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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

RENATO MARTINS ANDRADE

CARRAGENANAS DA ALGA MARINHA VERMELHA Solieria filiformis:

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

CICATRIZANTE

FORTALEZA

2016

RENATO MARTINS ANDRADE

CARRAGENANAS DA ALGA MARINHA VERMELHA Solieria filiformis:

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

CICATRIZANTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de mestre em Bioquímica.

Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientadora: Profa. Dra. Norma Maria Barros

Benevides.

Coorientadora: Dra. Natássia Albuquerque

Ribeiro.

FORTALEZA

2016

A Deus.

À minha família.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida, pelas oportunidades, por me conceder saúde, disposição,

determinação, força e sabedoria para conquistar meus objetivos.

À professora Dra. Norma Maria Barros Benevides, por ter me acolhido em seu

laboratório, pelos ensinamentos e por me orientar durante os dois anos de mestrado com muita

dedicação e disponibilidade.

À Dra. Natássia Albuquerque Ribeiro, por todos os ensinamentos, pela

colaboração nos experimentos e por sua dedicação em me coorientar.

Ao professor Dr. Vitor Hugo Pomin, da Universidade Federal do Rio de Janeiro

(UFRJ), por ter me recebido em seu laboratório e por sua essencial colaboração na realização

dos experimentos de caracterização estrutural.

Ao professor Dr. Renato de Azevedo Moreira e a Dra. Ana Luíza Gomes

Quinderé, por gentilmente terem aceitado integrar a banca examinadora deste trabalho.

A todos da farmácia de manipulação Magistral Medicina e Estética, pela

colaboração na formulação dos géis.

Aos amigos Ismael Nilo, Kátia Ribeiro, Ariévilo Rodrigues, por me receberem em

sua residência no Rio de Janeiro e pelas valiosas contribuições nos experimentos de

ressonância magnética nuclear.

Ao colega Felipe Bezerra pela ajuda na interpretação dos resultados de

ressonância magnética nuclear.

Ao colega Gustavo Ramalho pela ajuda nos experimentos de composição

monossacarídica.

À Associação dos Produtores de Algas de Flecheiras e Guajirú (APAFG), pelo

cultivo da macroalga marinha vermelha Solieria filiformis.

Ao casal de amigos e companheiros de jornada Rogênio Mendes e Kueirislene

Amâncio, pela amizade, incentivo, colaboração e companheirismo.

Aos amigos e ex-professores Ana Angélica e Laécio Macêdo, pela amizade,

conselhos, dedicação, incentivos e por sempre acreditarem no meu potencial.

À minha querida mãe Antônia Irenilda, por todo amor, apoio, dedicação, cuidado

e pela compreensão nos momentos em eu precisei estar ausente.

Aos meus irmãos Ricardo Martins e Henrique Martins, pelo carinho, incentivo e

apoio.

A todos do laboratório de Carboidratos e Lectinas (CARBOLEC) com quem tive a

oportunidade de conviver e aprender: Acrísio Uchôa, Andressa Alexandre, Chistiane Coura,

Cirlânio Albuquerque, Edna Silva, Felipe Barros, Fernanda Pires, George Meredite, Géssica

Hellen, Helaynne Gomes, Ianna Wivianne, José Gerardo, Luiz Miranda, Marjory Holanda,

Neto Silva, Patrício Servente, Pedro Nonato, Pietro Danziato, Raquel, Ramon Mota, Rayena

Koana, Dantas, Renata Rivanor, Roberta Cristiane, Ticiana Abreu, Ticiana Lima, Valdécio

Silvano, Willame Alves.

À Melissa Ribeiro e Andrei dos Santos, que fizeram parte no desenvolvimento

deste trabalho, colaborando com os experimentos e como meus alunos de Iniciação Científica.

Aos Amigos Ricardo Basto, Annyta Frota e Vitória Virgínia por todas as

colaborações nos experimentos, pelos conselhos e amizade.

À Universidade Federal do Rio de Janeiro, através do Instituto de Bioquímica

Médica.

À Universidade Federal do Ceará e a todos do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a

Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), pelo

apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

pelo apoio financeiro dos projetos desenvolvidos no Laboratório de Carboidratos e Lectinas.

“Nenhuma grande descoberta foi feita jamais

sem um palpite ousado.”

(Isaac Newton)

RESUMO

Nas macroalgas marinhas vermelhas (Rhodophytas) os polissacarídeos sulfatados estão

presentes majoritariamente na forma de galactanas sulfatadas, subdividindo-se em

carragenanas e agaranas. O estudo destes polissacarídeos se justifica pelo fato de serem

descritos na literatura como possuidores de várias atividades biológicas, tais como

anticoagulante, antitrombótica, antioxidante, antiviral, antitumoral, imunomodulatória,

antinociceptiva, anti-inflamatória, pró-inflamatória, gastroprotetora, ansiolítica, dentre outras.

Entretanto, não há relatos da atividade cicatrizante de polissacarídeos sulfatados de algas

marinhas. No presente trabalho, determinou-se a caracterização estrutural de carragenanas da

alga marinha vermelha Solieria filiformis e avaliou-se a atividade cicatrizante de géis

formulados com as referidas carragenanas, em modelo de feridas induzidas em camundongos.

As carragenanas foram obtidas por extração enzimática, fracionadas por cromatografia de

troca iônica em matriz de DEAE-celulose e caracterizadas por espectroscopia de

infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e ressonância magnética nuclear (RMN),

sendo as frações (Sf I e Sf II) constituídas por um híbrido do tipo k- e ι-carragenana. Ambas

as frações híbridas apresentaram potencial não irritante dermal e atividade cicatrizante em

modelo de feridas induzidas em camundongos. No entanto, a carragenana constituída por

kappa (30%) e iota (70%), na concentração de 10 mg/mL, foi a que evidenciou um melhor

efeito no processo de cicatrização. Sugerindo assim, uma nova aplicabilidade biológica da

referida carragenana no processo de cicatrização de feridas cutâneas.

Palavras-chave: κ-carragenana. ι-carragenana. Cicatrização.

ABSTRACT

In Red seaweeds (Rhodophyta) the sulfated polysaccharides are present mostly in the form of

galactans sulfated subdividing themselves in carrageenan and agaranas. The study of these

polysaccharides is justified by the fact that they are described in the literature as having

various biological activities such as anticoagulant, antithrombotic, antioxidant, antiviral,

anti-tumor, immunomodulatory, antinociceptive, anti-inflammatory, pro-inflammatory,

gastroprotective, anxiolytic, among others. However, there are no reports of healing activity

of sulfated polysaccharides from seaweed. In this study, we determined the structural

characterization of carrageenan from red seaweed Solieria filiformis and evaluated the healing

activity gels formulated with these carrageenan in model induced in mice wounds. The

carrageenans were obtained by enzymatic extraction and fractionated by ion exchange

chromatography on DEAE-cellulose matrix and characterized by infrared Fourier transform

spectroscopy (FT-IR) and nuclear magnetic resonance (NMR), and the fractions (SF I and sf

II) composed of a hybrid of k- and ι-carrageenan type. Both hybrid fractions showed no

irritant potential dermal and healing activity model induced in mice wounds. However, the

carrageenan consisting of kappa (30 %) and iota (70 %) at the concentration of 10 mg/mL,

which was showed a better effect on healing. Thus suggesting a new biological applicability

of said carrageenan in the healing process of cutaneous wounds.

Keywords: κ-carrageenan. ι-carrageenan. Healing.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura química repetitiva de carragenanas com unidades D-alternantes ...... 18

Figura 2 – Estrutura química repetitiva de agaranas com unidades L-alternantes ............. 18

Figura 3 – Estruturas químicas de unidades diméricas de carragenanas comerciais .......... 19

Figura 4 – Alga marinha vermelha Solieria filiformis ........................................................ 29

Figura 5 – Fluxograma da extração de polissacarídeos sulfatados totais ........................... 31

Figura 6 – Camundongos tricotomizados para o teste de irritabilidade dermal ................. 35

Figura 7 – Corrida eletroforética em gel de agarose .......................................................... 39

Figura 8 – Monossacarídeos detectados ............................................................................................ 42

Figura 9 – Espectros de infravermelho dos polissacarídeos sulfatados totais de S.

filiformis ............................................................................................................................. 44

Figura 10 – Espectros de infravermelho da fração Sf I de S. filiformis .............................. 45

Figura 11 – Espectros de infravermelho da fração Sf II de S. filiformis ............................. 46

Figura 12 – Espectros unidimensionais da fração Sf I e de carragenanas comerciais......... 47

Figura 13 – Espectro bidimensional 1H/

13C – HSQC editado da fração Sf I de S.

filiformis .............................................................................................................................. 48

Figura 14 – Espectros unidimensionais da fração Sf II e de carragenanas comerciais ....... 50


13C – HSQC editado da fração Sf II de S.

filiformis. ............................................................................................................................. 51

Figura 16 – Estrutura química da carragenana presente na fração Sf II. ............................. 52

Figura 17 – Avaliação da irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf I. ....... 53

Figura 18 – Avaliação da irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf II. ...... 54

Figura 19 – Teste de irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf I ............. 55

Figura 20 – Teste de irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf II ............ 55

Figura 21 – Aspectos macroscópicos das lesões tratadas com os controles e os géis da

fração Sf I. ............................................................................................................................ 57

Figura 22 – Contração da área das lesões tratadas com os controles e os géis da fração

Sf I ....................................................................................................................................... 58

Figura 23 – Aspectos macroscópicos das lesões tratadas com os controles e os géis da

fração Sf II. .......................................................................................................................... 59

Figura 24 – Contração da área das lesões tratadas com os controles e os géis da fração

Sf II ...................................................................................................................................... 60

Figura 25 – Cicatrização das lesões tratadas com os controles e os géis da fração Sf II .... 61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Análise físico-química dos polissacarídeos sulfatados de Solieria filiformis ...... 40

Tabela 2 - Composição monossacarídica ............................................................................. 42

Tabela 3 - Absorbâncias de espectros de infravermelho de carragenanas kappa, iota e

lambda ................................................................................................................................. 43

Tabela 4 - Deslocamentos químicos de 1H e

13C da carragenana presente na fração Sf I. .. 49

Tabela 5 - Deslocamentos químicos de 1H e

13C da carragenana presente na fração Sf II. . 51

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

C Carbono

kDa Kilodaltons

RMN Ressonância magnética nuclear

IL-1

IL-6

Interleucina 1

Interleucina 6

TNF-α

FGT-β

PDGF

VEGF

FGF

EGF

TGF-β

KGF

PST

Sf I

Sf II

UFC

UFRJ

COBEA

CEUA

v

V

g

mg

μg

μL

M

mM

mL

nm

Min

Do inglês “Tumor necrosis factor alpha”

Do inglês “Tumor growth factor beta”

Do inglês “Platelet-derived growth factor”

Do inglês “Vascular endothelial growth factor”

Do inglês “Fibroblast growth factor”

Do inglês “Endothelial factor growth”

Do inglês “Transforming factor growth beta”

Do inglês “ Factor growth keratinocyte”

Polissacarídeos sulfatados totais

Fração polissacarídica sulfatada eluída com 0,5 M de NaCl

Fração polissacarídica sulfatada eluída com 0,75 M de NaCl

Universidade Federal do Ceará

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

Comissão de Ética no Uso de Animais

Volume

Volts

Grama

Miligrama

Micrograma

Microlitro

Molar

Milimolar

Mililitro

Nanômetro

Minuto

pH

EDTA

CPC

DEAE-celulose

ADM

BSA

h

HCl

NaCl

CGMS

FTIR

KBr

MHz

HSQC-ED

i.p.

Kg

cm2

mm

PE

II

PF

PN

PC

TG

ANOVA

1D

2D

Potencial hidrogeniônico

Etilenodiaminotetracético

Do inglês “Cetylpyridinium chloride”

Dietilaminoetil-celulose

Azul de 1,9-dimetilmetileno

Albumina sérica bovina

Hora

Ácido clorídrico

Cloreto de sódio

Do inglês “Gas chromatography/mass spectrometry”

Do inglês “Fourier transform infrared spectroscopy”

Brometo de potássio

Mega hertz

Do inglês “Hetronuclear Single Quantum Coherence – Editing”

Intraperitoneal

Kilograma

Centímetros quadrados

Milimetro

Presença de epitelização

Infiltrado inflamatório

Presença de fibroblastos

Presença de neovasos

Presença de colágeno

Tecido de granulação

Análise de variância

Unidimensional

Bidimensional

LISTA DE SÍMBOLOS

Α Alfa

Β Beta

Ι Iota

Κ Kappa

Λ Lambda

Μ Mu

Ν Nu

%

ºC

Porcentagem

Graus Celsius

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 14

1.1 Algas marinhas ................................................................................................... 14

1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas .................................................. 16

1.3 Características estruturais de galactanas sulfatadas ...................................... 17

1.4 Atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas ........ 20

1.4.1 Polissacarídeos sulfatados da espécie Solieria filiformis .............................. 21

1.5 Feridas cutâneas ................................................................................................. 21

1.6 Fisiologia da cicatrização ................................................................................... 22

1.6.1 Fase de hemostasia ......................................................................................... 23

1.6.2 Fase inflamatória .......................................................................................... 24

1.6.3 Fase de proliferação ....................................................................................... 24

1.6.4 Fase de remodelamento tecidual .................................................................... 25

1.7 Polissacarídeos utilizados na cicatrização de feridas cutâneas ....................... 26

2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 28

2.1 Geral ..................................................................................................................... 28

2.2 Específicos ............................................................................................................ 28

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 29

3.1 Materiais .............................................................................................................. 29

3.1.1 Coleta e identificação da alga marinha ......................................................... 29

3.1.2 Animais ........................................................................................................... 30

3.2 Métodos ................................................................................................................ 30

3.2.1 Extração de polissacarídeos sulfatados totais (PST) ..................................... 30

3.2.2 Fracionamento dos PST por cromatografia de troca iônica ........................ 32

3.2.3 Eletroforese em gel de agarose....................................................................... 32

3.2.4 Caracterização físico-química e estrutural .................................................... 32

3.2.4.1 Quantificação de carboidratos totais .............................................................. 32

3.2.4.2 Quantificação de contaminantes proteicos ..................................................... 33

3.2.4.3 Quantificação de sulfato livre ......................................................................... 33

3.2.4.4 Composição monossacarídica ......................................................................... 33

3.2.4.5 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ....... 33

3.2.4.6 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) ............................ 34

3.2.5 Formulação dos géis ....................................................................................... 34

3.2.6 Teste de irritabilidade dermal ......................................................................... 34

3.2.6.1 Parâmetros macroscópicos ............................................................................. 35

3.2.7 Avaliação da atividade cicatrizante ................................................................ 35

3.2.7.1 Avaliação e medida da área das lesões ........................................................... 36

3.2.8 Análises estatísticas ........................................................................................ 37

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................... 38

4.1 Rendimento dos polissacarídeos sulfatados totais (PST) ................................. 38

4.2 Rendimento do fracionamento dos PST ............................................................ 38

4.3 Perfil eletroforético em gel de agarose ............................................................... 39

4.4 Caracterização físico-química ............................................................................ 40

4.5 Caracterização estrutural ................................................................................... 41

4.5.1 Composição monossacarídica ........................................................................ 41

4.5.2 Espectros de FTIR .......................................................................................... 42

4.5.3 Espectros de ressonância magnética nuclear ................................................ 47

4.6 Avaliação da irritabilidade dermal das frações polissacarídicas sulfatadas .. 52

4.7 Atividade cicatrizante das frações polissacarídicas sulfatadas ....................... 56

5 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 62

REFERÊNCIAS .................................................................................................. 63

ANEXO - Certificado de aprovação pela Comissão de Ética no Uso de

Animais ....................................................................................................................... 75

14

1 INTRODUÇÃO

1.1 Algas marinhas

As algas constituem-se em uma grande diversidade de organismos que, na sua

maioria, estão apenas remotamente relacionados uns aos outros. Além disso, sendo produtores

primários as algas apresentam funções biológicas e ecológicas semelhantes as plantas, apesar

de não compartilharem uma história evolutiva comum e sua bioquímica diferir

significativamente. A grande variedade de algas pode ser explicada com base em relações

taxonômicas ou filogenéticos, estágio de vida, reprodução, desenvolvimento, estrutura

morfológica e celular, composição química e habitats ocupados por diferentes grupos

(STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011).

Abrangendo um grupo heterogêneo de organismos fotossintetizantes, as algas

atuam como produtoras da maior parte do oxigênio da Terra e necessárias para o metabolismo

dos organismos consumidores (KILINÇ et al., 2013). A matéria orgânica é sintetizada a partir

do consumo de dióxido de carbono, água, captação de energia solar e absorção de nutrientes

presentes na água, desse modo, esse processo é fundamental para a sustentação de todas as

formas de vida e para a estruturação de muitos sistemas aquáticos (TEIXEIRA, 2002). As

algas marinhas representam a base da cadeia alimentar nos oceanos. Sua distribuição depende

da temperatura, disponibilidade de luz solar, correntes oceânicas, salinidade da água e das

condições físicas e químicas do ambiente (EL GAMAL, 2010).

Predominantemente aquáticas, as algas podem ser encontradas nos oceanos, águas

estuarinas, dulcícolas e em superfícies úmidas. Em regiões tropicais, esses organismos

ocorrem com grande variedade de espécies, diferente dos encontrados em zonas temperadas,

que apresentam maior biomassa disponível (TEIXEIRA, 2002). As algas variam bastante em

tamanho, podendo apresentar de 3-10 µm como as algas unicelulares (microalgas) ou mais de

70 m de comprimento como as gigantes kelps (macroalgas), apresentando variação

morfológica extremamente diversa (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). Entre os organismos

marinhos, as macroalgas se destacam como fonte de compostos biomédicos (MANILAL et

al., 2010).

As algas estão incluídas no Reino Protista, pois se diferenciam dos vegetais

superiores (Reino Plantae) por serem desprovidas de raízes, caule, folhas e frutos, quando

comparadas a outros grupos de plantas, principalmente as vasculares (RAVEN; EVERT;

EICHHORN, 2014). A classificação das algas está em constante evolução à medida que mais

15

evidências genéticas e de ultraestruturas são descobertas. Do ponto de vista botânico, as

macroalgas são classificadas de acordo com a organização celular, filogenia molecular, ciclo

reprodutivo, polissacarídeos de reserva e quantidade de pigmentos em: Chlorophyta (algas

verdes), devido à predominância das clorofilas “a” e “b”; Phaeophyta (algas pardas) pela

presença majoritária dos pigmentos xantofila e fucoxantina; Rhodophyta (algas vermelhas)

pela presença predominante dos pigmentos ficoeritrina e ficocianina (BARSANTI;

GUALTIERI, 2006; GUPTA; ABU-GHANNAM, 2011).

As algas vermelhas apresentam grande variedade, sendo encontradas desde

regiões tropicais até ambientes frios. Existe cerca de 6000 espécies de algas vermelhas, a

maioria de habitat marinho e cerca de 100 espécies de ambiente de água doce. Possuem

coloração avermelhada devido à presença majoritária do pigmento ficoeritrina, e em menor

quantidade dos pigmentos ficocianina e aloficocianina. Apresentam o “amido das florídeas”

como principal polissacarídeo de reserva. São predominantemente dotadas de estrutura

multicelular, filamentosa ou pseudoparenquimatosa, com ou sem ramos, podendo ser

encontradas na forma cilíndrica ou foliácea (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2007).

As algas utilizam diversas estratégias reprodutivas e de síntese de inúmeras

classes de compostos bioativos, os quais estão normalmente envolvidos nos processos

metabólicos (primário e secundário), responsáveis pelas mais diversas funções biológicas

comuns a todos os seres vivos ou particulares de grupos taxonômicos específicos. A

investigação de muitos de seus metabólitos (polissacarídeos, lipídios, alcalóides, terpenóides,

entre outros.) tem despertado o interesse de diversos grupos de pesquisa no Brasil e exterior

(TEIXEIRA, 2002).

Em muitos países, as algas são amplamente utilizadas na medicina popular devido

a seus efeitos benéficos à saúde, e na indústria alimentícia, por apresentarem altas

concentrações de polissacarídeos, fibras, minerais, ácidos graxos poli-insaturados, vitaminas,

antioxidantes e baixo teor de lipídeos, que tornam as algas uma fonte de alimento saudável

(HOLDT; KRAAN, 2011; VO; KIM, 2013).

Além da utilização para fins alimentares, as algas ainda produzem inúmeros

compostos químicos que têm revelado importantes resultados nas mais variadas aplicações

biológicas e industriais (CRAIGIE, 2011; AHMED et al., 2014; MARTINS et al., 2014). E

metabólitos com potencial econômico, inclusive farmacológico, como proteínas (lectinas),

aminoácidos, compostos halogenados e principalmente polissacarídeos sulfatados, que fazem

destes organismos foco das mais diversas pesquisas biomédicas (O’SULLIVAN et al., 2010;

MAYER et al., 2013).

16

1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas

Polissacarídeos sulfatados são descritos como uma classe de macromoléculas

bioativas, polianiônicas complexas e heterogêneas formadas por unidades repetitivas de um

único tipo de monossacarídeo ou de diferentes tipos, e carregadas negativamente, devido

principalmente à substituição de alguns dos grupos hidroxila dos resíduos de carboidrato por

grupamentos sulfato (PÉREZ-RECALDE et al., 2014).

Estes polissacarídeos são encontrados em gramíneas marinhas (AQUINO et. al.,

2005), em animais mamíferos e invertebrados (MOURÃO, 2007), fungos (CARDOZO et al.,

2011), plantas (DANTAS-SANTOS et al., 2012) e em altas concentrações nas algas marinhas,

com estruturas químicas que variam de acordo com a espécie (COSTA et al., 2010;

RODRIGUES et al., 2009;), compondo a matriz extracelular e atuando como mecanismo de

defesa (ANDRADE et al., 2010). Além de proteger contra desidratação durante a maré baixa,

o que justificaria o maior teor de polissacarídeos sulfatados nas algas no nível entre marés

(DANTAS-SANTOS et al., 2012; MICHELOTTI; IODICE, 2010).

Nas macroalgas marinhas os polissacarídeos sulfatados estão presentes

majoritariamente na forma de arabino-galactanas, ramnanas ou ulvanas, nas Chlorophytas

(PERCIVAL; McDOWELL, 1967), em fucanas sulfatadas, nas Phaeophytas (BERTEAU;

MULLOY, 2003), e galactanas sulfatadas, subdividindo-se em carragenanas e agaranas, nas

Rhodophytas (PAINTER, 1983). Além de carragenanas e agaranas as algas vermelhas

sintetizam outros polissacarídeos sulfatados contendo diversas substituições envolvendo

grupos sulfatos, metoxilas e ácido pirúvico (JIAO et al., 2011).

As carragenanas possuem propriedades estabilizantes, espessante e gelificante,

além de características como biodegradabilidade, biocompatibilidade, resistência mecânica de

seus géis e elevada capacidade de retenção de água (PRAJAPATI et al., 2014). Devido a essas

propriedades as carragenanas são amplamente utilizadas na indústria alimentícia. Sendo ainda

empregadas na fabricação de cosméticos e como excipientes de medicamentos pela indústria

farmacêutica devido a suas excelentes compatibilidade e viscoelasticidade (CAMPO et al.,

2009).

Atualmente, a carragenana é usada principalmente como matriz de polímero na

forma de comprimidos de liberação prolongada por via oral, como um auxiliar de extrusão

para a produção de pellets e como um carreador/estabilizador em sistemas de micro e

nanopartículas (LI et al., 2014). Em ensaios laboratoriais a carragenana é utilizada para

induzir inflamação em testes de agentes anti-inflamatórios. O modelo de edema em pata de

17

rato induzido por carragenana é o mais adotado para determinar a atividade anti-inflamatória,

com a vantagem de produzir resposta em doses abaixo do nível tóxico (PRAJAPATI et al.,

2014).

Agaranas possuem a capacidade de formar gel em pequenas concentrações de

água, sendo assim conhecido genericamente como ficocolóide (ARMISEN, 1995). Na

indústria alimentícia as agaranas são amplamente utilizadas na produção de gelatinas, queijos,

enlatados e doces. Na fabricação de laxantes, agentes emulsificantes e estabilizantes de

medicamentos pela indústria farmacêutica (RINAUDO, 2008).

1.3 Características estruturais de galactanas sulfatadas

Galactanas sulfatadas são constituídas por uma cadeia linear formada por

unidades dissacarídicas repetitivas de β-D-galactose ligadas através do C-1 e C-3 e α-

galactose através do C-1 e C-4, sendo as unidades de α-galactose também encontradas na

forma 3,6-anidrogalactose (POMIN; MOURÃO, 2008).

Apesar de possuírem uma estrutura básica repetitiva, as galactanas sulfatadas de

diferentes espécies de algas apresentam ampla variedade estrutural, uma vez que podem

apresentar diferentes tipos de substituintes em sua cadeia principal (ERREA;

MATULEWICZ, 2003), como a presença dos grupos éter metílico no C-6 ou sulfato nos C-2,

C-4 ou C-6, na unidade A, e no C-2, C-3 ou C-4 na unidade B (PAINTER, 1983).

As galactanas sulfatadas comumente apresentam altas massas moleculares

(≥ 100 kDa) e densidade de carga altamente eletronegativa devido à presença de grupos éster

sulfato. Suas interações intermoleculares com proteínas específicas, suscitando suas

atividades biológicas, têm sido consideradas estéreo-específicas e não uma mera consequência

de interações de cargas (POMIN, 2010). A caracterização da estrutura química dos

polissacarídeos sulfatados de algas marinhas é imprescindível para relacionar detalhes

estruturais com propriedades físico-químicas e suas diferentes atividades biológicas (USOV;

BILAN, 2009).

A determinação estrutural de novas moléculas a partir de fontes naturais tem

proporcionado o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e a compreensão da ação

destes compostos em determinadas doenças. O surgimento de técnicas espectroscópicas

modernas revolucionou o processo de determinação estrutural (SUYAMA et al., 2011).

A ressonância magnética nuclear (RMN) é considerada na atualidade a técnica

mais avançada e rica em informações para caracterizar a estrutura de biomoléculas. A

18

qualidade das informações obtidas por meio da espectroscopia de RMN não é superada por

nenhuma técnica analítica. Diversos métodos experimentais estão disponíveis para RMN

bimolecular, compreendendo experimentos unidimensionais ou multidimensionais, tais como

homo e heteronucleares. O número e as combinações de sequências de pulso, transferência de

magnetização através de diferentes isótopos (geralmente 1H,

13C e

15N), geram várias

permutações que contribuem para solucionar questionamentos estruturais (POMIN, 2014a).

As carragenanas e agaranas são galactanas sulfatadas que diferem na configuração

enantiomérica da α-galactose, sendo atribuída à série D para as carragenanas (Figura 1), e L

para agaranas (Figura 2). Estudos estruturais mais avançados revelaram um terceiro grupo de

galactanas, o hibrido D/L, onde as unidades de α-galactose apresentam configuração D ou L na

mesma molécula (ESTEVEZ; CIANCIA; CEREZO, 2004).

O

OO

O

OR

HO

OH

CH2OR R'OH2C

HO

n

Fonte: Elaborada pelo autor. Grupos substituintes: R = H ou CH3; R’ = H ou SO-

3.

Figura 1 - Estrutura química repetitiva de carragenanas com unidades D-alternantes.

Fonte: Elaborada pelo autor. Grupo substituinte: R = H ou SO-

3.

Figura 2 - Estrutura química repetitiva de agaranas com unidades L-alternantes.

CH2OR

RO

OR HO OR

n

O

OO

O O

CH2OR

19

A classificação das carragenanas é realizada de acordo com o número e posição

dos grupos sulfato na unidade α-D-galactose, e a presença de 3-6-anidrogalactose no resíduo

de galactose 4-O-ligado (unidade B). Deste modo, são geralmente classificadas com base em

suas características estruturais (VAN DE VELDE et al., 2002). A classificação das agaranas

não é tão específicas quanto à das carragenanas (STORTZ; CEREZO, 2000).

Tem sido descrita na literatura a ocorrência de 15 diferentes estruturas de

carragenanas (JIAO et al., 2011). Dentre estas, destacam-se comercialmente seis formas

básicas: Iota ()-, Kappa ()-, Lambda ()- Mu (µ)-, Nu (v)- e Theta (ɵ)-carragenanas, como

demonstradas na Figura 3, todas contendo cerca de 22-38% de grupos sulfatos (CAMPO et

al., 2009).

Fonte: Adaptado de Campo et al., 2009.

- OH

enzima

O

OH

O

OH

O

O

O

OH

O

-O3SOO

OOH

O

OH

O

OSO-3

HOOH

-O3SO

O

OOH

O

OH

O

HO

OSO-3

-O3SO

-O3SO

O

OH

OO

OH

O

O-O3SO

OSO-3

- OH

enzima

OH

O

O

OH

O

O

HO

OSO-3

-O3SO

-O3SO

OH

O

OSO-3

OO

OH

O

O

OSO-3

- OH

enzima

μ-carragenana κ-carragenana

ν-carragenana ι-carragenana

λ-carragenana θ-carragenana

Figura 3 – Estruturas químicas de unidades diméricas de carragenanas comerciais.

20

As agaranas são estruturalmente semelhantes às carragenanas, sendo constituídas

por unidades de β-D-galactose (unidade A) e α-L-galactopiranose (unidade B), diferindo,

portanto, das carragenanas pela forma estereoquímica L na unidade B. Assim como nas

carragenanas, essa unidade pode estar na forma de seu derivado 3,6-anidrogalactose

(FERREIRA, 2011).

1.4 Atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas

Algas marinhas são importantes fontes de compostos bioativos estruturalmente

diversos, os quais apresentam diversas atividades biológicas. (WIJESEKARA; YOON; KIM,

2011). Dentre estes compostos que tem despertado interesse biomédico e biotecnológico,

destacam-se as lectinas e os polissacarídeos sulfatados.

Por apresentarem grande variedade de estruturas, os polissacarídeos obtidos de

organismos marinhos são considerados uma importante fonte natural de compostos para a

prospecção de novos fármacos (SENNI et al., 2011). As aplicações dos polissacarídeos

sulfatados de algas marinhas como agentes terapêuticos têm sido pesquisado intensamente no

campo acadêmico e científico (NA et al., 2010).

Estudos demonstraram que as propriedades biológicas dos polisscarídeos

sulfatados dependem do padrão de sulfato, densidade de cargas, estrutura química,

conformação de cadeia e peso molecular (ZHANG et al., 2008), além de apresentarem

toxicidade relativamente baixa (TALARICO et al., 2005) e risco mínimo de contaminação por

partículas virais (LEITE et al., 1998).

O estudo destes polissacarídeos se justifica pelo fato de serem descritos na

literatura como possuidores de várias atividades biológicas, tais como anticoagulante,

antitrombótica (POMIN, 2014b; QUEIROZ et al., 2014), antioxidante e gastroprotetora

(SOUSA et al., 2016), antiviral (MENDES, 2014; VANDERLEI et al., 2016), antiadesiva

(ROCHA et al., 2001), antitumoral e imunomodulatória (FEDOROV et al., 2013),

antinociceptiva (CARNEIRO et al., 2014; QUINDERÉ et al., 2013, RIBEIRO et al., 2014),

anti-inflamatória (ARAÚJO et al., 2016; COURA et al., 2015), pró-inflamatória (SILVA et al.,

2010; BANDYOPADHYAY et al., 2011), ansiolítica (MONTEIRO et al., 2016).

21

1.4.1 Polissacarídeos sulfatados da espécie Solieria filiformis

Estudos relataram algumas atividades biológicas de frações polissacarídicas

sulfatadas da alga marinha vermelha Solieria filiformis. Rodrigues et al. (2010) reportaram

que suas frações são capazes de alterar a coagulação sanguínea, porém com atividade

anticoagulante in vitro inferior à da heparina. Adicionalmente, Assreuy et al. (2010)

mostraram que uma fração polissacarídica sulfatada de S. filiformis apresentou efeito

edematogênico e relaxante no endotélio vascular in vitro.

Araújo et al. (2011) estudaram os efeitos de uma fração polissacarídica sulfatada

da alga marinha vermelha S. filiformis utilizando modelos clássicos de nocicepcão e

inflamação aguda. A pesquisa demonstrou que o composto foi eficaz como agente analgésico

via mecanismo de ação periférica. Sua atividade edematogênica in vivo sugeriu o

envolvimento de prostaglandinas, óxido nítrico e citocinas primárias (IL-1 e TNF-α), além de

não apresentar sinais visíveis de toxicidade in vivo. Recentemente, Sousa et al. (2016),

demonstraram que uma fração polissacarídica de S. filiformis possui atividade antioxidante e

gastroprotetora em lesões induzidas por etanol. Porém, não há na literatura relatos de estudos

com frações polissacarídicas sulfatadas de S. filiformis em modelos de cicatrização ou

irritabilidade dermal.

1.5 Feridas cutâneas

As feridas ou lesões cutâneas surgem quando ocorre a ruptura do tecido cutâneo-

mucoso, alterando sua estrutura anatômica e/ou fisiológica. Pode ser ocasionada por

exposição a traumas de origem química, mecânica, física ou microbiológica (LEITE, 2014;

LIMA, 2010). São classificadas de acordo com a sua etiologia em: agudas e crônicas, em

relação à intensidade podem ser: superficiais ou profundas (CHAYAMITI et al., 2011).

Feridas agudas ocorrem em decorrência de queimaduras, lesões traumáticas,

abrasões ou procedimentos cirúrgicos, em que a cicatrização completa ocorre em tempo

adequado (BOATENG et al., 2008; LI; CHEN; KIRSNER, 2007). No entanto, as feridas

crônicas apresentam atraso no reparo do tecido lesionado, que não cicatriza mesmo depois de

decorridas 12 semanas da lesão. Esse atraso é causado por uma falha nos estágios iniciais da

cicatrização ou devido às etapas do processo de cicatrização não estarem ocorrendo de modo

ordenado, prolongando o tempo de inflamação e provocando a incapacidade cicatricial

(MENKE et al., 2008; YOUNG; MCNAUGHT, 2011).

22

As úlceras de pernas (diabéticas, isquêmicas e venosas) e úlceras de pressão, são

os tipos de feridas com maior dificuldade de cicatrização. Esse tipo de lesão afeta

principalmente as pessoas idosas, e à medida que as úlceras cronificam, os pacientes tendem a

sofrer com reincidência destas, que podem até mesmo causar a morte dos pacientes (JAUL,

2004).

O retardo da cicatrização de feridas é um dos principais problemas terapêuticos e

econômicos da medicina. Diversos recursos são disponibilizados para auxiliar no processo de

cicatrização e na aplicação de curativos e técnicas para o tratamento de feridas

(MANDELBAUM; DI SANTIS, 2003). Apesar desta grande disponibilidade de recursos,

novos métodos que sejam mais eficazes no reparo de feridas têm sido buscados. Os métodos

estudados atualmente incluem tanto o uso de terapias alopáticas quanto de terapias

complementares, sendo parte destas a utilização de bioprodutos que há séculos são aplicadas

empiricamente, mas que atualmente vem recebendo maior atenção em estudos científicos

(SCHREML et al., 2010).

1.6 Fisiologia da cicatrização

A cicatrização de feridas é um processo sistêmico e dinâmico que está diretamente

relacionado a diversos tipos celulares, fatores de crescimento, citocinas e componentes da

matriz extracelular (colágeno, elastina e fibras reticulares), que são ativados imediatamente

após a injúria com a finalidade de regenerar o tecido lesionado, quer a lesão tenha sido

traumática ou necrótica. A reconstituição do tecido pode ser desenvolvida pelo mecanismo de

reparação ou regeneração, sendo o primeiro responsável pela formação de uma cicatriz

(PANOBIANCO et al., 2012; REINKE; SORG, 2012; YOUNG; MCNAUGHT, 2011).

Após a lesão, uma série de eventos bioquímicos se estabelece para reparar a ferida

(PAGANELA et al., 2009) e promover a cicatrização. Os eventos que desencadeiam a

cicatrização são guiados por mediadores bioquímicos, descritos em diferentes fases, que estão

relacionados aos principais episódios observados na cicatrização (LIMA et al., 2012).

Os eventos biológicos que caracterizam o reparo tecidual devem ocorrer com

intensidade adequada, em sequencia correta e duração controlada. No entanto, vários fatores

podem influenciar negativamente na cicatrização, como, infecção bacteriana que prolonga a fase

inflamatória, devido ao aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (GUO; DIPIETRO,

2010) e deficiência de nutrientes, visto que os processos bioquímicos requerem nutrientes para

23

proliferação e diferenciação celular, síntese de fatores de crescimento e citocinas (BROWN;

PHILLIPS, 2010).

A reconstituição tecidual ocorre em quatro fases distintas, sucessivas e precisamente

programadas, ainda que não aconteçam em um período de tempo preciso: hemostasia, inflamação,

proliferação celular e remodelação tecidual (MAHDAVIAN et al., 2011).

1.6.1 Fase de hemostasia

Esta fase é iniciada logo após a injúria tecidual e persiste por até 6 horas,

procedida pela inflamação (NAWAZ; BENTLEY, 2010). Imediatamente após a lesão, ocorre

a vasoconstrição, primeira resposta dos vasos sanguíneos à injúria, que é mediada pela

norepinefrina, secretada pelos vasos sanguíneos rompidos, e pela serotonina, secretada pelas

plaquetas e mastócitos, impedindo, deste modo, a hemorragia e consequentemente o

extravasamento de fluidos e proteínas. As plaquetas entram em contato e se aderem às fibras

de colágeno expostas no local da lesão (STRECKER-MCGRAW; JONES; BAER, 2007).

O endotélio lesionado expõe fibras de colágeno, onde as plaquetas irão se agregar

liberando o conteúdo de seus grânulos que ativam as cascatas intrínseca e extrínseca da

coagulação (GANTWERKER; HOM, 2012). Com a cascata de coagulação ativada, a

protrombina é convertida em trombina, resultando na quebra de fibrinogênio em fibrina e na

formação de um tampão rico em fibrina sobre o local da lesão (YOUNG; MCNAUGHT,

2011).

O tampão formado funciona como uma barreira protetora temporária, prevenindo

a entrada de microrganismos, a perda de eletrólitos e fluidos, além de fornecer resistência

limitada à ferida e formar uma matriz provisória para que as células inflamatórias alcancem o

local da lesão (MENDONÇA; COUTINHO-NETO, 2009; THEORET, 2004).

A matriz provisória é composta por proteínas biologicamente ativas, tais como:

trombina, fator de crescimento tumoral (TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas

(PDGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) que promovem a quimiotaxia de

neutrófilos, monócitos e ativação de macrófagos, (KONDO; ISHIDA, 2010; MARDAVIAN

et al., 2011). Com a evolução da cicatrização, a matriz provisória é gradualmente substituída

por um tecido de granulação rico em fibronectina que fornece um leito vascularizado para a

deposição de colágeno (MIDWOOD, et al., 2004).

24

1.6.2 Fase inflamatória

A inflamação que ocorre durante a cicatrização é caracterizada pela resposta

vascular e celular, sendo a primeira representada pela vasodilatação local, com

extravasamento de fluidos para o espaço extravascular e consequentemente formação de

edema, além do aumento no fluxo sanguíneo, responsável pela hiperemia (MACHADO,

2011).

No início da inflamação os neutrófilos migram para o local da lesão, atraídos por

fatores quimiotáticos liberados pelas plaquetas (PDGF), por células do sistema imunológico e

pela ativação do sistema complemento. A atividade fagocitária dos neutrófilos garante

proteção à ferida contra infecções por meio da eliminação de bactérias e restos celulares

(MIDWOOD et al., 2004; GANTWERKER; HOM, 2012). Além da ação fagocitária, os

neutrófilos possuem ação pró-inflamatória por meio da liberação de citocinas que ativam

fibroblastos e queratinócitos. Decorridas 48 horas, os monócitos chegam ao local da lesão, são

ativados e se diferenciam em macrófagos, finalizando a fase inflamatória (SZPADERSKA;

DIPIETRO, 2005; MARTIN, 2005).

Os macrófagos promovem a transição da fase de inflamação para a proliferação,

atuando de modo similar aos neutrófilos, realizam a digestão de microrganismos, remoção de

neutrófilos mortos e restos celulares, degradação do tampão de fibrina e liberação de óxido

nítrico (GUTWEIN et al., 2012). Além de promoverem a liberação de citocinas pró-

inflamatórias e fatores de crescimento: interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), fator de

crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento endotelial (EGF), (TGF-β) e (PDGF)

(KONDO; ISHIDA, 2010). Estes fatores de crescimento estimulam a formação do tecido de

granulação e, podem influenciar as fases tardias da cicatrização, como: neovascularização,

granulação e reepitelização. Adicionalmente, estes fatores promovem também a quimiotaxia

de neutrófilos e monócitos na fase inicial da inflamação e impulsionam a proliferação de

fibroblastos na fase proliferativa (LI; CHEN; KIRSNER, 2007; SANTOS, 2000).

1.6.3 Fase de proliferação

Nesta fase ocorre a formação do tecido de granulação com proliferação endotelial

e de fibroblastos. Estes últimos são direcionados por estímulos químicos para o leito da ferida,

produzindo matriz extracelular e angiogênese. Os fibroblastos surgem 48 horas após o trauma

e, são as principais células envolvidas no processo de cicatrização. Estes eventos são

25

necessários para promover a reepitelização e a proliferação vascular (DESMOULIÈRE et al.,

2005). Durante a reepitelização, o exsudato presente na camada mais externa da ferida fornece

umidade necessária para a produção de fatores essenciais para o reparo, além de proteger a

ferida de desidratação infecção (GANTWERKER; HOM, 2012).

O tecido de granulação se forma no espaço da ferida a partir do quarto dias após o

trauma, onde os capilares se difundem no novo estroma adotando um aspecto granular. Os

macrófagos permanecem no local da lesão após a inflamação e contribuem para a liberação de

fatores de crescimento necessários para estimular a fibroplasia e angiogênese (KONDO;

ISHIDA, 2010).

A função dos fibroblastos é produzir glicosaminoglicanos, proteoglicanos e

colágeno, que são os principais componentes do tecido de granulação. Os fibroblastos são

fontes únicas de colágeno e fibronectina, proteínas constituintes do tecido conectivo da

derme. A síntese de colágeno é imprescindível para a cicatrização cutânea (YOUNG;

MCNAUGHT, 2011). O colágeno garante força e integridade ao tecido, e quando depositado

de forma insuficiente, a cicatriz se torna frágil e a ferida pode ressurgir (CORSETTI et al.,

2010).

Durante a cicatrização, os fibroblastos que migram para o local do trauma iniciam

a proliferação celular e se diferenciam em miofibroblastos, fundamentais ao processo de

contração da ferida por segunda intenção (GUTWEIN et al., 2012). Os fibroblastos liberam

ainda o fator de crescimento de queratinócitos (KGF) que contribuem para a reepitelização e

remodelamento tecidual (TSIROGIANNE; MOUTSOPOULOS; MOUTSOPOULOS, 2006).

A angiogênese, processo de formação de novos vasos sanguíneos, fornece

nutrientes e oxigênio para o tecido de granulação. Em resposta a hipóxia, fatores de

crescimento são liberados para reconstituir os vasos lesionados e estimular a produção de

novos (YOUNG; MCNAUGHT, 2011; GANTWERKER; HOM, 2012).

1.6.4 Fase de remodelamento tecidual

A maturação ou remodelação tecidual é a última fase da cicatrização, sendo

responsável pela formação de um tecido cicatricial maduro. Nesta fase, além da deposição,

agrupamento e remodelamento do colágeno, ocorre a regressão endotelial. A resposta

inflamatória que ocorre logo após o trauma, é capaz de estimular a reparação tecidual por

meses, até mesmo quando a presença das células inflamatórias no tecido cicatricial é reduzida

(WILGUS, 2008).

26

No tecido regenerado, as fibras de colágeno sintetizadas são menores, pouco

organizadas e extremamente frágeis, conferindo ao novo tecido uma espessura fina, pálida e

de fácil rompimento (DIEGELMANN; EVANS, 2004). O colágeno do tipo III, depositado

aleatoriamente no tecido de granulação, é substituído gradualmente pelo tipo I, uma forma

mais resistente, até alcançar a proporção da pele normal de 4:1 organizando o novo tecido e

aumentando sua resistência (NAWAZ; BENTLEY, 2010; GUTWEIN et al., 2012).

O tecido reparado apresenta uma redução no seu volume de forma gradativa, de

acordo com a maturação da estrutura formada, apresentando uma coloração inicial

avermelhada, consequência da inflamação local, evoluindo para uma cor rosa pálida eu

corresponde ao término do processo de cicatrização (BLANCK, 2008).

Para que o reparo de uma lesão ocorra de forma apropriada, deve envolver uma

rápida hemostasia, inflamação adequada, proliferação, diferenciação e migração de células,

angiogênese, reepitelização e remodelamento tecidual. No entanto, prolongamentos e

interrupções nos eventos fundamentais de cada fase podem provocar atrasos ou resultar em

feridas crônicas que não cicatrizam (GUO; DIPIETRO, 2010).

1.7 Polissacarídeos utilizados na cicatrização de feridas cutâneas

Diversos artigos já foram publicados relatando a utilização de bioprodutos para

promover as várias fases da cicatrização (MURTI et al, 2012.; OLIVEIRA et al., 2013). Por

serem biomoléculas os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas tem sido uma alternativa

para investigação de potenciais ferramentas auxiliares na cicatrização de ferida. Diante do

exposto, foi reconhecido que não só pode ser atribuído aos polissacarídeos características

necessárias de um curativo, mas também, como participantes ativos no processo de

cicatrização de feridas. Com base na necessidade de se obter formulações mais eficientes e

nas propriedades apresentadas pelas moléculas oriundas de algas marinhas, acredita-se que

estas possam ser eficazes no processo de cicatrização.

A aplicação de compostos isolados de diversas classes de algas tem visado obter

importantes novos agentes, citando-se, como exemplo, os polissacarídeos sulfatados (PS)

(CARDOZO et al., 2007). Na maioria da sinalização celular, da adesão célula-célula ou

interações parasito-hospedeiro são devido às interações entre os carboidratos a partir do

sistema extracelular e receptores da superfície das respectivas celulas. Receptores celulares

são, em muitos casos, por si só altamente glicosilados com polímeros na superfície da sua

membrana, formando o glicocálice da célula. A interação positiva carboidrato-carboidrato ou

27

carboidrato-proteína levará posteriormente a uma transdução de sinal para dentro da célula,

iniciando vários efeitos fisiológicos. Estes polissacarídeos já são descritos na literatura por

apresentarem diversas atividades biológicas, como a anti-inflamatória e por serem substâncias

não tóxicas (ANANTHI, et al., 2010).

Diallo et al. (2001), estudaram os polissacarídeos extraídos das raízes de Entada

africana Guill e observaram que estes interferiam com o sistema do complemento em testes

realizados in vitro, podendo ser parcialmente responsáveis pela cicatrização de feridas, efeito

este observado quando os curandeiros em Mali aplicavam unguentos com preparações

extraídas das raízes de E. africana em diferentes tipos de feridas.

O polissacarídeo de Angelica sinensis apresentou efeito cicatrizante em úlceras

gástricas experimentais em ratos Sprague-Dawley, além de mostrar efeito estimulante in vitro

da proliferação de células epiteliais gástricas (YE, et al., 2003). Foi relatado também que o

polissacarídeo da planta Anacardium occidentale L. favoreceu a resolução do período

inflamatório da cicatrização, onde os resultados demonstraram que os animais apresentaram

sinais flogísticos menos intensos e o aumento da presença do tecido de granulação

fibrovascular e fibras colágenas nas feridas (SCHIRATO et al., 2006). No entanto, a literatura

não faz referência a produtos cicatrizantes obtidos a partir de algas marinhas.

28

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Isolar carragenanas da alga marinha vermelha Solieria filiformis, caracterizar a

estrutura química e avaliar a atividade cicatrizante em modelo de feridas induzidas em

camundongos.

2.2 Específicos

• Extrair e fracionar por cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose, as

carragenanas da alga marinha vermelha S. filiformis;

• Determinar a estrutura química das carragenanas através das técnicas de

Espectroscopia de Infravermelho e RMN uni e bidimensional;

• Formular géis com as carragenanas, utilizando como veículo o carbopol 940;

• Analisar a irritabilidade dermal dos géis em camundongos;

• Avaliar a atividade cicatrizante dos géis em modelos de feridas induzidas por

trauma mecânico em camundongos.

29

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Coleta e identificação da alga marinha

A alga marinha vermelha Solieria filiformis (Kützing) P. W. Gabrielson foi

coletada no período de agosto de 2014 a agosto de 2015, durante a maré baixa (-0,2 a 0,3 m),

no cultivo localizado na praia de Flecheiras município de Trairí-CE. Após a coleta as algas

foram transportadas em sacos plásticos ao Laboratório de Carboidratos e Lectinas (Carbolec)

do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará –

UFC, Campus do Pici. No laboratório as algas foram lavadas com água corrente e destilada

para a remoção de areia, epífitas e/ou organismos incrustantes. Em seguida foram secas em

temperatura ambiente (25 ºC), maceradas com nitrogênio (N2) líquido e armazenadas para uso

posterior. A espécie S. filiformis (Figura 4) foi identificada e uma exsicata foi depositada no

Herbário Prisco Bezerra (EAC) da Universidade Federal do Ceará (UFC), sob o número

35682.

Figura 4 - Alga marinha vermelha Solieria filiformis.

Filo: Rhodophyta

Subfilo: Eurhodophytina

Classe: Floridophyceae

Subclasse: Rhodymeniophycidae

Ordem: Gigartinales

Família: Solieriaceae

Gênero: Solieria

Epíteto específico: filiformis

Espécie: Solieria filiformis (Kützing)

P. W. Gabrielson 1985

A B

(A) Fonte: Holanda, 2007. Aspecto macroscópico da alga marinha vermelha Solieria filiformis.

(B) Fonte: Algaebase, 2016. Classificação taxonômica.

30

3.1.2 Animais

Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) machos da linhagem

Swiss, (30 ± 35 g), provenientes do Biotério Central da UFC Campus do Pici, e mantidos em

gaiolas em ambiente controlado (período de 12 h claro/escuro), temperatura (23 ± 2 ºC), com

livre acesso à ração e água no biotério do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular

da UFC. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento e o número de animais

utilizados. Os ensaios foram realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos nos

Princípios Éticos da Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA), analisados e aprovados pela Comissão de Ética no Uso de

Animais da UFC (CEUA-UFC nº 74/2015), em anexo.

3.2 Métodos

3.2.1 Extração de polissacarídeos sulfatados totais (PST)

A extração dos PST foi realizada conforme metodologia descrita por Farias et. al.,

(2000), com modificações. A alga (5 g) desidratada em temperatura ambiente (25 ºC) e

macerada em nitrogênio líquido foi hidratada em 233 mL de tampão acetato de sódio 100 mM

(pH 5,0) contendo EDTA 5 mM e cisteína 5 mM, e digerida com 17 mL de solução de papaína

bruta (30 mg/mL), durante 6 horas em banho-maria a 60 ºC. Após esse período o material foi

filtrado, o resíduo obtido foi ressuspendido em água destilada e submetido à filtração, o

filtrado obtido foi adicionado ao da primeira filtragem e centrifugado (8000 x g, 20 min, 4

ºC), os PST presentes no sobrenadante foram precipitados por meio da adição de 10,2 mL de

solução de cloreto de cetilpiridínio (CPC) 10% (24 h, 8 ºC). Após a precipitação o extrato de

PST foi centrifugado, o precipitado lavado três vezes com 180 mL de CPC 0,05%, seguido de

centrifugação. Em seguida o precipitado foi dissolvido com 90 mL de uma solução de cloreto

de sódio 2 M : etanol comercial (100:15, v/v), e precipitado novamente por meio da adição de

180 mL de etanol absoluto (24 h, 8 ºC). Após a segunda precipitação o extrato foi

centrifugado novamente, o precipitado foi lavado duas vezes com 180 mL de etanol comercial

80% e uma vez com 180 mL de etanol absoluto. O material obtido foi dissolvido em água

destilada, dialisado, liofilizado e denominado de PST, (Figura 5).

31

ALGA DESIDRATADA (5 g)

HIDRATAÇÃO (tampão acetato de sódio 100 mM (pH 5,0) + cisteína 5 mM + EDTA 5 mM)

DIGESTÃO (papaína bruta 30 mg/mL; 60 ºC; 6 h)

FILTRAÇÃO

PRECIPITAÇÃO (CPC 10%; 8 ºC; 24 h)

LAVAGEM (CPC 0,05%)

PRECIPITADO SOBRENADANTE

(descartado)

DISSOLUÇÃO (NaCl 2 M : etanol comercial (100:15; v/v)

PRECIPITAÇÃO (etanol absoluto, 8 ºC; 24 h)

PRECIPITADO SOBRENADANTE

(descartado)

LAVAGEM (2 x etanol comercial 80%; 1 x etanol absoluto)

DIÁLISE

LIOFILIZAÇÃO

Centrifugação (8000 x g; 20 min; 4 ºC)





POLISSACARÍDEOS SULFATADOS TOTAIS (PST)

Fonte: Elaborada pelo autor.

Figura 5 - Fluxograma da extração de polissacarídeos sulfatados totais.

32

3.2.2 Fracionamento dos PST por cromatografia de troca iônica

Os PST (100 mg) foram dissolvidos em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0

(2 mg/mL) e submetidos à cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose, que

foi equilibrada e lavada com o mesmo tampão até a remoção completa dos polissacarídeos

sulfatados não retidos. As frações polissacarídicas sulfatadas retidas na matriz foram eluídas

por step wise com NaCl nas concentrações de 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 e 1,5 M, preparado

com o mesmo tampão de equilíbrio, utilizando um coletor de frações com fluxo ajustado para

2,3 mL/min. Alíquotas de 4,6 mL foram coletadas e monitoradas por meio da reação

metacromática utilizando o azul de 1,9-dimetilmetileno (ADM) e as leituras realizadas em

espectrofotômetro a 525 nm (FARNDALE; BUTTLE; BARRET, 1986). As frações

polissacarídicas sulfatadas majoritárias, obtidas nas concentrações de 0,5 e 0,75 M de cloreto

de sódio foram denominadas Sf I e Sf II respectivamente. Em seguida as frações foram

dialisadas contra água destilada, liofilizadas e armazenadas à temperatura ambiente para os

ensaios posteriores.

3.2.3 Eletroforese em gel de agarose

Os PST e as frações polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II foram analisados por

eletroforese em gel de agarose, de acordo com a metodologia descrita por Dietrich e Dietrich

(1977). As amostras (20 µg) foram aplicadas em gel de agarose 0,5% e submetidas à migração

eletroforética durante 1 hora em voltagem constante (110 V), com tampão 1,3-acetato

diaminopropano 50 mM (pH 9,0). Em seguida, os PST e as frações Sf I e Sf II foram fixados

no gel com uma solução de N-cetil-N,N,N-brometo de trimetilamônio 0,1% durante 24 horas,

seguido de secagem. Após a fixação o gel foi corado com azul de toluidina 0,1% e, descorado

com uma solução de etanol absoluto, água destilada e ácido acético concentrado (4,95: 4,95:

0,1; v/v/v).

3.2.4 Caracterização físico-química e estrutural

3.2.4.1 Quantificação de carboidratos totais

O teor de carboidratos totais presentes nos PST e nas frações Sf I e Sf II, foi

determinado pelo método fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS et al., 1956). As leituras foram

33

realizadas em espectrofotômetro a 490 nm, utilizando D-galactose para a obtenção da curva-

padrão.

3.2.4.2 Quantificação de contaminantes proteicos

A concentração de proteínas contaminantes foi quantificada nos PST e nas frações Sf I

e Sf II, segundo o método de Bradford (1976), utilizando Albumina Sérica Bovina (BSA)

como padrão. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 525 nm.

3.2.4.3 Quantificação de sulfato livre

O teor de sulfato livre nos PST e nas frações Sf I e Sf II, foi determinado após

hidrólise ácida (HCl 1 M, 5 h, 105 ºC), pelo método gelatina-bário (DODGSON; PRICE,

1962). As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 360 nm. O sulfato de sódio foi

utilizado como padrão.

3.2.4.4 Composição monossacarídica

Os PST e as frações polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II (5 mg) foram

hidrolisados (ácido trifluoroacético 5 M, 4 h, 100 ºC), reduzidos com boro-hidreto e os

alditois acetilados com anidrido acético:piridina (1:1 v/v). Os alditois acetilados foram

dissolvidos em clorofórmio e analisados em cromatografia gasosa/espectrometria de massa

(CGMS-QP2010 Shimadzu, Japão) utilizando uma coluna Restek RTX-5MS, de acordo com

Kircher (1960).

3.2.4.5 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)

Espectros na região do infravermelho, dos PST e das frações polissacarídicas

sulfatadas foram obtidos em espectrômetro (IRTracer-100 Shimadzu, Japão), utilizando

pastilhas de KBr com resolução de 4 cm-1

e 26 scans por segundos na faixa de 400-4000 cm-1

,

conforme especificado por Albuquerque et. al. (2014).

34

3.2.4.6 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)

Espectros de RMN uni (1D) e bidimensionais (2D) foram obtidos segundo

metodologia descrita por Pomin et al. (2005) e Queiroz et al. (2015). As amostras (10 mg de

cada fração) foram dissolvidas em 600 μL de D2O (óxido de deutério a 99,9%) e as soluções

colocadas em tubos de RMN de 5 mm. Os espectros unidimensionais de 1H foram corridos a

25 ºC com 16 acumulações em espectrômetro Bruker DRX de 400 MHz. Os espectros

bidimensionais 1H/

13C HSQC-ED (Hetronuclear Single Quantum Coherence – Editing) foram

corridos com 64 acumulações a 25°C nos espectrômetros Bruker DRX 400 MHz e 600 MHz.

3.2.5 Formulação dos géis

Foram formulados dois géis, um com a fração Sf I e outro com a fração Sf II,

onde foram adicionados a cada fração polissacarídica sulfatada nas concentrações 1; 5 e 10

mg/mL, Carbopol 940 1% (5 mL), silicone S.F. 1204 (500 µL), aminometilpropanol-95 (300

µL) e água desmineralizada q.s.p. 10 mL. Para comprovar a atividade cicatrizante dos

polissacarídeos presentes nos géis, foi preparado um gel nas mesmas condições descritas

acima, sem a presença das frações polissacarídicas, denominado veículo.

3.2.6 Teste de irritabilidade dermal

Para avaliar se o veículo ou os géis contendo as frações polissacarídicas sulfatadas

Sf I e Sf II provocariam alguma irritação, foi realizado o teste de irritabilidade dermal em

animais com pele íntegra e escarificada, conforme metodologia descrita por Jia et al. (2008),

com modificações. Os camundongos foram anestesiados por via intraperitoneal (i.p.) com

cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) associado ao cloridrato de ketamina 10% (80 mg/Kg).

Em seguida foi realizada a tricotomia no dorso dos animais, e após 24 horas os animais foram

anestesiados novamente e a pele da região dorsal foi escarificada, com o auxílio de uma lixa

de aço inoxidável, até a presença de fluido tissular perceptível, mas sem presença de sangue.

A região escarificada foi identificada pelo escurecimento e perda de brilho, quando

comparada à pele íntegra.

Para cada teste de irritabilidade dermal, os animais foram divididos em dois

grupos: 1-animais com pele íntegra e 2-animais com pele escarificada (Figura 6), e cada grupo

foi subdividido em 5 grupos (n=6), de acordo com o tratamento tópico: salina, veículo e gel

35

das frações Sf I ou Sf II nas concentrações (1; 5 e 10 mg/mL). Em seguida, foi delimitada

uma área de 1 cm2 na região dorsal dos camundongos com pele íntegra e escarificada, onde o

veículo, os géis e a salina (50 µL) foram administrados topicamente logo após a realização da

escarificação e diariamente por um período sete dias consecutivos.

3.2.6.1 Parâmetros macroscópicos

Antes de iniciar o tratamento e durante os sete dias, a espessura da pele dos

camundongos foi mensurada com o auxílio de um micrômetro digital (mm). Durante o

experimento foram observadas nos animais, com pele íntegra e escarificada, as reações

dermatológicas macroscópicas provenientes do tratamento: edema, eritema, exsudação e

presença de crosta, sendo estas reações classificadas em escores (0: ausente, 1: leve, 2:

moderado e 3: intenso). Ao final do experimento os animais foram anestesiados, uma amostra

de pele (± 5 mm) da área tratada foi coletada, e em seguida, os animais foram eutanasiados. A

amostra de tecido removida foi pesada (P inicial), colocada em estufa (1 h, 60 ºC) e pesado

novamente (P final). O exsudato presente nos tecidos foi calculado utilizando a fórmula: P final -

P inicial = exsudato.

3.2.7 Avaliação da atividade cicatrizante

Para avaliar a atividade cicatrizante de cada gel formulado com as frações

polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II nas concentrações (1; 5 e 10 mg/mL), foi adotado o

modelo de indução de lesão tecidual descrito por Schirato et al. (2006), com modificações.

Figura 6 – Camundongos tricotomizados para o teste de irritabilidade dermal.

Fonte: Elaborada pelo autor. (A) animal com pele íntegra, (B) animal com pele escarificada.

36

Inicialmente, os camundongos foram anestesiados por via i.p. com cloridrato de

xilazina 2% (10 mg/Kg) associado ao cloridrato de ketamina 10% (80 mg/Kg). Em seguida

foi realizada a tricotomia da região dorsal dos animais e 24 horas após a tricotomia os animais

foram anestesiados novamente para a realização da assepsia da região dorsal, utilizando álcool

iodado 0,15%, e da indução da lesão tecidual. A lesão foi induzida cirurgicamente na região

dorsal dos camundongos, por incisão da pele e remoção das camadas de derme e epiderme

com o mínimo de sangramento, com auxílio de um punch cirúrgico (5 mm), pinça de

dissecação e tesoura cirúrgica. Ao término do procedimento cirúrgico os animais foram

mantidos em ambiente aquecido até total recuperação da anestesia e divididos em 5 grupos

(n=6), aos quais foram administrados topicamente (50µL) de gel contendo as frações

polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II nas concentrações (1; 5 e 10 mg/mL), veículo e como

controle positivo foi administrada colagenase, uma pomada cicatrizante. Os tratamentos

foram administrados logo após a indução da lesão e diariamente por um período de 15 dias

consecutivos.

3.2.7.1 Avaliação e medida da área das lesões

As avaliações macroscópicas das lesões no dorso dos camundongos foram

realizadas logo após a indução da lesão e diariamente por um período de 15 dias. Antes de

cada tratamento tópico foram evidenciados os sinais flogísticos: edema, eritema, exsudação e

presença de crosta, e classificados em escores (0: ausente, 1: leve, 2: moderado e 3: intenso),

foram evidenciados ainda os sinais de reepitelização: presença de tecido cicatricial,

desprendimento da crosta e percentual de contração da área da ferida.

Com relação à medida da área das feridas, nos dias 0, 3º, 7º, 11º e 15º após a

indução da lesão, as feridas no dorso dos camundongos foram fotografadas com uma câmera

digital Sony DSC-H100, modo básico, sem flash, zoom óptico de 7.2, com resolução de 16.1

mega pixels. Para a padronização da distância da câmera à ferida, a câmera foi posicionada

em um tripé com distância de 30 cm e perpendicular a ferida. Os camundongos foram

fotografados sobre um papel milimetrado para a padronização da unidade da área da ferida em

mm2 e para servir como medida conhecida na calibração do softwear ImageJ, onde as

imagens foram analisadas e a área das feridas foi mensurada. O percentual de contração da

área das feridas foi determinado utilizando a equação: % da contração = 100 . [(Wo –

Wi)/Wo], onde Wo = área inicial da ferida e Wi = área final da ferida (Ramsey et al., 1995).

37

3.2.8 Análises estatísticas

Os resultados foram expressos como média ± E.P.M. (Erro Padrão da Média), para

a verificação das diferenças estatísticas entre os grupos foi realizada Análise de Variância

(ANOVA) e, quando observado diferenças significativas entre as médias, aplicou-se o teste de

Bonferroni. Foi adotado nível de significância de P<0,05 em todos os teste realizados. Para a

plotagem dos gráficos e tabelas foram utilizados os softwears GraphPad Prism 4.0 e Origin

7.0.

38

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Rendimento dos polissacarídeos sulfatados totais (PST)

A partir da extração enzimática de 5 g de alga seca da espécie S. filiformis,

seguida de diálise e liofilização, obteve-se 1 g de polissacarídeos sulfatados totais (PST)

totalizando um rendimento de 20%. Resultados semelhantes foram obtidos por Pontes et al.

(2009), Assreuy et al. (2010) e Araújo et al. (2011), onde os PST da alga marinha vermelha S.

filiformis apresentaram um rendimento de 24%, 25% e 19,14%, respectivamente.

O rendimento dos PST foi superior ao obtido para algas marinhas vermelhas

Botryocladia occidentalis 4% (FARIAS et al., 2000), Gelidium crinale 2,4% (PEREIRA et al.,

2005), Solieria chordalis 14,6% (STEPHANIE et al., 2010) e Gracilaria birdiae 4,66%

(VANDERLEI et al., 2011). Contudo o rendimento dos PST foi inferior ao obtido para as

espécies Halymenia pseudofloresia 40,5% (RODRIGUES et. al., 2009) e Halymenia sp. 46%

(RODRIGUES et al., 2010).

A disparidade entre os rendimentos dos polissacarídeos sulfatados extraídos de

algas marinhas pode ser justificada pelas diferentes metodologias de extração que podem ser

adotadas, variações sazonais, bem como da espécie de alga utilizada (MARINHO-SORIANO;

BOURRET, 2003).

Os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas podem ser obtidos por diversas

metodologias de extração, tais como: aquosa a frio (MACIEL et al., 2008) e a quente

(SOUZA et al., 2011), enzimática (FARIAS et al., 2000), por tratamento alcalino

(STEPHANIE et al., 2010), entre outras. Neste trabalho foi utilizada a extração por digestão

enzimática.

4.2 Rendimento do fracionamento dos PST

O fracionamento dos PST obtidos da alga marinha vermelha S. filiformis foi

realizado por meio de cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose, obtendo-se

duas frações polissacarídicas sulfatadas majoritárias denominadas Sf I eluída com 0,5 M de

NaCl e Sf II eluída com 0,75 M de NaCl. O rendimento obtido após diálise e liofilização foi

de 7,72% (Sf I) e 5,76% (Sf II). Corroborando com os resultados encontrados por Araújo et

al., (2011), para a referida alga marinha, que foram de 6,80% e 4,80% para as frações Sf I e Sf

II, respectivamente.

39

As duas frações Sf I e Sf II foram utilizadas nos ensaios biológicos e de

caracterização estrutural, por apresentarem um bom rendimento e por haver na literatura

relatos de algumas de suas atividades biológicas (ARAÚJO et al., 2011; ASSREUY et al.,

2010; RODRIGUES et al., 2010; SOUSA et al., 2016).

4.3 Perfil eletroforético em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose revelou que os PST da espécie S. filiformis

apresentaram uma banda polidispersa ao longo do gel, corroborando com Assreuy et al.

(2010), que também observaram para os PST obtidos por extração enzimática a partir da alga

marinha S. filiformis, um resultado semelhante. A eletroforese mostrou ainda que cada fração

polissacarídica sulfatada Sf I e Sf II, apresentou uma banda no gel de agarose, estando de

acordo com os resultados já relatados por Araújo et al. (2011), que também observaram

apenas uma banda no gel de agarose para cada fração SfI e Sf II.

Neste trabalho, a eletroforese em gel de agarose mostrou que tanto os PST quanto

as frações Sf I e Sf II, da alga S. filiformis, apresentaram homogeneidade de cargas, sendo

observada uma maior densidade de cargas negativas nos PST e na fração Sf II (Figura 7),

sugerindo ser a fração Sf II mais sulfatada que a Sf I, uma vez que o azul de toluidina é capaz

de se associar a compostos sulfatados e apresentar uma coloração violácea.

Sf II Sf I PST

Fonte: Elaborada pelo autor. Os polissacarídeos sulfatados totais (PST) e as frações

Sf I e Sf II (20 μg de cada) da alga Solieria filiformis foram aplicados em gel de

agarose 0,5%. Em seguida o gel foi corado com azul de toluidina.

Figura 7 – Corrida eletroforética em gel de agarose.

Origem

+

40

4.4 Caracterização físico-química

A quantificação de carboidratos totais, sulfato livre e contaminantes proteicos dos

PST e das frações Sf I e Sf II da alga marinha S. filiformis estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1 – Análise físico-química dos polissacarídeos sulfatados de Solieria filiformis.

Solieria

filiformis

Rendimento

(%)

Carboidratos

totais (%)

Sulfato livre

(%)

Contaminantes

proteicos (%)

PST 20 57,74 35,89 0,03

Sf I 7,72 46,53 13,76 -

Sf II 5,76 35,84 19,53 -

Fonte: Elaborada pelo autor. (-) Não detectado.

O percentual de carboidratos totais obtido para os PST (57,74%) e para as frações

Sf I (46,53%) e Sf II (35,84%) mostraram-se superiores aos encontrados por Araújo et al.

(2011), em que os percentuais foram de 29,21% (PST), 30,09% (Sf I) e 23,92% (Sf II) para a

mesma espécie de alga. Analisando outras espécies de algas marinhas vermelhas, Vanderlei et

al. (2011) obtiveram um teor de 68,2% para os PST da alga marinha Gracilaria birdiae, que

foi superior ao obtido neste trabalho para a espécie S. filiformis, porém o teor de carboidratos

totais da frações Sf I e Sf II mostrou-se superior ao obtido para as duas frações

polissacarídicas sulfatadas de G. birdiae, eluídas por cromatografia de troca iônica em DEAE-

celulose, que foi de 37,4% e 30,8% para as frações F I e F II, respectivamente.

O teor de sulfato livre quantificado para os PST da espécie S. filiformis foi de

35,89% e para as frações Sf I e Sf II foi de 13,76% e 19,53%, respectivamente, sendo

observada uma diferença no teor de sulfato livre entre as duas frações avaliadas e um maior

percentual de sulfato na fração Sf II. Resultados semelhantes foram obtidos por Araújo et al.

(2011) para a mesma alga, sendo quantificado um teor de sulfato livre de 27,75% para os PST,

obtidos por extração enzimática, e de 12,69% e 22,35% para as frações Sf I e Sf II,

respectivamente, eluídas por cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose. O teor de

sulfato livre avaliado neste trabalho para os PST e as frações da alga S. filiformis foi superior

ao obtido por Coura et al. (2012), que avaliaram o teor de sulfato livre dos PST e das frações

polissacarídicas da alga marinha vermelha Gracilaria cornea obtendo um percentual de

15,66% para os PST, 16% para a fração F I e 11% para F II.

41

No intuito de comparar os teores de carboidratos totais e sulfato livre procurou-se

na literatura artigos que comparassem esses valores. Os teores de carboidratos totais e sulfato

livre de três carragenanas comerciais (ι-, λ- e κ-carragenana) foram avaliados por Silva et al.

(2010). O percentual de carboidratos totais e sulfato livre obtidos para a ι-carragenana foi de

64,5% e 27,2%, respectivamente, a λ-carragenana apresentou os maiores teores de

carboidratos totais (61,20%) e sulfato livre (33,38%), enquanto a κ-carragenana mostrou os

menores percentuais de carboidratos totais (60,26%) e sulfato livre (17,89%). Apesar de

diferirem, os teores de carboidratos totais são bem semelhantes entre as carragenanas

avaliadas. De acordo com Campo et al. (2009), os teores de sulfato livre tipicamente

apresentados para as κ-, ι- e λ- carragenanas comerciais são de 22%, 32% e 38%,

respectivamente.

O rendimento e a composição química dos PST e das frações polissacarídicas

sulfatadas de algas marinhas podem sofrer variações dependendo: da espécie estudada, das

metodologias adotadas no estudo destes compostos, localização geográfica, condições

ambientais e climáticas, e do período do ano em que a alga for coletada (RODRIGUES,

2011).

O teor de contaminantes proteicos presentes nos PST, obtidos por extração

enzimática da alga S. filiformis, foi de apenas 0,03%, já nas frações Sf I e Sf II sua presença

não foi detectada. Os PST e as frações Sf I e Sf II mostraram-se isentos de contaminantes

proteicos, quando comparados os seus teores aos quantificados para outras espécies de algas

utilizando o mesmo protocolo de extração de polissacarídeos sulfatados (ARAÚJO et al.,

2011; COURA et al., 2012; RODRIGUES et al., 2010a; 2010b; VANDERLEI et al., 2011;).

Ressaltando, assim, a eficiência da extração de PST por digestão enzimática.

4.5 Caracterização estrutural

4.5.1 Composição monossacarídica

A composição de monossacarídeos dos polissacarídeos sulfatados totais (PST) e

das frações polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II, foi determinada por meio de cromatografia

gasosa acoplada a espectrometria de massa dos alditois acetilados após hidrólise ácida,

utilizando os padrões: manose, glucose e galactose. A análise revelou um rendimento em

% m/m de glucose: 7% para os PST, 14% para Sf I e 7% para Sf II e de galactose: 93% para

os PST, 86% para Sf I e 93% para Sf II, respectivamente, (Tabela 2).

42

Tabela 2 - Composição monossacarídica

Monossacarídeos PST Sf I Sf II

Glucose 7% 14% 7%

Galactose 93% 86% 93%


A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa revelou que os PST e

as frações Sf I e Sf II de S. filiformis são constituídos por dois tipos de monossacarídeos

galactose e glucose, conforme a Figura 8 nenhum outro monossacarídeos foi detectado até o

limite < 2% em % do peso seco.

4.5.2 Espectros de FTIR

A espectroscopia de FTIR infravermelho com transformada de Fourier é uma

importante técnica para auxiliar na caracterização estrutural de polissacarídeos sulfatados de

algas marinhas. A Tabela 3 relaciona as principais características estruturais de carragenanas

dos tipos kappa, iota e lambda com suas absorbâncias na região do infravermelho (IV).

Figura 8 - Monossacarídeos detectados.


43

Tabela 3 - Absorbâncias de espectros de infravermelho de carragenanas kappa, iota e lambda.

Número de

ondas (cm1)

Grupo funcional Carragenanas

Kappa Iota Lambda

3400-3000 O-H + + +

2920 C-H + + +

1380-1355 Sulfato + + +

1250-1230 O=S=O + + +

1190 S=O + + -

1160-1155 C-O-C + + +

1125 Ligação glicosídica + + +

1090 S-O + + +

1080-1040 C-O + C-OH + + +

1045 C-OH + S=O + + +

1026 S=O em C2 - + +

1012 S=O em C6 - - +

1002 Ligação glicosídica + + +

970-975 Ligação glicosídica + + +

930 C-O-C (3,6-anidrogalactose) + + +

900-890 Grupo em C6 da -D-galactose + + +

850-840 C-O-S em C4 da galactose + + -

830-825 C-O-S em C2 da galactose - - +

820-810 C6-O-S - - +

805-800 C-O-S em C2 de 3,6

anidrogalactose

- + -

740-725 C-O-C (13) + + -

705 Sulfatos em C4, galactose

615-608 O=S=O + + +

580 O=S=O + + +

Fonte: Prado-Fernández et al., 2003; Holanda, 2007.

Os PST e as frações polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II da alga marinha

vermelha S. filiformis foram anteriormente caracterizados pela técnica de espectroscopia de

FTIR por Araújo et al. (2011), onde os espectros obtidos mostraram sinais intensos típicos de

44

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Ab

sorb

ân

cia

Comprimento de onda (cm-1)

3452

2926

1637

1373

1242 1074

930

850

805

galactanas do tipo carragenanas. Neste trabalho, os PST e as frações Sf I e Sf II da referida

alga, também foram caracterizados pela mesma técnica para averiguar a ocorrência de alguma

modificação na estrutura dos polissacarídeos.

Os espectros na região do IV obtidos para os PST revelaram bandas em torno de

930, 850 e 805 cm-1

, atribuídos à presença de 3,6-anidrogalactose, β-D-galactose-4-sulfato e

3,6-anidrogalactose-2-sulfato, respectivamente. A região dos espectros localizada entre 1400 e

400 cm-1

foi ampliada para permitir uma melhor visualização das bandas de menor

intensidade. Deste modo é possível observar, nos espectros de IV dos PST, uma banda de

baixa intensidade em torno de 970 cm-1

atribuído à presença de β-D-galactose-4-sulfato ligada

a α-D-galactose-2-sulfato (CHOPIN; WHALEN, 1993), e ainda uma banda na faixa de 1250-

1230 cm-1

, característica de grupos sulfato (Figura 9).

Absorbâncias em torno de 1690 e 1425 cm-1

, associadas a grupos amidas

provenientes de proteínas (CHOPIN; KERIN; MAZEROLLE, 1999), não foram observadas

nos espectros de IV dos PST, estando este resultado de acordo com o baixo teor de

contaminantes proteicos (0,03%), determinado pelo método de Bradford (1956). Os espectros

de IV dos PST da alga S. filiformis revelam que estes contêm tanto κ-carragenana quanto ι-

carragenana, como relatado anteriormente por Murano et al. (1997).

1400 1200 1000 800 600 400

0,32

0,34

0,36

0,38

0,40

0,42

0,44

0,46

705

580

805850

930

970

1033

1155

10741242

Ab

sorb

ân

cia


Fonte: elaborada pelo autor. (A) Espectros de IV dos PST de S. filiformis na região entre 4000 a 400 cm-1

.

(B) Ampliação dos espectros na região entre 1400 a 400 cm-1

.

B

Figura 9 – Espectros de infravermelho dos polissacarídeos sulfatados totais de S. filiformis.

A

45

Os espectros de IV obtidos para a fração polissacarídica Sf I mostraram bandas

com absorbâncias nas regiões de 930 cm-1

(3,6-anidrogalactose), 850 cm-1

(galactose-4-

sulfato), características de κ-carragenana (Figura 10), porem não foi observado absorbância

entre 890 e 900 cm-1

(β-D-galactose-6-sulfato), mesmo com a ampliação da região dos

espectros situada entre 1400 e 400 cm-1

.

Absorbâncias em torno de 1690 e 1425 cm-1

, referentes a grupos amidas

provenientes de proteínas, também não foram observadas confirmando assim, a inexistência

de contaminantes proteicos na fração polissacarídica Sf I.

A fração Sf II apresentou espectros de IV com bandas de absorbâncias em 930

cm-1

(3,6-anidrogalactose), 850 cm-1

(β-D-galactose-4-sulfato), 805 cm-1

(3,6-anidrogalactose-

2-sulfato), que são referentes à galactanas do tipo ι-carragenana (Figura 11). Estes resultados

estão em concordância com os obtidos por Araújo et al. (2011), para os espectros de IV dos

PST e das frações Sf I e Sf II de S. filiformis.

1400 1200 1000 800 600 400

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

623

1153

638

997

850930

Ab

sorb

ân

cia


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Ab

sorb

ân

cia


3442

1629

1153

623

930

997

Fonte: elaborada pelo autor. (A) Espectros de IV da fração Sf I de S. filiformis na região entre 4000 a 400 cm-1

. (B)

Ampliação dos espectros na região entre 1400 a 400 cm-1

.

A B

Figura 10 – Espectros de infravermelho da fração Sf I de S. filiformis.

46

1400 1200 1000 800 600 400

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,651070

705

580

805850930

1045 613

Ab

sorb

ân

cia


12501130

A ampliação da região localizada entre 1400 e 400 cm-1

, dos espectros da fração

polissacarídica Sf II, permite uma melhor visualização de absorbâncias na região em torno de

1080-1040 cm-1

, que corresponde à estrutura característica de galactanas. Além disso, os

espectros de IV dos PST e da fração Sf II apresentaram absorbância na região compreendida

entre 1250-1230 cm-1

correspondentes aos estiramentos assimétricos dos grupos éster sulfato

presentes na estrutura química de galactanas extraídas de algas marinhas vermelhas (PRADO-

FERNÁNDEZ et al., 2003). No entanto esta absorbância não foi observada nos espectros da

fração Sf I, que pode ser justificado em função da distribuição de grupos que ocorre quando

os PST são fracionados na cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose, onde

as frações são eluídas em diferentes concentrações de NaCl.

O pico de absorbância em torno de 1250-1230 cm-1

corrobora com os teores de

sulfato determinados para a fração polissacarídica Sf II pelo método descrito por Dodgson e

Price (1962). Além disso, a não ocorrência de absorbâncias em torno de 1690 e 1425 cm-1

,

associadas a grupos amidas provenientes de proteínas, permite afirmar que a fração Sf II está

livre de contaminantes proteicos.

Os espectros de IV obtidos para as frações Sf I e Sf II da alga S. filiformis em

conjunto com os resultados relatados na literatura para a mesma espécie de alga (ARAÚJO et

al., 2011; HOLANDA, 2007; MURANO et al., 1997), sugerem que as frações Sf I e Sf II são

galactanas do tipo κ-carragenana e ι-carragenana, respectivamente. Conforme Campo et al.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

805

Ab

sorb

ân

cia


3383

3444

1645

1402

12501130

1074

930

850

Fonte: elaborada pelo autor. (A) Espectros de IV da fração Sf I de S. filiformis na região entre 4000 a 400 cm-1

.

(B) Ampliação dos espectros na região entre 1400 a 400 cm-1

.

B A

Figura 11 – Espectros de infravermelho da fração Sf II de S. filiformis.

47

(2009), a diferença entre as galactanas κ- e ι-carragenana se dá devido ao número e a posição

dos grupos éster-sulfato nas estrutura química destas galactanas.

4.5.3 Espectros de ressonância magnética nuclear

Com base nos resultados obtidos na espectroscopia de infravermelho, comparou-

se o espectro 1D da fração Sf I de S. filiformis com os espectros de duas diferentes

carragenanas comerciais. Na fig. 12 observa-se em verde na parte superior o espectro da

kappa carragenana tipo III de Eucheuma cottonii, cuja unidade dissacarídica repetitiva é

formada por [→3-β-D-galactopiranose-4-sulfatada (1→4)-3,6-anidro-α-D-galactopiranose-

(1→], em vermelho o espectro da iota carragenana tipo V de Eucheuma spinosa, a qual

possui unidade dissacarídica repetitiva formada por [→3-β-D-galactopiranose-4-sulfatada

(1→4)-3,6-anidro-α-D-galactopiranose-2-sulfatada (1→] e em azul o espectro da fração Sf I.

Figura 12 - Espectros unidimensionais da fração Sf I e de carragenanas comerciais.

Kappa-carragenana

Iota-carragenana

Sf I - S. filiformis

Fonte: Elaborada pelo autor. 10 mg da fração Sf I foi dissolvida em 600 µL de D2O (óxido de

deutério a 99,9%) e a solução colocada em um tubo de RMN de 5 mm. O espectro foi corrido a

25° C com 16 acumulações no espectrômetro Bruker de 400 MHz.

1H Deslocamento químico (ppm)

48

No espectro 2D 1H/

13C-HSQC da fração Sf I (Figura 13 e Tabela 4), os picos de

correlação H/C foram assinalados como: (A) G4S - unidade de β-D-galactopiranose-3-ligada

e sulfatada no carbono 4; (B) DA2S - unidade de uma 3,6-anidro-α-D-galactopiranose-4-

ligada e sulfatada no carbono 2 e (C) DA - unidade de uma 3,6-anidro-α-D-galactopiranose-4-

ligada, com a respectiva correlação de 1H/

13C assinalada após a nomenclatura. O

assinalamento foi baseado na sobreposição do espectro da fração Sf II sobreposto ao da Sf I.


13C

Deslo

camen

to q

uím

ico (p

pm

)

Fonte: Elaborada pelo autor. O espectro foi corrido com 64 acumulações a 25°C em

espectrômetro Bruker de 600 MHz.


13C – HSQC editado da fração Sf I de S. filiformis.

49

Devido à dificuldade no assinalamento da fração Sf I não foi possível elucidar a

estrutura como foi realizado para a fração Sf II, porém os dados obtidos dos espectros 1D e

2D (Figuras 12 e 13), sugerem que a fração Sf I é constituída por um híbrido de kappa e iota

carragenana, embora a proporção de cada carragenana na fração Sf I ainda não esteja bem

determinada.

Com base nos espectros de IV da fração Sf II, foram comparados separadamente

espectros de carragenanas comerciais do tipo iota e kappa com a finalidade de correlacionar o

espectro da fração Sf II. Na Figura 14 podemos comparar os espectros 1D da fração Sf II com

os espectros de duas carragenanas padrões, obtidas comercialmente. Em verde na parte

superior o espectro de uma iota carragenana comercial, na qual a unidade dissacarídica

repetitiva é formada por [→3-β-D-galactopiranose-4-sulfatada (1→4)-3,6-anidro-α-D-

galactopiranose-2-sulfatada (1→], em vermelho o espectro de uma kappa carragenana

comercial cuja unidade dissacarídica repetitiva é formada por [→3-β-D-galactopiranose-4-

sulfatada (1→4)-3,6-anidro-α-D-galactopiranose- (1→] e em azul o espectro da fração Sf II

de S. filiformis cujo espectro apresenta uma mistura de ambas as carragenanas descritas

anteriormente.

Deslocamento Químico (ppm)

Unidade

repetitiva H1/C1 H2/C2 H3/C3 H4/C4 H5/C5 H6/C6 H6’/C6

G4S (A) 4.68/102.3 3.64/69.5 4.04/76.9 - 3.93/72.1 3.98/61.0 3.85/61.2

DA2S (B) 5.09/109.4 4.70/75.1 4.68/77.1 - 4.85/77.9 4.33/68.1 4.29/68.2

DA (C) 4.45/79.5 4.4/76.9 - - - 3.82/75.1 3.67/75.7

Tabela 4 – Deslocamentos químicos de 1H e 13C da carragenana presente na fração Sf I.


50

A partir da análise dos espectros 1D da fração Sf II e dos resultados obtidos por

Van de Velde et al. (2001), em que são estudados diferentes proporções de híbridos de κ- e ι-

carragenana, é possível propor que a fração Sf II é formada por um híbrido do mesmo tipo na

proporção de 30% : 70%, respectivamente.

Na Figura 15 e Tabela 5 temos o assinalamento do espectro 2D 1H/

13C-HSQC da

fração Sf II de S. filiformis. Os picos de correlação 1H/

13C foram assinalados da seguinte

forma: (A) G4S - unidade de β-D-galactopiranose-3-ligada e sulfatada no carbono 4, (B)

DA2S – unidade de uma 3,6-anidro-α-D-galactopiranose-4-ligada e sulfatada no carbono 2 e

(C) DA – unidade de uma 3,6-anidro-α-D-galactopiranose-4-ligada, com a respectiva

correlação de 1H/

13C assinalada após a nomenclatura, tendo como base trabalhos semelhantes

já relatados na literatura (SOUSA et al., 2016; VAN DE VELDE et al., 2001 e 2002;

VORON’KO et al., 2016).

Figura 14 - Espectros unidimensionais da fração Sf II e de carragenanas comerciais.

comerciais..

Iota-carragenana

Sf II - S. filiformis

Kappa-carragenana

Fonte: Elaborada pelo autor. 10 mg da fração Sf II foi dissolvida em 600 µL de D2O (óxido de

deutério a 99,9%) e a solução colocada em um tubo de RMN de 5 mm. O espectro foi corrido a

25° C com 16 acumulações no espectrômetro Bruker de 400 MHz.


51

Tabela 5 – Deslocamentos químicos de 1H e 13C da carragenana presente na fração Sf II.

Deslocamento Químico (ppm)

Unidade

repetitiva H1/C1 H2/C2 H3/C3 H4/C4 H5/C5 H6/C6 H6’/C6

G4S (A) 4.68/102.3 3.64/69.5 4.04/76.9 4.92/72.2 3.93/72.1 3.98/61.0 3.85/61.2

DA2S (B) 5.09/109.4 4.70/75.1 4.68/77.1 4.70/78.5 4.85/77.9 4.33/68.1 4.29/68.2

DA (C) 5.29/92.1 4.04/76.9 4.46/80.1 - - 3.82/75.1 3.67/75.7


A Figura 16 mostra a estrutura da carragenana presente na fração Sf II. A unidade

dissacarídica repetitiva consiste numa mistura de dois tipos de carragenanas, kappa (30%) e

iota (70%), ambas são formadas pela ligação de uma β-D-galactopiranose-3-ligada e sulfatada

Figura 15 - Espectro bidimensional 1H/

13C - HSQC editado da fração Sf II de S. filiformis.

13C

Deslo

camen

to q

uím

ico (p

pm

)


Fonte: Elaborada pelo autor. O espectro foi corrido com 64 acumulações a 25°C em

espectrômetro Bruker de 600 MHz.

52

no carbono 4, que pode estar ligada ao carbono 4 de uma 3,6-anidro-α-D-galactopiranose

sulfatada (iota) ou (kappa) no carbono 2 representado pelo radical R.

Por apresentar características de kappa e iota carragenanas na proporção de 30:70,

respectivamente, a estrutura foi representada com o radical R no resíduo de 3,6

anidrogalactose.

4.6 Avaliação da irritabilidade dermal das frações polissacarídicas sulfatadas

O potencial de irritabilidade dermal dos géis formulados com cada uma das

frações polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II nas concentrações (1; 5 e 10 mg/mL) e do gel

veículo, formulado com Carbopol 940 (1%) foi analisado durante os sete dias de experimento,

em que as reações dermatológicas macroscópicas: edema, eritema, exsudação e presença de

crosta, foram avaliadas diariamente.

Ensaios adotados com a finalidade de determinar o grau de irritabilidade de

produtos e substâncias químicas, como medicamentos de uso tópico e cosméticos,

denominados testes de irritação ocular ou cutânea, foram primeiramente descritos na década

de 1940 por John Draize e ainda hoje são utilizados mundialmente por órgãos oficiais

(OLIVEIRA et al., 2012).

Durante o experimento, não foi observada nenhuma reação irritante nos grupos de

animais (pele íntegra e escarificada) tratados com os géis formulados com as frações Sf I e Sf


Figura 16 - Estrutura química da carragenana presente na fração Sf II.

O

OHR

OOO

O

OH

O

OH

-O3SO

R = OH (70%)

R = OSO-3

(30%)

53

II, nas concentrações avaliadas (1; 5 e 10 mg/mL). Os animais tratados com o gel veículo

(Carbopol 940) também não apresentaram alterações dermatológicas que caracterizassem

irritabilidade, sendo este veículo considerado inerte.

Com a finalidade de comprovar o potencial não irritante das frações

polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II presentes nos géis, além da avaliação das reações

dermatológicas, foram realizadas medições diárias da espessura da pele dos animais (íntegra e

escarificada). Os grupos de animais com pele íntegra, tratados com os géis formulados com as

frações Sf I e Sf II, assim como os animais tratados com o veículo, não apresentaram

alterações na espessura da pele ao longo do período avaliado (Figuras 17 e 18).

No ensaio de irritabilidade realizado com as frações Sf I e Sf II nas concentrações

de 1; 5 e 10 mg/mL; veículo e salina (grupo controle), foi observado nos animais com pele

escarificada, que apenas o grupo tratado com salina, apresentou um leve edema nos dois

primeiros dias de tratamento. No 2º dia foi observado nos grupos com pele escarificada,

tratados com os géis das frações polissacarídicas a formação de uma crosta, indicativo de uma

possível atividade cicatrizante.

Figura 17 – Avaliação da irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf I.

Fonte: Elaborada pelo autor. (A) Animais com pele íntegra. (B) Animais com pele escarificada. Uma área de 1 cm2 na

região dorsal dos camundongos com pele íntegra ou escarificada foi tratada diariamente durante 7 dias com gel Sf I (1;

5 ou 10 mg/mL), salina ou veículo. Os resultados foram expressos em média ± E.P.M. (n = 6/grupo).

A B

54

Ao final do teste de irritabilidade dermal, os animais foram anestesiados e uma

amostra de pele da área tratada foi coletada para pesagem e análise quanto à presença de

infiltrado celular nos tecidos dermais caracterizados por edema (inflamação). Como

demonstrado nas Figuras 19 e 20, os grupos de animais (pele íntegra e escarificada) tratados

com os géis das frações polissacarídicas Sf I e Sf II nas três diferentes concentrações (1; 5 e

10 mg/mL), assim como os grupos tratados com o veículo, não apresentaram diferenças

significativas em relação ao grupo controle salina.

A B

Figura 18 – Avaliação da irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf II.

Fonte: Elaborada pelo autor. (A) Animais com pele íntegra. (B) Animais com pele escarificada. Uma área de 1 cm2

na região dorsal dos camundongos com pele íntegra ou escarificada foi tratada diariamente durante 7 dias com gel

Sf II (1; 5 ou 10 mg/mL), salina ou veículo. Os resultados foram expressos em média ± E.P.M. (n = 6/grupo).

55

Diante dos resultados obtidos, os géis elaborados com as frações polissacarídicas

sulfatadas Sf I e Sf II da alga marinha S. filiformis, foram considerados seguros para serem



Sf I (1; 5 ou 10 mg/mL), salina ou veículo. Os resultados foram expressos em média ± E.P.M. (n = 6/grupo).

Figura 19 – Teste de irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf I.

A B

Figura 20 – Teste de irritabilidade dermal dos controles e dos géis da fração Sf II



Sf II (1; 5 ou 10 mg/mL), salina ou veículo.Os resultados foram expressos em média ± E.P.M. (n = 6/grupo).

A B

56

utilizados nos ensaios de atividade cicatrizante, visto que as aplicações tópicas dos géis não

demonstraram irritabilidade dermal, em animais com pele íntegra ou escarificada, em

nenhuma das concentrações utilizadas. Resultados semelhantes foram relatados na literatura

em que, Burlando et al. (2008) demonstraram que o polissacarídeo de Boswellia serrata não

possui efeitos irritante/citotóxicos quando aplicados topicamente. Recentemente, Fernández-

Ferreiro et al. (2015), demonstraram que kappa-carragenana e alginato não apresentaram

potencial irritante em teste de irritabilidade aguda na córnea. E Ribeiro (2016), demonstrou

que frações polissacarídicas sulfatadas das algas marinhas Cryptonemia crenulata, Caulerpa

racemosa e Gracilaria birdiae não possuem efeito irritante em teste de irritabilidade dermal.

4.7 Atividade cicatrizante das frações polissacarídicas sulfatadas

Com a finalidade de mensurar a área das feridas e investigar o efeito do

tratamento tópico com os géis das frações polissacarídicas sobre a contração e cicatrização da

área lesionada, os grupos de animais submetidos ao ensaio de atividade cicatrizante, tratados

com os géis formulados com as frações polissacarídicas Sf I e Sf II, veículo (controle

negativo) e colagenase (controle positivo), foram anestesiados e imagens da lesão na região

dorsal foram registradas após o procedimento cirúrgico e no 3º; 7º; 11º e 15º dia de

tratamento.

As análises macroscópicas dos grupos experimentais tratados com os géis da

fração Sf I e os controles (Figura 21) demonstraram que no intervalo entre os dias 0 e 3 os

animais de todos os grupos apresentaram edema, hiperemia e presença de exsudato variando

de leve a moderado. Nesse período os animais tratados com o veículo e gel Sf I - 5 mg/mL já

apresentaram uma leve crosta de aspecto granular. A partir do 7º dia foi possível perceber uma

crosta espessa de intensidade moderada nos grupos: veículo, colagenase, Sf I 1 mg/mL e 10

mg/mL e intensa no grupo Sf I – 5 mg/mL. No 11º dia foram evidenciados sinais de

reepitelização e desprendimento da crosta em todos os grupos, exceto no grupo veículo. As

feridas dos grupos colagenase, Sf I 5 mg/mL e 10 mg/mL mostraram-se totalmente

cicatrizadas no 15º dia, com formação de novo tecido epitelial semelhante ao que foi

lesionado. No entanto as lesões dos grupos veículo e Sf I – 1 mg/mL apresentaram apenas

sinais de reepitelização.

57

A contração da área das feridas dos grupos tratados com colagenase, Sf I 5 mg/mL

e 10 mg/mL foi de 82,25 %; 88,46% e 71,32% no 11º dia, respectivamente. No 15º dia o

percentual de contração foi de 98,6 % (Colagenase); 97,6% (Sf I 5 mg/mL) e de 97% (Sf I 10

mg/mL), apresentando diferença significativa em relação ao veículo cujos percentuais de

contração foram de 55,07% no 11º dia e de 93,5 % no 15º dia. E, contudo quando comparadas

as duas maiores concentrações dos géis da fração Sf I, o gel formulado na concentração 5

mg/mL foi o que mostrou melhor efeito cicatrizante, sendo seu resultado idêntico ao da

colagenase (Figura 22). O grupo Sf I - 1 mg/mL apesar de ter apresentado 95,6% de contração

da área lesionada no 15º dia, não diferiu significativamente dos demais grupos experimentais.


Colagenase

Dia 3

Dia 0

Dia 7

Dia 11

Dia 15

Veículo Sf I - 1 mg/mL Sf I - 5 mg/mL Sf I - 10 mg/mL

Figura 21 – Aspectos macroscópicos das lesões tratadas com os controles e os géis da fração Sf I.

58

O efeito cicatrizante dos géis da fração polissacarídica Sf II e dos grupos

controles, sobre as feridas dos grupos experimentais (Figura 23), foi semelhante ao obtido nas

lesões dos animais tratados com os géis da fração Sf I. Os sinais flogísticos de edema,

hiperemia e presença de exsudato com intensidade moderada foram observados em todos os

grupos experimentais no intervalo entre os dias 0 e 3. Foi percebido ainda nos grupos

colagenase, veículo, Sf II 1 mg/mL e 5 mg/mL a formação de uma crosta de aspecto

granular. No 7º dia de tratamento os animais dos grupos colagenase, Sf II 5 mg/mL e 10

mg/mL já apresentaram expressiva contração da lesão, desprendimento da crosta e formação

de tecido cicatricial. Conforme Wilgus (2008), a fase final da cicatrização é caracterizada pela

remodelação tecidual, que tem início na fase proliferativa, quando os fibroblastos sintetizam

colágeno e os diversos componentes da matriz extracelular, que promovem a formação do

tecido cicatricial maduro.

Os animais tratados com colagenase e com os géis de Sf II 5 mg/mL e 10 mg/mL,

apresentaram um percentual de contração das lesões de 82,25%; 88,85% e 94,32%,

respectivamente, já no 11º dia. Enquanto que o percentual de contração das lesões tratadas

com o veículo foi de apenas 55% e do grupo Sf II 1 mg/mL foi de 78,5% no 11º dia.

Figura 22 – Contração da área das lesões tratadas com os controles e os géis da fração Sf I.

Fonte: Elaborada pelo autor. (A) 11º dia de experimento, (B) 15º dia de experimento. Os resultados foram expressos

em média ± E.P.M. (n = 6/grupo); *,** e *** indicam diferença estatística significativa (p<0,05, p<0,01 e P<0,001,

respectivamente) em comparação ao grupo veículo. # indica diferença estatística (p<0,05), em relação ao grupo

colagenase. (ANOVA; Bonferroni).

A B

59

A cicatrização das feridas ocorre pela substituição do tecido injuriado, por outro

semelhante, porém não idêntico caracterizado pela formação de tecido de granulação e

contração da ferida (Al-Khamis et al., 2011).

No 15º dia as feridas tratadas com colagenase, Sf II 5 mg/mL e 10 mg/mL

mostraram-se totalmente cicatrizadas e com regeneração integral do tecido lesionado. No

entanto as lesões dos grupos veículo e Sf II – 1 mg/mL apresentaram apenas sinais de

reepitelização acentuada.

A cicatrização das feridas dos animais tratados com colagenase, Sf II 5 mg/mL e

10 mg/mL apresentaram diferença significativa em relação ao grupo veículo. Entretanto o gel

formulado na concentração 10 mg/mL apresentou melhor efeito cicatrizante quando

comparado a colagenase e a concentração 5 mg/mL (Figura 24). A concentração 1 mg/mL não

apresentou diferença significativa em relação aos demais grupos experimentais, embora

também tenha mostrado efeito cicatrizante expressivo.


Colagenase

Dia 3

Dia 0

Dia 7

Dia 11

Dia 15

Veículo Sf II - 5 mg/mL Sf II - 10 mg/mL Sf II - 1 mg/mL

Figura 23 – Aspectos macroscópicos das lesões tratadas com os controles e os géis da fração Sf II.

60

As duas frações polissacarídicas sulfatadas Sf I e Sf II da alga marinha vermelha

S. filiformis apresentaram efeito positivo na cicatrização e reepitelização do tecido injuriado,

nas três concentrações avaliadas. No entanto, quando comparado o percentual de contração

das lesões e o efeito cicatrizante das duas frações, é possível perceber que a fração Sf II

apresentou melhor resultado, visto que as feridas tratadas com o gel Sf II - 10 mg/mL

apresentaram sinais de reepitelização do tecido lesionado já no 7º dia de tratamento,

remodelamento tecidual no 11º dia e 100% de cicatrização no 15º dia, diferindo

estatisticamente do grupo veículo (controle negativo) e apresentando resultado mais

significativo que o grupo tratado com colagenase (controle positivo), Figura 25.

Fonte: Elaborada pelo autor. (A) 11º dia de experimento, (B) 15º dia de experimento. Os resultados foram expressos em

média ± E.P.M. (n = 6/grupo); *, ** e *** indicam diferença estatística significativa (p<0,05, p<0,01 e p<0,001,

respectivamente), em comparação ao grupo veículo, (ANOVA; Bonferroni).

Figura 24 - Contração da área das lesões tratadas com os controles e os géis da fração Sf II.

A B

61

Muitas pesquisas têm sido desenvolvidas para investigar o processo de reparação

tecidual e dos eventos que prejudicam ou retardam a cicatrização de feridas cutâneas. Por

meio da compreensão do processo cicatricial é possível desenvolver novas terapias, capazes

de revolucionar o reparo de feridas (WONG; GURTNER; LONGAKE, 2013). Embora a

indústria farmacêutica tenha alcançado grandes avanços no desenvolvimento de novos fármacos, a

capacidade de promover a cicatrização de feridas ainda é limitada. Assim, muitos estudos relatam

a utilização de bioprodutos para promover as várias fases da cicatrização (MURTI et al,

2012.; OLIVEIRA et al., 2013), e atividade cicatrizante de diversos polissacarídeos

(AMMAR, et al., 2015; BURD, A.; HUANG, L., 2008; CHANDIKA et al., 2015; LI et al.,

2015; SCHIRATO et al., 2006). No entanto, vale ressaltar que não há na literatura relatos do

efeito cicatrizante, em modelo de feridas induzidas em camundongos, de polissacarídeos

sulfatados obtidos a partir de algas marinhas.

Figura 25 – Cicatrização das lesões tratadas com os controles e os géis da fração Sf II.

Fonte: Elaborada pelo autor. Os resultados foram expressos em média ± E.P.M. (n = 6/grupo); *, ** e ***

indicam diferença estatística significativa (p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente), em comparação ao

grupo veículo, (ANOVA; Bonferroni).

62

5 CONCLUSÃO

As carragenanas da alga marinha vermelha Solieria filiformis, fracionadas por

cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose, foram caracterizadas como um híbrido

constituído por k- e ι-carragenana. As carragenanas híbridas apresentaram comportamento

semelhante, demonstrando potencial não irritante dermal e atividade cicatrizante em modelo

de feridas induzidas em camundongos. No entanto, a carragenana constituída por kappa

(30%) e iota (70%), na concentração de 10 mg/mL, foi a que evidenciou um melhor efeito

no processo de cicatrização, conforme demonstrado por análises de parâmetros

macroscópicos. Sugerindo assim, uma nova aplicabilidade biológica da referida carragenana

no processo de cicatrização de feridas cutâneas.

63

REFERÊNCIAS

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ANEXO – Certificado de aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais

universidade federal do cearÁ centro de ciÊncias ... · troca iônica em matriz de deae-celulose...

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