁSICA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Goiás - Nível
Mestrado.
Orientadora: Profa. Dra. Elisângela de
Paula Silveira Lacerda
Co-orientador: Prof. Dr. Hugo Delleon da
Silva
GOIÂNIA-GO
2015
RAQUEL SANTOS FARIA
BUSCA DE NOVO PROTÓTIPO A BASE DE RUTÊNIO CANDIDATO À
UTILIZAÇÃO NA TERAPIA ANTINEOPLÁSICA
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda
Universidade Federal de Goiás - ICB
_____________________________________________
Dr. Rui Manuel Vieira Reis
Hospital de Câncer de Barretos - Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM)
_____________________________________________
Profa. Dra. Aliny Pereira Lima
Faculdade FIBRA
Aprovada em: ____/____/________
Dedicatória
Dedico este trabalho A minha
avó pelo exemplo de vida. Aos
meus pais por sempre me
apoiarem. A minha irmã que
sempre esteve ao meu lado.
Agradecimentos
Primeiro, agradeço a Deus, que sempre guiou meu caminho me levando a
alcançar meus objetivos, iluminando meus passos para superar todas as
dificuldades encontradas no meu caminho até aqui.
Aos meus pais José Adriles e Marília que sempre me apoiaram nas minhas
decisões, me guiaram e estiveram ao meu lado em todos os momentos de alegria e
de tristeza.
A minha irmã Renata, obrigada por todo apoio, pelas risadas nos momentos
mais difíceis e principalmente pela paciência! Tenho muito orgulho de você muito
obrigada por ser tão presente na minha vida!
A minha avó Maria Raimunda, minha inspiração de vida, minha musa! Uma
pessoa meiga e vencedora, orgulho da família. Com seus 88 anos cheios de
histórias e lembranças. Sempre esteve ao meu lado, me apoiando em tudo, me
amando e me achando sempre linda!
A minha avó de coração Ildenê, um exemplo de dedicação e companheirismo,
um exemplo para todos da família!
Aos meus padrinhos, meus pais de coração. Obrigada por acompanharem a
trajetória da minha vida, sempre me apoiando.
A todos os membros da família Albuquerque Santos, que qυе dе forma
especial е carinhosa mе dеυ força е coragem. A toda família Ulhoa Faria, porque só
quem é UFA sabe o verdadeiro significado da palavra família. Mesmo com todos os
problemas sempre conseguimos reunir e festejar, e assim todas às vezes
relembramos que a vida não tem sentido sem a alegria de viver.
Ao meu namorado Célio Gonzaga, e as minhas amigas Laís Fleury, Marina
Borges e Amanda Amorim pela paciência nos dias mais difíceis e pelo apoio!
Obrigada pela amizade, companheirismo e dedicação durante todo esse tempo.
Não posso deixar de mencionar o Guga, meu “cãopanheiro” e guarda-costas,
essa criaturinha de menos de 6 quilos e com 13 anos de puro charme que sempre
está ao meu lado me alegrando todos os dias.
A minha orientadora Profa Dra Elisângela de Paula que sempre esteve de
braços abertos para me auxiliar. Muito obrigada pela oportunidade de crescimento
na carreira acadêmica. Sempre serei grata por tudo que me proporcionou, por todo
carinho, dedicação e por ter acreditado no meu potencial.
Aos meus “chefes” de coração Flávia de Castro e Hugo Delleon por toda
dedicação e paciência nesses anos. Agradeço por tudo que me ensinaram, pela
amizade, companheirismo e por todo o apoio.
A toda a equipe do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética em
especial a Sônia Santos, Thallita Monteiro, Wanessa Carvalho, Lucas Carlos,
Francyelli Mariana, Kézia Delmont, Lorena Felix. Obrigada pelo auxílio e incentivo
durante esse período, todos vocês tiveram uma contribuição importante esses anos.
Obrigada a todos os professores e funcionário da Pós-Graduação em
Ciências Biológicas. Agradeço também à Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa de mestrado concedida.
Eu não teria chegado até aqui sem o apoio de cada um dos que foram citados
e tantos outros que não foi possível lembrar. Sempre serei grata por cada um, vocês
são parte da minha história!
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Siglas ............................................................................... IX
Lista de Figuras ........................................................................................................ X
Lista de Tabelas ..................................................................................................... XII
Resumo .................................................................................................................. XIII
Abstract .................................................................................................................. XIV
Introdução .................................................................................................................. 1
O Câncer .................................................................................................................. 1
Carcinogênese ......................................................................................................... 4
Sarcoma ................................................................................................................... 6
Quimioterapia antineoplásica ................................................................................. 10
Ciclo celular............................................................................................................ 13
Compostos baseados em metais utilizados na terapia antineoplásica .................. 20
Avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade em cultura celular ........................... 23
Objetivo .................................................................................................................... 25
Objetivos específicos ............................................................................................. 25
Materiais e Métodos ................................................................................................ 25
Fluxograma da metodologia do trabalho desenvolvido .......................................... 26
Síntese e diluição do complexo de rutênio (II) ....................................................... 27
Linhagens celulares e manutenção do cultivo celular ............................................ 27
Ensaio de viabilidade celular pelo método redução do MTT .................................. 28
Ensaio de toxicidade pelo teste de letalidade de Artemia salina ............................ 28
Avaliação Genotóxica: Teste Cometa .................................................................... 29
Análise da cinética do ciclo celular por citometria de fluxo .................................... 30
Ensaio apoptose (Anexina V-FITC/Iodeto de Propídio) ......................................... 31
Análise de Bcl-2 ativa por citometria de fluxo......................................................... 32
Ensaio de Western blotting .................................................................................... 33
Análise Estatística .................................................................................................. 33
Artigo - The ruthenium(II) complex [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 induces cell
cycle arrest and cell death triggered by the intrinsic apoptotic pathway in S-180
cells .......................................................................................................................... 34
Abstract .................................................................................................................. 34
1.0 Introduction ...................................................................................................... 35
2.0 Materials and Methods ..................................................................................... 36
2.1. Chemical and preparation of compound for biological tests ..................... 36
2.2 Cell Culture ............................................................................................... 36
2.3 Cell viability assay (MTT assay) ............................................................... 36
2.4 Toxicity assay with Artemia salina ............................................................ 37
2.5 Comet assay ............................................................................................. 38
2.6 Cell Cycle analysis .................................................................................... 38
2.7 Annexin V-FITC/PI double staining and analysis by flow cytometry ......... 39
2.8 Flow Cytometric Detection of the BCL-2 Protein ....................................... 39
2.9 Western blot analysis ................................................................................ 39
2.10 Statistical analysis ................................................................................... 40
3.0 Results ............................................................................................................. 40
3.1 S180 cell viability ...................................................................................... 40
3.2 Toxicity assay with Artemia salina ............................................................ 41
3.3 Comet assay ............................................................................................. 41
3.4 Induction of G0/G1 arrest in S180 cells .................................................... 44
3.5 Induction of apoptosis in S180 cells .......................................................... 45
3.6 Detection of the Bcl-2 protein in S180 cells by flow cytometry assay ....... 45
3.7 Protein analysis in Western Blot assay ..................................................... 46
4.0 Discussion ........................................................................................................ 47
5.0 References ....................................................................................................... 52
Conclusão ......................................................................................................................................... 57
Referência Bibliográfica .............................................................................................................. 58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIF: Fator Indutor de Apoptose
APAF-1: Protease Apoptótica Ativadora de Fator 1
ATCC: Coleção Americana de Cultura Celular
Bad: Proteína pró-apoptótica
Bak: Proteína pró-apoptótica
Bax: Proteína X associada ao Bcl-2
Bcl-2: Proteína antiapoptótica (Linfoma células B)
Bcl-x: Proteína antiapoptótica
Bid: Domínio de Morte de Interação com BH3
CD95: Ligante de Receptor de Morte Celular
CDK: Quinases Dependentes de Ciclina
DIABLO: Inibidor Direto de Proteínas Inibidoras de Apoptose
DNA: Ácido desoxirribonucleico
dppb:1,4 bis(difenilfosfina) butano
FADD: Domínio de Morte Associada ao CD95
FASL/CD95: Ligante de Receptor de Morte Celular
FITC: Isotiocianato de Fluoresceína
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IC50: Concentração que Inibe 50% da Viabilidade Celular
INK4: Inibidores Específicos de CDK4
KP1019: Indazol trans-[tetraclorobis (1H-indazol)rutenato(III)
MTT: 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazoilium)
NAMI-A: ImH[trans -RuCl4(DMSO)Im]
MOMP: Permeabilização Membrana Mitocondrial Externa
NCCD: Comitê de Nomenclatura Sobre Morte Celular
PBS: Solução Salina Tamponada com Fosfato
phen: 1,10-phenanthroline
PF6: Hexafluorfosfato
PP2A: Proteína Fosfatase 2A
RPMI: Meio de cultura Instituto Memorial Park Roswell
RT-PCR: Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase
S180: Sarcoma 180
SMAC: Segundo Ativador de Caspase Derivado da Mitocôndria
TNF: Fator de Necrose Tumoral
TNF-R: Receptor do Fator de Necrose Tumoral
TRAIL: Ligante Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose Tumoral
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Processo de formação da carcinogênese.
http://patoneoplasia.blogspot.com.br/2013/06/processo-de-carcinogenese.html
Figura 2: Tomografia computadorizada de um paciente com sarcoma
retroperitoneal. http://www.aboutcancer.com/sarcoma_page2.htm.
Figura 3: Vias de sinalização de receptores de morte e receptores dependentes
durante a apoptose via extrínseca. Fonte: Galluzzi et al. (2012).
Figura 4: Via de apoptose mitocondrial dependente e independente de caspase.
Fonte: Galluzzi et al. (2012).
Figura 5: Fluxograma contendo a metodologia do trabalho desenvolvido.
Figura 6: Fórmula estrutural do composto [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6.
Figura 7: Princípio do ensaio de marcação com Anexina V/PI.
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO
Figure 1: Cells after comet assay (a) negative control of lymphocyte (b) and (c)
lymphocytes treated with 5 and 10 µM, respectively, for 24 horas. (d) negative control
of S180; (b) and (c) S180 treated with 5 and 10 µM, respectively, for 24 horas.
Figure 2: Effects of Ru25 on the cell cycle distribution of S180 cells after 24 h of
exposure. The data are the means ± SD of three experiments. Significant differences
from the untreated control are indicated by ***p<0.001.
Figure 3: Effect of Ru25 on the mechanism of S180 cell death (early and late
apoptosis/necrosis) evaluated by flow cytometry after 24 h of incubation. The data
are the means ± SD of three experiments.
Figure 4: Detection of Bcl-2 in sarcom 180 cell treated with ruthenium 25 complex, at
concentrations 5 and 10 μM for 24 hours. M1: cells that do not have the presence of
Bcl-2 activated. M2: cells that has active Bcl-2.
Figure 5: Nitrocellulose membrane form Western blot assay, negative control and
cells treated with two concentrations (5 and 10 µM).
Figure 6: A schematic diagram showing the proposed signaling pathways of bufalin-
induced apoptosis in S180 cell line.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: As dez principais causas de morte no mundo de acordo com a
Organização Mundial de Saúde.
Tabela 2: Sinais e sintomas em pacientes com sarcoma de retroperitônio e sua
frequência.
Tabela 3: Fármacos mais utilizados na quimioterapia de sarcomas de partes moles.
LISTA DE TABELAS DO ARTIGO
Table 1: IC50 value for lymphocyte and S180 cell lines.
Table 2: CL50 value for Artemia salina treated with Ru25 complex.
Table 3: Frequency of cell nuclei found in each class of the comet assay using
lymphocytes with no treatment (negative control), and treated with two different
concentrations of Ru25 (5 and 10 µM).
Table 4: Frequency of cell nuclei found in each class of the comet assay using S180
with no treatment (negative control), and treated with two different concentrations of
Ru25 (5 and 10 µM).
RESUMO A estimativa aponta que ocorrerão 27 milhões de novos casos de câncer no mundo até 2030. Em decorrência do aumento no numero de casos de câncer no mundo, houve uma intensificação na busca de novos quimioterápicos que sejam eficientes para o tratamento do câncer. A indústria farmacêutica, portanto, intensificou a busca por novas drogas à base de metal que ofereçam possibilidade de administração oral, diminuição de efeitos colaterais graves e redução de custos clínicos. Devido ao exposto, foi avaliado o potencial citotóxico, genotóxico, a interferência na cinética do ciclo celular e o mecanismo de morte celular de um novo complexo de rutênio (II). A citotoxicidade foi avaliada pelo teste do MTT e este mostrou que o complexo testado apresentou inibição da viabilidade na célula tumoral de S180 em concentrações baixas (IC50 8.89 ± 3.9 µM) e uma citotoxicidade em concentração maior para linfócitos normais (IC50 17 µM). Ru25 também apresentou letalidade significativa no teste de Artemia salina (CL50 300.31 µg mL). O teste cometa indicou que o composto não é genotóxico para células normais, pois não apresentou aumento significativo de dano ao DNA nas células normais tratadas, e apresenta baixa genotoxicidade para as células tumorais. O complexo Ru25 induziu mudanças no ciclo celular, identificado pelo teste de citometria de fluxo, aumentando a quantidade de células na fase G0/G1 e diminuindo na fase de síntese em 24 horas de tratamento. O complexo induziu o aumento da quantidade de células positivas para Anexina-V pelo teste de citometria de fluxo, sugerindo morte celular por apoptose. Pelo teste de Western Blot, foi possível inferir que o complexo pode estar desencadeando morte celular por apoptose via intrínseca e independente de caspase. Porém, outros marcadores específicos são necessários para compreender qual a cascata de eventos de apoptose via intrínseca que está efetivando esse processo de morte celular, e se somente esta via está sendo ativada no processo de apoptose, elucidando assim, o mecanismo de ação nas células de S180. Portanto, este composto apresentou boa citotoxicidade para células tumorais, com alta segurança de uso, devido ausente genotoxicidade em células normais, baixa genotoxicidade em células tumorais, e que possivelmente atua pelo por apoptose via intrínseca e independente de caspase. Palavras-Chave: Câncer, Ciclo Celular; Morte celular; Sarcoma 180; Complexo de Rutênio (II).
ABSTRACT
The estimate indicates that occur 27 million new cases of cancer in the world by 2030. Due to the increase in the number of cancer cases in the world, there was intensification in the search for new chemotherapeutic agents that are effective for the treatment of cancer. The pharmaceutical industry therefore intensified the search for new metal-based drugs that offer the possibility of oral administration, reduction of serious side effects and reduced clinical costs. Due to the foregoing, we assessed the cytotoxic, genotoxic, interference on the cell cycle kinetics and mechanism of cell death of a new complex of ruthenium (II). Cytotoxicity was assessed by the MTT assay and it has shown that the compound tested showed inhibition of tumor cell viability in S180 in lower concentrations (IC50 8.89 ± 3.9 µM) and cytotoxicity at higher concentrations for normal lymphocytes (IC50 17 µM). Ru25 also showed a significant lethality to brine shrimp nauplii Artemia salina (CL50 300.31 µg mL). The comet assay indicated that the compound is not genotoxic for normal cells, because there was no significant increase in DNA damage in the normal cells treated, and exhibits low genotoxicity to tumor cells. The Ru complex 25 induced changes in cell cycle identified by flow cytometric test, increasing the number of cells in G0 / G1 phase and lowering synthesis phase within 24 hours of treatment. The complex induced an increase of cells positive for Annexin-V for flow cytometric test, suggesting cell death by apoptosis. By Western Blot assay, it was possible to infere that the complex may be triggering cell death by caspase-independent intrinsic apoptosis. However, others specifics markers are needed to understand the cascade of events which the intrinsic apoptosis pathway that is effecting this process of cell death, and if only this pathway is being activated in apoptosis, thus elucidating the mechanism of action in cells S180. Thus, this compound showed good cytotoxicity to tumor cells, high safety of use, due to absent genotoxicity in normal cells, low genotoxicity in tumor cell, and possibly acts by caspase-independent apoptosis intrinsic pathway. Keywords: Cancer, cell cycle, cell death, Sarcoma 180, Ruthenium (II) complex.
1
INTRODUÇÃO
O Câncer
As alterações na sequência de DNA são compreendidas como um tipo de
mutação gênica. As mutações podem promover alterações nas funções celulares e a
formação de tumores, portanto o câncer é um processo patológico que inicia quando
uma célula é transformada pela mutação genética do DNA celular (Klung et al.,
2010).
Quando uma célula anormal é formada começa a se proliferar de maneira
descontrolada, desconsiderando as sinalizações de regulação de crescimento no
ambiente circunvizinho à célula, podendo adquirir características invasivas e
promover alterações nos tecidos próximos (Klung et al., 2010). As células
denominadas neoplásicas penetram nos tecidos, e podem alcançar vasos
sanguíneos e também linfáticos, sendo capaz de disseminar para outras partes do
corpo no processo conhecido como metástase (Brunner & Suddarth, 2002).
As causas do câncer podem ser de fatores externos ou internos ao
organismo, estando ambas inter-relacionadas. Os agentes externos estão
associados ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente
social e cultural. Os fatores internos são, na maioria das vezes, geneticamente pré-
determinados, e estão relacionados à capacidade do organismo de se defender das
agressões externas. Esses fatores interagem de diversas formas, aumentando a
probabilidade de transformações das células normais em neoplasias. O surgimento
do câncer depende da intensidade e duração da exposição das células aos agentes
causadores de câncer (INCA, 20012).
Independente da forma de ocorrência, esporádica ou hereditária, o câncer é
considerado uma doença genética, pois a carcinogênese sempre inicia com danos
no DNA. Sendo que usualmente esses danos são causados por agentes químicos,
físicos ou virais (Klung et al., 2010).
Sendo considerado a sétima causa de morte da população mundial, o câncer
é responsável por um número expressivo e crescente de pacientes no mundo todo,
sendo que os principais tipos de câncer que causam mortes são de traqueia,
brônquios e pulmão (Tabela 1).
2
Tabela 1: As dez principais causas de morte no mundo de acordo com a Organização Mundial de
Saúde.
Causas de mortes no mundo Morte em milhões
% de mortes
Doença cardíaca isquêmica 7,25 12,8%
Acidentes vasculares cerebrais e outras
Doenças cerebrovasculares 6,15 10,8%
Infecções do trato respiratório inferior 3,46 6,1%
Doença pulmonar obstrutiva crônica 3,28 5,8%
Diarreias 2,46 4,3%
HIV/AIDS 1,78 3,1%
Câncer de traqueia, brônquios e pulmões 1,39 2,4%
Tuberculose 1,34 2,4%
Diabetes mellitus 1,26 2,2%
Acidentes de trânsito 1,21 2,1%
Fonte: OMS divulga as dez principais causas de morte no mundo. Disponível em:
http://www.news.med.br/p/saude/222530/oms-divulga-as-dez-principais-causas-de-morte-no-
mundo.htm. Acesso em: 3 de março de 2015.
Os tipos de câncer diferem entre si de acordo com os tipos de células do
corpo os quais se originaram, pela velocidade de multiplicação das células e pela
capacidade de invadirem tecidos e órgãos vizinhos ou distantes (INCA, 2012). Em
conformidade com o tipo de célula pelo qual se originou anatomopatologicamente, o
câncer pode ser classificado em:
Carcinoma: originam-se de células que revestem as superfícies do corpo, incluindo a
pele e uma série de revestimentos do corpo;
Glioma: Desenvolvem-se a partir de células do tecido de suporte cerebral ou da
medula espinhal;
3
Leucemia: originam-se de células da medula óssea que produzem células
sanguíneas brancas as quais fazem parte do sistema de defesa do organismo contra
infecções;
Linfoma: originam-se de células conhecidas como linfócitos, são encontradas em
glândulas linfáticas e no sangue;
Melanoma: originado dos melanócitos que são células da pele que produzem
pigmento;
Mieloma: originam-se das células plasmáticas da medula óssea as quais produzem
anticorpos;
Sarcoma: originam-se de tecidos de suporte, tais como ossos, músculos, tecido
gorduroso e fibroso.
De acordo com INCA (2014), o câncer constitui um problema de saúde
pública tanto para o mundo desenvolvido, quanto para nações em desenvolvimento.
O projeto Globocan 2012, em conjunto com a Agência Internacional para Pesquisa
em Câncer (IARC) e a Organização mundial de Saúde (OMS) organizou uma
pesquisa de âmbito mundial. A pesquisa indicou que em 2012 houve 14,1 milhões
de casos novos de câncer e 8,2 milhões de mortes por câncer no mundo. A carga do
câncer continuará expandindo se as medidas preventivas não forem devidamente
aplicadas, em especial nos países desenvolvidos (INCA, 2014).
A estimativa para 2014 e 2015 no Brasil, é de que a ocorra aproximadamente
576 mil novos casos de câncer, incluindo os casos de câncer de pele do tipo não
melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país (Brasil, Inca,
2014).
Estimativas indicam que em 2030, a carga global crescerá para 21,4 milhões
de novos casos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, devido ao aumento
e à elevação da idade média da população, em conjunto com a redução da
mortalidade infantil e das mortes por doenças infecciosas em países em
desenvolvimento (Brasil, INCA, 2014).
4
Carcinogênese
O corpo humano é todo formado por células que se organizam em tecidos e
órgãos. As células normais se dividem, amadurecem e morrem, renovando-se a
cada ciclo. O câncer se desenvolve quando células anormais deixam de seguir esse
processo natural, sofrendo mutação que pode provocar danos em um ou mais genes
de uma única célula (Silva, 2003).
Com o reconhecimento do modelo molecular de múltiplos estágios no
desenvolvimento da carcinogênese, ou seja, de formação de câncer, como, por
exemplo, o modelo clássico de câncer coloretal, ficou evidente que o processo de
desenvolvimento de um tumor resulta de alterações complexas envolvendo uma
serie de alterações genéticas e epigenéticas. Os modelos moleculares usados para
descrever o processo de múltiplos estágios na carcinogênese indicam que pelo
menos um, provavelmente vários, eventos mutagênicos são necessários (Silva,
2003).
O desenvolvimento de um tumor inicia quando uma célula é portadora de uma
mutação que pode aumentar sua capacidade proliferativa, caracterizando o estágio
de iniciação (Silva, 2003).
De acordo com de Almeida (2005), o processo de carcinogênese, em geral é
lento, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um tumor
detectável. Vários estágios ocorrem neste processo antes de chegar a um tumor
(Figura 2):
Estágio de iniciação: Primeiro estágio da carcinogênese. As células sofrem o efeito
de um agente carcinogênico (agente oncoiniciador, como: sulfato de dimetila,
metilnitrossuréia, cloreto de vinila, aflatoxinas, dimetilnitrosoamina e benzopireno)
provocando modificações em alguns de seus genes. Nesta fase ocorrem alterações
genéticas nas células, porém ainda não é possível se detectar um tumor
clinicamente.
Estágio de promoção: As células que já estão geneticamente alteradas sofrem o
efeito de agentes cancerígenos classificados como oncopromotores. A célula
iniciada é então transformada em célula maligna, de forma lenta e gradual. Para que
ocorra essa transformação, é necessário um longo e continuado contato com o
5
agente cancerígeno promotor. Sendo que a suspensão do contato pode interromper
o processo nesse estágio.
Estágio de progressão: Caracterizado pela multiplicação descontrolada, um
processo irreversível. O câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das
primeiras manifestações clínicas da doença.
Os genes envolvidos na perda do controle celular são divididos em duas
classes: proto-oncogenes, são os genes que estimulam o crescimento celular,
impedem a diferenciação e a morte celular, e os genes supressores de tumor, que
são os tipos de genes que atuam limitando a proliferação celular, controlando
negativamente a proliferação e sobrevivência celular. O desequilíbrio na regulação
desse sistema, por meio da ativação de proto-oncogenes ou da perda da função de
genes supressores de tumor, pode levar à proliferação descontrolada de células e
ao acúmulo de sucessivas anormalidades genéticas, características do câncer
(Doucas e Berry, 2006).
Um conjunto de alterações genéticas conferem novas características
fenotípicas às células neoplásicas, e garantem a malignidade tumoral. Dentre as
alterações destacam-se: autossuficiência em sinais de crescimento (independem de
fatores de crescimento), resistência aos sinais antiproliferativos (insensíveis aos
inibidores de crescimento), resistência à morte celular, potencial replicativo ilimitado
(imortalidade), angiogênese sustentada (crescimento sustentado em células do
estroma para atrair novos vasos), evasão do sistema imunológico, invasão,
metástase, além de estresse metabólico, proteotóxico, mitótico, oxidativo e de dano
ao DNA (Hanahan e Weinberg, 2011).
6
Figura 1: Processo de formação da carcinogênese.
http://patoneoplasia.blogspot.com.br/2013/06/processo-de-carcinogenese.html
Sarcoma
Os sarcomas constituem um grupo heterogêneo de tumores sólidos raros
originados a partir de células mesenquimais, que são normalmente responsáveis
pela formação do músculo esquelético, músculo liso, gordura, tecido fibroso, osso e
cartilagem (Toledo, 2004; Demetri et al., 2010).
Por serem tumores de origem mesenquimal, apresentam diferentes
características patológicas e clínicas, e são divididos em duas categorias: sarcoma
ósseo e sarcomas de partes mole (gordura, músculo, nervos, vaso sanguíneo e
outros tecidos conectivos). Sarcoma de partes moles são tumores relativamente
raros, correspondendo a apenas 1% das neoplasias malignas do adulto e 7% em
crianças e adolescentes. Os tumores ósseos correspondem a 4,3% das neoplasias
malignas em crianças e adolescentes (Toledo, 2004; Demetri et al., 2010).
As variedades histológicas mais frequentes em adultos são: lipossarcoma e
leiomiossarcoma seguidos de fibrossarcoma, Schwannoma e histiocitoma fibroso
maligno, entre outros (Arlen et al., 1987; Lewis et al., 1998; Stoeckle et al., 2001;
Mendenhall et al., 1967).
7
A maior parte dos sarcomas de partes moles localiza-se nas extremidades,
seguido pelos localizados na cavidade abdominal, retroperitônio, parede do tronco e
cabeça e pescoço (Singer et al., 2000; Latorre et al., 1999). Somente 10% a 20%
dos sarcomas de parte mole estão localizados no retroperitônio (Figura 1 e 2)
(Mettlin et al., 1999). Os Sarcomas retroperitoneais correspondem a
aproximadamente 50% de todos os tumores retroperitoneais, 40% são linfomas, e o
restante são tumores urogenitais, benignos e metástases, porem, a maioria das
massas primárias únicas, extra viscerais do retroperitônio é sarcoma. (Bonvalot et
al., 2006; Arlen et al., 1987).
Ocasionalmente, o grande tamanho das lesões retroperitoneais desloca os
órgãos de suas localizações anatômicas (Figura 1), fazendo com que a sua
localização de origem fique de difícil acesso e causando sinais e sintomas no
paciente (Santos et al., 2007) (Tabela 2).
Figura 2: Tomografia computadorizada de um paciente com sarcoma retroperitoneal.
http://www.hindawi.com/journals/cris/2013/763702/fig1/. Acesso em: 2 de dezembro de 2014.
8
Tabela 2: Sinais e sintomas em pacientes com sarcoma de retroperitônio e sua frequência. Fonte:
Johnson LFP, Lopes A (1999).
Sinal / Sintoma Frequência
Tumor abdominal 40%-70%
Aumento do volume abdominal 40%
Desconforto abdominal 40%
Alteração neurológica 30%
Ascite 15%
Alterações gastrintestinais 10%
Febre / Leucocitose Raro
Hemorragia digestiva Raro
Hipoglicemia Raro
Três modalidades terapêuticas principais são utilizadas para o tratamento dos
sarcomas: a ressecção cirúrgica, que é a forma mais comum de tratamento para
sarcoma de partes moles, a radioterapia e a quimioterapia. Atualmente, o tratamento
dos sarcomas de partes moles é orientado de acordo com o grau histológico e pela
adequação das margens cirúrgicas (Manoel et al., 2008; Alektiar et al., 2008;
Zlotecki et al., 2005).
Na quimioterapia, os fármacos mais utilizados para o tratamento de sarcoma
de partes moles são a doxorrubicina, ciclofosfamida, imatinib, ifosfamida, e, além
desses, vários outros agentes antitumorais, tais como ecteinascidina, gemcitabina,
paclitaxel, que têm sido testados em pacientes (Tabela 3) (Spira e Ettinger, 2002;
Siegel et al., 2007).
9
Tabela 3: Fármacos mais utilizados na quimioterapia de sarcomas de partes moles.
Fármacos Fórmula Estrutural
Doxorrubicina
Ciclofosfamida
Imatinib
Apesar de diferentes protocolos terapêuticos serem utilizados para o
tratamento de sarcomas, especialmente através da combinação de diferentes
fármacos, esses tumores são bastante resistentes aos tratamentos, trazendo para
os pacientes uma resposta não muito adequada (Spira e Ettinger, 2002).
No registro brasileiro de tumores não há dados específicos sobre os
sarcomas primários do retroperitônio. Já nos Estados Unidos, tem-se a ocorrência
de 1.000 casos novos de sarcoma de retroperitônio diagnosticados anualmente
(Santos et al., 2007).
Sarcoma 180 (S-180) ou Tumor de Crocker (TIB66 na classificação da ATCC)
é um tumor indiferenciado que apresenta contatos intercelulares característicos de
carcinoma, entretanto sem a característica produção de laminina. Pode ser
transplantado por inoculação intramuscular, subcutânea (situações em que o tumor
10
se apresenta sólido e frequentemente apresenta necrose central, e apesar de
invasivo, não produz metástases) ou intraperitonial (desenvolvendo-se como “tumor
líquido”) (Qi & Xu, 2006). Cresce em 90 a 100% dos animais e regride
espontaneamente em 8 a 10%. A morte dos animais, segundo a história natural do
tumor, ocorre entre 28 e 30 dias (Zuckerberg, 1973; Sato & Wal, 2002).
Quimioterapia antineoplásica
De acordo com o INCA (2014), o tratamento do câncer pode ser feito através
de cirurgia, radioterapia, quimioterapia, hormônioterapia, terapia-alvo ou transplante
de medula óssea, sendo que o papel de cada um desses tratamentos depende do
tipo de tumor e de seu estágio de desenvolvimento. Em muitos casos, é necessário
combinar mais de uma modalidade.
Além dos tipos de tratamentos citados acima, outras modalidades de
tratamento, como a terapia fotodinâmica e a hipertermia (ainda em estudos clínicos),
têm sido utilizadas em combinação para o tratamento contra o câncer (Dolmans et
al., 2003; Rao et al., 2010).
A quimioterapia antineoplásica tem como objetivo o tratamento de diversos
tumores malignos, tornando-se uma das mais importantes e promissoras maneiras
de combater o câncer. Essa forma de tratamento pode ser empregada de forma
curativa ou paliativa, dependendo do tipo e extensão do tumor, além da condição
física do paciente. A associação da quimioterapia a outras formas de tratamento é
bastante comum (Mealey et al., 1994). Seu emprego antes da cirurgia e/ou
radioterapia na tentativa de promover a erradicação de micrometástases constitui a
quimioterapia neo-adjuvante. Porém, o uso depois da cirurgia e/ou radioterapia
constitui a quimioterapia adjuvante (Sonis, 1998).
A quimioterapia com fármacos citotóxicos é o principal método de tratamento
de alguns cânceres, mas tem tido uso crescente como adjuvante da cirurgia ou da
radioterapia em vários tipos de tumores. A introdução da quimioterapia aumentou
significativamente os índices de cura de alguns tumores, em especial das neoplasias
hematológicas (Chu e Sartorelli, 2006; Chabner et al., 2006).
11
Os quimioterápicos são divididos em grupos de acordo com suas
especificações farmacológicas e suas funções. Esses agentes podem agir em uma
determinada fase do ciclo (ciclo-específico/fase-específico), no ciclo como um todo
(cicloespecífico/fase não-específico), ou não agirem necessariamente em fases de
crescimento celular, mas em células de repouso (Rang e Dale, 2007). Podem ser
divididos em cinco grupos:
Agentes alquilantes: são ciclos-específicos, mas não fase-específico. Sua função é
impedir a síntese de DNA, atuando na formação de ligações covalentes com o DNA.
Ex: mostarda nitrogenada, etileniminas, alquilsulfonados, triazenos.
Antimetabólicos: seu efeito principal é bloquear a síntese de DNA. São restritas as
fases de síntese do ciclo celulares (ciclo e fase-específico). Ex: análogos das
purinas, análogos das pirimidinas e análogos do ácido fólico.
Antibióticos citotóxicos: são geralmente ciclo-não-específicas, agem intercalando
com o DNA, impedindo sua duplicação e a produção de RNA mensageiro. Essas
drogas interferem diretamente, impedindo a ação da topoisomerase, uma enzima
nuclear que permite que a estrutura tridimensional da proteína se desfaça,
permitindo que as hélices de DNA fiquem alinhadas durante a fase de replicação.
Ex: antraciclinas, mitoxantrona, dactinomicina, bleomicina e mitomicina C.
Alcalóides da Vinca ou antimitóticos: Atuam especialmente inibindo a montagem
do fuso mitótico, ligando-se às proteínas microtubulares e conseqüentemente
interrompendo a divisão celular na metáfase. Ex: alcalóides da vinca, taxanos e
camptotecina.
Agentes diversos: não se encaixam nas categorias anteriores, este grupo abrange
uma série de fármacos desenvolvidos recentemente. Ex: dacarbazina, L-
asparaginase, imatinibe.
De acordo com dados do INCA (2012), a finalidade da quimioterapia depende
basicamente do tipo de tumor, da extensão da doença e do estado geral do
paciente. De acordo com sua finalidade, a quimioterapia pode ser classificada em:
Curativa: objetiva a ausência de evidências de doenças pelo mesmo período de
tempo que outra pessoa sem câncer. Ex: leucemias agudas e tumores germinativos.
12
Paliativa: visa minimizar os sintomas decorrentes da proliferação tumoral e melhorar
a qualidade de vida da criança, aumentando seu tempo de sobrevida, em função de
uma redução importante do número de células neoplásicas.
Potencializadora: quando utilizada simultaneamente à radioterapia no sentido de
melhorar a relação dose terapêutica/dose tóxica do tratamento com irradiação.
Objetiva principalmente potencializar o efeito das drogas no local irradiado e
conceitualmente não interfere no efeito sistêmico do tratamento. Ex: tumor de
pulmão.
Adjuvante: quando é administrada posteriormente ao tratamento principal, quer seja
cirúrgico ou radioterápico.
Neo-Adjuvante: quando é administrada previamente ao tratamento definitivo, quer
seja cirúrgico ou radioterápico. Objetiva tanto a diminuição do volume tumoral,
quanto à eliminação de metástases não-detectáveis clinicamente já existentes ou
eventualmente formadas no momento da manipulação cirúrgica. Ex: sarcomas.
Progressos importantes na quimioterapia antineoplásica foram registrados na
área da biologia molecular e celular, o que facilitou, juntamente com o maior
entendimento do mecanismo de ação de muitas substâncias, a aplicação mais
racional dos quimioterápicos e o planejamento de novos fármacos. Muitas das
substâncias citotóxicas mais potentes atuam em fases específicas do ciclo celular e,
consequentemente, só exercem a sua atividade em células que se encontram em
processo de divisão. Sendo assim, os fármacos antineoplásicos apresentam melhor
atividade “antiproliferativa” do que antineoplásica, visto que atuam tanto em células
normais com rápida divisão e células neoplásicas, acarretando assim diversos
efeitos colaterais (Mcknight, 2003; Chabner e Roberts, 2005).
O ataque indiscriminado promovido pelas drogas antineoplásicas às células
de rápida proliferação, cancerosas ou normais, produz os indesejáveis efeitos
colaterais ou tóxicos, conhecidos e extremamente temidos pelos indivíduos que
necessitam submeter-se ao tratamento (Mealey et al., 1994).
13
Ciclo celular e Morte Celular
Nos últimos anos, houve uma evolução no conhecimento sobre proliferação
celular, o que proporcionou um crescimento no conhecimento da biologia celular.
Esse avanço promoveu novas abordagens para o desenvolvimento de agentes
antineoplásicos. É importante considerar as características especiais da célula
cancerosa, para a compreensão da atuação dos agentes antineoplásicos atuais e a
descoberta da atuação dos novos medicamentos (Laurence et al., 1997).
As células eucarióticas dão origem às células-filhas idênticas através de ciclos
de divisão. A divisão celular é um conjunto ordenado de eventos, e é dividido em
duas fases: a interfase, período em que as células multiplicam seu material genético
e sintetizam produtos necessários para sua divisão; e a mitose, que constitui na
divisão celular propriamente dita. A divisão celular é um evento rigorosamente
controlado e dividido em quatro fases: intervalo G1, fase S ou de síntese do DNA,
intervalo G2 e mitose (fase M) (Garrett, 2001).
As fases do ciclo celular são divididas em funcionais e preparatórias. As fases
funcionais são a fase S, com síntese do DNA, e a fase M, ou mitose, com
segregação dos cromossomos duplicados. As fases preparatórias são a G1 (gap 1)
que prepara a célula bioquimicamente para a fase S, com a produção de fatores de
crescimento celular que são essenciais para formação de uma nova célula e G2
(gap 2), em que ocorre a síntese de componentes para a mitose. As células que não
se dividem ativamente podem ser permanentemente removidas do ciclo por
diferenciação, ou ficar temporariamente presas na fase G0, em um estado inerte,
com atividade nuclear baixa, devido ao fato de que o DNA apresenta-se super-
enovelado (Almeida et al., 2005).
O fluxo de uma fase para outra, ocorre apenas após os rigorosos mecanismos
reguladores serem ativados em pontos estratégicos do ciclo, nos chamados de
“pontos de checagem” ou “checkpoints”. Esses pontos de checagem ocorrem
predominantemente em G1, na transição G1/S, na transição G2/M e na mitose, na
transição metáfase/anáfase. Os pontos de checagem do ciclo celular atuam
interrompendo o ciclo celular caso determinados eventos não se complete. O avanço
através de G1 e G2 também pode ser atrasado pelos mecanismos de frenagem
caso houver danos no DNA cromossômico. O atraso nestes pontos de checagem
14
fornece tempo para que ocorra a reparação ao DNA danificado, então a frenagem do
mecanismo é liberada e o ciclo celular é retomado, ou se necessário a célula pode
desencadear o processo de apoptose (Gallorini et al., 2012).
As quinases dependentes de ciclina (CDK) juntamente com as proteínas
ciclinas são consideradas essenciais ao processo de regulação da progressão do
ciclo celular positivamente, e os inibidores de CDKs possuem um papel fundamental
na regulação negativa do ciclo celular. Os inibidores de CDKs, chamados de CKIs
(Inibidores de Quinase-Ciclina) podem ser classificados em dois tipos principais: os
inibidores universais, como p21, p27 e p57, que atuam em diversos momentos do
ciclo celular, por meio de sua ligação a CDKs complexadas com as ciclinas; e os
inibidores específicos, a família de genes INK4 (inibidores específicos da CDK4)
p15, p16, p18 e p19, que interferem na ligação das ciclinas D com as CDKs (Pinto e
Felzenszwalb, 2003; Schwartz e Shah, 2005; Tajara, 2004).
A proteína p53 também possui um papel fundamental na regulação do ciclo
celular, assim como na indução de apoptose. Quando há danos na molécula de
DNA, essa proteína ativa a transcrição de vários genes envolvidos no controle
celular (p21, Gadd45), e genes envolvidos na indução da apoptose, como a proteína
Bax (Proteína X associada ao Bcl-2) (Silva, 2003).
A perda do controle do ciclo celular é uma das principais características dos
cânceres. Alterações genéticas resultantes da desregulação de oncogenes e genes
supressores tumorais nos componentes do ciclo celular e nas vias de sinalização
dos mecanismos de checkpoint ocorrem na maioria dos tumores humanos. Essas
alterações possuem importantes implicações para a otimização das atuais terapias e
para a seleção de novos alvos do ciclo celular (Stewart et al., 2003).
A descoberta de drogas anticancerígenas pode ser resultado de testes
empíricos ou da síntese dirigida de substâncias. Os testes empíricos consistem na
seleção aleatória dos compostos que são testados em animais experimentais com
tumores. A síntese dirigida de substâncias químicas e de produtos biológicos contra
as células tumorais constitui um dos métodos empregados na atualidade, para
triagem de diversas drogas sintetizadas por grandes universidade e laboratórios. As
descobertas podem ser também, resultado de observações feitas ao acaso,
15
geralmente de substâncias sintetizadas para outras finalidades (Mather, 1998;
Freshney, 2000).
A compreensão da cinética do ciclo celular é essencial para o uso apropriado
de novos fármacos antineoplásicos, tendo em vista que na quimioterapia
antineoplásica muitos fármacos exercem seus efeitos citotóxicos principalmente
através de sua atuação sobre o ciclo celular (Chabner et al., 2006).
O Comitê de Nomenclatura sobre Morte Celular (NCCD) classifica a morte
celular de acordo com critérios morfológicos, enzimáticos (sem envolvimento de
nucleases ou com o envolvimento de distintas classes de proteases como caspases,
catepsinas e transglutaminase) e aspectos funcionais (morte programada ou
acidental, fisiológico ou patológico) (Kroemer et al., 2009; Galluzzi et al., 2012). Os
tipos de morte celular, segundo Galluzzi et al., (2012), são: apoptose, necrose
regulada, autofagia e catástrofe mitótica (Figura 3). Além dessas, outras
modalidades de morte celular, tais como anóiques, entose, piroptose, têm sido
citadas como novas modalidades de morte celular.
Figura 3: Vias de sinalização de receptores de morte e receptores dependentes durante a apoptose
via extrínseca. Fonte: Galluzzi et al. (2012).
16
Sabe-se hoje que a necrose não é somente um mecanismo de morte
acidental de células, podendo ocorrer de maneira regulada através de um
mecanismo chamado “necroptose”, e que a morte celular necrótica tem um
importante papel em processos fisiológicos e patológicos (Fulda, 2013).
A necrose possui como características morfológicas: aumento do volume
celular, acompanhado de inchaço de organelas, formação extensiva de vacúolos
intracelulares que culmina na ruptura da membrana plasmática e na perda de
conteúdo intracelular. Semelhantemente à apotose, células necróticas externalizam
fosfatidilserinas antes da permeabilização da membrana plasmática, promovendo,
assim, o seu reconhecimento pelos fagócitos (Galluzzi et al., 2011).
Recentemente, iniciou-se a identificação dos mecanismos moleculares
responsáveis pela necroptose. É importante ressaltar que a necroptose pode ser
ativada pelos mesmos ligantes que ativam a apoptose, como, por exemplo, Fator de
Necrose Tumoral (TNF), Ligante de Receptor de Morte Celular (FasL) e Ligante
Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose Tumoral (TRAIL). Contudo,
os eventos que deflagram tais vias de morte ainda precisam ser mais esclarecidos
(Galluzzi, 2012).
A apoptose é a forma mais conhecida de morte celular programada, esta
desempenha um importante papel durante o desenvolvimento embrionário, na
manutenção da homeostase celular e em uma variedade de doenças, como o
câncer. Morfologicamente, a apoptose possui como principais características: o
encolhimento celular, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos.
As modificações morfológicas podem ser acompanhadas por alterações
bioquímicas, como a externalização da fosfatidilserina na membrana celular,
ativação de proteases e fragmentação do DNA internucleossomal em fragmentos de
180 a 200 pares de bases. Entretanto, somente as alterações bioquímicas não
devem ser utilizadas para definir morte celular via apoptose, tendo em vista que
esse tipo de morte celular pode ocorrer sem fragmentação de DNA, e sem ativação
de caspases (Galluzzi et al., 2007; Liu et al., 2009).
17
A apoptose pode occorer por duas vias principais: a via extrínseca (Figura 3),
que pode ser acionada por estímulos de receptores específicos presentes na
superfície celular, chamados receptores de morte célular (TNF), e a via intrínseca ou
mitocondrial (Figura 4), que ocorre por meio de estresse intracelular (Galluzzi et al.,
2012). Essas vias podem estar relacionadas com a ativação de proteases
denominadas como caspases executoras, que são geralmente divididas dentro de
duas categorias: caspases iniciadoras, que incluem caspases 2, 8, 9 e 10, e
caspases efetoras, caspases 3, 6 e 7 (Shi, 2002).
Figura 4: Via de apoptose mitocondrial dependente e independente de caspase. Fonte: Galluzzi et al.
(2012).
A via apoptótica extrínseca é desencadeada normalmente pela interação
entre sinais de morte celular TNFα, FASL/CD95 (Ligante de Receptor de Morte
Celular), e TRAIL (Ligante Indutor de Apoptose Relacionado ao Fator de Necrose
Tumoral) e receptores da família TNF-R (Receptor do Fator de Necrose Tumoral).
Quando ocorre essa interação, os receptores formam agregados que, na forma de
trímeros, ligam-se à proteína adaptadora FADD presente no citoplasma. Ocorre,
18
então, a ligação dessas moléculas à pró-caspase-8, resultando na formação de um
complexo denominado DISC, que culmina na autoclivagem e ativação da caspase 8.
A caspase 8 pode assim, diretamente ou pela via mitocondrial, ativar a caspases
efetoras 3 e 7, o que resulta na apoptose celular (Figura 3) (Fulda, 2009; Galluzzi et
al., 2012).
A ativação da via extrínseca também pode ser desencadeada por meio da via
de receptores dependentes. Como por exemplo pelos receptores UNC5A-D e
Deleção Carcinoma Coloretal (DCC), os quais exercem funções de apoptose
somente quando os níveis de seus ligantes (Netrina-1) estão em baixas quantidades
na célula. A indução de apoptose através do receptor DCC é ativada quando, na
ausência de seus ligantes, DCC interage com as proteínas TUCAN e DRAL para a
montagem do complexo, o qual irá ativar a pró-caspase-9. O receptor UNC5-B, na
ausência do seu ligante Netrina-1, induz a apoptose através do recrutamento da
proteína fosfatase 2A (PP2A), a qual realiza a desfosforilação/ativação da proteína
DAPK (Proteína Quinase serina/treonina Associada à Morte), conhecida por induzir
a morte celular por mecanismos dependentes e independentes de p53. DAPK
induzir a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP) e a ativação
das caspase 9 e caspase 8 (via Bid) (Galluzzi et al., 2012; Delcros e Mehlen, 2013).
A família de proteínas Bcl-2 é conhecida como reguladores da via intrínseca.
Membros pró-apoptóticos (Bax, Bak, Bad, Bid) e antiapoptóticos (Bcl-2 e Bcl-x) são
considerados uns dos mais importantes desta família. As proteínas antiapoptóticas
agem como repressores da apoptose, bloqueando a liberação de citocromo c,
enquanto as proteínas próapoptóticas atuam como promotores de apoptose
(Tsujimoto, 2002; Ghobrial et al., 2005).
A via intrínseca ou mitocondrial (Figura 4) é ativada principalmente pela
presença de sinais de estresse intracelular, como sobrecarga de Ca2+, alterações
metabólicas, estresse oxidativo, danos ao DNA, e redução de fatores de
crescimento, que ocasionam a ativação de proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-
2, como Bax, Bak e Bid. Com a ativação de Bid, a proteína pró-apoptótica Bax é
ativada e migra do citoplasma para a mitocôndria, alterando sua permeabilidade e
permitindo a liberação de fatores apoptogênicos como o citocromo C, AIF (Fator
Indutor de Apoptose), Smac (Segundo Ativador de Caspase derivado da
19
Mitocôndria)/DIABLO (Inibidor Direto de Protéinas IAP), endonuclease G e
Omi/HtrA2 para o citosol. Essas proteínas apoptogênicas acionam a morte celular
através de mecanismos independentes e dependentes de caspases (Saelens et al.,
2004).
A alteração do potencial de membrana mitocondrial interna e a transição da
permeabilidade mitocondrial, além de promoverem a liberação de moléculas
apoptogênicas, levam ao colapso dessa membrana, interrompendo a síntese de
ATP e aumentando, consequentemente, a produção de espécies reativas de
oxigênio (Galluzzi et al., 2012).
O mecanismo de apoptose mitocondrial dependente de caspases ocorre com
a liberação do citocromo c, a partir da mitocôndria, levando à ativação de caspase-3
através da ligação do citocromo c à proteína adaptadora Apaf-1 (Protease
Apoptótica Ativadora de Fator 1) e a prócaspase 9, levando à formação do
apoptossomo e à ativação da caspase 9, a qual irá ativar as caspases 3 e 7. As
proteínas Smac/Diablo e Omi/HtrA2 facilitam a ativação das caspases através da
apreensão ou degradação de proteínas da família IAPs (Stephen e Green, 2010;
Galluzzi et al., 2012).
A indução de morte celular programada por mecanismos independentes de
caspases, envolve a participação de proteases, como Calpainas, Catepsina B,
Granenzima A e B, Omi/htra2, Endonuclease G e AIF. Essas proteases, na maioria
das vezes, cooperam na via apoptótica dependente de caspases. Não obstante,
dados recentes sugerem que elas também podem acionar mudanças morfológicas
que são características de apoptose independente de caspases. No mecanismo de
apoptose independente de caspases, as proteínas AIF e Endonuclease G atuam
através da clivagem da molécula de DNA. Já a proteína Omi/htra2 realiza a clivagem
de vários substratos, como proteínas do citoesqueleto, através da atividade serina
protease (Jaattela e Mathiasen, 2002; Galluzzi et al., 2012).
Uma interação entre as vias extrínseca e mitocondrial ocorre em diferentes
níveis. Em alguns tipos de células, conhecidas como células de tipo I, a ativação de
caspase 8 é suficiente para ativar diretamente as caspases efetoras 3 e 7 para
completar a excecução da apoptose de uma maneira independente da via
mitocondrial. Já em células como hepatócitos e células pancreáticas β (células de
20
tipo II), caspase-8 medeia a clivagem proteolítica de Bid (Domínio de Morte de
Interação com BH3) que leva à geração da permeabilização da membrana
mitocondrial e, consequentemente, ativação da via intrínseca ou mitocondrial (Li e
Yuan, 2008; Galluzzi et al., 2012).
Pesquisas realizadas nesta última década têm demonstrado que a morte
celular provocada pelas drogas quimioterápicas ocorre principalmente por indução
de apoptose. Esta classe de drogas tem o potencial de restabelecer a apoptose
celular, processo este alterado em células cancerígenas (Parkinson, 2001).
Compostos baseados em metais utilizados na terapia antineoplásica
Há mais de 3500 anos, metais preciosos são usados para propostas
medicinais. Naquela época, metais nobres eram confiáveis para beneficiar a saúde,
pela sua raridade. O ouro, por exemplo, foi utilizado em várias áreas da medicina na
Arábia e China. Recentemente, pesquisas têm associado propriedades medicinais
de drogas inorgânicas com suas propriedades biológicas específicas (Allardice &
Dyson, 2001).
A descoberta da atividade antitumoral da cisplatina {cis-[PtCl2(NH3)2]} foi ao
acaso, ocorreu quando Rosemberg e seus colaboradores, em 1965, estudavam os
efeitos dos campos elétricos sobre o crescimento celular bacteriano. Quando a
corrente era fornecida através de eletrodos de platina para o crescimento das
bactérias, a divisão celular era inibida, e elas passavam a crescer em forma de
longos filamentos, o mesmo fenômeno ocorria quando as bactérias eram tratadas
com agentes alquilantes. Foi constatado, após uma análise mais extensa, que os
íons de platina eram liberados a partir dos eletrodos durante a eletrólise, e, em
presença de sais de amônio e luz, a cisplatina (cis- [Pt(NH3)2Cl4]) era formada, e
esta coibia ciclo replicativo bacteriano pelos complexos amino-platina formados
(Pizarro et al., 2009).
Hoje, após quase 50 anos de sua aprovação como um agente quimioterápico
pela Food and Drug Administration (FDA), drogas a base de cisplatina ainda são os
anticancerígenos mais utilizados do mundo. Sendo que a quimioterapia baseada na
cisplatina é responsável pela cura de mais de 90% dos casos de câncer testicular e
21
possui uma importante função em tratamentos contra o câncer de cabeça e
pescoço, de ovário, câncer cervical, câncer de bexiga, cólo de útero, melanoma e
linfomas (Pizarro et al., 2009).
A partir da descoberta da cisplatina, houve uma grande motivação e
intensificação na pesquisa e no desenvolvimento de fármacos à base de metais e,
com isso, complexos inorgânicos são utilizados em inúmeras pesquisas
terapêuticas, com diversas aplicações em diferentes ramos da medicina, inclusive na
terapia anticâncer (Dyson e Sava, 2006; Sussfink, 2010; Sabale et al., 2012).
Atualmente, centenas de análogos à cisplatina foram sintetizadas e avaliadas,
porém, apenas cinco compostos são utilizados na terapia antineoplásica: a
carboplatina e oxaloplatina, utilizadas mundialmente, e a nedaplatina, lobaplatina e
heptaplatina, utilizados somente no Japão, na China e na Coreia (Hartinger et al.,
2006).
Os complexos de platina utilizados na quimioterapia são considerados um dos
principais pilares no tratamento do câncer, sendo que o uso de compostos de platina
(sozinhos ou em combinação) representam 40 a 80% dos tratamentos de pacientes
com câncer. A cisplatina é utilizada no tratamento de diversos tumores, dentre eles
tumores de ovário, testículo, bexiga, mama; a carboplatina é utilizada para
tratamentos de câncer de ovário; e, por último, a oxaliplatina, utilizada para câncer
de coloretal (Kelland, 2007).
O mecanismo de ação da cisplatina é comparável ao dos agentes alquilantes,
em que baseia-se na sua ligação covalente com o DNA, através da formação de
aductos, originando ligações intra e intercadeias, que induzem alterações estruturais
no DNA. Essas alterações inibem a transcrição e a replicação do DNA, levando à
morte celular. Porém, o seu mecanismo de ação ainda não está completamente
esclarecido. (Pizarro e Sadler, 2009).
Apesar da grande contribuição de fármacos à base de platina na
quimioterapia antineoplásica, sérios problemas são enfrentados durante a
administração desses fármacos, os conhecidos efeitos colaterais, são principalmente
sintomas gastrointestinais (náuseas, vômitos, diarreia), nefro e neurotoxicidade.
Outro problema enfrentado é a resistência, pois, após 4 a 6 ciclos de tratamento, os
22
tumores, inicialmente sensíveis ao medicamento, tornam-se resistentes (Kartalou e
Essigmann, 2001; Jirsova et al., 2006). Essas limitações têm estimulado à busca de
novos complexos metálicos de transição, que apresentem reduzida toxicidade e
melhor efetividade, tais como complexos contendo rutênio, gálio, ferro, titânio, ouro
(Kostova, 2006; Alama et al., 2009).
Apesar do sucesso indiscutível da cisplatina e medicamentos à base de
platina, o mercado de drogas ainda é acessível para novas drogas á base de metal
que ofereçam especialmente a possibilidade de administração oral, o que pode
ajudar a diminuir os efeitos colaterais graves e custos clínicos. Além disso também,
a possibilidade de novas drogas com maior eficácia, ou seja, drogas que interajam
de forma diferente com o DNA, o que pode levar à superação da resistência inata ou
adquirida de certos tipos de tumores (Pizarro et al., 2009).
Em 1970, Clarke e colaboradores, estudaram o pentamino-(purina)-
rutênio(III), e relataram que este composto é capaz de inibir a síntese de DNA e
proteínas em células de carcinoma de nasofaringe in vitro, o que desencadeou o
interesse em complexos de rutênio como potenciais fármacos anticancerígenos.
Durante a década seguinte, Mestroni e colaboradores, em 1989, desenvolveram
complexos hexacoordenados com Ru(II)dimetilsulfóxido e ligantes de cloreto, em
particular os cis- e trans-RuCl2 (dimetilsulfóxido)4, e foi evidenciado a atividade
anticancerígena dos mesmos in vitro e in vivo. Os complexos mostraram interagir
tanto in vitro quanto in vivo com o DNA, o seu alvo mais provável (Pizarro et al.,
2009).
Hoje, duas drogas anticancerígenas baseadas em Rutênio estão em fase de
ensaios clínicos: o NAMI-A, desenvolvido em Trieste por Mestroni e colaboradores
em 1998, e o KP1019, desenvolvido por Keppler e colaboradores em 1996, na
cidade de Viena (Pizarro et al., 2009).
O antitumoral NAMI-A possui uma citotoxicidade relativamente baixa para as
células cancerosas, mas é particularmente eficaz contra metástases de tumores
sólidos, tanto em tumores experimentais de murinos, quanto em tumores humanos
enxertados em camundongo nude, sendo pouco eficaz em tumores sólidos. A droga
já concluiu a fase I nos ensaios clínicos (Pizarro et al., 2009). Diferentemente de
outras drogas anticâncer baseadas em metais, a atividade antimetastática do NAMI-
23
A ocorre devido aos efeitos combinados sobre o controle da angiogênese
(possivelmente porque interfere com o metabolismo de NO in vivo) e propriedades
anti-invasivas para as células tumorais e nos vasos sanguíneos. Embora tenha sido
relatada a interação NAMI-A com o DNA in vitro, essa ligação pode não contribuir
para o seu mecanismo de ação (Vacca et al., 2002; Pizarro et al., 2009).
Em investigações pré-clínicas, o composto Indazolium trans-
[(tetracloreto)bis(1H-indazol)rutênio(III)], conhecido como KP1019 ou FFC14A,
apresentou atividade citotóxica contra carcinoma de cólon em ratos. Foi proposto
que um dos alvos biológicos do KP1019 é o DNA, e também tem sido relatado que a
droga desencadeia morte celular por apoptose (Kapitza et al., 2005). No entanto, os
mecanismos celulares de ativação da apoptose ainda estão sob investigação (Egger
et al., 2005, Kapitza et al., 2005; Bergamo e Sava, 2007).
Avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade em cultura celular.
Em geral, prejuízo celular induzido por algum agente citotóxico é considerado
como toxicidade celular. O parâmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade celular
é através da viabilidade celular, sendo estes ensaios cruciais em estudos
toxicológicos. Os ensaios de viabilidade celular utilizam corantes vitais (Rogero et
al., 2003). Estes ensaios podem ser realizados em sistemas celulares in vitro, sendo
relativamente fáceis de execução (Donato et al., 2008).
A citotoxicidade em cultura celular pode ser realizada utilizando ensaios
colorimétricos, como o ensaio MTT, que utiliza 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil
bormeto tetrazolina, um sal tetrazolina amarelo (Mosmann, 1983). O ensaio MTT é
um teste quantitativo que avalia indiretamente a viabilidade das células quando
expostas a determinadas concentrações de compostos possivelmente citotóxicos
(Bopp; Lettieri, 2008; Moore; Yedjou; Tchounwou, 2010; Peres et al., 2008). O
primeiro relato do uso da técnica MTT para a avaliação de citotoxicidade em cultura
celular foi com Phillips (1996) explorou a técnica de cultura celular para testar a
toxicidade de cinco plantas, cujos produtos podem ter efeitos tóxicos ou benéficos.
Extratos vegetais foram avaliados em culturas celulares de ovário de hamster chinês
(CHO) e hepatócitos. Os resultados sugeriram que os testes de cultura de células
24
podem ser úteis para detectar e avaliar os efeitos de toxinas e antitoxinas de
produtos vegetais em células.
A capacidade que algumas substâncias têm de induzir alterações no material
genético de organismos a elas exposto é chamado de Genotoxicidade. Os objetivos
dos testes de genotoxicidade são detectar mutágenos e carcinógenos, estudar os
mecanismos de mutagênese e carcinogênese química, e avaliar os perigos de
compostos químicos mutagênicos e carcinogênicos para os seres humanos (Sasaki
et al., 2000; Wasson; Mckelvey-Martin; Downes, 2008). Sendo assim, a avaliação do
potencial genotóxico de um composto pode ser feito por meio de ensaios que
investiguem o dano genômico como, por exemplo, o ensaio de eletroforese em gel
de célula única, conhecido como ensaio Cometa. O ensaio cometa vem sendo
proposto para estudos de toxicogenética devido a suas peculiaridades e vantagens
quando comparado a outros testes para detecção de substâncias genotóxicas. Este
ensaio não é utilizado para detectar mutações, mas sim lesões genômicas que, após
serem processadas, podem resultar em mutação. Diferente das mutações, as lesões
detectadas pelo ensaio cometa são passíveis de correção (Ribeiro et al., 2003). O
potencial para causar danos ao DNA pode ser avaliado rapidamente, pois há uma
rápida detecção dos danos imediatamente após a injúria ao DNA, sem qualquer
necessidade de se esperar pela progressão das mitoses, e o teste cometa pode ser
considerado como um biomarcador de genotoxicidade, para animais e plantas
(ZUCCHI et al., 2004).
25
OBJETIVO
Determinar a atividade citotóxica, genotóxica e mecanismo de indução de morte
celular de um composto a base de rutênio frente a linhagens tumoral e normal, com
o intuito de alcançar um novo protótipo antitumoral que seja menos citotóxico para
as células normais.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a atividade citotóxica do complexo [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
(Ru25);
Analisar a mudança na cinética do ciclo celular após tratamento do composto;
Avaliar o tipo de morte celular pela presença da fosfatidilserina na superfície
externa da membrana plasmática;
Analisar a genotoxicidade de células sadias tratadas com o complexo Ru25;
Determinar a presença de proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas após
tratamento de células tumorais com o Ru25.
MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido de acordo com as metodologias descritas no fluxograma
apresentado na figura 5.
26
Figura 5: Fluxograma contendo as metodologias utilizadas no trabalho desenvolvido.
Síntese
• Complexo de Rutênio II (Ru25)
Cultura Celular
• Linfócito
• Sarcoma 180
Triagem Citotóxica
• MTT
• A. salina
Citometriade Fluxo
• Ciclo Celular
• Anexina V/PI
• Bcl-2
Western Blot• Análise Protéica
Genotóxico
• Cometa
27
Síntese e diluição do complexo de rutênio (II)
O complexo [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (Figura 6) foi sintetizado no Laboratório
de Química do Instituto de Química da Universidade Federal de São Carlos,
conforme o artigo de Pereira, et al., 2014 (submetido), e encaminhado ao
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética da Universidade Federal de Goiás
(UFG) para realização dos ensaios de atividade biológica e mecanismo de morte
celular. Para os ensaios biológicos, o composto foi pesado e diluído em dimetil
sulfóxido (DMSO), resultando em uma concentração final de 0,1%.
P
F F
F F
F
F
Ru
P
P
Cl
N
N
N
Figura 6: Fórmula estrutural do composto [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6.
Linhagens celulares e manutenção do cultivo celular
Para os ensaios biológicos, foram utilizadas a linhagem tumoral estabelecida de
camundongo Sarcoma 180 (S-180) (ATCC®# TIB-66) e como célula normal (basal)
a linhagem de linfócitos (Número do protocolo: 043/2007). Ambas as linhagens
foram mantidas em cultura a 37 oC, 5% CO2 em meio RPMI 1640 suplementado com
5% de soro bovino fetal, 100IU mL-1 de penicilina e 100 μg mL-1 de estreptomicina
segundo protocolo estabelecido pela American Type Culture Collection (ATCC,
Rockville, MD, EUA).
28
Ensaio de Viabilidade Celular pelo Método Redução do MTT
Para avaliar a atividade citotóxica do complexo de rutênio, foi utilizado o método
colorimétrico do MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)2,5-Difenil Brometo de Tetrazolium). O
princípio desse método descrito por Mosman (1983) consiste em medir
indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células
vivas.
Para o teste do MTT, 1 x 105 de células S180 e 2 X 104 de linfócitos, foram
plaqueadas em microplacas de 96 poços na ausência ou presença do composto em
diluição (0,2 a 200 μM). Após tratamento de 48 horas, as células foram incubadas
em estufa a 37°C com atmosfera contendo 5% de CO2. Ao final do período de
incubação, foram adicionados aos poços de cultivo celular 10 μL de MTT na
concentração de 5 mg.mL-1, e após 3h de incubação com o MTT, foram
acrescentados 50 μL SDS a 10% diluído em HCL/0,01N. A quantificação da
densidade óptica (DO) foi medida em espectrofotômetro (Awareness Technology
INE/ Stat Fax 2100).
A porcentagem de viabilidade celular foi determinada a partir da seguinte
fórmula: % Viabilidade = Absorbância do Tratamento/Absorbância do controle
negativo*100. O valor de IC50 (concentração em μM que inibe 50% da viabilidade
celular) foi determinada por meio da curva dose resposta utilizando o programa
estatístico GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A partir
do valor de IC50 obtido sobre células tumorais (S180) e células normais (linfócitos), o
complexo de rutênio (II) foi selecionado para a continuação dos ensaios de
mecanismo de morte celular.
Ensaio de toxicidade pelo teste de letalidade de Artemia salina
A avaliação da toxicidade do composto pela determinação da concentração
letal a 50% (CL50) das larvas de Artemia salina Leach um pequeno crustáceo
conhecido como camarão de água salgada. O ensaio com Artemia salina permite
atavés de uma avaliação preliminar da toxicidade além de ser eficiente, rápido e
baixo custo.
29
Foi colocado 1 g dos cistos de A.salina previamente comprados
comercialmente em 1 L de água marinha artificial (40 g/L de sal marinho
suplementado com extrato de levedura e com pH ajustado a 8,5 com 0,1 M Na2CO3)
com aeração e incubação ao abrigo de luz direta por 36 h a 25 ºC. Foi separado os
náuplios das cascas dos cistos utilizando uma lâmpada artificial e pipeta de Pasteur,
em uma placa de Petri com 5 mL de água marinha artificial (AMA) fresca foi
transferido para o concentrador de náuplios ( MOLINA et al, 2006).
Em microplaca de poliestireno com concentrações seriadas dos compostos a
serem testasdos 1000 µg/ml; 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml. Para uma
maior precisão do teste foi feita triplicatata de cada concentração no mesmo teste,
foi adcionado em cada poço 10 larvas de Artemia salina, pipetadas uma por uma
com volume de 10 µL de água marinha artificial a cada repetição com total de 100 µL
de solução em cada poço.
Após 24 h em temperatura ambiente foi realizada a leitura das larvas com
auxílio de um microscópio com a contagem de larvas imóveis por 10 segundos. Em
seguida foi realizado os cálculos da (CL50) dos compostos a partir do método
PROBIT com auxílio do programa BioStat 2009 professional.
Avaliação Genotóxica: Teste Cometa
Para detecção de danos na fita simples e/ou dupla do DNA, foi utilizada a
versão alcalina do ensaio cometa segundo Singh (1988), onde 1 x 105 células de
Linfócitos foram semeados na ausência ou presença do complexos de Ru25 [5 e 10
µM] por 24 horas. Após tratamento, a suspensão de células foram homogeneizadas
com 100 µL de agarose de baixo ponto de fusão (0,5%) e, então, colocadas em
lâminas que já continham agarose padrão (1,5%). Estas lâminas foram
posteriormente colocadas a 4°C por 10 minutos e, em seguida, colocadas em
solução de lise (2,4M NaCl; 100 mM EDTA; 10 mM Tris, 10% DMSO e 1% Triton-X,
pH 10) por 24 horas. Após etapa de lise, as lâminas foram transferidas para cuba de
eletroforese contendo tampão (NaOH 300mM + EDTA 1mM, pH ~13) a 4ºC, com
uma corrente elétrica de 300 mA e tensão de 25 V. Na etapa seguinte, as lâminas
foram retiradas da cuba de eletroforese e posteriormente submetidas a uma solução
30
de neutralização (0,4M Tris–HCl, pH 7,5) por 15 min. Após a secagem das lâminas,
elas foram então fixadas em etanol 100% por 3 min. A coloração das lâminas foi
realizada com brometo de etídio (20 µg mL-1) e analisadas imediatamente após
coloração. As lâminas foram preparadas em duplicata e 100 nucleóides foram
analisados (50 nucleóides de cada lâmina) utilizando microscópio de fluorescência
(Leica, Wetzlar, Alemanha) com interface com um computador. As imagens obtidas
foram analisadas em sistema de análise de imagem do software Comet Score 15 de
acordo com a migração dos fragmentos, considerando-se os seguintes parâmetros:
comprimento do cometa, diâmetro da cabeça e comprimento da cauda.
A partir destes parâmetros, foi determinada a classe como proposto por
Kobayashi et al., (1995): classe 0 (nenhum dano), classe 1 (pequeno dano,
comprimento da cauda menor do que o diâmetro da cabeça ), classe 2 (médio dano,
comprimento da cauda uma ou duas vezes o diâmetro da cabeça), classe 3 (dano
significativo, comprimento da cauda maior que duas ou três vezes o diâmetro da
cabeça), classe 4 (dano significativo, comprimento da cauda maior que três vezes o
diâmetro da cabeça). O índice de dano (ID) foi atribuído a cada um dos nucleóides
de acordo com a sua classe, a partir da seguinte equação:
ID = (0 x n0) + (1 x n1) + (2 x n2) + (3 x n3) + (4 x n4)
onde n é o número de nucleóides de cada classe analisada. Desta forma, o índice
de dano para 100 nucleóides variou de 0 (completamente sem danos: 100 x 0) a 400
(totalmente danificadas: 100 x 4) (Tice et al., 2000).
Análise da Cinética do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo
As fases do ciclo celular podem ser caracterizadas por variações no seu
conteúdo de DNA, que, quando analisado por citometria de fluxo após marcação
com iodeto de propídeo, permite quantificar a percentagem de células em cada fase
do ciclo celular. Para essa análise, 5 x 105 de célula S180 foram icubadas na
ausência ou presença dos complexo de rutênio (II) (5 e 10 μM), respectivamente, no
período de 24 horas. Após exposição das células aos complexos de rutênio, essas
foram centrifugadas e, em seguida, lavadas com PBS. Ao final da lavagem, o
sobrenadante foi desprezado, e o pellet celular foi incubado com 1 mL de álcool
31
etílico gelado (70%) por 24 horas a -20°C. Ao final da incubação, as células foram
lavadas novamente com PBS e, em seguida, essas foram incubadas por 15 minutos
em uma solução contendo ribonuclease A (RNase A) 0.05% e iodeto de propídio (50
μg.mL-1). A análise da porcentagem de células em sub-G1, G0/G1, S e G2/M foi
realizada em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences), através do software
ModFit.
Ensaio Apoptose (Anexina V-FITC/Iodeto de Propídio)
A externalização de fosfatidilserina na superfície externa da membrana
plasmática é um dos primeiros eventos que se passa na superfície de uma célula em
processo de apoptose ou necrose, sendo que essa perda de assimetria do
fosfolipídeo na membrana contribui para facilitar o reconhecimento por proteínas
dependente de ións cálcio, como a Anexina V (Boersma et al., 2005; Galluzzi et al.,
2011). O procedimento de detecção de apoptose por Anexina V-FITC/Iodeto de
Propídeo consiste na ligação da anexina V-FITC à fosfatidilserina, na membrana das
células que estão iniciando o processo apoptótico ou processo necrótico, e na
ligação do iodeto de propídeo ao DNA das células no processo final da apoptose.
Para detecção de apoptose ou necrose, foi utilizado o kit de detecção de
Anexina V/Iodeto de Propídio (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) de acordo com as
instruções do próprio fabricante (Figura 7). Para esse ensaio 5 x 105 células de S180
foram incubadas na ausência ou presença do complexo de rutênio (II) (10 e 5μM),
por um período de 24 horas. Após tratamento, as células foram centrifugadas e,
posteriormente, lavadas com PBS. O sobrenadante foi descartado e ao pellet celular
foram adicionados 400 μL de tampão de ligação e, em seguida, acrescentados 5 μL
de Anexina V-FITC e 1 μL de iodeto de propídio. As células foram, então, incubadas
em temperatura ambiente por 15 minutos e, posteriormente, foi feita a aquisição dos
dados em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences). Para análise dos
dados foi utilizado o software Diva.
Foram classificadas como células em apoptose inicial aquelas com marcação
somente para Anexina-V (AN+)/(PI-) e, como células em apoptose tardia, aquelas
32
com dupla marcação de Anexina V e PI (An+)/(PI+), células em necrose somente
marcação para PI (An-)/(PI+) e células viáveis não apresentam nenhuma marcação.
Figura 7: Princípio do ensaio de marcação com Anexina V/PI.
Análise de Bcl-2 ativa por Citometria de Fluxo
Membros da família Bcl-2 têm sido descritos como reguladores-chave da
função mitocondrial durante a apoptose. Membros pró-sobrevida, ou anti-
apoptóticos, associam-se à membrana mitocondrial externa e mantêm sua
integridade. Em contraste, membros pró-apoptóticos como o Bax, associam-se à
membrana mitocondrial externa e causam a liberação de fatores que desencadeiam
a apoptose no citosol (Lugli et al., 2005; Marvetti et al., 2011; Qian et al., 2013).
Após o tratamento das células de S180 com o complexo de Ru25 [5 e 10 µM]
por 24 horas, as células foram retiradas da cultura e centrifugas a 1800 rpm por 3
minutos. Descartado o sobrenadante as células foram lavadas com PBS 1X e
resuspendidas em 500 µL de tampão de lise por 10 minutos em temperatura
ambiente (20° a 30°C). Passado o tempo, as células foram centrifugadas e
resuspendidas em 500 µL de solução de permeabilização por 10 minutos. Após o
tempo de exposição, as células foram lavadas com tampão BSA (PBS 1X, 0.5% de
SFB e 0.1% de azida de sódio) e adicionado 20 µL do reagente anti-Bcl-2. O tubo foi
mixado e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente (20° a 30°C). Após o
período de incubação as células foram lavadas, resuspendidas em 500 µL BSA e
33
levadas para a analise imediatamente no citometro de fluxo FACS Calibur (BD
Bioscience), a análise dos dados foi feita através do software Cell Quest,(BD).
Ensaio de Western blotting
Para detecção da expressão de proteínas relacionadas às vias de morte
celular, foi utilizado o ensaio de Western blotting. Para o ensaio, 3 x 106 de células
S180 foram tratadas com o complexo Ru25 (5 e 10µM) durante 24 horas. As células
foram lisadas com tampão de lise contendo 50mM Tris (pH 7.6 - 8), 150mM NaCl,
5mM EDTA, 1mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM pirofosfato de sódio, 1 % NP-40, e
inibidores de proteases. O lisado celular foi centrifugado a 13000 rpm por 15 minutos
a 5 ºC, e o total de proteínas foi quantificado pelo método Bradford. Foi feita a
eletroforese com 20 μg de proteínas, e as mesmas foram transferidas para uma
membrana de nitrocellulose pelo TransBlot Turbo transfer (Bio-Rad) e incubado em
5% de leite desnatado com TBS-T por 1 hora a temperatura ambiente antes da
incubação com os anticorpos primários específicos. Todos os anticorpos foram
diluídos de acordo com o manual Cell Signaling e incubados overnight a 4 ºC, e a ß
actina foi utilizada como endógeno. a imuno detecção foi feita com ECL Western
Blotting Detection Reagents em automático pelo ImageQuant mini LAS4000 (GE
Healthcare). O experimento foi feito em três repetições, sendo que nos três os
resultados foram semelhantes.
Análise Estatística
Os resultados, expressos através de Média ± DP (ou EPM) e Mediana, foram
organizados e apresentados na forma de gráficos, tabelas e figuras. Todas as
variáveis sob estudo foram testadas para a hipótese de normalidade.
Para verificar diferenças significativas entre os grupos estudados, foram
utilizados e analizados por meio do software GraphPad Prism versão 4.0, os testes
de análise de variância (ANOVA). Quando detectada diferença significativa entre os
grupos, foi aplicado o teste “t” de Student e os testes de contraste de Tukey e
Dunnet. Para todos os grupos consideram-se estatisticamente significativos quando
p<0,05.
34
Artigo - The ruthenium (II) complex cis- [RuCl(BzCN)(phen)(dppb)]PF6 induces
cell cycle arrest and cell death triggered by caspase-independent apoptosis by
mitochondrial pathway in S-180 cells
Raquel Santos Fariaa, Wanessa Carvalho Piresa, Flávia de Castro Pereiraa, Aliny
Pereira de Limaa, Hugo Delleon Silvaa, Sônia de Fátima Oliveira Santosa, Thallita
Monteiro Silvaa, Plínio Lázaro Faleiro Navesb, Renato J. S. Oliveirad, Rui Manuel
Reisd, Alzir Azevedo Batistac, Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa*
a Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil
b Universidade Estadual de Goiás, Campus de Anápolis de Ciências Exatas e
Tecnológicas, Goiás, Brazil
c Departamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo, Brazil
d Centro de Pesquisa de Oncologia Molecular, Hospital do Câncer de Barretos,
Barretos, São Paulo, Brazil.
*E-mail: [email protected] (E.S.Lacerda)
Abstract
The pharmaceutical industry has intensified the search for new metal-based drugs that offer the possibility of oral administration, reduction of serious side effects and reduced clinical costs. In face of this new research area, we assessed the cytotoxic, genotoxic, interference on the cell cycle kinetics and mechanism of cell death of a new complex of ruthenium (II). Cytotoxicity was assessed by the MTT assay and it has shown that the compound tested showed inhibition of tumor cell viability in S180 in lower concentrations and cytotoxicity at higher concentrations for normal lymphocytes. [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 also showed a significant lethality to brine shrimp nauplii Artemia salina. The comet assay indicated that the compound is not genotoxic for normal cells, and exhibited low genotoxicity to tumor cells. [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 complex induced changes in cell cycle identified by flow cytometric test, increasing the number of cells in the G0/G1 phase and lowering synthesis phase. The complex induced an increase of cells positive for Annexin-V for flow cytometric test, suggesting cell death by apoptosis. By the Western Blot assay, it was possible to infere that the complex may be triggering cell death by caspase-independent intrinsic apoptosis. However, others specifics markers are needed to understand the cascade of events in which the intrinsic apoptosis pathway are
35
affecting this process of cell death, and if only this pathway is being activated in apoptosis, thus elucidating the mechanism of action in the cells S180. Keywords: Cancer, cell cycle, cell death, Sarcoma 180, Ruthenium (II) complex.
1.0 Introduction
From the discovery of cisplatin, there was a large increase on intensifying
research and development of drugs based on metals and, since then, inorganic
complexes have been used in numerous therapeutic research with many applications
in different branches of medicine, including anticancer therapy (Dyson and Sava,
2006; Sussfink, 2010; Sabale et al., 2012.).
In 2003, Clarke et al., studied the pentamino-(purine)-ruthenhium (III) and
reported that this compound is able to inhibit DNA synthesis and the protein itself in
nasopharyngeal carcinoma cells in vitro, which sparked the interest in ruthenium
complexes as potential anticancer drugs. Over the next decade, Mestroni et al.
(1989a) developed the hexacoordenated complex of Ru (II) chloride,
dimethylsulfoxide and binders, in particular cis- and trans-RuCl2 (dimethylsulfoxide)4,
and the anticancer activity was evidenced in vitro and in vivo. These complexes were
found to Interact with DNA both in vitro and in vivo.
Today, two ruthenium-based anticancer drugs are undergoing clinical trials: the
NAMI A, developed by Mestroni et al. (1998b), and KP1019, developed by Keppler et
al. (1996). The KP1019 shows cytotoxic activity against colon carcinoma in rats. It
has been proposed that the DNA is one of the biological targets of KP1019, and has
also been reported that the drug triggers cell death by apoptosis (Kapitza et al.,
2005). However, the cellular mechanisms of activation of apoptosis are still under
investigation (Egger et al., 2005, Kapitza et al., 2005).
Given that the indiscriminate attack promoted by antineoplastic agents to rapidly
proliferating cells, cancerous or normal, is extremely feared by individuals who need
to undergo treatment effects because of these drugs undesirable side or toxic effects
(Mealey et al., 1994), the researches conducted in the last decade have shown that
cell death caused by chemotherapy drugs occurs primarily by inducing apoptosis.
And since, this class of drugs has the potential to restore the apoptosis, a process
36
that is alterated in cancer cells (Parkinson, 2001), this study evaluated the
cytotoxicity and genotoxicity of the [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 as well as the type of
cell death that occurs in the process in order to elucidate the death pathway initiated
by it.
The diphosphines were chosen as ligand for their ability to stabilize Ru(II)
complexes, due to their π acceptor properties, and the diimines can assist in the
complex intercalation with DNA. The benzonitrile ligand was introduced into the
complexes to make them anionic, and thus more soluble in the cell culture medium.
2.0 Materials and Methods
2.1. Chemical and preparation of compound for biological tests
The complex cis- [RuCl(BzCN)(phen)(dppb)]PF6 was sintetize in Chemical
Laboratory from Chemical Institution in Federal University of São Carlos, and sent to The
Molecular and Citogenetics Laboratory of the Federal University od Goias (UFG) for
biological activity tests (Pereira et al., 2015). The compound was diluted in dimetil
sulfóxid (DMSO) 0,1%, for biological assays.
2.2 Cell Culture
The murine sarcoma-180 tumor cells (S180) (ATCC®# TIB-66) and human
normal Lymphocyte cells (ATCC®# CRL-8293) were cultured in suspension in RPMI
1640 (Sigma Chemical Co., MO), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS)
(Gibco®, Life Technologies), 100 μg/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin. The
cultures were incubated in a humidified incubator (Thermo Scientific) at 37°C with 5%
CO2.
The protocol (N. 043/2007) of these experiments was approved by the Ethics
Committee of the Federal University of Goias, and prior to joining the study, all blood
donors signed an informed consent form.
2.3 Cell viability assay (MTT assay)
The cytotoxic effects of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 was evaluated using an
MTT assay with S180 tumor cells and Lymphocyte cells as described previously
37
(Mosmann, 1983) Briefly, 1.0 x 105 S180 cells and 2.0 x 104 Lymphocyte cells were
placed on plaques in 96-well tissue culture plates and treated with different
concentrations of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (0.2-200 μM) for 48 h. After treatment,
10 μL of MTT (5 mg mL-1) was added to each well, and the plates were incubated at
37°C for an additional 3 h. The purple formazan crystals were dissolved in 50 μL of
SDS, and the absorbance was determined at 545 nm using a Stat Fax 2100
microplate reader (Awareness Technology, Palm City, FL, USA). The cell viability
was calculated as follows: viability (%) = (absorbance of the treated
wells)/(absorbance of the control wells)×100. The IC50 (complex concentration (μM)
that results in a 50% reduction in cellular viability) was obtained from dose-response
curves using GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego,
CA, USA). The IC50 values obtained from the MTT assay were used as a reference
for further testing.
2.4 Toxicity assay with Artemia salina
The methodology adapted from Molina-Salinas and Said-Fernández (2006)
was applied in the Bioassay Laboratory of the Exact and Technological Sciences Unit
of the State University of Goiás. In this assay, artificial sea water medium were used,
prepared by dissolving sea salt in distilled water (40 g L-1), supplemented with yeast
extract (6 mg L-1) and sterilized in autoclave. The pH was adjusted to 8.5 using a 0.1
mol L-1 solution of Na2CO3. Eighty milligrams of the A. salina eggs were incubated for
36 hours in 1 L of medium with natural light, with constant room temperature and
oxygenation. After the outbreak, the nauplii were attracted by the light source,
pipetted and transferred to a Petri dish with 5 mL of fresh medium. Serial dilutions of
the compounds (32.0, 62.5, 125.0, 250.0 and 500.0 µg mL-1) were made in wells of
96-well microplates in triplicate of 100 μL of artificial sea water. After, nauplii were
distributed in the plate, standardizing a total of 10±1 individuals in each well.
Negative, viability and lethality controls were included, and 100 µg mL-1 dilutions of
K2Cr2O7 for lethality control were used.
The results allowed calculation of LD50 by the probit dose-response graphical
method, with the program Statplus 2009 professional (Analyst Soft). Each assay was
carried out independently in triplicate.
38
2.5 Comet assay
To detect damage in the single strand and / or double DNA, the alkaline comet
assay version was used with a Singh (1988), where 1 x 105 of lymphocyte cells were
plated in the absence or presence of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (5 and 10µM like
IC50 value) for 24 hours. After treatment, the cell suspension was homogenized with
100 µL of agarose low melting (0.5%) and then placed in slides which already
contained a standard agarose (1.5%). These blades were then placed at 4 °C for 10
minutes and then placed in a lysis solution (2.4M NaCl, 100 µM EDTA, 10 µM Tris,
DMSO 10% and Triton-X 1%, pH 10) by 24 hours. After the lysis step, the slides were
transferred to a tank containing electrophoresis buffer (300 µM NaOH + 1 µM EDTA,
pH 13) at 4 °C with an electric current of 300 mA and voltage of 25 V. In the next
step, the slides were removed by tub electrophoresis and then subjected to a
neutralizing solution (Tris-HCl 0.4M, pH 7.5) for 15 min. After drying the slides, they
were then fixed in ethanol 100% for 3 minutes. The slide staining was performed with
ethidium bromide (20 µg mL-1) and analyzed immediately after staining. Slides were
prepared in duplicate and 100 nucleoides were analyzed (50 nucleoides of each
blade) using a fluorescence microscope (Leica, Wetzlar, Germany) interfaced with a
computer. Images were analyzed on image analysis software CometScore 15
according to the migration of the fragments system, considering the following
parameters: length of the comet head diameter and tail length.
From these parameters, the grade was determined as proposed by Kobayashi
et al. (1995): Class 0 (no damage), Class 1 (little damage, tail length of less than the
diameter of the head), class 2 (medium damage tail length one or two times the
diameter of the head), Class 3 (significant damage length greater than two or three
times the diameter of the head tail), class 4 (significant damage tail length greater
than three times the diameter of the head). A value of damage index (DI) was
allocated to each nucleoides according to its class.
2.6 Cell Cycle analysis
The S180 cells were treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (5 μM and 10
μM) for 24 h. Briefly, 5.0 × 105 cells were harvested by centrifugation, washed with
phosphatebuffered saline (PBS), fixed with 70% (v/v) cold ethanol and stored
overnight at - 20°C. The fixed cells were washed with PBS and incubated with
39
propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich) containing 0.05% RNase. The samples were
incubated at 4°C in the dark and analyzed by flow cytometry (FACS Calibur, BD
Biosciences). The percentage of cells in the G0/G1, S, G2/M and sub-G1 phases
were analyzed using ModFit software.
2.7 Annexin V-FITC/PI double staining and analysis by flow cytometry
The cell death of S180 tumor cells was examined using the Annexin V-FITC
Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) according to the manufacturer’s
instructions. S180 cells were treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (5 μM and 10
μM) for 24 h. Briefly, 5.0 x 105 cells were harvested and washed with PBS. The cells
were resuspended in 400 μL of binding buffer. Next, 5 μL of Annexin V-FITC and 1
μL of PI were added. Flow cytometric analysis was performed immediately after
supravital staining. Data acquisition and analysis were performed on a flow cytometer
(FACSCalibur, BD Biosciences) using Cell Quest software. The criteria for positivity
in cells in early stages of apoptosis were Annexin V-positive and PI-negative,
whereas the criteria for cells in the late stages of apoptosis were both Annexin
Vpositive and PI-positive.
2.8 Flow Cytometric Detection of the Bcl-2 Protein
After treatment of the S180 cells with the ruthenium complex (5 and 10 µM) for 24
hours, the cells were removed from culture and centrifugated at 1800 rpm for 3
minutes. The supernatant was discarded; the cells were washed with PBS 1X and
resuspended in 500 µL of lysis buffer for 10 minutes at room temperature (20 to 30
°C). After the time, the cells were centrifuged and resuspended in 500 µL
permeabilization solution for 10 minutes. After the exposure time, the cells were
washed with BSA buffer (1X PBS, 0.5% FBS and 0.1% sodium azide) and 20 µL of
the anti-Bcl-2 reagent added. The tube was mixed and incubated for 30 minutes at
room temperature (20 to 30 °C). After the incubation period the cells were washed,
resuspended in 500 µL BSA and taken for analysis immediately in FACS Calibur flow
cytometer (BD Bioscience), data analysis was performed using the Cell Quest (BD).
2.9 Western blot analysis
To assess cell death pathways provided by [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6, S180
cell line was treated with ruthenium complex in 6 well plates. After the S180 cells
40
were exposed to [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 at the concentrations of 5 and 10 µM,
for 3-24 hours, S180 was scrapered in buffer lyses containing 50mM Tris (pH 7.6–8),
150mM NaCl, 5mM EDTA, 1mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM sodium
pyrophosphate, 1 % NP-40, and protease cocktail inhibitors contend. The cellular
lysate was centrifuged at 13.000 rpm for 15 minutes in 5 ºC and total protein was
quantified by Bradford method. Briefly, 20 μg lysate proteins were placed for
visualization on 10 % SDS-PAGE and transferred to nitrocelulose membranes in
TransBlot Turbo transfer (Bio-Rad) and incubated in 5 % nonfat dried milk in TBS-T
for 1 hour at room temperature before primary specific antibodies incubation and β-
actin was used as control. All antibodies for TNF-R2, p21, Bax, caspase 3, caspase
7, TNF-R1 and cytochrome C were diluted according to Cell Signaling manufacturer’s
and overnight incubated at 4 ºC. Immune detection was done with ECL Western
Blotting Detection Reagents in automatic ImageQuant mini LAS4000 (GE
Healthcare). The experiment, repeated three times, yielded similar results.
2.10 Statistical analysis
Statistical analysis of the results was performed using an unpaired t test or
one-way ANOVA followed by Dunnett’s post hoc test or the Bonferroni post hoc test
for multiple comparisons with a control. All statistical analyses were performed using
the statistical software GraphPad Prism (version 5.0). A probability of 0.05 or less
was deemed statistically significant. The following notation is used throughout the
manuscript: *, p<0.05 and **, p<0.01 relative to the control.
3.0 Results
3.1 S180 cell viability
The ruthenium complex was tested in vitro for their cytotoxic effects on the
S180 tumor cell line and the lymphocyte normal cell line using the MTT assay. The
complex showed lower cytotoxicity against the Lymphocyte, IC50 value of 17 μM, than
S180 tumor cell line, IC50 value of 8.89 μM (Table 1).
41
Table 1: IC50 value for lymphocyte and sarcom 180 cell lines.
Complex
IC50 (μM)
Lymphocyte S180
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 17 8.89±3.9
Cisplatin - 64.83±0.17
- data very low, not possible to calculated.
3.2 Toxicity assay with Artemia salina Leach
The toxicity analysis using Artemia salina Leach is shown in Table. Such
results suggest that the cis- [RuCl(BzCN)(phen)(dppb)]PF6 presents a moderate
toxicity for A. salina larvae.
Table 2: CL50 value for Artemia salina treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6.
Complex CL50 (µg mL)
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 300.31
3.3 Comet assay
Table 3 shows the frequency of cell nuclei found in each class of the comet assay
in lymphocyte treated with two different concentrations of cis-
[RuCl(BzCN)(phen)(dppb)]PF6. In negative control and treatment with 5µM for 24
hours, 54,66% of cells were considered type 0, and 45,33% of cells were considered
as type 1, no cells were classified as types 2, 3 and 4. 63,28% of cells were
considered as type 0, no damage, and 36,72% of the cells were classified as type 1,
when treated with 10 µM of compound, no cells were classified as types 2, 3 and 4.
42
Table 3: Frequency of cell nuclei found in each class of the comet assay using lymphocytes with no
treatment (negative control), and treated with two different concentrations of cis-
[RuCl(BzCN)(phen)(dppb)]PF6 (5 and 10 µM).
Frequency of cell nuclei (%)
Treatment Class of comet assay
0 1 2 3 4
Negative control 54,66 45,33 0 0 0
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
[5 µM] 54,66 45,33 0 0 0
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
[10 µM] 63,28 36,72 0 0 0
Nucleus classification according to the migration of the fragments using the software CometScore 15:
class 0 (no damage); class 1 (little damage, tail length smaller than the diameter of the nucleus); class
2 (medium damage, tail length once or twice the diameter of the nucleus); class 3 (significant damage,
tail length between two and a half to three times the diameter of the nucleus); class 4 (significant
damage, tail length longer than three times the diameter of the nucleus).
Table 4 shows the frequency of cell nuclei found in each class of the comet
assay in S180 treated with two different concentrations of
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6. In negative control, 80,80% of cells were considered
type 0, and 19,20% of cells were considered as type 1, no cells were found in type 2,
3 and 4. After the treatment with 5µM for 24 hours, 61,43% of cells were considered
as type 0, and 62,71% of cells were considered as type 1, no cells were classified as
types 2, 3 and 4. 37,29% of cells were considered as type 0, no damage, and
62,71% of the cells were classified as type 1, when treated with 10 µM of compound.
No cells were classified as types 2, 3 and 4.
Table 4: Frequency of cell nuclei found in each class of the comet assay using S180 with no treatment
(negative control), and treated with two different concentrations of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (5 and
10 µM).
43
Frequency of cell nuclei (%)
Treatment Class of comet assay
0 1 2 3 4
Negative control 80,80 19,20 0 0 0
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
[5 µM] 61,43 38,57 0 0 0
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
[10 µM] 37,29 62,71 0 0 0
Nucleus classification according to the migration of the fragments using the software CometScore 15:
class 0 (no damage); class 1 (little damage, tail length smaller than the diameter of the nucleus); class
2 (medium damage, tail length once or twice the diameter of the nucleus); class 3 (significant damage,
tail length between two and a half to three times the diameter of the nucleus); class 4 (significant
damage, tail length longer than three times the diameter of the nucleus).
(a) (b)
(c) (d)
44
(e) (f)
Figure 1: Cells after comet assay (a) negative control of lymphocyte (b) and (c) lymphocytes treated
with 5 and 10 µM, respectively, for 24 horas. (d) negative control of S180; (b) and (c) S180 treated
with 5 and 10 µM, respectively, for 24 horas.
3.4 Induction of G0/G1 arrest in S180 cells
The cell cycle distribution of the S180 cells treated with
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 was examined by flow cytometry. S180 cells when
treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 presented G0/G1 phase arrest, as shown
by the graph of cell cycle distributions in phases, treatment with the complex caused
a statistically significant increase in the percentage of cells in the G0/G1 phase, and
a consequent decrease of cells in the S phase (p<0.001).
The fraction of G0/G1 cells increased from 23% in the control to 54% after
treatment with 5 μM [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 and to 43% in cells treated with 10
μM [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6, all 24 hour’s treatment.
Figure 2: Effects of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 on the cell cycle distribution of S180 cells after 24 h
of exposure. The data are the means ± SD of three experiments. Significant differences from the
untreated control are indicated by ***p<0.001.
45
3.5 Induction of apoptosis in S180 cells
The FITC-Annexin V/PI assay was used to evaluate the mechanism of S180
cell death. A total of 20% and 61% of the cells treated with 5 μM and 10 μM
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6, respectively, were in late apoptosis (Annexin V+ and
PI+) after 24 hour of treatment (p<0.001 compared to the control).
Figure 3: Effect of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 on the mechanism of S180 cell death (early and late
apoptosis/necrosis) evaluated by flow cytometry after 24 h of incubation. The data are the means ± SD
of three experiments.
3.6 Detection of the Bcl-2 protein in S180 cells by flow cytometry assay
The expression of Bcl-2 in S180 cell line treated with
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 was detected by flow cytometry. When S180 cells were
treated with 5 μM and 10 μM [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 for 24 h no expression of
Bcl-2 was detected.
S180
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
C- 24h
S180
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
5µM 24h
S180
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
10 µM 24h
46
Figure 4: Detection of Bcl-2 in S180 cell treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6, at concentrations 5
and 10 μM for 24 hours. M1: cells that do not have the presence of Bcl-2 activated. M2: cells that has
active Bcl-2.
3.7 Protein analysis by Western Blot assay
To confirm the findings of the cell cycle assay and FITC-Annexin V/PI assay,
we examined the expression levels of apoptosis-related proteins using the Western
Blot technique. There was an increase of TNF-R2, p21 and Bax, and a decrease of
caspase 3, caspase 7, TNF-R1 and cytochrome C, after the treatment with
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6.
S180 [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
5 µM 24h
S180 [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
10 µM 24h
S180 [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6
C- 24h
47
Figure 5: Nitrocellulose membrane form Western blot assay, negative control and cells treated with
two concentrations (5 and 10 µM).
4.0 Discussion
Many of the complexes of ruthenium (II) tested have showed low values of
IC50, which indicate that they are more cytotoxic to tumor cells (Xie et al., 2013;
Wang et al., 2013). The IC50 values of [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 were better than
the IC50 values for cisplatin. These results suggest that the ruthenium complex
studied in this work was more selective for cancer cells when compared with
lymphocyte cells. Ru complexes with similar binders show higher values of IC50 than
our previous study (Pereira et al., 2015).
The brine shrimp lethality test is an efficient, rapid and inexpensive test and it
has a good correlation with cytotoxic activity (Molina-Salinas et al., 2006). Anchuri et
al., (2012) studied two ruthenium compounds and proved that both have a significant
lethality to brine shrimp nauplii, and a significant cytotoxic activity in vitro against IEC-
6 cell lines. In our study, [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 also showed a low lethality to
brine shrimp nauplii (table 2). In vitro cytotoxic activity of the ruthenium complex
48
using A. salina and MTT assays revealed that these compounds inhibited the
Artemia salina and S180 cell line growth in a dose dependent manner, so
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 has shown to be a promising compound.
The comet assay is a sensitive and relatively inexpensive technique for
detection of DNA damage and DNA repair (Singh et al., 1988), and has been used to
assess the genotoxicity of chemicals, environmental exposures to carcinogens,
toxins, and physical agents, and can be tested in vitro and in vivo (Trzeciak A.R. et
al., 2000; Sekihashi K. et al., 2002). In our study, [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 did not
show a significant increase in the percentage of lymphocytes with damage (table 3
and figure 5a, b, c). Ribeiro et al. (2009) tested cis-[RuCl2(NH3)4]Cl in lymphocytes
and showed similar results, the compound did not show a significant increase in
tailed cells in any of the concentrations tested. It was also observed that, when S180
was treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 (figure 5d, e, f), there was a dose-
dependent increase in the percentage of cells classified as type 1, and consequently
a decrease in the percentage of cells type 0 (table 4). Thus, the cytotoxicity might be
associated with the genotoxicity of the complex.
Cytotoxic drugs can promote changes in the percentage of cells in each phase
of the cell cycle, thereby promoting inhibition of cell viability, and thus possibly
resulting in cell death (Li et al., 2012). To determine the possible mechanisms of cell
growth inhibition by [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 in S180 cells, flow cytometric
analysis was performed and the cell cycle was analyzed. When the S180 cells were
exposed to [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 in 5 and 10µM concentrations for 24 hours
of treatment, a significant increase in the percentage of cells in the G0/G1 phase was
detected, with a consequent reduction in the percentage of cells in the S phase
(figure 1).
Xie et al (2013) obtained results similar to our for a complex of ruthenium (II)
polipiridinic [Ru(dmp)2(AHPIP)](ClO4)2] in liver cancer tumor Bel-7402, the complex
induced cell cycle arrest and apoptosis in a dose-dependent manner. Many effective
drugs against cancer are called cell-cycle specific drugs (CCS), because they act on
cells that are in a specific phase of the cell cycle (Almeida et al., 2005).
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 shows this profile, and it seems to exert it effects in the
G0/G1 phase of the cell cycle, preventing cell proliferation.
49
A cell death assay using Annexin V/PI was used to determinate whether the
growth inhibitory activity of the [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 was related to the
induction of apoptosis or necrosis. The Annexin V/PI assay showed that treatment
with the complex induced apoptosis in S180 cells as shown by a significant increase
in Annexin V-positive and PI-positive cells, which indicates late apoptosis (figure 2).
Consistent with our results, previous studies have demonstrated that the cis-
(dichloro)tetrammineruthenium(III) compound also increased the numbers of Annexin
V-positive in S180 cells (Lima, et al., 2010). Pereira et al., (2015) showed that the
treatment of S180 with 24 μM of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 24 and 48h
increased the numbers of Annexin V-positive and PI-positive cells, indicating late
apoptosis. Lima et al., (2014) showed that treatment with complex
[Ru(gly)(bipy)(dppb)]PF6 induced apoptosis in S180 cells showed by a significant
increase in Annexin V-positive cells.
These results suggest that the ruthenium complex tested is promoting cell
death by apoptosis, however, other tests are necessary to confirm if this is the death
pathway that operates in the ruthenium complex. According to Galuzzi et al (2012)
the externalization of phosphatidylserine in cellular membrane, detected by annexin
V test, is no guarantee of apoptosis, since this can also be associated with other
death pathways, such as parthanatos and netosis.
Several studies conducted with ruthenium (II) complex showed that they
induced apoptosis in various cell lines (Kasper et al., 2012; Yang et al., 2012; Chen
et al., 2013, Lima et al., 2014; Pereira et al. 2015), some parts of these studies
reports the ability of these complexes to activate cell cycle arrest. Several types of
Ruthenium (II) complexes described in literature show that cell death can occur in
different apoptosis pathways. Thus, it is observed that the way in which the process
of cell death will occur depends greatly on the types of ligands to which these
ruthenium complexes are synthesized.
Inhibition of tumor cell proliferation may result from apoptosis induction that
also induces the cell cycle arrest or the combination of both (Yang et al., 2012).
According to the results presented for the cell cycle and annexin V (Figure 2), it is
suggested that the ruthenium complex [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 induced cell cycle
arrest in G0/G1 phase and suggests apoptosis by the annexin V test in cells S-180.
50
Therefore, it may be inferred that perhaps this new complex induces cellular
inhibition with a combination of the two mechanisms.
Bcl-2 is an anti-apoptotic protein. The presence of the activated protein in cells
treated with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 complex was assessed by flow cytometry in
a 24 hours treatment. In figure 3, it is observed that the bar of the graph called M2
refers to cells that have active Bcl-2, and the bar called M1 refers to the number of
cells that do not have the presence of Bcl-2 activated.
There was a statistically significant difference in the number of cells with active
Bcl-2 between the positive control and the negative control. The treatment of
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 complex at both concentrations (5 and 10 µM) showed
no increase in the number of cells with active Bcl-2. Therefore, the treatment with
[RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 at both concentrations presented no expression of
active Bcl-2 protein in S180 cells. Possibly the time of treatment used in this method
was higher than the time of detection of this specific protein, avoiding the non-
detection of the protein during the same determined period.
The Western Blot is an analytical method which interact three main points,
high resolving power and determining the molecular weight of proteins, both obtained
by polyacrylamide gel electrophoresis, and the specificity of the immunochemical
obtained by the interaction of specific antibodies for each protein. The Western blot is
a method that has high sensitivity and specificity, being considered as a "gold
standard" technique for detection of proteins (Cavalcanti Júnior et al., 2004).
To confirm that the treatment with [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 leads to
activation of p53 protein, Western blot analysis of Bax and p21 proteins were
realized, these two proteins are target genes of Tp53 and can be considered
responsible for cell cycle arrest and apoptosis (Xiong et al., 1993; Brady and Gil-
Gomez, 1998). The result of Western Blot assay indicates the presence of Bax and
p21 proteins at both concentrations tested. The results indicate that the G0/G1 phase
arrest, as shown in cell cycle assay, is a consequence of an increase of p21 protein
in the first 3 hours of treatment (figure 1, 4). Similar results were found for cisplatin
(Prives and Hall, 1999), and otheres ruthenium (II) complexes (Gaiddon, et al.,
2005). The increasing of p53 levels promoted by Bax has been widely documented
51
as the mitochondrial pathway kind of induction of apoptosis (Xiong et al., 1993; Brady
and Gil-Gomez, 1998).
The presented results, such as, decrease of caspases 3 and 7, and
cytochrome c after treatment, and the increase of Bax mediated by p21 (figure 6),
and also the increase of TNFR-2 after treatment, leads us to infer that the
mechanism of death cell triggered by the complex in S180 cell line is caspase-
independent apoptosis by mitochondrial pathway. Other proteins such as cathepsins,
calpains, AIF and endonuclease G might be responsible for apoptosis characteristics
as shown in annexin assay.
Figure 6: A schematic diagram showing the proposed signaling pathways of bufalin-induced
apoptosis in S180 cell line.
Mechanisms involving the participation of proteases, such as calpains,
cathepsin B, Granenzima A and B, HTRA2, endonuclease G and AIF have shown to
induce programmed cell death by independent mechanisms of caspase. These
proteases, in most cases cooperate in a caspase-dependent apoptotic pathway.
HTRA2, also known as Omi, is a mitochondrially located serine protease. HTRA2 can
be released from the mitochondria during apoptosis and uses its four most N-terminal
52
amino acids to mimic a caspase and be recruited by IAP caspase inhibitors such as
XIAP and CIAP1/2. Once bounded, the serine protease cleaves the IAP, reducing the
cell's inhibition to caspase activation. So, we can infer that this is the reason why it
was not possible to detect caspases in this specific study (Faccio et al., 2000; Grey
et al., 2000)
Although data have suggested by Mathiasen and Jaattela (2002) and Galluzzi
et al. (2012) and has indicated that morphological changes may trigger the death
mechanism of caspase-independent apoptosis, and they also described for the first
time the AIF and endonuclease G proteins that act cleaving the DNA molecule, and,
even other proteins have been described in the literature, such as the HTRA2 protein
that acts through serine protease activity and performs cleavage of various
substrates, such as cytoskeletal proteins (Mathiasen and Jaattela, 2002; Galluzzi et
al., 2012), it is clear that the death mechanism in caspase-independent apoptosis is
not so much studied and described in the literature.
Galluzzi et al. (2012) has mentioned that the expression of TNF is involved in
both cell death mechanism, apoptosis and necroptose, classified as cell death
mechanism dependent on caspases and it can’t exclude other type of cell death.
However, the results of our study have shown for the first time the increasing of the
protein TNF-R2 and the decreasing of TNF-R1, indicating and suggesting that further
studies should be performed with other proteins such as calpains and cathepsin.
Thus, facing the promissing perspectives in the researched area, our studies
have been focusing in understanting, mapping, and fully comprehending all the
stages involved in the death cells mechanism, which will contribute to the
synthetysing of better, specific and more effective drugs for the treatment and cure of
cancer.
5.0 References
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Ciclo-Celular não Específicos que Interagem com o DNA: Uma Introdução.
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Conclusão
Atualmente, vários testes são necessários para que um determinado complexo
possa atuar como um fármaco para o tratamento do câncer. Testes iniciais com
linhagens de células tumorais e normais (in vitro) são indispensáveis para que se
conheça a citotoxicidade dos complexos e entender o mecanismo de ação e a via de
morte em que os complexos atuam, para que então possam seguir os estudos com
animais em experimentos in vivo prosseguindo para fase clínica posteriormente.
O complexo de rutênio (II) em destaque neste trabalho foi citotóxico para a
linhagem de célula tumoral, também foi obtido resultado interessante para a célula
normal e no teste de toxicidade com A. salina. O teste cometa indicou que o
composto não é genotóxico para células normais, pois não apresentou aumento
significativo de dano ao DNA nas células normais tratadas, e apresenta baixa
genotoxicidade para as células tumorais.
Em relação ao mecanismo de morte, podemos inferir que o complexo atua por
meio de apoptose por via intrínseca e independente de caspase, entretanto, estudos
adicionais se fazem necessários principalmente para avaliar se o complexo Ru25
pode estar agindo também por outra via de morte, e se este atua apenas por via
intrínseca ou se há também atuação pela via extrínseca.
É necessária a continuação dos testes, especialmente testes de expressão
gênica, para esclarecer qual o mecanismo de morte desencadeado. E pomover
outros testes de segurança, como o teste de Ames, visando futuros testes in vivo.
58
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