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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

Eliana Isac

Efeito in vitro da nitazoxanida e ABZSO no metabolismo de

cisticerco de Taenia crassiceps

GOIÂNIA

2016

i

Eliana Isac

X

ii

Eliana Isac

Eliana Isac

Efeito in vitro da nitazoxanida e ABZSO no metabolismo de

cisticerco de Taenia crassiceps

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde

Pública da Universidade Federal de Goiás, para

obtenção do Título de Doutor em Medicina

Tropical e Saúde Pública.

Orientadora: Prof.ª Dra. Marina Clare Vinaud

GOIÂNIA

2016

iii

Eliana Isac

iv

Eliana Isac

v

Eliana Isac

Dedico este trabalho a minha

querida filha Bruna, ao meu filho

do coração Éder, e a minha tia

Maria que já não está mais entre

nós.

vi

Eliana Isac

AGRADECIMENTOS

Agradeço a DEUS por ter chegado até aqui.

A minha orientadora Marina Clare Vinaud pela confiança depositada em mim, e

principalmente, pela oportunidade que me deu para que pudesse vencer mais essa etapa.

A Carolina Miguel Fraga pela disponibilidade, atenção e paciência no

acompanhamento de toda a parte experimental e estruturação deste trabalho.

A mestre Guaraciara de Andrade Picanço pela valiosa ajuda e estímulo durante

todo o experimento.

A Nayana Lima pelo carinho, amizade e pela colaboração no desenvolmento deste

trabalho.

A Tatiane Luiza da Costa pela contribuição na realização das análises

bioquímicas.

A todos os colegas e professores do Laboratório de Estudo da Relação Parasito-

Hospedeiro (LAERPH) que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desta

tese.

A minha amiga Sandra Vasconcelos que sempre me incentivou e torceu pela

minha vitória.

Aos professores e técnicos do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical

do IPTSP-UFG.

A todos vocês, o meu muito obrigada.

vii

Eliana Isac

viii

Eliana Isac

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .................................................................................................... vi

SUMÁRIO ..................................................................................................................... viii

TABELAS, FIGURAS, APÊNDICES E ANEXOS .......................................................... x

Lista de figuras ................................................................................................................. x

Lista de figuras do artigo 1 .............................................................................................. x

Lista de figuras do artigo 2 ............................................................................................. xi

SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................ xiv

RESUMO ........................................................................................................................ xv

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

1.1-Taenia crassiceps ....................................................................................................... 1

1.2- Ocorrência de T. crassiceps em animais ................................................................... 3

1.3-Patogenia da cisticercose por T. crassiceps ................................................................ 4

1.4. Metabolismo .............................................................................................................. 5

1.4.1-Cestodeo adulto ....................................................................................................... 5

1.4.2- Cisticerco de Taenia crassiceps ........................................................................... 10

1.5-Fármacos utilizados no tratamento da cisticercose .................................................. 13

1.5.1-Praziquantel ........................................................................................................... 13

1.5.2-Albendazol ............................................................................................................ 14

1.5.3 Niclosamida ........................................................................................................... 16

1.5.4 Tamoxifeno ............................................................................................................ 17

1.5.5-Nitazoxanida.......................................................................................................... 17

2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 22

3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 24

3.1-Objetivo Geral: ......................................................................................................... 24

ix

Eliana Isac

3.2-Objetivos específicos: .............................................................................................. 24

4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25

4.1-Manutenção de Taenia crassiceps ............................................................................ 25

4.2-Obtenção de cisticerco de T. crassiceps ................................................................... 25

4.3-Exposição de cisticerco de T. crassiceps a nitazoxanida ......................................... 26

4.4-Análise dos ácidos orgânicos ................................................................................... 27

4.4.1-Extração dos ácidos orgânicos .............................................................................. 27

4.4.2-Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)............................... 28

4.5-Dosagens bioquímicas .............................................................................................. 28

4.6-Análises estatísticas .................................................................................................. 28

5. ARTIGOS ................................................................................................................ 29

6. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................... 77

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 78

8. ANEXOS ............................................................................................................... 101

x

Eliana Isac

TABELAS, FIGURAS, APÊNDICES E ANEXOS

Lista de figuras

Figura 1: Ciclo biológico de Taenia crassiceps. ................................................................ 2

Figura 2: Via de degradação da glicose em anaerobiose. .................................................. 8

Figura 3: Catabolismos de aminoácidos em hepatócitos de vertebrados. ......................... 9

Figura 4: Via de degradação da glicose pelo cisticerco de T. crassiceps ........................ 12

Figura 5: Estrutura química da nitazoxanida. .................................................................. 18

Lista de figuras do artigo 1

Figura 1: Glucose concentrations in the culture medium and in the cysticerci extract

from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and

albendazole.CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:

concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cm: RPMI culture medium without

cysticerci; ctl cyst: cysticerci without drugs exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2

µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz

0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to

0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole;

abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to

0.3 µg/mL of albendazole; abz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. *

statistical difference when compared to the control group .............................................. 36

Figura 2: Pyruvate concentrations in the culture medium and in the cysticerci extract

from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and


concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cyst: cysticerci without drugs

exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci

xi

Eliana Isac

exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of

nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2:

cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole; abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6

µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of albendazole; abz

0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. * statistical difference when

compared to the control group. ........................................................................................ 37

Figura 3: Lactate concentrations in the culture medium and in the cysticerci extract of

cysticerci exposed to different concentrations of albendazole and nitazoxanide. CM:

concentrations detected in the culture medium analysis; CYST: concentrations detected

in the cysticerci extrac; ctl cm: RPMI culture medium without cysticerci; ctl cyst:

cysticerci without drugs exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of

nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.3

cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to 0.15

µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole; abz

0.6: cysticerci exposed to 0.6 µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to 0.3

µg/mL of albendazole; abz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. *

statistical difference when compared to the control group. ............................................. 38

Lista de figuras do artigo 2

Figura 1. Concentração média de citrato detectado no meio de cultura (MC) e no

extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes

concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................................. 55

Figura 2. Concentração média de α-cetoglutarato detectado no meio de cultura (MC) e

no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes


xii

Eliana Isac

Figura 3. Concentração média de succinato detectado no meio de cultura (MC) e no



Figura 4. Concentração média de fumarato detectado no meio de cultura (MC) e no



Figura 5. Concentração média de malato detectado no meio de cultura (MC) e no



Figura 6. Concentração média de oxaloacetato detectado no meio de cultura (MC) e no



Figura 7. Concentração média de acetato detectado no meio de cultura (MC) e no



Figura 8. Concentração média de beta-hidroxibutirato detectado no meio de cultura

(MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a

diferentes concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido. ................................ 61

Figura 9. Concentração média de propionato detectado no meio de cultura (MC) e no



Figura 10. Concentração média de ureia detectada no meio de cultura (MC) e no



xiii

Eliana Isac

Figura 11. Concentração média de creatinina detectada no meio de cultura (MC) e no



Lista de anexos

O parecer do Comite de Ética no Uso de Animais (CEUA) .......................................... 101

Artigo ............................................................................................................................. 102

xiv

Eliana Isac

SIMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

µg: micrograma

µL: microlitros

ABZSO: sulfóxido de albendazol

CLAE: cromatografia de alta eficiência

CoEp/UFG: Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás

H2SO4: ácido sulfúrico

HCL: ácido clorídrico

IPTSP: Instituto de Patologia Tropical Saúde Pública

L: litro

LDH: lactato desidrogenase

mg: miligrama

mL: mililitro

NTZ: nitazoxanida

ORF: original red fox

EC:extrato de cisticerco

MC: meio de cultura

OMS: organização mundial de saúde

FDA: Foudation drug administration

xv

Eliana Isac

RESUMO

A cisticercose humana por cisticercos de Taenia solium é uma doença tropical

negligenciada e grave problema em saúde pública. Os fármacos de escolha para o seu

tratamento são o albendazol e praziquantel. No entanto a utilização maciça e repetida

desses tem levado a casos de resistência parasitária, e consequentemente a uma

necessidade do desenvolvimento de novos fármacos. A cisticercose por Taenia

crassiceps embora seja considerada rara é uma zoonose de risco principalmente em

pacientes imunocomprometidos. A nitazoxanida (NTZ) vem demonstrando uma

excelente atividade no tratamento de parasitoses gastrointestinais, porém ainda não foi

testada contra parasitoses teciduais. O objetivo do estudo foi avaliar a influência in vitro

da NTZ e do albendazol sulfoxido (ABZSO) em vias do metabolismo energético de

cisticerco de T. crassiceps, cepa ORF. Os cisticercos foram retirados da cavidade

abdominal de camundongos BALB/c fêmeas com 30 dias de infecção. Cisticercos

estádio larval foram semeados em placas de microcultivo de seis poços, em meio RPMI

suplementado. Estes cisticercos foram expostos, por 24 horas, a 37ºC, às concentrações

1,2 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,3 μg/mL, 0,15 μg/mL, de NTZ ou ABDZSO diluídos em

dimetil sulfóxido (DMSO). Os grupos controles foram constituídos por um grupo de

cisticercos sem fármacos e outro com DMSO. Após 24 horas de cultivo, separou-se os

cisticercos do meio de cultura e foram congelados em nitrogênio líquido. Foram

realizadas análises do extrato do cisticerco (EC) e do meio de cultura (MC) por meio de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, e espectrofotometria. Foi possível observar

xvi

Eliana Isac

uma diminuição na captação de glicose e a indução da gliconeogenese nos grupos

tratados com NTZ devido as concentrações de glicose e lactato detectadas no MC e EC.

Houve um aumento significativo nas concentrações de piruvato nos grupos tratados com

ABZSO. Houve uma diminuição significativa nas concentrações de citrato detectadas

nos grupos tratados com NTZ. Foi possível observar que o grupo controle e os grupos

tratados com NTZ realizaram o ciclo do ácido cítrico de forma tradicional devido a

detecção de alfa-cetoglutarato, enquanto que os grupos tratados com ABZSO realizaram

a via da fumarato redutase devido a não detecção de alfa-cetoglutarato. Não foi

detectado o acetato nos grupos tratados com NTZ fato que confirma o bloqueio da

enzima piruvato oxidoredutase (PFOR) pela ação do fármaco. Foi possível observar

um aumento na oxidação de ácidos graxos devido a um aumento na concentração de

beta-hidroxibutirato e propionato nos grupos tratados. Conclui-se que houve uma

acidose metabólica induzida pela ação da NTZ; os fármacos induziram a utilização de

vias alternativas de produção de acetil-coA, como a oxidação de ácidos graxos e o

catabolismo de proteínas.

Palavras chaves: Taenia crassiceps, nitazoxanida, albendazol sulfóxido, metabolismo

energético.

xvii

Eliana Isac

ABSTRACT

Human cysticercosis due to Taenia solium cysticerci is a neglected tropical disease and

a severe public health issue. The drugs of choice to treat it are albendazole and

praziquantel. However mass drug administration and repetitive use of these drugs have

lead to parasitary resistance and, consequently, the need of new drugs. Cysticercosis by

Taenia crassiceps is rare but a risk zoonosis especially in immunocompromised

patients. Nitazoxanide (NTZ) is a antiparasitary drug that have been demonstrating a

satisfactory activity against intestinal parasites but has not been tested against tissue

ones. The aim of this study was to evaluate the in vitro influence of NTZ and

albendazole sulfoxide (ABZSO) in the energetic metabolism of T. crassiceps cysticerci,

ORF strain. The cysticerci were removed from the intraperitoneal cavity of BALB/c

mice with 30 days of infection. The cysticerci were harvested in 6 well microculture

plates with RPMI culture medium. The cysticerci were exposed to 1.2; 0.6; 0.3; or 0.15

μg/mL of NTZ or ABDZSO, for 24 hours, at 37ºC. The drugs were diluted in dimethyl

sulfoxide (DMSO). Two control groups were performed, one with the cysticerci without

drugs, and the other with DMSO. After 24h, the cysticerci were separated from the

culture medium and frozen with liquid nitrogen. Analysis of the culture medium (CM)

and the cysticerci extract (CE) were perfomed through high performance

chromatography and spectrophotometry. It was possible to observe a decrease in the

glucose uptake and an induction of gluconeogenesis in the NTZ treated groups due to

the concentrations of glucose and lactate detected in the CM and CE. There was a

significative increase in the pyruvate concentrations in the ABZSO treated groups.

There was a significant decrease in the citrate concentrations in the NTZ treated groups.

The control group and the NTZ treated groups performed the tricarboxylic acid cycle in

its traditional form due to the detection of alpha-ketoglutarate while the ABZSO treated

xviii

Eliana Isac

groups performed the fumarate reductase pathway due to the non detection of this

organic acid. In the NTZ treated groups acetate was not detected which

fact that confirms the blocking of the oxidoreductase enzyme pyruvate (PFOR) by drug

action. There was an increase in the fatty acids oxidation due to an increase in the beta-

hydroxybutyrate and propionate concentrations in the treated groups. It is possible to

conclude that there was a metabolic acidosis induced by NTZ; the drugs also induced

alternative energy production pathways in order to produce acetyl-coA such as fatty

acids oxidation and proteins catabolism.

Key words: Taenia crassiceps, nitazoxanide, albendazole sulfoxide, energetic

metabolismo.

1

Eliana Isac

1. INTRODUÇÃO

1.1-Taenia crassiceps

Taenia crassiceps (Zeder, 1800) Rudolphi, 1810 é um cestodeo representante da

família Taenidae, ordem Cyclophyllidea. Os adultos medem entre 7 e 14 cm,

apresentam o corpo segmentado, formado por um conjunto de proglotes hermafroditas

(estróbilo), não possui trato digestório e possui escólex com duas coroas de acúleos e

quatro ventosas (FREEMAN, 1962; WILLIMS & ZURABIAN, 2010). A forma larval

deste parasito é conhecida como Cysticercus logincollis Rudolphi 1819, (FREEMAN,

1962; MAILLARD et al., 1998).

Algumas cepas de T. crassiceps como HYG, KBS, Toi, ORF, COLA, GIKS e

recentemente a WFU isolada de roedores na América do Norte são usadas em

laboratório. As cepas HYG, KBS, Toi, COLA, GIKS e WFU são capazes de dar origem

ao helminto adulto, e seus cisticercos medem em torno de 5 mm de diâmetro, com

escólex invaginado. (EVERHART el al., 2004; WILLMS & ZURABIAN, 2010)

A cepa ORF não apresenta escólex possuindo somente o canal do escólex, sendo

incapaz de dar origem a forma adulta (WILLMS & ZURABIAN, 2010). Em todas as

cepas de T. crassiceps observa-se a reprodução assexuada através da formação de

brotamentos na superfície da membrana tegumentar do parasito (FREEMAN, 1962;

MAILLARD et al., 1998; VINAUD, 2007). As proliferações assexuadas por brotamento

são atributos úteis apresentados por este cisticerco, permitindo a sua manutenção através

de passagens sucessivas pela cavidade abdominal de camundongos (PADILHA et al.,

2001).

As formas adultas de T. crassiceps são parasitos do intestino delgado de

canídeos silvestres, cães domésticos, coiotes e principalmente de raposas, (FREEMAN,

1962; AROCKER-METTING et al., 1992; SHIMALOV & SHIMALOV, 2003). As

2

Eliana Isac

proglotes grávidas são eliminadas repletas de ovos pelas fezes, sendo ingeridas pelos

hospedeiros intermediários (roedores silvestres). Os ovos medem de 6 a 8 μm, com os

embriões hexacantos envolvidos por uma membrana protetora de quitina (embrióforo).

A eclosão dos embriões ocorre no trato digestório de seus hospedeiros naturais,

penetram pela mucosa migrando por via linfática indo se alojar de preferência na região

subcutânea, cavidades pleural e abdominal, onde o cisticerco se desenvolve. Esta forma

larval pode ser detectada em torno de 12 dias após a ingestão dos ovos, atingindo até 11

mm de diâmetro. Os brotamentos podem se destacar do cisticerco larval, em torno de 4

semanas após seu surgimento. Esses cisticercos são ingeridos pelo hospedeiro

definitivo, originando a forma adulta, de 34 a 70 dias após sua ingestão (Figura 1).

Nestes hospedeiros a infecção se mantém por nove meses evoluindo então para a cura

espontânea. Nos hospedeiros intermediários, paratênicos ou acidentais, ainda não foi

relatado a cura espontânea (FREEMAN, 1962; MAILARD et al., 1998).

Figura 1: esquema representando o ciclo biológico de Taenia crassiceps, com seus

hospedeiros definitivos (1) - canídeos, intermediários, (2) – ovos presentes no meio

ambiente (3) - roedores, (4) – cisticercos encontrados nos tecidos e cavidades dos

hospedeiros intermediários e acidental (5) -mamíferos como o homem, lêmures e animais

domésticos (VINAUD et al., 2007).

3

Eliana Isac

Ao longo dos últimos 50 anos, os resultados experimentais usando estágios

larvais e adultos de T. crassiceps renderam muitas informações sobre a morfologia,

bioquímica, dinâmica de proliferação e resposta imune no hospedeiro (WILLMS &

ZURABIAN, 2010). Contribuindo também para estudos a respeito da resposta da ação

de fármacos no metabolismo energético em T. crassiceps e tratamento da cisticercose

(LINO JUNIOR et al., 2005; NOGALES-GAETE et al., 2006; VINAUD et al., 2007;

VINAUD et al., 2008; VINAUD et al., 2009; FRAGA et al., 2012a; FRAGA et al.,

2012b).

O emprego de cisticerco de T. crassiceps (cepa ORF) como modelo experimental

se justifica pela capacidade de proliferação rápida que os mesmos apresentam por

brotamentos, permitindo assim sua manutenção intraperitoneal em camundongos.

Nesses animais, é possível realizar estudos sobre respostas imunes de camundongos,

tanto em uma infecção inicial como em infecções por períodos prolongados (PADILHA

et al., 2001). Além disso, a infecção experimental propicia a produção de antígenos

utilizados em testes sorológicos para o diagnóstico da neurocisticercose por T. solium

(VAZ et al., 1997).

1.2- Ocorrência de T. crassiceps em animais

Este parasito foi pela primeira vez identificado em raposas vermelhas (Vulpes

vulpes) e é encontrado principalmente na Europa (FREEMAN, 1962, FRASSEN et al.,

2014). Sua forma adulta foi detectada em áreas rurais da Grécia infectando raposas

vermelhas, lobos, chacais e gatos selvagens (PAPDOPOULOS et al., 1997). Foi também

encontrado em várias regiões da Alemanha, em raposas vermelhas, texugos, fuinhas e

gatos selvagens (LOOS-FRANK & ZEYHLE, 1982; BALLEK et al., 1992). Raposas

vermelhas também foram encontradas parasitadas por T. crassiceps na Itália

4

Eliana Isac

(POGLAYEN, GUBERTI, LEONI, 1985), França (PETAVY & DEBLOCK, 1980) e nas

Ilhas Banks (EATON & SECORD, 1979).

O cisticerco de T. crassiceps por sua vez, já foi identificado em uma grande

variedade de roedores, tais como ratos e ratazanas, lagomorfos, tais como coelhos,

podendo também acometer outros grupos de mamíferos como marmotas, lêmures, cães

e gatos domésticos (FREEMAN,1962; PETAVY & DEBLOCK, 1980; BROJER et al.,

2002). Não se tem relatos na literatura, de animais selvagens, ou domésticos infectados

na América Latina.

1.3-Patogenia da cisticercose por T. crassiceps

Cisticercose causada por cisticerco de T. crassiceps é rara no homem, no entanto

é considerada de risco zoonótico, pela presença de animais domésticos infectados pelo

parasito, como cão e gato. Esses animais podem levar ao aumento da incidência de

casos em humanos. (WUNSCSHMANN et al., 2003). FREEMAN et al. (1973)

relataram um caso de cisticercose intraocular por cisticerco de T. crassiceps, em uma

menina que se infectou a partir de ovos contidos nas fezes de seu cão de estimação.

Infecções subcutâneas podem representar um problema clínico para os seres humanos

(FRANCOIS et al.1998). Entretanto a patogenicidade da cisticercose vai depender do

órgão parasitado, podendo resultar em doença grave (FREEMAN et al., 1973). Esses

cisticercos podem se alojar em vários locais tais como fígado, sistema nervoso central,

cavidade pleural, região ocular e região subcutânea, em mamíferos e humanos com o

sistema imune deprimido ou competente (SHEA et al., 1973; DEBLOCK & PETAVY,

1983; DYER & GREEVE, 1998; AROUCKER et al., 1992; BROJER et al., 2002;

HEIDWEIN et al., 2006; NTOUKAS et al., 2013). Duong et al. (2006), relataram

também um caso de um paciente com cisticercos sugestivos de cisticerco de T.

5

Eliana Isac

crassiceps na parede abdominal, não tendo relatos de casos na família de taeniase por T.

solium. Provavelmente a etiologia desta parasitose seja pela ingestão de ovos deste

parasito pelo contato do paciente com raposas da região norte da França. Mesmo com

um pequeno número de casos de cisticerco de T. crassiceps em humanos, sendo a

maioria em população imunodeprimida pela infecção pelo HIV deve-se estar atento,

pois este cestodeo pode encontrar no homem um hospedeiro acidental, levando a

quadros graves e de difícil prognóstico.

1.4. Metabolismo

1.4.1-Cestodeo adulto

As pesquisas envolvendo o metabolismo energético dos helmintos tiveram um

aumento significativo nos últimos quarenta anos. A partir da década de 1970 foram

descritas as principais vias energéticas dos helmintos parasitos (BARRET, 2009).

O sistema respiratório dos helmintos se apresenta de maneira complexa, sendo

que fontes de nutrientes e tensão de oxigênio desempenham um importante papel em

suas vias metabólicas. (DEL ARENAL et al., 2005).

Os helmintos da classe cestoda não apresentam o trato digestório, sendo que a

absorção de substâncias imprescindíveis para o seu metabolismo é feita pela superfície

de seu tegumento através de microtriquias. Estes parasitos podem utilizar diversas

substâncias como fonte de energia tais como aminoácidos, carboidratos, nucleotídeos,

ácidos graxos entre outras, sendo todas elas retiradas de seus hospedeiros e algumas

armazenadas em camadas sub tegumentares ou vacúolos (KÖHLER, 1991; KÖHLER &

VOIGT, 1988).

Os parasitos adultos da família Taeniidae têm como principal fonte de energia

carboidratos, tanto na forma de glicogênio, como na forma de glicose. Apresentam

6

Eliana Isac

preferencialmente metabolismo anaeróbio pela falta de oxigênio na luz intestinal de seu

hospedeiro definitivo. Desta forma, não são capazes de oxidar compostos orgânicos em

CO2 e água, tendo como produtos finais de seu metabolismo ácidos graxos voláteis e

lactato (KÖHLER, 1991; KÖHLER & VOIGT, 1988). O catabolismo anaeróbio de

carboidratos apresenta como um dos seus produtos, o fosfoenolpiruvato que pode ser

convertido a piruvato que pela ação da enzima lactato desidrogenase gerar lactato. O

fosfoenolpiruvato sob ação da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase será convertido

em oxaloacetato que pela ação da enzima malato desidrogenase citosólica será

condensado em malato que por sua vez é transportado para dentro da mitocôndria. O

malato na matriz mitocondrial pela ação da enzima málica mitocondrial pode originar o

piruvato, que sofrerá uma descarboxilação oxidativa, tendo como produto o acetil CoA.

Este por sua vez sofre a ação da enzima acetoacetato descarboxilase tendo como

produto o acetato. Por outro lado, o malato pode ser convertido em fumarato pela

enzima fumarase, que é convertido em succinato pela ação da enzima fumarato redutase

participando da síntese do propionil-CoA, que tanto pode originar o propionato, ou ser

precursor de ácidos graxos volateis como metilbutirato ou metilvalerato (Figura 2)

(KÖHLER & VOIGT, 1988). O malato produzido em helmintos, apresenta uma função

semelhante à da fermentação do lactato pela manutenção do equilíbrio redox pela

enzima malato desidrogenase, e produção de dois mols de ATP para cada mol de glicose

catabolizada (KÖHLER & VOIGT, 1988). A degradação de ácidos graxos em alguns

helmintos pode estar associada à produção de energia, ocorrendo dentro da mitocôndria

e são semelhantes à inversão da β-oxidação dos ácidos graxos associada com a

produção de energia. Entretanto, as propriedades cinéticas de algumas enzimas

envolvidas na produção de ácidos graxos por helmintos são diferentes das propriedades

das enzimas envolvidas na produção de ácidos graxos por mamíferos (KÖHLER &

7

Eliana Isac

VOIGT, 1988; FRAGA, 2012a). Os ácidos graxos provenientes de fontes exógenas são

incorporados nas reservas de triacilglicerol e de fosfolipídeos, que são encontrados na

membrana cística e no tegumento de cestodeos (KÖHLER & VOIGT, 1988).

Os ácidos graxos por serem mais voláteis difundem-se com maior facilidade

através das membranas biológicas, sendo, portanto menos prejudiciais para o parasito

quanto para seu hospedeiro quando comparadas ao succinato e o lactato (KÖHLER &

VOIGT, 1988; FRAGA, 2011).

A biossíntese de aminoácidos e proteínas pelos helmintos ainda não está

totalmente esclarecida, provavelmente o parasito obtenha esses nutrientes pela retirada

do meio, de acordo com a disponibilidade no hospedeiro. Esses aminoácidos podem ser

utilizados pelo parasito na síntese de proteínas e também de neurotransmissores e

neurohormônios (KÖHLER & VOIGT, 1988).

Apesar de ainda não estarem esclarecidos os processos de catabolismo de

proteínas em helmintos, admite-se a produção e excreção de amônia e úreia como

produto final (KÖHLER & VOIGT, 1988).

A descrição de vias metabólicas como a excreção de ureia e creatinina foi

relatada em cisticerco de T. crassiceps por VINAUD et al. (2009). Em mamíferos

(Figura 3), ocorre o catabolismo de aminoácidos dentro e fora da mitocôndria, gerando

fumarato e uréia como produtos finais, os quais serão excretados (LEHNINGER et al.,

2011).

8

Eliana Isac

Figura 2: Via da degradação da glicose em anaerobiose. 1: piruvato quinase, 2: fosfoenol

piruvato carboxiquinase, 3:malato desidrogenase citosólica, 4:enzima málica, 5: complexo

piruvato desidrogenase (LEHNINGER et al., 2005; FRAGA, 2015).

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Eliana Isac

Figura 3: Catabolismo de aminoácidos em hepatócitos de vertebrados. O excesso de amônia

é excretado na forma de ureia (LEHNINGER et al., 2011; VINAUD et al., 2007).

10

Eliana Isac

1.4.2- Cisticerco de Taenia crassiceps

A atividade aeróbia in vivo de cisticerco de T. crassiceps é dependente da

quantidade de oxigênio que é difundida em seu habitat, ou seja, nos tecidos dos seus

hospedeiros intermediários. Ainda não foi elucidado porque em cisticerco de T.

crassiceps e em outras formas larvares de helmintos observa-se uma maior capacidade

de oxidação do que suas formas adultas. (KÖHLER & VOIGT, 1988; LAMSAN &

MCMANUS,1990; DEL ARENAL et al., 2001). Provavelmente o tamanho reduzido das

formas larvares, facilitaria uma maior difusão de oxigênio pelos tecidos do parasito, que

é retirado do tecido dos hospedeiros no qual se encontra o cisticerco. Existem ainda

diferenças metabólicas dos cisticercos entre seus estádios evolutivos indicando um

maior gasto de energia e fontes energéticas retiradas de seu hospedeiro durante a

formação de seus brotamentos (DORAIS & ESCH, 1969, VINAUD et al., 2007). Esses

fatores são primordiais para que se estabeleçam as vias metabólicas responsáveis pela

cadeia respiratória como o ciclo do ácido cítrico, degradação dos substratos,

fosforilação oxidativa e via de β-oxidação (KÖHLER & VOIGT, 1988).

Os principais carboidratos utilizados como fonte e reserva energética na fase

larval são a glicose e o glicogênio, sendo que a degradação dessas substâncias gera

substratos que são utilizados em vias de metabolismo aeróbio (KÖHLER & VOIGT,

1988; CORBIN et al., 1998; VINAUD et al., 2007).

Nas fases larvais, esses carboidratos são retirados do meio onde o parasito se

encontra, porém outros tipos de carboidratos são armazenados em sua membrana

cística, como as glicosamidas, galactose e manose podendo ser utilizados em situações

de escassez energética, ou ainda quando a incorporação da glicose é dificultada pela

ação de fármacos (MELHORN et al., 1988; LAMSAN & MCMANUS, 1990).

A produção de piruvato a partir do catabolismo de carboidratos ocorre em duas

11

Eliana Isac

regiões da célula: no citosol, através da ação da enzima piruvato quinase sobre o

fosfonolpiruvato, e na mitocôndria pela ação da enzima málica sobre o malato. O

piruvato citosólico pode ainda sofrer ação da enzima lactato desidrogenase, produzindo

lactato que será excretado ou reutilizado na gliconeogênese; O piruvato pode ainda ser

transaminado tendo como produto a alanina que será excretada, ou ser transportado

para o interior da mitocôndria. O piruvato mitocondrial é descarboxilado em Acetil-coA

(pelo complexo da enzima piruvato desidrogenase) que será condensado com o

oxaloacetato produzindo citrato que poderá ser excretado ou participar do ciclo do ácido

cítrico. O citrato é convertido em cis aconitato e posteriormente em isocitrato,

ocorrendo então uma descarboxilação oxidativa com formação de NADH e CO2 e

produção de alfa-cetoglutarato. Este por sua vez sofre uma descarboxilação oxidativa

pela ação da enzima succinil CoA sintetase produzindo succinato (LEHNIGUER, 2011).

Em uma via inversa, o malato, sob ação da enzima fumarase, pode ainda ser

desidratado a fumarato, o qual é reduzido a succinato, sob ação da enzima fumarato

redutase. Essas reações atuam como fonte de NADH para a cadeia transportadora de

elétrons (CORBIN et al., 1998). Esta via inversa é chamada de via da enzima fumarato

redutase (Figura 4) (ZENKA & PROKOPIC, 1987; CORBIN et al., 1998; VINAUD et

al., 2007).

Em cisticerco de T. crassiceps os produtos finais do metabolismo anaeróbio in

vitro de carboidratos são: lactato e alanina; e do metabolismo aeróbio são: acetato,

citrato e succinato (CORBIN et al., 1998).

A enzima málica (Figura 4), por ser encontrada tanto no citoplasma quanto na

mitocôndria de helmintos, apresenta grande importância no estudo do metabolismo de

cisticerco de T. crassiceps, enquanto que em vertebrados só é encontrada no citoplasma

(ZENKA & PROKOPIC, 1987), podendo ser indicado como um potencial local de ação

12

Eliana Isac

de fármacos anti-helmínticos.

A cadeia transportadora de elétrons detectada em cisticerco de T. crassiceps é

semelhante à cadeia encontrada em mamíferos demonstrando a presença de citocromos

b, c1, c e a3; enquanto este tipo de respiração não foi detectado em parasitos adultos

(DEL ARENAL et al., 2001).

Figura 4: Via de degradação da glicose pelo cisticerco de T. crassiceps. E. produtos

do metabolismo excretados. PEP. fosfoenolpiruvato. OAA. oxaloacetato. T.

substâncias com trânsito livre pela membrana mitocondrial. 1. piruvato quinase; 2.

lactato desidrogenase; 3. alanina transaminase; 4. fosfoenolpiruvato

carboxiquinase; 5. malato desidrogenase citosólica; 6. fumarase; 7. fumarato

redutase; 8. enzima málica mitocondrial; 9. enzima málica citosólica; 10.

complexo da piruvato desidrogenase; 11. acetoacetato descarboxilase; 12. malato

desidrogenase mitocondrial; 13. citrato sintase; 14. aconitase; 15. isocitrato

desidrogenase; 16. α-cetoglutarato desidrogenase; 17. succinil-CoA sintetase.

Reações mitocondriais separadas pelo pontilhado ocorrem em vertebrados e não

foram demonstradas em cestodeos (LEHNINGER et al., 2011; VINAUD et al.

2007).

13

Eliana Isac

1.5-Fármacos utilizados no tratamento da cisticercose

A cisticercose causada pela presença da larva de Taenia solium nos tecidos do

hospedeiro humano é considerada um grave problema de saúde pública, é uma doença

tropical negligenciada (GARCIA et al., 2014). O tratamento da cisticercose leva a uma

redução do número de lesões ativas, e frequência de sequelas quando ocorre o

acometimento do sistema nervoso central, e deve ser realizado com o uso combinado de

fármacos antiparasitários com corticosteroides, minimizando a reação inflamatória local

(GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015).

O esquema terapêutico varia para cada caso, como o número de cisticercos, sua

localização, os estádios evolutivos encontrados, e ainda de acordo com a reação

inflamatória nos tecidos adjacentes (GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015).

1.5.1-Praziquantel

A escolha do praziquantel para o tratamento da neurocisticercose tem sido

relatada por vários autores (PALOMARES et al., 2006; MAHANTHY et al., 2013;

GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015). Os pacientes respondem bem ao

esquema terapêutico apresentando efeitos colaterais como dores de cabeça e distúrbios

digestivos. Alguns apresentam uma melhora significativa no quadro, inclusive com o

desaparecimento dos cisticercos (GROLL, 1982; ALARCON, 2006; NOGALES-

GAETE et al., 2006).

O praziquantel vem sendo empregado para o tratamento de várias outras

infecções teciduais por helmintos como por exemplo Schistosoma mansoni, causando

alterações musculares, metabólicas e dano no tegumento do parasito. Este fármaco é

capaz de interagir diretamente com fosfolipídeos de membrana causando um aumento

do fluxo intracelular de Ca+2

, alterando assim a permeabilidade estrutural levando à

14

Eliana Isac

contração muscular do parasito (DA SILVA, 1993).

Estudos relatados por Greenberg (2005) demonstraram que o praziquantel altera

o fluxo de cálcio em platelmintos, indicando que somente os canais de cálcio do

parasito são sensíveis ao fármaco, o mesmo não acontece com o hospedeiro. Isto explica

a ação seletiva do fármaco.

Este fármaco também promove a despolarização na membrana das células do

parasito, desregulando os mecanismos que são responsáveis pelo fluxo de cátions

através de sua membrana celular, inibindo as enzimas que mantém os gradientes de íons

inorgânicos, estimulando a entrada de sódio e inibindo a de potássio. É ainda capaz de

modificar o metabolismo glicídico com redução na captação de glicose e um aumento

na liberação de lactato, estimulando assim o metabolismo anaeróbico (KÖHLER, 2001).

1.5.2-Albendazol

O albendazol é um fármaco benzimidazólico, desenvolvido há mais de 30 anos e

utilizado no tratamento da cisticercose e de vários helmintos intestinais como: Ascaris

lumbricoides, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis, Taenia spp e Strongyloides

stercoralis. Atua ao se ligar à beta-tubulina do parasito impedindo a polimerização do

microtubulo impedindo a captação da glicose de forma seletiva e irreversível induzindo

a redução do armazenamento do glicogênio, interferindo assim em seu metabolismo

energético (VENKATESAN, 1998; CIOLI & PICA-MATTOCCIA, 2001; KÖHLER,

2001, NOGALES-GAETE et al., 2006; PALOMARES-ALONSO et al., 2007).

Apresenta rápida velocidade de absorção intestinal sendo convertido a um composto

ativo, o metabólito sulfóxido, por isso não é detectado no plasma (EDWARDS &

BRECKENRIDGE, 1988). Sua baixa solubilidade em água resulta em uma alta

variabilidade deste fármaco nos níveis plasmáticos (JUNG et al., 1998; DEL BRUTTO

15

Eliana Isac

et al., 2006). Este fármaco causa perfurações do tegumento e ruptura de fibras

musculares nos parasitos. Sabe-se que formas adultas dos parasitos apresentam o

tegumento mais delgado, com menor resistência à ação dos fármacos, enquanto que as

formas larvais são mais resistentes (MARKOSKI et al., 2006).

Zurabian et al. (2013) demonstraram in vivo que o albendazol pode diminuir

significativamente a carga parasitária de T. crassiceps ou ainda causar danos teciduais

em cisticercos inoculados em camundongos.

Os efeitos colaterais aos esquemas terapêuticos são raros, e o uso do

praziquantel e albendazol podem levar à morte do parasito causando uma resposta

inflamatória no hospedeiro com pico entre o 5º e 7º dia de tratamento. Esta resposta

inflamatória associada a encefalite e reações das menínges, podem levar a um aumento

da pressão intracraniana na neurocisticercose levando o paciente ao óbito. É importante,

portanto, o acompanhamento médico durante o tratamento da cisticercose (NOGALES-

GAETE et al., 2006).

Os cisticercos de T. crassiceps expostos in vitro, ao albendazol demonstraram

um decréscimo na excreção de lactato pelo parasito, dando uma preferência por vias

aeróbias de produção de energia (VINAUD, et al., 2007 e 2008), porém in vivo, após o

tratamento do hospedeiro, ocorreu um aumento de oxaloacetato e alfa-cetoglutarato,

induzindo a utilização de fontes alternativas como a oxidação de ácidos graxos com o

aumento na produção de beta-hidroxibutirato e propionato (FRAGA et al., 2012a e

2012b).

Palomares et al. (2006) demonstraram que a associação do praziquantel e

albendazol sulfóxido mostraram resultados satisfatórios no tratamento em cisticerco de

T. crassiceps in vitro do que quando usadas sozinhas. Isto poderia ser uma alternativa

para o tratamento da cisticercose humana.

16

Eliana Isac

Albendazol, praziquantel e outros fármacos disponíveis como a nitazoxanida

tem demonstrado que suas atividades metabólicas apresentam um efeito significante no

arranjo celular e mortalidade dos parasitos, características estas avaliadas em cisticerco

de T. crassiceps (PALOMARES et al., 2006 e 2007).

O tratamento da cisticercose associando o albendazol e o praziquantel causam

danos no tegumento do parasito, interferindo na captação da glicose e resultando na

imobilização do parasito e sua morte (CIOLI et al., 1995; KOHLER, 2001; NOGALES-

GAETE, et al., 2006). Entretanto os maiores danos morfológicos são atribuídos ao

praziquantel levando a uma vacuolização, inchaço aparecimento de bolhas e

deslocamento do tegumento do parasito (MARKOSKI et al., 2006).

1.5.3 Niclosamida

A niclosamida é um fármaco também indicado para o tratamento de infecções

intestinais por T. solium, T. saginata e Diphyllobothrium latum, e como moluscocida no

controle da esquistossomíase. Este fármaco lesa irreversivelmente o escólex do cestódeo

e o seu segmento proximal é separado da parede intestinal sendo então expelido. Para T.

solium, o anti-helmintico é administrado em dose única após refeição leve, seguida de

um laxante duas horas mais tarde. O uso de laxante se faz necessário, pois os

seguimentos lesados do parasito podem liberar ovos que não sofrem ação deste

medicamento, existindo então a possibilidade de uma auto-infecção interna levando ao

desenvolvimento da cisticercose. Devido a sua baixa absorção intestinal, este fármaco

não é indicado para o tratamento de infecções teciduais. A niclosamida é um

desacoplador da fosforilação oxidativa mitocondrial promovendo um desequilíbrio do

gradiente de concentração de íons H+ entre a matriz mitocondrial e o espaço

intramembranar. Dessa forma interfere na produção de energia do parasito, que morre

17

Eliana Isac

por inanição (SIQUEIRA-BATISTA & GOMES, 2005).

1.5.4 Tamoxifeno

O tamoxifeno é um fármaco antagonista do receptor competitivo do estrogênio,

amplamente utilizado para o tratamento de neoplasias mamárias, e ginecomastia em

homens, que recebem a terapia hormonal para o carcinoma prostático (RYSSEL et al.,

2008; RIVERA-GUEVARA & CAMACHO, 2011). Entretanto, este fármaco anti-

estrogênio tem demonstrado uma ação contra várias protozoários como Leishmania

major e Trypanosoma cruzi (MIGUEL et al., 2010; EISSA & EL SAWY, 2011).

Atualmente o tamoxifeno foi utilizado no tratamento para de infecções por T. crassiceps

inibindo sua proliferação e sua viabilidade in vitro (IBARRA-CORONADO et al.,

2011). Este fármaco mostrou um forte efeito na larva de T. solium, in vitro reduzindo

também as formas adultas intestinais em hamsters, entretanto o seu mecanismo de ação

ainda não foi elucidado (ESCOBEDO et al., 2013).

1.5.5-Nitazoxanida

A nitazoxanida - 2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-thiazolil) benzamida (NTZ) (Figura 5)

é um composto da classe dos nitrotiazois, com o nome comercial Anitta®. É um

fármaco de amplo espectro descrito pela primeira vez em 1975 por Jean Francois

Rossignol, do Instituto Pasteur. Inicialmente usada para o tratamento de nematodeos,

cestodeos e trematodeos de pulmão de importância veterinária (ROSSIGNOL &

CAVIER, 1975). Foi também aprovada na Suíça e França para o tratamento de

infecções intestinais por helmintos em cães e gatos. Desde 1996, a nitazoxanida tem

sido comercializada na maior parte da América Latina e estudada em todo o mundo

(FOX & SARAVOLATZ, 2005). Estudos in vitro demostraram que tanto a NTZ quanto

18

Eliana Isac

sua forma reduzida, a tizoxanida são eficazes no tratamento de infecções por bactérias

anaeróbias gram-positivas e gram-negativas e vírus da hepatite B e C e do rotavírus,

provavelmente impedindo sua replicação viral por meio de uma inibição proteica ainda

não identificada (GILLES & HOFFMANN, 2002; FOX & SARAVOLATZ, 2005;

ESPOSITO et al. 2006; ESPOSITO et al., 2007; KORBA et al., 2007; SANTORO et al.,

2007; SARRAZIN & ZEUZEN et al., 2010).

A NTZ está sendo usada no tratamento de infecções intestinais em humanos,

causadas por uma grande variedade de protozoários e helmintos (FOX &

SARAVOLATZ, 2005; SOMVANSHI et al., 2014). Mostrou-se eficaz para o tratamento

das fases adultas de diferentes espécies de nematodeos como Ascaris lumbricoides,

(ROMERO CABELLOET et al., 1997; ABAZA et al., 1998; DAVILA-GUTIERREZ et

al., 2002; JUAN et al., 2002; DIAZ et al. 2003), Ancylostoma duodenale (ABAZA et

al., 1998; GEARY et al., 1999), Trichuris trichiura (ABAZA et al., 1998; DAVILA-

GUTIERREZ et al., 2002; JUAN et al., 2002; FOX & SARAVOLATZ, 2005),

Figura 5: Estrutura química da nitazoxanida- 2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-

thiazolil) benzamida.

19

Eliana Isac

Strongyloides stercoralis (SOMVANSHI et al., 2014), T. saginata e Hymenolepis nana

(ROSSINGNOL & MAISONNEUVE, 1984; ORTIZ et al., 2002). De acordo com

estudos de realizados por Zumaquero-Rios et al. (2013), a NTZ pode ser utilizada no

tratamento de um trematodeo tecidual causador da fasciolose humana como tratamento

alternativo ao triclabendazole. Entretanto ainda não se tem resultados concretos no

tratamento de outras helmintíases teciduais (FOX & SARAVOLATZ, 2005; DAVID &

BOBAK, 2006; SOMVANSHI et al., 2014).

HU et al. (2013) utilizaram in vitro os fármacos: albendazol, ivermectina,

nitazoxanida e pirantel testados em várias espécies de nematodeos de importância

veterinária. Este estudo demonstrou que a NTZ foi mais eficaz contra Ancylostoma

ceylanicum e Ascaris suunn. Os resultados encontrados por esses autores sugeriram que

na avaliação do valor clínico de um fármaco, estudos farmacocinéticos e metabólicos in

vivo sejam também realizados.

Após administração oral em humanos, este fármaco é rapidamente hidrolisado

pelas esterases do plasma em seu metabólito ativo; a tizoxanida (diacetil-nitazoxanida) é

parcialmente absorvido no trato gastrointestinal com aproximadamente um terço da

dose oral excretada na urina, e dois terços nas fezes (BROEKHUYSEN et al., 2000;

HUANG et al., 2015).

Geralmente, a nitazoxanida é bem tolerada, não existindo reações adversas

significativas durante o seu uso. No entanto, alguns efeitos colaterais podem ser

observados como distúrbios gastrointestinais, diminuição do apetite, febre, anorexia

entre outros (STOCKIS et al., 1996). É apresentada em suspensão oral com dose de 100

100 mg/5ml, ou em comprimidos de 500 mg (FOX & SARAVOLATZ, 2005).

PALOMARES-ALONSO et al. (2007) relataram pela primeira vez a ação da

NTZ, tizoxanida e albendazol sulfóxido em diferentes concentrações em cisticerco de T.

20

Eliana Isac

crassiceps. Os resultados encontrados sugerem que a NTZ em combinação com

albendazol poderia ser usada in vivo no tratamento da cisticercose, apresentando ainda

um avanço significativo no tratamento de infecções parasitárias intestinais. Este

fármaco mostrou também um efeito protoescolicida, in vitro, em Echinococcus

granulosus, podendo ser utilizado na prevenção de um contágio secundária durante a

retirada do cisto hidático (LIU et al., 2015). Tratamentos da cisticercose em suínos com

associação de praziquantel (PZQ) e oxfendazole (OFZ), e o OFZ sozinho na dosagem

de 30 mg/kg mostraram resultados satisfatórios. Entretanto o uso da NTZ com a

dosagem de 150 mg/kg, não mostrou nenhum efeito cisticida. Isto pode ser devido as

diferentes formas utilizadas para avaliar a viabilidade do cisticerco e ainda dificuldades

na obtenção de um modelo de infecção artificial em suínos (MKUPASI et al., 2013).

Demonstrou-se que cisticerco de T. crassiceps, quando tratado com fármacos

não convencionais como NTZ e artesunato, fármaco utilizado no tratamento da malária

estimulam a liberação pelo parasito de enzimas como a fosfatase alcalina (AP) e a

fosfoglicose isomerase (PGI). Estas enzimas sinalizam os danos causados no cisticerco

que sofreram ação destes fármacos (MAHANTY et al., 2013).

A NTZ apresenta atividade em vários protozoários como, Giardia intestinalis e

Cryptosporidium parvum que são responsáveis por grande número de diarreias graves

em todo o mundo, principalmente em individuos imunocomprometidos (MYIAMOTO

& ECKMANN, 2015). Para o tratamento da criptosporidíase, as opções são limitadas, e

somente a NTZ foi aprovada pela FDA para o seu tratamento. (MIYAMOTO &

ECKMANN, 2015). A atividade anti-protozoário deste fármaco está relacionada a sua

ação sobre uma enzima vital para o metabolismo energético, a piruvato ferredoxina

oxidoredutase (PFOR), impedindo a descarboxilação de piruvato em acetil CoA.

HOFFMAN et al., (2007) demonstraram que a NTZ bloqueia a descarboxilação do

21

Eliana Isac

piruvato, através da inibição da reação de transferência de elétrons dependente da

enzima piruvato-ferredoxina oxiredutase. O metabolismo de G. intestinalis é

fermentativo, e o transporte de elétrons neste parasito acontece na ausência da

fosforilação oxidativa mitocondrial. Esta enzima doa os elétrons para a ferredoxina

levando a produção de ATP e seu bloqueio induz a morte do parasito (FUIRD &

RAGSDALET 2000; PALOMARES-ALONSO et al., 2007). A ferredoxina reduzida

pode também reduzir o 5- nitroimidazole (5-NI) liberando radicais tóxicos também

capazes de induzir a morte do parasito (HOFFMANN et al.; 2007). Outra via de redução

pode ocorrer incluindo as enzimas nitroredutases (MÜLLER, et al.; 2007), ativando

também o 5- NI que compromente a integridade celular causando lesões na membrana

celular da G. intestinalis, por induzir a formação de vacúolos (MÜLLER, et al.; 2006).

Comportamento semelhante à NTZ também ocorre com o metronidazole e tinidazole,

no tratamento da G. lamblia (PAL et al., 2009; LEITSCH, et al., 2011; NILLIUS, et al.,

2011). Portanto o bloqueio da reação de transferência de elétrons da PFOR não é a

única via pela qual a NTZ apresenta atividade anti-protozoários.

Entretanto, com relação aos helmintos, seu mecanismo de ação ainda não está

completamente elucidado, mas enzimas envolvidas no transporte de elétrons parecem

ser os potenciais sítios de ação (GILLES & HOFFMAN, 2002; RAETHER & HÄNEL,

2003).

22

Eliana Isac

2. JUSTIFICATIVA

Infecções humanas por cisticercos de T. solium, representam um grave problema

em saúde pública no Brasil e em alguns países da América Latina, África, e sudeste da

Ásia. Atualmente a neurocisticercose é considerada a helmintose mais comum do

sistema nervoso central em humanos, e a maior causa de epilepsia adquirida em todo o

mundo (COYLE et al., 2012; DEL BRUTTO & GARCÍA, 2012; DEL BRUTTO, 2014).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (2010), no mínimo 50 milhões de pessoas

sofrem de epilepsia causada pelo cisticerco de T.solium e 80% dessa população reside

em países em desenvolvimento. Um dos modelos experimentais utilizados para o estudo

da cisticercose por T. solium é o uso de cisticercos de T. crassiceps devido a sua

similaridade antigênica e facilidade de manutenção em condições de laboratório.

Os principais fármacos atualmente utilizados para o tratamento da cisticercose

são o albendazol e o praziquantel, com estudos direcionados sobre as alterações

bioquímicas e estruturais causadas nos parasitos. Entretanto, alguns pacientes não

respondem satisfatoriamente a estes tratamentos (PALOMARES-ALONSO, 2007).

Além disso, a utilização maciça e repetida desses fármacos em um grande número de

indivíduos, pode levar a casos de resistência parasitária (DONATO et al., 2014). De

acordo com Köhler (2001), os principais mecanismos utilizados pelos helmintos para

adquirir resistência aos fármacos, parece ser por perda do receptor ou diminuição da

afinidade para o sítio alvo do fármaco. Esses fatores podem ser explorados para o

desenvolvimento de novos anti-helmínticos, fornecendo informações sobre as formas de

superar a resistência no tratamento das parasitoses.

A nitazoxanida é um agente antiparasitário de amplo espectro, comercializada na

maior parte da América Latina, e estudada em todo o mundo. Apresenta atividade no

23

Eliana Isac

tratamento de infecções intestinais causadas por uma grande variedade de protozoários e

helmintos, embora não existam na literatura dados concretos da sua ação em helmintos

teciduais. É um fármaco bem tolerado durante o tratamento pelo paciente, não sendo

comum a manifestação de reações adversas ou interações com outros medicamentos.

Este fármaco também é utilizado para o tratamento de infecções teciduais por vírus,

bactérias e protozoários (HOFFMAN et al. 2007; GAU et al. 2016).

Trabalhos relatam a ação dos fármacos albendazol e praziquantel no

metabolismo energético do cisticerco de T. crassiceps. Entretanto não se sabe o efeito da

nitazoxanida no metabolismo energético in vitro deste parasito. O conhecimento a cerca

do mecanismo de ação da nitazoxanida no metabolismo energético neste modelo

experimental, poderá contribuir no tratamento da cisticercose e de outras parasitoses

teciduais, permitindo assim avaliar a ação deste fármaco nas vias metabólicas utilizadas

pelo parasito.

24

Eliana Isac

3. OBJETIVOS

3.1-Objetivo Geral:

Avaliar o efeito in vitro, da NTZ e ABZSO em vias do metabolismo energético

de cisticerco de T. crassiceps, cepa ORF.

3.2-Objetivos específicos:

Em cisticercos de T. crassiceps, estádio larval, cultivados, após exposição a

diferentes concentrações de NTZ e ABZSO:

1. Avaliar a glicólise por meio da detecção de glicose, piruvato e lactato.

2. Verificar a ocorrência do ciclo do ácido cítrico por meio da quantificação de

citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, fumarato e oxaloacetato.

3. Investigar a oxidação de ácidos graxos por meio da detecção de acetato,

acetoacetato, beta-hidroxibutirato e propionato.

4. Avaliar o catabolismo de proteínas através da quantificação de ureia e

creatinina.

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Eliana Isac

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1-Manutenção de Taenia crassiceps

O cisticerco de T. crassiceps, cepa ORF, tem sido mantido no biotério do

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás

(IPTSP/UFG) desde 2002. Foram inoculados 10 cisticercos em estádio inicial na

cavidade peritoneal de camundongos BALB/c fêmea de 8 a 12 semanas de idade, onde

se multiplicam por brotamento. Cerca de 90 dias após a inoculação, os animais foram

eutanasiados e necropsiados. Retiraram-se os cisticercos da cavidade peritoneal, e

selecionaram-se 10 cisticercos em estádio inicial que foram inoculados em outros

camundongos não infectados para dar continuidade ao ciclo (VINAUD et al., 2007,

2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b).

Os camundongos receberam cuidados diários, água acidificada e ração padrão

para a espécie, a vontade. Foram obedecidos os princípios éticos em experimentação

animal preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

(SBCAL/COBEA), e o trabalho obteve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal de Goiás (CEUA/UFG) (protocolo número 050/2013) (Anexo 1).

Os animais foram devidamente alojados no biotério, no qual luminosidade e

temperatura foram controladas, a intensidade de ruído e a umidade relativa do ar foram

as do ambiente geral.

4.2-Obtenção de cisticerco de T. crassiceps

Cisticercos de T. crassiceps foram retirados da cavidade peritoneal de

camundongos BALB/c fêmeas com 30 dias de infecção, previamente selecionados e

mantidos no biotério do IPTSP/UFG. Os cisticercos foram lavados em solução

26

Eliana Isac

fisiológica para a retirada de células e quaisquer outros interferentes (FRAGA et al.,

2012a e 2012b, MÁRQUEZ-NAVARRO et al., 2013). Foram em seguida classificados

macroscopicamente, de acordo com seu estádio evolutivo: inicial, larval e final. Em

estádio inicial os cisticercos apresentam-se translúcidos, no larval apresentam-se

translúcidos e com brotamentos e no final opacos e sem brotamentos (VINAUD et al.,

2007; FRAGA et al., 2012a e 2012b).

4.3-Exposição de cisticerco de T. crassiceps a nitazoxanida

Em placas de cultivo de 6 poços, colocaram-se 30 cisticercos em estádio larval

/poço acrescido de 5 mL de meio RPMI suplementado com: L-glutamina a 200 mM,

soro fetal bovino 10% inativado penicilina/estreptomicina a 1:1000, hepes a 1 M e 2-

mercaptoetanol a 5 mM, e expostos às concentrações 1,2 μg/mL, 0,6 μg/mL, 0,3 μg/ml,

0,15 μg/mL, de NTZ e ABDZSO previamente diluídos em DMSO.

De acordo com Palomares-Alonso (2007), a EC50 de NTZ encontrada para o

tratamento in vitro do cisticerco de T. crassiceps foi de 0,15 μg/mL. Para verificar a

interferência do DMSO no metabolismo do parasito, fez-se o cultivo de 30 cisticercos

do estádio larval acrescido ao meio de cultura, e 60ul de DMSO (4,9%) utilizado na

diluição dos fármacos (grupo controle). Além deste controle, fez-se o controle do meio

RPMI, com 5 mL de meio, e cisticercos com o meio RPMI sem os fármacos, nas

mesmas condições de incubação (VINAUD et al., 2008 e 2009; MÁRQUEZ-

NAVARRO et al., 2013). Os parasitos foram incubados a 37°C, em 5% de CO2 e

umidade relativa de 95%, por 24 horas (VINAUD et al., 2008 e 2009; MÁRQUEZ-

NAVARRO et al., 2013). Após as 24 horas de cultivo, separou-se os cisticercos do meio

de cultura. Ambos foram congelados em nitrogênio líquido para estase das reações

metabólicas (VINAUD et al., 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b).

27

Eliana Isac

4.4-Análise dos ácidos orgânicos

4.4.1-Extração dos ácidos orgânicos

4.4.1.1- Amostras de meio de cultura

Após a estase em nitrogênio líquido, as amostras do meio de cultura foram

descongeladas, e os ácidos orgânicos secretados/excretados foram extraídos utilizando-

se uma coluna de troca iônica (Bond Elut® Agilent®), com o auxílio de uma caixa

acoplada a uma bomba a vácuo. Esta coluna foi ativada com 1 mL de HCl a 0,5 M, 1

mL de metanol e 2 mL de água ultrafiltrada. Em seguida aplicou-se 1 mL de amostra e

acrescentou-se 2 mL de água tipo I. Retirou-se a coluna da caixa, acrescentou-se 250 µL

de H2SO4 a 0,5 M, e centrifugou-se a 626 g (2.000 rpm), por 5 minutos, a 4 °C

(VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b). A amostra obtida

foi armazenada à -20 °C para posterior análise em Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE).

4.4.1.2- Amostras de extrato de cisticerco (EC)

Após a estase em nitrogênio líquido, os cisticercos foram descongelados e

homogeneizados em 500 µL de tampão tris-HCl a 0,1 M, com pH 7,6, acrescido de

inibidores de proteases (SIGMAFAST) (RENDÓN et al., 2004 e 2008; FRAGA et al.,

2012a e 2012b). O extrato obtido foi centrifugado a 15.652 g (10.000 rpm), por 10

minutos, a 4 °C (VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b). Do

fluido vesicular obtido extraiu-se os ácidos orgânicos, utilizando-se uma coluna de troca

iônica (Bond Elut® Agilent®), como descrito anteriormente no item 4.4.1.1. As

amostras obtidas foram armazenadas a -20 °C para posterior análise em CLAE.

28

Eliana Isac

4.4.2-Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

As amostras de extrato de cisticerco (EC) e do meio de cultura (MC) foram

submetidas à análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), com uma

coluna de exclusão BIORAD-Aminex HPX-87H. O eluente utilizado foi ácido sulfúrico

a 5 mM, com vazão de 0,6 mL/min, acoplado a um espectrofotômetro, em um

comprimento de onda de 210 nm. Para esta análise, utilizou-se 50 µL de cada amostra

(VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a e 2012b). Os resultados

foram analisados pelo programa Star Chromatography Workstation (Agilent®),

calibrado para identificação de ácidos orgânicos: piruvato e lactato, citrato, alfa-

cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato, acetato, acetoacetato, beta-

hidroxibutirato e propionato (VINAUD et al., 2007, 2008 e 2009; FRAGA et al., 2012a

e 2012b).

4.5-Dosagens bioquímicas

Utilizando-se o aparelho Architec C8000 Plus, por meio de análises

espectrofotométricas, foram feitas as dosagens das concentrações de glicose, ureia e

creatinina no EC e MC segundo o protocolo do kit comercial Wiener lab®.

4.6-Análises estatísticas

Os experimentos foram realizados em cinco repetições independentes. A análise

estatística foi realizada por meio do programa Sigma Stat 2.3. A estatística descritiva

foi feita para a determinação de média e desvio padrão, e, para avaliar as diferenças

entres os grupos analisados, as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal e

variância homogênea. Por apresentarem distribuição normal, utilizou-se análise da

variância. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p<0,05.

29

Eliana Isac

5. ARTIGOS

Nitazoxanide induces in vitro metabolic acidosis in Taenia crassiceps

cysticerci

Eliana Isac, Guaraciara de A. Picanço, Tatiane L. da Costa, Nayana F. de Lima,

Daniella de S. M. M. Alves, Carolina M. Fraga, Ruy de S. Lino Junior, Marina C.

Vinaud*

Laboratory of studies of the host-parasite relationship, Tropical Pathology and

Public Health Institute, Federal University of Goias. Brazil. Rua 235, s/n, Setor

Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.

* Corresponding author: Marina C. Vinaud. Laboratory of studies of the host-

parasite relationship, Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University

of Goias. Rua 235, s/n, Setor Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.

Telephone: +55 62 3209 6113. Fax: + 55 62 3209 6363. Email address:

[email protected]

Artigo submetido a Experimental Parasitology

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Eliana Isac

Abstract

Nitazoxanide (NTZ) is a broad-spectrum anti-parasitic drug used against a wide

variety of protozoans and helminthes. Albendazole (ABZ) is one of the drugs of choice

to treat both intestinal and tissue helminth and protozoan infections. However little is

known regarding their impact on the metabolism of parasites. The aim of this study was

to compare the in vitro effect of NTZ and albendazol sulfoxide (ABZSO) in the

glycolysis of Taenia crassiceps cysticerci. The cysticerci were treated with 1.2; 0.6; 0.3

and 0.15 µg/mL of NTZ or ABZSO. Chromatographic and spectrophotometric analyses

were performed. Regarding the glucose concentrations was possible to observe two

responses: impair of the uptake and gluconeogenesis. The pyruvate concentrations were

increased in the ABZ treated group. Lactate concentrations were increased in the culture

medium of NTZ treated groups. Therefore it was possible to infer that the metabolic

acidosis was greater in the group treated with NTZ than in the ABZ treated group

indicating that this is one of the modes of action used by this drug to induce the parasite

death.

Key words: Nitazoxanide; albendazole; anaerobic metabolism; lactic acid; Taenia

crassiceps

31

Eliana Isac

1. Introduction

Nitazoxanide (NTZ) is a broad-spectrum anti-parasitic drug used against a wide

variety of protozoans and helminths. It has been established that NTZ as well as its

reduced form, tizoxanide, are effective against most target pathogens. It is the only drug

effective against Cryptosporidium infections and one of the most effective against

intestinal giardiasis (Miyamoto and Eckman, 2015). It has been described as an

effective treatment of cutaneous leishmaniasis by Leishmania donovani (Dhawan et al.

2015). Also this drug has been indicated against intestinal and tissue helminth infection

such as cystic echinococcosis (Laura et al. 2015), soil-transmitted helminths

(Somvanshi et al. 2014); Ancylostoma ceylanicum, Ascaris suum, Trichuris muris and

Caenorhabditis elegans (Hu et al. 2013), Taenia saginata and Hymenolepis nana

(Rossignol and Maisonneuve, 1984). Interestingly this drug has been successfully used

against nosocomial pathogens (Gau et al. 2016), Clostridium difficile (Soriano and

Johnson, 2015) and hepatitis C virus (Kohla et al. 2016).

This drug has been indicated as an alternative treatment when the resistance to

traditional anti-parasitic drugs is detected. For example, NTZ has been described as

effective against T. saginata niclosamide- and praziquantel-resistant (Lateef et al. 2008).

In protozoans both NTZ and tizoxanide inhibit central physiological enzymes

such as pyruvate ferredoxin oxidoreductase, nitroreductase 1, quinone reductase and

induces lesions in the cell membrane and vacuolization (Leitsch 2015). While in

Neospora caninum, NTZ inhibited the protein disulfide isomerase (Muller et al. 2008).

In bacteria this drug inhibits the pilus biogenesis by the chaperone/usher pathway

(Chahales et al. 2016). However, there are few studies determining the effect of this

32

Eliana Isac

drug on helminths. Somvanshi et al. (2014) using the C. elegans experimental model for

soil-transmitted nematodes determined that NTZ acts on an alpha-type subunit of a

glutamate-gated chloride ion channel which is also responsible for ivermectin

susceptibility in this organism.

Albendazole (ABZ) is one of the drugs of choice to treat both intestinal and tissue

helminth and protozoan infections (Van den Enden 2009). However, regarding the G.

intestinalis treatment it has been determined that other drugs such as tinidazole and

NTZ are more effective than ABZ (Leitsch 2015; Escobeddo et al. 2016). Regarding the

treatment of helminth’s tissue infections there are few drugs used such as ABZ,

ivermectin and praziquantel, easy to use and effective against most parasites such as

Echinococcus granulosus (Hemphill et al. 2014), Strongyloides stercoralis (Luvira et al.

2014), ocular toxocariasis (Ahn et al. 2014) and cysticercosis (Del Brutto 2014). The

reliance on such drugs creates the danger of resistance which has already been reported

(Geary 2012) leading to the imperative need for the development of new drugs.

It is known that antihelminthic drugs are able to eliminate the parasitic infections,

however the mode of action of such drugs and their effect on the parasite metabolism

has been little explored. It has been previously determined that ABZSO in in vitro

analysis induces a partial blockage of glucose uptake, decrease in lactate concentrations

in the culture medium and a preference for the aerobic metabolism in T. crassiceps

cysticerci (Vinaud et al. 2008).

T. crassiceps is a cestode widely used as experimental model of cysticercosis

caused by T. solium due to their antigenic similarity (Vaz et al. 1997). It has been

previously used to determine the impact of anti-helminthics such as ABZ, praziquantel

and a benzimidazole derivative in their energetic metabolism (Vinaud et al. 2007; 2008;

33

Eliana Isac

Fraga et al. 2016). Therefore the aim of this study is to compare the in vitro effect of

NTZ and ABZ in the glycolysis of T. crassiceps cysticerci.

2. Material and Methods

2.1. Maintenance of T. crassiceps cysticerci

The maintenance of T. crassiceps cysticerci was performed according to the

description by Fraga et al. (2012). Briefly, BALB/c female mice with 8 – 12 weeks old

are intraperitoneally infected with 10 initial stage (no buds, translucent membrane and

vesicular liquid) T. crassiceps cysticerci, maintained in cages with five animals

maximum, received standard ration and water ad libitum. After 90 days of infection, the

animals are euthanized, the cysticerci removed from the peritoneal cavity and inoculated

into another mouse. The ethical principles of animal experimentation stipulated by the

Brazilian Society of Laboratory Animals Science (SBCAL) were obeyed. This study

was approved by the Ethics Committee in Animal Use from the Federal University of

Goias (CEUA/UFG) (protocol number 050/2013).

2.2. Cysticerci culture and drugs exposure

A mouse with 30 days of intraperitoneal infection was euthanized within a laminar

flow chamber and the cysticerci were removed and washed with sterile saline solution

as to remove cells and any other contaminants (Márquez-Navarro et al. 2013).

Afterwards the larval stage cysticerci (with buds, translucent vesicular membrane and

fluid) (Vinaud et al. 2007) were collected and cultured as described by Fraga et al.

(2016). Briefly, 30 larval stage cysticerci were added into 5 mL of supplemented RPMI

culture medium. The cysticerci were treated with 1.2; 0.6; 0.3 or 0.15 µg/mL of NTZ or

34

Eliana Isac

ABZ. The drugs were diluted with DMSO (0.60%). The control groups were constituted

by a group of cysticerci without drugs and another one that received the concentration

of DMSO used to dilute the drugs.

After 24 hours of culture the cysticerci were separated from their culture medium

and frozen into liquid nitrogen as to stop the metabolic reactions (Vinaud et al. 2008).

2.3. Biochemical analysis

The organic acids secreted/excreted into the culture medium were extracted

through an ionic exchange solid phase extraction column (Bond Elut® Agilent®), as

described by Vinaud et al. (2007).

The cysticerci extract (CE) was obtained after the liquid nitrogen metabolic stasis.

The cysticerci were defrost and homogenized in 500 µL of tris-HCl 0.1 M buffer

supplemented with a protease inhibitor (SIGMAFAST, protease inhibitor cocktail

tablets, EDTA free, Sigma), pH 7.6. The extract obtained was centrifuged at 15,652g

(10,000 rpm) per 10 minutes at 4ºC and then the organic acids were extracted through

an ionic exchange solid phase extraction column (Bond Elut® Agilent®). The resulting

samples were frozen at -20°C for posterior analysis in high performance liquid

chromatography (Vinaud et al. 2007).

For the chromatographic analysis an exclusion BIORAD-Aminex HPX-87H

column was used. The eluent was sulfuric acid 5 mM, 0.6 mL/min, with

spectrophotometric reading of absorbance at 210 nm. The results were analyzed through

the Star Chromatography Workstation software (Agilent®), previously calibrated for the

pyruvate and lactate identification which are indicative of anaerobic glycolisis (Vinaud

et al. 2007). The glucose quantification was performed through an Architec C8000 Plus

35

Eliana Isac

device, using a commercial kit protocol with an enzymatic method (Fraga et al. 2012).

2.4. Statistical analysis

All experiments were repeated five times independently. The statistical analysis

was performed through the Sigma Stat 4.0 software. The descriptive analysis was

performed as to determine the normal distribution and homogenous variation as well as

mean and standard deviation. As the values presented normal distribution, the analysis

of variation test (ANOVA) was performed followed by the Bonferrone post-test. The

differences were considered significant when p<0.05.

3. Results

This study compared the in vitro effect of two widely used antihelminthic drugs in

the glycolysis of T. crassiceps cysticerci. Therefore the concentrations of glucose and

the main final products of glycolysis, pyruvate and lactate, were quantified both in the

culture medium and in the cysticerci extract from T. crassiceps cysticerci after the

exposure to different concentrations of NTZ and ABZSO. The analysis of the culture

medium aimed to detect the excretion/secretion of glucose, pyruvate and lactate; while

the analysis of the cysticerci extract aimed to determine the intracellular concentrations

of these substances. The cysticerci were in vitro exposed to different concentrations of

the drugs which were diluted with DMSO. The diluent did not influence in the

metabolic analysis.

There was a significant difference between the glucose concentrations in the

culture medium of the control group and the group treated with the highest

concentrations of NTZ (p<0.05). While the NTZ treatment induced an impairment of

36

Eliana Isac

the glucose uptake the ABZ treatment induced a greater uptake of glucose (p<0.05)

(Figure 1).

Figure 1. Glucose concentrations in the culture medium and in the cysticerci

extract from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and









statistical difference when compared to the control group.

In the cysticerci extract the glucose levels were significantly higher in the NTZ

treated groups than in the control group (p<0.05). While in the ABZSO treated group

there was no significant difference when compared to the control group.

37

Eliana Isac

The pyruvate concentrations in the culture medium of the groups treated with

ABZSO were significantly higher than the concentration detected in the control group

(p<0.05). The NTZ treatment did not influence the pyruvate concentrations in the

culture medium. The pyruvate concentrations in the cysticerci extract were not

influenced by the exposure to ABZSO nor to NTZ (Figure 2).

Figure 2. Pyruvate concentrations in the culture medium and in the cysticerci

extract from groups in vitro treated with different concentrations of nitazoxanide and


concentrations detected in the cysticerci extrac; ctl cyst: cysticerci without drugs

exposure; ntz 1.2: cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.6: cysticerci

exposed to 0.6 µg/mL of nitazoxanide; ntz 0.3 cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of

nitazoxanide; ntz 0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of nitazoxanide; abz 1.2:

cysticerci exposed to 1.2 µg/mL of albendazole; abz 0.6: cysticerci exposed to 0.6

µg/mL of albendazole; abz 0.3: cysticerci exposed to 0.3 µg/mL of albendazole; abz

0.15: cysticerci exposed to 0.15 µg/mL of albendazole. * statistical difference when

compared to the control group.

38

Eliana Isac

There was a significant increase in the lactate concentrations in the culture

medium of the group exposed to all concentrations of NTZ (p<0.05). While the

exposure to different concentrations of ABZ did not influence the concentration of this

organic acid in the culture medium. The lactate concentrations in the cysticerci extract

were not influenced by the in vitro exposure nor to ABZ neither to NTZ (Figure 3).

Figure 3. Lactate concentrations in the culture medium and in the cysticerci

extract of cysticerci exposed to different concentrations of albendazole and

nitazoxanide. CM: concentrations detected in the culture medium analysis; CYST:








statistical difference when compared to the control group.

39

Eliana Isac

4. Discussion

Glucose is the main energy source for cestodes such as T. crassiceps (SMYTH a&

McMANNUS 1989). Due to the importance of such molecule in the parasite

metabolism this study compared the effect of two widely used antihelminthic drugs in

the in vitro glycolysis of T. crassiceps cysticerci.

The anaerobic energy metabolism in helminthes is enhanced when there are

stressful factors affecting the cell such as inadequate oxygen supply or exposure to

drugs. This may lead to metabolic acidosis and cell death (SMYTH & McMANNUS

1989). In our study was possible to observe the metabolic acidosis due to high levels of

lactate in the culture medium of the cysticerci treated both with NTZ. This fact may be

understood as the response of the parasitic cell to the stressful factor present in the

culture medium, i.e., the different concentrations of the drugs. Also it indicates that the

parasitic cell is evolving to death, even under little time of exposure (24h), single dose

of treatment and non-lethal doses (0.15 to 1.2 µg/mL).

The impair of glucose uptake is one of the mode of action observed in

benzimidazole drugs alongside with inhibition of tubulin formation (KOHLER 1985;

McCRACKEN & STILLWELL 1991; MARTIN 1997) and was observed in the group

treated with 1.2 µg/mL of ABZ in our study. Also as there was an increase in the

glucose levels in the culture medium it is possible to infer that gluconeogenesis also

happened in this group.

Xiao et al. (1993) described that mebendazole also inhibited the glucose uptake in

E. granulosus cyst wall. This effect was observed in the ABZSO (1.2 µg/mL) and in the

NTZ (1.2, 0.6 and 0.3 µg/mL) treated groups in our study. It seems that one of the

modes of action of benzimidazole antihelminthics, such as mebendazole and ABZ, is to

impair the transmembrane proton gradient which results in diminished levels of cellular

40

Eliana Isac

ATP (MCCRACKEN and STILLWELl, 1991) and in the use of alternative energy

sources such as protein catabolism and fatty acids oxidation (VINAUD et al. 2009;

FRAGA et al. 2012).

One of the metabolic effects of NTZ is to interfere in the pyruvate oxidoreductase

activity (Sisson et al. 2002). This enzyme catalyzes the interconversion of pyruvate into

acetyl-CoA. The blockage of this enzyme leads to an excess of pyruvate which may be

used in two different pathways: 1. Gluconeogenesis from the activity of

phosphoenolpyruvate synthase and phosphoenolpyruvate carboxykinase; 2. Anaerobic

metabolism through lactate dehydrogenase activity and lactate production (SMYTH &

McMANNUS 1989). Both this pathways were observed in the NTZ treated groups due

to the high concentrations of glucose in the culture medium analysis and due to the high

concentrations of lactate both in the culture medium and in the cysticerci extract

analysis. Also gluconeogenesis was observed in the ABZSO 1.2 µg/mL treated group

due to the increase in the glucose levels in the culture medium analysis.

Interestingly, the pyruvate concentrations were not altered in the NTZ treated

groups. This indicates that this organic acid is being used as substrate for lactate

dehydrogenase as to produce lactate and also as substrate for malic enzyme as to

produce malate, both cytoplasmatic and mitrochondrially (SMYTH & McMANNUs

1989). The ABZ treated groups presented an increase in the pyruvate concentrations in

the culture medium analysis. The pyruvate may have been produced by the activity of

lactate dehydrogenase and malic enzyme which are not influenced by the presence of

the drug (ESCOBEDO et al. 2016).

Therefore, it is possible to conclude that the NTZ concentrations tested induced

metabolic acidosis in in vitro T. crassiceps cysticerci which is a signal of cell death.

Also the drug impacted the glucose uptake by the parasite which may have contributed

41

Eliana Isac

to the lactate production. It was possible to infer that the metabolic acidosis was greater

in the group treated with NTZ than in the ABZ treated group indicating that this is one

of the modes of action used by this drug to induce the parasite death.

8. Acknowledgments:

This work was supported by CNPq - National Counsel of Technological and

Scientific Development (grant number 471009/2013-0).

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47

Eliana Isac

Artigo 2

Influência in vitro da nitazoxanida no metabolismo energético de cisticercos de

Taenia crassiceps.

Eliana Isac, Guaraciara de A. Picanço, Tatiane L. da Costa, Nayana F. de Lima,

Daniella de S. M. M. Alves, Carolina M. Fraga, Ruy de S. Lino Junior, Marina C.

Vinaud*

Laboratory of studies of the host-parasite relationship, Tropical Pathology and

Public Health Institute, Federal University of Goias. Brazil. Rua 235, s/n, Setor

Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.

* Corresponding author: Marina C. Vinaud. Laboratory of studies of the host-

parasite relationship, Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University

of Goias. Rua 235, s/n, Setor Universitário, Goiania, Goias, Brazil. CEP:74605-050.

Telephone: +55 62 3209 6113. Fax: + 55 62 3209 6363. Email address:

[email protected]

Resumo

A cisticercose pela Taenia crassiceps em humano é uma parasitose tecidual

considerada rara e de caráter grave principalmente em pacientes imunodeprimidos. A

infecção deste parasito em camundongos é utilizada como modelo experimental para estudos

da cisticercose pela T. solium, pela similaridade antigênica, e pela facilidade no manuseio em

laboratório. A nitazoxanida é um fármaco de largo espectro utilizado no tratamento de

parasitoses por helmintos e protozoários, no entanto pouco explorado no tratamento de

parasitoses teciduais.

mailto:[email protected]

48

Eliana Isac

O objetivo deste estudo foi avaliar alterações no metabolismo energético in vitro de

cisticercos de T. crassiceps induzidas pela exposição a dois fármacos antiparasitários,

nitazoxanida (NTZ) e albendazol sulfóxido (ABZSO). Foram analisados os ácidos orgânicos

do ciclo do ácido cítrico: citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, malato e oxaloacetato, da

oxidação de ácidos graxos: acetato, beta-hidroxibutirato e propionato, e do catabolismo de

proteínas, ureia e creatinina. Esses ácidos foram quantificados no extrato de cisticerco (EC) e

no meio de cultura (MC) após 24 horas de exposição in vitro a diferentes concentrações de

NTZ e ABZSO em meio RPMI suplementado. Houve uma diminuição significativa nas

concentrações de citrato detectadas nos grupos tratados com NTZ quando comparado ao

controle. Foi possível observar que o grupo controle tratado com NTZ realizaram o ciclo do

ácido cítrico de forma tradicional devido a detecção de alfa-cetoglutarato, enquanto que os

grupos tratados com ABZSO realizaram a via da fumarato redutase devido a não detecção de

alfa-cetoglutarato. Observou-se um aumento significativo na concentração de succinato

detectado no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL quando comparado ao grupo controle.

Observou-se um aumento das concentrações de malato no MC nos grupos tratados com NTZ

1,2 e 0,6 µg/mL e ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL em relação ao grupo controle. Nas vias de beta

oxidação de ácidos graxos, não foi detectado o acetato nos grupos tratados com NTZ fato que

confirma o seu mecanismo de ação. Foi possível observar um aumento na oxidação de

ácidos graxos devido a um aumento na concentração de beta-hidroxibutirato e de propionato.

Conclui-se que os fármacos induziram a utilização de vias alternativas de produção de acetil-

coA, como a oxidação de ácidos graxos e o catabolismo de proteínas. Observou-se também

uma preferência pela via da fumarato redutase nos grupos expostos ao ABZSO.

Palavras chaves: Taenia crassiceps, nitazoxanida, albendazol sulfóxido, metabolismo

energético, vias alternativas de produção de energia.

49

Eliana Isac

1. Introdução

A cisticercose causada pela presença de larvas de Taenia solium nos tecidos do

hospedeiro humano, representa um grave problema em saúde pública sendo considerada

ainda como uma doença negligenciada (GARCIA et al., 2014). Segundo a Organização

Mundial de Saúde (2010), existem aproximadamente 50 milhões de pessoas sofrendo

com epilepsia quando há o comprometimento do sistema nervoso central, e 80%

residindo em países em desenvolvimento.

O albendazol e praziquantel são os fármacos de escolha usados para o

tratamento da cisticercose, variando o esquema terapêutico de acordo com o número e a

localização dos cisticercos, e também com a reação inflamatória nos tecidos adjacentes

(GARCIA et al., 2014; FONGANG, et al., 2015).

VINAUD et al. (2007; 2008) demonstraram que cisticercos de T. crassiceps

expostos in vitro ao albendazol tiveram uma preferência por vias aeróbias de produção

de energia pela baixa excreção de lactato. Porém in vivo, após o tratamento do

hospedeiro com o fármaco houve um aumento de oxaloacetato e alfa-cetoglutarato,

induzindo a utilização de fontes alternativas de produção de energia, como a oxidação

de ácidos graxos com o aumento de beta-hidroxibutirato e propionato (FRAGA et al.,

2012a; 2012b).

Taenia crassiceps é um parasito similar antigenicamente e bioquimicamente à T.

solium (VAZ et al., 2007), podendo ser utilizada como modelo experimental para

estudos do efeito de fármacos no seu metabolismo energético (VINAUD et al.,2007;

2008; FRAGA et al., 2012).

A glicose e o glicogênio são os principais carboidratos utilizados como fonte de

reserva energética para cisticerco de T. crassiceps em sua fase larval. A degradação

dessas substâncias gera substratos que são utilizados em vias de seu metabolismo

50

Eliana Isac

aerobio (KÖHLER & VOIGT, 1988; CORBIN et al., 1998; VINAUD et al., 2007). Em

situações de escassez energética ou mesmo quando a captação da glicose é dificultada

por ação de fármacos, outros carboidratos armazenados em sua membrana cística

podem ser utilizados pelo parasito como a manose, galactose e as glicosamidas

(MELHORN et al., 1988; LAMSAN & MCMANUS, 1990).

A atividade aeróbia in vivo de cisticerco de T. crassiceps ocorre em função da

quantidade de oxigênio que é difundida em seu habitat, ou seja, nos tecidos dos seus

hospedeiros intermediários. Existe um maior gasto de energia e fontes energéticas

retiradas de seu hospedeiro no cisticerco em estádio larval. Provavelmente isto ocorra

durante a formação de seus brotamentos (DORAIS & ESCH, 1969; VINAUD et al.,

2007). Associado a esse fato, o tamanho do cisticerco também facilitaria uma maior

difusão de oxigênio pelos tecidos de seu hospedeiro estabelecendo assim as vias

metabólicas responsáveis pela cadeia respiratória como o ciclo do ácido cítrico,

degradação dos substratos, fosforilação oxidativa e a via alternativa de beta-oxidação de

ácidos graxos (KÖHLER & VOIGT, 1988). Embora os antihelmínticos sejam eficazes

no tratamento das parasitoses, o impacto desses fármacos no metabolismo desses

parasitos ainda é pouco conhecido.

A nitazoxanida (NTZ) é um anti-parasitario do grupo dos nitrotiazois de amplo

espectro utilizado no tratamento de infecções intestinais em humanos causadas por

protozoários e helmintos gastrointestinais (FOX & SARAVOLAX, 2004). É um

fármaco de escolha para o tratamento de giardíase e criptosporidíase (MIYAMOTO &

ECKMANN, 2015). É rapidamente hidrolisado no plasma pelas esterases ao seu

metabólito a tizoxanida após a sua administração oral, em humanos (BROEKHUYSEN

et al., 2000; HUANG et al., 2015). Mostrou-se eficaz no tratamento de parasitos adultos

de diferentes espécies de nematodeos e cestodeos como Ascaris lumbricoides

51

Eliana Isac

(ROMERO CABELLOET et al., 1997; ABAZA et al., 1998; DAVILA-GUTIERREZ et

al., 2002; JUAN et al., 2002; DIAZ et al., 2003), Ancylostoma duodenale (ABAZA et

al., 1998; GEARY et al., 1999), Trichuris trichiura (ABAZA et al., 19 98; DAVILA-

GUTIERREZ et al., 2002; JUAN et al., 2002; FOX & SARAVOLATZ, 2005),

Strongyloides stercoralis (SOMVANSHI et al., 2014), T. saginata e Hymenolepis nana

(ROSSINGNOL & MAISONNEUVE, 1984; ORTIZ et al., 2002).

Sua atividade antiparasitária esta relacionada à sua ação sobre a enzima piruvato

ferredoxina oxiredutase (PFOR) na descarboxilação do piruvato em Acetil CoA, a partir

de transferência de elétrons e produção de ATP (FUIRD & RAGSDALET, 2000;

PALOMARES-ALONSO, et al., 2007). Podendo também inibir enzimas nitroredutases,

quinona1, quinona redutase lesando a membra celular e vacualização. É também

indicado como um tratamento alternativo quando ocorre resistência do parasito aos

tratamentos com outros fármacos. Como o desenvolvimento de resistência da T.

saginata ao praziquantel e niclosamida (LATEEF et al., 2008).

Para o tratamento de helmintiases teciduais foi relatado o uso de ABZ e

praziquantel e ivermectina em Echinococus granulosus (LUVIRA et al., 2014) e

Strongyloides stercoralis (HEMPHILL et al., 2014) e cisticercose (DEL BRUTO et al.,

2014). No entanto o uso frequente desses fármacos pode gerar resistência como

relatado por (CIOLI et al., 2014; GEARY et al., 2012). Isto reforça a necessidade para o

desenvolvimento de novos fármacos.

O objetivo deste estudo foi avaliar alterações no ciclo do ácido cítrico in vitro e

oxidação de ácidos graxos e catabolismo de proteinas de cisticercos de T. crassiceps

induzidas pela exposição a dois fármacos antiparasitários, nitazoxanida e albendazol

sulfóxido.

52

Eliana Isac

2. Material e Metódos

2.1. Manutenção de cisticerco de T. crassiceps

A manutenção de T. crassiceps cepa ORF foi realizada de acordo com a

descrição por FRAGA et al. (2012). Resumidamente, camundongos BALB / c fêmeas

com 8 - 12 semanas de idade são infectados intraperitoneal com 10 cisticercos na fase

inicial (translúcidos e sem brotamentos, e líquido translúcido). Os camundongos

infectados com T.crassiceps são mantidos em gaiolas com o máximo de cinco animais,

recebendo ração padrão e água ad libitum. Após 30 dias de infecção os animais são

eutanasiados, os cisticercos removidos da cavidade peritoneal e inoculados em outro

camundongo BALB/c. Foram obedecidos os princípios éticos da experimentação animal

estipuladas pela Sociedade Brasileira de Animais de Laboratório Ciência (SBCAL).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Universidade

Federal de Goiás (CEUA / UFG) (protocolo número 050/2013).

2.2 Cultura e exposição dos cisticercos aos fármacos

Camundongo com 30 dias de infecção intraperitoneal foi eutanasiado dentro

de uma câmara de fluxo laminar, e os cisticercos removidos e lavados com solução

salina estéril para remover as células e quaisquer outros contaminantes (MARQUEZ-

NAVARRO et al., 2013). Posteriormente, o cisticercos em fase larval (com

brotamentos, translúcidos e liquido translúcido) (VINAUD et al., 2007) foram coletados

e cultivados como descrito por FRAGA et al. (2016). Resumidamente, 30 cisticercos

em fase larval foram adicionados a 5ml de meio de cultura RPMI suplementado.

Os cisticercos foram tratados com 1,2; 0,6; 0,3 e 0,15 ug / mL de NTZ e ABZSO. Os

fármacos foram diluídas com DMSO (0,60 %). Os grupos controles foram constituídos

53

Eliana Isac

por um grupo de cisticercos sem NTZ e outro que recebeu a concentração de DMSO

utilizada para diluir os fármacos. Após 24 horas de cultura, os cisticercos foram

separados do seu meio de cultura, e congelados em nitrogênio líquido para parar as

reações metabólicas (VINAUD et al., 2008).

2.3 Análises Bioquímicas

Os ácidos orgânicos detectados no meio de cultura foram extraídos

através de uma troca iónica em coluna de extração em fase sólida (Bond Elut®

Agilent®) como descrito por VINAUD et al. (2007).

Após a estase metabólica em nitrogênio líquido, os cisticercos foram

descongelados e homogeneizados em 500 uL de tampão Tris-HCl 0,1 M, suplementado

com um inibidor de protease (SIGMAFAST, comprimidos de coquetel inibidor da

protease, EDTA livre, Sigma), pH 7,6. Os extractos obtido foram centrifugados a

15,652g (10.000 rpm) por 10 minutos a 4 ° C e em seguida, os ácidos orgânicos foram

extraídos através de uma troca ionica em coluna de extração em fase sólida (Bond

Elut® Agilent®). As amostras resultantes foram congeladas a -20 ° C para posterior

análise em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (VINAUD et al., 2007). Para a

análise cromatográfica foi utilizada uma coluna de exclusão BIORAD - Aminex HPX -

87H. O eluente foi ácido sulfúrico a 5 mM, 0,6 mL / min, com a leitura

espectrofotométrica da absorvância a 210 nm. Os resultados foram analisados por meio

do software Star Cromatografia Workstation (Agilent®), previamente calibrado para a

identificação de acidos orgânicos que são indicativos do ciclo do ácido cítrico: citrato,

alfa-cetoglutarato, succinato, malato e oxaloacetato e de vias alternativas como: acetato,

acetoacetato, beta-hidroxibutirato fumarato, ureia e creatinina (VINAUD et al., 2007).

54

Eliana Isac

A quantificação da ureia e cretinina foi realizada através de um

dispositivo Architec C8000 e além disso, usando um protocolo de kit comercial com um

método enzimático (FRAGA et al., 2012).

2.4 Análise Estatística

Todos os experimentos foram repetidos cinco vezes de forma

independente. A análise estatística foi realizada através do software Sigma Stat 4.0. A

análise descritiva foi realizada para determinar a distribuição normal e variação

homogênea, bem como a média e desvio padrão.

Com os valores apresentados de distribuição normal, o teste de

análise de variância (ANOVA) foi realizada seguindo-se o pós-teste Bonferrone. As

diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

3. Resultados

Este estudo analisou in vitro a ação da NTZ e ABZSO no ciclo do ácido

cictrico e na oxidação de ácidos graxos em cisticercos de T. crassiceps. A ánalise no

meio de cultura detectou citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, malato e oxaloacetato,

acetato, beta-hidroxibutirato, enquanto que no extrato do cisticerco determinou-se as

concentrações dentro da célula. Os fármacos foram diluidos em DMSO, o qual não

interferiu nas ánalises metabólicas.

Ciclo do ácido cítrico

Como pode se observar nos grupos controle, há uma concentração maior de

citrato no EC do que no MC (p < 0,05). Esse padrão foi observado somente nos grupos

tratados com ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL (Figura 1).

55

Eliana Isac

Foi observado que os grupos controle e os grupos tratados com NTZ realizaram

o ciclo do ácido cítrico tradicional. Enquanto que os grupos tratados com ABZSO

realizaram a via da fumarato redutase devido a não detecção de alfa-cetoglutarato nem

no MC nem no EC (Figura 2). Houve uma diminuição significativa nas concentrações

de citrato detectadas nos grupos tratados com NTZ quando comparado ao controle

(p<0,05). O tratamento com ABZSO não influenciou as concentrações de citrato

detectadas no EC. Não houve diferença significativa nas concentrações de citrato

detectadas no MC (Figura 1).

Observou-se um aumento significativo na concentração de succinato detectado

no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL quando comparado ao grupo controle

(p<0,05). Os fármacos não influenciaram as concentrações de succinato nas demais

análises (Figura 3).

Figura 1. Concentração média de citrato detectado no meio de cultura (MC) e


concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.

56

Eliana Isac

Figura 2. Concentração média de α-cetoglutarato detectado no meio de cultura

(MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes


Figura 2. Concentração média de succinato detectado no meio de cultura (MC)

e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes


57

Eliana Isac

Existe uma concentração significativamente maior de fumarato no MC do grupo

controle do que no meio RPMI sem cisticercos (p<0,05), mostrando que o fumarato

detectado foi proveniente do metabolismo do cisticerco. Em todos os grupos tratados

com NTZ foi possível observar uma maior concentração de fumarato no EC do que no

MC (p<0,05). Este padrão não foi observado no grupo controle nem nos grupos tratados

com ABZSO (Figura 4).

As concentrações de malato detectadas no EC dos grupos tratados com ABZSO

foram significativamente menores do que aquelas observadas no grupo controle

(p<0,05). Em relação as concentrações detectadas no MC observou-se que houve um

aumento significativo de malato nos grupos tratados com NTZ 1,2 e 0,6 µg/mL e

ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL em relação ao grupo controle (p<0,05). É importante ressaltar

que no grupo controle foi possível observar uma concentração de malato

significativamente maior no EC do que no MC (p<0,05), padrão que foi observado

somente nos grupos tratados com NTZ. Nos grupos tratados com ABZSO não houve

diferença entre as concentrações detectadas no EC e no MC (Figura 5).

Observou-se que no grupo controle ocorre uma concentração maior de

oxaloacetato no EC do que no MC (p<0,05). Este padrão foi observado somente nos

grupos expostos com ABZSO nas concentrações de 1,2 e 0,6 µg/mL. Observou-se uma

concentração significativamente menor deste ácido no EC do grupo exposto a NTZ 0,6

µg/mL em relação ao grupo controle (Figura 6).

58

Eliana Isac

Figura 3. Concentração média de fumarato detectado no meio de cultura (MC) e



Figura 4. Concentração média de malato detectado no meio de cultura (MC) e



59

Eliana Isac

Figura 5. Concentração média de oxaloacetato detectado no meio de cultura

(MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a diferentes


Oxidação de ácidos graxos

Não se observou a detecção de acetato nos grupos tratados com NTZ. O

tratamento com ABZSO não influenciou nas concentrações de acetato detectadas no EC

e no MC (Figura 7).

Os fármacos não influenciaram as concentrações de beta-hidroxibutirato

detectadas no EC. Com relação as concentrações detectadas no MC, houve um aumento

significativo nos grupos tratados com NTZ 1,2 µg/mL, ABZSO 1,2 e 0,6 µg/mL

(p<0,05). Foi possível observar nos grupos controle que as concentrações de beta-

hidroxibutirato são significativamente maiores no EC do que no MC (p<0,05). Este

padrão foi observado somente nos grupos tratados com NTZ 0,6 e 0,15 µg/mL e

ABZSO 0,6 e 0,15 µg/mL (p<0,05) (Figura 8).

Observou-se um aumento significativo nas concentrações de propionato

encontradas no MC tratado com NTZ 0,6 µg/mL e no EC do grupo tratado com NTZ

60

Eliana Isac

1,2 µg/mL(p<0,05). Por outro lado ocorreu uma diminuição significativa das

concentrações deste ácido no grupo tratado com ABZ 1,2 µg/mL (p<0,05). É

interessante observar que este ácido não foi detectado no MC dos grupos tratados com

NTZ 0,3 e 0,15 µg/mL e ABZSO 0,15 µg/mL, e no EC dos grupos tratados com

ABZSO (Tabela 3). Observou-se que nos grupos controles não ocorre diferença

significativa nas concentrações de propionato detectadas no EC e no MC, padrão que se

repetiu nos grupos tratados (Figura 9).

Figura 6. Concentração média de acetato detectado no meio de cultura (MC) e



61

Eliana Isac

Figura 7. Concentração média de beta-hidroxibutirato detectado no meio de

cultura (MC) e no extrato de cisticercos (EC) de Taenia crassiceps expostos in vitro a

diferentes concentrações de nitazoxanida e albendazol sulfóxido.

62

Eliana Isac

Figura 8. Concentração média de propionato detectado no meio de cultura (MC)



Catabolismo de proteínas

Foi possível detectar o catabolismo in vitro de proteínas nos cisticercos de T.

crassiceps expostos a diferentes concentrações de NTZ e ABSZO devido a

quantificação de fumarato, ureia e cretatinina tanto no MC quanto no EC.

Observou-se uma diferença significativa nas concentrações de ureia detectadas

no meio de cultura RPMI e no MC do grupo controle (p<0,05) indicando que o parasito

é capaz de produzir ureia. Os fármacos utilizados não influenciaram nas concentrações

de ureia detectadas no MC e no EC. Foi possível observar que nos grupos controle

ocorre uma maior concentração de ureia no MC do que no EC (p<0,05). Este padrão foi

observado somente e nos grupos tratados com NTZ 1,2 µg/mL e nos grupos tratados

com ABZSO. Este fato demonstra uma interferência no padrão de produção de ureia

63

Eliana Isac

pelo parasito quando exposto a NTZ 0,6; 0,3 e 0,15 µg/mL (Figura 10).

Os fármacos utilizados não influenciaram nas concentrações de creatinina

detectadas no EC e MC (Figura 11).

Figura 9. Concentração média de ureia detectada no meio de cultura (MC) e no



Figura 10. Concentração média de creatinina detectada no meio de cultura (MC)



64

Eliana Isac

4. Discussão

Este estudo permitiu avaliar o impacto de dois fármacos anti-helminticos

amplamente utilizados no tratamento de parasitoses intestinais e teciduais no

metabolismo in vitro de cisticercos de T. crassiceps. Estudos metabólicos permitem a

compreensão do mecanismo de ação do fármaco, dos mecanismos de sobrevivência

utilizados pelo parasito e uma melhor compreensão da relação parasito hospedeiro

(VINAUD et al., 2008, 2009; FRAGA et al. 2012a, 2012b).

A detecção de citrato nos grupos tratados com NTZ indica que a acetil-CoA foi

produzido pelas fontes alternativas de produção de energia, como a oxidação de ácidos

graxos e o catabolismo de proteínas (VINAUD et al., 2009; KÖHLER & VOIGT,

1988). Podemos fazer essa afirmação diante do mecanismo de ação do fármaco ao inibir

a ação da enzima piruvato ferredoxina oxidoredutase impedindo a descarboxilação de

piruvato em acetil-coA e, consequentemente, impede a utilização de glicose como fonte

de acetil-coA e citrato (FUIRD & RAGSDALET, 2000; PALOMARES-ALONSO et al.,

2007; HOFFMANN et al., 2007).

A diminuição significativa nas concentrações de citrato detectadas no EC do

grupo tratado com todas as concentrações de NTZ em relação ao grupo controle

confirma este mecanismo de ação do fármaco (FUIRD & RAGSDALET, 2000;

PALOMARES-ALONSO et al., 2007; HOFFMANN et al., 2007). Dessa forma, a

produção de citrato permitiu ao parasito realizar o ciclo do ácido cítrico na forma

tradicional, devido a detecção de alfa-cetoglutarato nos grupos tratados com NTZ.

Nos grupos tratados com ABZSO não foi detectado o alfa-cetoglutarato, nem no

MC quanto no EC mostrando que provavelmente o parasito utilizou a via da fumarato

redutase. A via fumarato redutase é utilizada pelo parasito em situações em que ocorre

depleção de fontes energéticas, como bloqueio da captação de glicose induzida pelo

65

Eliana Isac

ABZ tanto in vitro quanto in vivo (VINAUD et al., 2008; FRAGA et al., 2012a) ou em

situações de alterações metabólicas (VINAUD et al., 2007, 2008 2009). Esta via permite

ao parasito produzir succinato e moléculas doadoras de elétrons como NADH e FADH2

para a cadeia transportadora de elétrons ao metabolismo aeróbio para que ambos se

completem (ZENKA & PROCOPIC, 1987; ZENKA et al., 1987; CORBIN et al., 1998;

VINAUD et al., 2007).

Analisando as concentrações de oxaloacetato observou-se que houve um

aumento somente nos grupos expostos ao ABZSO nas concentrações de 1,2 e 0,6

µg/mL. Indicando que o fármaco nessas concentrações não influenciou nas atividades

das enzimas malato desidrogenase citosolica e malato desidrogenase mitocondrial,

sendo o oxaloacetato desidrogenado para a produção de malato (CORBIN et al., 1998;

LENHINGER et al., 2011).

A detecção de maiores concentrações de malato no EC nos grupos tratados com

NTZ nas concentrações de 1,2 e 0,6 µg/ml em relação ao grupo controle pode ser

resultado do aumento de piruvato pela influência do fármaco bloqueando a PFOR na

descarboxilação do piruvato em acetil-coA (HOFFMANN et al., 2007). Isto gera um

excesso de piruvato mitocondrial que tem transito livre para o citosol, podendo ser

desidrogenado pela enzima lactato desidrogenase e ser excretato como lactato. Podendo

ainda sob ação da enzima málica citosolica originar o malato. Na mitocôndria, o

piruvato é consumido pela ação da enzima málica mitocondrial para a formação do

malato mitocondrial, gerando assim o aumento de malato nessas concentrações dos

fármacos.

Quanto as concentrações de succinato, observou-se um aumento significativo na

concentração deste ácido detectado no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL

quando comparado ao grupo controle. O succinato foi excretado como produto

66

Eliana Isac

intermediário do ciclo do ácido cítrico, podendo ainda ser utilizado pela via succinato

desidrogenase como transportadora de elétrons na cadeia respiratória confirmando a

preferência do cisticerco pela produção de energia em aerobiose (CORBIN et al., 1998;

DEL ARENAL et al., 2005; WILLMS et al., 2005; LENHINGER, et. al., 2011). Os

fármacos nas demais concentrações não influenciaram as concentrações de succinato.

Foi possível observar uma maior concentração de fumarato no MC do grupo controle

quando comparado ao meio RPMI sem o cisticerco, sendo um indicativo que o fumarato

detectado foi originado do cisticerco sem ação dos fármacos. Em todos os grupos

tratados com NTZ observou-se um aumento nas concentrações de fumarato, indicando

que este metabólico pode ter sido produzido pelo catabolismo de proteínas no ciclo da

úreia, podendo ser excretado ou entrar para a mitocôndria participando do ciclo do ácido

cítrico (LEHNINGER et al., 2011). As concentrações de fumarato não foram alteradas

nos grupos tratados com ABZSO.

As concentrações de beta-hidroxibutirato não foram influenciadas pelos

fármacos no EC. Entretanto podemos observar um aumento significativo das

concentrações deste ácido no MC nos grupos tratados com NTZ 1,2 µg/mL, ABZSO 1,2

e 0,6 µg/ml. Foi possível observar também que as concentrações detectadas de beta-

hidroxibutirato são significativamente maiores no MC do que no EC no grupo controle,

o mesmo ocorreu nos grupos tratados com NTZ 0,6 e 0,15 µg/mL e ABZSO 0,6 e 0,15

µg/ml. Pela influência exercida pelos fármacos na captação da glicose acredita-se que o

parasito tenha utilizado outra fonte alternativa para a produção de energia com a

produção de acetil-coA a partir da degradação de ácidos graxos. Além disso, a não

detecção de acetato nos grupos tratados com NTZ confirmam a influência deste fármaco

na enzima ferredoxina oxidoredutase (HORTON, 2000; LENHIGNER et al., 2011).

Isto provavelmente tenha ocorrido pois o acetato foi utilizado pelo parasito para

67

Eliana Isac

a produção de acetil coA produzido por vias alternativas e suprindo as concentrações

necessárias deste metabólito nas vias do ciclo do ácido cítrico (HORTON, 2000;

LENHIGNER et al., 2011).

Foi detectado um aumento de propionato no MC no grupo tratado com NTZ 0,6

µg/mL e no EC do grupo tratado com NTZ 1,2 µg/mL. Provavelmente este ácido

orgânico foi consumido para a produção de succinato, utilizando uma via alternativa

para a produção de energia pela influência da NTZ na captação de glicose. (HORTON,

2000, LEHNINGER et al., 2011; FRAGA et al., 2012a). Diferentemente nos grupos

onde ocorre uma diminuição do propionato e nos grupos onde não foi detectado, este

metabólito pode ter sido consumido para a produção de propionil CoA gerando ácidos

graxos voláteis como metilbutirato e metilvalerato, excretados em condições de

anaerobiose (LEHNINGER et al., 2011; FRAGA et al., 2012).

A diferença significativa encontrada de ureia detectada no MC em relação ao EC

no grupo controle indica que o parasito está realizando o catabolismo de proteínas.

Entretanto em nenhuma concentração os fármacos interferiram nas concentrações de

ureia no MC e EC. Observou-se que nos grupos controle e nos grupos tratados com

NTZ e nos grupos tratados com ABZSO ocorre uma maior concentração de ureia no

MC do que no EC, demonstrando uma interferência no padrão de produção de ureia

pelo parasito nos grupos expostos a NTZ 0,6; 0,3 e 0,15 µg/ml. A detecção do ciclo da

uréia é uma via metabólica importante na excreção de produtos tóxicos como a amônia

em mamíferos (LEHNINGER et al., 2011).

Podemos concluir diante dos resultados encontrados que o mecanismo de ação

descrito da NTZ, o bloqueio da enzima piruvato ferredoxina oxidoredutase impede

descarboxilação de piruvato em acetil-CoA e, consequentemente, impedindo a

utilização de glicose como fonte de acetil-coA. Esse mecanismo de ação induz o

68

Eliana Isac

parasito ao uso de vias alternativas para a produção de acetil CoA, como a oxidação de

ácidos graxos e o catabolismo de proteínas. Observou-se também a preferência do

metabolismo aeróbio nos grupos tratados com a NTZ e o uso da via da fumarato

redutase nos grupos expostos ao ABZSO pela não detecção de alfa-cetoglutarato nesses

grupos.

69

Eliana Isac

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77

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6. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este estudo permitiu avaliar alterações metabólicas nos cisticercos de T.

crassiceps expostos in vitro a diferentes concentrações de NTZ e ABZSO. Dessa forma

foi possível observar que:

1. As concentrações testadas de NTZ induziram a uma acidose metabólica in vitro

em cisticercos de T. crassiceps, detectada pelas concentrações de lactato

elevadas no MC.

2. Observou-se maior impacto na captação de glicose nos grupos tratados com as

diferentes concentrações de NTZ.

3. Foi possível observar a utilização de vias alternativas de produção de Acetil-

CoA, como a oxidação de ácidos graxos e o catabolismo de proteínas, devido a

detecção de citrato nos grupos tratados com NTZ

4. O mecanismo ação da NTZ descrito em protozoários foi confirmado in vitro em

cisticercos de T. crassiceps devido a não detecção de acetato nos grupos tratados

com diferentes concentrações deste ácido.

5. Observou-se uma preferência pela via da fumarato redutase nos grupos expostos

ao ABZSO pela não detecção de alfa-cetoglutarato.

6. A oxidação de ácidos graxos foi influencia pela presença de NTZ devido a

alterações detectadas nas concentrações de beta-hidroxibutirato e propionato

7. Foi possível detectar o catabolismo de proteínas nos parasitos expostos aos

fármacos, que não influenciaram nessa via.

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8.1. Parecer do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA)

8. ANEXOS

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8.2. Artigo

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universidade federal de goiÁs instituto de ......ii eliana isac eliana isac efeito in vitro da...

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