universidade federal do parÁ instituto de ciÊncias ......everton, thaigo leite, jean, jaciara,...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
EFEITOS DA INIBIÇÃO DA ENZIMA NADPH OXIDASE SOBRE O
ESTRESSE OXIDATIVO E A SÍNTESE DE OXIDO NÍTRICO EM CAMUNDONGOS
INFECTADOS PELO Plasmodium berghei
ANA CAROLINA MUSA GONÇALVES UBERTI
Belém – Pará
2014
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ANA CAROLINA MUSA GONÇALVES UBERTI
AVALIAÇÃO TEMPORAL DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA
ENZIMA NADPH OXIDASE SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO, A
SÍNTESE DE OXIDO NÍTRICO E A INDUÇÃO DA PARASITEMIA EM
CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO Plasmodium berghei
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará como requisito parcial para a
obtenção do grau de Doutor em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário.
Belém – Pará
2014
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Dados Internacional de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema de Biblioteca da UFPA _______________________________________________________
Uberti, Ana Carolina Musa Gonçalves, Efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase sobre o
estresse oxidativo e a síntese de oxido em camundongos infectados pelo Plasmodium berghei / Ana Carolina Musa Gonçalves Uberti – 2014.
Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de
Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, 2014.
1. Malária. 2. Estresse oxidativo. 3. NADPH-oxidase. 4. Óxido Nítrico. 5. Superóxido. 6. Plasmodium berghei. _______________________________________________________
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ANA CAROLINA MUSA GONÇALVES UBERTI
AVALIAÇÃO TEMPORAL DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO DA ENZIMA
NADPH OXIDASE SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO, A SÍNTESE DE OXIDO
NÍTRICO E A INDUÇÃO DA PARASITEMIA EM CAMUNDONGOS INFECTADOS
PELO Plasmodium berghei
Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo ICB/UFPA
Banca examinadora: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela Laboratório de Farmacodinâmica ICS/UFPA Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves Laboratório de Tecnologia Biomolecular ICB/UFPA Prof. Dr. Flávio de Vasconcelos Laboratório de Toxicologia ICS/UFPA Prof. Dr. José Luis Fernandes Vieira Laboratório de Toxicologia ICS/UFPA Profa. Dra. Marcela Pinhel (Suplente) Laboratório de Estudos e Nutrigenômica Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP
Belém, 13 de fevereiro de 2014
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“O conhecimento nos faz responsáveis”
Che Guevara
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades,
lembrai-vos de que as grandes coisas do homem
foram conquistadas do que parecia impossível”
Charles Chaplin
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DEDICO ESTE TRABALHO
Ao meus pais, Aparecido e Fátima, pessoas maravilhosas que sempre me
incentivaram a correr atrás dos meus sonhos, apoiando e orientando-me em todas
as horas de medos (fraquezas) e ansiedade, que souberam ser compreensivos e
tolerantes, ensinando-me com tanta sabedoria a confiar em minha intuição. Obrigada
por serem meus melhores amigos, o meu suporte, a minha fortaleza, a minha
inspiração!! A Vocês, meu “Bem” mais precioso, os responsáveis por eu vencer mais
uma importante etapa da minha vida, não há Muito Obrigada que agradeça... Sem
palavras para expressar o quanto são maravilhosos!!!!
Ao meus avós, Jamal e Clarinda, que pegaram na minha mão quando
criança, e me ensinaram os primeiros passos no saber... Que sempre admiraram e
oraram por mim, motivando-me com palavras carinhosas a seguir em frente, e nunca
desistir. Sem dúvida, sou um pouquinho de cada um de vocês.
Aos meus irmãos, Vitor e Ana Flávia, que amo tanto e que torcem muito pelo
meu sucesso... Saibam que ser a irmã mais velha, nos impõem muitas
responsabilidades e a maior delas é tentar ser de forma humilde mas sincera um
referencial positivo na vida de Vocês!! Obrigada por acreditarem e me apoiarem
sempre.... esta vitória também é para Vocês!!
Ao meu marido Rafael, que veio como um presente belo de Deus em minha
vida!!! Você me ensinou muito, com seu exemplo de superação e sucesso não só
profissional, mas especialmente pessoal.... Ao seu lado, concretizei mais um sonho
(doutorado), mas propiciaste a minha vida algo de importância espiritual, agradeço-
lhe por me aproximar ainda mais de Deus, me apresentando a Doutrina Espírita, que
me fez (e faz) refletir diariamente em como ser um Ser Humano melhor!!! Obrigada
meu Amor por dividir comigo momentos de correria, onde a paciência e a tolerância
para com meu estresse foram sem dúvida muito importante ao nosso bom
relacionamento e amadurecimento pessoal, tudo isso graças ao seu Amor, ao bom
senso e ao companheirismo me dedicado. Obrigada por tanto carinho dispensado
nestes momentos de desespero (de estudante), me mostrando sempre que sou e
posso ser ainda mais forte, encarando os meus obstáculos de frente. Por fim,
obrigada pela família maravihosa que formamos, e pelo presente tão abençoado de
ser Mãe, cujo o fruto já cresce (27 semanas) dentro de meu ser: a Ana Lis!!!
Amo Vocês!!
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da Vida, pela oportunidade concedida, em especial por esta
conquista... enfim por estar sempre ao meu lado!!!
Aos meus pais, Aparecido e Fátima, que além de me darem a vida, me deram
a sabedoria de viver, a paciência de esperar, a força para vencer e a coragem para
me re-erguer. Que me dão amor incondicional. Que foram e ainda são exemplos de
pessoas virtuosas para mim!
Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras pessoas
para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto pode mudar a
nossa vida e contribuir para o nosso sucesso.
Ao meu orientador, Prof. Livre-Docente Sandro Percário, docente do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará e responsável pelo LAPEO
– Laboratório de Pesquisa em Estresse Oxidativo, por me receber em seu grupo de
pesquisa com as portas abertas, após breve entrevista, e acreditou em meu
potencial. Um Ser Humano de raríssima índole, verdadeiro exemplo de
determinação e de liderança a ser alcançado; meu muito obrigada pelo incentivo,
apoio, orientação e compreensão ofertado, foi muito importante aprender com o
Senhor. Obrigada pela confiança e dedicação incessante na minha formação.
Ao Laboratório de Pesquisa em Estresse Oxidativo – LAPEO, local onde
desenvolvi toda minha pesquisa, desde o levantamento bibliográfico até as etapas
laboratoriais. Não me esquecendo das reuniões científicas que enriqueciam meus
conhecimentos a cada semana.
Aos Prof. Dr. José Luis, Profa. Dra. Liliam e Prof. Dr. Flávio, por colocar a
disposição o Laboratório de Toxicologia, bem como suas experiências.
À chefia do Biotério de Criação e Manutenção do Instituto de Ciências
Biológicas – ICB da UFPA, em especial ao amigo e colaborador Reginaldo, pelo
apoio e orientações sobre questões burocráticas, éticas e experimentais.
A equipe de manutenção do biotério do ICB, em especial ao Sr. Amarildo e
Marcelinho, que estiveram sempre presentes oferecendo o auxilio necessário e
dedicação durante todo o experimento, além de um convívio alegre e carismático.
Aos estagiários graduandos da área da saúde, Taiana, Íngride, Bruna, Breno,
Everton, Thaigo Leite, Jean, Jaciara, Jone, Victor, Marcelle, Iane, Rosian, João
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Clauder, Langela e Luan pelo auxílio e motivação em aprender mais para também
ensinar.
Aos amigos especiais da Iniciação Científica: Rafael Quadros, Mayani Ribeiro
e Aline Barbosa, pela amizade e dedicação sempre prontos a ajudar; do Mestrado:
Daniele Ribeiro, Marcela Figueiredo, Maria do Céu Souza e Thiago Vilhena pela
presença e auxílio sempre que eu necessitava de apoio; e do Doutorado: à Paula
Costa Laurindo, ao Danilo Reymão, à Amanda Soares e à Michelli Ferreira, que me
ensinaram e colaboraram na realização deste trabalho de forma ímpar, estando ao
meu lado até mesmo aos finais de semana (dia de eutanásia), mas principalmente
pela amizade, força, atenção e companheirismo ao longo dessa jornada.
Todos Vocês foram de importância extrema no meu aprendizado!!
Não poderia deixar de agradecer de forma mais que especial a quem dividiu
seu sonho comigo, a minha amiga Paula Costa Laurindo, que o saber da minha
possibilidade em mudar de cidade, permitiu que eu desenvolvesse parte da sua tese
de doutorado, dividindo comigo responsabilidades tão grandes, mas acima de tudo,
acreditando que tudo daria certo, não medindo esforços a me auxiliar! Muito
obrigada Amiga, não sou muito boa com as palavras, e Você sempre me faz chorar,
mas saiba que sou imensamente grata por tudo!
A minhas amigas que moram longe Dra. Marcela Pinhel, Ma. Maysa Araújo,
Dra. Patrícia Lopes pela linda amizade iniciada desde o início da minha formação
científica, ou mesmo à minha grande amiga pessoal Paula Porto e Rosilene Muraro,
agradeço a Vocês pelo carinho incentivador e motivacional, sem contar altas horas
de desabafos, as alegrias e tristezas compartilhadas quando algo não saia como
esperávamos.
Ao Laboratório do Instituto de neurociências da UFPA pelo fornecimento da
cepa do Plasmodium berghei.
Ao estatístico Rogério Santos pela ajuda na realização das análises
estatísticas, competência e paciência.
As instituições de fomento e pesquisa, em especial a Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida e
concomitante incentivo, imprescindíveis para a execução desse trabalho.
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 10
LISTA DE TABELAS E QUADROS 14
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 16
RESUMO 18
ABSTRACT 19
1. INTRODUÇÃO 20
1.1 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA 23
1.2 AGENTE ETIOLÓGICO E CICLO BIOLÓGICO DA MALÁRIA 25
1.3 PATOGENIA DA MALÁRIA 28
1.4 RADICAIS LIVRES E O ESTRESSE OXIDATIVO 31
1.4.1 Malária e o Estresse Oxidativo 33
1.4.1.1 Fontes de Estresse Oxidativo 34
1.4.1.2 Óxido Nítrico e a Malária 38
1.5 SISTEMA NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTÍDEO FOSTATO OXIDASE – NADPH oxidase / NOX
40
1.5.1 Malária e a NOX 42
1.5.1.1 Apocinina – Inibidor da NOX 43
1.6 OBJETIVOS 46
1.6.1 Objetivo Geral 46
10
1.6.2 Objetivos Específicos 46
2 MATERIAL E MÉTODOS 47
2.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO 47
2.1.1 Grupos Experimentais 48
2.2 INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS 50
2.3 INIBIÇÃO DA NOX – TRATAMENTO COM APOCININA 50
2.3.1 Preparo e administração da Solução de Apocinina 50
2.3.2 Determinação do Consumo de Líquidos 51
2.4 DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA 51
2.5 EUTANÁSIA E OBTENÇÃO DE AMOSTRAS 52
2.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PULMÃO E CÉREBRO 53
2.7 DOSAGEM DE SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)
53
2.7.1 Preparo de Reagentes 54
2.7.1.1 Ãcido Tiobarbitúrico 54
2.7.1.2 Solução Padrão de MDA 54
2.7.2 Procedimento Técnico 54
2.7.3 Curva Padrão do TBARS 55
2.8 DOSAGEM DE NITRATOS E NITRITOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO
57
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 58
3 RESULTADOS 59
3.1 PARASITEMIA 59
11
3.2 SOBREVIDA 61
3.3 DOSAGENS PULMONARES 63
3.3.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 63
3.3.2 Nitritos e Nitratos 66
3.3.3 Estudos de Correlação em Amostras Pulmonares 69
3.3.3.1 Correlação TBARS e Nitritos e Nitratos 69
3.3.3.2 Correlação TBARS e Parasitemia 71
3.3.3.3 Correlação entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia 72
3.4 DOSAGENS CEREBRAIS 74
3.4.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 74
3.4.2 Nitritos e Nitratos 77
3.4.3 Estudos de Correlação em Amostras Cerebrais 81
3.4.3.1 Correlação TBARS e Nitritos e Nitratos 81
3.4.3.2 Correlação TBARS e Parasitemia 83
3.4.3.3 Correlação entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia 84
4 DISCUSSÃO 85
4.1 ACHADOS PULMONARES E CEREBRAIS 88
5 CONCLUSÕES 93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
APÊNDICES 108
ANEXOS 128
12
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa de risco da malária por Município de infecção (Brasil, 2011).
24
Figura 2: Ciclo evolutivo do Plasmodium. A) Ciclo Hepático (A e B – Ciclo esquizogônico; B) Ciclo hemático; C) Ciclo esporogônico. 1) Esporozoíto; 2) Merozoítos sanguíneos; 3) Penetração de merozoítas nas hemácias; 4) Esquizonte; 5) Esquizonte maduro; 6) Gametócitos; 7) Gametócitos maduros (microgametócito e macrogametócito); 8) Microgametócito exoflagelado; 9) Oocineto; 10) Oocisto; 11) Esporozoítos. (Adaptado de CDC, 2010).
27
Figura 3: Sistema antioxidante enzimático. O2●- = radical superóxido;
H2O2 = peróxido de hidrogênio; O2= oxigênio; H2O = água; H+ = cátion hidrogênio; GSH = Glutationa reduzida; GSSH = Glutationa oxidada; GSH-Px = Glutationa peroxidase; SOD = Superóxido dismutase.
33
Figura 4. Representação esquemática da cadeia de transporte de elétrons da mitocondria (CTE) e o acoplamento e desacoplamento da fosforilação oxidativa. Os substratos NADH e FADH2 reduzido são oxidados, com a passagem dos elétrons pelos complexos enzimáticos da CTE e o bombeamento dos prótons (H+) para dentro do espaço intermembranar das mitocôndrias, formando um grande potencial de membrana mitocondrial conhecida como força motriz protônica. A energia perdida pelos prótons reentra na matriz mitocondrial através da ATP sintase (A) e é usada para geração de energia de ATP a partir de ADP. Os prótons também pode voltar a entrar na matriz por meio das proteínas de desacoplamento (U), tal como UCP2, sem a produção de ATP (Fariss et al., 2005).
34
FIGURA 5: Reações de Haber-Weiss e Fenton. (1) Reação de Haber Weiss: O radical ânion superóxido (O2
•-) reage com o peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de metais de transição, para produzir radicais hidroxila (HO•), íons hidroxila (HO-) e oxigênio (O2). (2) Reação
de Fenton: O peróxido de hidrogênio (H2O2) é ionizado na presença de íons ferrosos, levando à produção de radicais hidroxila (OH•) e íons
hidroxila (HO-). O íon ferroso (Fe+2) sofre oxidação, sendo liberado na forma de íon férrico (Fe+3).
35
Figura 6: A) Sequência de eventos que ocorrem na síndrome de isquemia e reperfusão (SIR). B) Integração da SIR com a reação de Haber-Weiss. Legenda: ATP=Trifosfato de adenosina; ADP=Difosfato de adenosina; AMP= Monofosfato de adenosina; Ca+2= íon cálcio; O2= Oxigênio; O2
•-=Radical Superóxido; H2O2 = peróxido de hidrogênio; OH = íon hidroxila; OH• = Radical Livre Hidroxila; H2O = Água (Adaptado de
36
14
Percário et al., 2008).
FIGURA 7: Estrutura da NOX fagocítica. A gp91phox é o ligante do NADPH com função transportadora de elétrons na NOX ativa. A Produção de O2
•- extracelular ocorre pela redução de um elétron do O2 via gp91phox, usando nicotinamida adenina dinucleotídeo fostato reduzida – NADPH (Adaptado de Dusting et al., 2005).
40
Figura 8: A) O complexo enzimático NADPH oxidase (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase – NOX) nos neutrófilos consiste em duas subunidades de membrana do citocromo b558: a subunidade p22phox e gp91phox/NOX2, e três co-fatores citosólicos (p67phox, 47 phox e p40phox) além de uma GTPase Rac 2, necessários para o metabolismo oxidativo. B) Agregação do complexo NADPH oxidase em fagócitos A Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzida (NADPH) serve como substrato para a redução do O2 em O2
•-, que é rapidamente transformado em H2O2 espontaneamente ou pela superóxido dismutase – SOD (Bedard & Krause, 2007).
41
Figura 9: Molécula de Apocinina (Ximenes et al., 2007) 44
Figura 10: Molécula de Diapocinina (Ximenes et al., 2007) 45
Figura 11: Curva padrão das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS).
56
Figura 12: Curva Padrão do Óxido Nítrico. 57
Figura 13: Progressão temporal da parasitemia de camundongos infectados com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Apo + (Grupo A): Grupo tratado com o inibidor da NOX (Apocinina); Apo - (Grupo C): Grupo não tratado com Apocinina (Controle).
59
Figura 14: Percentual de sobrevida de camundongos infectados com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho) tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (roxo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).
61
Figura 15: Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium
berghei, submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Grupo A
(vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e
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15
ingestão de água).
Figura 16: Concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).
67
Figura 17: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Nitritos e Nitratos (NN) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
70
Figura 18: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e percentual de Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
71
Figura 19: Correlações entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
72
Figura 20: Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com
74
16
P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).
Figura 21: Concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com P. berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).
78
Figura 22: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Nitritos e Nitratos (NN) em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo P. berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
82
Figura 23: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e percentual de Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
83
Figura 24: Correlações entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
84
17
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Quadro 1 – Distribuição de grupos de animais de acordo com o tempo
de infecção.
50
Quadro 2 – Número de hemácias a serem contadas a partir de uma
estimativa inicial da parasitemia.
53
Quadro 3 – Protocolo de Diluições do padrão de malondialdeido (MDA)
para curva padrão
60
Tabela 1 – Evolução da parasitemia dos camundongos infectados com
o Plasmodium berghei submetidos e não submetidos ao tratamentos
com Apocinina de acordo com os dias de infecção.
60
Tabela 2 – Valores de p# para as comparações entre os tempos de
cada grupo para Parasitemia.
60
Tabela 3 – Valores de p# para as comparações entre os grupos a cada
tempo para Parasitemia.
62
Tabela 4 – Percentual de sobrevida de camundongos infectados ou não
com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com
Apocinina.
64
Tabela 5 – Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou
não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento
com Apocinina.
65
Tabela 6 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada
grupo para níveis de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
(TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o P.
berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
65
Tabela 7 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada
tempo para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em
pulmão de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e
submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
65
Tabela 8 – Concentração de Nitritos e Nitratos (NN) nos pulmões de
camundongos infectados com o Plasmodium berghei e submetidos ou
não ao tratamento com Apocinina.
67
18
Tabela 9 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada
grupo para níveis de Nitritos e Nitratos (NN) nos pulmões de
camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e
submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
67
Tabela 10 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada
tempo dos Nitritos e Nitratos (NN) em pulmão de camundongos
infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina.
68
Tabela 11 – Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou
não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento
com Apocinina.
75
Tabela 12 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada
grupo para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos
cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium
berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
76
Tabela 13 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada
tempo para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em
cérebros de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei
e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
76
Tabela 14 – Concentração de Nitritos e Nitratos (NN) produzidos nos
cérebros de camundongos infectados com o Plasmodium berghei e
submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
78
Tabela 15 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada
grupo para Nitratos e Nitritos (NN) nos cérebros de camundongos
infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina
79
Tabela 16 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada
tempo para Nitratos e Nitritos (NN) em cérebros de camundongos
infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao
tratamento com Apocinina.
80
19
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACT Combinações com Derivados de Artemisina
ATP Trifosfato de Adenosina
Ca++ Íon Cálcio
cNOS Óxido Nítrico Sintase Constitutiva
CPH Complexo Principal de Histocompatibilidade
CTE Cadeia de Transporte de Elétrons
EO Estresse Oxidativo
ERN Espécies Reativas de Nitrogênio
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo oxidada
FADH2 Flavina Adenina Dinucleotídeo reduzida
Fe Ferro
Fe2+ Cátion Ferroso
Fe3+ Cátion Férrico
G6PD Glicose-6-Fosfato Desidrogenase
H+ Hidrogênio
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
Hb Hemoglobina
HO- Íon hodroxila
HO2- Hidroperoxila
IFN-γ Interferon Gama
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
iNOS Óxido Nítrico Sintase induzível
IPA Incidência Parasitária Anual
LDL Lipoproteína de Baixa Densidade
LT Linfócito T
MC Malária Cerebral
MDA Malondialdeído
MPO Mieloperoxidase
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Hidreto
NADP+ Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato
20
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida
NK Células Natural Killer
NO Óxido Nítrico
NO2 Nitrito
NO3 Nitrato
NOS Óxido Nítrico Sintase
NOX Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase
O2 Oxigênio Molecular
O2•- Radical Ânion Superóxido
OH• Radical Hidroxila
OMS Organização Mundial da Saúde
ONOO- Peroxinitrito
PDGF Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta
R•- Radical Alquila
RL Radical Livre
ROO•- Radical peroxila
SIM Sistema de Informação sobre Mortalidade
SIR Síndrome de Isquemia e Reperfusão
SOD Superóxido Dismutase
TBA Ácido Tiobarbitúrico
TCD4+ Linfócitos TCD4+
TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa
21
RESUMO
A malária constitui uma das mais importantes doenças parasitárias negligenciadas e apresenta-se bastante difundida no mundo. A resposta à infecção causada pelos plasmódios manifesta-se primariamente pelo mecanismo de defesa natural do organismo hospedeiro com envolvimento dos fagócitos e, consequentemente, produção de grande quantidade de espécies reativas do oxigênio (ERO), tais como o radical superóxido por ação da enzima NADPH oxidase (Nox) durante a explosão respiratória realizada pelos fagócitos. Com o objetivo de avaliar os efeitos da inibição das enzimas Nox sobre o estresse oxidativo associado à malária causada pelo Plasmodium berghei, foram utilizados 230 camundongos divididos em 4 grupos: A = infectados com P. berghei e submetidos à inibição da NOX, B = submetidos à inibição da Nox, C= infectados com P. berghei e D = não infectados e sem uso do inibidor da Nox. Cada grupo foi subdividido em 5 subgrupos que foram submetidos à eutanásia após 24h, 5, 10, 15 ou 20 dias após o início do estudo. A inibição do complexo enzimático NADPH oxidase foi realizada com 1,5mM de apocinina em água potável e se iniciou cinco dias antes do período de estudo, sendo mantida diariamente até o dia de eutanásia dos animais, quando foram obtidos o cérebro e os pulmões doas animais para avaliação da peroxidação lipídica por meio das substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e determinação dos metabólitos do óxido nítrico, através da quantificação de nitritos e nitratos (NN), bem como o sangue total para avaliação da parasitemia. Os resultados encontrados mostram que o grupo A (6,67%) apresentou menor sobrevida do que o grupo C (20%), sugerindo que o estresse oxidativo possa ter um papel protetor na malária, uma vez que quando houve diminuição da produção de superóxido, observou-se menor sobrevida. No entanto, não foram observadas relações entre o tratamento com a apocinina e os níveis de TBARS ou NN. Os resultados apresentados sugerem ainda que, embora a inibição da NADPH oxidase tenha diminuído a sobrevida, o uso dessa substância não promoveu alterações significativas no perfil oxidativo nas amostras pulmonares e cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei e, portanto, a síntese de radicais superóxido não seja um componente importante do estresse oxidativo do hospedeiro frente à infecção pelos plasmódios.
Palavras chaves: Malária, Estresse Oxidativo, Superóxido, NADPH-oxidase, Óxido Nítrico, Superóxido, Plasmodium berghei.
22
ABSTRACT
Malaria is one of the most important neglected parasitic diseases and is quite widespread in the world. The response to the infection caused by plasmodium is manifested primarily by natural defense mechanism of the host organism with involvement of phagocytes and, consequently, the production of large quantities of reactive oxygen species (ROS), such as the superoxide radical by the action of the enzyme NADPH oxidase (Nox) during phagocytes’ respiratory burst. With the objective to evaluate the effects of the inhibition of Nox enzymes on the oxidative stress associated with Plasmodium berghei malaria, 230 mice were divided into 4 groups : A = infected with P. berghei and subjected to inhibition of Nox, B = subjected to inhibition of Nox, C = infected with P. berghei, and D = not infected and with no inhibition of Nox. Each group was subdivided into 5 subgroups that underwent euthanasia after 24h, 5, 10, 15 or 20 days after the beginning of the study. The inhibition of the NADPH oxidase enzyme complex was performed with 1.5mM of apocinin in drinking water and began five days before the period of study, being maintained daily until the day of euthanasia of the animals, when brain and lungs were obtained the for evaluation of lipid peroxidation by means of the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and determination of nitric oxide metabolites through the quantification of nitrites and nitrates (NN), as well as the whole blood for evaluation of parasitemia. The results show that group A (6.67%) had lower survival than the group C (20%), suggesting that oxidative stress may have a protective role in malaria, once that when there was a decrease in the production of superoxide, lower survival was observed. However, no relationships were observed between the treatment with apocinin and TBARS levels or NN. The presented results suggest that, although the inhibition of NADPH oxidase has decreased the survival rate, the use of this substance did not promote significant changes in oxidative profile in lung and brain samples in mice infected with P. berghei and, therefore, the synthesis of superoxide radicals is not an important component of the host’s oxidative stress against plasmodium infection.
Key words: Malaria, Oxidative Stress, Superoxide, NADPH -oxidase, Nitric Oxide, Plasmodium berghei.
23
1 INTRODUÇÃO
A malária constitui uma das mais importantes doenças parasitárias de regiões
tropicais e subtropicais e apresenta-se bastante difundida no mundo (Tobón et al.,
2006; França et al., 2008; Parise, 2009; Garcia et al., 2010). É uma doença
frequentemente associada aos viajantes que estiveram nas áreas endêmicas (Garcia
et al., 2010), caracterizada por desencadear acessos periódicos de febres intensas
que debilitam profundamente os acometidos.
A infecção é causada por um hematozoário intracelular do gênero
Plasmodium e é transmitida ao homem por vetores, representados pelos mosquitos
fêmeas do gênero Anopheles infectadas (França et al., 2008; Parise, 2009).
Segundo informações do Ministério da Saúde, a incidência da malária no
Brasil concentra-se atualmente na região Amazônica (99,8% dos casos; Brasil,
2010a; Brasil, 2013), que é por isto considerada área endêmica para malária (Parisi,
2009; Brasil, 2010b), em função de seus múltiplos fatores biológicos, ecológicos,
geográficos e sociais (Brasil, 2010b). Além disso, a intensa e desordenada ocupação
das periferias das grandes cidades, o desmatamento para extração de madeira,
criação de gado, agricultura e assentamentos, atividades não autorizadas pelos
órgãos competentes, contribuem para o aumento da transmissão da doença (Brasil,
2013).
Apesar de se ter observado um declínio na média do número de casos no ano
de 2011 em todo o país (266.348 casos), quando comparados ao ano de 2000 - que
foi de 615.247 casos(Brasil, 2013) - este índice é de extrema preocupação,
especialmente em doentes infectados com o Plasmodium faciparum, responsável
por cerca de 20% dos casos na região Amazônica, cuja tendencia é ainda crescer
visto que a resistência à droga da terapia aumentou (Brasil, 2012).
De fato, já existem cepas do Plasmodium falciparum resistentes aos
medicamentos usados atualmente, tais como a cloroquina (França et al., 2008) e
artemisinina (Silva, 2011; Gomes, 2011). No entanto, os fatores que levam a essa
resistência ainda não são bem conhecidos, devido à ausência na compreensão
completa dos mecanismos de ação do parasita no organismo humano, ou seja,
sobre a fisiopatogenia da doença.
Nas últimas décadas, diversos pesquisadores vêm estudando o envolvimento
de agentes oxidantes alterando o equilíbrio redox em diversos processos
24
fisiopatológicos (Gutierrez et al., 2010), bem como na malária (Pablón et al., 2002;
Huber et al., 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al.,
2004; Yazar et al., 2004; Wilmanski et al., 2005; Kumar et al., 2005; Jaramillo et al.,
2005; Sohail et al., 2007).
Em relação ao equilíbrio redox no organismo humano frente à infecções
parasitárias, um fator importante é a relação parasita-hospedeiro, uma vez que a
intensidade da patogenicidade vai decorrer do desequilíbrio deste balanço, reflexo
das concentrações locais das espécies pró e antioxidantes produzidas pelo
hospedeiro e pelo parasita. Este desequilíbrio promove o estresse oxidativo, quando
a ação antioxidante é deficiente ou inibida, ou por meio da produção de radicais pelo
hospedeiro com o intuito de debelar a infecção (Ferreira & Matsubara, 1997;
Vasconcelos et al., 2007).
Pouco se sabe sobre o envolvimento do estresse oxidativo na infecção
malárica. Os mecanismos precisos de seu envolvimento ainda são incertos: alguns
autores sugerem um papel protetor, enquanto outros alegam uma relação com a
fisiopatologia da doença (Potter et al., 2005). De fato, alguns estudos sugerem que a
geração de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) e Nitrogênio (ERN) associado ao
estresse oxidativo, desempenha um papel crucial no desenvolvimento de
complicações sistêmicas causada pela malária (Keller et al., 2004).
A produção de algumas ERO, como os radicais superóxido (O2-) e a
hidroperoxila (HO-2) ocorre a partir do metabolismo do oxigênio molecular (O2), que é
potencializada na presença de metais, como o ferro (Fe), liberada durante o estágio
eritrocítico do plasmódio (Ferreira & Matsubara, 1997; Kumar et al., 2005; Lyaweh &
Onigbinde, 2009; Circu & Aw, 2010).
Outro radical livre que parece estar envolvido na doença é o Óxido Nítrico
(NO; Pablón et al., 2002; Huber et al. 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et
al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al. 2004, Pino et al., 2005), cuja produção é
mediada por citocinas, em especial pelo Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e
pelo Interferon Gama (INF-γ), que ativam as enzimas responsáveis por sua
produção, denominadas Óxido Nítrico Sintases (NOS; Moncada et al., 1991;
Marletta, 1993).
O papel do NO na malária ainda é controverso, apesar de apresentar ação
citotóxica e citostática contra microrganismos, parasitas e células tumorais,
geralmente vem acompanhado de grande produção de ERO (Pfeilschifter et al.,
25
2003; Shirley, 2005). Há autor que afirme que o acometimento cerebral da doença
seja uma consequência da produção de quantidades elevadas de NO para promover
a morte dos parasitas, enquanto outro defende a sugestão de que a malária cerebral
(MC) decorra de uma baixa biodisponibilidade deste gás (Favre et al., 1997;
Gramaglia et al., 2006).
Entre as diferentes fontes de produção de radicais livres (RL) na malária,
destaca-se a atividade da família de proteínas Nicotinamida Adenina Dinucleotideo
Fosfato Oxidase (NADPH oxidase, ou NOX), observadas na imunidade inespecífica,
pela ação dos fagócitos durante a invasão dos plasmódios e na sua eliminação
(Bedard & Krause, 2007; Brown & Griendling, 2009). Esta enzima pode, portanto,
participar dos mecanismos fisiopatológicos que cursam com a doença, uma vez que
produzem ERO não como subproduto, mas como principal produto do seu sistema
enzimático. Por isso, tem recebido atenção especial nos últimos anos, uma vez que
a sua relação com o desequilíbrio redox e a patogênese de inúmeras doenças ainda
é pouco conhecida (Lassègue & Clempus, 2003; Geiszt, 2006; Brown & Griendling,
2009).
O esclarecimento da correlação entre as vias de produção de RL e o
comportamento da patogenia da malária, motiva a realização de muitos estudos, o
que justifica este trabalho, pois auxiliará no melhor entendimento a respeito da
fisiopatogenia das doenças infecciosas como a malária, bem como pode possibilitar
avanços no tratamento e/ou prevenção da malária (The malERA Consultative
Group, 2011).
O presente estudo pesquisou a importância da NOX como fonte de estresse
oxidativo na malária e avaliou os efeitos que sua inibição provocou sobre
marcadores da peroxidação lipidíca e sobre a síntese do NO e os correlacionou com
a progressão da parasitemia.
26
1.1 EPIDEMIOLOGIA DA MALÁRIA
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a malária ou paludismo é
a doença tropical infectocontagiosa que mais causa problemas sociais e econômicos
no mundo (Barata, 1995; WHO, 2009). Em 2010, estima-se que ocorreram 219
milhões de casos de malária em todo o mundo (WHO, 2012). Entretanto, foi
observada uma redução no número de mortes de 985.000 no ano de 2000 para
660.000, no ano de 2010, sendo que a República Democrática do Congo e a Nigéria
assumem mais de 40% do total mundial de mortes (WHO, 2012).
Contudo, os dados disponíveis sobre a ocorrência de malária são bastante
imprecisos. Entre os 99 países em que ocorreu a transmissão da malária em 2011,
58 países apresentaram informação completa e consistente sobre os casos de
paludismo, mas estes representam apenas 15% dos casos mundiais estimados. Por
outro lado, nos outros 41 países, em que se calcula ocorrerem 85% dos casos de
malária, há necessidade de reforçar a vigilância, a fim dos programas poderem
identificar e dirigir recursos para as populações mais necessitadas, bem como
responder aos surtos da doença e avaliar os impactos das medidas de controle
(WHO, 2012).
Na América do Sul, a transmissão de malária ocorre nos países que
abrangem a Floresta Amazônica - Brasil, Bolívia, Colômbia, Equador, Guiana
Francesa, Guiana, Peru, Suriname e Venezuela, sendo o Brasil responsável pelo
maior número de casos (PAHO, 2002).
No Brasil, os graus de risco para adoecer de malária são classificados de
acordo com a Incidência Parasitária Anual (IPA), que expressa o número de exames
positivos de malária por mil habitantes em determinado espaço geográfico, no ano
considerado (Brasil, 2010a). As áreas são classificadas como alto risco (IPA
≥50/1.000 hab.), médio risco (IPA entre 10 e 49/1.000 hab.) e baixo risco (IPA
≤10/1.000 hab.). Em 2011, 45 municípios do Brasil foram classificados como alto
risco (todos localizados na região Amazônica), 82 com médio risco e 370 de baixo
risco, de acordo com o representado no mapa da figura 1 (Brasil, 2013).
A malária é transmitida no Brasil por três espécies de parasitos: o
Plasmodium vivax, o P. faciparum e o P. malarie. Dados epidemiológicos recentes
sugerem que as espécies P. vivax e P. falciparum são responsáveis por mais de
27
95% dos casos, sendo que destes, o P. vivax pode causar 80% dos casos no Brasil,
uma vez que esta espécie tem distribuição mais ampla nos trópicos, zonas
subtropicais e zonas temperadas (WHO, 2010; Garcia et al., 2010, Brasil, 2010b;
Brasil, 2013).
Figura 1: Mapa de risco da malária por Município de infecção (Brasil, 2011).
A distribuição da malária no Brasil está frequentemente associada às
categorias consideradas como áreas especiais de transmissão, tais comoas áreas
de acampamentos agrários; as áreas indígenas, os garimpos, bem como à abertura
de grandes rodovias e construção de hidroelétricas (Parisi, 2009).
Até 2009, a maioria dos casos de malária na Região Amazônica ocorria em
assentamentos. A partir desse ano, nota-se um aumento do numero de casos em
áreas indígenas, as quais já vinham apresentando tendência de crescimento, com
crescimento de 142,8% no ano 2011 em relação ao ano de 2003. Por outro lado,
houve redução no número de casos em todas as áreas, quando comparados o ano
de 2011 com 2010 (Brasil, 2013).
A mortalidade por malária no Brasil em 2011 (69 óbitos), registrados no
Sistema de Informação sobre Mortalidade do Ministério da Saúde (SIM), representou
28
uma redução de 71,8% em relação ao ano de 2000 (245 óbitos), porém os dados
sobre o número de óbitos por espécies são incompletos, verificando ainda nesse
ano que na maior proporção de óbitos (43,5%) não consta a informação sobre a
espécie causadora, sendo que somente 37,7% foram informados como óbitos
causados por P. vivax e 18,8% por P. falciparum (Brasil, 2013).
Nos últimos anos, Manaus e Porto Velho apresentaram extensas áreas de
aglomerados urbanos em regiões periféricas, importantes locais de propagação da
infecção devido ao intenso fluxo de pessoas procedentes de outros municípios em
busca de oportunidades de trabalho ou necessidades comerciais. Esses municípios
concentraram 26,9% e 22,9% dos casos de malária da Região Amazônica nos anos
de 2003 e 2004 (Parisi, 2009).
O Estado do Pará é um dos que apresenta maior morbidade da doença
(Mascarenhas et al., 2005) e de acordo com a coordenação Estadual de Malária,
70% dos casos acontecem em áreas rurais (SESPA, 2011). Em Belém, 51% dos
650 casos autóctones de malária notificados no ano de 2004 foram procedentes da
ilha de Cotijuba (Região Metropolitana da grande Belém; Renault et al., 2007).
1.2 AGENTE ETIOLÓGICO E CICLO BIOLÓGICO DA MALÁRIA
Os agentes etiológicos da malária são os protozoários do gênero
Plasmodium. As cinco espécies associadas à malária humana são: P. vivax, P.
falciparum, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi (Brasil, 2010b; Singh & Daneshvar,
2010).
O ciclo de vida dos protozoários do gênero Plasmodium está dividido entre o
hospedeiro vertebrado e o inseto vetor (França et al., 2008). O ciclo assexuado do
Plasmodium ocorre no homem e denomina-se ciclo esquizogônico, enquanto que o
ciclo sexuado ocorre dentro do intestino delgado do vetor (França et al., 2008;
Garcia, 2010; CDC, 2010a).
Os vetores da infecção são as fêmeas de mosquitos do gênero Anopheles,
sendo o Anopheles darlingi a espécie mais importante no Brasil (Saraiva et al, 2009),
cujos criadouros principais são depósitos de água limpa, quente, sombreada e de
baixo fluxo, muito comuns na Amazônia brasileira (Brasil, 2010b).
A inoculação das formas infectantes do Plasmodium ocorre durante o repasto
sanguíneo, momento em que os esporozoítos presentes em suas glândulas
29
salivares ganham a corrente sanguínea do hospedeiro e rapidamente invadem as
células do fígado, dando início ao ciclo exo-eritrocítico primário, também conhecido
como o ciclo pré-eritrocítico (França et al., 2008; Garcia, 2010) ou esquizogonia
tecidual (Garcia, 2010; Brasil, 2010c).
O desenvolvimento do parasito nas células do fígado requer
aproximadamente uma semana para o P. falciparum e P. vivax e cerca de duas
semanas para o P. malariae. Pode-se observar a esquizogonia secundária ou
latente nas infecções por P. vivax e P. ovale, na qual alguns parasitos permanecem
em repouso no fígado para apresentam desenvolvimento lento de alguns dos seus
esporozoítos ou, até mesmo, em um momento posterior (Garcia, 2010). Seja qual for
o caso, haverá a formação dos hipnozoítos (do grego hipnos, sono), formas latentes
do parasito no hepatócito responsáveis pelas recidivas da doença, que ocorre
meses ou anos após a infecção inicial (Brasil, 2010c).
É importante diferenciar recaída verdadeira de uma recrudescência. A
primeira refere-se a uma situação na qual a infecção eritrocítica é eliminada e ocorre
uma recidiva depois por causa de uma nova invasão das hemácias pelos merozoitos
do fígado (antigas formas latentes: hipnozoítos), o que teoricamente ocorre apenas
nas infecções por P vivax e P ovale; e a segunda refere-se a uma situação na qual a
infecção não é eliminada das hemácias pelo sistema imunitário ou por terapia e o
número de parasitas nas hemácias começa a aumentar novamente com sintomas
clínicos subsequentes. Neste caso, o fenômeno de recrudescência pode ocorrer nas
infecções causadas por todas as espécies de Plasmodium (Garcia, 2010).
Nas células hepáticas, os protozoários diferenciam-se em forma ovais ou
arredondadas denominadas criptozoítos, que em seguida sofrem multiplicação
assexuada resultando em milhares de novos parasitas (merozoítos) que eclodem na
ruptura de cada hepatócito (Bernan, 2004; Vale et al., 2005; França et al., 2008;
Garcia, 2010; CDC, 2010a).
Ao final do ciclo tecidual, os esquizontes rompem os hepatócitos, liberando
milhares de merozoítos na corrente sanguínea. Cada merozoíto invade um eritrócito,
onde passa por mais uma etapa de multiplicação, produzindo de 12 a 16 merozoítos
por esquizonte (glóbulo vermelho contaminado), iniciando assim a segunda fase do
ciclo chamada esquizogonia sanguínea, fase em que são observados os sintomas
da doença. Durante um período que varia de 48 a 72 horas, o parasito se
desenvolve no interior da hemácia até provocar a sua ruptura, liberando novos
30
merozoítos que irão invadir novas hemácias (Figura 2; França et al., 2008; Brasil,
2010c).
Figura 2- Ciclo evolutivo do Plasmodium. A) Ciclo Hepático (A e B – Ciclo esquizogônico; B)
Ciclo hemático; C) Ciclo esporogônico. 1) Esporozoíto; 2) Merozoítos sanguíneos; 3)
Penetração de merozoítos nas hemácias; 4) Esquizonte; 5) Esquizonte maduro; 6)
Gametócitos; 7) Gametócitos maduros (microgametócito e macrogametócito); 8)
Microgametócito exoflagelado; 9) Oocineto; 10) Oocisto; 11) Esporozoítos (Adaptado de
CDC, 2010).
As manifestações clínicas da malária, febres e calafrios, também referidas
como o paroxismo malárico, são associadas com a ruptura sincronizada dos
eritrócitos infectados (França et al., 2008). Inicialmente, no ciclo sanguíneo o parasito
sofre uma série de transformações morfológicas, mas sem divisão celular, até chegar
à fase de esquizonte, quando se divide e origina novos merozoítos que serão
lançados na corrente sanguínea após a ruptura do eritrócito (Brasil, 2010c).
A maior parte dos merozoítos liberados na eclosão dos esquizontes invade
outros eritrócitos dando origem a outros esquizontes. Alguns, todavia, após um
31
período de replicação assexuada se diferenciam em formas sexuadas masculinas e
femininas chamadas de microgametócitos e macrogametócitos, respectivamente,
que amadurecem sem divisão celular e tornam-se infectantes aos mosquitos (França
et al., 2008; Brasil, 2010c).
Os gametócitos permanecem na corrente sanguínea do hospedeiro
vertebrado até serem ingeridos por uma fêmea do Anopheles durante o repasto
sanguíneo. Uma vez dentro do intestino delgado do mosquito, estes sofrem rápida
divisão celular, produzindo 8 microgametas flagelados cada um, os quais fertilizarão
os macrogametas formando assim os oocinetos (macrogametas fecundados). Os
oocinetos atravessam a parede do intestino e formam cistos em sua parte exterior,
chamados de oocistos. Em poucos dias os oocistos sofrem o processo de
esporogenia e se rompem liberando centenas de esporozoítos que, eventualmente,
migrarão para as glândulas salivares do mosquito, prontos para serem injetados em
outro hospedeiro vertebrado (França et al., 2008).
O período de incubação na infecção malárica varia de 9 a 40 dias após a
picada do mosquito infectado, dependendo do número de parasitos inoculados, da
espécie do Plasmodium e da imunidade do hospedeiro, podendo, contudo, a doença
se manifestar vários meses (para o P. vivax e o P. malarie; Brasil, 2010c) ou
eventualmente anos, depois da infecção (França et al., 2008; Parise, 2009; Brasil,
2010c).
1.3 PATOGENIA DA MALÁRIA
A fisiopatologia da doença está relacionada ao ciclo de vida do parasita no
organismo hospedeiro, ocorrendo a manifestação dos sinais clínicos da doença no
final do estágio eritrocitário, onde ocorre rompimento simultâneo de um grande
número de hemácias, com consequente liberação de merozoítos e de pirógenos, tais
como o pigmento hemozoína, que é capaz de estimular monócitos/macrófagos e
induzir a liberação das citocinas TNF-α e Interleucina 1 (IL-1; Garcia et al., 2010).
A crise aguda da malária caracteriza-se por episódios de febres precedidos
de calafrios e seguidos de intensa sudorese (Parise, 2009; Brasil, 2010c), que estão
intimamente relacionados com a duração do ciclo esquizogônico, com o número de
plasmódios em desenvolvimento e com o período de incubação (Brasil, 2006).
32
As manifestações clínicas da doença também podem ser relacionadas com
a hemólise intravascular e consumo de glicose pelo parasita. A intensidade dos
sintomas está relacionada à carga parasitária e liberação de citocinas (Suh et al.,
2004).
A proteção do hospedeiro contra uma infecção está ligada a uma complexa
interação entre mecanismos imunes inatos e adquiridos (Smith et al., 2002). Na
primeira linha de defesa do organismo contra a malária, células como macrófagos,
células Natural Killer (NK), células dendríticas e os linfócitos T (LT) são apontadas
como as mais importantes (Stevenson & Riley, 2004; Wykes et al., 2007).
A resposta imune adaptativa aos parasitas da malária no estágio sanguíneo
depende tanto da resposta celular, quanto do mecanismo mediado por anticorpos
(Gillman et al., 2004). O Plasmodium utiliza, em especial, a variabilidade genética
como estratégia para se evadir do sistema imune do hospedeiro (Gardner et al.,
2002), por isso a reposta imune protetora não é exclusivamente efetiva e várias são
as causas: a estrutura dos antígenos e sua considerável diversidade dificulta a
resposta imune, a localização intracelular do parasita e ausência de moléculas do
Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) nos eritrócitos concorrem para
que estes proporcionem um meio relativamente favorável ao crescimento do
plasmódio, influenciando a sobrevivência do parasita e a transmissão ao vetor
(Smith et al., 2002).
A gravidade da doença depende da espécie de plasmódio presente e do
estado imunológico do hospedeiro (Suh et al., 2004; Brasil, 2006). As infecções
causadas por P. vivax, P. ovale e P. malariae são geralmente mais brandas do que
as causadas por P. falciparum, nas quais o período de incubação é mais curto, a
evolução da doença mais rápida e a gravidade da doença geralmente maior, uma
vez que este parasita penetra todos os eritrócitos, sejam células maduras ou jovens
(Suh et al., 2004).
Ademais, na infecção pelo P. falciparum, observa-se um aumento da
viscosidade dos eritrócitos, promovida pelos trofozoítos que se multiplicam durante a
fase esquizogônica sanguínea, provocando modificações na superfície da célula
parasitada, que possibilita a sua adesão à parede endotelial dos capilares. Este
aumento da viscosidade é conhecido como fenômeno de citoaderência, e já foi
relatado como um possível mecanismo de defesa do parasito, pois evitaria a sua
passagem pelo baço e sua consequente destruição (Luse et al, 1971).
33
Este fenômeno parece ser o principal responsável pela obstrução de vasos
sanguíneos, sendo comumente observado nos capilares renais (o que justifica a
ocorrência de insuficiência renal aguda nos portadores da doença e que
normalmente se torna crônica devido às crises sucessivas de malária), nos capilares
pulmonares (que pode provocar transudação alveolar) e nos capilares cerebrais,
sendo que a malária cerebral é a forma mais comum de coma e morte nas crianças
infectadas (Braga et al, 2005; Phiri et al, 2009).
Há quatro espécies de Plasmodium (Plasmodium berghei, Plasmodium yoelii,
Plasmodium chabaudi e Plasmodium vinckei) causadores da malária de roedores
que são amplamente usados nos estudos experimentais, pois apresentam um
quadro clínico semelhante à infecção por espécies do gênero Plasmodium em
humanos (Carlton et al., 2002).
O Plasmodium berghei é ideal para o estudo dos casos de malária grave, pois
além de conter sequencias genômicas muito semelhantes a do P. falciparum
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/P_berghei/), exibem lesões em órgãos como
pulmões, cérebro, fígado e baço (Panet et al, 2007).
A imunidade para malária em uma diversidade de hospedeiros, inclusive
humanos, é marcadamente espécie-parasita, linhagem e variante específica. No
entanto, um grau de resistência-cruzada é relatado em alguns casos (Mota et al.,
1998; Gardner et al., 2002). Neste sentido, diante de tamanha complexidade a
respeito da patogenia da malária, faz-se necessário a busca de respostas que
possibilitem seu melhor entendimento, atraves da realização de estudos sobre o o
envolvimento das vias de regulação redox, tais como o estresse oxidativo (EO) e o
aumento das defesas antioxidantes pelo hospedeiro (Silva, 2011), ou ainda a
expressão de citocinas diversas, como IFN-γ e TNF-α (Good & Doolan, 1999;
D’Ombrain et al., 2008; Robinson et al., 2009).
34
1.4 RADICAIS LIVRES E O ESTRESSE OXIDATIVO
Os Radicais livres (RL) são átomos ou moléculas altamente instáveis e
reativos, que contém número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica, ou
seja, são espécies químicas reativas que possuem elétrons não pareados nos
orbitais mais externos e no intuito de captar um elétron para obter estabilidade,
reagem com qualquer biomolécula, sendo necessário apenas que estas
biomoléculas existam na proximidade do local de formação do radical livre (Halliwell
& Gutteridge, 2007).
Estas espécies químicas podem ser formadas em meio de reações de óxido-
redução, isto é, ou cedem o elétron não-pareado, oxidando-se, ou recebem outro,
reduzindo-se, bem como por fissão homogênea de uma ligação química (Ferreira &
Matsubara, 1997; Halliwell & Gutteridge, 2008). Entretanto, RL não é o termo ideal
para designar algumas destas moléculas, uma vez que algumas não apresentam
elétrons não-pareados em sua última camada, mas são importantes para o
metabolismo oxidativo, constituindo as espécies reativas tóxicas derivadas do
oxigênio e do nitrogênio (ERTON; Halliwell & Gutteridge, 2008).
Estas moléculas recebem este nome por serem em sua maioria derivadas do
metabolismo do oxigênio ou do nitrogênio, além de serem consideradas as principais
espécies químicas relacionadas a mecanismos patogênicos em humanos e animais
(Halliwell & Gutteridge, 2007).
As ERTON (também chamadas de ERO e/ou ERN) representam uma família
diversa de moléculas envolvidas em processos fisiológicos e fisiopatológicos. São
geradas durante uma sequência de reações conhecida por estresse oxidativo, em
que há um aumento no consumo não mitocondrial de oxigênio, provocado pela
ativação da NADPH oxidase, a qual reduz o oxigênio a ânion superóxido (BABIOR,
1999; QUINN et al., 2006).
O ânion superóxido é o precursor primário das ERO, que podem ser divididas
em: radicais livres de oxigênio – espécies altamente instáveis e de vida curta – como
o ânion superóxido (O2•-), oxigênio singlete (1O2), radical hidroxila (OH•) e radicais
mais estáveis e oxidantes não-radicalares como o ácido hipocloroso (HOCl),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e ozônio (O3; BABIOR, 1999; QUINN et al., 2006).
35
Além deste, ainda há outros exemplos de ERO como o radical alquila (R•-) e radicais
peroxila (ROO•-), NO e peroxinitrito (ONOO- ou O=NO; Halliwell & Gutteridge, 2008).
Tais ERO são formadas continuamente durante o metabolismo celular e
pode-se encontra-las nos diversos sistemas biológicos, tais como nas mitocôndrias,
peroxissomas, citoplasma e membrana de células, retículo endoplasmático,
fagócitos, lisossomas e na presença de metais de transição, como o ferro e cobre
que facilitam sua formação (Ferreira & Matsubara, 1997).
Fisiologicamente, as ERTON estão envolvidas como efetoras ou subprodutos
em diversos processos, tais como na produção de energia, regulação do
crescimento, sinalização intercelular e síntese de substâncias. No entanto, quando
ocorre uma produção aumentada de radicais livres em detrimento da capacidade
fisiológica de defesa antioxidante, ocorre o desequilíbrio da sinalização e controle
redox, caracterizando o estado de EO, no qual a agressão celular se torna eminente,
e pode ser evidenciada através de danos aos ácidos nucléicos, proteínas,
carboidratos e lipídeos (Jones, 2006; Percário et al., 2000).
Dessa forma, encontram-se relacionadas à várias patologias, tais como,
câncer, hipóxia, artrite, doenças cardiovasculares, choque hemorrágico, doenças
inflamatória e desordens neurológicas, assim como no envelhecimento celular
(Ferreira & Matsubara, 1997; Barreiros et al., 2006; Vasconcelos et al., 2007;
Gutierrez et al., 2010).
As ERTON também fazem parte dos mecanismos intermediários das
moléstias que envolvem isquemia, inflamação, trauma, efeitos da radiação ionizante
e hiperóxia (Halliwell & Gutteridge, 1986). Mesmo nas moléstias onde as ERO não
são a causa primária de lesão, elas são importantes porque toda destruição celular
libera ferro, o qual catalisa a geração do OH•, sendo capaz de iniciar a peroxidação
lipídica e geralmente resultando na destruição das membranas celulares das células
vizinhas e na propagação do dano celular (Ferreira & Matsubara, 1997).
Adicionalmente, as interações parasita-hospedeiro são bastante complexas e
promovem constante mudança no delicado equilíbrio redox, uma vez que tanto os
parasitas como o hospedeiro são capazes de produzir oxidantes e antioxidantes
(Uhlemann et al., 2004).
Os antioxidantes compreendem sistemas distintos que auxiliam o organismo a
se defender da agressão causada pelos radicais livres (moléculas oxidantes).
Didaticamente estes sistemas são divididos em três: enzimático (Figura 3), as
36
moléculas pequenas e as proteínas queladoras de metais (Halliwell & Gutteridge,
2007).
22 OO22●●-- ++ 22HH++ SSOODD HH22OO22 ++ OO22
HH22OO22 ++ 22GGSSHH GGSSHH--PPxx HH22OO ++ GGSSSSHH
22 HH22OO22 CCaattaallaassee HH22OO ++ OO22
Figura 3: Sistema antioxidante enzimático. O2●- = radical superóxido; H2O2 = peróxido de
hidrogênio; O2= oxigênio; H2O = água; H+ = cátion hidrogênio; GSH = Glutationa reduzida; GSSH = Glutationa oxidada; GSH-Px = Glutationa peroxidase; SOD = Superóxido dismutase.
1.4.1 Malária e o Estresse Oxidativo
A resposta à infecção causada pelos plasmódios manifesta-se primariamente
pelo mecanismo de defesa natural do organismo hospedeiro com envolvimento de
fagócitos (macrófagos ativados e neutrófilos). Estes, por sua vez, geram grande
quantidade de ERTON (O2•-, H2O2, dentre outras) e enzimas hidrolíticas,
ocasionando um desequilíbrio entre a formação de espécies oxidantes e a atividade
dos antioxidantes, desencadeando o EO, um importante mecanismo do hospedeiro
humano em resposta a infecções microbianas em geral (Ferreira & Matsubara,
1997).
A participação do O2•- é observada em inúmeras doenças. A produção
aumentada de O2•- relaciona-se com aterosclerose, esclerose múltipla e hipertensão
(Glabinski et al. 1993; Cangemi et al., 2007; Lavi et al., 2007; Custodis et al., 2008),
contribuindo para o início de eventos pró-inflamatórios. A disfunção endotelial
também se relaciona com o aumento da produção de O2•- (Cangemi et al., 2007;
Chan et al., 2007). Alguns autores também discutem o papel do O2•- no clearence de
alguns parasitas como Toxoplasma gondii (Murray et al., 1979), Leishmania
donovani (Haidaris & Bonvetere, 1982) e Trypanossoma cruzi (Maugeri & Cazzulo,
2004; Souza, 2008).
37
Nesse sentido, estudos têm sido realizados no intuito de relacionar o
envolvimento dos RL, através do EO, à resposta imunológica e a patogenia da
malária (Good & Doolan, 1999; Pino et al., 2005 Becker et al., 2004; Gillman et al.,
2004; Moreira, 2010; Silva, 2011).
1.4.1.1 Fontes de Estresse Oxidativo
Uma das fontes geradoras de ERO observado fisiologicamente em indivíduos
sadios é a fosforilação oxidativa que ocorre na mitocôndria cujo processo metabólico
envolve a síntese de adenosina trifosfato (ATP) a partir da energia liberada pela
cadeia de transporte de elétrons (CTE) na cadeia respiratória. Em condições
normais a produção de ATP mitocondrial se dá devido ao fluxo intermitente de
elétrons possibilitados pelos derivados reduzidos do ácido tricarboxílico
(Nicotinamida adenina dinucleotídeo hidreto – NADH e Flavina Adenina
Dinucleotídeo reduzida – FADH2). Dessa forma, cerca de 1% do oxigênio consumido
para a formação de água (reduzido simultaneamente com quatro elétrons) é
convertido em O2•- (redução incompleta do oxigênio com apenas um elétron),
resultado de um fluxo inconstante de elétrons (Figura 4; Fariss et al., 2005).
Figura 4. Representação esquemática da cadeia de transporte de elétrons da mitocondrial (CTE) e o acoplamento e desacoplamento da fosforilação oxidativa. Os substratos NADH e FADH2 reduzido são oxidados, com a passagem dos elétrons pelos complexos enzimáticos da CTE e o bombeamento dos prótons (H+) para dentro do espaço intermembranar das mitocôndrias, formando um grande potencial de membrana mitocondrial conhecida como força motriz protônica. A energia perdida pelos prótons reentra na matriz mitocondrial através da ATP sintase (A) e é usada para geração de energia de ATP a partir de ADP. Os prótons também podem voltar a entrar na matriz por meio das proteínas de desacoplamento (U), tal como UCP2, sem a produção de ATP (Fariss et al.,
2005).
38
Em relação às fontes de RL produzidas pelo parasita, destacam-se as
reações catalisadas por metais de transição, notadamente as reações de Haber-
Weiss e Fenton (Figura 5), responsáveis pela produção do OH• (Percario et al.,
2012). Um bom exemplo ocorre na exposição do parasita ao EO ao entrar nas
hemácias, pois, uma vez que o Plasmodium se encontre dentro do eritrócito, sucede-
se a degradação da hemoglobina (Hb) no vacúolo digestivo e o ferro (Fe) do heme,
que se encontrava quase que inteiramente no estado ferroso (Fe2+), é oxidado para
o estado férrico (Fe3+; Hunt & Stocker, 1990). Os elétrons liberados pela oxidação
combinam com o O2 para formar as ERO: O2•-, OH• e H2O2. Esta parece ser uma
importante fonte de EO derivada do parasita (Atamna & Ginsburg, 1993; Francis et
al., 1997), que é altamente suscetível às ERO durante parte do seu ciclo eritrocítico,
e como consequência, pode ser fatal ao Plasmodium (Clark et al., 1989).
Haber Weiss 1
Fenton 2
FIGURA 5: Reações de Haber-Weiss e Fenton. (1) Reação de Haber Weiss: O radical ânion superóxido (O2
•-) reage com o peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de metais de transição, para produzir radicais hidroxila (HO•), íons hidroxila (HO-) e oxigênio (O2). (2) Reação de Fenton: O
peróxido de hidrogênio (H2O2) é ionizado na presença de íons ferrosos, levando à produção de radicais hidroxila (OH•) e íons hidroxila (HO-). O íon ferroso (Fe+2) sofre oxidação, sendo liberado na
forma de íon férrico (Fe+3).
A exemplo disso, um estudo desenvolvido por Erel et al. (1997) mostrou um
aumento nos indicadores do EO, acompanhado de uma diminuição das defesas
antioxidantes em pacientes infectados com o P. vivax, mostrando a participação do
balanço redox na patogenia da doença, sugerindo que o aumento do estresse
oxidativo possa estar ligado ao mecanismo de defesa do hospedeiro. Da mesma
maneira, Hermsen et al. (1997) demonstram que as ERO possuem papel importante
no desenvolvimento de MC em camundongos infectados por P. berghei.
39
Por outro lado, as ERO que são geradas pelo parasita durante a degradação
da Hb têm sido propostas como as grandes causadoras de danos à célula
hospedeira (Vennerstrom & Easton, 1988).
Paralelamente, na síndrome de isquemia e reperfusão (SIR), pode haver
produção de O2•- adicionais, e este também produz o H2O2, demonstrando que a
própria fisiopatogenia da doença constitui uma fonte de ERO. Por sua vez, ambos os
RL produzidos poderão reagir entre si, produzindo a reação de Haber-Weiss,
originando radicais OH•, ainda mais reativos e capazes de propagar e difundir o
dano oxidativo (Figura 6; Percário et al., 2008).
Figura 6: A) A sequência de eventos que ocorrem na síndrome de isquemia e reperfusão (SIR). B) Integração da SIR com a reação de Haber-Weiss. Legenda: ATP=Trifosfato de adenosina; ADP=Difosfato de adenosina; AMP= Monofosfato de adenosina; Ca+2= íon cálcio; O2= Oxigênio; O2
•-=Radical Superóxido; H2O2 = peróxido de hidrogênio; OH = íon hidroxila; OH• = Radical Livre Hidroxila; H2O = Água (Adaptado de Percário et al., 2008).
Uma terceira fonte de RL descrita é a que ocorre nos mecanismos de
combate a microrganismos, fenômeno conhecido como explosão respiratória, no
A
B
40
qual os fagócitos (macrófagos e neutrófilos) convertem o O2 consumido em O2•-, por
meio da ativação da NOX, produzindo grandes quantidades deste ânion em frações
de segundos (Kontush & Capman, 2006; Brown, 2009). Adicionalmente, durante a
resposta inflamatória realizada pelos macrófagos e outras células imunes, ocorre a
produção de quantidades significativas de NO, a partir da isoforma da enzima óxido
nítrico sintase induzível (iNOS) expressa nestas células, que usam o aminoácido de
L-arginina como substrato. Este RL gasoso, produzido nestas circunstâncias provoca
danos oxidativos letais para as células alvo, tais como bactérias e outros
microrganismos (Beckman & Koppenol, 1996; Pacher et al., 2007).
E por último, algumas terapias farmacológicas utilizadas para o tratamento da
malária (cloroquina, primaquina, artemisinina e entre outros) também constituem
uma fonte de RL contra o parasita, pois baseiam-se na sensibilidade do gênero
Plasmodium aos RL e oxidantes, bem como na interferência ou na inibição de uma
via de síntese metabólica de uma molécula essencial para o parasita (Grahame-
Smith & Aronson, 2004). Este efeito pode ser devido à capacidade do fármaco para
promover a produção direta de RL (Zhang et al., 2010), ou pela inibição de
moléculas com atividade antioxidante (Grellier et al., 2010).
Portanto, entre as diferentes fontes de produção de RL e consequentes
promoçao do EO na malária destaca-se as produzidas: 1) pelo hospedeiro, através
do processo inflamatório iniciado no hospedeiro em resposta à infecção, observado
pela ação dos fagócitos (NOX) e também através da síntese do NO; 2) pelo parasita,
atraves da produção direta de espécies livres, além da catálise de metais de
transição, pela indução da hemozoína, uma vez que durante a alimentação do
parasita a partir da Hb, este libera quantidades significativas de ferro livre; 3) pela
fisiopatogenia da doença, atraves da ocorrência da SIR, resultado do processo de
citoaderencia e anemia desencadeadas pela infecção (Cabrales et al., 2011); ou 4)
pelo tratamento, visto que as drogas anti-maláricas constituem uma fonte de
oxidação observados em fármacos como a cloroquina, primaquina e derivados de
artemisina (Atamna & Ginsburg, 1993; Guha et al., 2006; Sohail et al., 2007; Percario
et al., 2012).
41
1.4.1.2 Óxido Nítrico (NO) e a Malária
O NO é uma das menores e mais simples moléculas biossintetizadas
(Beckman & Koppenol, 1996), produzido a partir do aminoácido L-arginina por ação
das NOS. Há três isoformas de enzimas NOS que são agrupadas em duas
categorias, a NOS constitutiva (cNOS), dependente de íons cálcio (Ca++) e de
calmodulina, que está envolvida na sinalização celular, presente nos neurônios não-
colinérgicos não-adrenérgicos e células endoteliais, e iNOS, produzida por
macrófagos, células hepáticas e endoteliais e ativadas por citocinas, especialmente
TNF-α e INF-γ (Moncada et al., 1991; Marletta, 1993). Todas as isoformas de NOS
requerem a Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzido (NADPH) e o O2
como co-substratos na reação da síntese de NO (Wang & Marsden, 1995).
Em condições normais, o NO desempenha importante papel na manutenção
da integridade da parede vascular por inibição da inflamação, proliferação celular e
trombose, reduzindo o tônus vascular, a ativação de plaquetas e leucócitos, a
proliferação de células musculares lisas, a deposição de matriz extracelular e a
morte de células endoteliais (Marletta, 1993; Fitzgerald et al., 2007).
Apesar de ser um importante mediador citotóxico das células imunes
ativadas, capazes de destruir patógenos e células tumorais, o NO é potencialmente
tóxico, principalmente em situações de EO, o que leva a geração de intermediários
reativos oxigênio e uma deficiência do sistema antioxidante (Dusse et al., 2003).
Quando produzido juntamente com o radical O2•-, ele reage de forma extremamente
rápida resultando na formação de ONOO-. Este por sua vez, é um vasodilatador
menos potente que o NO, instável e que pode por meio de uma protonação a um íon
hidrogênio (H+), originar o OH•, aumentando efetivamente a ação tóxica do NO e do
O2•- e dando continuidade a cascata de reações oxidativas (Beckman & Koppenol,
1996; Pfeilschifter et al., 2003; Shirley, 2005).
Como o NO desempenha um papel importante nas funções fisiológicas,
muitas doenças podem estar relacionada a altos ou baixos níveis deste gás no
organismo, o que sugere que realmente esteja envolvido na fisiopatogenia da
malária, já que nas doenças infecciosas, uma cascata de reações leva a produção
de NO. Entretanto, seu papel na fase sanguínea da doença ainda permanece
desconhecido.
De fato, ainda não há um amplo conhecimento acerca dos mecanismos
precisos do envolvimento do EO na doença, existindo diversos relatos contraditórios
42
sobre o papel do NO na malária e alguns estudos propoem que o NO esteja
envolvido no desenvolvimento de malária grave (Gramaglia et al., 2006).
Por outro lado, em um estudo experimental realizado por Nahrevania &
Dascombe (2006), foi demonstrado o aumento da síntese de óxido nítrico em
camundongos infectados com P. berghei, o que também foi evidenciado em
humanos por Chiwakata et al. (2000) que encontraram níveis mais elevados de NO
em amostras de sangue de pacientes de malária não grave, em comparação a
pacientes com malária grave, sugerindo um papel benéfico do NO na patogenia da
malária causada por P. falciparum.
Ainda neste ambito, há autores que relatam que o acometimento cerebral da
doença seja uma conseqüência da produção de quantidades elevadas de NO para
promover a morte dos parasitas, enquanto outros sugerem que a MC decorra de sua
baixa biodisponibilidade (Favre et al., 1997; Gramaglia et al., 2006).
A produção do NO pelas NOS endoteliais em todos os tecidos impede a
isquemia local pois atua como regulador do fluxo de sangue, causando
vasodilatação, prevenindo a agregação de plaquetas e inibindo a adesão de
linfócitos e monócitos ao endotélio (Dusse et al., 2003; Forstermann & Sessa, 2012).
Estes efeitos são cruciais na prevenção da malária cerebral e a administração
de NO exógeno, ou de substâncias que liberam o NO, tem sido investigada como
tratamento adjuvante para a malária, com excelentes resultados na melhoria da
microcirculação, reduzindo a inflamação do cérebro e protegendo a barreira hemato-
encefálica (Clark & Rockett, 1996; Zanini et al., 2011; Cabrales et al., 2011),
diminuindo assim o estresse oxidativo. NO exógeno é também indicado para a
profilaxia de danos pulmonares de pacientes com malária (Speyer et al., 2003).
Dessa forma, os intermediários reativos do oxigênio e do nitrogênio, em
especial o NO, têm sido sugeridos como possíveis agentes que atuam na eliminação
do Plasmodium e na fisiopatogenia da doença em geral (Good & Doolan, 1999;
Greve et al., 1999; Gillman et al., 2004).
Nesse sentido, entre as diversas fontes de radicais livres que podem
participar dos mecanismos fisiopatológicos que cursam com a doença, a produção
dessas espécies pelas enzimas NOX, tem recebido especial atenção, nos últimos
anos (Lassègue & Clempus, 2003; Brown & Griendling, 2009).
43
1.5 SISTEMA NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTÍDEO FOSFATASE OXIDASE
(NADPH oxidase / NOX)
As nicotinamida adenina dinucleotídeo fostato (NADPH) oxidases constituem
um grupo de proteínas enzimáticas transmembranas, presente nos fagócitos (e em
células de origem mesodérmica), que catalisam a transferência de elétrons através
da membrana celular (Babior, 1999; Bedard & Krause, 2007).
A forma clássica desta enzima (presente nos fagócitos) é composta de seis
subunidades: duas proteínas transmembranas (p22phox e gp 91phox/NOX2; esta
última codificada pelo gene CYBB), que formam o flavocitocromo b558 e são
formadoras do sítio catalítico da enzima. As outras subunidades constituem-se de
três proteínas citosólicas (p47phox, p67phox, p40phox, onde phox deriva de phagocyte
oxidase) e uma GTPase (Rac 1 ou Rac 2; Figura 7; Elbenna et al., 2005; Groemping
& Rittinger, 2005).
FIGURA 7: Estrutura da NOX fagocítica. A gp91phox é o ligante do NADPH com função transportadora de elétrons na NOX ativa. A Produção de O2
•- extracelular ocorre pela redução de um elétron do O2 via gp91phox, usando nicotinamida adenina dinucleotídeo fostato reduzida – NADPH (adaptado de Dusting et al., 2004).
A separação destes dois grupos de componentes em compartimentos
distintos garante a regulação do complexo enzimático. A ativação da NOX requer
interações de suas subunidades proteicas na membrana do fagosomo dos
macrófagos ativados. Este processo inicia-se pela fosforilação da proteína
citoplasmática p47phox, levando a formação de um complexo das subunidades
citoplasmáticas, que migrará para a membrana e se associará ao flavocitocromo
44
b558, constituindo assim a enzima em sua forma ativa (Figura 8A; Balbior, 1999;
Balbior et al., 2002; Sumimoto et al., 2005; Bedard & Krause, 2007).
A agregação do complexo NOX permite o início da transferência eletrônica, a
partir do substrato (NADPH), para o oxigênio molecular, gerando ânion superóxido e
em seguida, outras espécies reativas de oxigênio (ERO). Ao mesmo tempo, ocorre a
liberação de ERO no meio extracelular, já que todo o complexo é levado para a
membrana celular (Figura 8B; Barbior, 1999; Bedard & Krause, 2007).
Figura 8. A) O complexo enzimático NADPH oxidase (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase – NOX) nos neutrófilos consiste em duas subunidades de membrana do citocromo b558: a subunidade p22phox e gp91phox/NOX2, e três co-fatores citosólicos (p67phox, 47 phox e p40phox) além de uma GTPase Rac 2, necessários para o metabolismo oxidativo. B) Agregação do complexo NADPH oxidase em fagócitos A Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato reduzida (NADPH) serve como substrato para a redução do O2 em O2
•-, que é rapidamente transformado em H2O2 espontaneamente ou pela superóxido dismutase – SOD (BEDARD & KRAUSE, 2007).
A NOX dos fagócitos foi o primeiro exemplo de um sistema que gera ERO não
como um subproduto, mas sim como a principal função do sistema enzimático
(Geiszt, 2006; Bedard & Krause, 2007). Entretanto, a NADPH oxidase expressa nos
fagócitos difere daquela encontrada em células vasculares, tanto pela estrutura
bioquímica quanto pelas funções que realiza (Dusting et al., 2004; Rabêlo et al.,
2010).
A importância da produção de ERO (estresse oxidativo) pela NOX pode ser
observada em indivíduos afetados pela doença granulomatosa crônica (DGC), onde
45
o sistema NADPH oxidase é parcial ou totalmente deficiente, devido à não
expressão de um ou mais de seus componentes. Os portadores de DGC estão
sujeitos a infecções recorrentes e, como consequência, a uma diminuída expectativa
de vida (Jurkowska et al., 2004).
Este complexo sistema enzimático está ativo em todas as camadas da parede
vascular gerando ERO de forma lenta e contínua (Lasségue & Clempus, 2003). A
NOX, pode também estar presente nas mais variadas células do organismo
(endoteliais, pulmonares, cerebrais, etc) desempenhando, também, a modulação de
fatores de transcrição, interferindo diretamente na expressão gênica (Brown &
Griendling, 2009).
A identificação de subunidades homólogas à gp91phox (NOX2), resultou na
formação da família NOX, constituída, atualmente por sete membros (NOX1, NOX2,
NOX3, NOX4, NOX5, Duox1 e Duox2). A subunidade catalítica da proteína é
conhecida como NOX2 ou gp91phox e juntamente com a NOX4 são as principais
componentes do complexo, uma vez que são altamente expressas nas células
vasculares e aumentadas durante o processo de remodelamento vascular (Brown &
Griendling, 2009).
Todas as NOX transportam elétrons através de membranas biológicas para
reduzir oxigênio a O2•- e possuem propriedades estruturais conservadas que incluem
um sítio de ligação para NADPH e um sítio de ligação para Flavina Adenina
Dinucleotídeo oxidada (FAD), localizados na porção carboxiterminal; seis domínos
transmembrana e quatro histidinas como sítios de ligação para moléculas de heme
(Geiszt, 2006).
As NOX são ativadas e reguladas por diversos fatores como hormônios,
citocinas, dentre os quais se destacam a trombina, o Fator de Crescimento Derivado
de Plaqueta (PDGF), TNF-α, a lactosiceramida, Interleucina-1 e a Lipoproteína de
baixa densidade (LDL) Oxidada (Rueckschloss et al., 2001; Geiszt, 2006).
1.5.1 Malária e a NOX
Não obstante a participação do complexo enzimático NOX na produção de
ERO, alguns estudos começam a ser desenvolvidos no sentido de tentar elucidar a
participação dessas enzimas na patogênese da malária, entretanto, ainda são
46
escassos os que tentam avaliar o real papel da NADPH oxidase na patogenia da
malária.
A este exemplo, o estudo de Gillman et al. (2004) realizado em camundongos
knockout para NADPH oxidase (p47phox -/-) infectados com P. chabaudi, demonstrou
que esses animais não tem a parasitemia exacerbada na ausência da enzima,
sugerindo que a supressão da parasitemia é independente das ERO produzidas
durante o estágio sanguíneo da doença.
Do mesmo modo, um estudo do EO induzido pelo plasmódio foi realizado em
camundongos knockout para o gene da enzima NOX. Entretanto, a despeito do
aumento dos níveis em marcadores do EO, os animais não apresentaram diferenças
na progressão da parasitemia para nenhuma das espécies de Plasmodium testadas
(P. yoelii, P. chabaudi K562, P. berguei ANKA, P. berguei K173 e P. vinckei vinckei).
Estes dados sugerem que a produção de RL esteja aumentada em decorrência da
infecção e que não seja oriunda da explosão respiratória de fagócitos, mas
possivelmente esteja associada à produção pelo próprio parasito, bem como pela
produção de NO (Potter et al., 2005).
Em contrapartida, um estudo desenvolvido em crianças do Gabão com
malária branda e malária grave, encontrou a presença de um polimorfismo
dinucleotídeo no gene promotor da gp91phox da NOX e que conferia proteção contra
a malária severa, devido à diminuição dos níveis desta enzima e consequente
diminuição da liberação de O2•- (Uhlemann et al., 2004).
1.5.1.1 Apocinina – Inibidor da NOX
A apocinina (Figura 9) é um inibidor da NOX derivado de acetofenona, que
possui peso molecular de 166,17g/mol. Sua característica como inibidor do
complexo multienzimático NOX vem sendo descrita e estudada desde meados de
1990 (De Almeida et al., 2011). Possui um fraco odor de baunilha e um ponto de
fusão de 115 ºC (Stefanska & Pawliczak, 2008).
É um metóxi-catecol (4-hidroxi-3-metoxiacetofenona), originalmente extraído
da raiz da erva medicinal Picrorhiza kurrooa, uma planta rasteira nativa das
montanhas da Índia, Nepal, Tibete e do Paquistão (Wang et al., 2008).
Nos neutrófilos, a enzima mieloperoxidase (MPO) é a responsável pela
oxidação da Apocinina quando essas células são ativadas (De Almeida et al., 2011).
47
Em células desprovidas de MPO (HEK293), a formação de dímeros de apocinina
não ocorre mesmo após a super expressão das isoformas NOX (Dusting et al.,
2004).
Apesar do mecanismo de ação da Apocinina não estar totalmente
esclarecido, sabe-se que esta pró-droga após ser oxidada pela ação catalítica da
MPO expressa seletivamente em leucócitos, é convertida em um produto dimérico
com maior capacidade anti-inflamatória do que a Apocinina, chamado de
Diapocininina (Figura 10; De Almeida et al., 2011). Este metabólito é sugerido como
responsável pela inibição da agregação e translocação dos componentes citosólicos
(p47phox) do complexo NOX para a membrana (Johnson et al., 2004; Ximenes et
al., 2007).
Alguns trabalhos têm demonstrado que apocinina, apesar de sua função
potencialmente útil como um inibidor do complexo multienzimático da NOX, também
apresenta características pró-oxidantes de membrana (Ximenes et al., 2007,
Heumüller et al., 2008).
Assim, diante do exposto, é possível que a NOX apresente papel protetor ao
desenvolvimento da infecção malárica, atuando como primeira linha de defesa do
hospedeiro. Desta forma, a inibição da NOX possivelmente promoverá o aumento da
velocidade de desenvolvimento da doença, cursando com aumento da parasitemia e
diminuição da sobrevida dos hospedeiros.
Figura 9. Molécula de Apocinina (Ximenes et al., 2007)
48
Figura 10. Molécula de Diapocinina (Ximenes et al., 2007)
49
1.6 OBJETIVOS
1.6.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da inibição das enzimas NADPH oxidase sobre alterações
no estresse oxidativo e sobre a síntese de NO em camundongos infectados com o
Plasmodium berghei, ao longo de 20 dias de infecção.
1.6.2 Objetivos Específicos
(a) Avaliar os efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase sobre a
parasitemia e sobrevida de camundongos infectados por P. berghei.
(b) Avaliar os efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase sobre
marcadores laboratoriais da peroxidação lipídica em camundongos infectados
por P. berghei.
(c) Avaliar os efeitos da inibição da enzima NADPH oxidase sobre a síntese
de NO nesses animais.
(d) Verificar a existência de possíveis correlações entre a peroxidação lipídica,
os níveis de NO, sobrevida e progressão da parasitemia nos animais.
(e) Avaliar a importância da síntese de radicais superóxido como componente
do estresse oxidativo do hospedeiro frente à infecção pelo plasmódio.
50
2 MATERIAL E MÉTODOS
No presente estudo a NOX foi inibida em camundongos que foram infectados
pelo P. berghei e que foram acompanhamos por 20 dias, para então compará-los
com os dados obtidos dos controles. A realização da eutanásia aconteceu ao final
de cada período programado, que neste caso, ocorreu após 1, 5, 10, 15 ou 20 dias
do início do estudo, marcado pela inoculação de hemácias infectadas ou não com o
Plasmodium berghei. As amostras de pulmão e cérebro obtidas no momento da
eutanásia foram acondicionadas à temperatura – 20°C, e posteriormente analisadas
quanto a parasitemia e as dosagens bioquímicas de Nitratos/Nitritos, metabólitos
estáveis do NO, e Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS).
2.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Para o experimento foram utilizados 230 camundongos (Mus musculus)
machos, da linhagem Swiss, adultos, com 10 semanas de idade e peso entre 25 e
40 gr. Os camundongos eram provenientes do Instituto Evandro Chagas (IEC) -
Belém/PA foram alojados no Biotério de Experimentação do Laboratório de
Pesquisas em Estresse Oxidativo do ICB/UFPA, equipado com gaiolas específicas
para roedores, estéreis, livre de ruídos, com condições livres de patógenos
específicos e livres de reprodução durante os experimentos. A temperatura no
biotério foi mantida em torno de 25ºC, com ciclo claro/escuro a cada 12 horas. Antes
e durante o período de estudo os animais foram mantidos com ração e água ad
libitum.
Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, com tampa de arame
iNOX, nas medidas 41x34x16cm, contendo cama em maravalha de Pinus. As
gaiolas eram substituídas em dias alternados, sendo lavadas com água, sabão e
desinfetadas com hipoclorito de sódio (Braggio et al., 2003).
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o
guia para utilização de animais de laboratório e o projeto foi aprovado pelo Comitê
de Ética na Pesquisa com Animais de Experimentação da Universidade Federal do
Pará – UFPA (Anexo 1).
51
2.1.1 Grupos Experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grandes grupos,
descritos abaixo:
Grupo A: Animais (n = 65) que foram pré-tratados e tratados diariamente com
apocinina, 5 dias antes da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei, até
o dia da eutanásia.
Grupo B: Animais (n = 50) que foram pré-tratados e tratados diariamente com
apocinina, 5 dias antes da inoculação de hemácias não parasitadas com o P.
berghei (sadias), até o dia da eutanásia.
Grupo C: Animais (n = 65) que foram infectados com hemácias parasitadas
pelo P. berghei, mas não foram tratados com apocinina.
Grupo D: Animais (n = 50) foram inoculados com hemácias não infectadas
com o P. berghei (sadias) e não foram tratados com apocinina.
Cada grupo foi subdividido de acordo com o tempo a que foram submetidos à
eutanásia, conforme descrito no Quadro 1.
Nos Grupos Controles (B, C e D) os animais foram submetidos aos mesmos
procedimentos experimentais e estiveram expostos às mesmas condições
laboratoriais dos animais do Grupo A.
52
Quadro 1 – Distribuição de grupos de animais de acordo com o tempo de infecção
GRUPO A
Inibidor NOX: + / Infecção pelo P. berguei: +
GA/1 (N = 10) GA/5 (N = 10) GA/10 (N = 15)* GA/15 (N = 15)* GA/20 (N = 15)*
Eutanásia após 24 horas de
infecção
Eutanásia após 5 dias de infecção
Eutanásia após 10 dias de infecção
Eutanásia após 15 dias de infecção
Eutanásia após 20 dias de infecção
GRUPO B
Inibidor NOX: + / Infecção pelo P. berguei: -
GB/1 (N = 10) GB/5 (N = 10) GB/10 (N = 10) GB/15 (N = 10) GB/20 (N = 10)
Eutanásia após 24 horas de
infecção
Eutanásia após 5 dias de infecção
Eutanásia após 10 dias de infecção
Eutanásia após 15 dias de infecção
Eutanásia após 20 dias de infecção
GRUPO C
Inibidor NOX: - / Infecção pelo P. berguei: +
GC/1 (N = 10) GC/5 (N = 10) GC/10 (N = 15)* GC/15 (N = 15)* GC/20 (N = 15)*
Eutanásia após 24 horas de
infecção
Eutanásia após 5 dias de infecção
Eutanásia após 10 dias de infecção
Eutanásia após 15 dias de infecção
Eutanásia após 20 dias de infecção
GRUPO D
Inibidor NOX: - / Infecção pelo P. berguei: -
GD/1 (N = 10) GD/5 (N = 10) GD/10 (N = 10) GD/15 (N = 10) GD/20 (N = 10)
Eutanásia após 24 horas de
infecção
Eutanásia após 5 dias de infecção
Eutanásia após 10 dias de infecção
Eutanásia após 15 dias de infecção
Eutanásia após 20 dias de infecção
* N=15 devido ao fato de já ser observado em estudos deste laboratório uma baixa expectativa de sobrevida após 10 dias da infecção.
53
2.2 INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS
Os animais dos Grupos A e C foram infectados por inoculação intraperitoneal
de 107 hemácias infectadas pela cepa ANKA de Plasmodium berghei, diluídas em
0,2 mL de solução salina estéril (0,9%). Os animais foram imobilizados sempre pela
mesma pessoa, segurando-o pela pele da nuca com o polegar e o indicador,
deixando-o de abdômen voltado pra cima, e prendendo a cauda (Garvey et al.,
1977). A inoculação foi realizada utilizando-se seringas de 1mL e agulhas de
12,7mm e cada animal recebeu 150µl da solução de hemácias parasitadas.
Os animais dos grupos B e D não foram infectados com a cepa de P. berghei,
recebendo apenas a inoculação intraperitoneal de 150 µL de hemácias não
parasitadas (contendo 107 células).
A cepa de P. berghei utilizada encontrava-se conservada em sangue total de
camundongos BALBC na presença de solução de glicerina a 30% e armazenada a -
70ºC, foi originalmente fornecida pelo Laboratório de Neuroquímica do Instituto de
Ciências Biológicas da UFPA – Belém – PA e mantida em sucessivas replicações no
Biotério de Experimentação do Laboratório (Percário 1994; Scardoeli, 1996).
2.3 INIBIÇÃO DA NOX - TRATAMENTO COM APOCININA
O papel da enzima NADPH oxidase na infecção por P. berghei foi verificada
através da inibição da NOX, onde os animais dos grupos A e B receberam
tratamento com o inibidor de NADPH oxidase, a apocinina (1,5 mM; 3,217 g/100 mL;
Sigma Aldrich, #55539) em água de beber, enquanto que os outros grupos (C e D)
receberam água potável não tratada com apocinina.
O tempo de tratamento foi dividido de acordo com cada grupo de experimento
(1, 5, 10, 15 e 20 dias), sendo que os Grupos A e C iniciou o tratamento com a
apocinina, 5 dias antes da inoculação de hemácias parasitadas (ou não) com P.
berghei.
2.3.1. Preparo e administração da solução de apocinina
A apocinina (1,5 mM; Sigma Aldrich; #55539) foi preparada em água
destilada, misturando-se 0,246g do inibidor em 1000mL de água destilada com
54
auxílio de bastão de vidro e homogeneizador tipo vórtex, até que se diluísse
complemente. Posteriormente, a solução era acondicionada em geladeira por até 07
dias e diariamente cada gaiola recebia 100 mL da solução, distribuída em
mamadeiras próprias.
2.3.2 Determinação do consumo de líquidos
Já que a administração da apocinina foi feita na água de beber, foi calculada
uma dose diária da droga a ser consumida diariamente por cada animal, de forma
que o consumo médio de água pelos animais foi avaliado previamente, que baseado
na experiência de nosso Grupo de Pesquisas, o consumo de líquidos para a espécie
Mus musculus é, em média, de 10mL de água por dia por animal.
Adicionalmente, cogitou-se a possibilidade de que a adição da apocinina à
água causasse alteração de sabor ou odor e, desta forma, pudesse promover
alteração no seu consumo pelos animais. Assim, levando-se em consideração que
cada gaiola abrigava no máximo cinco camundongos e considerando as eventuais
perdas, cada gaiola recebeu diariamente um bebedouro com o volume de 200mL da
solução de apocinina ou 200mL de água mineral não tratada com apocinina (USP,
2013. Após 24 horas, o volume de líquido remanescente no frasco foi medido em
proveta e, por diferença, obtive-se o volume de líquido consumido por cada animal.
Durante o tratamento com apocinina (Grupos A e C), o consumo de água por
gaiola foi avaliado diariamente, sendo o valor obtido dividido pelo número de animais
na gaiola, permitindo uma estimativa dia-a-dia do consumo do inibidor. Os dados
foram expressos em mL de líquido por dia (mL/dia).
2.4 DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA
Para verificar a parasitemia dos animais, ao término do período determinado
de infecção (1; 5, 10, 15 ou 20 dias), foi realizado um esfregaço sanguíneo de cada
animal.
Para a coleta do material foi feita a assepsia da cauda com algodão embebido
em álcool a 70%, em seguida a cauda do animal foi puncionada com uma agulha. A
amostra foi colhida em uma lâmina de vidro onde foi confeccionado o esfregaço
55
sanguíneo, com o auxílio de outra lâmina de vidro. Em seguida, foi realizada a
fixação do material na lâmina com metanol 100%, durante 3 minutos.
O esfregaço foi corado pelo método de Giemsa, observando a seguinte
sequencia: 3 gotas do corante Giemsa 100%, acrescido a cada 1 mL de água
destilada. Cada lâmina foi coberta com 3 mL dessa solução durante 10 minutos e em
seguida, a lâmina foi enxaguada para retirar o excesso de corante e foi deixada para
secagem em temperatura ambiente.
A estimativa do número de hemácias parasitadas foi determinante para o
número de campos contados, como mostra o quadro 2. A razão porcentual entre o
número de hemácias parasitadas e o número de hemácias totais contadas foi
considerada como o grau de parasitemia. A leitura foi realizada em microscópio
óptico com aumento de 1000x.
Quadro 2- Número de hemácias contadas a partir de uma estimativa inicial da
parasitemia
Parasitemia (%) Hemácias contadas
0 10.000
< 6 5.000
6-10 2.000
11 a 20 1.000
>20 300
2.5 EUTANÁSIA E OBTENÇÃO DE AMOSTRAS
Ao final de cada período de estudo (1, 5, 10, 15 e 20 dias) os animais foram
submetidos à inoculação intraperitoneal de heparina (Sulfato de heparina 100 Ul,
i.p.) e em seguida anestesiados (Cloridrato de Ketamina + Xilazina, 2:1, 80 Ul, i.p.),
sendo submetidos à eutanásia por exsanguinação e obtenção das amostras de
sangue e tecidos corporais.
Após a toracotomia, amostras de sangue foram obtidas em seringas de 1 mL
heparinizadas, por punção do ventrículo direito do coração de cada. Além disso,
ambos os pulmões foram extraídos, bem como o cérebro de cada animal. Em
56
seguida, as amostras cerebrais e pulmonares foram lavadas em solução salina 0,9%
(NaCl; CAAL, Cat # 16825; solução aquosa), secas, identificadas e armazenadas a -
20ºC, para que posteriormente, fossem submetidas ao processo de disrupção de
tecidos e às análises bioquímicas.
2.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE PULMÃO E CÉREBRO
Para a preparação do homogeneizado de tecidos foi usado metade do pulmão
e do cérebro, que foram pesados individualmente em um béquer, e acrescentou-se a
cada uma das amostras, solução salina tampão fosfato PBS na proporção 1:10
(m:m).
Na sequência, dentro do copo béquer em que foram pesados, os órgãos
foram picotados com tesoura de ponta fina, para produzir fragmentos menores, com
a finalidade de facilitar a sua homogeneização. Então, todo o conteúdo amostral foi
transferido para um tubo falcon, que por sua vez esteve mantido em um béquer com
gelo durante o processo de homogeneização no disruptor de células ultrassônico,
para evitar que o calor produzido no processo comprometesse a viabilidade das
amostras. O processo de homogeneização foi realizado em um disruptor de células
ultrassônico (D Cell; Unique). Cada órgão teve o seu processo de disrupção
programado, por aproximadamente 3 minutos, podendo esse tempo ser maior, caso
o órgão não ficasse completamente homogeneizado.
A amostra disruptada foi centrifugada a 2.500 rpm, por 10 minutos e após a
centrifugação foi recolhido o sobrenadante, que foi armazenado e congelado a -20ºC
até o momento do uso.
2.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)
O protocolo para dosagem de TBARS segue os fundamentos iniciais
propostos por Konn & Livesedge (1944), com as condições químicas da reação
alterados segundo Percário, et al. (1994). O método se baseia na reação do
malondialdeído e outros compostos com o ácido tiobarbitúrico (TBA), em pH baixo e
temperatura elevada, para formar o complexo MDA-TBA, de cor rosada e absorção
máxima em 535nm.
57
2.7.1. Preparo de Reagentes
2.7.1.1. Ácido tiobarbitúrico
Para a execução da técnica, no dia da realização do teste, 250 µl do ácido
Tiobarbitúrico (10nM; Sigma Aldrich; T5500) foi preparado em solução aquosa de
KH2PO4. Devido a difícil solubilização do TBA, foi necessária a homogeneização em
placa agitadora magnética.
2.7.1.2 Solução padrão de MDA.
O malondialdeído (1,1,3,3, tetrahidroxipropano; Sigma Aldrich; T9889) foi
preparado a 20µM em água destilada. Após o preparo, a solução foi estocada em
geladeira até o momento do uso.
2.7.2. Procedimento técnico
Após o preparo dos reagentes, as amostras foram descongeladas para iniciar
as dosagens. Todas as amostras e padrões foram ensaiados em duplicata,
desprezando-se as leituras nas quais houvesse diferenças maiores que 10% de
absorbância entre os dois tubos, situação em que as dosagens foram repetidas.
Após a identificação dos tubos, foi adicionado 500µl do reagente TBA em
todos os tubos e 250 µl de amostra, sendo que nos tubos do branco foram
adicionados 250 µl de água destilada e nos tubos do padrão foram adicionados 250
µl de solução padrão de MDA. Em seguida, todas as amostras foram colocadas em
banho-maria a 94ºC, durante 1 hora. Findado o tempo no banho-maria, as amostras
foram refrigeradas em água corrente. Depois do resfriamento, foram adicionados 2
mL de álcool n-butílico (Dinâmica #1171) e os tubos foram devidamente tampados e
levados ao agitador tipo vórtex, para que houvesse a homogeneização da amostra.
Subsequentemente, as amostras foram centrifugadas (2.500 rpm x 10
minutos) e, ao término, observou-se que apresentavam duas fases, uma ao fundo
transparente e límpida e outra mais superficial de coloração rosada, variando de
acordo com a quantidade e MDA na amostra. Na sequência, foram pipetados 3 mL
do sobrenadante e, então, foi realizada a leitura em espectrofotômetro (Femto;
58
800XI). A leitura foi realizada em comprimento de onda de 535nm e o aparelho foi
zerado com o branco (água destilada). As absorbâncias dos tubos dos padrões e de
cada amostra foram anotadas e posteriormente utilizadas para elaboração de curva
padrão e para determinação do valor de MDA na amostra, respectivamente.
2.7.3. Curva padrão do TBARS
Antes da execução procedimentos técnicos, foi realizada a curva padrão
para verificar a linearidade da reação e, se necessário, calcular um fator de
conversão de valores de absorbância em concentração.
A curva padrão de TBARS (Figura 11) foi realizada pela diluição sucessiva
do padrão MDA, a partir de uma solução de 400 µM, conforme o protocolo no
Quadro 3.
Quadro 3: Protocolo de Diluições do padrão de malondialdeido (MDA) para curva padrão
TUBO Padrão de MDA (µl) H2O Destilada (µl) MDA (nmol)
S1 3000 0 100
S2 900 de S1 300 75
S3 1000 de S1 1000 50
S4 1000 de S3 1000 25
S5 1200 de S4 300 20
S6 600 de S5 200 15
S7 100 de S1 900 10
S8 100 de S2 900 7,5
S9 50 de S1 950 5
S10 300 de S9 300 2,5
S11 10 de S1 990 1
S12 300 de S11 300 0,5
S13 0 600 0
59
Após a realização das diluições, foram utilizados 500µl de cada valor de
concentração para realização das dosagens. Cada ponto da curva foi realizado em
triplicata e ao final calculou-se a média das absorbâncias dos valores encontrados.
Dessa maneira, a curva padrão encontrada está demonstrada na figura 11.
Figura 11: Curva Padrão de MDA
Com base nos dados obtidos e no gráfico apresentado acima, seguiu-se o
cálculo da equação da reta, utilizando-se a equação de mínimos quadrados, obtendo
a seguinte equação da reta:
MDA = Abs+ 0,0172 0,0601
2.7.4. Cálculo do valor de TBARS das amostras
O valor final de TBARS de cada amostra foi determinado em nmol/mL e foi
calculado pela fórmula obtida através da curva padrão:
TBARS = Absorbância da amostra corrigida para o fator do dia + 0,172 0,0601
Após esse cálculo, o valor obtido foi multiplicado pelo fator de diluição
utilizado na disrrupção.
60
2.8 Dosagem de Nitritos e Nitratos (NN) para Quantificação do Óxido Nítrico
Esta técnica foi realizada utilizando-se o Kit Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay
Kit (Cayman Chemical, Cat # 780001). A dosagem dos metabólitos do óxido nítrico
foi feita utilizando-se o método colorimétrico em placas de ELISA, no qual a
utilização de nitrato redutase promove a conversão do nitrato a nitrito. Na sequencia,
o reagente de Griess converteu o nitrito em um azo composto de cor púrpura
intensa, com absorbância em 540 e 550 nm. Os resultados de absorbância foram
lidos em multileitor de placas em 540nm (PerkinElmer, Victor X3).
Os dados de concentração com base nas absorbâncias encontradas foram
calculados de acordo a seguinte equação da reta NN=(ABS+0,0027)/0,0251, obtida
na curva padrão visualizada na figura 12.
Figura 12: Curva Padrão de Nitritos e Nitratos.
61
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para cada parâmetro analisado foi realizada uma análise de possíveis pontos
discrepantes (outliers) a qual utilizou em seu cálculo o intervalo interquartil, isto é a
diferença entre o terceiro quartil (Q3) e o primeiro quartil (Q1), chamada de dj.
Considerou-se todo valor menor que Q1 -3/2 dj ou maior que Q3 +3/2 dj, como sendo
discrepante, não sendo considerado nos cálculos estatísticos.
Com o objetivo de investigar a existência de diferenças estatisticamente
significantes entre as variáveis estudadas entre os Grupos, aplicou-se o teste
paramétrico, ANOVA dois fatores, quando satisfeita a suposição de normalidade e
homocedasticidade (igualdade de variâncias) assim como, o não-paramétrico,
Kruskal-Wallis, quando não satisfeita a suposição de normalidade, o que ocorreu no
caso da variável PARASITEMIA. Os testes utilizados para testar a normalidade e a
homocedasticidade das variáveis foram o Kolmogorov-Smirnov e Teste de Levene,
respectivamente. Quando rejeitada hipótese de nulidade entre a diferença de médias
entre as variáveis dos grupos estudados foi aplicado o teste de Tukey e quando
detectada a diferença estatisticamente significante entre os postos da mediana
aplicou-se o teste de Dunn´s.
Para verificação de possível correlação entre parâmetros, foi realizado o teste
de correlação de Pearson, considerando-se os valores pareados de dois parâmetros
obtidos para um mesmo animal, realizando-se os cálculos com os dados obtidos de
todos os animais simultaneamente, independente do grupo a que pertençam. Para
as correlações estatisticamente significantes foram atribuídas intensidades sendo
até 0,30 (r < 0,30) uma fraca correlação, entre 0,30 e 0,70 (0,30 < r < 0,70)
moderada correlação e entre 0,70 e 1,00 (0,70 < r < 1,00) uma forte correlação, o
sinal de positivo (+) ou negativo (-), do valor da correlação indica se a relação entre
as variáveis foi diretamente proporcional ou inversamente proporcional,
respectivamente.
Para aplicação do teste ANOVA Dois Fatores e Kruskal-Wallis foi utilizado o
pacote estatístico SigmaStat versão 3.5 e para o cálculo de correlações o pacote
estatístico SPSS versão 17.0. Para edição de tabelas e gráficos foram utilizados os
programas Excel e Word do pacote Office 2007 de Microsoft.
Todos os testes estatísticos foram aplicados considerando o nível de
significância de 5%, ou seja, p< 0,05.
62
3 RESULTADOS
3.1 PARASITEMIA
A figura 13 mostra a progressão da parasitemia nos camundongos infectados
com o P. berghei, 24 horas, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias após a infecção. Cada
grupo foi nomeado de acordo com o tratamento empregado nos animais. Os valores
médios e desvio-padrão estão apresentados na tabela 1. Os resultados da análise
estatística encontram-se nas tabelas 2 e 3.
Os Grupos A e C mostraram um crescimento progressivo e significante
(p<0,001) ao longo do tempo, como esperado para animais infectados. Porém
quando comparados entre si, mesmo apresentando uma diferença numérica de
aproximadamente 10% no 20° dia, não se alcançou significância estatística (p=
0,145).
Figura 13: Progressão temporal da parasitemia de camundongos infectados com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. A: Grupo de camundongos tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); C: Grupo de animais não tratados com Apocinina.
63
Tabela 1- Evolução da parasitemia (%) de camundongos infectados com o Plasmodium berghei submetidos e não submetidos ao tratamento com Apocinina de acordo com o tempo de infecção em dias (d)
Tratamento PARASITEMIA (%)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
Grupo A 10 1,4 ±0,5 10 2,7 ±1,5 11 9,7 ±4,3 11 22,8 ±8,4 1 55,9
Grupo C 9 1,7 ±0,7 10 2,1 ±1,2 12 9,1 ±5,7 12 21,4 ±8,2 3 45,3 ±18,2
N = Número de Animais por grupo de dias; d = tempo de infecção em dias. Resultados expressos como média ± desvio padrão. Grupo A: Grupo de camundongos tratados com o inibidor da NOX (Apocinina) e infectados pelo Plasmodium berghei. Grupo C: Grupo de camundongos não tratados com Apocinina e infectados pelo Plasmodium berghei..
Tabela 2 – Valores de p# para as comparações entre os tempos de cada grupo para Parasitemia
COMPARAÇÃO GRUPOS
A
C
1 dia vs. 5 dias
0,990
1,000
1 dia vs. 10 dias
0,025
0,074
1 dia vs. 15 dias
<0,001
<0,001
1 dia vs. 20 dias
<0,001
<0,001
5 dias vs. 10 dias
0,085
0,076
5 dias vs. 15 dias
<0,001
<0,001
5 dias vs. 20 dias
<0,001
<0,001
10 dias vs. 15 dias
<0,001
<0,001
10 dias vs. 20 dias
<0,001
<0,001
15 dias vs. 20 dias
<0,001
<0,001
Grupo A= Animais infectado com Plasmodium berghei e tratado com Apocinina. Grupo C= Animais infectado com Plasmodium berghei #Obtido pelo Teste de Tukey.
Tabela 3 – Valores de p# para as comparações entre os grupos a cada tempo para Parasitemia.
COMPARAÇÃO TEMPOS
1d 5d 10d 15d 20d
A vs. C 0,808 0,834 0,816
0,209 0,145
Grupo A= Animais infectado com Plasmodium berghei e tratado com Apocinina. Grupo C= Animais infectado com Plasmodium berghe i#Obtido pelo Teste de Tukey.
64
3.2- SOBREVIDA
A figura 14 mostra a taxa percentual de sobrevida, nos diferentes grupos, de
camundongos infectados ou não com o P. berghei. Cada grupo foi nomeado de
acordo com o tratamento empregado nos animais. Os valores percentuais utilizados
encontram-se discriminados na tabela 4.
Figura 14: Percentual de sobrevida de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados e não tratados com Apocinina.
Os grupos A e C mostraram um decréscimo progressivo na sobrevida, dos
grupos infectados pelo P. berghei, porem evidenciando no 20° dia, menor sobrevida
no grupo A, que apresentou 13% de diferença percentual entre os grupos infectados
(6,67% para o Grupo A e 20,00% para o Grupo C), que também foi observado (10%)
nos grupos que não estavam infectados (90% para o Grupo B e 100% para o Grupo
D
65
Tabela 4 – Sobrevida de acordo com os diferentes grupos de experimentação.
Dias Sobrevida (%)
N A N B N C N D
0 64 100 50 100 65 100 50 100
1 64 100 50 100 64 100 50 100
2 54 100 40 100 54 100 40 100
3 54 100 40 100 54 100 40 100
4 54 100 40 100 54 100 40 100
5 54 98 40 100 54 100 40 100
6 44 97 30 100 44 100 30 100
7 44 95 30 100 44 100 30 100
8 44 88 30 100 41 93 30 100
9 44 88 30 100 40 91 30 100
10 44 88 30 100 39 89 30 100
11 30 87 20 100 25 86 20 100
12 30 87 20 100 25 86 20 100
13 30 87 20 100 25 86 20 100
14 30 83 20 100 22 76 20 100
15 30 80 20 100 20 69 20 100
16 15 47 10 100 5 33 10 100
17 15 27 10 100 5 33 10 100
18 15 13 9 90 5 33 10 100
19 15 13 9 90 3 20 10 100
20 15 7 9 90 3 20 10 100
N= Número de amostras por grupo por dia. Valores apresentados como percentual. A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P.
berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei
66
3.3 DOSAGENS PULMONARES
3.3.1 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
A figura 15 mostra o comportamento das Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico nos pulmões de camundongos infectados ou não com o P. berghei,
durante 1 dia, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias de infecção. Cada grupo foi
nomeado de acordo com o tratamento empregado nos animais. Os valores médios e
desvio-padrão estão apresentados na tabela 5. Os valores de p encontram-se
discriminados nas tabelas 6 e 7.
No 1o dia de infecção as seguintes comparações foram significativas: Grupo A
vs. Grupo C (p= 0,001), Grupo B vs. Grupo D (p= 0,005), e Grupo C vs. Grupo D (p <
0,001). No 10o dia as significativas foram: Grupo A vs. Grupo B (p <0,001) e Grupo B
vs. Grupo C (p < 0,001). No 15o dia as diferenças significativas ocorreram nos Grupo
A vs. Grupo D (p <0,001) e Grupo C vs. Grupo D (p < 0,006). Já no 20o dia, as
comparações diferentes foram: Grupo B vs. Grupo C (p < 0,001) e Grupo C vs.
Grupo D (p < 0,048).
Figura 15: Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de
67
camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina.
Os valores de TBARS encontrados no grupos B oscilaram dentro do limiar,
aqui considerado de normalidade, representado pelo grupo D (90 a 160 nmol/mL),
mesmo apresentando algumas diferenças estatísticas entre alguns dias da infecção.
Já os valores encontrados no grupo A e C mostraram considerável diminuição
quando comparados aos expressos em D, mesmo o grupo A mostrando
concentrações iniciais mais elevadas, a partir do 10° dia estes níveis se apresentam
semelhantes ao grupo C. Todas as diferenças estatísticas notadas em determinados
dias ou grupos, são observações isoladas e não se repetem ao longo dos dias de
infecção, portanto não representam significado biológico.
Tabela 5 – Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
Grupos TBARS (nmol/mL)
N 1d N 5d N 10d N 15d N 20d
A 8 128±44 10 123±44 10 61±14 12 54±12 1 61
B 10 83±40 10 156±55 7 153±17 10 94±38 9 151±58
C 9 49±13 10 97±27 12 63±23 6 63±11 3 38±7
D 9 156±19 10 125±53 10 96±43 10 130±29 10 106±56
N= número de amostras por grupo por dia; d = tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média ± desvio padrão. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina
68
Tabela 6 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada grupo da Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
COMPARAÇÃO GRUPOS
A
B
C
D
1 dia vs. 5 dias 0,999
0,332
0,196
0,892
1 dia vs. 10 dias 0,004
0,041
0,999
0,076
1 dia vs. 15 dias <0,001
0,972
0,999
0,963
1 dia vs. 20 dias 0,500
0,002
0,936
0,248
5 dias vs. 10 dias 0,005
0,866
0,265
0,461
5 dias vs. 15 dias <0,001
0,719
0,467
0,999
5 dias vs. 20 dias 0,571
0,291
0,163
0,793
10 dias vs. 15 dias 0,994
0,180
1,000
0,317
10 dias vs. 20 dias 1,000
0,878
0,871
0,984
15 dias vs. 20 dias 1,000
0,013
0,901
0,647
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. #Obitido por Teste de Tukey.
Tabela 7 – Comparação dos valores de p# entre os grupos para as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em pulmão de camundongos infectados ou não pelo P. berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
COMPARAÇÃO TEMPOS
1d 5d 10d 15d 20d
A vs. B 0,077
0,982
<0,001
0,093
0,132
A vs. C 0,001
0,462
1,000
0,972
0,960
A vs. D 0,883
0,998
0,202
<0,001
0,703
B vs. C 0,520
0,699
<0,001
0,437
<0,001
B vs. D 0,005
0,949
0,165
0,174
0,057
C vs. D <0,001
0,364 0,200 0,006
0,048
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei #Obtido por Teste de Tukey.
69
3.3.2 Nitritos e Nitratos
A figura 16 demonstra a concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos
pulmões de camundongos infectados ou não com o P. berghei durante 24 horas, 5
dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias de infecção. Cada grupo foi nomeado de acordo com
o tratamento empregado nos animais. Os valores médios e desvio-padrão estão
apresentados na tabela 8. Os valores de p encontram-se discriminados nas tabelas
9 e 10.
No 1o dia de infecção as seguintes comparações foram significativas: Grupo A
vs. Grupo C (p= 0,001), Grupo B vs. Grupo D (p= 0,005), e Grupo C vs. Grupo D (p <
0,001). No 10o as significativas foram: Grupo A vs. Grupo B (p <0,001) e Grupo B vs.
Grupo C (p < 0,001). No 15o as significativas foram nos Grupo A vs. Grupo D (p
<0,001) e Grupo C vs. Grupo D (p < 0,006). Já no 20o, as comparações diferentes
foram: Grupo B vs. Grupo C (p < 0,001) e Grupo C vs. Grupo D (p < 0,048).
Os comportamento evidenciado para as concentrações de Nitritos e Nitratos
mostra-se semelhante em todos os grupos, e apesar de apresentarem alguns pontos
estatisticamente diferentes, também não se repetem ao longo dos dias,
especialmente quando destacamos as comparações entre os grupos A vs. C, B vs.
D e A vs. D.
Figura 16: Concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, de acordo com o tratamento empregado.
70
A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina.
Tabela 8 – Concentração de Nitritos e Nitratos (NN) nos pulmões de camundongos infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
Grupo
Nitratos e Nitritos (μM)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 9 54 ±41 9 25 ±9 9 31 ±13 12 18 ±13 1 33
B 10 33 ±14 10 46 ±17 9 23 ±8 10 27 ±15 8 36 ±9
C 10 40 ±11 10 17 ±6 11 24 ±13 6 26 ±17 3 42 ±17
D 10 37 ±11 9 24 ±5 10 18 ±9 8 26 ±5 8 32 ±13
N= número de amostras por grupo por dia; d = tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média ± desvio padrão. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina
Tabela 9 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada grupo para Nitritos e Nitratos (NN) nos pulmões de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
COMPARAÇÃO GRUPOS
A
B
C
D
1 dia vs. 5 dias 0,013
0,475
0,020
0,738
1 dia vs. 10 dias 0,225
0,848
0,422
0,104
1 dia vs. 15 dias <0,001
0,934
0,498
0,785
1 dia vs. 20 dias 0,780
0,868
1,000
0,991
5 dias vs. 10 dias 0,798
0,061
0,588
0,739
5 dias vs. 15 dias 0,675
0,109
0,838
1,000
5 dias vs. 20 dias 0,999
0,972
0,174
0,445
10 dias vs. 15 dias 0,092
0,999
1,000
0,689
10 dias vs. 20 dias 0,999
0,285
0,698
0,030
15 dias vs. 20 dias 0,936
0,411
0,689
0,498
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
71
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei #Obtido por Teste de Tukey
Tabela 10 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada tempo em dias
(d) para Nitritos e Nitratos (NN) em pulmão de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
COMPARAÇÃO TEMPOS
1d
5d
10d
15d
20d
A vs. B 0,077
0,982
<0,001
0,093
0,132
A vs. C 0,001
0,462
1,000
0,972
0,960
A vs. D 0,883
0,998
0,202
<0,001
0,703
B vs. C 0,520
0,699
<0,001
0,437
<0,001
B vs. D 0,005
0,949
0,165
0,174
0,057
C vs. D <0,001
0,364
0,200
0,006
0,048
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei #Obtido por Teste de Tukey
72
3.3.3 Estudos de Correlação em Amostras Pulmonares
3.3.3.1 Correlação TBARS e Nitritos e Nitratos
A figura 17 mostra os gráficos de correlação de TBARS e NN nas amostras
pulmonares de camundongos infectados ou não com o P. berghei e submetidos ou
não ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento
isolado e com todas as amostras de todos os tratamentos simultaneamente.
O Grupo C, representados pelos camundongos que não foram tratados com
Apocinina, mas que foram infectados pelo P. berghei, foi o único grupo que
apresentou correlação negativa moderada significativa (r= -0,54; p= 0,0004),
mostrando que nestes animais quando ocorre o aumento das concentrações de
TBARS, as concentrações de NN diminuem. Já o grupo A não apresentou nenhuma
correlação (r= -0,07; p= 0,692)
O grupo B (r= -0,08; p= 0,619) e D (r= 0,21; p= 0,172), assim como Todos os
Grupos não apresentaram correlação significante, mostrando que a apocinina não
exerce influência nestes.
73
Figura 17: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Nitritos e Nitratos (NN) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada
apenas com os pontos do grupo controle negativo.
74
3.3.3.2 Correlação TBARS e Parasitemia
A figura 18 mostra os gráficos de correlação de TBARS e Parasitemia nas
amostras pulmonares de camundongos infectados ou não com o P. berghei e
submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por
tratamento isolado e com todas as amostras de todos os tratamentos
simultaneamente.
A avaliação da correlação para os Grupos A (r= -0,49; p= 0,0012) e para
Todos os Grupos (r= -0,38; p= 0,0006), apresentaram correlação negativa moderada
significante, exibindo uma relação inversamente proporcional. Embora o Grupo C ser
convencionalmente considerado como uma fraca correlação, este mostra tendência
a diferença (r= -0,30; p= 0,061).
Figura 18: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e percentual de Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
75
3.3.3.3 Correlação entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia
A figura 19 mostra os gráficos de correlação de Nitritos e Nitratos e
Parasitemia nas amostras pulmonares de camundongos infectados ou não com o P.
berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são
apresentados por tratamento isolado e com todas as amostras de todos os
tratamentos simultaneamente.
Apesar de nenhum dos grupos apresentarem correlação significante: Grupo A
(r= -0,24; p= 0,148), Grupo C (r= 0,25; p= 0,120), e para todos os grupos (r= -0,03;
p= 0,788), pode-se observar que a apocinina inverte o resultado observado no grupo
C, que mostrava efeito diretamente proporcional, ou seja, quanto mais parasitas
circulantes, mais níveis de NN eram encontrados, e muito embora não se tenha
verificado diferença estatística, o grupo A exibiu efeito inversamente proporcional, se
comportando de maneira semelhante ao cérebro.
Figura 19: Correlações entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação
76
realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
77
3.4- DOSAGENS CEREBRAIS
3.4.1- Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
A figura 20 mostra o comportamento das Substâncias Reativas ao Ácido
Tiobarbitúrico nos cérebros de camundongos infectados ou não com o P. berghei,
durante 1 dia, 5 dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias de infecção. Cada grupo foi
nomeado de acordo com o tratamento empregado ou não nos animais. Os valores
médios e desvio-padrão estão apresentados na tabela 11. Os valores de p
encontram-se discriminados nas tabelas 12 e 13.
O comportamento observado no grupo D, grupo experimental que não estava
infectado e não recebeu apocinina, obteve valores de TBARS entre 106 a 231
nmol/mL, que oscilaram discretamente nos primeiros dias de estudo, decaindo suas
concentrações apenas no 20° dia, que mostrou algumas diferenças estatísticas
temporais de p<0,001. (Tabela 12).
Figura 20: Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei, submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina
78
Também foram observadas as seguintes comparações significativas, no 10o
dia de estudo: Grupo A vs. Grupo B (p= 0,025) e Grupo B vs. Grupo C (p= 0,009) e
no 15o dia, as comparações significativas foram: Grupo C vs. Grupo D (p= 0,043;
Tabela 13).
Apesar de outras diferenças estatísticas poderem ser observadas, quando
comparamos os grupos de estudo A vs. C, não foram encontradas nenhuma
diferença entre eles. De modo geral, todos os grupos estudados exibiram o mesmo
comportamento, apresentando valores dentro do limiar de normalidade, referenciado
em nosso grupo de estudo D.
Tabela 11 – Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o P. berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
Grupos
TBARS (nmol/mL)
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 10 209±20 10 191±14 10 199±11 12 212±15 1 115
B 9 213±18 10 226±30 10 155±43 10 186±57 8 95±40
C 10 203±13 8 200±10 12 212±18 11 181±16 3 153±60
D 10 196±28 9 233 ±8 9 206±45 10 231±90 9 106±75
N= número de amostras por grupo por dia; d = tempo de infecção em dias.
Valores apresentados como média ± desvio padrão. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina
79
Tabela 12 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada grupo das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
COMPARAÇÃO GRUPOS
A
B
C
D
1 dia vs. 5 dias 0,862
0,784
0,989
0,444
1 dia vs. 10 dias 1,000
0,060
0,991
1,000
1 dia vs. 15 dias 1,000
0,858
0,812
0,346
1 dia vs. 20 dias 0,196
<0,001
0,367
<0,001
5 dias vs. 10 dias 0,921
0,001
0,881
0,380
5 dias vs. 15 dias 0,774
0,204
0,981
1,000
5 dias vs. 20 dias 0,411
<0,001
0,591
<0,001
10 dias vs. 15 dias 0,998
0,455
0,487
0,290
10 dias vs. 20 dias 0,223
0,223
0,200
<0,001
15 dias vs. 20 dias 0,169
0,002
0,793
<0,001
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. #Obitido por Teste de Tukey
Tabela 13 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada tempo das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) em cérebros de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
COMPARAÇÃO TEMPOS
1d
5d
10d
15d
20d
A vs. B 0,993
0,246
0,025 * 0,468
1,000
A vs. C 0,986
0,999
0,992
0,349
0,857
A vs. D 0,890
0,207
0,909
0,722
0,996
B vs. C 1,000
0,342
0,009 * 0,999
0,507
B vs. D 0,969
1,000
0,151
0,079
0,966
C vs. D 0,982
0,296
0,775
0,043 * 0,314
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei.
80
C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. #Obitido por Teste de Tukey
3.4.2 Nitritos e Nitratos
A figura 21 demonstra a concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos
cérebros de camundongos infectados ou não com o P. berghei durante 24 horas, 5
dias, 10 dias, 15 dias e 20 dias de infecção. Cada grupo foi nomeado de acordo com
o tratamento empregado nos animais. Os valores médios e desvio-padrão estão
apresentados na tabela 14. Os valores de p encontram-se discriminados nas tabelas
15 e 16.
Na comparação ao longo do tempo, não foi observado nenhuma diferença
estatística. Já na comparação entre os grupos, no 10o dia apenas o grupo B vs. D
(p= 0,043) mostraram diferença estatística e no 15o dia, o grupo A vs. C (p= 0,022).
O comportamento do grupo D observado na figura 21, mostra um crescimento
progressivo, exibindo valores de Nitritos e Nitratos cerebrais entre 21 e 41 µM, que
foram considerados normais, por se tratar do grupo de estudo que não foi tratado
com apocinina e também não foi infectado pelo P. berghei. Quando comparamos
com o grupo B, que teve a enzima NOX inibida, observa-se um decrécimo em suas
concentrações até o 10° dia, evidenciando diferença estatística entre eles (Grupo B
vs. Grupo D, p= 0,043), seguido de uma aumento que apresentou valores
praticamente dentro da normalidade.
Ao analisarmos o Grupo A vs. C, ambos infectados pelo P. berghei, porém
apenas o primeiro teve a NOX inibida, nota-se que o grupo C apresentou aumento
nos valores de NN cerebrais até o 15° dia de estudo (p= 0,022) e mesmo decaindo
suas concentrações no 20° dias, estas foram maiores do que as do grupo A. No
entanto, por se tratar de diferenças pontuais entre alguns grupos, e não
apresentarem nenhuma diferença na análise temporal, evidencia-se o mesmo
comportamento para todos os grupos, da mesma forma que as observadas para as
amostras pulmonares.
81
Figura 21: Concentração de Nitritos e Nitratos produzidos nos cérebros de camundongos infectados ou não com o P. berghei, de acordo com o tratamento empregado. Grupo A (vermelho): tratado com Apocinina e Infectado com Plasmodium berghei; Grupo B (amarelo): tratado com Apocinina; Grupo C (azul): Infectado pelo P. berghei; Grupo D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis e ingestão de água).
Tabela 14 – Concentração de Nitritos e Nitratos (NN) produzidos nos cérebros de camundongos infectados com o P. berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
Grupos
Nitritos e Nitratos ((μμMM))
N 1 d N 5 d N 10 d N 15 d N 20 d
A 10 39,4±19,5 9 26,8±9,3 10 20,7±5,1 12 30,4±10,3 1 27,97
B 10 25,0±7,9 10 17,7±5,8 9 15,7±4,9 10 27,9±13,4 9 30,3±17,5
C 9 25,1±9,8 7 30,0±5,3 12 43,0±34,3 12 54,5±20,6 3 34,8±2,9
D 8 21,0±4,6 10 22,0±11,0 9 28,9±27,7 10 37,4±10,9 9 40,7±23,2
N= número de amostras por grupo por dia; d = tempo de infecção em dias. Valores apresentados como média ± desvio padrão. A= grupo de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei e tratados com o inibidor da NOX (Apocinina); B= grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei, mas tratados com Apocinina; C= grupo de camundongos infectados pelo P. berghei, mas não tratados com Apocinina; D=
82
grupo de camundongos não infectados pelo Plasmodium berghei e não tratados com Apocinina
Tabela 15 – Comparação dos valores de p# entre os tempos de cada grupo dos Nitratos e Nitritos (NN) nos cérebros de camundongos infectados ou não com o Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina.
COMPARAÇÃO
GRUPOS
A
B
C
D
1 dia vs. 5 dias 0,886
0,934
0,873
0,896
1 dia vs. 10 dias 0,305
0,963
0,586
0,643
1 dia vs. 15 dias 0,850
0,998
0,045
0,941
1 dia vs. 20 dias 0,985
0,981
0,997
0,809
5 dias vs. 10 dias 0,867
1,000
0,993
0,152
5 dias vs. 15 dias 1,000
0,804
0,442
0,455
5 dias vs. 20 dias 1,000
0,673
0,998
0,278
10 dias vs. 15 dias 0,866
0,862
0,650
0,973
10 dias vs. 20 dias 0,999
0,743
0,973
0,999
15 dias vs. 20 dias 1,000 0,999 0,576 0,997
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. #Obitido por Teste de Tukey.
83
Tabela 16 – Comparação dos valores de p# entre os grupos a cada tempo dos
Nitratos e Nitritos (NN) em cérebros de camundongos infectados ou não pelo
Plasmodium berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina
COMPARAÇÃO
TEMPOS
1d 5d 10d 15d 20d
A vs. B 0,403
0,487
0,984
0,992
1,000
A vs. C 0,743
0,816
0,071
0,022
0,992
A vs. D 0,762
0,777
0,091
0,860
0,936
B vs. C 0,948
0,107
0,032
0,014
0,988
B vs. D 0,938
0,966
0,043
0,732
0,706
C vs. D 1,000 0,271 1,000 0,214 0,973
A = Grupo de animais tratados com Apocinina e infectados com Plasmodium berghei. B = Grupo de animais tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. C = Grupo de animais não tratados com Apocinina (receberam água potável) e infectados com P. berghei. D = Grupo de animais não tratados com Apocinina e não infectados com P. berghei. #Obitido por Teste de Tukey.
84
3.4.3 Estudos de Correlação em Amostras Cerebrais
3.4.3.1 Correlação TBARS e Nitritos e Nitratos
A figura 22 mostra os gráficos de correlação de TBARS e NN nas amostras
cerebrais de camundongos infectados ou não com o P. berghei e submetidos ou não
ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por tratamento isolado
e com todas as amostras de todos os tratamentos simultaneamente.
Nenhum dos grupos apresentou correlação significante: Todos os Grupos (r=
-0,06; p= 0,420), Grupo A (r= 0,01; p= 0,959), Grupo B (r= -0,10; p= 0,524), Grupo C
(r= -0,05; p= 0,772), Grupo D (r= -0,20; p= 0,192).
85
Figura 22: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Nitritos e Nitratos (NN) em amostras cerebrais de camundongos infectados ou não pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
86
3.4.3.2 Correlação TBARS e Parasitemia
A figura 23 mostra os gráficos de correlação de TBARS e Parasitemia nas
amostras cerebrais de camundongos infectados ou não com o P. berghei e
submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são apresentados por
tratamento isolado e com todas as amostras de todos os tratamentos
simultaneamente.
O grupo C (r= -0,64; p < 0,0001), bem como todos os Grupos (r= -0,48; p <
0,0001) apresentaram correlação negativa moderada significante, exibindo uma
relação inversamente proporcional entre as concentrações de TBARS e Parasitemia
cerebrais. Por outro lado, apesar do Grupo A (r= -0,26; p= 0,101) ter apresentado
correlação negativa fraca, esta não foi significante como a observada nos pulmões.
Figura 23: Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e percentual de Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
87
3.4.3.3 Correlação entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia
A figura 24 mostra os gráficos de correlação de Nitritos e Nitratos e
Parasitemia nas amostras cerebrais de camundongos infectados ou não com o P.
berghei e submetidos ou não ao tratamento com Apocinina. Os gráficos são
apresentados por tratamento isolado e com todas as amostras de todos os
tratamentos simultaneamente.
Nenhum dos grupos apresentou correlação significante: Grupo A (r= -0,09; p=
0,567), Grupo C (r= 0,23; p= 0,151) e para todos os grupos (r= 0,13; p= 0,231).
Figura 24: Correlações entre Nitritos e Nitratos e Parasitemia em amostras cerebrais de camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Todos os Grupos = correlação realizada com todos os pontos de todos os grupos simultaneamente; Grupo A = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina e infectado com P. berghei; Grupo B = correlação realizada apenas com os pontos do grupo tratado com Apocinina; Grupo C = correlação realizada apenas com os pontos do grupo infectado com P. berghei; Grupo D = correlação realizada apenas com os pontos do grupo controle negativo.
88
4 DISCUSSÃO
O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da inibição das
enzimas NADPH oxidase sobre alterações no estresse oxidativo e sobre a síntese
de NO em camundongos infectados com o Plasmodium berghei, ao longo de 20
dias.
Para elucidar estes mecanismos patológicos modelos experimentais em
animais tem sido fundamentais para a compreensão de doenças humanas. Muitos
dos procedimentos experimentais refinados usados com o P. falciparum foram
desenvolvidos inicialmente para as espécies de malária de roedores e macacos.
Embora não possam reproduzir precisamente a doença completa, representam
fielmente certos aspectos da malária humana (Carlton et al., 2002; Hunt & Grau,
2003; Combes et al., 2005).
O modelo mais amplamente utilizado para a malária falciparum em humanos
é o da infecção por P. berghei ANKA em camundongos (Bassir et al., 2012). O
Plasmodium berghei é ideal para o estudo dos casos de malária grave, pois além de
conter sequencias genômicas muito semelhantes a do P. falciparum
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/P_berghei/), exibe lesões em órgãos como
pulmões, cérebro, fígado e baço, características de formas graves da malária
humana (Panet et al, 2007).
Deste modo, o modelo experimental selecionado foi o camundongo Swiss
infectado com a cepa P. berghei ANKA, que oferece além das manifestações
clínicas observadas na malária humana grave, tais como a capacidade de
citoaderência à microcirculação e o desenvolvimento das manifestações cerebrais,
segurança ao pesquisador durante sua manipulação, já que esta espécie não infecta
seres humanos (Cardoso, 2001; Gomes et al., 2011; Jambou et al., 2011; Bassir et
al., 2012).
Entre as diferentes fontes de síntese de ERTON na malária, a via de
conversão de O2 em O2●- realizada pelas enzimas do complexo NOX dos fagócitos,
podem ser responsáveis por este excesso de RL sintetizados, onde o próprio nome
da via (explosão respiratória) faz referência a uma exagerada produção iniciado pelo
hospedeiro nos processos inflamatórios.
89
Para melhor se entender a atividade da NOX, algumas substâncias têm sido
estudadas como inibidores no intuito de avaliar a atividade dessa enzima (Williams &
Griendling, 2007). A apocinina é um destes inibidores, sendo caracterizada como um
bloqueador da atividade das enzimas da família NOX, por isso tem sido amplamente
utilizada como ferramenta experimental desde a década de 80 em estudos in vitro
(Cai et al., 2003), bem como nos estudos que investiram a participação da NOX em
modelos animais in vivo (Bedard & Krause, 2007; Williams & Griendling, 2007;
Stenfanska & Pawliczak, 2008). Além disso, é um agente de administração oral, e o
seu uso em água potável já foi estabelecido em outros estudos (‘tHart et al., 1991;
Matsuhima et al., 2009; Yokota et al., 2009 Yukihiro et al., 2011, Dhiman & Garg,
2011; Castro et al., 2012; Shortt et al., 2014), não apresentando toxicidade nas
doses suficientes para inibir a NOX (Bedard & Krause, 2007; Williams & Griendling,
2007; Stenfanska & Pawliczak, 2008; Maraldi, 2013).
No presente estudo, nossos animais foram tratados com a concentração de
1,5mM de apocinina em água potável, assim como Dhiman & Garg (2011) que
também trataram camundongos infectados e não infectados com Trypanossoma
cruzii, com apocinina em água potável na mesma concentração, conseguindo
bloquear o complexo NADPH oxidase de forma eficiente. De maneira análoga,
Hiroyuki e colaboradores (2011) trataram camundongos na dosagem de 10 mmol/L
em água potável e também conseguiram inibir o complexo enzimático de forma
satisfatória.
Entretanto, embora nossos resultados apresentem diferenças pontuais, não
se pode afirmar que os animais tratados com o inibidor manifestaram alterações nos
níveis de TBARS e NN. Assim como também não podemos afirmar
incontestavelmente que houve a inibição da atividade da NADPH oxidase, pois não
foi realizada nenhuma técnica que evidenciasse diretamente sua inibição, tais como
a Imunohistoquímica, a Quimioluminescência, ou técnicas moleculares como
Reação em Cadeia mediada pela Polimerase com Transcrição Reversa (RT – PCR),
a fim de investigar a expressão dos componentes citosólicos e transmembrana, ou
ainda por Western Blott com investigação das proteínas do complexo NOX.
O papel do estresse oxidativo no modelo proposto foi avaliado através da
quantificação da peroxidação lipídica (TBARS), da produção de metabólitos do óxido
nítrico (nitritos e nitratos), da estimação da parasitemia e da sobrevida observada
90
nos grupos tratados com apocinina em relação aos grupos não tratados. Estes
dados foram comparados entre si e aos efeitos sobre a parasitemia e a sobrevida.
A parasitemia encontrada nos Grupos infectados com P. berghei (Grupos A e
C), se comportou de maneira absolutamente igual ao longo do tempo para cada
grupo, mostrando um crescimento progressivo e significante (p<0,001), como o já
observado em outros estudos do nosso grupo (Souza, 2013; Moreira, 2013).
Entretanto, ao final do tempo de estudo (20° dia), apesar de numericamente
apresentarem diferença de 10% quando comparados entre si, estas não foram
significantes (p= 0,145). Estes dados sugerem que a inibição da NOX, e
consequente diminuição da síntese de superóxido, não tenha interferido na
progressão da parasitemia, o que pode nos levar à interpretação preliminar de que o
estresse oxidativo não seja um fator importante na defesa do hospedeiro contra a
infecção pelos plasmódios, ou ainda, o que é mais provável, que a produção de
radicais livres pela NOX não seja um mecanismo importante de estresse oxidativo
nesta defesa.
Dentre os escassos artigos que estudaram a inativação da NOX na malária,
os resultados obtidos por Sanni et al. (1999) são discrepantes aos achados do
presente estudo. Neste estudo, utilizou-se camundongos knockout (KO) gp91 phox(-/-)
infectados com P. berghei, mostrando que a parasitemia foi significantemente maior
nos camundongos KO, especialmente entre o 5º e o 7º dia após a inoculação.
Entretanto, as diferenças entre os achados de Sanni et al. (1999) e do presente
estudo podem decorrer de múltiplos fatores, tais como de efeitos colaterais
promovidos pelo uso da apocinina sobre outras vias oxidativas, virulência da cepa
de plasmódio empregada, entre outros.
Por outro lado, os achados do presente estudo confirmam o estudo de Potter
et al., (2005) que comparou animais controle de linhagem selvagem com
camundongos knockout (KO) para gp91 phox(-/-) da NADPH oxidase infectados com P.
berghei ANKA, P. berguei K173, P. yoelii, ou P. chabaudi K562, e/ou P. Vinckei
vinckei, e também não encontrou diferenças na progressão da parasitemia nas
diferentes cepas de plasmódio.
Comportamento similar foi observado por Gillman et al. (2004) que avaliou a
parasitemia provocada por Plasmodium chabaudi em animais KO para a porção
p47phox(-/-) da NOX com um grupo controle de camundongos C57BL/6 e notou que a
91
parasitemia nos grupos experimental e controle, apresentou um padrão parecido e
que os animais KO não apresentavam parasitemia exacerbada.
Corroborando o resultado da parasitemia, os dados da sobrevida mostraram
um decréscimo na sobrevida para os grupos de camundongos infectados com P.
berguei. Nota-se uma diferença percentual entre os Grupos A e C (13%), bem como
entre os grupos não infectados (B vs. D = 10%), sugerindo que a apocinina promova
diminuição da sobrevivência dos animais, independente da infecção pelos
plasmódios.
Este fato é ainda mais evidente quando analisamos o grupo de animais
tratado com a apocinina mas não infectado (Grupo B), no qual a diminuição de 10%
da sobrevida em relação ao grupo D (não tratado) pode ter decorrido da diminuição
da capacidade oxidativa dos macrófagos, em resposta ao tratamento com o inibidor,
o que possivelmente tornaram os animais mais susceptíveis à ação de outros
agentes infecciosos.
Alternativamente, esta diferença pode ser oriunda de aspectos individuais do
animal ou decorrente de qualquer problema experimental, já que se trata da morte
de um único animal do grupo ocorrida no período de 20 dias. É importante ressaltar,
que dados não foram analisados estatisticamente, uma vez que esses valores
representam valores percentuais, portanto não passíveis de análise pelos métodos
estatísticos convencionais.
4.1 ACHADOS PULMONARES E CEREBRAIS
O comprometimento pulmonar e/ou cerebral que se observa na malária grave,
pode resultar de inúmeros fatores, porém a presença do estresse oxidativo tem sido
amplamente estudada, já que a síntese excessiva de RL promove danos celulares,
bem como alteração na permeabilidade vascular (Gillrie et al., 2007; Lau, 2013).
Complicações como a malária cerebral (MC), apresentam patogênese
complexa, caracterizada como um estado de coma e que está associado às
manifestações neurológicas resultantes do dano endotelial e sequestro de eritrócitos
parasitados na microcirculação cerebral. Muitas alterações morfológicas, como
modificações na barreira hematoencefálica (BHE) e dano neuronal, já foram
92
identificadas nos portadores da MC (Turner, 1997; Sanni et al., 1999; Medana et al.,
2002).
Pouco se sabe a respeito da participação do complexo enzimático NOX na
fisiopatogenia desta síndrome, embora a participação da ERO na MC já tenha sido
relatada (Sanni et al., 2012). No entanto, a excessiva e inapropriada produção de
ERO pode contribuir para o dano tecidual, agredindo as células endoteliais que por
sua vez, podem comprometer a BHE, provocando o agravamento da doença. Nesse
sentido, o edema cerebral, assim como o pulmonar, parece determinar o quadro
patológico da malária grave (Lopes, 1987). No entanto, o aumento da pressão
intracraniana é que, aparentemente, confere ao edema cerebral maior risco de
morte. Tal anormalidade é advinda de um conjunto de fatores que atuam a fim de
eliminar a infecção mesmo sem que haja a passagem do microrganismo para o
tecido cerebral (Robbins, 1991).
Dentre as fontes do estresse oxidativo na doença, uma das principais vias de
produção de RL é realizada pela NOX, presente não apenas nos fagócitos, mas
também em outros tecidos como as células vasculares, sintetizando fisiologicamente
O2-• em baixos níveis por longos períodos de tempo, ou em altos níveis em resposta
à infecções (Rabelo et al., 2010).
Apesar da NOX fagocítica ter sido primeiramente descrita, há escassas
pesquisas sobre o envolvimento desta na infecção malárica. Ao contrário dos
inúmeros estudos que investigam o papel da NOX endotelial em outras patologias.
De fato, o conhecimento acerca da relação do complexo enzimático NOX e o
desbalanço redox (estresse oxidativo), se deve principalmente aos estudos
relacionados à doenças cardiovasculares (Dusting et al.,2005; Rabelo et. al, 2010).
Para avaliar a participação das ERO nas alterações oxidativas da malária em
camundongos tratados e não tratados com Apocinina foram avaliados indicadores
de estresse oxidativo, especificamente da peroxidação de lipídios, como as
Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico.
No presente estudo, os resultados encontrados para TBARS nos pulmões dos
grupos A e C, apresentaram considerável diminuição, quando comparados aos
grupos B e D (não infectados pelo P. berghei), mostrando entre outras diferenças
pontuais, a observada entre os grupos A vs. D no 15º (p<0,001), o que nos faz
pensar, que o uso da apocinina possa diminuir os níveis de TBARS. Este dado
93
sugere que a produção de O2.- pela NOX seja uma fonte importante de estresse
oxidativo na doença (Figura 15; Tabelas 5-7).
No entanto, mesmo mostrando algumas diferenças estatísticas iniciais, estas
não se sustentaram, pois são observações isoladas, o que não representa
significado biológico, ou seja, estes dados mostram que a apocinina diminuiu a
produção de TBARS neste modelo, o que sugere, diferentemente do afirmado
acima, que a síntese de superóxido pela atividade macrofágica (e portanto pela
NOX) não seja um mecanismo importante para o estresse oxidativo do hospedeiro
na malária.
Do mesmo modo, as concentrações de TBARS cerebrais mostraram
comportamento semelhante para todos os grupos estudados, mostrando valores
dentro do limiar de normalidade, referido em nosso grupo de estudo D. Esses
resultados sugerem que a produção de superóxido, pelo menos no parênquima
cerebral não desenvolve papel importante no desenvolvimento e na patogênese da
malária, ou, ainda, que a apocinina não tenha sido capaz de atravessar a BHE.
Dessa forma, os achados do presente estudo discordam os dados
encontrados por Kleniewska et al. (2013), que avaliou a influência da apocinina na
peroxidação lipídica utilizando a técnica TBARS em homogeneizados de coração de
ratos, nos quais o uso do inibidor da NOX provocou uma diminuição significativa nos
níveis de TBARS.
Além do superóxido, há outras moléculas que desempenham papel
importante durante a infecção malárica. Dentre estas, destaca-se o NO que
apresenta grande importância na manutenção da parede vascular (Rabelo et. al,
2010), mas que por ser um RL, na presença do O2-•, reage extremamente rápido,
formando a ânion peroxinitrito (ONOO-•), um agente pro-inflamatório altamente
reativo (Dusting et al., 2005). No entanto, seu envolvimento nos acometimentos
cerebrais ainda continua obscuro, não se conhendo se o problema advém das
concentrações insuficientes do mesmo atuando diretamente, via radical livre, na
eliminação do parasita, e por este motivo, conferindo sobrevida ao parasita
(Gramaglia et al., 2006), ou se óxido nítrico em altas concentrações é o responsável
pelo edema cerebral (Favre et al., 1999; Maneerat et al., 2000).
Repetindo o comportamento encontrado para as concentrações de TBARS
pulmonares e cerebrais, os níveis de nitratos e nitritos detectados nos pulmões
foram muito semelhantes em todos os grupos estudados, e mesmo apresentando
94
algumas diferenças estatísticas pontuais, estas não são observadas quando
comparamos os grupos A vs. C, B vs. D, ou A vs. D.
Já a análise das concentrações de nitritos e nitratos encontradas no cérebro
revelou um crescimento progressivo exibido pelo grupo D, o qual não recebeu
tratamento com inibidor da NOX e não estava infectado pelo P. berghei, assim como
o grupo C também mostrou crescimento progressivo, porém até o 15° dia,
diminuindo suas concentrações na sequência do estudo. Quando comparamos o
grupo B vs. D, verifica-se um decréscimo em suas concentrações até o 10° dia, com
diferença estatística entre estes (p= 0,043), o que também foi observado para o
grupo A vs. C, que exibiu o mesmo comportamento no 15° dia (p=0,022). Contudo,
estas diferenças pontuais não representam significado biológico, pois não se
reproduzem ao longo do tempo.
Portanto, esperava-se encontrar maior disponibilidade de NO após inibição da
NOX, já que em patologias onde há ativação da NOX, tal como ocorre na malária, o
aumento extracelular de O2•- favorece o sequestramento do NO e leva ao aumento
da produção de peroxinitrito e de dano celular, além de diminuir a biodisponibilidade
do NO (Rabelo et al., 2010).
Nas análises entre TBARS e NN pulmonares, foi encontrada correlação
negativa moderada e significante para o Grupo C (r= -0,54; p= 0,0004), grupo
infectado com o P. berghei, mas não tratado com a apocinina. Como os demais
grupos, e em especial o Grupo A, não apresentaram correlações significantes, pode-
se inferir que a apocinina não tenha exercido influência na síntese de NO durante a
malária. Entretanto, a correlação TBARS vs. NN encontrada para o Grupo C se
desfaz pelo uso da apocinina, conforme constatado pela ausência de correlação
significante para o Grupo A, sugerindo que a inibição da NOX tenha diminuído a
síntese de superóxido e, consequentemente, impedido o sequestro do NO. Ademais,
para as amostras cerebrais não se encontrou correlação significante em nenhum
grupo estudado.
As correlações pulmonares realizadas entre TBARS e parasitemia mostraram
moderada correlação negativa significante para o Grupo A (r= -0,49; p= 0,0012) e
também para Todos os Grupos (r= -0,38; p= 0,0006), e embora o grupo C tenha
apresentado apenas tendência a diferença (r= -0,30; p= 0,06), o que significa que,
assim como para as outras comparações, quanto maior as concentrações de
TBARS, menores as porcentagens de parasitemia encontrada, ou seja, os dados do
95
presente estudo concordam com os achados anteriores de que o estresse oxidativo
atua como fator protetor para o hospedeiro na infecção pelo P. berghei. Pode-se
inferir mais ainda, neste caso, que a via de produção de ERO pela NOX não é um
componente importante no estabelecimento do EO pulmonar.
Já as correlações cerebrais entre TBARS e parasitemia, apesar da correlação
negativa moderada significante encontrada para todos os grupos (r= -0,48; p<
0,0001), assim como no grupo C (r= -0,64; p< 0,001), o grupo A não apresentou
correlação, sugerindo que a inibição da NOX, tenha alterado este efeito de
correlação anteriormente observado no grupo não tratado com apocinina (C),
diferentemente dos dados observados nos pulmões.
Por último, não foi estabelecido correlações entre Nitritos e Nitratos e a
parasitemia em ambos os tecidos, porem observa-se através do comportamento do
estudo de correlação do grupo C, que os resultados são inversamente proporcionais,
enquanto que para o grupo A, ocorreu inversão no comportamento destes
resultados, demostrando valores inversamente proporcionais, ou seja, quanto mais
parasitas circulantes, menores são os níveis de NN encontrados. Portanto, a
diminuição de síntese de ERO pela inibição da via NADPH oxidase, não
comprometeu a formação do EO, confirmando os dados de TBARS pulmonar e a
parasitemia.
Embora, nossos resultados tenham sido consistentes em não mostrar
diferenças significantes nos níveis de TBARS e NN em decorrência da inibição da
NOX pela apocinina, ainda é cedo para que se possa afirmar que o superóxido não
tenha participação importante como mecanismo primário de defesa do hospedeiro
frente à infecção pelos plasmódios, fazendo-se necessário o desenvolvimento de
estudos complementares.
Não obstante, os resultados de parasitemia mostram que o estresse oxidativo
revela-se, de fato, como mecanismo protetor para o hospedeiro, corroborando com
outros estudos que também discutiram a participação de moléculas do estresse
oxidativo na proteção contra malária grave (Yeo et al, 2007; 2008; Brown et al, 2009,
Dhangadamajhi et al, 2009).
96
5 CONCLUSÃO
Os resultados apresentados sugerem que, embora a inibição da NADPH
oxidase, via tratamento com o inibidor Apocinina, tenha diminuído a sobrevida, o uso
dessa substância não promoveu alterações significativas no perfil oxidativo nas
amostras pulmonares e cerebrais em camundongos infectados pelo P. berghei.
O uso da apocinina não promoveu alterações significantes sobre a evolução
da parasitemia durante 20 dias após a infecção pelo P. berghei.
Não foram encontradas correlações significantes entre TBARS e Parasitemia.
A síntese de radicais superóxido por ação da NOX aparentemente não é um
componente importante do EO na malária.
97
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7 APÊNDICES
APÊNDICE 1- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 1 dia de infecção com P. Berghei.
TBARS Parasitemia NN Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 189,7 AI 1,3 91,8 75,1
2 203,6 155,1 0,7 29,3 39,3
3 172,3 TQ 1,7 46,0 TQ
4 218,8 175,3 1,9 31,3 21,2
5 232,3 96,9 1,8 31,8 35,5
6 199,4 137,6 1,3 42,0 10,7
7 205,3 51,8 2,2 27,2 133,3
8 223,9 145,6 1,0 25,3 42,8
9 234,5 171,9 1,0 32,7 21,4
10 218,4 88,2 1,3 36,3 101,9
Média 209,8 127,8 1,4 39,4 53,5
DP 19,6 44,2 0,5 19,5 41,4
Q1 200,4 94,7 1,0 29,8 21,4
Q3 222,6 159,3 1,8 40,6 75,1
DJ 22,2 64,6 0,7 10,8 53,7
2/3DJ 33,3 96,9 1,1 16,2 80,5
Q1-3/2DJ 167,2 -2,1 -0,1 13,6 -59,2
Q3+3/2DJ 255,9 256,2 2,9 56,8 155,6
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável AI= Amostra insuficiente TQ= tubo quebrou na centrífuga
112
APÊNDICE 2- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 5 dias de infecção com P. Berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 178.82 166.86 2.8 25.52 26.42
2 199.15 56.67 0.8 22.48 54.68 *
3 190.55 179.67 2 24.83 19.12
4 192.90 78.27 5 18.99 25.50
5 188.59 122.93 2.6 22.62 17.60
6 162.00 172.71 2.4 14.87 24.79
7 210.49 70.22 1.1 67.04 * 16.25
8 183.90 143.06 5.2 44.82 42.65
9 203.06 113.41 3.8 28.96 35.25
10 204.63 121.83 1.5 37.69 20.48
Média 191.41 122.56 2.72 26.75 25.34
DP 14.24 43.83 1.53 9.31 8.69
Q1 185.07 87.05 1.63 22.48 19.12
Q3 202.08 160.91 3.55 28.96 26.42
DJ 17.01 73.85 1.93 6.48 7.30
2/3DJ 25.51 110.78 2.89 9.72 10.95
Q1-3/2DJ 159.56 -23.72 -1.26 12.76 8.17
Q3+3/2DJ 227.60 271.68 6.44 38.68 37.37
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
113
APÊNDICE 3- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 10 dias de infecção com P. Berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 286,06 * 80,73 8 35,39 18,27
2 199,09 45,43 4,8 20,55 22,84
3 191,31 77,96 7,1 21,43 45,37
4 195,20 50,28 9,4 26,38 12,68
5 202,21 72,08 4,3 20,25 25,59
6 192,48 TQ 18,2 13,88 TQ
7 220,51 43,01 13,3 27,87 49,12
8 † † † † †
9 † † † † †
10 † † † † †
11 182,35 72,43 13,8 18,79 22,55
12 195,98 61,00 12,9 11,96 34,21
13 196,37 65,50 7,5 25,14 43,46
14 211,16 45,08 7,6 20,28 94,94 *
15 † † † † †
Média 198,67 61,35 9,72 20,65 30,45
DP 10,69 14,47 4,29 5,06 13,05
Q1 193,16 46,64 7,30 19,15 22,55
Q3 201,43 72,34 13,10 24,21 43,46
DJ 8,27 25,70 5,80 5,06 20,91
2/3DJ 12,41 38,55 8,70 7,59 31,36
Q1-3/2DJ 180,75 8,10 -1,40 11,56 -8,81
Q3+3/2DJ 213,84 110,89 21,80 31,81 74,82
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável TQ= tubo quebrou na centrífuga †= camundongo falecido *= valores excluídos
114
APÊNDICE 4- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 15 dias de infecção com P. Berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 184,69 53,04 39,1 44,19 32,33
2 198,71 54,08 8,5 20,21 22,34
3 218,95 39,20 44,5 * 41,81 16,38
4 192,09 39,55 18,7 26,47 29,45
5 † † † † †
6 214,67 58,24 25,8 25,68 6,96
7 213,11 67,93 17,7 51,11 9,92
8 222,46 41,28 17,9 27,45 15,47
9 196,76 45,43 21,9 27,33 35,29
10 † † † † †
11 222,46 52,01 21,9 18,19 7,44
12 227,91 52,70 24,8 24,98 38,80
13 232,58 72,43 20,0 34,63 3,15
14 221,68 75,54 35,0 22,88 4,10
15 † † † † †
Média 212,17 54,29 22,84 30,41 18,47
DP 15,36 12,37 8,42 10,28 12,81
Q1 198,22 44,39 18,30 24,45 7,32
Q3 222,46 60,66 25,30 36,43 30,17
DJ 24,24 16,27 7,00 11,97 22,85
2/3DJ 36,36 24,40 10,50 17,96 34,27
Q1-3/2DJ 161,86 19,99 7,80 6,50 -26,95
Q3+3/2DJ 258,81 85,06 35,80 54,38 64,44
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= camundongo falecido *= valores excluídos
115
APÊNDICE 5- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 20 dias de infecção com P. Berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 † † † † †
2 † † † † †
3 † † † † †
4 † † † † †
5 † † † † †
6 115,19 60,76 55,9 27,97 32,53
7 † † † † †
8 † † † † †
9 † † † † †
10 † † † † †
11 † † † † †
12 † † † † †
13 † † † † †
14 † † † † †
15 † † † † †
Média 115,19 60,76 55,90 27,97 32,53
DP
Q1 115,19 60,76 55,90 27,97 32,53
Q3 115,19 60,76 55,90 27,97 32,53
DJ 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2/3DJ 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Q1-3/2DJ 115,19 60,76 55,90 27,97 32,53
Q3+3/2DJ 115,19 60,76 55,90 27,97 32,53
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= camundongo falecido
116
APÊNDICE 6- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 1 dia da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 237,4 42,4 41,4 39,3
2 226,4 83,8 15,9 41,7
3 130,5 * 88,5 19,4 31,4
4 229,0 62,5 19,0 26,0
5 184,2 55,9 20,9 5,1
6 195,6 118,2 30,8 33,0
7 208,9 150,4 29,4 23,4
8 228,5 39,5 21,2 51,5
9 197,2 51,2 20,2 25,6
10 210,5 134,6 31,3 52,2
Média 213,1 82,7 25,0 32,9
DP 18,3 39,7 7,9 14,2
Q1 197,2 52,4 19,6 25,7
Q3 228,5 110,8 30,5 41,1
DJ 31,3 58,4 10,9 15,4
2/3DJ 46,9 87,6 16,3 23,1
Q1-3/2DJ 150,3 -35,2 3,3 2,6
Q3+3/2DJ 275,4 198,3 46,8 64,2
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
117
APÊNDICE 7- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 5 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 235,52 154,04 11,64 39,28
2 237,47 136,84 18,72 56,83
3 200,72 168,69 20,82 28,91
4 168,65 50,45 28,12 79,88
5 245,68 55,94 15,70 33,80
6 184,68 125,86 13,14 39,97
7 250,10 49,35 24,55 30,35
8 246,99 207,49 19,68 59,51
9 248,15 74,61 13,35 59,24
10 243,87 135,74 10,86 27,65
Média 226,18 115,90 17,66 45,54
DP 29,95 55,35 5,75 17,40
Q1 209,42 60,61 13,19 31,21
Q3 246,66 149,74 20,53 58,64
DJ 37,24 89,13 7,34 27,43
2/3DJ 55,87 133,70 11,01 41,14
Q1-3/2DJ 153,55 -73,09 2,18 -9,93
Q3+3/2DJ 302,52 283,44 31,54 99,78
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
118
APÊNDICE 8- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 10 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 159,38 51,31 * 19,66 30,31
2 236,08 181,10 46,01 * 28,46
3 133,68 132,30 20,80 8,11
4 94,75 79,69 * 19,61 22,41
5 115,77 AI 14,64 47,56 *
6 150,04 156,87 11,04 19,68
7 119,28 140,26 22,03 31,87
8 211,55 144,76 11,12 25,44
9 158,21 149,95 8,87 14,82
10 171,84 166,91 13,74 21,90
Média 155,06 153,16 15,72 22,56
DP 43,47 16,66 4,89 7,64
Q1 122,88 142,51 11,12 19,68
Q3 168,73 161,89 19,66 28,46
DJ 45,85 19,38 8,54 8,78
2/3DJ 68,77 29,07 12,81 13,16
Q1-3/2DJ 54,11 113,44 -1,68 6,52
Q3+3/2DJ 237,49 190,96 32,47 41,62
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável AI= Amostra insuficiente *= valores excluídos
119
APÊNDICE 9- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 15 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 141,86 76,58 26,34 31,78
2 202,60 160,33 15,61 18,87
3 206,49 117,76 17,34 31,64
4 248,93 67,23 55,05 48,73
5 184,69 143,37 42,27 11,60
6 203,38 60,66 18,58 29,09
7 183,91 83,15 38,61 1,70
8 282,00 71,04 28,48 14,78
9 97,87 110,15 16,48 47,91
10 110,34 46,47 19,95 32,21
Média 186,21 93,68 27,87 26,83
DP 57,37 37,56 13,35 15,19
Q1 152,37 68,19 17,65 15,80
Q3 205,71 115,86 36,08 32,10
DJ 53,34 47,67 18,43 16,30
2/3DJ 80,01 71,51 27,65 24,45
Q1-3/2DJ 72,36 -3,32 -10,00 -8,64
Q3+3/2DJ 285,73 187,37 63,73 56,55
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável
120
APÊNDICE 10- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos tratados com Apocinina após 20 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 77,41 119,93 16,13 25,41
2 162,97 254,33 47,00 27,83
3 65,11 119,08 23,89 23,65
4 † † † †
5 274,56 * 104,29 24,44 80,11 *
6 142,26 119,51 12,95 35,92
7 72,64 76,73 25,37 45,36
8 90,88 198,12 62,18 40,67
9 46,43 210,37 46,87 38,03
10 101,59 160,08 13,74 48,59
Média 94,91 151,38 30,29 35,68
DP 39,60 58,28 17,49 9,28
Q1 70,75 119,08 16,13 27,22
Q3 111,76 198,12 46,87 41,84
DJ 41,00 79,03 30,75 14,62
2/3DJ 61,50 118,55 46,12 21,93
Q1-3/2DJ 9,25 0,54 -29,99 5,29
Q3+3/2DJ 173,26 316,66 92,99 63,78
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= camundongo falecido *= valores excluídos
121
APÊNDICE 11- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 1 dia da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 185,0 49,0 1,8 38,2 61,9
2 206,6 73,1 2,7 34,8 43,5
3 191,8 46,1 2,6 17,1 31,6
4 190,1 44,6 1,6 74,3 * 32,0
5 217,6 46,1 1,2 26,6 31,2
6 195,2 35,8 1,7 36,0 42,7
7 195,6 44,2 5,5 * 14,3 44,3
8 218,4 66,9 1,0 27,6 25,3
9 216,7 145,6 * 0,9 17,7 43,4
10 217,6 33,2 2,0 13,6 46,3
Média 203,4 48,8 1,7 25,1 40,2
DP 13,3 13,2 0,7 9,8 10,5
Q1 192,6 44,2 1,2 17,1 31,7
Q3 217,3 49,0 2,0 34,8 44,1
DJ 24,7 4,8 0,9 17,8 12,4
2/3DJ 37,1 7,1 1,3 26,6 18,6
Q1-3/2DJ 155,5 37,1 -0,2 -9,6 13,1
Q3+3/2DJ 254,4 56,1 3,4 61,4 62,7
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
122
APÊNDICE 12- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 5 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 209,3 133,2 1,3 53,6 * 20,0
2 208,4 121,5 1,3 88,7 * 16,8
3 186,6 95,1 1,3 27,9 12,8
4 192,5 128,1 1,6 35,4 33,0
5 190,9 90,7 0,6 31,7 9,3
6 215,6 88,5 3,7 31,2 15,7
7 196,4 49,7 1,8 23,8 12,8
8 151,5 * 85,2 2,7 36,9 14,1
9 196,4 65,5 4,5 23,0 17,4
10 AE 109,4 2,5 AE 15,2
Média 199,5 96,7 2,1 30,0 16,7
DP 10,3 26,9 1,2 5,3 6,4
Q1 192,1 86,0 1,3 25,9 13,2
Q3 208,7 118,4 2,7 33,5 17,2
DJ 16,5 32,4 1,4 7,6 4,1
2/3DJ 24,8 48,6 2,0 11,5 6,1
Q1-3/2DJ 167,3 37,5 -0,7 14,4 7,1
Q3+3/2DJ 233,5 167,0 4,7 45,0 23,3
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável AE= Amostra extraviada *= valores excluídos
123
APÊNDICE 13- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 10 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 220,51 79,35 21,5 17,16 11,34
2 232,19 65,16 4,9 28,20 27,96
3 211,16 49,24 13 12,27 43,95
4 203,77 32,28 2,2 19,34 25,25
5 210,39 29,86 5,6 16,28 66,06 *
6 190,14 66,54 14,5 19,79 20,82
7 210,78 53,74 9,3 31,12 18,30
8 252,44 47,16 9,4 110,67 47,12
9 † † † † †
10 † † † † †
11 190,92 50,28 6,2 59,57 30,59
12 222,46 81,08 14,2 101,56 11,23
13 194,03 103,92 5,5 69,20 14,99
14 199,48 94,23 3,0 30,54 12,56
15 † † † † †
Média 211,52 62,74 9,11 42,98 24,01
DP 18,33 23,34 5,72 34,26 12,54
Q1 198,12 48,72 5,35 18,79 13,77
Q3 221,00 79,78 13,30 61,98 29,28
DJ 22,87 31,06 7,95 43,18 15,50
2/3DJ 34,31 46,59 11,93 64,78 23,25
Q1-3/2DJ 163,81 2,13 -6,58 -45,98 -9,48
Q3+3/2DJ 255,31 126,37 25,23 126,75 52,53
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= camundongo falecido *= valores excluídos
124
APÊNDICE 14- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 15 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 220,51 * 79,00 27,7 28,31 41,15
2 170,28 53,04 18,6 41,79 28,81
3 189,75 52,01 14 31,80 45,70
4 183,52 59,62 17,8 77,25 17,41
5 † † † † †
6 183,13 59,62 9,9 32,56 22,14
7 160,55 74,50 21,4 82,09 0,55
8 176,12 AE 11,8 73,69 AE
9 175,34 AE 18,6 60,64 AE
10 212,72 AE 22,1 37,18 AE
11 187,80 AE 24,8 76,75 AE
12 193,64 AE 36,0 69,27 AE
13 153,93 AE 34,4 42,73 AE
14 † † † † †
15 † † † † †
Média 180,62 62,97 21,43 54,50 25,96
DP 16,19 11,24 8,21 20,63 16,50
Q1 172,81 54,69 16,85 36,02 18,59
Q3 188,78 70,78 25,53 74,45 38,06
DJ 15,96 16,09 8,68 38,43 19,47
2/3DJ 23,95 24,14 13,01 57,64 29,20
Q1-3/2DJ 148,87 30,55 3,84 -21,62 -10,61
Q3+3/2DJ 212,72 94,92 38,54 132,09 67,27
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável AE= Amostra extraviada †= camundongo falecido *= valores excluídos
125
APÊNDICE 15- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 20 dias da inoculação de hemácias parasitadas com P. berghei.
TBARS Parasitemia NN
Animal Cérebro Pulmão (%) Cérebro Pulmão
1 116,35 30,33 54,6 35,57 61,51
2 222,51 43,43 24,4 31,52 34,49
3 † † † † †
4 † † † † †
5 † † † † †
6 † † † † †
7 † † † † †
8 † † † † †
9 † † † † †
10 † † † † †
11 121,85 40,48 57,0 37,21 29,66
12 † † † † †
13 † † † † †
14 † † † † †
15 † † † † †
Média 153,57 38,08 45,33 34,77 41,89
DP 59,76 6,87 18,17 2,93 17,17
Q1 119,10 35,40 39,50 33,55 32,08
Q3 172,18 41,96 55,80 36,39 48,00
DJ 53,08 6,55 16,30 2,84 15,93
2/3DJ 79,62 9,83 24,45 4,26 23,89
Q1-3/2DJ 39,49 25,58 15,05 29,28 8,19
Q3+3/2DJ 251,80 51,78 80,25 40,66 71,89
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= camundongo falecido
126
APÊNDICE 16- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 1 dia da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 208,9 136,8 50,3 * 35,1
2 236,7 14,9 * 22,7 41,0
3 196,8 142,7 22,4 39,9
4 211,3 165,0 25,3 23,3
5 208,5 132,8 84,8 * 20,4
6 144,8 149,3 17,6 52,8
7 164,4 165,4 16,0 55,7
8 196,8 184,1 23,2 39,5
9 222,2 143,4 26,8 33,5
10 173,3 181,9 14,1 28,4
Média 196,4 155,7 21,0 37,0
DP 28,0 19,1 4,58 11,5
Q1 179,2 142,7 17,2 29,7
Q3 210,7 165,4 23,8 40,7
DJ 31,5 22,7 6,59 11,1
2/3DJ 47,2 34,0 9,89 16,6
Q1-3/2DJ 132,0 108,7 7,28 13,1
Q3+3/2DJ 257,9 199,4 33,7 57,3
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= camundongo falecido *= valores excluídos
127
APÊNDICE 17- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 5 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 242,3 83,4 40,4 18,2
2 244,3 192,8 13,5 31,0
3 237,6 132,6 19,3 23,3
4 220,1 109,8 15,2 19,6
5 233,7 194,7 27,4 27,4
6 221,7 56,9 41,0 21,7
7 231,4 77,3 11,9 17,6
8 232,6 191,8 23,6 63,7 *
9 232,2 78,0 13,4 21,2
10 182,7 * 137,5 14,2 31,3
Média 232,9 125,5 22,0 23,5
DP 8,2 53,0 11,0 5,2
Q1 231,4 79,3 13,7 19,6
Q3 237,6 178,2 26,4 27,4
DJ 6,2 98,9 12,7 7,7
2/3DJ 9,3 148,4 19,1 11,6
Q1-3/2DJ 222,1 -69,1 -5,4 8,0
Q3+3/2DJ 247,0 326,6 45,5 39,0
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
128
APÊNDICE 18- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 10 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 229,85 53,39 18,80 34,23
2 222,46 92,50 170,04 * 11,03
3 231,02 143,72 70,34 6,43
4 193,64 157,22 12,29 18,21
5 271,90 131,95 9,30 18,89
6 176,90 135,07 24,41 19,24
7 218,56 81,08 18,48 14,41
8 197,54 67,93 11,98 24,55
9 90,86 * 32,28 11,63 6,75
10 111,49 66,20 83,14 27,09
Média 205,93 96,13 28,93 18,08
DP 44,68 42,99 27,69 8,90
Q1 193,64 66,63 11,98 11,87
Q3 229,85 134,29 24,41 23,23
DJ 36,21 67,66 12,43 11,35
2/3DJ 54,31 101,49 18,64 17,03
Q1-3/2DJ 139,33 -34,86 -6,65 -5,16
Q3+3/2DJ 284,17 235,78 43,05 40,25
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
129
APÊNDICE 19- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 15 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 187,32 82,12 30,51 22,22
2 157,26 105,30 51,94 29,26
3 285,56 166,56 22,76 18,45
4 57,55 152,72 40,77 26,16
5 325,15 90,08 19,78 35,25
6 287,02 138,18 45,53 28,63
7 276,03 128,15 51,00 10,18 *
8 135,75 141,30 41,71 24,32
9 305,35 134,38 35,01 24,29
10 292,16 159,29 34,89 62,81 *
Média 230,91 129,81 37,39 26,07
DP 89,92 28,72 10,94 5,07
Q1 164,77 111,01 31,61 23,77
Q3 290,87 149,86 44,58 28,78
DJ 126,10 38,85 12,97 5,01
2/3DJ 189,15 58,27 19,46 7,52
Q1-3/2DJ -24,38 52,74 12,15 16,25
Q3+3/2DJ 480,02 208,14 64,03 36,30
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
130
APÊNDICE 20- Valores de TBARS, Nitritos e Nitratos, e Parasitemia para camundongos não tratados com Apocinina após 20 dias da inoculação de hemácias não parasitadas com P. berghei.
TBARS NN
Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão
1 66,56 76,82 16,52 12,14
2 155,06 93,73 32,33 30,84
3 243,04 185,44 82,37 41,82
4 151,39 171,91 20,36 36,34
5 35,29 82,64 49,60 67,98 *
6 10,24 54,00 36,61 31,08
7 152,13 64,14 22,02 43,85
8 46,43 78,51 34,09 45,95
9 AE 194,22 AE 11,56
10 90,73 53,90 72,73 83,56 *
Média 105,65 105,53 40,74 31,70
DP 74,90 55,69 23,24 13,44
Q1 46,43 67,31 22,02 26,16
Q3 152,13 152,37 49,60 42,32
DJ 105,69 85,05 27,58 16,16
2/3DJ 158,54 127,58 41,37 24,24
Q1-3/2DJ -112,10 -60,27 -19,36 1,93
Q3+3/2DJ 310,66 279,95 90,97 66,56
DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= j-ésimo decil Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= valores excluídos
131
ANEXOS
ANEXO 1
PPAARREECCEERR MMEEDD001144//22000088
PPrroojjeettoo:: AALLTTEERRAAÇÇÕÕEESS OOXXIIDDAATTIIVVAASS,, DDOO ÓÓXXIIDDOO NNÍÍTTRRIICCOO EE EEXXPPRREESSSSÃÃOO DDEE
CCIITTOOCCIINNAASS EE GGMM--CCSSFF,, IINNDDUUZZIIDDAASS PPEELLOO PPLLAASSMMOODDIIUUMM BBEERRGGHHEEII EEMM
CCAAMMUUNNDDOONNGGOOSS
CCoooorrddeennaaddoorr:: SSaannddrroo PPeerrccáárriioo ((IICCBB//UUFFPPaa))
VViiggêênncciiaa:: 0066--0033--22001111 aa 0066--0033--22001144
OO PPrroojjeettoo ddee PPeessqquuiissaa iinnttiittuullaaddoo ““AALLTTEERRAAÇÇÕÕEESS OOXXIIDDAATTIIVVAASS,, DDOO
ÓÓXXIIDDOO NNÍÍTTRRIICCOO EE EEXXPPRREESSSSÃÃOO DDEE CCIITTOOCCIINNAASS EE GGMM--CCSSFF,, IINNDDUUZZIIDDAASS PPEELLOO
PPLLAASSMMOODDIIUUMM BBEERRGGHHEEII EEMM CCAAMMUUNNDDOONNGGOOSS”” ffooii aavvaalliiaaddoo ppeelloo CCoommiittêê ddee ÉÉttiiccaa
eemm PPeessqquuiissaa ccoomm AAnniimmaaiiss ddee EExxppeerriimmeennttaaççããoo ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall
ddoo PPaarráá ((CCEEPPAAEE)) ee ooss pprroocceeddiimmeennttooss eexxppeerriimmeennttaaiiss uuttiilliizzaaddooss sseegguueemm
aass nnoorrmmaass llooccaaiiss ee iinntteerrnnaacciioonnaaiiss ppaarraa mmaanniippuullaaççããoo ee uussoo ddee aanniimmaaiiss ddee
eexxppeerriimmeennttaaççããoo.. PPoorrttaannttoo,, oo CCEEPPAAEE,, aattrraavvééss ddee sseeuu pprreessiiddeennttee,, nnoo uussoo
ddaass ssuuaass aattrriibbuuiiççõõeess,, rreessoollvvee AAPPRROOVVAARR aa uuttiilliizzaaççããoo ddee aanniimmaaiiss ddee
eexxppeerriimmeennttaaççããoo nnaass aattiivviiddaaddeess ddoo pprroojjeettoo eemm qquueessttããoo,, nnoo ppeerrííooddoo ddee
vviiggêênncciiaa eessttaabbeelleecciiddoo.. AAss aattiivviiddaaddeess eexxppeerriimmeennttaaiiss ffoorraa ddeessttee ppeerrííooddoo
ddeevveemm rreecceebbeerr nnoovvaa aauuttoorriizzaaççããoo ddeessttee ccoommiittêê.. AAoo CCEEPPAAEE éé ffaaccuullttaaddoo oo
ddiirreeiittoo ddee vveerriiffiiccaarr iinn llooccoo aa ccoorrrreettaa aapplliiccaaççããoo ddoo pprroottooccoolloo aapprroovvaaddoo..
PPrrooff.. DDrr.. AAnnttôônniioo PPeerreeiirraa
PPrreessiiddeennttee ddoo CCEEPPAAEE//UUFFPPAA