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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

THAIS MURATORI HOLANDA

EFEITO FARMACOLÓGICO DE COMPLEXOS DE RUTÊNIO COM LIGANTES 2-

IMIDAZOLIDINETIONA NA REATIVIDADE VASCULAR IN VITRO E DA

INTERAÇÃO FÁRMACO-RECEPTOR IN SILICO

FORTALEZA

2019





Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do título de Doutora em

Farmacologia. Área de Concentração:

Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de

Moraes Filho.

Coorientador: Prof. Dr. Francisco Vagnaldo

Fechine

FORTALEZA

2019





Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do título de Doutora em

Farmacologia. Área de Concentração:

Farmacologia.

Aprovada em: _______________

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho (Orientador)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

Profª. Drª. Roberta Jeane Bezerra Jorge


Prof. Dr. Luiz Gonzaga de França Lopes


Profª. Drª. Karilane Maria Silvino Rodrigues

Universidade Federal do Amapá (UNIFAP)

Profª. Drª. Mirizana Alves de Almeida

Centro Universitário Christus (UNICHRISTUS)

À minha família, que tanto me apoia e torce por mim.

AGRADECIMENTOS

À Deus, primeiramente, por traçar e iluminar meus caminhos, por me permitir

oportunidades engrandecedoras e conhecer pessoas extraordinárias, pela minha saúde e

capacidade de agregar e repassar conhecimento.

À Universidade Federal do Ceará (UFC) e ao Departamento de Fisiologia e

Farmacologia (DFF) da Faculdade de Medicina pela oportunidade da realização do trabalho e

pelo suporte docente, físico e administrativo.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio financeiro no custeio da bolsa.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, pelo meu acolhimento

como orientanda, por todos os conhecimentos compartilhados e confiança em mim depositada

para a realização deste trabalho.

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Francisco Vagnaldo Fechine, por todos os

ensinamentos, pela disponibilidade e pelo incessante estímulo ao conhecimento científico.

Aos Professores integrantes das bancas de qualificação (Profs. Drs. Mirizana Alves de

Almeida, Renata Bessa Pontes e Gilmara Holanda da Cunha) e defesa (Profs. Drs. Roberta

Jeane Bezerra Jorge, Luiz Gonzaga de França Lopes, Karilane Maria Silvino Rodrigues e

Mirizana Alves de Almeida), pelas ideias e sugestões no aprimoramento do trabalho.

Aos meus colegas de pós-graduação e parceiros nesse trabalho João Alison Moraes

Silveira e Danilo Galvão Rocha, pela intensa colaboração na realização desse estudo.

À equipe integrante do grupo de pesquisa Bioinorgânica do Departamento de Química

Orgânica e Inorgânica da UFC, pela parceria nesse trabalho.

À Adelânia Roque por estar sempre disponível e de portas abertas.

À toda a minha família, meu pai (José Nilson), meus irmãos (Débora e Guilherme) e

especialmente à minha mãe (Maria Kátia) por estar sempre ao meu lado incentivando e

torcendo pelas minhas conquistas.

Aos meus sogros (Cristiany e Erisvaldo) pelo apoio e suporte incondicional.

Ao meu amado, Pedro, por toda ajuda, companheirismo e suporte, no trabalho e na

vida.

Aos meus amigos pela positividade e torcida. Aos meus sobrinhos e sobrinhas que

aquecem meu coração e me estimulam a ver um mundo melhor no futuro.

Aos animais experimentais, verdadeiros heróis da ciência, que entregaram suas vidas

para a realização deste trabalho e progresso do conhecimento científico.

“O sucesso nasce do querer, da determinação e

persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo

não atingindo o alvo, quem busca e vence

obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”

(José de Alencar)

RESUMO

É notória a participação do endotélio no processo contrátil do vaso produzindo substâncias

vasoativas como o óxido nítrico (NO). Atualmente nota-se um grande interesse por fármacos

com a capacidade de liberar NO, devido à sua importância. Derivados de rutênio com ligantes

piridínicos mostram uma ampla diversidade de aplicações. O objetivo desse trabalho é avaliar

o efeito farmacológico de complexos de rutênio com ligantes 2-imidazolidinetiona na

reatividade vascular. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos, anestesiados com

cetamina e xilazina e exsanguinados. Foram retirados 4 anéis da artéria aorta de cada animal e

montados em um sistema de banho de órgãos que foram incubados com solução nutridora de

Krebs-Henseleit. Inicialmente foi realizado um protocolo para verificar o efeito

vasorrelaxante dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis pré-contraídos com

fenilefrina ou KCl, seguido de protocolos para testar a influência de vias de relaxamento

vascular, entre elas a via do NO, participação endotelial e canais de K+. Também foi realizada

dosagem de GMPc por ELISA e o docking molecular com a guanilato ciclase solúvel (GCs).

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média, a comparação entre dois

grupos foi realizada através do teste t, de múltiplos grupos por ANOVA e para comparações

múltiplas foi utilizado o teste de Tukey. Foi observado que o FOR011B e FOR811B

apresentaram efeito relaxante máximo similar aos controles com nitroprussiato de sódio e

BAY 41-2272 quando pré contraídos com fenilefrina, porém esse efeito foi reduzido na pré-

contração com KCl. O FOR011B apresentou uma diminuição estatisticamente significante na

potência de vasorrelaxamento quando pré-incubado com L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina,

L-cisteína, wortmanina, tetraetilamônio e 4-aminopiridina e uma redução no efeito máximo

com glibenclamida. Já o FOR811B mostrou uma redução estatisticamente significante na

potência de vasorrelaxamento quando pré-incubado com L-NAME, ODQ, wortmanina e

tetraetilamônio e uma diminuição do efeito máximo também com glibenclamida. Pode-se

concluir, portanto, que o efeito vasodilatador do FOR011B e FOR811B parece advir da via do

NO possivelmente no bloqueio da GCs, adicionalmente o FOR011B também atua nos canais

de potássio. A presença de ODQ não alterou a dosagem de GMPc nas preparações. Ambos os

complexos de rutênio se ligaram aos sítios da GCs reduzida e oxidada.

Palavras-chave: Reatividade vascular. Rutênio. Guanilato ciclase solúvel. Óxido nítrico.

ABSTRACT

Pharmacological effect of ruthenium complexes with 2-imidazolidinethione ligands in

vascular reactivity in vitro and receptor interaction in silico. Thais Muratori Holanda.

Ph.D. Thesis. Postgraduate Program in Pharmacology, Federal University of Ceara, 2019.

The participation of endothelium in the contractile process of vessels is known to produce

vasoactive substances such as nitric oxide (NO). Currently there is a great interest in drugs

with the ability to release NO, due to its importance. Ruthenium derivatives with pyridine

binders show a wide variety of applications. The objective of this work is to evaluate the

pharmacological effect of ruthenium complexes with 2-imidazolidine ligands on vascular

reactivity. For this, male Wistar rats were anesthetized with ketamine and xylazine and

exsanguinated. Four rings of the aortic artery were removed from each animal and mounted in

an organ bath system where were incubated with Krebs-Henseleit nutrient solution. Initially, a

protocol was used to verify the vasorelaxant effect of FOR011B and FOR811B metalloprugs

in pre-contracted rings with phenylephrine or KCl, followed by protocols to test the influence

of vascular relaxation pathways, including NO pathway, endothelial participation and K +.

We also performed cGMP dosing by ELISA and molecular docking with soluble guanylate

cyclase (sGC). Data were expressed as mean ± standard error of the mean, the comparison

between two groups was performed through t test, of multiple groups by ANOVA and Tukey

test was used for multiple comparisons. It was observed that FOR011B and FOR811B

presented a maximum relaxing effect similar to the controls with sodium nitroprusside and

BAY 41-2272 when pre-contracted with phenylephrine, but this effect was reduced in the pre-

contraction with KCl. FOR011B showed a statistically significant decrease in vasorelaxation

potency when pre-incubated with L-NAME, ODQ, hydroxocobalamin, L-cysteine,

wortmannin, tetraethylammonium and 4-aminopyridine and a reduction in maximal effect

with glibenclamide. FOR811B showed a statistically significant reduction in vasorelaxation

potency when pre-incubated with L-NAME, ODQ, wortmanine and tetraethylammonium also

a decrease in maximal effect with glibenclamide. It can be concluded, that the vasodilatory

effect of FOR011B and FOR811B appears to proceed from the NO pathway possibly by

blocking of sGC, in addition FOR011B also acts on potassium channels. The presence of

ODQ did not alter the cGMP dosage in the preparations. Both ruthenium complexes bound to

reduced and oxidized sGC sites.

Keywords: Vascular reactivity. Ruthenium. Soluble guanylate cyclase. Nitric oxide.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Músculo liso multiunitário e unitário.............................................................. 21

Figura 2 Mecanismo de contração e relaxamento do músculo liso............................... 22

Figura 3 Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial................................................ 25

Figura 4 Efeitos cardiovasculares do óxido nítrico....................................................... 26

Figura 5 Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial................................................ 27

Figura 6 Compostos imidazólicos conhecidos............................................................... 30

Figura 7 Compostos derivados de rutênio utilizados em pesquisas............................... 31

Figura 8 Estruturas moleculares dos metalofármacos FOR011B e FOR811B.............. 35

Figura 9 000 (vermelho) e L11B (verde)....................................................................... 35

Figura 10 Procedimento de retirada da aorta................................................................... 37

Figura 11 Preparação dos anéis de aorta.......................................................................... 38

Figura 12 Experimento de reatividade vascular............................................................... 39

Figura 13 Equipamentos. ................................................................................................ 40

Figura 14 Linha do tempo do protocolo de análise inicial do efeito relaxante dos

metalofármacos em anéis de aorta de ratos..................................................... 41

Figura 15 Linha do tempo de participação do endotélio vascular no efeito

vasodilatador dos metalofármacos.................................................................. 43

Figura 16 Linha do tempo do protocolo de participação do óxido nítrico no efeito


Figura 17 Linha do tempo do protocolo de participação da guanilato ciclase solúvel

no efeito vasodilatador dos metalofármacos................................................... 44

Figura 18 Linha do tempo do protocolo de participação dos receptores muscarínicos

no efeito vasodilatador dos metalofármacos................................................... 44

Figura 19 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio não

seletivos no efeito vasodilatador dos metalofármacos.................................... 45

Figura 20 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio

voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos metalofármacos............... 46

Figura 21 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio

dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos metalofármacos................. 46

Figura 22 Linha do tempo do protocolo de participação dos prostanóides no efeito


Figura 23 Linha do tempo do protocolo de participação do fosfatidilinositol 3-quinase

(PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos....................................... 47

Figura 24 Linha do tempo do protocolo de participação da via do AMPc no efeito


Figura 25 Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de cálcio no efeito


Figura 26 Docking molecular entre os ligantes FOR011B (1A), FOR811B (1B) e

BAY 41-2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs................... 96

Figura 27 Mapa 2D das interações do sítio catalítico do ligante FOR011B (1A),

FOR811B (1B) e BAY 41-2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1

da GCs............................................................................................................. 97

Figura 28 Distâncias do ligante BAY 41-2272 e a proteína (PDB 2O09)....................... 98

Figura 29 Interação dos resíduos do sítio ativo da proteína (PDB 3L6J) e os ligantes

FOR811B (A), FOR811B (B) e cinaciguat (C)............................................... 99

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Efeito do metalofármaco FOR011B (n=8), de seus precursores estruturais

(000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de

aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM........................ 54



aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM. .................... 55

Gráfico 3 Comparação entre os efeitos do FOR011B em anéis de aorta pré-

contraídos com KCl 60 mM (n=8) e com PHE 1 µM (n=8). ....................... 56



aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM........................ 57



aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM. .................... 58

Gráfico 6 Comparação entre os efeitos do FOR811B em anéis de aorta com

endotélio íntegro pré-contraídos com KCl (n=8) e com PHE (n=8)............. 59

Gráfico 7 Comparação entre os efeitos do FOR811B e FOR011B em preparações de

aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE (n=8) e com KCl

(n=8).............................................................................................................. 60

Gráfico 8 Efeito vasodilatador do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de

aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM (n=6) e PHE

1 µM (n=6).................................................................................................... 63

Gráfico 9 Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=8) e

desnudo (E-) (n=8) pré-contraídos com PHE 1 µM...................................... 64


desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM.................................... 65


desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com PHE 1 µM...................................... 66


desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM.................................... 67

Gráfico 13 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com

endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle)

(n=8) ou na presença de Atropina (n=6)....................................................... 69



(n=8) ou na presença de Atropina (n=6)....................................................... 70



(n=8) ou na presença de L-NAME (n=6)...................................................... 71



(n=8) ou na presença de L-NAME (n=6)...................................................... 72



(n=8) ou na presença de ODQ (n=6)............................................................. 73


endotélio pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou

na presença de ODQ (n=6)............................................................................ 74



(n=8) ou na presença de Hidroxicobalamina (n=6)...................................... 75



(n=8) ou na presença de Hidroxicobalamina (n=6)...................................... 76



(n=8) ou na presença de L-Cisteína (n=6).................................................... 77



(n=8) ou na presença de L-Cisteína (n=6).................................................... 78



(n=8) ou na presença de Wortmaninna (n=6)............................................... 79



(n=8) ou na presença de Wortmaninna (n=6)............................................... 80



(n=8) ou na presença de Tetraetilamônio (TEA) (n=6)................................ 81



(n=8) ou na presença de Tetraetilamônio (TEA) (n=6)................................ 82



(n=8) ou na presença de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6).............................. 85



(n=8) ou na presença de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6).............................. 86



(n=8) ou na presença de Glibenclamida (n=6).............................................. 87



(n=8) ou na presença de Glibenclamida (n=6).............................................. 88



(n=8) ou na presença de Indometacina (n=6)................................................ 89

Gráfico 32 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta pré-

contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença

de Indometacina (n=6).................................................................................. 90



(n=8) ou na presença de MDL 12,330A (n=6).............................................. 91



(n=8) ou na presença de MDL 12,330A (n=6).............................................. 92

Gráfico 35 Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de PHE 1 µM após depleção

do Ca2+ intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B

(n=6), ou FOR811B (n=7)............................................................................ 93

Gráfico 36 Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de KCl 8 mM após depleção

do Ca2+ intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B

(n=7), ou FOR811B (n=7)............................................................................ 94

Gráfico 37 Concentração de GMPc nos grupos Controle (n=4), 011B (n=4), 811B

(n=4), 011B+ODQ (n=4) e 811B+ODQ (n=4)............................................. 95

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito vasodilatador do FOR011B (n=8), FOR811B (n=8), de seus

precursores estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-

2272 (n=6) em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas

com PHE ou com KCl...................................................................................... 62

Tabela 2 Efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis

de aorta com endotélio íntegro (E+) e desnudo (E-) pré-contraídos com

PHE 1 µM ou KCl 60 mM............................................................................. 68

Tabela 3 Efeito vasodilatador do FOR011B em preparações de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na

presença de Atropina, L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína,

TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina, MDL 12,330A ou wortmaninna

(n=6).............................................................................................................

91

Tabela 4 Efeito vasodilatador do FOR811B em preparações de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na

presença de Atropina, L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína,

TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina, MDL 12,330A ou wortmaninna

(n=6)............................................................................................................... 94

Tabela 5

Tabela comparativa das distâncias entre os resíduos/ligantes....................... 97

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

4-AP 4-aminopiridina

ACh Acetilcolina

AChE Acetilcolinesterase

AMPc Monofosfato cíclico de adenosina

ATP Adenosina trifosfato

ATR Atropina

BH2 Dihidrobiopterina

BH4 Tetrahidrobiopterina

CEPA Comitê de ética em pesquisa animal

CO2 Gás crabônico

COBEA Colégio brasileiro de experimentação animal

DBCA Diretriz brasileira para o cuidado e a utilização de animais para fins científicos

e didáticos

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

GCs Guanilato ciclase solúvel

GLIB Glibenclamida

GMPc Monofosfato cíclico de guanosina

GTP Trifosfato de guanosina

H2O2 Peróxido de hidrogênio

HCB Hidroxicobalamina

HO Hidroxil

IgG Imunoglobulina G

INDO Indometacina

iNOS Óxido nítrico sintase induzível

IP3 Inositol trifosfato

KCl Cloreto de potássio

LCIS L-cisteína

LFPC Laboratório de farmacologia pré clínica

nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

NPDM Núcleo de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos

O2 Oxigênio

O2- Superóxido

ODQ 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one

PGI2 Prostaglandina I2

PHE Fenilefrina

PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase

PIP2 Bifosfato de fosfatidilinositol

PKG Proteinocinase G

RYR Receptor de rianodina

SERCA Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase

SNP Nitroprussiato de sódio

TEA Tetraetilamônio

UFC Universidade Federal do Ceará

WORT Wortmanina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 21

1.1 Músculo liso vascular .............................................................................................................. 21

1.2 Função endotelial..................................................................................................................... 24

1.3 Via do óxido nítrico ................................................................................................................. 27

1.4 Fármacos doadores de óxido nítrico ...................................................................................... 29

1.5 Metalofármacos ....................................................................................................................... 30

1.6 Justificativa .............................................................................................................................. 33

2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 34

2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................................... 34

2.2 Objetivos Específicos............................................................................................................... 34

3 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 35

3.1 Aspectos éticos ......................................................................................................................... 35

3.2 Animais ..................................................................................................................................... 35

3.3 Local de realização do estudo ................................................................................................. 35

3.4 Metalofármacos ....................................................................................................................... 36

3.5 Estudo in vitro .......................................................................................................................... 37

3.5.1 Técnica cirúrgica ................................................................................................................... 37

3.5.2 Montagem e estabilização dos anéis de aorta ........................................................................ 40

3.5.3 Teste de viabilidade dos anéis de aorta ................................................................................. 42

3.5.4 Análise inicial do efeito relaxante dos metalofármacos em anéis de aorta de ratos. ............. 42

3.5.5 Protocolos experimentais ...................................................................................................... 43

3.5.5.1 Participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ................ 43

3.5.5.2 Participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ......................... 44

3.5.5.3 Participação da guanilato ciclase solúvel no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ....... 44

3.5.5.4 Participação dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ...... 45

3.5.5.5 Influência da inibição não seletiva dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos

metalofármacos. .................................................................................................................................... 46

3.5.5.6 Participação dos canais de potássio voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos

metalofármacos. .................................................................................................................................... 46

3.5.5.7 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos

metalofármacos. .................................................................................................................................... 47

3.5.5.8 Participação dos prostanóides no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ........................ 47

3.5.5.9 Participação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos

metalofármacos. .................................................................................................................................... 48

3.5.5.10 Participação da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ..................... 49

3.5.5.11 Participação dos canais de cálcio no efeito vasodilatador dos metalofármacos. ............. 49

3.6 Determinação de GMPc por ELISA ...................................................................................... 50

3.7 Docking Molecular .................................................................................................................. 51

3.8 Fármacos e Diluições ............................................................................................................... 52

3.9 Análise Estatística ................................................................................................................... 52

4 RESULTADOS .................................................................................................................... 54

4.1 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro

pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM. ............................................................................... 54

4.2 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro

pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM. ............................................................................... 58

4.3 Influência do endotélio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B

em anéis de aorta pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM. ................................................ 65

4.4 Influência dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos

FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

............................................................................................................................................................... 70

4.5 Influência da via do NO/GCs efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B

em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM. ..................................... 72

4.6 Influência da presença de Hidroxicobalamina ou L-Cisteína no efeito vasodilatador dos

metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos

com PHE 1 µM. ................................................................................................................................... 76

4.7 Influência da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos

FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM. ........ 80

4.8 Influência dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e

FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM............................ 82

4.9 Influência da via da ciclooxigenase no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e

FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM............................ 88

4.10 Influência da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em

anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM. ................................................ 90

4.11 Influência dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B na contração induzida por Ca2+ na

presença de Fenilefrina ou de alta concentração de K+ após depleção do Ca2+ intracelular. .............. 94

4.11 Dosagem de GMPc por Elisa ......................................................................................................... 96

5 DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 100

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 111

7 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 112

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 113

21

1 INTRODUÇÃO

1.1 Músculo liso vascular

Os vasos sanguíneos possuem uma camada de células musculares lisas em sua

composição anatômica. Esse tecido pode ser classificado como músculo liso unitário (cada

célula contrai de forma independente) e tônico (contração continuamente ativa gerando um

tônus basal) (WEBB, 2003).

A estrutura dos vasos em forma de tubo e a disposição das células em circunferência

permite que a luz do vaso reduza no momento da contração muscular. Esta musculatura é

capaz de se manter contraída por longos períodos com um baixo consumo energético, o que é

fundamental para funções vasculares básicas como o tônus, permitindo assim o controle da

pressão arterial. A contração muscular lisa ocorre em resposta a estímulos elétricos ou

químicos que aumentem a concentração de cálcio intracelular, sem que haja necessariamente

uma alteração do potencial de membrana (SHIMOKAWA; SATOH, 2014).

Variações do potencial de membrana podem ser geradas por alterações da atividade da

Na+, K+-ATPase na membrana celular, que por sua vez, são capazes de produzir potenciais de

ação. Pequenas variações no potencial de repouso podem alterar significativamente o influxo

de cálcio através dos canais de cálcio voltagem-dependentes, alterando assim a graduação

contrátil. Esse tipo de resposta à pequenas alterações de potencial é característica de músculo

liso unitário tônico (Figura 1) (HOROWITZ et al., 1996; WALSH, 2011).

22

Figura 1 - Músculo liso multiunitário e unitário

Fonte: (GUYTON; HALL, 2017).

Algumas substâncias endógenas e fármacos são capazes de se acoplar mecanicamente

ao receptor da célula muscular lisa sem gerar variações no potencial de membrana, nesse caso

há aumento nos níveis de um segundo mensageiro intracelular como o monofosfato cíclico de

guanosina (GMPc) ou o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) que irão posteriormente

alterar os níveis intracelulares de cálcio (HOROWITZ et al., 1996; WALSH, 2011).

Uma vez a concentração de cálcio intracelular elevada, quatro desses íons se ligam à

proteína calmodulina, esse complexo cálcio-calmodulina ativa a cinase da cadeia leve de

miosina, que por sua vez fosforila a cadeia leve regulatória da miosina. Uma molécula de

adenosina trifosfato (ATP) é então utilizada para fornecer energia à ponte cruzada de miosina

que se liga à actina realizando o movimento de catraca, onde o filamento fino é direcionado

ao centro. Este ciclo das ponte cruzadas continua até que os níveis de cálcio intracelulares

diminuam, inativando a cinase da cadeia leve de miosina e, por sua vez, a miosina fosfatase

realiza a desfosoforilação da miosina, encerrando a contração muscular (Figura 2) (PFITZER,

2001).

O músculo liso utiliza duas fontes de íons cálcio distintas, o retículo sarcoplasmático e

o meio extracelular. Os receptores do retículo são sensibilizados pela ligação de inositol

trifosfato (IP3), que são produzidos a partir do estímulo gerado nos receptores de membrana

acoplados à proteína G, essa ativa a fosfolipase C que hidrolisa o fosfolipídeo de membrana

bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2) em IP3 e diacilglicerol. Essa sensibilização abre os canais

23

de cálcio dependentes de IP3 do retículo sarcoplasmático, aumentando a concentração de

cálcio citoplasmática (WALSH, 2011).

Várias substâncias são capazes de ativar os receptores acoplados à proteína G

presentes na membrana da célula muscular lisa. As fibras simpáticas do sistema nervoso

autônomo inervam o músculo liso vascular e liberam a noraepinefrina como neurotransmissor

que se liga aos receptores adrenérgicos α1, ativando fosfolipase C e produzindo IP3, assim

como a vasopressina e a angiotensina II (PFITZER, 2001).

Figura 2 - Mecanismo de contração e relaxamento do músculo liso.

Fonte: (PFITZER, 2001).

Ca2+: íons cálcio, IP3: inositol trifosfato, SR: retículo sarcooplasmático, CaM: Calmodulina, MLCK: cinase de

cadeia leve de miosina, ATP: adenosina trifosfato, ADP: adenosina difosfato, Pi: fosfato, MLCP: fosfatase da

cadeia leve de miosina.

24

O retículo sarcoplasmático também possui canais de cálcio dependentes de cálcio,

também conhecidos como receptores de rianodina (RYR), que são ativados durante a entrada

de cálcio extracelular na célula. No final da contração o cálcio é removido do interior da

célula pela SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) que sequestra o cálcio de

volta para o retículo, além do antiportador 3Na+-1Ca2+ e a atividade da Ca2+-ATPase que

bombeiam cálcio para o meio extracelular (AMBERG; NAVEDO, 2013).

A partir desses dados, podemos afirmar que substâncias que ajam diminuindo as

concentrações intracelulares de cálcio atuarão no relaxamento do músculo liso, como por

exemplo os bloqueadores de canais de cálcio que diminuem influxo de cálcio na célula

através dos canais de cálcio tipo L, dependentes de voltagem na membrana celular, causando

vasodilatação. Assim como fármacos que abrem os canais de potássio, causando

hiperpolarização celular e diminuição do influxo de cálcio na célula (WEBB, 2003;

AMBERG; NAVEDO, 2013).

Outro possível mecanismo de vasodilatação seria pelo aumento nos níveis de GMPc,

por exemplo através da liberação de acetilcolina pelas fibras parassimpáticas, que culmina na

produção de óxido nítrico (NO) pelas células endoteliais vasculares. Substâncias que

estimulam os receptores adrenérgicos β e aumentam a concentração de AMPc também

causam relaxamento do músculo liso vascular por reduzir a atividade da cinase da cadeia leve

da miosina e a concentração de cálcio intracelular (SHIMOKAWA; SATOH, 2014).

Dessa maneira, podemos verificar que o controle vasomotor está associado a uma série

de mecanismos e estruturas, relacionados ao sistema nervoso autônomo, hormônios

endógenos, neurotransmissores, fármacos e células endoteliais vizinhas (BIAN; SHI; FERID,

2011).

1.2 Função endotelial

O tecido endotelial, inicialmente, era tido como uma camada de revestimento por onde

substâncias eram difundidas, realizando as trocas entre o sangue e as células circunvizinhas.

Hoje, é notória a participação do endotélio no processo de contração e relaxamento do vaso

produzindo uma gama de substâncias vasoativas como os prostanóides, NO, peptídeos, fatores

de hiperpolarização derivados do endotélio, entre outros (CUNHA et al. 2013).

25

As espécies reativas de oxigênio são moléculas com alta capacidade oxidativa, as mais

conhecidas são o superóxido (O2-), o radical hidroxil (HO) e o peróxido de hidrogênio (H2O2).

A síntese dessas moléculas se dá pela redução incompleta do oxigênio molecular por enzimas

que incluem a xantina oxidase, óxido nítrico sintase, NADPH oxidase, citocromo P450 e vias

mitocondriais (MIZUNO; JACOB; MASON, 2010). Substâncias antioxidantes como a

superóxido dismutase (SOD), catalase e a glutationa peroxidase, o ácido ascórbico,

NADPH/NADP+ e NADH/NAD+ controlam os efeitos celulares deletérios das espécies

reativas de oxigênio (ANSELM et al., 2007; ANOZIE et al., 2007; CAMPANA et al., 2009).

O fator hiperpolarizante derivado do endotélio produz vasodilatação em resposta a

uma série de mediadores químicos como a acetilcolina e a bradicinina. Atualmente existem

possíveis fatores que seriam responsáveis por esse efeito: 1- epoxieicosanóides sintetizados a

partir do ácido araquidônico por uma isoforma do citocromo P450; 2 - propagação

eletrotônica da hiperpolarização do endotélio para o músculo liso vascular através de junções

intercelulares; 3 - K+ liberado do endotélio, que paradoxalmente hiperpolariza o músculo liso

vascular ao ativar canais de potássio retificadores de orientação interna (RANG et al., 2007;

CUNHA et al. 2013).

A prostaglandina I2 (PGI2), também conhecida como prostaciclina, por exemplo, é

produzida pelas células endoteliais a partir do ácido aracdônico e causa vasodilatação por

aumentar os níveis de AMPc, além de diminuir a agregação plaquetária. A PGI2 foi

descoberta em 1976 por Bunting, Gryglewski, Moncada e Vane e relaxa o músculo liso por

ativação da adenilato ciclase. Peptídeos vasoativos, como o perptídeo C natriurético, também

é secretado pelo endotélio e assim como a endotelina são importantes vasoconstrictores

(RANG et al., 2007).

O fator relaxante derivado do endotélio foi descoberto em 1980 por Furchgott e

Zawadzki e, posteriormente, associado à inibição da proliferação e migração de células

musculares lisas vasculares, a adesão leucocitária e a agregação plaquetária, além de mediar o

relaxamento da musculatura lisa vascular (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; RANG et al.,

2007).

Uma vasodilatação mais significativa é mediada por um componente do fator

relaxante derivado do endotélio, sintetizado a partir da L-arginina, o NO, que ativa a enzima

guanilato cliclase solúvel (GCs) aumentando a síntese de GMPc, que diminui a afinidade do

miofilamento de miosina ao cálcio. A produção de NO é estimulada pelo atrito do fluxo

sanguíneo nas células endoteliais ou pelo estímulo de algum agente vasodilatador como a

acetilcolina, ATP, bradicinina, serotonina, substância P e histamina. Existem dois tipos de

26

guanilato ciclase, a solúvel que é citosólica e a particulada que é uma proteína

transmembrana. Esta última também é capaz de sintetizar GMPc através da guanosina 5-

trifosfato, porém, ao invés de ser estimulada pelo NO, pequenos peptídeos hormonais, como o

fator atrial natriurético desempenham esse papel (Figura 3) (ZHAO et al., 2000;

TOUSOULIS et al., 2012).

Figura 3 - Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial.

Fonte: BRUNTON; CHABNER; KNOLLMAN, 2011.

27

1.3 Via do óxido nítrico

O NO é uma molécula de gás facilmente difundível através da membrana plasmática e

responsável pela regulação de diversos processos endógenos fisiopatológicos (Figura 4).

Inicialmente foi descoberto que as células endoteliais respondiam aos agentes vasodilatadores

produzindo um fator relaxante derivado do endotélio, que posteriormente foi constatado

possuir como principal bioativo o NO (MILLER; MEGSON, 2007).

Figura 4 - Efeitos cardiovasculares do óxido nítrico.

Fonte: MILLER; MEGSON, 2007.

A enzima responsável pela produção do NO é a óxido nítrico sintase (NOS) que pode

ser subdividida em três subtipos: induzível (iNOS), neuronal (nNOS) e endotelial (eNOS)

(Figura 5). A iNOS é constitutiva, já a eNOS e a nNOS são ativadas pelo aumento da

concentração de cálcio dentro da célula através do complexo cálcio-calmodulina, então o NO

estimula a GCs a produzir GMPc que por sua vez ativa a proteinocinase G (PKG) que

fosforila proteínas reduzindo a concentração de cálcio dentro da célula causando relaxamento

muscular (FÖRSTERMANN; SESSA, 2012; GARCIA; SESSA, 2019).

Células

inflamatórias Plaquetas

Endotélio

Células do músculo

liso vascular

↑↓ apoptose ↓ liberação citocinas ↓ adesão

↓ agregação ↓ adesão ↓ liberação mediadores

↑ vasodilatação ↓ proliferação ↓ migração

28

Figura 5 - Síntese de óxido nítrico pela célula endotelial.

Fonte: FÖRSTERMANN; SESSA, 2012.

A duração do NO é fugaz uma vez que reage facilmente com o oxigênio, espécies

reativas de oxigênio e com metais. A inibição da NOS é uma estratégia utilizada para inibir a

síntese de NO, a utilização de análogos da L-arginina que se liguem no mesmo sítio de

ligação são efetivos, porém essa inibição, geralmente, é inespecífica para as isoformas de

NOS (RUSSWURM; KOESLING, 2004; IGNARRO, 2019).

A GCs é um dos principais alvos biológicos do NO, pois possui maior sensibilidade à

essa substância, além de ser parte integrante do mecanismo de controle fisiológico da pressão

arterial fazendo a regulação do tônus do músculo liso vascular. Seu mecanismo envolve

inicialmente a descarga de acetilcolina no endotélio, causada por uma estimulação

parassimpática, causando um influxo de cálcio na célula endotelial e consequentemente

ativando a eNOS. Essa enzima então produz pequenas quantidades de NO que são suficientes

para que haja a difusão à musculatura lisa vascular e ativação da GCs, que por consequência

Plasticidade sináptica,

regulação da pressão arterial Neurotransmissão atípica, ereção

peniana

Defesa imune não específica Mediação inflamatória, choque

séptico

Vasodilatação, vasoproteção, prevenção de aterosclerose

Endotélio

Células nervosas

Células medulares

29

age catalizando a conversão de guanosina trifosfato (GTP) em GMPc. Finalmente, o GMPc

como segundo mensageiro ativa a proteinoquinase, que iniciam mecanismos de redução da

concentração intracelular de cálcio, resultando no relaxamento da musculatura lisa vascular.

(MARTIN et al., 2005; IGNARRO, 2009; BRUNTON; CHABNER; KNOLLMAN, 2011).

1.4 Fármacos doadores de óxido nítrico

Algumas substâncias usadas para causar o relaxamento da musculatura lisa são

capazes de doar NO através de mecanismos distintos, gerando moléculas de NO de natureza

diferentes, portanto com propriedades biológicas diferenciadas (IGNARRO, 2019).

A enzima aldeído redutase mitocondrial presente em grande quantidade no músculo

liso venoso, metaboliza a nitroglicerina em NO e possuindo grande potencial venodilatador,

principalmente, nas veias e artérias coronarianas gerando um efeito antiangionoso e uma

redução da pré-carga cardíaca. Outros nitratos orgânicos, como o dinitrato de isossorbida, não

atuam tão significativamente na agregação plaquetária como o NO. Apesar do efeito potente

da administração aguda de nitratos orgânicos, a infusão contínua causa tolerância,

provavelmente pela produção de espécies reativas de oxigênio inibindo a enzima aldeído

redutase mitocondrial (TARKIN; KASKI, 2016; DIVAKARAN; LOSCALZO, 2017).

Os nitritos orgânicos por sua vez não induzem a tolerância apresentada pelos nitratos,

mas também necessitam de ativação metabólica, apesar da enzima responsável ainda não ter

sido identificada. A combinação de nitritos orgânicos, como o nitrilo de amila, em conjunto

com inibidores de fosfodiesterase, como a sildenafila, pode causar uma hipotensão letal, dessa

forma os nitritos vêm sendo substituídos pelos nitratos, também por ser de mais fácil

administração (TARKIN; KASKI, 2016).

Em casos de hipertensão arterial aguda o nitroprussiato de sódio é utilizado por

promover vasodilatação em arteríolas e vênulas. A metabolização do nitroprussiato de sódio

produz cinco moléculas de cianeto e uma de NO. Para tratar a hipertensão pulmonar o próprio

NO pode ser utilizado de maneira inalatória, assim como nos casos de hipoxemia aguda e

reanimação cardiopulmonar. Porém, o NO reage com o oxigênio formando dióxido de

nitrogênio, que é um irritante pulmonar, além disso, o NO pode induzir a formação de

metemoglobina, molécula que possui Fe3+ no lugar de Fe2+ culminando na não ligação ao

30

oxigênio. Dessa forma, durante a administração de NO inalado os níveis de dióxido de

nitrogênio e metemoglobina devem ser monitorados (HOTTINGER et al., 2014).

Uma maneira alternativa para potencialização do efeito do NO é a inibição da enzima

que degrada o GMPc, a fosfodiaesterase. A sildenafila inibe a fosfodiesterase 5, prolongando

a ação do GMPc induzido pelo NO (SCHADE; KOTTHAUS; CLEMENT, 2010).

1.5 Metalofármacos

Drogas que liberam NO, assim como os nitratos e nitritos orgânico, foram sintetizados

com o objetivo de reverter a deficiência na síntese de NO pelo endotélio em pacientes com

doenças cardiovasculares. Atualmente, percebe-se um aumento nas publicações de potenciais

substâncias capazes de atuar na via do NO, sejam elas orgânicas ou derivadas de metais

(FRICKER, 2007; PRIVIERO; WEBB, 2010).

A utilização de compostos metálicos como fármacos possui várias vantagens como o

variável número de coordenação e geometrias, acessibilidade a diferentes estados redox,

características termodinâmicas e cinéticas particulares, assim como as propriedades

intrínsecas dos cátions metálicos e seus ligantes (BRUIJNINCX; SADLER, 2008;

HAMBLEY,2007; MEGGERS, 2009).

Substâncias que tenham a GCs como alvo, principalmente os compostos metálicos

nitrosilados, surgiram com o objetivo de serem liberadores de NO, especialmente em alvos

biológicos visando o relaxamento do músculo liso vascular (BERGAMO et al., 2007). Os

complexos de rutênio foram primeiramente divulgados na década de 50 (DWYER et al.,1952)

e desde então têm sido alvo de diversos outros estudos que evidenciam a liberação de NO,

assim como a baixa toxicidade e seu potencial terapêutico como antitumorais, antimaláricos e

como reguladores da pressão arterial (KARIDI et al., 2006, CAMPELO, et al, 2012;

EKENGARD et al., 2015).

Derivados de rutênio com ligantes piridínicos mostram uma ampla diversidade de

aplicações. Esses ligantes mostram uma estabilização satisfatória do centro metálico, assim

como um aumento da função redutora (CRAVER et al., 2010; CAO; SOLTAU et al., 2015;

ZHENG; CHEN, 2015; ZENG et al., 2016).

31

Os ligantes imidazólicos, apesar de sua estrutura simples, também têm sua importância

em relação aos demais radicais. Atualmente a aplicação medicinal desses compostos é

bastante variada atuando como antineoplásicos, antifúngicos, antiparasitários, anti-

histamínicos, antineuropáticos, bactericidas, anti-inflamatórios, antivirais e anti-hipertensivos

(Figura 6) (ANDERSON; LONG, 2010; EBEL et al., 2012; ZHANG et al., 2014).

Figura 6 - Compostos imidazólicos conhecidos.

Fonte: GOUVEIA-JÚNIOR, 2017.

Nos dias atuais complexos de rutênio têm sido largamente utilizados em pesquisas

com potencial efeito terapêutico, principalmente relacionado a via do NO (Figura 7). O

rutênio é o elemento com a maior capacidade de formar complexos nitrosilados, além de

apresentar baixa toxicidade e efeitos reguladores da pressão arterial, antitumorais e

antimaláricos (ALVES, 2018).

32

Figura 7 - Compostos derivados de rutênio utilizados em pesquisas.

Fonte: PAUWELS et al., 2016.

Um estudo anterior com o FOR811A mostrou que este composto foi capaz de relaxar a

musculatura lisa brônquica, em um modelo de asma em camundongos, assim como reduziu os

níveis de IL-4 (COSTA, 2018). Outra pesquisa, observou o efeito protetor do FOR811A na

função renal em modelo de lesão por isquemia reperfusão, além de efeito antioxidante e anti-

inflamatório (ALVES, 2018).

Em uma pesquisa com os complexos FOR011B e FOR811B foi evidenciado

alterações em parâmetros da hemodinâmica renal como: diminuição do ritmo de filtração

glomerular, aumento do fluxo urinário, diminuição do clearence osmolar, dos transportes

totais e proximais de eletrólitos. Somado a isso, o FOR811B também mostrou efeito protetor

na lesão induzida por isquemia/reperfusão renal (SILVA, 2018).

A partir desses dados, novas pesquisa vêm objetivando a pesquisa farmacológica com

compostos de rutênio, assim como outras pequenas moléculas que apresentem propriedades

químicas e farmacológicas biologicamente utilizáveis (GOUVEIA-JÚNIOR, 2017).

33

1.6 Justificativa

As doenças cardiovasculares são um dos maiores problemas de saúde pública no

mundo ocidental (LEVY et.al.,2002). Segundo dados da American Heart Association

(ROGER et al., 2011), a prevalência de infarto do miocárdio nos Estados Unidos situa-se em

3,1% na população com mais de 20 anos. No Brasil, as doenças cardiovasculares ainda

permanecem como a primeira causa de mortalidade proporcional, responsáveis por 29% dos

óbitos em 2010 e o infarto agudo do miocárdio se mantém persistentemente elevada: em

média, 16,2%, em 2000, 16,1%, em 2005, e 15,3%, em 2010. Apesar das doenças

cardiovasculares estarem diminuindo ao longo do tempo, ainda assim, é a enfermidade com a

maior taxa de mortalidade quando comparada a outras doenças crônicas não transmissíveis.

Assim, as doenças coronarianas têm um grande impacto financeiro sobre o sistema de saúde,

constituindo-se em cerca de 5% dos gastos com internação (SILVA et al., 2018).

A grande maioria dos complexos de rutênio são farmacologicamente interessantes por

serem estáveis, hidrossolúveis além de serem compostos com a maior capacidade de formar

complexos nitrosilados (CALANDRELLI; TFOUNI, 2005; FERREIRA; TFOUNI, 2010). Tal

fato torna esses compostos alvo de interesse visando sua utilização clínica na liberação de NO

e consequentemente no tratamento de doenças cardiovasculares como a hipertensão arterial

(CALANDRELLI; TFOUNI, 2005).

Atualmente nota-se um grande interesse por fármacos com a capacidade de liberar

NO, devido à sua importante ação fisiológica, patológica e farmacológica. Existem no

mercado substâncias orgânicas e inorgânicas empregadas no tratamento da hipertensão

arterial, mas sua utilização é limitada pelos seus efeitos colaterais. Portanto, é vantajosa a

realização de pesquisas com o objetivo de caracterizar a ação farmacológica de substâncias

com esse potencial (GOUVEIA-JÚNIOR, 2017).

Este trabalho é uma parceria com o grupo de pesquisa Bioinorgânica do Departamento

de Química Orgânica e Inorgânica da UFC que tem como objetivo estudar possíveis

moléculas de rutênio com o ligante nitrosil, que sejam capazes de atuar na via do NO e que

possuam potenciais biológicos para serem utilizados como metalofármacos. Portanto, optou-

se pelos complexos FOR011B e FOR 811B já que possuem efeitos promissores previamente

relatados e por possuírem ligantes imidazólicos, já que são amplamente utilizados com

sucesso na prática clínica.

34

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito farmacológico de complexos de rutênio com ligantes 2-

imidazolidinetiona na reatividade vascular in vitro e da interação fármaco-receptor in silico.

2.2 Objetivos Específicos

Verificar o efeito dos complexos de rutênio na reatividade vascular e definir a CE50.

Analisar a influência do endotélio vascular no efeito dos complexos de rutênio.

Investigar a participação da via do óxido nítrico/guanilato ciclase solúvel no efeito dos

complexos de rutênio.

Verificar a influência dos sequestradores de óxido nítrico no efeito dos complexos de

rutênio.

Avaliar a influência dos canais de potássio no efeito dos complexos de rutênio.

Verificar a participação da via da ciclooxigenase no efeito dos complexos de rutênio.

Observar a participação da via IP3K no efeito dos complexos de rutênio.

Avaliar a influência da adenilato ciclase no efeito dos complexos de rutênio.

Verificar a participação do cálcio no efeito dos complexos de rutênio.

Determinar a concentração de GMPc nas amostras de tecido vascular.

Caracterizar a interação fármaco-receptor dos complexos de rutênio através da técnica

de docking macromolecular.

35

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Aspectos éticos

O projeto de pesquisa intitulado de “Efeito farmacológico de complexos de rutênio

com ligantes 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular in vitro e da interação fármaco-

receptor in silico.” foi submetido a avaliação de um Comitê de Ética em Pesquisa Animal

(CEPA) e executado após aprovação número 03/2016 (ANEXO A). Neste estudo foram

seguidas as normas de boas práticas indicadas para a realização de pesquisas que envolvem o

uso de animais experimentais de acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA) e de acordo com a Lei nº 11794 da Diretriz brasileira para o cuidado e a utilização

de animais para fins científicos e didáticos (DBCA).

3.2 Animais

Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus, var. albinus, Rodentia, Mammalia) da

linhagem Wistar, machos e sadios, pesando de 200 a 250 gramas, provenientes do Biotério

Central da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os ratos foram previamente avaliados para

exclusão de doenças e ficaram alojados no biotério de manutenção do Núcleo de Pesquisa e

Desenvolvimento de Medicamentos (NPDM) da UFC, mantidos em ciclo claro/escuro

(12/12h), a uma temperatura de 25ºC, em gaiolas coletivas convencionais de polipropileno

com tampa de metal, com divisórias para ração e água. Cada gaiola abrigou quatro ratos, aos

quais foram fornecidos ração e água ad libitum.

3.3 Local de realização do estudo

O estudo foi realizado no Laboratório de Farmacologia Pré-clínica (LFPC) integrante

do NPDM – Faculdade de Medicina – UFC, em Fortaleza-Ceará, o qual possui infra-estrutura

necessária para realização dos experimentos.

36

3.4 Metalofármacos

Nessa pesquisa foram utilizados dois metalofármacos sintetizados pelo grupo de

pesquisa Bioinorgânica do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da UFC, o

FOR011B e o FOR811B (Figura 08) (GOUVEIA-JÚNIOR, 2017). Também foram utilizados

os radicais isolados (L11B e 000) dos metalofármacos para verificar seu efeito separadamente

comparado ao da molécula total (Figura 9).

Figura 8 - Estruturas moleculares dos metalofármacos FOR011B e FOR811B.

Fonte: GOUVEIA-JÚNIOR, 2017.

Figura 9 - 000 (vermelho) e L11B (verde).

Fonte: GOUVEIA-JÚNIOR, 2017 (adaptado).

37

3.5 Estudo in vitro

3.5.1 Técnica cirúrgica

Para realização do estudo foi realizado experimento de tensão isométrica utilizando a

artéria aorta de ratos no equipamento de banho de órgãos isolado. Os animais foram

anestesiados com cetamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) e o sacrifício foi realizado por

exsanguinação dos vasos cervicais.

Depois do sacrifício, o rato foi colocado em decúbito dorsal com as patas fixadas para

permitir livre acesso ao tórax e abdômen. Com uma tesoura, foi realizada uma incisão no

abdômen, logo abaixo do músculo diafragma para permitir acesso à cavidade torácica. Com a

secção da musculatura diafragmática e a exposição dos órgãos torácicos foi realizado o

piçamento da região superior da aorta que foi seccionada em toda a sua extensão com o

auxílio de uma tesoura (Figura10).

O fragmento de aorta retirado foi colocado em uma placa de Petri submerso em

solução de Krebs-Henseleit para limpeza do tecido sem que houvesse lesão tecidual. Logo em

seguida foram desprezadas as extremidades do vaso e a artéria foi dividida em 4 anéis de

aproximadamente 4 milímetros cada. Estes montados em clipes triangulares ligados a um

gancho metálico através de fios de algodão não elásticos (Figura11).

Foram preparadas duas soluções de Krebs-Henseleit, com cálcio (NaCl: 118,0

mmol/L; KCl: 4,7 mmol/L; KH2PO4: 1,2 mmol/L; MgSO4.7H2O: 1,2 mmol/L; NaHCO3:

15,0 mmol/L; CaCl2: 2,5 mmol/L e Glicose: 5,5 mmol/L) (HIPÓLITO et al., 2009;

HIPÓLITO et al., 2011) e sem cálcio que tiveram o pH ajustado para 7,4 com solução de

ácido acético.

38

Figura 10 – Procedimento de retirada da aorta.

Fonte: CUNHA, 2012.

1: Animal em decúbito dorsal com exposição de órgãos. 2: Aorta. 3: Retirada da aorta torácica.

39

Figura 11 – Preparação dos anéis de aorta.

Fonte: CUNHA, 2012.

1 e 2: Lavagem da aorta torácica em solução de Krebs-Henseleit.

3 e 4: Retirada do tecido conectivo e secção da aorta em anéis.

5 e 6: Colocação dos anéis aórticos em clipes metálicos.

40

3.5.2 Montagem e estabilização dos anéis de aorta

Os anéis de aorta foram levados montados em cubas no equipamento de banho de

órgãos preenchidas com 10ml de solução de Krebs-Henseleit e submersas em água destilada à

37ºC e aeradas com carbogênio (95% de Oxigênio (O2) e 5% de dióxido de carbono (CO2).

Os anéis eram fixados em haste de metal de modo que o gancho metálico ficasse posicionado

em um sensor de força (Figura 12).

Figura 12 – Experimento de reatividade vascular.

Fonte: CUNHA, 2012.

1: Banho de órgãos.

2: Cuba de 10 mL contendo anel aórtico aerado por carbogênio.

3: Ajuste da tensão do fio de algodão.

4: Cilindro de carbogênio.

41

A tensão dos anéis foi mensurada por um transdutor de força (Force Transducer,

MLT0201, ADInstruments, Spain), e o sinal amplificado (Quad Bridge Amp, ML224,

ADInstruments, Australia) e transmitido para um conversor analógico-digital (Power Lab,

ML8661P, 4130, ADInstruments, Australia), e finalmente registrado por um computador para

captação temporal da tensão pelo software de aquisição e processamento de dados (LabChart

8.0 for Windows, ADInstruments, Australia) (Figura 13).

Figura 13 – Equipamentos.

Fonte: CUNHA, 2012.

1: Sensor de tensão.

2: Termostato para controle de temperatura.

3: Amplificador de sinais.

4: Conversor analógico-digital.

5: Software para registro temporal da tensão.

6: Banho de órgãos.

42

Os fragmentos foram submetidos a um período de estabilização de 60 minutos, onde a

tensão basal era constantemente ajustada para 10 mili Newtons (mN) (HIPÓLITO et al.,

2009) e a solução de Krebs-Henseleit das cubas trocada a cada 15 minutos.

3.5.3 Teste de viabilidade dos anéis de aorta

Após os 60 minutos de estabilização foram realizados os testes de viabilidade dos

fragmentos de aorta através da contração do tecido. Inicialmente foi adicionado cloreto de

potássio (KCl) a 60mmol/l objetivando uma contração mínima de 70% acima da tensão basal

(ESTRADASOTO et al., 2010). Em seguida foram realizadas 5 lavagens dos anéis de aorta

com solução de Krebs-Henseleit e após 5 minutos adicionada a fenilefrina (PHE) a 1 µmol/l

(SOARES, 2008; CHEN et al., 2009), seguida pela adição de acetilcolina (ACh) a 10 µmol/l

(WONGSAWATKUL et al., 2008; CHEN et al., 2009). Os anéis que apresentaram

relaxamento maior ou igual a 80% após a adição de ACh eram considerados fragmento com

endotélio íntegro. Em alguns protocolos foi realizada a retirada mecânica do endotélio com

um clipe de metal no interior do vaso que era rolado na placa de Petri, nesses casos foi

considerado um relaxamento inferior ou igual a 10% (BRITO et al., 2017; ENGHOLM et al.,

2016). Para avaliar a integridade do endotélio vascular foi utilizada a fórmula a seguir

(CUNHA, 2012).

:

3.5.4 Análise inicial do efeito relaxante dos metalofármacos em anéis de aorta de ratos.

Esta etapa inicial teve como objetivo avaliar os efeitos relaxantes dos metalofármacos,

assim como verificar se estes são dependentes da concentração. Foi realizada a comparação

com os controles (nitroprussiato de sódio (SNP) e BAY 41-2272) e com os ligantes isolados

da molécula (000 e L11B).

Foram realizadas contrações mantidas com PHE (1 µmol/L) e KCl (60 mmol/L) onde

foram adicionadas concentrações crescentes e cumulativas dos compostos até a obtenção do

relaxamento máximo. Foram utilizadas as seguintes concentrações: FOR011B (10-8 a 3x10-5

43

M), FOR811B (10-8 a 3x10-5 M), L11B (10-8 a 3x10-5 M), 000 (10-8 a 3x10-5 M), SNP (3x10-11

a 6x10-8 M), BAY-41-2272 (10-8 a 3x10-5 M). Neste experimento foram utilizadas diferentes

preparações de aorta de rato (n = 8, para os metalofármacos FOR011B e FOR811B; n = 6

para os controles SNP e BAY 41-2272 e para os ligantes 000 e L11B) (Figura 14). Como

controle utilizou-se água destilada, veículo para diluição dos metalofármacos estudados.

Figura 14 - Linha do tempo do protocolo de análise inicial do efeito relaxante dos

metalofármacos em anéis de aorta de ratos.

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

3.5.5 Protocolos experimentais

3.5.5.1 Participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Antes da montagem no miógrafo, os fragmentos tiveram o endotélio removido através

da da rolagem em placa de Petri utilizando com grampo metálico. Foram considerados vasos

sem endotélio funcional, os vasos cuja vasodilatação induzida pela acetilcolina forem menor

que 10% da vasoconstrição causada pelo KCl (JADHAV et al., 2012; BRITO et al., 2017).

Após a confirmação de endotélio não funcional, foi avaliado o efeito vasodilatador dos

FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) (n=8) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (n=8) após vasoconstrição

causada por KCl 60 mM (n=8) ou PHE 1 µM (n=8) (Figura 15). Este procedimento foi

realizado para verificar se a vasodilatação causada pelos metalofármacos é endotélio-

dependente.

44

Figura 15 - Linha do tempo de participação do endotélio vascular no efeito vasodilatador dos

metalofármacos.


3.5.5.2 Participação do óxido nítrico no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com L-NAME (n=6),

hidroxicobalamina (HCB) (n=6) e L-cisteína (LCIS) (n=6) por 30 minutos seguida de

contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o

FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 16) (BRITO, 2015).

Figura 16 - Linha do tempo do protocolo de participação do óxido nítrico no efeito

vasodilatador dos metalofármacos.


3.5.5.3 Participação da guanilato ciclase solúvel no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com ODQ (1H-

[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com

PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a

45

3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M) (Figura 17) (FRANÇA-SILVA et al., 2012;

ALSULEIMANI, HILEY, 2013; BRITO et al., 2017).

Figura 17 - Linha do tempo do protocolo de participação da guanilato ciclase solúvel no efeito



3.5.5.4 Participação dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com atropina (ATR) (n=6)

por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma

curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M)

(Figura 18) (CUNHA, 2012).

Figura 18 - Linha do tempo do protocolo de participação dos receptores muscarínicos no

efeito vasodilatador dos metalofármacos.


46

3.5.5.5 Influência da inibição não seletiva dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos

metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com tetraetilamônio (TEA)

(n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada

uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M)

(Figura 19) (BRITO et al., 2017; CUNHA et al., 2013).

Figura 19 - Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio não seletivos

no efeito vasodilatador dos metalofármacos.


3.5.5.6 Participação dos canais de potássio voltagem dependentes no efeito vasodilatador dos

metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com 4-aminopiridina (4-

AP) (n=6) por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi

realizada uma curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (Figura

20) (10-8 a 3x10-5 M) (BRITO et al., 2017; CUNHA et al., 2013).

47

Figura 20 - Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio voltagem

dependentes no efeito vasodilatador dos metalofármacos.


3.5.5.7 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito vasodilatador dos

metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com glibenclamida (GLIB)



(Figura 21) (BRITO et al., 2017; CUNHA et al., 2013).

Figura 21 - Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de potássio dependentes

de ATP no efeito vasodilatador dos metalofármacos.


3.5.5.8 Participação dos prostanóides no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com indometacina (INDO)


48



Figura 22 - Linha do tempo do protocolo de participação dos prostanóides no efeito



3.5.5.9 Participação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos

metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com wortmanina (WORT)




Figura 23 - Linha do tempo do protocolo de participação do fosfatidilinositol 3-quinase

(PI3K) no efeito vasodilatador dos metalofármacos.


49

3.5.5.10 Participação da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Os fragmentos com endotélio íntegro foram pré incubados com MDL 12,330A (n=6)

por 30 minutos seguida de contração com PHE 1 µM. Após 25 minutos foi realizada uma

curva de relaxamento com o FOR011B (10-8 a 3x10-5 M) e o FOR811B (10-8 a 3x10-5 M)

(Figura 24) (ANDRADE et al., 2015).

Figura 24 - Linha do tempo do protocolo de participação da via do AMPc no efeito



3.5.5.11 Participação dos canais de cálcio no efeito vasodilatador dos metalofármacos.

Este protocolo tem o objetivo de verificar a influência do efeito vasodilatador dos

metalofármacos no influxo de cálcio através de canais de cálcio dependentes de receptor após

a depleção do cálcio intracelular.

Após a estabilização foram realizadas seis lavagens com solução de Krebs-

Henseleit sem cálcio, em seguida foi adicionado às cubas o EGTA (Ethylene glycol-bis(2-

aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid ) (1 mmol/l) um quelante dos íons de cálcio que

permaneceu por 15 minutos. Em sequência foi adicionada PHE 1 µM que permaneceu por

mais 30 minutos junto ao EGTA. Foram realizadas mais seis lavagens com solução de Krebs-

Henseleit sem cálcio e acrescentado o EGTA (1 mmol/l) mais uma vez que permaneceu por

15 minutos e foi retirado com três lavagens com solução de Krebs-Henseleit sem cálcio. Em

seguida foi adicionada a PHE 1 µM e os metalofármacos nas primeiras doses correspondentes

ao efeito máximo, FOR011B (5,6x10-7 M) (n=6) e o FOR811B (3,16x10-6 M) (n=6), então foi

50

realizada uma curva com cloreto de cálcio (CaCl2 - 0,01 a 3 mM) (CUNHA et al., 2013; HOE

et al., 2011).

Figura 25: Linha do tempo do protocolo de participação dos canais de cálcio no efeito



3.6 Dosagem de GMPc por ELISA

A concentração de GMPc foi determinada em anéis de aorta previamente

montados no banho de órgãos, onde passaram por um protocolo de pré-contração com

Fenilefrina 1 µM na presença ou ausência de ODQ, com posterior adição de água (Controle),

ou de um dos complexos de rutênio. A concentração de metalofármaco utilizada foi

equivalente a menor concentração capaz de causar efeito vasodilatador máximo. Os grupos

tratados ficaram incubados no banho de órgãos tempo suficiente para vasodilatação completa,

no grupo Controle ou nos grupos na presença de ODQ, onde não houve vasodilatação,

esperou-se tempo similar aos grupos tratados. Após esse tempo, o tecido e uma amostra da

solução de Krebs foram coletados, congelados em nitrogênio líquido, e posteriormente

armazenados em freezer -80º C.

No dia da análise, foram feitos homogenatos dos anéis de aorta em ácido

tricloroacético 5%, em uma concentração de 10 mg de tecido/mL, após isso as amostras foram

centrifugadas por 10 minutos, 1500g, 4º C. O sobrenadante foi utilizado para a dosagem,

51

entretanto foi realizado ainda um processo de retirada do ácido tricloroacético com éter

saturado de água, conforme recomendações do fabricante do kit.

Para tanto, foi utilizado um Kit para determinação quantitativa de GMPc

utilizando um ensaio imunoenzimático competitivo (Cayman Chemical®, Michigan, EUA). A

dosagem consistiu na utilização de uma placa de 96 poços sensibilizada com anticorpo

monoclonal de Coelho anti-IgG, onde foram adicionadas as amostras ou padrões, uma solução

contendo GMPc complexado a acetilcolinesterase (AChE) e um anticorpo (IgG) específico

para GMPc, assim o GMPc da amostra e o GMPc complexado a AChE competiram pelo

anticorpo específico, que se ligaram ao anticorpo monoclonal anti-IgG na superfície da placa.

Após 18 horas de incubação a uma temperatura de 4º C, foi feita a lavagem da placa e foi

incubado o reagente de Ellman, um substrato da AChE cujo produto da reação enzimática tem

uma coloração amarela, que foi lida em 405 nm, sendo a intensidade da cor é inversamente

proporcional à concentração de GMPc na amostra. A curva padrão foi obtida por regressão

não linear utilizando uma função logística de 4 parâmetros, cuja equação foi utilizada para

determinar a concentração das amostras.. Os resultados foram expressos em pmol/mg de

tecido.

3.7 Docking Molecular

As estruturas dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B foram construídas

utilizando o software MarvinSketch® v.19.10 (ChemAxon, Hungria). Estas foram otimizadas

através do software Avogadro® v.1.2.0 (HANWELL et al., 2012), configurado para utilizar o

campo de força Merck Molecular Force Field (MMFF94) (HALGREN et al., 1996).

As estruturas proteicas selecionadas foram obtidas através do repositório RCSB

Protein Data Bank (PDB, https://www.rcsb.org/). A estrutura proteica do domínio H-NOX β1

da GCs foi obtida sob o código “2O09”, nomeada como “estrutura cristalina do domínio H-

NOX da Nostoc sp. PCC 7120”, classificada como proteína de sinalização, sistema de

expressão Escherichia coli BL21(DE3) e organismo Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG

25.82 / UTEX 2576) (MA et al., 2007). Já a estrutura proteica do domínio H-NOX β1

oxidado da GCs e do cinaciguat foi obtida sob o código “3L6J”, nomeada como “estrutura do

cinaciguat (BAY 58-2667) ligada ao domínio H-NOX de Nostoc”, classificada como proteína

https://www.rcsb.org/

52

de sinalização, sistema de expressão Escherichia coli e organismo Nostoc sp. (strain PCC

7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) (MARTIN et al., 2010).

Os resíduos presentes no arquivo PDB da H-NOX ou cinaciguat foram removidos

utilizando a interface gráfica do software AutoDockTools® - ADT v.1.5.6 (MORRIS et al.,

2009) para que o docking molecular ocorresse sem interferência de outros compostos

químicos. Em seguida, tanto para os ligantes (FOR011B ou FOR811B) quanto para as

proteínas (H-NOX reduzida ou H-NOX oxidada), adicionou-se hidrogênios polares (Kollman)

e cargas parciais (Gasteiger).

O procedimento de docking molecular foi realizado por meio do código HEX®

8.0.0 (RITCHIE; KEMP, 2000) configurado para OPLS Minimisation. Para avaliação dos

resultados, considerou-se a localização e geometria de mais baixo valor de energia livre total.

As interações do ligante com os resíduos de aminoácidos foram visualizadas no software

UCSF Chimera® 1.13.1 (PETTERSEN et al., 2004).

3.8 Fármacos e Diluições

Todos os reagentes utilizados nessa pesquisa foram adquiridos da empresa Sigma

Aldrich® (USA). No preparo das soluções dos metalofármacos foi utilizada água destilada

como solvente, assim como nas soluções de KCl, PHE, ACH, L-NAME, TEA, 4-AP, WORT,

SNP, BAY, MDL e ATR. As soluções de ODQ e GLIB usaram o dimetilsulfóxido (DMSO)

como solvente e a INDO foi solubilizada em uma solução aquosa de NaHCO3 a 5%. Não

foram realizados experimentos controle com os diluentes já que suas concentrações na cuba

eram mínimas e haver a comprovação de ausência de atividade biológica dessas substâncias

(LIMA-ACCIOLY et al., 2006; HIPÓLITO et al., 2009; HIPÓLITO et al., 2011).

3.9 Análise Estatística

Nos ensaios de relaxamento da musculatura lisa vascular, o efeito relaxante (R) das

substâncias foi calculado, para cada concentração, em função da máxima contração

proporcionada pelo agonista, sendo normalizado e expresso em termos percentuais, conforme

a seguinte expressão:

53

onde TA e TS são, respectivamente, as tensões decorrentes da ação do agonista e de uma dada

substância.

Em seguida, realizou-se a transformação logarítmica (base 10) das concentrações,

molar ou µg/mL. Os gráficos foram então elaborados a partir dos valores médios da

magnitude do efeito vasodilatador, ou vasoconstritor, calculados para cada concentração da

substância (após transformação logarítmica). Tais dados foram usados para construir as

curvas concentração-efeito mediante o uso de análise de regressão não linear. Para tanto,

tomou-se como base o modelo que utiliza uma função sigmoide do tipo:

onde y corresponde à medida da resposta (efeito relaxante), x ao logaritmo decimal da

concentração, a à resposta mínima e b à resposta máxima. A CE50 é definida como a

concentração da substância que produz 50% da resposta máxima ou a resposta semimáxima,

ou seja, é o valor da concentração que corresponde ao ponto médio entre a resposta mínima e

a máxima. O Emax pode ser definido como a máxima resposta proporcionada por uma

determinada substância.

A maioria dos resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM)

com a representação do número de observações experimentais (n). A CE50 foi expressa como

média e o intervalo de confiança de 95% (IC95%). Comparações entre dois grupos foram

realizadas através do teste t de para dados não emparelhados, enquanto para comparações

entre três grupos ou mais utilizou-se a análise de variância (ANOVA) associada ao pós-teste

de comparações múltiplas de Tukey. Em todas as análises, estabeleceu-se o nível de

significância em 0,05 (5%), ou seja, consideraram-se estatisticamente significantes valores de

P menores que 0,05.

O software GraphPad Prism® versão 7.00 para Windows® (GraphPad Software, San

Diego, California, USA, 2016) foi utilizado para a realização dos procedimentos estatísticos e

elaboração dos gráficos.

54

4 RESULTADOS

4.1 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

O FOR011B causou uma vasodilatação em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-

contraídos com PHE 1 µM de maneira dose dependente. A CE50 do FOR011B foi 9,89 x 10-2

µM (IC95%: 7,38 x 10-2 – 13,2 x 10-2), enquanto seu Emax foi 110,95%±1,964. Os dois

controles positivos SNP e BAY 41-2272 tiveram um Emax de 105,4%±0,4882 e

107,1%±0,9323, respectivamente. Não foram encontradas diferenças estatisticamente

significantes entre os Emax do FOR011B, SNP e BAY 41-2272. Os precursores estruturais do

FOR011B (000 e L11B) causaram uma vasodilatação nas mesmas condições. O 000 teve uma

CE50 de 6,16 x 10-1 µM (IC95%: 2,88 x 10-1 – 13,5 x 10-1) e um Emax de 58,96%±2,995,

enquanto o L11B teve uma CE50 de 7,27 x 10-1 µM (IC95%: 24,2 x 10-1) e um Emax de

49,1%±4,441. O FOR011B, assim como o SNP e o BAY 41-2272, tiveram um Emax

significativamente maior do que os dois precursores 000 e L11B (P<0,001) (Gráfico 1). Não

foi possível calcular a CE50 dos controles positivos com precisão, entretanto pode-se afirmar

que ambos tiveram uma CE50 menor que o FOR011B.

55

Gráfico 1 - Efeito do metalofármaco FOR011B (n=8), de seus precursores estruturais (000 e

L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta com endotélio íntegro

pré-contraídos com PHE 1 µM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

S N P

B A Y 4 1 -2 2 7 2

0 0 0

L 1 1 B

F O R 0 1 1 B

* * *

F e n ile fr in a

Fonte: Dados da pesquisa

Dados expressos como média e erro padrão da média.

*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos SNP, BAY 41-2272 e FOR011B, com

relação aos grupos 000 e L11B (P<0,001).

56

Em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM, o efeito

vasodilatador do FOR011B foi muito discreto, tendo um Emax de 23,08%±1,667 e uma CE50

de 3,44 x 10-1 µM (IC95%: 0,59 x 10-1 – 45,7 x 10-1). Os controles positivos SNP e BAY 41-

2272 tiveram um Emax de 92,61%±0,963 e 94,36%±2,032, respectivamente. O Emax do

FOR011B foi significativamente menor que o Emax dos dois controles positivos (P<0,001).

Com relação aos precursores estruturais (000 e L11B), foram obtidos Emax de 7,55%±0,5471 e

11,34%±1,045, respectivamente. Ambos os precursores tiveram uma eficácia

significativamente menor que o FOR011B (P<0,001) (Gráfico 2).


L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (N=6) em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

S N P

B A Y 4 1 -2 2 7 2

0 0 0

L 1 1 B

F O R 0 1 1 B

***

***

+ + +

K C l



*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos FOR011B, 000 e L11B, em relação aos

grupos SNP e BAY 41-2272 (P<0,001).

+++ indica diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo FOR011B com relação aos grupos 000 e

L11B (P<0,001).

57

O gráfico 3 mostra a comparação entre o efeito vasodilatador do FOR011B em anéis

de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM e com PHE 1 µM. Observou-

se que o Emax do FOR011B em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM foi significativamente

maior que em artérias pré-contraídas com KCl 60 mM (P<0,001).

Gráfico 3 - Comparação entre os efeitos do FOR011B em anéis de aorta pré-contraídos com

KCl 60 mM (n=8) e com PHE 1 µM (n=8).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

P H E

K C l***



*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo PHE em relação ao grupo KCl (P<0,001).

58

4.2 Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

O FOR811B causou uma vasodilatação em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-

contraídos com PHE 1 µM de maneira dose dependente. A CE50 do FOR811B foi 2,16 x 10-1

µM (IC95%: 1,71 x 10-1 – 2,72 x 10-1), enquanto seu Emax foi 110,3%±2,019. O SNP e o BAY

41-2272 tiveram um Emax de 105,4%±0,488 e 107,1%±0,932 respectivamente. Não foram

encontradas diferenças estatisticamente significativas do Emax do FOR811B em relação aos

controles positivos em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM. Com relação aos precursores

estruturais, o 000 teve um Emax de 58,96%±2,995, enquanto o L11B teve um Emax de

49,1%±4,441. Os dois precursores tiveram um Emax significativamente menor que o FOR811B

e que os dois controles positivos (SNP e BAY 41-2272) (P<0,001) (Gráfico 04). Não foi

possível calcular a CE50 dos controles positivos com precisão, entretanto pode-se afirmar que

ambos tiveram uma CE50 menor que o FOR811B.



íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

S N P

B A Y 4 1 -2 2 7 2

0 0 0

L 1 1 B

F O R 8 1 1 B

***

F e n ile fr in a



*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos SNP, BAY 41-2272 e FOR811B,

quando comparados aos pares com os grupos 000 e L11B (P<0,001).

59

O FOR811B também teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM, entretanto foi observado um Emax de apenas

62,91%±4,142 e uma CE50 de 5,756 µM (IC95%: 3,559 – 9,462). O Emax do FOR811B foi

significativamente menor que o Emax encontrado para o SNP e o BAY 41-2272 (P<0,001),

quais foram 92,61%±0,9632 e 94,36%±2,032, respectivamente. Os grupos 000 e L11B

tiveram um Emax de 7,55%±0,5471 e 11,34%±1,045, respectivamente, sendo ambos

significativamente menores que o Emax do FOR811B (P<0,001) (Gráfico 5).



íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

S N P

B A Y 4 1 -2 2 7 2

0 0 0

L 1 1 B

F O R 8 1 1 B

***

***

+ + +

K C l



*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax dos grupos FOR811B, 000 e L11B, em relação aos

grupos SNP e BAY (P<0,001).

+++ indica diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo FOR811B, em relação aos grupos 000 e

L11B.

60

O gráfico 6 mostra a comparação entre o efeito do FOR811B em artérias pré-

contraídas com KCl 60 mM e em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM. Observou-se um

Emax significativamente maior em artérias pré-contraídas com PHE 1 µM (P<0,001).

Gráfico 6 - Comparação entre os efeitos do FOR811B em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com KCl (n=8) e com PHE (n=8).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

P H E

K C l

***



*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax do grupo PHE em relação ao grupo KCl (P<0,001).

61

O Gráfico 7 mostra os efeitos vasodilatadores dos dois metalofármacos (FOR011B e

FOR811B) em anéis de aorta pré-contraídas com PHE 1 µM e com KCl 60 mM. Pode-se

observar que o Emax dos dois fármacos em artérias pré-contraídas com PHE foi

significativamente maior que o Emax dos mesmos em artérias pré-contraídas com KCl

(P<0,001). Observou-se ainda que o FOR811B em artérias pré-contraídas com KCl teve um

Emax maior que o FOR011B em artérias também pré-contraídas com KCl (P<0,001). Não

foram observadas diferenças significativas com relação ao Emax ou CE50 dos dois fármacos em

artérias pré-contraídas com PHE.

Gráfico 7 - Comparação entre os efeitos do FOR811B e FOR011B em preparações de aorta

com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE (n=8) e com KCl (n=8).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

F O R 8 1 1 B - P H E

F O R 8 1 1 B - K C l

F O R 0 1 1 B - P H E

F O R 0 1 1 B - K C l

***+ + +

***+ + +

# # #



*** denota diferença estatisticamente significante do Emax em relação ao grupo FOR811B – PHE (P<0,001);

+++ indica diferença estatisticamente significante do Emax em relação ao grupo FOR011B – PHE (P>0,001);

### denota diferença estatisticamente significante do Emax quando comparado ao grupo FOR011B – KCl

(P<0,001).

62

O gráfico 8 mostra os efeitos vasodilatadores dos dois controles positivos (BAY 41-

2272 e SNP) em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM ou

Fenilefrina 0,1 µM. Observou-se uma diminuição do Emax de ambos os controles em

preparações contraídas com KCl, quando comparadas às preparações contraídas com PHE

(P<0,001).

Gráfico 8 – Efeito vasodilatador do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em anéis de aorta

com endotélio íntegro pré-contraídos com KCl 60 mM (n=6) e PHE 1 µM (n=6).

- 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

l o g [ ] ( M )

Re

lax

am

en

to

(%

)

S N P - P H E

B A Y - P H E

S N P - K C l

B A Y - K C l

* * *



*** denota diferença significativamente estatística do Emax dos grupos SNP-KCL e BAY-KCl em relação aos

grupos SNP-PHE e BAY-PHE.

63

A tabela 1 resume todos os dados dos metalofármacos (FOR011B e FOR811B), dos

precursores (000 e L11B) e dos controles positivos (SNP e BAY 41-2272) em anéis de aorta

com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM e com KCl 60 mM.

Tabela 1 - Efeito vasodilatador do FOR011B (n=8), FOR811B (n=8), de seus precursores

estruturais (000 e L11B) (n=6), do SNP (n=6) e do BAY 41-2272 (n=6) em preparações de

aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE ou com KCl.

Preparações pré-contraídas com PHE

Grupo

pCE50* Emax

Média EPM Média EPM

SNP 2,689 1,915 105,40% 0,488

BAY 41-2272 5,208 185,267 107,08% 0,932

FOR011B 1,005 0,068 110,95%a 1,964

FOR811B 0,665 0,054 110,33%a 2,019

L11B 0,139 0,222 49,10%b 4,441

000 0,210 0,136 58,96%b 2,995

Preparações pré-contraídas com KCl

Grupo

pCE50* Emax


SNP 1,194 0,048 92,61%b 0,963

BAY 41-2272 0,117 0,049 94,36%b 2,032

FOR011B 0,463 0,231 23,08%c,d,e,f 1,667

FOR811B -0,760 0,095 62,91%c,d,f 4,142

L11B -0,068 0,231 11,34%c 1,045

000 0,443 0,256 7,55%c 0,547


64 Dados expressos como média e erro padrão da média (EPM).

* pCE50 = -logCE50

a denota diferença estatisticamente significante em relação aos grupos L11B e 000 (PHE) (P<0,001)

b denota diferença estatisticamente significante quando comparados aos grupos SNP e BAY 41-2272 (PHE)

(P<0,001)

c indica diferença estatisticamente significativa em relação aos grupos SNP e BAY 41-2272 (KCl) (P<0,001)

d indica diferença estatisticamente significante em relação aos grupos L11B e 000 (KCl) (P<0,001)

e indica diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo FOR0811B (KCl) (P<0,001)

f indica diferença estatisticamente significante quando comparado aos grupos FOR011B (PHE) e FOR0811B

(PHE) (P<0,001)

65

4.3 Influência do endotélio no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e

FOR811B em anéis de aorta pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

O FOR011B causou um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio desnudo

pré-contraídos com PHE 1 µM, cujo Emax observado foi 112,2%±1,678 e CE50 foi 45,6 x 10-2

µM (IC95%: 40,8 x 10-2 – 50,8 x 10-2). Observou-se, no grupo com endotélio desnudo, um

aumento da CE50 (P<0,001) quando comparados com o grupo com endotélio íntegro (Gráfico

9).

Gráfico 9 - Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=8) e desnudo

(E-) (n=8) pré-contraídos com PHE 1 µM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

E +

E -

+ + +

F e n ile fr in a



+++ indica diferença estatisticamente significante entre o logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

66

Assim como no grupo com endotélio íntegro, o FOR011B causou apenas um

vasorrelaxamento discreto em anéis de aorta com endotélio desnuto pré-contraídos com KCl

60 mM. Foi observado um Emax de 32,31%±1,897 no grupo com endotélio desnudo (Gráfico

10).

Gráfico 10 - Efeito do FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro (E+) (n=6) e

desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM.

- 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

l o g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to

(%

)

E +

E -

K C l



67

Com relação ao efeito do FOR811B em anéis de aorta com endotélio desnudo pré-

contraídos com PHE 1 µM, foi observado um Emax de 128,2%±2,347 e uma CE50 de 1,91 x 10-

1 µM (IC95%: 1,49 x 10-1 – 2,43 x 10-1). Assim, o Emax do grupo com endotélio desnudo foi

significativamente maior que o grupo com endotélio íntegro (P<0,001), enquanto não houve

diferença estatisticamente significativa na CE50 dos dois grupos (Gráfico 11).


desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com PHE 1 µM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

E +

E -

***

F e n ile fr in a



*** denota diferença estatisticamente significante do Emax em relação do grupo E+ (p<0,001);

68

O FOR811B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio desnudo

pré-contraídos com KCl 60 mM. O Emax observado nessas artérias foi 88,99%±2,372 e a CE50

foi 1,032 µM (IC95%: 0,7657 – 1,395). Quando comparado ao grupo com endotélio íntegro,

observou-se que o grupo com endotélio desnudo teve um Emax significativamente maior

(P<0,001) (Gráfico 12).


desnudo (E-) (n=6) pré-contraídos com KCl 60 mM.

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

E +

E -

***

K C l



*** denota diferença estatisticamente significante do Emax em relação do grupo E+ (p<0,001);

69

A tabela 2 resume os dados de Emax e pCE50 dos experimentos realizados em anéis de

aorta com endotélio íntegro e desnudo pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

Tabela 2 - Efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta

com endotélio íntegro (E+) e desnudo (E-) pré-contraídos com PHE 1 µM ou KCl 60 mM.

Grupo

E+ E-

pCE50 Emax (%) pCE50 Emax (%)

Preparações pré-contraídas com fenilefrina

FOR011B 1,005±0,068 110,95±1,964 0,341±0,0239a 112,2±1,678

FOR811B 0,665±0,054 110,33±2,019 0,719±0,056 128,2±2,347a

Preparações pré-contraídas com KCl

FOR011B 0,463±0,231 23,08±1,667 -0,141±0,198 32,31±2,938

FOR811B -0,760±0,095 62,91±4,142 -0,014±0,059 88,99±2,372a


Dados obtidos utilizando um n amostral de 8 anéis de aorta em cada grupo e expressos como média ± erro

padrão da média.

a denota diferença estatisticamente significante com relação as preparações com endotélio íntegro (E+)

(P<0,001);

70

4.4 Influência dos receptores muscarínicos no efeito vasodilatador dos metalofármacos

FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE

1 µM.

O FOR011B teve um efeito vasodilatador em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-

contraídos com PHE 1 µM na presença de Atropina de forma dose-dependente. O Emax

observado nas artérias na presença de Atropina foi de 124,8%±3,072, que foi

significativamente maior que o grupo Controle (sem a presença de atropina) (P<0,01),

enquanto a CE50 foi 2,21 x 10-1 µM (IC95%: 1,15 x 10-1 – 3,15 x 10-1) (Gráfico 13).

Gráfico 13 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR011B em anéis de aorta com

endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença

de Atropina (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

A tro p in a**

F e n ile fr in a



** denota diferença estatisticamente significativa no Emax dos dois grupos (P<0,01).

71

O metalofármaco FOR811B também teve um efeito vasodilatador de forma dose-

dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na

presença de Atropina, apresentando um Emax de 114%±1,737 e uma CE50 de 1,46 x 10-1 µM

(IC95%: 1,14 x 10-1 – 1,88 x 10-1). Não foi observada diferença significativa entre o Emax do

grupo Controle e do grupo Atropina, entretanto o grupo Atropina teve uma CE50

significativamente menor que o grupo Controle (P<0,05) (Gráfico 14).



de Atropina (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

A tro p in a

+

F e n ile fr in a



+ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,05).

72

4.5 Influência da via do NO/GCs efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e

FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.

Foi observado um efeito vasodilatador do FOR011B em anéis de aorta com endotélio

íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de L-NAME de forma dose-dependente. O

Emax observado em tais preparações foi 119,5%±3,729, enquanto a CE50 foi 8,24 x 10-1 µM

(IC95%: 5,84 x 10-1 – 11,6 x 10-1). Foi observada uma CE50 significativamente maior na

presença de L-NAME, quando comparado ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 15).



de L-NAME (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

L -N A M E

+ + +

F e n ile fr in a



+++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,001).

73

O FOR811B também teve um efeito vasodilatador dose-dependente em preparações de

aorta com o endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na presença de L-NAME. O

Emax do FOR811B nessas preparações foi 114,7%±4,776 e a CE50 foi 4,055 x 10-1 µM

(IC95%: 2,37 x 10-1 – 6,9 x 10-1). Observou-se uma CE50 significativamente maior na

presença de L-NAME, quando comparada ao grupo Controle (P<0,05) (Gráfico 16).



de L-NAME (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

L -N A M E

+

F e n ile fr in a




74


contraídos com PHE 1 µM na presença de ODQ de forma dose-dependente. O Emax observado

nessas preparações foi 120,1%±4,543 e a CE50 foi 1,96 µM (IC95%: 1,40 – 2,73). Observou-

se um aumento estatisticamente significante na CE50 na presença de ODQ quando comparada

ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 17).



de ODQ (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

O D Q

+ + +

F e n ile fr in a




75


contraídos com PHE 1 µM na presença de ODQ de forma dose-dependente. O Emax observado

nessas preparações foi 98,48%±6,403 e a CE50 foi 2,433 µM (IC95%: 1,21 – 4,93). Observou-

se um aumento estatisticamente significante na CE50 na presença de ODQ quando comparada

ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 18).


endotélio pré-contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de

ODQ (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

O D Q

+ + +

F e n ile fr in a




76

4.6 Influência da presença de Hidroxicobalamina ou L-Cisteína no efeito vasodilatador

dos metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-

contraídos com PHE 1 µM.

Observou-se um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido pelo

FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM na

presença de hidroxicobalamina. O Emax observado nessas condições foi 103,4%±3,123 e a

CE50 foi 3,61 x 10-1 µM (IC95%: 2,56 x 10-1 – 5,09 x 10-1). A presença de hidroxicobalamina

aumentou significativamente a CE50 do FOR011B (P<0,001) (Gráfico 19).



de Hidroxicobalamina (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

H id ro x ic o b a la m in a

+ + +

F e n ile fr in a




77



presença de hidroxicobalamina. O Emax observado nessas condições foi 107,9%±3,064 e a

CE50 foi 3,01 x 10-1 µM (IC95%: 1,94 x 10-1 – 4,69 x 10-1). Não foram encontradas diferenças

estatisticamente significativas (Gráfico 20).



de Hidroxicobalamina (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

H id ro x ic o b a la m in a

F e n ile fr in a



78


contraídos com PHE 1 µM na presença de L-Cisteína de forma dose-dependente. O Emax

observado nas artérias na presença de L-Cisteína foi de 114,7%±5,4, enquanto a CE50 foi

1,846 µM (IC95%: 1,459 – 2,36), sendo esse último significativamente maior que a CE50 do

grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 21).



de L-Cisteína (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

L -C is te ín a

+ + +

F e n ile fr in a




79


contraídos com PHE 1 µM na presença de L-Cisteína de forma dose-dependente. O Emax

observado foi de 116,3%±4,32, enquanto a CE50 foi 2,99 x 10-1 µM (IC95%: 1,92 x 10-1 –

4,67 x 10-1). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes (Gráfico 22).



de L-Cisteína (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

L -C is te ín a

F e n ile fr in a



80

4.7 Influência da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador dos

metalofármacos FOR011B e FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-

contraídos com PHE 1 µM.

O metalofármaco FOR011B teve um efeito vasodilatador de forma dose-dependente

em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de

Wortmaninna, apresentando um Emax de 114,7%±3,389 e uma CE50 de 2,292 µM (IC95%:

1,728 – 3,038). Observou-se que o grupo Wortmaninna teve uma CE50 significativamente

maior que o grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 23).



de Wortmaninna (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

W o rtm a n in n a

+ + +

F e n ile fr in a




81

O metalofármaco FOR811B também teve um efeito vasodilatador de forma dose-

dependente em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na

presença de Wortmaninna, apresentando um Emax de 108,8%±2,11 e uma CE50 de 7,97 x 10-1

µM (IC95%: 7,03 x 10-1 – 9,05 x 10-1). Observou-se uma CE50 significativamente maior no

grupo Wortmaninna quando comparada ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 24).



de Wortmaninna (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

W o rtm a n in n a

+ + +

F e n ile fr in a




82

4.8 Influência dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos metalofármacos


1 µM.


íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de Tetraetilamônio (TEA) de forma dose-

dependente. O Emax observado em tais preparações foi 117,6%±6,18, enquanto a CE50 foi 1,64

µM (IC95%: 1,225 – 2,292). Foi observada uma CE50 significativamente maior na presença

de TEA, quando comparado ao grupo Controle (P<0,001) (Gráfico 25).



de Tetraetilamônio (TEA) (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

T E A

+ + +

F e n ile fr in a




83


íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de Tetraetilamônio (TEA) de forma dose-

dependente. O Emax observado em tais preparações foi 107,7%±1,902, enquanto a CE50 foi

2,74 x 10-2 µM (IC95%: 1,73 x 10-2 – 4,17 x 10-2). A presença de TEA reduziu

significativamente a CE50 do FOR811B (P<0,001) (Gráfico 26).



de Tetraetilamônio (TEA) (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

T E A

+ + +

F e n ile fr in a




84

O metalofármaco FOR011B teve um efeito vasodilatador de forma dose-dependente

em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de 4-

Aminopiridina (4-AP), apresentando um Emax de 117,9%±4,007 e uma CE50 de 2,73 x 10-1 µM

(IC95%: 1,64 x 10-1 – 4,51 x 10-1). Observou-se que o grupo 4-AP teve uma CE50

significativamente maior que o grupo Controle (P<0,01) (Gráfico 27).



de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

4 -A P

+ +

F e n ile fr in a



++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,01).

85

O FOR811B teve um efeito vasodilatador de forma dose-dependente em anéis de aorta

com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na presença de 4-Aminopiridina (4-AP),

apresentando um Emax de 120,5%±2,325 e uma CE50 de 1,54 x 10-1 µM (IC95%: 1,15 x 10-1 –

2,08 x 10-1) (Gráfico 28).



de 4-Aminopiridina (4-AP) (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

4 -A P**

F e n ile fr in a




86



presença de Glibenclamida. O Emax observado nessas condições foi 83,37%±5,971 e a CE50

foi 3,762 µM (IC95%: 2,108 – 6,823). A presença de glibenclamida reduziu

significativamente o Emax do FOR011B (P<0,001) (Gráfico 29).



de Glibenclamida (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

G lib e n c la m id a

***

F e n ile fr in a



*** denota diferença estatisticamente significativa no Emax dos dois grupos (P<0,001).

87

Observou-se, também, um efeito vasodilatador de forma dose-dependente induzido

pelo FOR811B em preparações de aorta com endotélio íntegro pré-contraídas com PHE 1 µM

na presença de Glibenclamida. O Emax observado nessas condições foi 112,2%±3,444 e a CE50

foi 1,47 x 10-1 µM (IC95%: 0,87 x 10-1 – 2,43 x 10-1). Não foram encontradas diferenças

significativas entre os grupos Controle e Glibenclamida (Gráfico 30).



de Glibenclamida (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

G lib e n c la m id a

F e n ile fr in a



88

4.9 Influência da via da ciclooxigenase no efeito vasodilatador dos metalofármacos


1 µM.


contraídos com PHE 1 µM na presença de Indometacina de forma dose-dependente. O Emax

observado nessas preparações foi 98,13%±2,292 e a CE50 foi 6,67 x 10-2 µM (IC95%: 3,63 x

10-2 – 12,02 x 10-2). Observou-se um aumento estatisticamente significante no Emax na

presença de indometacina quando comparado ao grupo Controle (P<0,01) (Gráfico 31).



de Indometacina (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

In d o m e ta c in a **

F e n ile fr in a




89


contraídos com PHE 1 µM na presença de Indometacina de forma dose-dependente. O Emax

observado nessas preparações foi 116,9%±3,355 e a CE50 foi 8,95 x 10-2 µM (IC95%: 4,66 x

10-2 – 16,91 x 10-2). Observou-se um aumento estatisticamente significante na EC50 do

FOR811B na presença de indometacina quando comparado ao grupo Controle (P<0,01)

(Gráfico 32).

Gráfico 32 - Efeito vasodilatador do metalofármaco FOR811B em anéis de aorta pré-

contraídos com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Indometacina

(n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

In d o m e ta c in a

+ +

F e n ile fr in a


++ denota diferença estatisticamente significativa do logCE50 dos dois grupos (P<0,01).


90

4.10 Influência da via do AMPc no efeito vasodilatador dos metalofármacos FOR011B e

FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM.


FOR011B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na

presença de MDL 12,330A. O FOR011B teve, nessas preparações, um Emax de 110,6%±2,163

e uma CE50 de 6,71 x 10-2 (IC95%: 4,54 x 10-2 – 9,83 x 10-2). Não foram encontradas

diferenças estatisticamente significantes com relação (Gráfico 33).



de MDL 12,330A (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 0 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

M D L 1 2 ,3 3 0 A

F e n ile fr in a



91


FOR811B em anéis de aorta com endotélio íntegro pré-contraídos com PHE 1 µM na

presença de MDL 12,330A. O FOR811B teve, nessas preparações, um Emax de 112%±1,476 e

uma CE50 de 3,41 x 10-1 (IC95%: 2,89 x 10-1 – 4,02 x 10-1) (Gráfico 34).



de MDL 12,330A (n=6).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

lo g [ F O R 8 1 1 B ] ( M )

Re

lax

am

en

to (

%)

C o n tro le

M D L 1 2 ,3 3 0 A

+

F e n ile fr in a




92

As tabelas 3 e 4 reportam os dados de pCE50 e Emax com erro padrão da média (EPM)

dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B, respectivamente, na ausência (Controle) e

na presença dos inibidores avaliados.

Tabela 3 – Efeito vasodilatador do FOR011B em preparações de aorta com endotélio íntegro

pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina, L-

NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina,

MDL 12,330A ou wortmaninna (n=6).

Grupo

pCE50* Emax (%)


Controle 1,005 0,068 110,95 1,964

Atropina 0,656 0,080 124,81b 3,072

L-NAME 0,084c 0,072 119,51 3,729

ODQ -0,292c 0,071 120,05 4,543

Hidroxicobalamina 0,443c 0,077 103,37 3,123

L-Cisteína -0,266c 0,052 114,7 5,4

Wortmaninna -0,360c 0,055 114,67 3,389

TEA -0,215c 0,065 117,6 6,18

Glibenclamida -0,575 0,115 83,37c 5,971

4-AP 0,563b 0,103 117,90 4,007

Indometacina 1,176 0,110 98,13b 2,330

MDL 12,330A 1,173 0,084 110,60 2,16


Dados de pCE50 e Emax expressos como média e erro padrão da média (EPM).

b denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,01);

c denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,001).

93

Tabela 4 – Efeito vasodilatador do FOR811B em preparações de aorta com endotélio íntegro

pré-contraídas com PHE 1 µM na ausência (Controle) (n=8) ou na presença de Atropina, L-

NAME, ODQ, hidroxicobalamina, L-cisteína, TEA, glibenclamida, 4-AP, indometacina,

MDL 12,330A ou wortmaninna (n=6).

Grupo

pCE50* Emax (%)


Controle 0,665 0,053 110,33 2,019

Atropina 0,834a 0,053 114,02 1,737

L-NAME 0,392a 0,111 114,72 4,776

ODQ -0,386c 0,118 98,48 6,403

Hidroxicobalamina 0,521 0,079 107,92 3,064

L-Cisteína 0,524 0,098 116,33 4,32

Wortmaninna 0,099c 0,027 108,83 2,110

TEA 1,562b 0,096 107,69 1,902

Glibenclamida 0,834 0,108 112,22 3,444

4-AP 0,811 0,064 120,54b 2,325

Indometacina 1,048b 0,124 116,88 3,355

MDL-12,330A 0,468a 0,037 112,05 1,476


Dados de pCE50 e Emax expressos como média e erro padrão da média (EPM).

a denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,05);

b denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,01);

c denota diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (P<0,001).

94

4.11 Influência dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B na contração induzida

por Ca2+ na presença de Fenilefrina ou de alta concentração de K+ após depleção do

Ca2+ intracelular.

Nesse protocolo foi realizada uma curva de concentração resposta de CaCl2 em anéis

de aorta com endotélio integro, em meio sem Ca2+, após depleção do Ca2+ intracelular e após

incubação com PHE 1 µM ou KCl 60 mM e água (grupo Controle), FOR011B 5,6 x 10-7 M,

ou FOR811B 3,16 x 10-6 M.

Nos segmentos de aorta pré-incubados com PHE (Gráfico 35), observou-se uma

contração dose-dependente induzida pelo Ca2+ nos grupos Controle e FOR011B, entretanto

essa contração não foi observada no grupo FOR811B. Observou-se um Emax de 139,3%±8,507

no grupo Controle, 188,8%±20,67 no grupo FOR011B e 25,51%±5,778 no grupo FOR811B,

sendo o último significativamente menor que os grupos Controle e FOR011B (P<0,001).

Gráfico 35 – Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de PHE 1 µM após depleção do Ca2+

intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B (n=6), ou FOR811B (n=7).

- 2 . 0 - 1 . 5 - 1 . 0 - 0 . 5 0 . 0 0 . 5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

l o g [ C a C l2

] m M

Co

nt

ra

çã

o (

%)

C o n t r o le

F O R 0 1 1 B

F O R 8 1 1 B

F e n i l e f r i n a

* * *



*** denota diferença estatisticamente significativa do Emax quando comparado aos grupos Controle e FOR011B

(P<0,001).

95

Nos segmentos de aorta pré-incubados com KCl 80 mM (Gráfico 36), observou-se

uma contração dose-dependente induzida pelo Ca2+ nos três grupos. Observou-se um Emax de

129,1%±5,593 no grupo Controle, 141,2%±4,233 no grupo FOR011B e 159,6%±14,47 no

grupo FOR811B, não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes com relação

ao Emax. Com relação à CE50, foi observada no grupo Controle uma CE50 de 1,45 x 10-1 µM

(IC95%: 0,78 x 10-1 – 2,68 x 10-1), no grupo FOR011B observou-se uma CE50 de 5,02 x 10-1

µM (IC95%: 3,87 x 10-1 – 6,55 x 10-1), e no grupo FOR811B, foi observada uma CE50 de 1,40

x 10-1 µM (IC95%: 3,3 x 10-1 – 13,5 x 10-1). A presença dos complexos de rutênio diminuiu

significativamente o logCE50 do CaCl2, quando comparados ao grupo Controle.

Gráfico 36 – Efeito vasoconstritor do CaCl2 na presença de KCl 8 mM após depleção do Ca2+

intracelular, na presença de Água (Controle) (n=4), FOR011B (n=7), ou FOR811B (n=7).

-2 .0 -1 .5 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

lo g [C a C l2 ] m M

Co

ntr

aç

ão

(%

)

C o n tro le

F O R 0 1 1 B

F O R 8 1 1 B

K C l

a , b



a denota diferença estatisticamente significante na comparação Controle vs FOR011B (P=0,0164);

b denota diferença estatisticamente significante na comparação Controle vs FOR811B (P=0,0046).

96

4.11 Dosagem de GMPc por ELISA

Nos resultados de dosagem das concentrações de GMPc foi observada diferença

estatisticamente significante quando comparados os 5 grupos entre si por one-way ANOVA

(P=0,0465), entretanto, quando comparados aos pares pelo teste de Tukey não foram

observadas diferenças estatisticamente significantes (P>0,05) (Gráfico 37).

Gráfico 37 – Concentração de GMPc nos grupos Controle (n=4), 011B (n=4), 811B (n=4),

011B+ODQ (n=4) e 811B+ODQ (n=4). Dados expressos como média e erro padrão da média.

Contr

ole

011B

811B

011B

+ODQ

811B

+ODQ

0.0

0.5

1.0

1.5

[GM

Pc

] (p

mo

l/m

g d

e t

ecid

o)


97

4.12 Docking Molecular

A partir da análise do Docking molecular (Figura 26), foi observado o desvio existente

entre o ligante (FOR011B, FOR0811B e BAY 41-2272) e a proteína (PDB 2O09) sendo

calculado um valor de RMSD em torno de 1 Å para todos os ligantes.

Figura 26 - Docking molecular entre os ligantes FOR011B (1A), FOR811B (1B) e BAY 41-

2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs.

Fonte: Dados da pesquisa.

Os resultados obtidos no Docking molecular da porção HNOX – Subunidade β1 da

GCs (PDB 2O09) foram analisados em função energia de interação com o sítio ativo da

proteína, bem como a energia de ativação necessária para sua ocorrência. Os valores de

energia de ligação encontrados foram de -243,9 Kcal/mol (FOR011B), -333,2 Kcal/mol

(FOR811B) e -901,6 Kcal/mol (BAY 41-2272).

Foi possível observar os ligantes FOR011B (Figura 27A), FOR0811B (Figura 27B) e

BAY 41-2272 (Figura 27C), interagindo sobre os resíduos que agem com o sítio ativo da

porção HNOX – Subunidade β1 da GCs (PDB 2O09).

98

Figura 27 - Mapa 2D das interações do sítio catalítico do ligante FOR011B (1A), FOR811B

(1B) e BAY 41-2272 (1C) e a porção HNOX – Subunidade β1 da GCs.


A Tabela 5 mostra os resultados de distância de ligação entre os resíduos da enzima

com os ligantes, sendo notória a maior proximidade dos ligantes FOR011B e FOR811B à

proteína.

Tabela 5 - Tabela comparativa das distâncias entre os resíduos/ligantes.

Resíduos de

aminoácidos

Distância dos ligantes

FOR011B FOR811B BAY 41-2272

Tyr 2 3.5 Å 3.5 Å 17.9 Å

Ala 42 3.6 Å 3.4 Å 20.7 Å

Asp 102 2.1 Å 2.0 Å 16.7 Å

Gln 114 3.3 Å 3.2 Å 17.7 Å

Arg 116 2.8 Å 3.0 Å 9.8 Å

Glu 121 3.5 Å 3.1 Å 14.8 Å

Arg 138 2.8 Å 3.0 Å 4.6 Å


Na figura 28, podemos destacar interações do BAY 41-2272 e a porção HNOX –

Subunidade β1 da GCs com outros resíduos de aminoácidos importantes no sítio ativo da

proteína, com maior proximidade entre a mesma e os resíduos Glu 169, Cys 139 e Arg 168.

99

Figura 28 - Distâncias do ligante BAY 41-2272 e a proteína (PDB 2O09).


Foi possível observar as seguintes interações entre a proteína e o ligante FOR011B:

Asn100, Ser89, Arg107 e Pro113 (Figura 29A). Entre a proteína e o ligante FOR811B, as

interações com os resíduos: Gln114, Glu99, Glu121, Arg116, Gln135 e Ser44 (Figura 29B).

Após o redocking, foi possível observar a interação da proteína com os resíduos Asn103,

Glu99, His124, Glu121(Figura 29C), bem como entre resíduos como Arg116 e Ser44,

visualizados também na interação com o ligante FOR811B, indicando um potencial inibitório

para tal ligante. É possível observar também, distâncias pequenas (˂ 3Å) da grande maioria

dos resíduos e a proteína, tanto em relação aos ligantes FOR011B e FOR811B, como no caso

do redocking.

Figura 29 - Interação dos resíduos do sítio ativo da proteína (PDB 3L6J) e os ligantes

FOR811B (A), FOR811B (B) e cinaciguat (C).


100

5 DISCUSSÃO

Na presente pesquisa foi utilizado o modelo com aortas de ratos para investigação de

mecanismo de ação farmacológico de substâncias. Este é um modelo largamente utilizado por

pesquisadores em todo o mundo e que apresenta resultados confiáveis (YÜSUF et al., 1994;

PATCHARIN et al., 2003; MARTINELLI et al., 2018; SAWABE et al., 2019).

Neste estudo, foi analisado o efeito farmacológico de complexos de rutênio com

radicais 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular em aortas de ratos e verificada a

interação fármaco-receptor entre os complexos e seus possíveis receptores de atuação.

Compostos derivados de metais vêm sendo largamente pesquisados, devido as suas

características químicas e farmacológicas favoráveis (CRAVER et al., 2010; CAO; ZHENG;

CHEN, 2015; SOLTAU, et al., 2015; ZENG, et al., 2016). Ademais, alguns compostos

imidazólicos já estão sendo utilizados na prática clínica e mostram importantes efeitos

antineoplásicos, antifúngicos, antiparasitários, anti-histamínicos, antineuropáticos,

bactericidas, anti-inflamatórios, antivirais e anti-hipertensivos (ANDERSON; LONG, 2010;

EBEL et al., 2012; ZHANG, et al., 2014).

Moléculas derivadas de rutênio com radicais piridínicos e imidazólicos têm se

mostrado com efeito satisfatório pela sua importante função redutora e a capacidade de doar

NO. Essa substância desempenha um papel fisiológico e farmacológico significativo, tal fato

faz com que a busca por substâncias capazes de doar NO ou estimular sua produção seja

intensificada. Atualmente existem substâncias terapêuticas capazes de atuar na via do NO,

porém seus efeitos colaterais são significativos e limitam sua utilização clínica (PRIVIERO;

WEBB, 2010; GOUVEIA-JÚNIOR, 2017).

Estudos com compostos de rutênio que possuem radicais nitrogenados mostram que

sua reatividade está relacionada com suas propriedades de redução e ligadas com a via do NO

(LIMA et al., 2014). Atualmente, esses compostos vêm sendo estudados por sua baixa

toxicidade (FRICKER et al., 1997; HUTCHINGS et al., 2005), similaridade com estruturas

metálicas endógenas e por serem termodinamicamente estáveis (ALLARDYCE; DYSON,

2001).

Em ensaios in vitro com o FOR0812, em concentrações iniciais de 10µM, não foram

encontradas evidências de toxicidade em células muscular lisa de vasos (CABRAL, 2016),

101

assim como estudos com outro complexo de rutênio (BONAVENTURA et al., 2004;

BONAVENTURA et al., 2006).

Compostos piridínicos têm mostrado um importante efeito anti-hipertensivo em ratos e

anti-inflamatório, inclusive com efeito protetor em modelos animais de lesão renal e hepática,

além de reduzir a pressão intraocular, o que estabelece um potencial alvo terapêutico para o

glaucoma (FRIEBE; SANDNER; SEIFERT, 2015).

Neste estudo, os metalofármacos pesquisados apresentaram um efeito vasorrelaxante

máximo similar aos controles utilizados, SNP e BAY 41-2272. O SNP foi quimicamente

caracterizado no século 19 e sua capacidade de reduzir a pressão arterial é conhecida desde

1929 (JOHNSON, 1929) o que tornou essa substância alvo para terapêutica clínica por mais

de 50 anos (MORACCA et al., 1962). Seu efeito vasodilatador está relacionado com a

liberação de NO e ativação da enzima GCs, aumentando consequentemente a produção de

GMPc. Por outro lado, essa ação ativa canais de potássio e a SERCA no músculo liso

vascular, levando a uma redução na concentração de cálcio citoplasmática e a um relaxamento

do vaso (PEREIRA et al., 2011; LUNARDI et al., 2006; BONAVENTURA et al., 2011).

Na pesquisa de Munhoz e colaboradores (2012) foi descrito um efeito vasorrelaxante

inferior do derivado de rutênio estudado (RuBPY) quando comparado ao SNP. Bonaventura e

colaboradores em 2005, assim como Rodrigues et al., em 2007, ao estudarem o efeito de um

composto derivado de rutênio (15-ANE e TERPY, respectivamente), relataram que o efeito

vasodilatador do SNP e do composto foram prejudicados em animais previamente

hipertensos.

Apesar do SNP ser considerado por muitos anos como um vasodilatador endotélio-

independente, há pesquisas que mostram que seu efeito pode estar relacionado à ativação de

canais de cálcio endoteliais, o que aumentaria a atividade da NOS, potencializando seu efeito

pela produção de NO (BONAVENTURA et al., 2008).

Marcondes e colaboradores (2002) demonstram que o derivado de rutênio Ru-NO

possui um efeito hipotensor mais lento e prolongado quando comparado com o SNP.

Já o BAY 41-2272 atua como um estimulador da GCs se ligando na subunidade α1 da

enzima, suas propriedades vasodilatadoras já foram largamente descritas na literatura

(BATES et al., 1991; HARRISON; BATES, 1993; MARCHESI et al., 2012). Incialmente seu

mecanismo foi descrito como heme-dependente (MARCHESI et al., 2012), porém a heme

102

oxidação com ODQ não bloqueou o efeito vasorrelaxante do BAY 41-2272 (BATES et al.,

1991; CLARKE; GAUL, 1993). Na presença da porção heme intacta, a GCs é ativada e libera

GMPc. Compostos heme-dependentes são incapazes de ativar essa enzima quando está

inativada (porção heme livre ou oxidada). De tal modo, compostos ativadores da GCs são

considerados heme-independentes e os estimuladores são heme-dependentes (LIMA et al.,

2014). O NO é um estimulador da GCs que se liga ao grupamento contendo Fe2+ reduzido

(PLANE et al., 1998).

Uma pesquisa realizada com o composto FOR005 mostrou que este composto foi

capaz de gerar uma vasodilatação oito vezes maior que o BAY 41-2272 e produzir

quantidades significativas de GMPc (SÁ et al., 2015).

Nesta pesquisa foi encontrada uma redução significativa do efeito vasodilatador

máximo dos compostos FOR011B e FOR811B quando pré-contraídos com KCl em

comparação com a pré-contração com PHE. A PHE é um vasoconstrictor que atua nos

receptores adrenérgicos α ativando a mobilização de cálcio intra e extracelular, já o KCl induz

a contração vascular através do influxo de cálcio extracelular, porém bloqueia os canais de

potássio, o que pode influenciar no relaxamento da musculatura lisa vascular induzida pelo

NO (FEREZIN, et al., 2005).

A fenilefrina, por ser um agonista α-1, estabelece uma ativação de fosfolipase C com

síntese de IP3 e DAG, o que culmina no aumento das concentrações de cálcio citoplasmáticas.

Somado a este fato, a fenilefrina também exerce uma função redutora, segundo Bonaventura e

colaboradores (2004) alguns compostos doadores de NO necessitam de uma reação de

redução para que sejam capazes de liberar NO. Este fato pode justificar os achados desse

estudo onde o efeito relaxante dos compostos FOR011B e FOR811B foi reduzido

significativamente na contração com KCl quando comparado com fenilefrina. Pode-se

observar também que os controles utilizados (BAY 41-2272 e SNP) também apresentaram

resultados vasodilatadores reduzidos quando pré-contraídos com KCl.

Um estudo realizado por Ceron e colaboradores (2001) com um complexo de rutênio,

mostrou que houve vasodilatação em anéis de aorta sem endotélio. Este mesmo estudo afirma

que a pré-contração com KCl diminui o efeito vasorrelaxante de compostos nitrosilados

(CERON, et al., 2001).

Outras pesquisam também mostram uma redução na eficácia e na potência de

compostos derivados de rutênio com o endotélio íntegro. Bonaventura e colaboradores (2009)

103

justificam esse fato através da oxidação do cofator BH4 pela liberação de NO, que culmina na

formação de dihidrobiopterina (BH2) e biopterina, causando o desacoplamento da NOS e

consequentemente um aumento da produção de superóxidos, que diminuiria o efeito relaxante

causado pelo NO (FÖRSTERMANN et al., 2006; BONAVENTURA et al., 2008). Esse fato

pode estar relacionado aos resultados encontrados nesta pesquisa, onde a retirada do endotélio

aumentou o efeito vasorrelaxante dos compostos FOR011B e FOR811B.

A eNOS é uma enzima essencial para homeostase e remodelamento vascular além da

adaptação ao estresse e exercício (GARCIA; SESSA, 2019). O NO é um gás solúvel de curta

meia vida (aproximadamente 6 a 30 segundos) sintetizado a partir do aminoácido L-arginina

pela eNOS. Várias substâncias (acetilcolina, bradicinina, serotonina) podem aumentar a

produção de NO, porém o mecanismo fisiológico responsável por grande parte desta síntese é

o atrito do fluxo sanguíneo na parede dos vasos (RUBANI; ROMERO; VANHOUTTE, 1986;

JOANNIDES et al., 1995; TOUSOULIS et al., 2012). Uma vez produzido, esse gás é capaz

de estimular a enzima GCs a produzir GMPc que culmina por um efeito vasorrelaxante

(TOUSOULIS et al., 2012). O NO também pode causar vasorrelaxamento atráves da

estimulação de canais de potássio dependentes de cálcio onde o estímulo gera ativação de

uma proteína quinase Akt ou proteína quinase B que fosforila a NOS tornando-a sensível ao

complexo cálcio-calmodulina (DALE et al., 2011).

A inibição da produção de NO pode ocorrer através da oferta de análogos à L-

arginina, como o L-NAME que competem pelo sítio de ligação na NOS de maneira não

seletiva (LUSZCZKI et al., 2011; TAKAHASHI et al., 2011; KOPINCOVÁ; PÚZSEROVÁ;

BERNÁTOVÁ, 2012).

Os resultados desta pesquisa mostraram uma redução na potência do FOR011B e

FOR811B quando pré-incubados com L-NAME. Na pesquisa de Potje e colaboradores (2018)

o L-NAME aumentou a potência do derivado de rutênio (TERPY) em aorta de ratos

normotensos, porém a potência foi reduzida em aorta de ratos espontaneamente hipertensos.

Tal fato evidencia o envolvimento da NOS no efeito vasodilatador dos complexos de rutênio,

assim como relata Bonaventura e colaboradores em seu estudo com TERPY (2009).

A GCs é um heterodímero composto pelas subunidades α e β, onde cada uma possui

três domínios: 1. N- terminal heme responsável pela sensibilidade ao NO; 2. domínio

dimerização e 3. C-terminal domínio catalítico, responsável pela conversão de GTP em GMPc

(AKESSON; LUNDQUIST, 1999). Atualmente existem sete mecanismos propostos para o

104

relaxamento mediado pelo GMPc: 1. Inibição da produção de inositol-1,4,5-trifosfato; 2.

Aumento do efluxo de cálcio; 3. Desfosforilação da quinase de cadeia leve de miosina; 4.

Inibição do influxo de cálcio; 5. Ativação da proteína quinase G; 6. Estimulação das bombas

de cálcio da membrana; 7. Abertura dos canais de potássio (FURCHGOTT; ZAWADZKI,

1980; MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991).

Outra maneira de bloquear o efeito vasodilatador estimulado pelo NO é através do

ODQ. Estudos comprovam que esta substância é capaz de inibir a atividade da GCs

estimulada por NO de forma específica, seu mecanismo envolve a oxidação da porção heme

localizada na região N-terminal da subunidade β1 da enzima, fazendo com que o NO não seja

mais capaz de ativá-la (STONE et al., 1995; OLESEN et al., 1998; ZHAO et al. 2000). O

ODQ não influencia o domínio catalítico da GCs e a re-redução da porção heme da enzima

reestabelece completamente a sensibilidade ao NO (ZHAO et al. 2000).

Na atual pesquisa, a pré-incubação com ODQ reduziu a potência do FOR011B e

FOR811B de maneira significativa. Várias pesquisas denotam o envolvimento da GCs no

mecanismo vasodilatador dos complexos derivados de rutênio, através da redução do efeito

desses complexos com a utilização de ODQ (MUNHOZ et al., 2012; TFOUNI et al., 2012;

PEREIRA et al., 2013; POTJE et al., 2018).

Em um estudo com dois compostos derivados de rutênio, foi observada uma eficácia

vasodilatadora dessas substâncias semelhante ao SNP em aorta de ratos, porém quando pré

incubados com ODQ o efeito vasorrelaxante foi reduzido significativamente (SILVA et al.,

2018).

Com o intuito de verificar se os complexos de rutênio estão agindo na doação de NO

ou na ativação direta da via, foram utilizados dois sequestradores de óxido nítrico. Sabe-se

que a hidroxicobalamina reage com NO formando nitrosocobalamina, reduzindo o efeito

vasodilatador do NO e de doadores de NO, como o SNP e outros complexos de rutênio em

preparações de artérias isoladas (KACZKA et al., 1951; RAJANAYAGAM et al., 1993;

BONAVENTURA et al., 2007; CABRAL, 2016). A L-Cisteína atua mais especificamente

como sequestradores do íon nitroxil (NO-), a forma reduzida do NO (PINO; FEELISCH,

1994; BONAVENTURA et al., 2007; CABRAL, 2016).

O NO vem sendo largamente estudado desde a sua descoberta como fator relaxante

derivado do endotélio por Ignarro e colaboradores (1987), entretanto o ânion nitroxil, que foi

ignorado por bastante tempo, está sendi bastante estudado nos últimos tempos como uma

105

molécula de grande importância para o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (IRVINE

et al., 2008; ANDREWS et al., 2009; EDWARDS et al., 2010). Endogenamente, o NO- pode

ser formado diretamente a partir da enzima NOS, principalmente na ausência de um dos seus

cofatores, a tetrahidrobiopterina, bem como pode ser formado pela oxidação dos produtos

intermediários da sintase de NO, Nω-hidroxi-L-Arginina e hidroxilamina (FUKUTO et al.,

2005; DONZELLI et al., 2005; 2008; IRVINE et al., 2008).

Observou-se uma redução de pCE50 na vasodilatação induzida pelo FOR011B na

presença dos sequestradores hidroxicobalamina e L-Cisteína, entretanto não foram observadas

diferenças na vasodilatação induzida pelo FOR811B, o que sugere que o primeiro complexo

de rutênio induz uma liberação de NO e de NO-, enquanto o segundo, provavelmente, não está

causando liberação do NO coordenado ao rutênio como mecanismo principal de atuação.

Gouveia Junior (2017) mostrou que o FOR811B libera óxido nítrico quando aplicado

um potencial elétrico, ocorrendo a substituição do NO da estrutura por uma molécula de água,

entretanto tal reação é dificultada em meio básico, devido ao seu baixo pKa, facilitando a

interconversão nitrosil/nitrito. Portanto, nas condições do estudo, duas hipóteses podem ser

levantadas quanto à não liberação do NO pelo FOR811B, a primeira diz respeito às condições

do meio não estarem favorecendo a liberação do NO, enquanto a segunda é de que pode estar

ocorrendo a interconversão nitrosil/nitrito, dificultando ainda mais a liberação, pois a ligação

com nitrito é mais estável.

Primariamente, fármacos doadores de NO são utilizados no tratamento da angina

aguda em pacientes com doenças coronarianas, crises hipertensivas e outras emergências que

necessitam de uma rápida intervenção com efeito de vasorrelaxamento. Recentemente o

riociguat, um estimulador da GCs foi aprovado e liberado para o tratamento da hipertensão

arterial pulmonar e da hipertensão pulmonar tromboembólica crônica. Outro fármaco que atua

na mesma enzima, vericiguat (BAY 1021189), está sendo estudado para tratar pacientes com

falência cardíaca e se encontra atualmente em ensaios clínicos de fase III, e assim como o

riociguat mostra aumento nas dosagens de GMPc (FRIEBE; SANDNER; SEIFERT, 2015;

FRIEBE; SANDNER; SCHMIDTKO, 2017).

A wortmannina é um inibidor da fosfatidilinositol-3 kinase (PI3K) (CHEN et al.,

2015; CUNHA, 2012; PARK et al., 1997) e observou-se uma redução significativa da

potência do FOR811B e, principalmente, do FOR011B, na presença desse inibidor. Uma das

ações da PI3K é a fosforilação da Akt, uma serina/treonina quinase que está envolvida em

106

diversos processos celulares, dentre eles a fosforilação e ativação da eNOS (LORENZ et al.,

2004; WANG et al., 2010; CHEN et al., 2015).

Assim, considerando a diminuição da potência do FOR011B em anéis de aorta com

endotélio desnudo, bem como na presença de L-NAME, ODQ, hidroxicobalamina, l-cisteína e

wortmanina, e considerando também que o FOR011B não tem o grupamento nitrosil

coordenado ao rutênio, levantou-se a hipótese de que esse complexo de rutênio esteja

estimulando a síntese de NO, e não liberando NO. Outras substâncias que agem diretamente

na via PI3K/Akt/NOSe também apresentam diminuição no efeito em artérias com endotélio

desnudo, bem como na presença de L-NAME e ODQ (LORENZ et al., 2004; CHEN et al.,

2015; ANWAR et al., 2017).

Os canais de potássio têm uma participação singular na regulação do potencial de

membrana e, consequentemente, na regulação do tônus da musculatura lisa dos vasos. Uma

ativação desses canais causa uma hiperpolarização da membrana, resultando em um

relaxamento do músculo liso vascular decorrente da diminuição do influxo de cálcio (KO et

al., 2010; STOTT; JEPPS; GREENWOOD, 2014). No músculo vascular existem quatro tipos

principais de canais de K+, são eles: (1) canais de K+ sensíveis ao Ca2+; (2) canais de K+

sensíveis ao ATP; (3) canais de K+ retificadores de influxo; (4) canais de K+ dependentes de

voltagem (STOTT; JEPPS; GREENWOOD, 2014).

Para avaliar a importância dos canais de potássio no efeito vasodilatador dos dois

complexos de rutênio, foram utilizados três inibidores desses canais: o tetraetilamônio (TEA),

um bloqueador não seletivo dos canais de K+; a 4-aminopiridina (4-AP), que age bloqueando

os canais de K+ dependentes de voltagem; e a glibenclamida, um bloqueador dos canais de K+

dependentes de ATP (PINTO et al., 2009; CUNHA et al., 2013).

Com relação ao FOR011B, observou-se uma redução de potência no efeito

vasodilatador na presença de TEA e 4-AP, e uma redução de efeito máximo na presença de

glibenclamida. Quanto ao FOR811B observou-se um aumento de potência na presença de

TEA, um aumento de efeito máximo na presença de 4-AP e não foram encontradas diferenças

de potência ou eficácia na presença de glibenclamida.

Tais resultados mostram claramente a importância dos canais de K+ para o efeito

vasodilatador do FOR011B. Outros trabalhos já mostraram o envolvimento dos canais de

potássio para o efeito do SNP e de outros complexos de rutênio (BONAVENTURA et al.,

2006; 2007; LIMA et al., 2014) e sabe-se que a via do NO está diretamente relacionada a

107

hiperpolarização das células musculares lisas via abertura de canais de potássio (BOLOTINA

et al., 1994; MURPHY; BRAYDEN, 1995; ABDERRAHMANE et al., 1998; PAOLOCCI et

al., 2007; PAULO et al., 2013; MÓNICA et al., 2016).

Tanto o NO como o nitroxil agem por vias semelhantes, ambos ativam a guanilato

ciclase solúvel, com posterior formação de GMPc e ativação de PKG, resultando na

fosforilação de diversas proteínas, entre elas canais de potássio, causando uma ativação dos

mesmos (MURPHY; BRAYDEN, 1995; PAULO et al., 2013). Além disso, também já foi

observado ativação direta de canais de potássio por óxido nítrico e por ânions nitroxil,

entretanto o primeiro parece estar mais envolvido com canais de K+ cálcio dependentes,

enquanto o segundo parece ativar canais de K+ dependentes de voltagem e de ATP

(BOLOTINA et al., 1994; ABDERRAHMANE et al., 1998; IRVINE et al., 2003;

PAOLOCCI et al., 2007; ANDREWS et al., 2009).

Assim, os resultados encontrados com relação ao efeito do FOR011B na presença dos

inibidores dos canais de potássio reiteram a hipótese de que esse metalofármaco está causando

uma liberação de NO/NO- ou uma ativação na síntese de tais compostos.

Na investigação do mecanismo de ação dos complexos de rutênio FOR011B e FOR

811B foi realizado bloqueio dos receptores muscarínicos com atropina (CORTES et al.,

2018), não havendo grande alteração no efeito relaxante dos compostos, evidenciando que,

provavelmente, não há envolvimento dessa via.

A enzima adenilato cilclase atua em uma via de relaxamento do músculo liso através

da produção a AMPc (LEFKOWITZ; STADEL; CARON, 1983). No intuito de investigar

essa via foi utilizado o inibidor dessa enzima MDL 12,330A (TEÓFILO et al., 2018), porém

também não houve grande mudança na vasodilatação causada pelo FOR011B e FOR 811B.

A indometacina é um inibidor não seletivo da enzima ciclooxigenase, portanto

utilizada na investigação do envolvimento dos prostanóides no relaxamento da musculatura

lisa do vaso (CORTES et al., 2018). Na presente pesquisa houve participação dessa via no

vasorrelaxamento induzido pelos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B. Foi observada

uma pequena redução no efeito máximo vasodilatador do FOR011B quando pré incubado

com indometacina, assim como uma redução na potência vasodilatadora do FOR811B. Até o

presente momento não há relatos na literatura sobre o possível envolvimento desse tipo de

composto na via dos prostanóides. Pode-se perceber também que o efeito observado nessa via

foi reduzido quando comparado à outros mecanismos testados (como a via do NO e canais de

108

potássio), evidenciando que o relaxamento da musculatura lisa vascular induzida pelos

compostos FOR011B e FOR811B depende majoritariamente de outros fatores.

O Ca2+ é um íon responsável por diversas funções no músculo liso, incluindo a

contração muscular, portanto os canais de Ca2+ são de fundamental importância para a

contração muscular, visto que controlam o movimento do Ca2+ na célula. O aumento da

concentração de Ca2+ no citoplasma da célula muscular lisa pode ocorrer mediante influxo de

Ca2+, podendo, este, ser decorrente de canais de Ca2+ dependentes de voltagem (VOCC, do

inglês voltage operated calcium channel) ou de receptores (ROCC, do inglês receptor

operated calcium channel), ou mediante liberação do Ca2+ armazenado no retículo

sarcoplasmático, podendo essa liberação ocorrer por receptores de rianodina ou por receptores

de IP3 (AMBERG; NAVEDO, 2013; RAINBOW; MACMILLAN; MCCARRON, 2009).

Com o objetivo de verificar o efeito dos complexos de rutênio no influxo de Ca2+

foram realizados dois protocolos, cada um visando o efeito em um canal específico.

A fenilefrina age ativando os receptores alfa adrenérgicos das artérias, que são

receptores acoplados a proteína Gq, cuja ativação leva a formação dos segundos mensageiros

trifosfato-1,4,5 de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG), com consequente influxo de Ca2+

medidado por ROCC, bem como a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares mediada por

receptores de IP3 (RANG et al., 2011; CUNHA, 2012).

Os resultados no protocolo de Ca2+ em anéis de aorta pré-incubados com fenilefrina,

mostrou que o grupo FOR011B não influenciou na contração induzida por CaCl2, indicando

que esse metalofármaco não inibe o influxo de Ca2+ via ROCC, entretanto, foi observado que

o FOR811B reduziu significativamente a contração, indicando que o FOR811B reduz o

influxo de Ca2+ via ROCC.

O segundo protocolo de Ca2+ teve como objetivo verificar o efeito dos complexos de

rutênio em anéis de aorta pré-incubadas com KCl. Sabe-se que altas concentrações de K+

induzem contração do músculo liso medidada por despolarização de membrana, resultando no

aumento da concentração intracelular de Ca2+ por influxo via VOCC (GODFRAIND; KABA,

1969; SOMLYO; SOMLYO, 1994; HIPÓLITO et al., 2009).

Os resultados mostraram que nenhum dos complexos de rutênio foi capaz de reduzir o

Emax das contrações induzidas por CaCl2 em artérias pré-incubadas com KCl, mostrando que

eles provavelmente não agem bloqueando os canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Tal

109

resultado já era de certa forma esperado, já que os complexos de rutênio não tiveram um

efeito vasodilatador muito bom em artérias pré-contraídas com KCl 80 mM.

Recentemente, as pesquisas evidenciam que o mecanismo de ação farmacológico dos

complexos derivados de rutênio está relacionado com vias ligadas ao NO, seja por doação ou

estimulação da síntese, além da participação dos canais de potássio no efeito vasodilatador

(PAUWELS et al., 2016; PEREIRA et al., 2017; POTJE et al., 2018). Tais dados corroboram

com os achados deste estudo.

Na tentativa de comprovar a participação do NO no mecanismo de ação dos

compostos FOR011B e FOR811B, Silva (2018) realizou a dosagem de GMPc urinário em rim

de rato isolado, perfundidos com solução salina, nitroglicerina e os compostos estudados. O

resultado mostrou que houve um aumento significativo dos níveis de GMPc urinário

perfundidos com nitroglicerina, FOR011B e FOR811B quando comparados ao controle.

Outra pesquisa realizada por Alves (2018) com substâncias semelhantes (FOR011A e

FOR811A) às utilizadas no presente estudo, também na tentativa de evidenciar a contribuição

da via do NO no mecanismo de ação desses compostos, foi constatado um aumento

significativo nos níveis de GMPc urinário comparados ao controle. Nesse estudo o composto

FOR811A apresentou dosagens de GMPc superiores, inclusive quando comparados aos rins

perfundidos com nitroglicerina, com 90 e 120 minutos de perfusão.

No estudo de Cabral (2016), em animais hipertensos tratados com o FOR0812, foi

observado um aumento nas dosagens de nitrito plasmático em aorta de ratos, comprovando o

envolvimento da via do NO. Nos estudos de Alves (2018) e Silva (2018), citados

anteriormente, também observaram um aumento nas dosagens de nitratos e nitratos em rins

perfundidos com FOR011A, FOR011B, FOR811A e FOR811B.

Em animais espontaneamente hipertensos (SHR) e com hipertensão renovascular, foi

realizado o tratamento dos animais por gavagem com o FOR0812 por quinze dias que

reverteu completamente o quadro hipertensivo (MONTENEGRO et al., 2012), assim como

Cristiane e colaboradores em 2008, com o mesmo modelo renovascular de hipertensão

utilizando outro composto derivado de rutênio. Em um estudo com o TERPY em ratos SHR

foi observada uma redução de 34% na aferição da pressão arterial da cauda dos animais,

assim como na hipertensão causada por uma dieta com altos níveis de sódio (MUNHOZ et

al., 2012).

110

No estudo realizado por Costa (2018), foi analisado o nível de interação fármaco-

receptor da molécula FOR811A com a enzima GCs, através de técnicas de docking

macromolecular. O resultado mostrou um alto nível de ligação do composto com o resíduo de

cisteína da enzima, mais especificamente com a porção distal do gupo Heme, evidenciando o

sítio de ligação da molécula com a GCs, desencadeando o mecanismo de ação do FOR811A.

neste mesmo estudo o FOR811A foi capaz de reverter a bronconstricção em um modelo de

asma em camundongos, assim como no estudo de Castro e colaboradores (2011) com o

complexo Ru-NO.

A partir dos dados do Docking molecular foi analisado o desvio existente entre o

ligante (FOR011B, FOR0811B e BAY 41-2272) e a proteína (PDB 2O09). O resultado obtido

foi aproximadamente de 1 Å de RMSD indica que o desvio padrão médio das interações

atingiu um valor ótimo, já que o valor ideal deve estar entre 1,000 Å e 2,000 Å (YURIEV et

al., 2015).

Tais resultados foram analisados em função da melhor energia de interação com o sítio

ativo da proteína (MA et al., 2007), bem como a energia de ativação necessária para sua

ocorrência. Os valores de energia de ligação encontrados sugerem uma interação mais estável

do controle utilizado e também, evidenciaram que o ligante FOR011B é energeticamente mais

favorável que o FOR811B.

Uma forma de predizer a função de uma proteína é através da identificação de resíduos

de aminoácidos diretamente envolvidos no sítio catalítico (IZIDORO, 2014). Dessa forma,

podemos observar que os ligantes FOR011B, FOR0811B e BAY 41-2272, interagem sobre os

resíduos que atuam com o sítio ativo da porção HNOX – Subunidade β1 da GCs (PDB 2O09).

Com base nos dados apresentados, vários compostos derivados de rutênio têm sido

estudados e mostram efeitos satisfatórios e promissores na vasodilatação e como anti-

hipertensivos. Esse efeito está majoritariamente ligado a via do NO, seja na liberação ou

síntese desse composto, principalmente, através do estímulo da enzima GCs. Há também

estudos que evidenciam a participação dos canais de potássio no efeito dos compostos de

rutênio, assim como o baixo nível de toxicidade e a alta estabilidade apresentada por essas

substâncias (DRAGUTAN; DRAGUTAN; DEMONCEAU, 2017; PAULO et al., 2017;

SILVA et al., 2017).

111

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito farmacológico de complexos de

rutênio com radicais 2-imidazolidinetiona na reatividade vascular in vitro, sendo verificado o

efeito vasodilatador dos complexos de rutênio FOR011B e FOR811B em anéis de aorta de

ratos pré contraídos com KCl e fenilefrina.

Foram estudadas diversas vias que podem causar o efeito vasodilatador dos

compostos, dentre elas a participação do endotélio, dos receptores muscarínicos, dos canais de

potássio, da influência da enzima guanilato ciclase solúvel e adenilato ciclase e da síntese de

óxido nítrico.

Este estudo é de fundamental importância, pois a pesquisa com substâncias derivadas

de metais com potenciais efeitos terapêuticos é crescente devido as suas vantagens químicas e

farmacológicas. Ademais, essas moléculas já foram recentemente alvo de outras pesquisas,

porém seu mecanismo de ação não fora desvendado.

A partir dos dados adquiridos nesta pesquisa podemos sugerir estudos futuros que

tenham como objetivo uma elucidação completa e detalhada do mecanismo de ação do

FOR011B e FOR811B em relação ao influxo de cálcio (microscopia confocal), e interação

fármaco-receptor através de técnicas de docking macromolecular. Ademais, também podem

ser realizadas pesquisas em artérias de resistência e os efeitos hemodinâmicos desses

compostos in vivo.

112

7 CONCLUSÃO

Através dos resultados da presente pesquisa podemos concluir que os complexos

derivados de rutênio FOR011B e FOR811B apresentaram efeito vasodilatador em aorta de

ratos, possivelmente atuando na via do óxido nítrico através do estímulo à enzima guanilato

cilcase solúvel, assim como na estimulação da enzima oxido nítrico sintase. Somado a este

fato, o FOR011B mostra atuação também nos canais de potássio causando hiperpolarização

celular e favorecendo a vasodilatação.

113

REFERÊNCIAS

AKESSON, B.; LUNDQUIST, I. Influence of nitric oxide modulators on cholinergically

stimulated hormone release from mouse islets.J. Physiol., , v. 515, p. 463–473, 1999.

ALLARDYCE, C.S.; DYSON, P.J. Ruthenium in medicine: Current clinical uses and future

prospects. Platin Met. Rev., v. 45, p. 62–69, 2001.

ALSULEIMANI, Y.M.; HILEY, C.R. Mechanisms of vasorelaxation induced by

oleoylethanolamide in the rat small mesenteric artery. European journal of pharmacology,

v. 702, n. 1, p. 1-11, 2013.

ALVES, Natacha Teresa Queiroz. Efeitos renais de complexos de rutênio e sua ação na

proteção da lesão aguda induzida por isquemia e reperfusão. 2018. 99 f. Tese (Doutorado)

- Curso de Farmacologia, Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará,

Fortaleza, 2018.

AMBERG, G. C.; NAVEDO, M. F. Calcium Dynamics in Vascular Smooth

Muscle. Microcirculation, v. 20, n. 4, p.281-289, mai. 2013.

AMBROSIO, S.R. et al. Mechanisms underlying the vasorelaxant action of the pimarane ent-

8(14),15-pimaradien-3β-ol in the isolated rat aorta. Cardiovascular Pharmacology, v. 616,

p.183-191, 2009.

ANDERSON, E.B.; LONG, T.E., Imidazole- and imidazolium-containing polymers for

biology and material science applications.Polymer, v. 51(12), p. 2447-2454, 2010.

ANDRADE, D.M.L et al. Vasorelaxant and Hypotensive Effects of Jaboticaba Fruit

(Myrciaria cauliflora) Extract in Rats. Evidence-based Complementary And Alternative

Medicine, v. 2015, p.1-8, 2015.

ANOZIE, O. et al. Differential modulation of bradykinin-induced relaxation of endothelin-1

and phenylephrine contractions of rat aorta by antioxidants. Acta Pharmacologica Sinica, v.

28, n. 10, p. 1566-1572, 2007.

114

ANSELM, E. et al. Grape juice causes endothelium-dependent relaxation via a redoxsensitive

Src- and Akt-dependent activation of eNOS. Cardiovascular Research, v. 73, p. 404-413,

2007.

BATES, J.N. et al. Nitric oxide generation from nitroprusside by vascular tissue. Evidence

that reduction of the nitroprusside anion and cyanide loss are required. Biochem.

Pharmacol., v. 42, p. S157–S165, 1991.

BELANI, K. et al. Sodium nitroprusside in 2014: A clinical concepts review. Journal of

Anaesthesiology Clinical Pharmacology, v. 30, n. 4, p.462-471, 2014.

BIAN, Ka; SHI, Hai-xia; FERID. Vasodilatory effects of cinnamaldehyde and its mechanism

of action in the rat aorta. Vascular Health And Risk Management, p.273-280, abr. 2011.

BONAVENTURA D, et al. A macrocyclic nitrosyl ruthenium complex is a NO donor that

induces rat aorta relaxation. Nitric Oxide.; v.10(2): p. 83-91, 2004

BONAVENTURA D, et al. Characterization of the mechanisms of action and nitric oxide

species involved in the relaxation induced by the ruthenium complex. Nitric Oxide.;v. 15(4):

p. 387-94, 2006

BONAVENTURA D, et al. Endothelium negatively modulates the vascular relaxation

induced by nitric oxide donor, due to uncoupling NO synthase. J Inorg Biochem.;v. 103(10):

p.1366-74, 2009

BONAVENTURA D. et al. Decreased vasodilation induced by a new nitric oxide donor in

two kidney one clip hypertensive rats is due to impaired K+ channel activation, Clin. Exp.

Pharmacol. Physiol., v. 32, p. 478–481, 2005.

BONAVENTURA, D. et al. A novel mechanism of vascular relaxation induced by sodium

nitroprusside in the isolated rat aorta. Nitric Oxide, 18, 287–295, 2008.

115

BONAVENTURA, D. et al. Comparison of the mechanisms underlying the relaxation

induced by two nitric oxide donors: Sodium nitroprusside and a new ruthenium

complex. Vascular Pharmacology, v. 46, n. 3, p.215-222, mar. 2007.

BONAVENTURA, D. et al. NO donors-relaxation is impaired in aorta from hypertensive rats

due to a reduced involvement of K+ channels and sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Life

Sci., v. 89, p. 595–602, 2011.

BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo

Moniz. Curso de manipulação de animais de laboratório. Organizadores: Fabienne

Petitinga de Paiva; Vitor Valério Maffili; Ana Carla Sampaio Santos. Salvador, 2005. 28p.

BRITO, T.S. Atividade vasorrelaxante do 2-Nitro-1-Fenil-1-Propanol em preparações

vasculares isoladas de ratos. 2015. 107 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Centro de

Ciências da Saúde, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015.

BRITO, T.S. et al. Endothelium-independent vasodilator effect of 2-nitro-1-phenyl-1-

propanol on mesenteric resistance vessels in rats. European journal of pharmacology, v.

806, p. 52-58, 2017.

BRUNTON, L.; CHABNER, B. e KNOLLMAN, B., Goodman and Gilman's The

Pharmacological Basis of Therapeutics, Twelfth Edition. McGraw-Hill Education, 2011.

BUTLER, A.R.; NICHOLSON, R., Life, Death and Nitric Oxide. RSC, 2003.

CABRAL, Pedro Henrique Bezerra. EFEITOS CARDIOVASCULARES DO

COMPOSTO [RU(BPY)2(TIOUREIA)(NO)](PF6)3 (FOR 0812) EM RATOS

NORMOTENSOS E HIPERTENSOS. 2016. 124 f. Tese (Doutorado) - Curso de

Farmacologia, Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016.

CAMPANA, E.M.G. et al. Pressão arterial e perfil antropométrico e metabólico de indivíduos

jovens acompanhados por 16 anos e estratificados pelo comportamento da pressão arterial:

estudo do Rio de Janeiro. Adolescência e Saúde, v. 4, n. 4, p. 49-56, 2007.

116

CAMPELO, M.W. et al. Preconditioning with a novel metallopharmaceutical NO donor in

anesthetized rats subjected to brain ischemia/reperfusion. Neurochem Res, v. 37(4), p. 749-

58, 2012.

CAO, W.; ZHENG, W. e CHEN, T. Ruthenium polypyridyl complex inhibits growth and

metastasis of breast cancer cells by suppressing FAK signaling with enhancement of TRAIL-

induced apoptosis. Sci Rep, v. 5, p. 9157, 2015.

CARVAJAL, J.A. et al. Molecular mechanism of cGMP-mediated smooth muscle

relaxation. Journal Of Cellular Physiology, v. 184, n. 3, p.409-420, 2000.

CASTRO PF. et al. A new nitrosyl ruthenium complex nitric oxide donor presents higher

efficacy than sodium nitroprusside on relaxation of airway smooth muscle. Eur J Pharm Sci.

2011

CERON, P.I.B. et al. The relaxation induced by S-nitroso-glutathione and S-nitroso-N-

acetylcysteine in rat aorta is not related to nitric oxide production. J. Pharmacol. Exp. Ther.,

v. 298, p. 686–694. 2001.

CHEN, G. et al. Endothelium-independent vasorelaxant effect of dodium ferulate on rat

thoracic aorta. Life Sciences, v. 84, p. 81-88. 2009.

CHEN, W. et al. 2-Methoxyestradiol Induces Vasodilation by Stimulating NO Release via

PPARγ/PI3K/Akt Pathway. Plos One, v. 10, n. 3, p.1-14, mar. 2015.

CLARKE, M.J.; GAUL, J.B. Chemistry relevant to the biological effects of nitric oxide and

metallonitrosyls. Struct. Bonding, v. 81, p. 147–181, 1993.

COSTA, Paula Priscila Correia. Efeito anti-asmático do metalodoador de óxido nítrico

(FOR811A) em camundongos swiss. 2018. 88 f. Tese (Doutorado) - Curso de Farmacologia,

Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.

117

CRAVER, E. et al. Tris-ruthenium(II)/copper(II) multimetallic porphyrin: Synthesis,

characterization, DNA binding and supercoiled DNA photocleavage studies. Inorganica

Chimica Acta, v. 363(2), p. 453-456, 2010.

CUNHA, G.H. Efeito farmacológico das frações hexânica, clorofórmica, e metanólica do

óleo essencial da Alpinia zerumbet na reatividade vascular in vitro e nos parâmetros

cardiovasculares in vivo. 2012. 224 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) –Centro de

Ciências da Saúde, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012.

CUNHA, G.H. et al. Vasorelaxant and antihypertensive effects of methanolic fraction of the

essential oil of Alpinia zerumbet.Vascular Pharmacology, v. 58, n. 5–6, p. 337–345, 2013.

DIVAKARAN, S.; LOSCALZO, J. The Role of Nitroglycerin and Other Nitrogen Oxides in

Cardiovascular Therapeutics. Journal Of The American College Of Cardiology, v. 70, n.

19, p.2393-2410, nov. 2017.

DRAGUTAN, I.; DRAGUTAN, V.; DEMONCEAU, A. Special Issue on Ruthenium

Complexes. Molecules, v. 22, n. 2, p.255-258, 8 fev. 2017

EBEL, K. et al. Imidazole and Derivatives, Ullman's Encyclopedia of Indistrual

Chemistry, p. 637-65, 2012.

EKENGARD, E. et al. Antimalarial activity of ruthenium(II) and osmium(II) arene

complexes with mono- and bidentate chloroquine analogue ligands. Dalton transactions, v.

44, p. 19314-19329, 2015.

ENGHOLM, M. et al. Involvement of transglutaminase 2 and voltage‐gated potassium

channels in cystamine vasodilatation in rat mesenteric small arteries. British journal of

pharmacology, v. 173, n. 5, p. 839-855, 2016.

ESTRADA-SOTO, S. et al. Vasorelaxant effect of Valeriana edulis ssp. procera

(Valerianaceae) and its mode of action as calcium channel blocker. The Journal of

Pharmacy and Pharmacology, v. 62, n. 9, p. 1167-1174, 2010.

118

FEREZIN, C.Z. et al. The complex trans-[RuCl([15]aneN4)NO]2+ induces rat aorta

relaxation by ultraviolet light irradiation. Nitric Oxide, v. 13, p. 170–175, 2005.

FERREIRA, K. Q.; TFOUNI, E. Chemical and photochemical properties of a ruthenium

nitrosyl complex with the N-monosubstituted cyclam 1-(3-Propylammonium)-1,4,8,11-

tetraazacyclotetradecane. Journal Of The Brazilian Chemical Society, v. 21, n. 7, p.1349-

1358, 2010.

FÖRSTERMANN U, MÜNZEL T. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease:

from marvel to menace. Circulation.; v. 113(13): p. 1708-14, 2006

FORSTERMANN, U.; SESSA, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and

function. European Heart Journal, v. 33, n. 7, p. 829-837, 1 set. 2011.

FRANÇA-SILVA, M.S. et al. The 2-nitrate-1, 3-dibuthoxypropan, a new nitric oxide donor,

induces vasorelaxation in mesenteric arteries of the rat. European journal of pharmacology,

v. 690, n. 1, p. 170-175, 2012.

FRICKER, S.P. et al. Ruthenium complexes as nitric oxide scavengers: A potential

therapeutic approach to nitric oxidemediated diseases. Br. J. Pharmacol., v. 122, p. 1441–

1449, 1997.

FRICKER, S.P. Metal based drugs: from serendipity to design. Dalton Trans:4903-17, 2007.

FRIEBE, A; SANDNER, P; SCHMIDTKO, A. Meeting report of the 8th International

Conference on cGMP “cGMP: generators, effectors, and therapeutic implications” at

Bamberg, Germany, from June 23 to 25, 2017. Naunyn-schmiedeberg's Archives Of

Pharmacology, v. 390, n. 12, p.1177-1188, 10 out. 2017.

FRIEBE, A.; SANDNER, P.; SEIFERT, R. From bedside to bench—meeting report of the 7th

International Conference on cGMP “cGMP: generators, effectors and therapeutic

implications” in Trier, Germany, from June 19th to 21st 2015. Naunyn-schmiedeberg's

Archives Of Pharmacology, [s.l.], v. 388, n. 12, p.1237-1246, 20 out. 2015.

119

FURCHGOTT, R.F. Role of endothelium in responses of vascular smooth

muscle. Circulation Research, v. 53, n. 5, p.557-573, nov. 1983.

FURCHGOTT, R.F; ZAWADZKI. J.V.; The obligatory role of endothelial cells in the

relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature, v. 27, n. 288, p.373-376, nov.

1980.

GARCIA, V.; SESSA, W.C. Endothelial NOS: perspective and recent developments. British

Journal Of Pharmacology, v. 176, n. 2, p.189-196, dez. 2018.

GILES, T.D. et al. Impaired Vasodilation in the Pathogenesis of Hypertension: Focus on

Nitric Oxide, Endothelial-Derived Hyperpolarizing Factors, and Prostaglandins. The Journal

Of Clinical Hypertension, v. 14, n. 4, p.198-205, mar. 2012.

GODFRAIND, T.; KABA, A. Inhibition by cinnarizine and chlorpromazine of the contraction

induced by calcium and adrenaline in vascular smooth muscle. British Journal of

Pharmacology, v. 35, p. 354-355, 1969.

GOUVEIA-JÚNIOR, F.S. Novos complexos de rutênio contendo derivados imidazólicos:

síntese, caracterização e avaliação do potencial terapêutico. 2017. 171f. Dissertação

(Mestrado em Química Inorgânica) – Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.

GUYTON, A.C.; HALL, J.E. Tratado de Fisiologia Médica. 13. ed. Elsevier, 2017.

HAMBLEY, T.W. Chemistry.Metal-based therapeutics. Science v. 318, p. 1392-3, 2007.

HALGREN, T. A. Merck molecular force field. I. Basis, form, scope, parameterization, and

performance of MMFF94. J. Comput. Chem., v. 17, n. 5-6, p. 490-519, 1996.

HARRISON, D.G.; BATES, J.N. The nitrovasodilators. New ideas about old

drugs. Circulation, v. 87, p. 1461–1467, 1993.

HIPÓLITO, U.V. et al. Gynura procumbens Merr. decreases blood pressure in rats by

vasodilatation via inhibition of calcium channels. Clinics, v. 66, n. 1, p. 143-150, 2011.

120

HIPÓLITO, U.V. et al. Mechanisms underlying the vasorelaxant action of the pimarane ent-

8(14),15-pimaradien-3β-ol in the isolated rat aorta. European Journal Of Pharmacology, v.

616, n. 1-3, p.183-191, ago. 2009.

HOROWITZ, A. et al. Mechanisms of smooth muscle contraction. Physiological Reviews, v.

76, n. 4, p.967-1003, out. 1996.

HUTCHINGS, S.R. et al. The ruthenium-based nitric oxide scavenger, AMD6221, augments

cardiovascular responsiveness to noradrenaline in rats with streptozotocininduced

diabetes. Eur. J. Pharmacol., v. 528, p. 132–136, 2005.

IGNARRO, L.J. Nitric oxide is not just blowing in the wind. British Journal Of

Pharmacology, v. 176, n. 2, p.131-134, dez. 2018.

IGNARRO, L.J., Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. Elsevier Science, 2009.

IGNARRO, L.J.; KADOWITZ, P.J. The Pharmacological and Physiological Role of Cyclic

GMP in Vascular Smooth Muscle Relaxation. Annual Review Of Pharmacology And

Toxicology, v. 25, n. 1, p.171-191, abr. 1985.

IRVINE, J.C. et al. Nitroxyl (HNO): the Cinderella of the nitric oxide story. Trends In

Pharmacological Sciences, v. 29, n. 12, p.601-608, dez. 2008.

JADHAV, A. et al. L‐Tryptophan ethyl ester dilates small mesenteric arteries by inhibition of

voltage‐operated calcium channels in smooth muscle. British journal of pharmacology, v.

166, n. 1, p. 232-242, 2012.

JOANNIDES, R.; HAEFELI, W.E.; LINDER, L., et al. Nitric oxide is responsible for flow-

dependent dilatation of human peripheral conduit arteries in vivo. Circulation, v. 91: p. 1314-

9, 1995.

JOHANSSON, B. Mechanics of vascular smooth muscle contraction. Experientia, v. 31, n.

12, p.1377-1386, dez. 1975.

121

JOHNSON, C.C. The actions and toxicity of sodium nitroprusside. Arch. Int. Pharmacodyn.

Ther., v. 35, p. 489–496, 1929.

JORIS, I. et al. The mechanism of vascular leakage induced by leukotriene E4. Endothelial

contraction. The American Journal Of Pathology, v. 126, n. 1, p.19-24, jan. 1987.

KACZKA, E.A. et al. Vitamin B12. XVI.1,2Modifications of Cyano-cobalamin. Journal Of

The American Chemical Society, v. 73, n. 8, p.3569-3573, ago. 1951.

KARIDI, K. et al. Synthesis, Characterization, and DNA-Binding Studies of

Nitro(oligopyridine)ruthenium(II) Complexes. Inorganic Chemistry, v. 45, n. 25, 2006.

KO, E.A. et al. Pathophysiology of voltage-gated K+channels in vascular smooth muscle

cells: Modulation by protein kinases.Progress in Biophysics and Molecular Biology, v. 103,

n. 1, p. 95–101, 2010.

KOPINCOVÁ, J.; PðZSEROVÁ, A.; BERNÁTOVÁ, I. L-NAME in the cardiovascular

system – nitric oxide synthase activator? Pharmacological Reports, v. 64, n. 3, p.511-520,

maio 2012.

LEFKOWITZ, R.J; STADEL, J.M; CARON, M.G. Adenylate Cyclase-Coupled Beta-

Adrenergic Receptors: Structure and Mechanisms of Activation and Desensitization. Annual

Review Of Biochemistry, v. 52, n. 1, p.159-186, jun. 1983.

LIMA, R. et al. Ruthenium Complexes as NO Donors for Vascular Relaxation

Induction. Molecules, v. 19, n. 7, p.9628-9654, jul. 2014.

LIMA-ACCIOLY, P. et al. Essential oil of croton nepetaefolius and its main constituent, 1,8-

cineole, block excitability of rat sciatic nerve in vitro. Clinical And Experimental

Pharmacology And Physiology, v. 33, n. 12, p.1158-1163, dez. 2006.

LORENZ, M. et al. A Constituent of Green Tea, Epigallocatechin-3-gallate, Activates

Endothelial Nitric Oxide Synthase by a Phosphatidylinositol-3-OH-kinase-, cAMP-dependent

122

Protein Kinase-, and Akt-dependent Pathway and Leads to Endothelial-dependent

Vasorelaxation. Journal Of Biological Chemistry, v. 279, n. 7, p.6190-6195, nov. 2003.

LUNARDI, C.N. et al. Cytosolic calcium concentration is reduced by photolysis of a nitrosyl

ruthenium complex in vascular smooth muscle cells. Nitric Oxide, v. 15, p. 252–258, 2006.

MA, X. et al. NO and CO differentially activate soluble guanylyl cyclase via a heme pivot‐bend

mechanism. EMBO J., v. 26, n. 2, p. 578-588, 2007.

MARCHESI, M.S.P. et al. Chemical mechanism of controlled nitric oxide release from trans-

[RuCl([15]aneN4)NO](PF6)2 as a vasorelaxant agent. Transit. Metal Chem., 37, 475–479,

2012.

MARCONDES F.G. et al. In vivo effects of the controlled NO donor/scavenger ruthenium

cyclam complexes on blood pressure. Life Sci.; v. 70(23): p. 2735- 52, 2002

MARTIN, E. et al. Soluble Guanylyl Cyclase: The Nitric Oxide Receptor. v. 396, p. 478-492,

2005.

MARTIN, F. et al. Structure of cinaciguat (BAY 58–2667) bound to Nostoc H-NOX domain

reveals insights into heme-mimetic activation of the soluble guanylyl cyclase. J. Biol. Chem.,

v. 285, n. 29, p. 22651-22657, 2010.

MARTINELLI, A.M. et al. In Endothelial Cells, the Activation or Stimulation of Soluble

Guanylyl Cyclase Induces the Nitric Oxide Production by a Mechanism Dependent of Nitric

Oxide Synthase Activation. Journal Of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, v. 21, n. 1,

p.38-45, jan. 2018.

MILLER, M.R; MEGSON, I.L. Recent developments in nitric oxide donor drugs. British

Journal Of Pharmacology, v. 151, n. 3, p.305-321, jan. 2009

123

MIZUNO, Y.; JACOB, R.F.; MASON, R. Preston. Advances in Pharmacologic Modulation

of Nitric Oxide in Hypertension. Current Cardiology Reports, v. 12, n. 6, p.472-480, set.

2010.

MONCADA, S.; PALMER, R.M.J.; HIGGS, E.A. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology

and pharmacology. Pharmacol. Rev., v. 43, p. 109–42, 1991.

MÓNICA, F.Z.; BIAN, K.; MURAD, F. The Endothelium-Dependent Nitric Oxide–cGMP

Pathway. Advances In Pharmacology, p.1-27, 2016.

MONTENEGRO MF, et al. Antihypertensive and antioxidant effects of a single daily dose of

sodium nitrite in a model of renovascular hypertension. Naunyn Schmiedebergs. Arch

Pharmacol.; v. 385(5): p. 509-17, 2012

MORACCA, P.P. et al. Clinical evaluation of sodium nitroprusside as a hypotensive

agent. Anesthesiology, v. 23, p. 193–199, 1962.

MOREIRA, L.N. et al. Activation of eNOS by D-pinitol Induces an Endothelium-Dependent

Vasodilatation in Mouse Mesenteric Artery. Frontiers In Pharmacology, v. 9, p.1-9, 22

maio 2018.

MORGADO, M. et al. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth

muscle. Cellular And Molecular Life Sciences, v. 69, n. 2, p.247-266, 27 set. 2011.

MUNHOZ, F.C. et al. Hypotensive and vasorelaxing effects of the new NO-donor

[Ru(terpy)(bdq)NO+]3+ in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide, v. 26, n. 2, p.111-

117, fev. 2012.

OLESEN, S. et al Br. J. Pharmacol., 123, 299-309, 1998.

ÖZTÜRK, Y. et al. Endothelium-dependent and independent effects of garlic on rat

aorta. Journal Of Ethnopharmacology, v. 44, n. 2, p.109-116, out. 1994.

124

PAOLOCCI, N. et al. The pharmacology of nitroxyl (HNO) and its therapeutic potential: Not

just the janus face of NO11This review is dedicated to the career of Prof. Herbert T.

Nagasawa, a pioneer in the field of HNO chemistry, biochemistry and

pharmacology. Pharmacology & Therapeutics, v. 113, n. 2, p.442-458, fev. 2007.

PARK, Y.C. et al. Wortmannin, a Specific Inhibitor of Phosphatidylinositol-3-kinase,

Enhances LPS-Induced NO Production from Murine Peritoneal Macrophages. Biochemical

And Biophysical Research Communications, v. 240, n. 3, p.692-696, nov. 1997.

PAULO, MICHELE et al. The nitric oxide donor RuBPY does not induce in vitro cross-

tolerance with acetylcholine. Nitric Oxide, v. 69, p.69-77, set. 2017.

PAUWELS, B. et al. Ruthenium-based nitric oxide-donating and carbon monoxide-donating

molecules. Journal Of Pharmacy And Pharmacology, v. 68, n. 3, p.293-304, 15 jan. 2016.

PEREIRA, A.C. et al. Ruthenium-nitrite complex as pro-drug releases NO in a tissue and

enzyme-dependent way. Nitric Oxide, v. 24, p. 192–198, 2013.

PETTERSEN, E. F. et al. UCSF chimera – a visualization system for exploratory research

and analysis. J. Comp. Chem., v. 25, n. 13, p. 1605-1612, 2004.

PFITZER, G. Invited Review: Regulation of myosin phosphorylation in smooth

muscle. Journal Of Applied Physiology, v. 91, n. 1, p.497-503, jul. 2001.

PINO, R.Z.; FEELISCH, M. Bioassay Discrimination between Nitric Oxide (NO·) and

Nitroxyl (NO−) Using L-Cysteine. Biochemical And Biophysical Research

Communications, v. 201, n. 1, p.54-62, maio 1994.

PINTO, N.V. et al. Endothelium-dependent vasorelaxant effects of the essential oil from

aerial parts of Alpinia zerumbet and its main constituent 1,8-cineole in rats. Phytomedicine,

v. 16, n. 12, p. 1151–1155, 2009.

125

PLANE, F. et al. Evidence that different mechanisms underlie smooth muscle relaxation to

nitric oxide and nitric oxide donors in the rabbit isolated carotid artery. Br. J. Pharmacol., v.

123, p. 1351–1358, 1998.

POTJE, S.R. et al. Endothelial modulation of a nitric oxide donor complex-induced relaxation

in normotensive and spontaneously hypertensive rats. Life Sciences, v. 201, p.130-140, maio

2018.

PRIVIERO, F.B.M; WEBB, R. Clinton. Heme-Dependent and Independent Soluble

Guanylate Cyclase Activators and Vasodilation. Journal Of Cardiovascular Pharmacology,

v. 56, n. 3, p.229-233, set. 2010.

RAINBOW, R. D.; MACMILLAN, D.; MCCARRON, J. G. The sarcoplasmic reticulum

Ca2+store arrangement in vascular smooth muscle. Cell Calcium, v. 46, n. 5–6, p. 313–322,

2009.

RAJANAYAGAM, M.A.S.; LI, C.G.; RAND, M.J.. Differential effects of hydroxocobalamin

on NO-mediated relaxations in rat aorta and anococcygeus muscle. British Journal Of

Pharmacology, v. 108, n. 1, p.3-5, jan. 1993.

RAJENDRAN, P. et al. The Vascular Endothelium and Human Diseases. International

Journal Of Biological Sciences, v. 9, n. 10, p.1057-1069, 2013.

RANG, H.P. et al. Farmacologia. Rio de Janeiro, Elsevier, 7ed., 2011.

RANG, H.P. et al. Pharmacology. USA: Churchill Livingstone, 6ed., 2007.

RITCHIE, D. W.; KEMP, G. J. Protein docking using spherical polar Fourier correlations.

Proteins, v. 39, n. 2, p. 178-194, 2000.

RODRIGUES, G.J. et al. Caveolae dysfunction contributes to impaired relaxation induced by

nitric oxide donor in aorta from renal hypertensive rats, JPET, 323, 831–837, 2007.

126

RODRIGUES, G.J. et al. Vitamin C improves the effect of a new nitric oxide donor on the

vascular smooth muscle from renal hypertensive rats, Nitric Oxide, v. 18, p. 176–183, 2008.

RUBANI, G.M.; ROMERO J.C.; VANHOUTTE P.M. Flow-induced release of endothelium-

derived relaxing factor. Am J Physiol., v. 250: p. 1145-9, 1986.

RUSSWURM, M.; KOESLING, D. NO activation of guanylyl cyclase. The Embo Journal,

v. 23, n. 22, p.4443-4450, 28 out. 2004.

SÁ, D.S. et al. Non-nitric oxide based metallovasodilators: synthesis, reactivity and biological

studies. Dalton Trans; v. 44(30): p. 13633-40, 2015

SAWABE, T. et al. A novel soluble guanylate cyclase activator with reduced risk of

hypotension by short-acting vasodilation. Pharmacology Research & Perspectives, v. 7, n.

2, p.1-9, 4 mar. 2019.

SILVA, B. R. et al. Nitric Oxide Signaling and the Cross Talk with Prostanoids Pathways in

Vascular System. Medicinal Chemistry, v. 13, n. 4, p.319-333, 5 maio 2017.

SILVA, C.D.S. et al. Thiocarbonyl-bound metallonitrosyl complexes with visible-light

induced DNA cleavage and promising vasodilation activity. Journal Of Inorganic

Biochemistry, v. 182, p.83-91, maio 2018.

SOARES, K.C.N. Estudo do efeito vasorrelaxante e hipotensor do extrato hidroalcoólico

da Polygala paniculata L. em ratos. 2008. 85 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) –

Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2008.

SOLTAU, S.R. et al. Aqueous light driven hydrogen production by a Ru-ferredoxin-Co

biohybrid. Chem Commun (Camb), 51(53), p. 10628-31, 2015.

SOMLYO, A.P.; SOMLYO, A.V. Signal transduction and regulation in smooth muscle.

Nature, v. 372, p. 231-236, 1994.

127

STONE, J. R.; SANDS, R. H., DUNHAM; W. R.; MARLETTA, M. A. Biochem. Biophys.

Res. Commun. 207, 572-577, 1995.

STOTT, J. B.; JEPPS, T. A.; GREENWOOD, I. A. KV7 potassium channels: A new

therapeutic target in smooth muscle disorders. Drug Discovery Today, v. 19, n. 4, p. 413–

424, 2014.

TAKAHASHI T.; ONO H, ONO Y.; ISHIMITSU T.; MATSUOKA H: Combination therapy

with telmisartan and spironolactone alleviates L-NAME exacerbated nephrosclerosis with an

increase in PPAR-g and decrease in TGF-b1. Int Heart J., 48, 637–647. 2007.

(CONSERTAR NO TEXTO O ANO)

TARKIN, J. M.; KASKI, J. C. Vasodilator Therapy: Nitrates and Nicorandil. Cardiovascular

Drugs And Therapy, v. 30, n. 4, p.367-378, 16 jun. 2016.

TEIXEIRA, B.C. et al. Inflammatory markers, endothelial function and cardiovascular

risk. Jornal Vascular Brasileiro, v. 13, n. 2, p.108-115, abr. 2014.

TEÓFILO, T.M. et al. Mechanism of the vasorelaxant effect induced by trans-4-methyl-β-

nitrostyrene, a synthetic nitroderivative, in rat thoracic aorta. Clinical And Experimental

Pharmacology And Physiology, v. 44, n. 7, p.787-794, 28 jun. 2017.

TEP-AREENAN, P.; KENDALL, D. A.; RANDALL, M. D. Mechanisms of vasorelaxation

to testosterone in the rat aorta. European Journal Of Pharmacology, v. 465, n. 1-2, p.125-

132, mar. 2003.

TOUSOULIS et al. The role of nitric oxide on endothelial function. Current Vascular

Pharmacology, v. 10, n. 1, p.4-18, jan. 2012.

VANHOUTTE, P M et al. Modulation of Vascular Smooth Muscle Contraction by the

Endothelium. Annual Review Of Physiology, v. 48, n. 1, p.307-320, out. 1986.

128

WALSH, M. P.. Vascular smooth muscle myosin light chain diphosphorylation: Mechanism,

function, and pathological implications. Iubmb Life, v. 63, n. 11, p.987-1000, out. 2011.

WANG, Y et al. Exercise improves the dilatation function of mesenteric arteries in

postmyocardial infarction rats via a PI3K/Akt/eNOS pathway-mediated

mechanism. American Journal Of Physiology-heart And Circulatory Physiology, v. 299,

n. 6, p.2097-2106, dez. 2010.

WEBB, R. Clinton. Smooth muscle contraction and relaxation. Advances In Physiology

Education, v. 27, n. 4, p.201-206, dez. 2003.

WINQUIST, R. J. et al. Atrial natriuretic factor elicits an endothelium-independent relaxation

and activates particulate guanylate cyclase in vascular smooth muscle. Proceedings Of The

National Academy Of Sciences, v. 81, n. 23, p.7661-7664, dez. 1984.

WONGSAWATKUL, O. et al. Vasorelaxant and antioxidant activities of Spilanthes acmella

Murr. International Journal of Molecular Sciences, v. 9, p. 2724-2744, 2008.

ZENG, L. et al. Ruthenium(II) Complexes with 2-Phenylimidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline

Derivatives that Strongly Combat Cisplatin-Resistant Tumor Cells. Sci Rep, 6, p. 19449,

2016.

ZHANG, L. et al. Comprehensive review in current developments of imidazole-based

medicinal chemistry. Med Res Rev, 34(2), p. 340-437, 2014.

ZHANG, Q. et al. Formaldehyde regulates vascular tensions through nitric oxide-cGMP

signaling pathway and ion channels. Chemosphere, v. 193, p.60-73, fev. 2018.

ZHAO, Y. et al. Inhibition of Soluble Guanylate Cyclase by ODQ. Biochemistry, v. 39, n.

35, p.10848-10854, set. 2000.

129

ANEXO A - FOLHA DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE

ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ (CEUA-UFC)

universidade federal do cearÁ faculdade de medicina ... · jeane bezerra jorge, luiz gonzaga de...

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