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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
CONSTRUÇÃO DO MINIGENOMA DO VÍRUS OROPOUCHE (BUNYAVIRIDAE: ORTHOBUNYAVIRUS)
DAISY ELAINE ANDRADE DA SILVA
Belém-Pará 2013
DAISY ELAINE ANDRADE DA SILVA
CONSTRUÇÃO DO MINIGENOMA DO VÍRUS OROPOUCHE (BUNYAVIRIDAE: ORTHOBUNYAVIRUS)
Belém-Pará 2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutora em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes
DAISY ELAINE ANDRADE DA SILVA
CONSTRUÇÃO DO MINIGENOMA DO VÍRUS OROPOUCHE (BUNYAVIRIDAE: ORTHOBUNYAVIRUS) Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes Banca Examinadora: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos
Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas-IEC
Profª. Drª. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas-IEC
Profª. Drª. Sueli Guerreiro Rodrigues Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas-IEC
Profª. Drª. Jeannie Nascimento dos Santos Laboratório de Biologia Celular e Helmitologia, ICB-UFPA Drª. Jannifer Oliveira Chiang (suplente) Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas-IEC
Belém, 13 de maio de 2013
“Knowledge is the pathway from slavery to freedom” Frederick Douglass, escritor.
Aos meus pais, pelo exemplo, incentivo, carinho e amor.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por ter-me iluminado ao longo dessa jornada;
Ao Prof° Dr. Márcio Nunes, pelos ensinamentos a mim repassados;
Ao Dr. Richard Elliott da University of Glasgow, por ter me aceitado como co-
orientanda e ter contribuído com novos conhecimentos científicos para realização
desse trabalho;
Aos meus amigos e colegas da Escócia Agnieszka, Angela, Basma, Ben,
Elina, Gillian, Gjon, Ing, Jill, Ping, Sophie, Steve and Xiaohong pela ajuda,
solidariedade, colaboração na troca de conhecimentos, experiências, conselhos e
pelo suplemento de sobremesas. Saudades do “tea time” e do “pub time”.
Agradecimento extra para Sophie: “Merci, Frenchie!”;
A todos da University of St. Andrews, Escócia, que me ajudaram nessa
caminhada;
Aos meus amigos e colegas de trabalho: Clayton, Janaína, Layanna, Sandro,
Keley, Jedson, Davi, Edivaldo, João, João, Cleise, Edna pelo carinho e ajuda nessa
caminhada importante na minha vida. Muito Obrigada;
Ao Dr. Pedro Vasconcelos da Seção de Arbovirologia do IEC e aos amigos e
colegas dessa seção. Obrigada a todos por sempre estarem dispostos a me ajudar.
A CAPES, pelo suporte científico e financeiro através da bolsa de Doutorado
Sanduíche no Exterior;
Ao Instituto Evandro Chagas;
A Universidade Federal do Pará;
A todos os meus amigos que me ajudaram nessa jornada;
Ao Edvaldo Penha por estar sempre comigo em todos os momentos.
Obrigada por tudo;
Aos meus familiares: meu pai Silva e minha mãe Regina, ao meu irmão Túlio
e aos meus tios, tias, primos, avós que torceram por mim;
A meu irmão Túlio. Amo-te.
Agradeço especialmente aos meus pais por tudo que fizeram e fazem por
mim. As dificuldades passadas para que eu pudesse ter o melhor. O melhor eu tive e
sempre terei, pois sempre estarão na minha alma, Regina e Silva. Amo vocês.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................ 11 LISTA DE QUADROS .......................................................................................................................... 13 RESUMO.............................................................................................................................................. 14 ABSTRACT .......................................................................................................................................... 15 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 16
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARBOVÍRUS ................................................................. 16
1.2. FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE ......................................................................................................... 18
1.2.1. Estrutura dos vírus da Família Bunyaviridae ................................................................. 20
1.2.2. Organização Genômica e Estratégia de Codificação ..................................................... 20
1.2.2.2. Estratégia de Codificação ............................................................................................. 22
1.2.2.3. Estratégia de Codificação para o Segmento L ............................................................. 23
1.2.2.4. Estratégia de Codificação para o Segmento M ............................................................ 24
1.2.2.5. Estratégia de Codificação para o Segmento S ............................................................. 26
1.2.3. Ciclo Replicativo dos vírus da Família Bunyaviridae..................................................... 28
1.3. GÊNERO ORTHOBUNYAVIRUS .............................................................................................. 30
1.4. VÍRUS OROPOUCHE ............................................................................................................... 32
1.4.1 Ciclo de Transmissão ........................................................................................................ 33
1.4.2 Manifestações Clínicas ...................................................................................................... 34
1.4.3 Epidemiologia ..................................................................................................................... 35
1.4.4. Diagnóstico Laboratorial .................................................................................................. 36
1.4.5 Organização Genômica ..................................................................................................... 37
1.5. GENÉTICA REVERSA .............................................................................................................. 37
1.5.1. Genética Reversa de vírus de filamento negativo .......................................................... 38
1.5.2. Genética Reversa dos Bunyavírus e suas aplicações ................................................... 42
1.5.2.1. Sistema de Minireplicon ou Minigenoma ...................................................................... 42
1.5.2.2. “Virus Like Particle” (VLP) ............................................................................................ 43
1.5.2.3. Sistema de Recuperação ............................................................................................. 44
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 46
2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................... 46
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 46
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................... 47
3.1. CULTIVO CELULAR E PROPAGAÇÃO DO VÍRUS .................................................................. 47
3.1.1. Cultivos de células BSR-T7/5 ........................................................................................... 47
3.1.2. Preparação de Estoque Viral ............................................................................................ 47
3.1.3. Infecção viral ....................................................................................................................... 48
3.2. IMUNOFLUORESCÊNCIA ........................................................................................................ 48
3.3. DNA PLASMIDIAL ..................................................................................................................... 49
3.3.1. Plasmídeos Usados no Estudo ........................................................................................ 49
3.3.2. Amplificação do DNA Plasmidial ..................................................................................... 51
3.3.3. Preparação de Bactérias Competentes ........................................................................... 51
3.3.4. Transformação das Bactérias Competentes E.Coli ....................................................... 51
3.3.5. Preparação do DNA Plasmidial ........................................................................................ 51
3.3.6. Determinação da Concentração do DNA ......................................................................... 52
3.4. MANIPULAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL .................................................................................... 52
3.4.1. Oligonucleotídeos sintéticos ........................................................................................... 52
3.4.2. Subclonagem do DNA Plasmidial do VORO ................................................................... 54
3.4.3. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR) ...................................................... 56
3.4.4. Mutagênese Sítio Específica ............................................................................................ 57
3.4.5. Adição de Desoxiadenosina (DATP) no Produto de PCR e Clonagem T/A .................. 58
3.4.6. Digestão do DNA com Enzimas de Restrições ............................................................... 59
3.4.7. Eletroforese em Gel De Agarose...................................................................................... 59
3.4.8. Purificação do DNA em Gel de Agarose ......................................................................... 60
3.4.9. Desfosforilação do Plasmídeo Linearizado .................................................................... 60
3.4.10. Ligação dos Fragmentos de DNA .................................................................................. 60
3.5. INDUÇÃO DA FORMAÇÃO SINCICIAL EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM GLICOPROTEÍNAS DO VORO POR MUDANÇA DE PH. ................................................................................................ 61
3.6. TRANSFECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO MEDIADA POR LIPOSSOMO.................................. 61
3.7. TESTE DE LUCIFERASE .......................................................................................................... 61
3.8. TESTE DE MINIREPLICON ...................................................................................................... 62
3.9. SEQUENCIAMENTO ................................................................................................................. 62
3.10. EXTRAÇÃO DE RNA DE CULTIVOS CELULARES................................................................ 63
3.11. PREPARAÇÃO DO cDNA ....................................................................................................... 63
3.12. TRANSCRIÇÃO DO RNA IN VITRO ....................................................................................... 64
4. RESULTADOS ................................................................................................................................. 66
4.1. ESTRATÉGIA DE CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO CONTENDO OS GENES L, M E S DO VORO............................................................................................................. 66
4.1.1. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene L ....................................... 66
4.1.2. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene M ...................................... 68
4.1.3. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene N e NSs ........................... 70
4.1.4. Construção do plasmídeo de expressão contendo apenas o gene N ......................... 72
4.1.5. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene NSs .................................. 75
4.2. CONSTRUÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO ...................................................................... 78
4.3. RECONSTITUIÇÃO IN VIVO DE RIBONUCLEOPROTEÍNAS RECOMBINANTES ................. 79
4.4. COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE DO GENE REPÓRTER ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIREPLICON DO VORO ........................................................................................................ 80
4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA NUCLEOPROTEÍNA N DO VORO ............................................................................................................................................... 82
4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA POLIMERASE VIRAL L E COMPARAÇÃO DE DOIS DIFERENTES PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA N DO VORO ............................................................................................................................................... 87
4.6. COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIGENOMA APÓS CO-TRANSFECÇÃO COM NOVOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS N E L DO VORO ............................................................................................................................................... 89
4.7. ANÁLISE DA ATIVIDADE DA REGIÃO CODIFICANTE DO SEGMENTO M DO VORO .......... 96
4.7.1. Atividade de distintos plasmídeos de expressão do segmento M no sistema de minireplicon do VORO ................................................................................................................ 96
4.7.2. Titulação da quantidade do plasmídeo de expressão do segmento M co-tranfectado com o sistema de minigenoma do VORO ................................................................................. 98
4.8. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO .............................................................................................................. 99
4.9. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS DO VORO POR IMUNOMARCAÇÃO ..................................... 103
4.10. ANÁLISE DA TRANSFECÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO COM O MINIGENOMA DO VBUN .............................................................................................................................................. 105
4.11. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs DO VBUN NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO E DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs DO VORO NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VBUN ................................................................................ 108
5. DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 110
6. CONCLUSÃO ................................................................................................................................ 123
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 124
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Distribuição geográfica dos principais vírus da família Bunyaviridae e doença associada .. 19
Figura 2- Representação do vírion do bunyavírus em seção transversal ............................................ 21
Figura 3- Estratégia de replicação dos segmentos dos genomas dos vírus da família Bunyaviridae.. 23
Figura 4- Estratégia de replicação dos bunyavírus. ............................................................................. 30
Figura 5- Desenho esquemático do ciclo de transmissão do VORO. .................................................. 34
Figura 6- Organização genômica do vírus Oropouche. ....................................................................... 37
Figura 7- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol.
............................................................................................................................................................. 55
Figura 8- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol. ............................................................................................................................................................. 65
Figura 9- Amplificação do gene L do VORO por PCR de alta fidelidade. ............................................ 66
Figura 10- Análise dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. ...................................... 67
Figura 11- Amplificação do gene M do VORO por PCR de alta fidelidade. ......................................... 68
Figura 12- Análise dos plasmídeos de expressão pela incubação com enzimas de restrição ............ 69
Figura 13- Amplificação do gene S do VORO por PCR de alta fidelidade. ......................................... 70
Figura 14- Screening dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. ................................. 71
Figura 15- Construção do plasmídeo de expressão da nucleoproteína N do VORO-pTM1-OROV-N . 72
Figura 16- Amplificação do gene N do VORO por PCR de alta fidelidade. ......................................... 73
Figura 17- Screening dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição.. ..... 74
Figura 18- Construção do plasmídeo de expressão da proteína não estrutural NSs do VORO-pTM1-
OROV-NSs.. ......................................................................................................................................... 75
Figura 19- Amplificação do gene NSs do VORO por PCR de alta fidelidade.. .................................... 76
Figura 20- Busca dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição.. ........... 77
Figura 21- Geração do minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla. ............................................................ 78
Figura 22- Esquema e função do sistema de minireplicon do VORO. ................................................. 79
Figura 23- Comparação da atividade do gene repórter entre dois sistemas de minireplicon distintos 81
Figura 24- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína N .................................... 83
Figura 25- Alinhamento das sequências da região codificante do gene da nucleoproteína N. ........... 84
Figura 26- Continuação da representação do alinhamento das sequências da região codificante do
gene da nucleoproteína N. ................................................................................................................... 85
Figura 27- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína N do VORO. .................................... 86
Figura 28- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína L. .................................... 88
Figura 29- Análise da atividade de diferentes sistemas de minigenoma do VORO............................. 90
Figura 30 a-b- Alinhamento das sequências da região não codificante do terminal 3’ do segmento M do VORO.. ............................................................................................................................................ 91
Figura 31- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA
do VORO. ............................................................................................................................................. 93
Figura 32- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. ............................................................................................................................................. 94
Figura 33- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA
do VORO. ............................................................................................................................................. 95
Figura 34- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-M-1 a 8 obtidos das colônias selecionadas ........................ 97
Figura 35- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando
diluições seriadas do plasmídeo pTM1-OROV-M eleito pelo estudo ................................................... 98
Figura 36- Análise da atividade da região codificante do segmento S do VORO. ............................. 100
Figura 37- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-NSs-1 a 8 obtidos das colônias selecionadas. .................. 101
Figura 38- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando as
diluições seriadas do plasmídeo pTM1-OROV-NSs eleito pelo estudo . ............................................ 102
Figura 39 a-d- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. ................................................................................................. 103
Figura 40 a-c- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão
construídos neste estudo. .................................................................................................................. 104
Figura 41- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. ................... 106
Figura 42- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. ................... 107
Figura 43- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína não estrutural NSs do VORO.. ...... 108
Figura 44- Efeitos da proteína não estrutural NSs.. ........................................................................... 109
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Alguns dos membros mais conhecidos da família Bunyaviridae ........................................ 19
Quadro 2- Sistemas de recuperação para vírus de RNA segmentado de filamento negativo ............. 41
Quadro 3- Descrição dos plasmídeos utilizados e construídos para a realização do estudo em
genética reversa do VORO .................................................................................................................. 49
Quadro 4- Oligonucleotídeos utilizados para construção do minireplicon do VORO ........................... 52
Quadro 5- Oligonucleotídeos desenhados para amplificação dos genes dos segmentos S, M e L. ... 54
Quadro 6- Reação padrão para o kit KOD hot start polymerase ........................................................ 56
Quadro 7- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR ............................................................. 56
Quadro 8- Reação padrão para o kit GoTaq DNA polymerase ........................................................... 57
Quadro 9- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR ............................................................. 57
Quadro 10- Reação padrão para realização da mutação sítio-específica: .......................................... 58
Quadro 11- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR para realização da mutação sítio-específica: ............................................................................................................................................ 58
Quadro 12- Reação de adição de desoxiadenosina ............................................................................ 59
Quadro 13- Diferenças nucleotídicas na sequência dos plasmídeos pTM1-OROV-N e pTM1-OROV-N
(A) ........................................................................................................................................................ 92
14
RESUMO
O desenvolvimento de sistemas de genética reversa para vírus de RNA de filamento
negativo é um campo de pesquisa em constante crescimento e que vem
proporcionando avanços nos estudos de diferentes aspectos do ciclo de vida dos
vírus. O vírus Oropouche (VORO), família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, é
um agente infeccioso emergente que tem causado numerosas epidemias de “febre
do Oropouche” no Brasil, Peru e Panamá. A “febre do Oropouche” constitui uma das
arboviroses de maior importância em saúde pública na região Amazônica. No
presente estudo, descrevemos o primeiro sistema de minigenoma para esse
orthobunyavírus, como também os obstáculos que ainda existem para o
desenvolvimento de tal sistema. Cinco plasmídeos suportes foram construídos que
expressavam os genes das proteínas L, N, NSs e M do VORO inseridos no
plasmídeo de expressão pTM1, além dos plasmídeos suportes que expressavam as
proteínas L e N doados pelo Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha. A
estrutura do minigenoma do VORO consistia nas regiões dos terminais 3’ e 5’ do
gene do segmento M flanqueado pelo gene repórter codificante da proteína Renilla
Luciferase e foi construído para analisar a eficácia dos quatro plasmídeos suportes,
pTM1-OROV-L, pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-S e pTM1-OROV-M, na replicação e
transcrição do genoma viral. Após co-transfecção das células BSR-T7/5 com os
plasmídeos suportes e o plasmídeo do minigenoma, a replicação do RNA do
minireplicon foi avaliada pela determinação da atividade da luciferase. No sistema de
minigenoma, a expressão do gene repórter foi detectada. Para elucidar a função da
proteína não estrutural NSs do VORO, construiu-se o plasmídeo pTM1-OROV-NSs.
A co-expressão da proteína NSs levou a diminuição da atividade da proteína
repórter sem afetar a expressão do sistema controle. A proteína NSs de outro
membro da família Bunyaviridae, vírus Bunyamwera (VBUN), também inibiu a
atividade da Renilla no nosso sistema de minireplicon do VORO, ou seja, a proteína
não estrutural NSs dos bunyavírus controla a atividade da polimerase viral por um
mecanismo altamente conservado. Os resultados indicam que os plasmídeos
suportes foram expressos e formam um complexo funcional de ribonucleoproteínas
que direciona efetivamente a transcrição do RNA do minigenoma do VORO.
15
ABSTRACT
The development of reverse genetics systems for negative-stranded RNA viruses is a
rapidly evolving field that has greatly advanced the study of the many different
aspects of the viral life cycle. Oropouche virus (OROV), family Bunyaviridae, genus
Orthobunyavirus, is an emergent infections agent which caused numerous epidemics
of “Oropouche fever” in Brasil, Peru and Panamá. Oropouche fever is one of the
arboviroses of major importance in health public of the Amazon region. Here, we
describe the first successful minigenome system for OROV, as well as many of the
obstacles that still exist in the development of such a system. We constructed five
helper plasmids expressing the L, N, NSs and M genes of OROV inserted on the
expression plasmid pTM1, in addition to the helper plasmids expression the L and N
donated by Dr. Manfred, Gottigen University, Germany. The minigenome consisting
of the 3’ trailer leader and 5’ trailer regions of the M segment of the OROV flanking a
reporter gene encoding Renilla Luciferase was constructed to examine the efficacy of
the four helper plasmids, pTM1-OROV-L, pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-S, pTM1-
OROV-M, in viral genome replication and transcription. After co-transfection of BSR-
T7/5 cells with the helper plasmids and the minigenome plasmid, replication of
minigenome RNA was evaluated by determining luciferase activity. In the
minigenome system, expression of the reporter gene was detected. In order to
elucidate the function of the non-structural protein of OROV, NSs, we constructed the
helper plasmid, pTM1-OROV-NSs. The co-expression of NSs led to a decrease in
reporter activity without affecting expression of controls. The NSs protein of other
member of the Bunyaviridae family, Bunyamwera virus (BUNV), was also inhibitory in
our system, in other words, thus, the bunyavirus NSs protein controls the activity of
the viral polymerase by a highly conserved mechanism. Our results indicate that the
helper plasmids were expressed ad can assemble into a functional ribonucleoprotein
complex that effectively directs the transcription of minigenome RNA.
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARBOVÍRUS
Os arbovírus são vírus ecologicamente distintos mantidos em natureza
mediante ciclo biológico envolvendo, em geral, hospedeiros vertebrados primários
não humanos e vetor artrópode primário (Gubler, 1996). Os vetores artrópodes de
maior relevância para as arboviroses são os mosquitos (ex: Aedes), maruins (ex;
Culicoides), moscas (ex: Phlebotominae) e carrapatos (ex: Ixodidae), pequenos
marsupiais e aves são considerados os hospedeiros vertebrados de maior
importância para o ciclo de manutenção dos arbovírus (Gubler, 1996; Mellor, 2000).
A transmissão biológica dos arbovírus pode ser vertical e envolve a
transmissão do vírus do vetor fêmea para ambos os descendentes, macho e fêmea.
Já a transmissão horizontal pode ser venérea, de um macho infectado através da
transmissão vertical para o vetor fêmea, como também, a transmissão pode ser oral
de um vetor para um hospedeiro vertebrado através da saliva durante o repasto. O
último tipo de transmissão horizontal é o mais comum para a maioria dos arbovírus e
envolve a infecção do trato alimentar do vetor imediatamente após o repasto,
disseminação do vírus no vetor e eventual replicação viral no intestino. Após
replicação, os vírus são regurgitados (Weaver & Reisen, 2010).
Os arbovírus têm uma distribuição mundial, porém, a maioria é encontrada
em regiões tropicais, certamente por oferecerem fatores ecológicos mais favoráveis,
tais como: temperatura, padrões de chuva, e abundância de vetores artrópodes e
hospedeiros vertebrados (Karabatsos, 1985; Travassos da Rosa et al., 1997).
Os arbovírus são agentes infecciosos emergentes e re-emergentes, dentre os
quais, os vírus Chikungunya (VCHK), vírus Dengue (VDEN), vírus da Febre Amarela
(VFA), vírus do Oeste do Nilo (VNO) e vírus Oropouche (VORO) constituem
exemplos desses agentes virais. Apesar de não serem completamente conhecidos,
vários fatores são responsáveis pela re-emergência desses vírus, como, distúrbios
ambientais oriundos de atividades antropogênicas (Vasconcelos et al., 2001),
mudanças climáticas que afetam a distribuição das populações dos vetores e
hospedeiros (Weaver & Reisen, 2010), migração de humanos via transporte aéreo,
17
migração e comércio de animais (Pfeffer & Dobler, 2010) e mutações virais (Weaver
& Barrett, 2004; Kuno & Chang, 2005).
As principais manifestações clínicas causadas por arbovírus em humanos
são: (1) doença febril, uma das mais comuns; (2) doença febril exantemática,
inicialmente, caracterizada por febre elevada, cefaléia intensa, mialgias e artralgias,
depois, o exantema (manifestação clínica na pele); (3) febre hemorrágica e (4)
encefalites, causadas por diferentes arbovírus pertencentes às famílias Togaviridae,
Flaviviridae e Bunyaviridae, e geralmente associadas a elevada taxa de letalidade
(Travassos da Rosa et al, 1997).
O grupo dos arbovírus está incluído em cinco famílias: Togaviridae,
Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae e Rhabdoviridae (Travassos da Rosa et al.,
1997). Os vírus dessas famílias são predominantemente vírus de ácido ribonucléico
(RNA), segmentado ou não, com fita simples ou dupla, no entanto, um único gênero
da família Orthomyxoviridae, vírus Thogoto, e um único vírus de ácido
desoxirribonucleico (DNA) da família Asfarviridae, vírus da Febre Suína Africana,
também são considerados arbovírus (Calisher & Karabatsos, 1988; Karabatsos,
1985; van Regenmortel et al., 2000). O fato dos arbovírus serem quase
exclusivamente vírus de RNA pode ser explicado pela necessidade de uma
significante plasticidade genética e taxas de mutações altas com o objetivo de
sobreviver em ambientes dinâmicos (Weaver, 2006). A taxa de erro da ação da RNA
polimerase dependente de RNA (RdRp) está estimada entre 10-3
a 10-5
erros/nucleotídeos/ciclos de replicação (Drake & Holland, 1999). Este fato em
conjunto com os rápidos níveis de replicação viral, permite a ligeira distribuição
geográfica e produção de variantes virais que pode ter uma vantagem na
sobrevivência do vírus em diferentes tipos de hospedeiros (Ciota & Kramer, 2010).
Com exceção da família Reoviridae, as demais famílias incluem vírus
associados a doenças em humanos, como por exemplo, o vírus Mayaro e vírus
Mucambo (família Togaviridae), VFA e VDEN (família Flaviviridae) e o VORO
(família Bunyaviridae) (Travassos da Rosa et al., 1997; Travassos da Rosa et al.,
1998).
18
1.2. FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE
A família Bunyaviridae contém mais de 350 membros distribuídos
mundialmente (a exceção do continente Antártico) (Fig. 1) e a maioria destes é
transmitida por artrópodes com exceção dos hantavírus que são transmitidos pelo
aerossol das excretas de roedores contaminados com esses vírus. Esta família foi
reconhecida pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral em 1975, tendo sido
nomeada de acordo com o vírus Bunyamwera (VBUN), o protótipo da família
(Fauquet et al., 2005). Este vírus foi isolado originalmente a partir de um lote de
mosquitos do gênero Aedes na floresta de Semliki, situada em Uganda, África, em
1943 (Smithburn et al., 1946).
As principais características morfológicas e bioquímicas que incluem um vírus
nesta família são: (1) os vírions são envelopados com partículas esféricas entre 80-
120 nm de diâmetro contendo RNA de filamento simples de sentido negativo ou
ambisenso e tri-segmentado; (2) a replicação é restrita ao citoplasma; (3) e a
montagem da partícula viral ocorre no Complexo de Golgi que leva a formação de
uma bicamada lipídica que incorpora as duas glicoproteínas virais (Schmaljohn &
Nichol, 2007).
A família Bunyaviridae é constituída por cinco gêneros: Orthobunyavirus,
Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus (Travassos da Rosa et al., 1997).
As orthobunyaviroses, phleboviroses, nairoviroses e tospoviroses são transmitidas
principalmente por mosquitos, phlebotomíneos, maruins e piolho de milho. Os vírus
desta família infectam vertebrados com exceção das tospoviroses que infectam
plantas (Fauquet et al., 2005). Vários membros dessa família, incluindo os vírus La
Crosse (VLAC), vírus Hantaan (VHTN), vírus da Febre do Rift Valley (VFRV), vírus
da Febre Hemorrágica do Crimean-Congo (VFHCC) e VORO, causam febre,
meningite asséptica, encefalite ou febre hemorrágica em humanos (Elliott, 1997;
Pinheiro et al., 1997) (Quadro 1), dessa forma, os bunyavírus são conhecidos como
sério problema de saúde pública e alguns membros (Ex: VFRV e VFHCC) são
considerados como potenciais agentes para ataques de bioterrorismo (Elliott, 1997).
Os vírus da família Bunyaviridae também possuem importância econômica, pois
podem comprometer a pecuária na África e Ásia (Ex: VFRV e VFHCC), e culturas
agrícolas pelo mundo (algumas tospoviroses).
19
Quadro 1- Alguns dos membros mais conhecidos da família Bunyaviridae
Gênero/Vírus Hospedeiro: Doença Vetor Distribuição
Orthobunyavirus
vírus Akabane Gado: Aborto e Defeitos congênitos
Mosquito África, Ásia, Austrália
vírus La Crosse Humanos: febre Mosquito América do Norte
vírus Oropouche Humanos: doença febril Mosquito América do Sul
Phlebovirus
vírus da Febre do Rift Valley Humanos: encefalite, febre hemorrágica. Ruminantes: aborto, hemorragia, hepatite necrótica.
Mosquito África
Nairovirus
vírus da Febre do Crimean Congo
Humano: febre hemorrágica, fatalidade de 20-80%.
Carrapato África, Leste Europeu, Ásia
Hantavirus
vírus Hantaan Humano: severa febre hemorrágica com síndrome renal, 5-15% de fatalidade.
Camundongo do campo
Leste Europeu
vírus Puumala Humano: branda febre hemorrágica com síndrome renal, 0,1% de fatalidade.
Rato Oeste Europeu
vírus Sin Nombre Humano: síndrome pulmonar, 40% de fatalidade.
Camundongo América do Norte
Tospovirus
vírus do Tomateiro > 650 espécies de plantas Insetos Escala mundial
Encefalite-
La Crosse
Febre do Oropouche
Febre do Rift Valley
Crimean-Congo
Crimean-Congo
HFRS: Febre hemorrágica com síndrome renal HPS: Síndrome pulmonar por hantavírus SFTS: Síndrome por trombocitopenia com febre severa
Febre e erupção na pele
Outros
Encefalite
FHV
Figura 1- Distribuição geográfica dos principais vírus da família Bunyaviridae e doença associada. HFRS= Febre Hemorrágica com síndrome febril. HPS=Síndrome pulmonar hantavírus. SFTS= Febre servera com síndrome trombocitopenia. FHV= Febre Hemorrágica Viral. (Meltzer, 2012)
20
1.2.1. Estrutura dos vírus da família Bunyaviridae
As partículas dos bunyavírus contêm projeções em suas superfícies,
denominadas glicoproteínas com tamanhos entre 5 a 10 nm que são revestidas por
uma bicamada lipídica de 5 a 7 nm de espessura (Schmaljohn & Nichol, 2007).
As projeções, visualizadas no exterior da partícula, são em maioria formadas
por duas glicoproteínas. O padrão de organização dessas glicoproteínas é diferente
dentro dos bunyavírus. Os vírions do gênero Orthobunyavirus apresentam pequenas
estruturas desorganizadas. A falta de organização também é observada nos vírions
dos gêneros Nairovirus e Tospovirus. As projeções nas estruturas dos vírions do
gênero Hantavirus contêm quatro heterodimêros organizadas na forma de grade,
mas sem formar um padrão distinto (Huiskonen et al., 2010). Um padrão organizado
na distribuição das glicoproteínas foi demonstrado apenas para vírions do gênero
Phlebovirus. As glicoproteínas formam unidades de pacotes redondos organizados
em uma simetria icosaédrica (Fig. 2) (Freiberg et al., 2008; Huiskonen et al., 2009).
1.2.2. Organização Genômica e Estratégia de Codificação
1.2.2.1. Estrutura do Genoma Viral
O genoma dos bunyavírus é composto por RNA (ácido ribonucléico) tri-
segmentado (L [Large-Grande], M [Medium-Médio] e S [Small-Pequeno],
denominados de acordo com o tamanho de nucleotídeos), fita simples e de
polaridade negativa (Elliott, 1990, 1997).
O tamanho de cada segmento varia entre os gêneros dessa família. O
segmento L dos orthobunyavírus, hantavírus e phlebovírus é de aproximadamente
6,5 kb, sendo que para os tospovírus e nairovírus o tamanho do segmento L está em
torno de 8,9 e 12,2 kb, respectivamente. Em relação ao segmento M, o menor
tamanho observado foi para os hantavírus, 3,6 kb e o maior 4,8 kb para os
tospovírus. Para o menor segmento, S, foi observado um tamanho de 1 kb nos
orthobunyavírus, enquanto que para os segmentos S dos hantavírus, nairovírus e
phlebovírus, o tamanho encontra-se na faixa de 1,7kb e para os tospovírus, 2,9 kb
(Elliott & Blakqori, 2011).
21
As regiões codificantes são flaqueadas por regiões não codificantes (RNC)
em que os tamanhos e as sequências variam entre os gêneros, mas em geral, a
RNC do terminal 3’ é menor que a RNC do terminal 5’. Os nucleotídeos nas
posições finais de ambos terminas 3’ e 5’ das RNC são conservados nos três
segmentos para os vírus do mesmo gênero. As sequências dessas regiões
conservadas são complementares e resultam em um pareamento de base
complementar e não-covalente das extremidades formando uma estrutura em forma
de “laço” (Obijeski et al., 1976; Hewlett et al., 1977).
Cada complexo do segmento do genoma viral em conjunto com numerosas
cópias de proteínas de nucleocapsídeos (N) e poucas cópias de RdRp formam
complexos individuais chamados complexo ribonucleoprotéico. Pelo menos um de
cada três nucleocapsídeos dos segmentos L, M e S devem ser empacotados em
uma partícula viral para conferir infectividade ao vírion (Fig. 2) (Elliott, 2005).
Gn & Gc
Carboidratos
Polimerase viral L
Envelope lipídico
Ribonucleocapsídeos
Figura 2- Representação do vírion da família Bunyaviridade em seção transversal. A
superfície contém duas glicoprotéinas, Gn e Gc. Os três nucleocapsídeos helicoidais são circulares e contém cada um único segmento de RNA (L, M e S). Fonte:
Whitehouse, 2004, com modificações.
22
1.2.2.2. Estratégia de Codificação
Todos os bunyavírus codificam quatro proteínas estruturais: a RdRp
codificada do segmento L, as glicoproteínas do envelope viral, Gn e Gc, codificadas
do segmento M e a proteína do nucleocapsídeo codificada a partir do segmento S.
Alguns vírus dos gêneros Orthobunyavirus, Phlebovirus e Tospovirus também
codificam duas proteínas não estruturais, NSm e NSs, advindas dos segmentos M e
S, respectivamente, enquanto que alguns hantavírus codificam apenas a proteína
não estrutural, NSs (Jääskeläinen et al., 2007; Vera-Otarola et al., 2011).
O segmento L dos vírus de todos os gêneros da família Bunyaviridae
codificam a proteína L no sentido negativo o qual é a RdRp. Até agora não há
evidências de qualquer outra região codificante presente em RNA genômico ou
antigenômico (Fig. 3) (Schmaljohn & Nichol, 2007).
O segmento M codifica as duas glicoproteínas, Gn e Gc, no sentido negativo.
Quando presente, a proteína não estrutural, NSm, é codificada em sentido negativo,
com exceção dos tospovírus que codificam a proteína NSm no sentido ambisenso.
Não há evidências da presença de uma região codificante para a proteína não
estrutural NSm em vírus do gênero Hantavirus (Schmaljohn & Nichol, 2007). No caso
dos phlebovírus, a proteína NSm está presente em mosquitos infectados com VFRV,
mas ausente no vírus Uukuniemi (VUUK). A proteína NSm foi recentemente relatada
para o nairovírus, VFHCC (Fig. 3) (Altamura et al., 2007).
Os segmentos S dos nairovírus, alguns hantavírus e orthobunyavírus dentro
dos sorogrupos Tete e Anopheles A e B codificam apenas a proteína N no sentido
negativo, enquanto que vírus dentro do gênero Phlebovirus, Tospovirus e alguns
Orthobunyavirus também codificam a proteína não estrutural NSs. Os
orthobunyavírus e hantavírus codificam suas proteínas não estruturais, em uma
região de leitura sobreposta em sentido negativo, mas os phlebovírus e tospovírus
utilizam uma estratégia ambisensa e codificam suas proteínas não estruturais no
sentido positivo do RNA (Fig. 3) (Schmaljohn & Nichol, 2007).
23
1.2.2.3. Estratégia de Codificação para o Segmento L
As proteínas RdRp da família Bunyaviridae são codificados em sentido
negativo e seus tamanhos variam entre 238 kDa para phlebovírus a 460 kDa para
tospovírus. Pouca homologia é observada entre proteínas L de vírus pertencentes a
gêneros diferentes, mas alinhamentos de sequências aminoacídicas do segmento L
revelou a presença de motivos conservados entre gêneros (Aquino et al., 2003; Jin &
Elliott, 1991; Müller et al., 1994; Reguera et al., 2010).
Quatro domínios, identificados como “módulo polimerase” (Poch et al., 1989)
estão presentes dentro da RdRp e foram denominados motivos de A a D. Dois
motivos adicionais foram descritos para as polimerases dos bunyavírus e arenavírus.
Um precedia o motivo A foi denominado pré-motivo A e o outro sucedia o motivo D
foi denominado motivo E (Müller et al., 1994). Os diferentes módulos de polimerase
estão localizados aproximadamente ao meio das polimerases dos bunyavírus e seu
papel principal, a atividade da polimerase, foi demonstrado por mutagênese de
aminoácidos conservados dentro desses motivos (Jin & Elliott, 1992).
Jin et al, (1991; 1993), trabalhando com o vírus da Vaccinia Recombinante
que expressava a proteína L do VBUN demonstrou que a proteína L foi capaz de
Segmento S Segmento M Segmento L
Figura 3- Estratégia de replicação dos segmentos dos genomas dos vírus da família Bunyaviridae. Virus Taxonomy, 2012, com algumas modificações.
24
realizar tanto as atividades de transcriptase quanto de replicase, dessa forma,
produzindo ambas espécies de genomas e antigenomas de ribonucleoproteínas
transfectadas (Jin & Elliott, 1991; 1993).
Jin & Elliott, 1993, demonstraram que a síntese de RNA de sentido positivo
por proteínas L recombinantes continha sequências derivadas das células e do
hospedeiro. Assim como os orthomyxovírus, as polimerases dos bunyavírus utilizam
o mecanismo “cap snatching” para sintetizar seus RNAm (RNA mensageiro) (Dias et
al., 2009).
A localização da proteína L em células infectadas foi extensamente estudada
para o VTUL utilizando-se a fusão da proteína verde fluorescente (green
fluorescente protein-GFP) e para o VBUN e VFRV usando-se a técnica de
introdução de epítopos V5 na região do terminal C de cada proteína (Brennan et al.,
2011a; Kukkonen et al., 2004; Shi & Elliott, 2009). Em ambos os estudos, as
proteínas L foram localizadas no citoplasma das células e formavam um padrão
pontual na periferia do núcleo. Este padrão sugere que há associação com a
estrutura da membrana intracelular.
1.2.2.4. Estratégia de Codificação para o Segmento M
O segmento M tem como função sintetizar duas glicoproteínas do envelope
viral. No passado, as glicoproteínas eram denominadas, G1 e G2, de acordo com o
seus perfis de migração em gel SDS-PAGE, no entanto, ao notar-se que as funções
das glicoproteínas em diferentes gêneros estavam mais relacionadas às suas
posições dentro do segmento do que com os seus tamanhos, as gliocoproteínas
foram renomeadas como Gn e Gc (Lappin et al., 1994).
As duas glicoproteínas são traduzidas como um precursor de poliproteína e
seus nomes, Gn e Gc, refletem suas posições dentro desses precursores tanto nos
terminais amino quanto carboxi. Pouco se sabe sobre a clivagem do precursor de
poliproteína, mas sugere-se que a clivagem ocorra em co-tradução, pois não há
evidências da presença de uma proteína com tamanho total em células infectadas
(Fazakerley et al., 1988). O mecanismo de clivagem é desconhecido para a maioria
dos bunyavírus, mas para ambas as glicoproteínas foi descoberto que o mecanismo
de clivagem é precedente por sinais de sequências que poderiam resultar em
25
clivagem por signalase da célula hospedeira (Fazakerley et al., 1988). Para o vírus
Hantaan (VHTN), o motivo pentapeptídico, WAASA, precedente da proteína Gc foi
identificado como sítio de clivagem (Löber et al.,2001).
Após clivagem, os tamanhos das glicoproteínas variam entre 37 a 72 kDa,
exceto para os vírus do gênero Orthobunyavirus que apresentam tamanhos entre as
glicoproteínas claramente diferentes, com a proteína Gn apresentando um tamanho
de 32 kDa e a proteína Gc apresentando um tamanho de aproximadamente de 110
kDa (Persson & Pettersson, 1991; Shi et al., 2005; Shi & Elliott, 2004).
As glicoproteínas dos bunyavírus são proteínas de membrana classe I o que
significa que seus terminais amino são expostos na superfície do vírion. As proteínas
Gn e Gc de todos os bunyavírus são glicosiladas com resíduos asparagino. Além
disso, o conteúdo de cisteína alcança uma porcentagem de 5%. Ambos os N-
glicanos e ligações disulfetos formadas entre as cisteínas são importantes para o
dobramento e tráfico das proteínas (Persson & Pettersson, 1991; Shi et al., 2005;
Shi & Elliott, 2004).
No retículo endoplasmático, as proteínas Gn e Gc formam heterodímeros que
são transportados para o Golgi. O sinal de retenção ou alvo do Golgi foi estudado
para o domínio trans-membrana da proteína Gn do VBUN e para a proteína Gc, foi
observado que há necessidade da ação da chaperone sob a Gn para que a proteína
Gc seja transferida ao Golgi (Shi et al., 2004). A marcação correta das glicoproteínas
é crucial para a montagem e ligação, consequentemente para a infectividade do
bunyavírus.
Os produtos do gene do segmento M diferem entre os gêneros. Os hantavírus
produzem apenas as proteínas Gn e Gc enquanto que alguns vírus dentro dos
quatro gêneros restantes também codificam a proteína não estrutural NSm. A
proteína NSm dos orthobunyavírus é originada da mesma proteína precursora que
produz as proteínas Gn e Gc. Provavelmente, a clivagem da proteína precursora que
gera a proteína NSm está relacionada à atuação de enzimas furinas e confere um
resultado de proteínas com tamahos variando entre 11 a 14 kDa. O papel da
proteína NSm dos orthobunyavírus durante infecção não é muito conhecido, mas foi
sugerido que a região N-terminal tem um papel importante na montagem do vírion
na membrana do Golgi (Shi et al., 2006).
A proteína não estrutural NSm também é expressa do mesmo RNAm que as
proteínas Gn e Gc em mosquitos infectados com phlebovírus VRVF, mas é ausente
26
em carrapatos infectados com phlebovírus, VUUK. Apesar de não ser bem
caracterizado o papel da proteína não estrutural NSm durante a infecção dos
bunyavírus, sabe-se que sua presença é dispensável para tal função, pois foi
possível produzir um vírus recombinante que não possuía a proteína NSm em seu
gene (Bird et al., 2008).
O segmento M dos tospovírus usa uma estratégia ambisenso para codificar
sua proteína NSm. Esta possui um tamanho aproximado de 34 kDa e há várias
características de proteínas envolvidas na movimentação entre células infectadas. A
proteínas NSm do vírus “Tomato spotted wilt” (VTWS) que é expressa no estágio
prematuro da infecção pode ligar-se ao RNA e permite a movimentação dos vírus
dentro das células (Li et al., 2009).
1.2.2.5. Estratégia de Codificação para o Segmento S
Dentro da família Bunyaviridae, o tamando da proteína do nucleocapsídeo, N,
varia entre 25 kDa para os orthobunyavírus, phlebovírus e tospovírus a 50 kDa para
os hantavírus e nairovírus. Pouca homologia entre as sequências foi observada
entre os vírus nos diferentes gêneros, mas as funções da proteína aparentemente
são similares (Schmaljohn & Nichol, 2007).
A nucleoproteína N é a proteína mais abundante encontrada em células
infectadas e nos vírions. Essa abundância reflete seu importante papel na replicação
dos bunyavírus, que é a proteção do genoma viral e do RNA anti-genômico contra a
degradação através da formação das ribonucleoproteínas virais. Além disso, a
proteína N possui a função de interagir com a polimerase viral, L e as glicoproteínas
(Kaukinen et al., 2003). Para os VBUN, a deleção de porções dos domínios
terminais N- e C- inibe a oligomerização da proteína N. Este fato sugere o modelo de
multimerização “cabeça-cabeça” e “cauda-cauda” onde o oligômero é formado pela
adição uma por uma da proteína N (Leonard et al., 2005). Ao contrário dos
hantavírus, uma região central da proteína N do VBUN também pode estar envolvida
na interação proteína N-proteína N (Eifan & Elliott, 2009).
Em adição à interação protéica, a nucleoproteína N está envolvida na ligação
do RNA. Para ambos os hantavírus e orthobunyavírus, a proteína N interage
preferencialmente com o terminal 5’ do RNA (Osborne & Elliott, 2000; Severson et
27
al., 2001). Enquanto que o sítio de ligação do RNA do VHTN é localizado na região
central da proteína (Severson et al., 2005; Xu et al., 2002). Estudos recentes com
análise de mutagênese da proteína N mostraram o papel crítico aminoacídico na
posição R94, como também, que aminoácidos na posição R40 e L50 facilitavam a
ligação do RNA (Walter et al., 2011).
Os membros dos gêneros Tospovirus e Phlebovirus, como também alguns
membros dos gêneros Orthobunyavirus e Hantavirus produzem a proteína não
estrutural NSs. Os vírus da família Bunyaviridae desenvolveram duas estratégias
diferentes para codificar suas proteínas não estruturais NSs. Os orthobunyavírus e
os hantavírus, ambos apresentam a proteína NSs com tamanho aproximado de 10
kDa, traduzem a proteína NSs na região codificante sobreposta do mesmo RNAm
que a proteína N. Este mecanismo envolve o mecanismo de exploração livre pelos
ribossomos no RNAm (Vera-Otarola et al., 2011). Já os phlebovírus e tospovírus,
ambos apresentam a proteína NSs com tamanho aproximado de até 50 kDa,
traduzem a proteína NSs em uma orientação ambisensa. A proteína não estrutural,
NSs, do VRVF acumula-se no núcleo de células infectadas onde é formado
estruturas filamentosas (Struthers & Swanepoel, 1982; Yadani et al., 2004). A
proteína NSs dos hantavírus tem sido localizada no citoplasma, para o VTUL tem
sido localizada em inclusões perinucleares (Virtanen et al.,2009), enquanto que para
o vírus Andes (VAND), a proteína NSs foi localizada em grânulos distribuídos ao
longo do citoplasma (Vera-Otarola et al., 2011). Análises de imunofluorescência com
plasmídeos de expressão marcados com a proteína FLAG mostraram que a proteína
NSs do VBUN poderia estar localizada no núcleo e na forma de inclusões
citoplasmáticas (Thomas et al., 2004).
Não foi observada alguma homologia na sequência da proteína NSs entre os
gêneros da família Bunyaviridae e até mesmo dentro de um mesmo gênero, as
sequências são pouco conservadas, no entanto, com o avanço da genética reversa,
a análise funcional revelou que há papéis semelhantes. A proteína NSs nos distintos
gêneros aparentemente contém proteínas multifuncionais envolvidas na replicação
dos bunyavírus e na interação do vírus com a célula hospedeira. Na técnica do
minireplicon, a ausência da proteína não estrutural NSs aumentou a atividade do
gene repórter para ambos os vírus, VBUN e VLAC, enquanto que a superexpressão
da proteína NSs inibe a atividade de minireplicon (Blakqori, 2003; Weber et al.,
2001).Essa característica sugere que a proteína NSs possa ser conservada, ao
28
menos entre os orthobunyavírus, pois também foi observado o mesmo resultado
para os vírus Guaroa (VGRO) e vírus Lumbo (Weber et al., 2001).
Em adição, sugere-se que a proteína NSs tenha influência negativa na
atividade da polimerase viral. A relevância deste efeito inibitório observado no
sistema de minireplicon não é completamente entendida. A proteína NSs parece ser
não essencial para replicação dos vírus em cultivo celular, pois foi observado que
vírus recombinantes com a proteína NSs deletada, como VBUN, VLAC e vírus
AkabaneI, VAKA, foram resgatados por sistema de recuperação de células
infectadas (Weber et al., 2001).
Vírus que não expressavam a proteína NSs foram atenuados em linhagens
de células interferon competentes comparados aos vírus selvagens, logo, a proteína
NSs foi identificada como sendo um fator virulento e antagonista do sistema de
interferon (Blakqori et al., 2007). Estudo com a proteína NSs do VRVF mostraram
que o clone 13, um isolado que contém uma grande e deletada região codificante da
NSs, foi um inibidor da produção de interferon (Bouloy et al., 2001). O papel da
proteína NSs durante a infecção do VRVF foi depois estudada usando o vírus
recombinante que não continha a região codificante da proteína NSs (Billecocq et
al., 2004; Bird et al., 2008).
1.2.3. Ciclo Replicativo dos vírus da família Bunyaviridae
Os bunyavírus se ligam a célula hospedeira através das glicoproteínas (Fig.
4), no entanto, não se sabe quais são as estruturas celulares que são reconhecidas
pelas glicoproteínas virais. A entrada dos bunyavírus nas células é mediada por
fusão da glicoproteínas virais com a membrana celular dependente de pH e via o
mecanismo de endocitose, fato observado para os VLAC e VORO (Jacoby et al.,
1993; Santos et al., 2008). Quando as ribonucleoproteínas são liberadas no
citoplasma, a polimerase viral L inicia a transcrição primária a partir do RNA viral
(RNAv) encapsulado. A polimerase viral possui a atividade de endonuclease que
permite a clivagem da estrutura 5’ cap do RNAm da célula hospedeira que em
resposta é usado para começar a síntese de RNAm viral. Os bunyavírus necessitam
de 10 a 18 de seus nucleotídeos dos RNAm situados no citoplasma que sofreram
29
“cap-snatching” para inicializar a replicação do genoma viral (Patterson et al., 1984).
A remoção do terminal cap 5’ dos RNAm das células podem contribuir para a
interrupção da síntese protéica da célula hospedeira (Raju et al., 1989). Como outros
vírus de RNA de filamento negativo, a transcrição dos bunyavírus termina em
sequências ricas em GU, mas a poliadenilação do RNAm não é observada (Bouloy
et al., 1990).
A transcrição primária originadas dos segmentos L e S são traduzidas em
ribossomos livres no citoplasma o que leva a produção da polimerase viral,
nucleoproteína e no caso dos orthobunyavírus, a proteína não estrutural,
respectivamente (Schmaljohn & Nichol, 2007). O RNA cópia (RNAc) serve como
modelo para transcrição ambisenso dos genes das proteínas não estruturais, NSm,
para os tospovírus e NSs para os tospovírus e plebovírus.
O RNAm primário do segmento M codifica a poliproteína precursora das
glicoproteínas Gn, Gc e NSm. Esta última para os orthobunyavírus e plebovírus é
traduzida no retículo endoplasmático (RE). A clivagem co-transducional leva a
liberação das proteínas de membrana para o RE onde são N-glicosiladas em várias
posições e formam heterodímeros que as translocam para o complexo de Golgi
(Schmaljohn & Nichol, 2007).
Novos vírions são formados em sítios da membrana do Golgi onde houve
acumulação das glicoproteínas virais (Schmaljohn & Nichol, 2007). O progênio do
vírus liga-se ao lúmen do Golgi e é liberado através de vias secretórias. Por serem
vírus tri-segmentados, o rearranjo em células infetadas por dois vírus é possível e
pode levar a origem de novas variantes virais com propriedades diferentes (Dunn et
al., 1995; Gerrard et al., 2004). Este processo natural é chamado de “antigenic shift”
e pode levar ao re-cap dos genes em laboratório (Cheng et al., 1999).
30
1.3. GÊNERO ORTHOBUNYAVIRUS
O gênero Orthobunyavirus possui a maior quantidade de integrantes dentre
os cinco gêneros da família Bunyaviridae, contendo mais de 170 vírus conhecidos
(Elliott & Blakqori, 2011). Este gênero possui três características que os distinguem
dos demais: (1) o padrão dos tamanhos dos 3 segmentos de RNA; (2) o padrão dos
tamanhos das estruturas das proteínas virais e (3) a sequência consenso nos
terminais 3’ e 5’ dos segmentos de RNA.
Vários estudos sorológicos através de testes de fixação de complemento,
neutralização e inibição de hemaglutinação agruparam os orthobunyavírus em 18
sorogrupos (Anopheles A, Anopheles B, Bakau, Bunyamwera, Bwamba, Grupo C,
Capim, California, Gamboa, Guamá, Koongol, Minatitlan, Nyando, Olifanstlei, Patois,
1. Ligação
2. Entrada
3. Transcrição Primária
4. Tradução
5. Replicação
6. Montagem RE
Montagem alternativa e liberação
Núcleo
Corpos de inclusão
7. Liberação
Figura 4- Estratégia de replicação dos bunyavírus. 1. Ligação via glicoproteínas. 2. Receptor
mediado por endocitose. 3. Trasncrição primária. 4. Tradução das proteínas dos vírus. 5. Replicação e formação de novas ribonucleoproteínas. 6. Montagem na membrana do Golgi. 7. Liberaçao dos progênios virais. N= núcleo, RE= retículo endoplasmático, G= Golgi. Fonte: Whitehouse, 2004, modificado.
31
Simbú, Tete e Turlock), cada sorogrupo contém vírus que são antigenicamente
distintos, mas relacionados (Bishop, 1990; Calisher, 1996).
O gênero Orthobunyavirus, assim como a família Bunyaviridae, tem como
protótipo o VBUN. Este vírus tem sido isolado de humanos em várias regiões da
África Subsahariana, sendo que a infecção por este pode levar a uma doença febril
aguda. O VBUN foi o primeiro bunyavírus o qual o genoma completo foi sequenciado
(Lees et al., 1986; Elliott, 1989a; 1989b) e foi o primeiro vírus de filamento negativo
em que o vírus infeccioso foi recuperado por transfecção de células com clones de
cDNA (Bridgen & Elliott, 1996).
Na América do Norte, a principal causa de encefalite por arbovírus é resultado
da infecção por dois membros do sorogrupo Califórnia, o VLAC que afeta crianças e
o vírus Jamestown Canyon que causa, principalmente, doenças em adultos
(McJunkin et al., 2001). O VLAC é transmitido essencialmente pelo mosquito Aedes
triseriatus e os esquilos são seu hospedeiro natural. A infecção dos esquilos é
assintomática, mas a viremia atinge títulos que são suficientes para infectar um
mosquito ao se alimentar do animal. Após o repasto do sangue virêmico, as células
epiteliais do mosquito são infectadas pelos vírus ingeridos (Beaty et al., 1982). Como
resultado, as partículas virais são liberadas da lâmina basal e disseminada pelo
corpo do mosquito. Entre os tecidos infectados, as glândulas salivares e os ovários
possuem um papel determinante na distribuição do vírus e sua manutenção na
natureza (Reese et al., 2010). A replicação nas glândulas salivares permite a
transmissão do hospedeiro vertebrado durante a alimentação, enquanto que a
replicação nos ovários resulta na transmissão do vírus do mosquito fêmea a sua
progênie.
Alguns vírus do gênero causam importantes doenças em bovinos, como o
vírus Cache Valley (VCV), na América do Norte, vírus Schmalleberg (VSB) na
Europa (Hoffmann et al., 2011) e os vírus Aino e VAKA na Austrália e na Ásia
(Tsuda et al., 2004; Kim et al., 2011) são responsáveis por abortos e anormalidades
congênitas em bovinos, carneiros e cabras.
No Brasil, a febre do Oropouche, causada pelo VORO, é a segunda infecção
por arbovírus mais comum logo após a febre do Dengue. O VORO é transmitido por
picadas de culicóides e diferente de outros orthobunyavírus, a viremia em humanos
é suficiente para infectar maruins após a picada em humanos infectados (Azevedo et
al., 2007).
32
1.4. VÍRUS OROPOUCHE
O VORO é um arbovírus, membro da família Bunyaviridae, por ter
características inerentes a família, está incluído no grupo Simbu (Karabatsos, 1985),
sendo pátogeno de uma doença febril aguda, a febre do Oropouche, muito parecida
com Dengue e que tem acometido milhares de pessoas na Amazônia brasileira nos
últimos 50 anos (Travassos da Rosa et al., 1997, Pinheiro et al, 2004, Vasconcelos
et al., 2009). Sua principal característica é a capacidade de provocar epidemias em
centros urbanos de áreas tropicais da América do Sul e América Central, sendo
assim, constitui uma das arboviroses mais importantes para saúde pública na
Amazônia, pois o número de casos de infecção pelo VORO é apenas superado pelo
da VDEN (Borborema et al., 1982; Travassos da Rosa et al., 1997).
Dentre suas características físico-químicas e biológicas, este arbovírus possui
uma hemaglutinina ativa contra eritrócitos de gansos, a qual é obtida a partir do soro
de hamsters infectados (Pinheiro, 1997). Em diversos cultivos celulares, tais como
VERO (células de rim de macaco Cercophitecus aethiops), BHK-21 (células de rim
de hamster) e embrião de galinha, causam efeito citopático (ECP) bem evidente
(Pinheiro, 1981). Possui a capacidade de causar infecção letal em camundongos
lactentes inoculados pelas vias intracerebral (i.c.) e intra-peritoneal (i.p.), com
tropismo preferencial para o Sistema Nervoso Central (SNC) (Araújo, et al., 1986).
De fato, em cérebro de camundongos albinos recém-nascidos inoculados com o
VORO, foi encontrado um pequeno número de partículas virais no citoplasma de
neurônios, mais particularmente, em cisternas dilatadas do retículo endoplasmático
sem apresentar alterações perceptíveis no fígado (Araújo et al., 1986) desses
animais. No entanto, a inoculação do VORO em hamsters adultos pelas vias i.c., i.p.
ou subcutânea (s.c.), resultou em hepatotropismo (Dias, 1986).
Atualmente são conhecidas quatro linhagens filogenéticas deste vírus
denominadas de genótipos I, II, III e IV. O genótipo I é encontrado em Trinidad e
predominantemente no Brasil. O genótipo II é encontrado no Peru e Brasil. O
genótipo III encontra-se distribuído no Panamá e Brasil e o genótipo IV apenas no
Brasil (Saeed et al., 2000; Nunes et al., 2005; Azevedo et al., 2007; Nunes et al.,
2007; Vasconcelos et al., 2009).
33
1.4.1 Ciclo de Transmissão
O primeiro isolamento do VORO em artrópodes foi obtido a partir de lotes de
Coquillettidia venezuelensis em Trinidad &Tobago, subseqüentemente foi isolado de
Culex quinquefasciatus (espécie comumente encontrada em áreas urbanas na
Amazônia) em 1961 e 1968, em Belém. Posteriormente o VORO foi isolado de
Culicoides paraensis, popularmente chamado de maruím na região Amazônica
brasileira (Robert et al., 1981).
O VORO é mantido em natureza através de dois ciclos distintos: ciclo urbano
e o ciclo silvestre (Pinheiro et al., 1981a). No ciclo urbano ou epidêmico, o vírus é
transmitido de pessoa a pessoa através da picada do inseto Culicoides paraensis.
Estudos demonstraram que esse inseto, após alimentar-se de pacientes virêmicos,
foi capaz de transmitir o VORO para hamsters, após cinco ou mais dias após
incubação (Pinheiro et al., 1982a). Este fato também foi observado na transmissão
do VORO pela picada do vetor Culex quinquefasciatus aos hamsters, no entanto,
eram necessários níveis virêmicos muito altos para que essa transmissão ocorresse
(Pinheiro et al., 1981b).
No ciclo silvestre, acredita-se que, as preguiças, primatas não-humanos e
algumas espécies de aves sejam os hospedeiros vertebrados (Travassos da Rosa et
al., 1997). Provavelmente, o homem é o vínculo entre esses dois ciclos, por adquirir
a infecção em áreas epizoóticas e retornar ao setor urbano em fase virêmica, dessa
forma, servindo de fonte de infecção para os maruíns (Pinheiro et al., 1981a; Nunes
et al., 2005a). O vírus replica-se nos tecidos desses artrópodes que passam a
infectar outros humanos. Além disso, pode ocorrer a transmissão de humanos para
outros maruíns, levando a um ciclo de infecção que pode desencadear uma
epidemia (Fig. 5) (Travassos da Rosa et al., 1997).
34
1.4.2 Manifestações Clínicas
Após um período de incubação, que costuma variar de três a oito dias (Dixon
et al., 1981), foi observado na maior parte dos casos, uma síndrome febril aguda
cujo período varia de três a seis dias de duração e é caracterizada por temperaturas
elevadas (39º a 40ºC). De maneira geral, os pacientes podem apresentar as
seguintes manifestações clínicas: calafrios, cefaléia, artralgia (Vasconcelos et al.,
1989), anorexia, diarréia, tonturas e fotofobia (Borborema et al., 1982), calafrios,
(Travassos da Rosa et al., 1997), astenia, dores musculares, vômitos e muito
raramente se observa presença de exantema e mais raramente nistagmo (Pinheiro
et al., 1997), atingindo ambos os gêneros de qualquer idade, com ligeiro predomínio
do feminino (Pinheiro, 2004). Não se observa icterícia, hepato ou esplenomegalia e,
ocasionalmente, constata-se a presença de linfonodos ingurgitados nas regiões
submaxilar e occipital, embora, sua constatação possa não estar relacionada com a
virose (Pinheiro et al., 1997). A intensidade das manifestações clínicas pode variar
(Pinheiro et al., 1997) e costumam regredir após três a cinco dias, podendo ocorrer
recorrência dos sintomas após o término de quadro febril. Não se tem registro de
óbito ou seqüela grave causado pelo VORO (Pinheiro et al., 1997; Pinheiro et al,
2004).
Ciclo Silvestre
Mosquito Mosquitos
Preguiça
Preguiça
Ciclo Urbano
Mosquitos
Maruíns
Mosquitos
Maruíns
Maruoíns Homem
Homem
Aves
Macaco
Homem
Figura 5- Desenho esquemático do ciclo de transmissão do VORO. Adaptado de Hervé., J.P et al., 1986.
35
1.4.3 Epidemiologia
Após o primeiro isolamento do VORO no ano de 1955, o vírus só foi
novamente detectado em 1960, no Estado do Pará (Brasil) em amostras de sangue
de um espécime de bicho preguiça, Bradypus tridactylus, capturada em uma área
silvestre, durante a construção da rodovia Belém-Brasília, bem como, a partir de
mosquitos Oschlerotus serratus capturados próximo a área da construção (Pinheiro
et al., 1961). Em 1961, houve uma grande epidemia da febre do Oropouche, na
cidade de Belém, Pará, Brasil, onde mais de onze mil pessoas foram infectadas pelo
VORO (Pinheiro et al., 1962).
A maioria das epidemias ocorreu no Estado do Pará, sendo somente a partir
dos anos de 1980 e 1981 que foram registrados casos de febre do Oropouche fora
do território paraense, quando ocorreram epidemias em Manaus e Barcelos (Estado
do Amazonas) e em Mazagão, antigo território Federal do Amapá. Posteriormente,
em 1988, foram registrados casos nos Estados do Maranhão e Goiás (Vasconcelos
et al., 1989). Nos anos 1980, vestígios da presença do VORO, em centros urbanos
mais afastados da Região Amazônica, foram observados a partir do teste de inibição
de hemaglutinação para o VORO, em dois moradores do município de Ribeirão
Preto, Estado de São Paulo (Figueiredo, 1999).
A febre do Oropouche tem se manifestado com uma abrangência com
epidemias de grande magnitude, como as que ocorreram nas cidades de Ariquemes
e Ouro Preto D'Oeste, no Estado de Rondônia (Travassos da Rosa et al., 1996).
Recentemente, após mais de 20 anos sem alguma evidência epidemiológica, surtos
de febre do Oropouche foram observados nos anos de 2003 e 2004, nos municípios
paraenses de Parauapebas e Porto de Moz e em 2006, nos municípios paraenses
de Maracanã, Igarapé-Açu, Magalhães Barata e Viseu (Azevedo et al., 2007;
Vasconcelos et al., 2009).
Essa dispersão viral acometeu populações de Trinidad & Tobago (Anderson
et al.,1961) e Peru (Baisley et al., 1998) mostrando uma evolução histórico-
geográfica de amplificação do raio de propagação de epidemias. A evolução desse
quadro de dispersão parece necessitar de mecanismos intermediários de
transferências entre hospedeiros, como primatas não-humanos que desenvolveram
imunidade para o VORO sugestivo de que o vírus está presente, muito embora não
36
gere sinais clínicos correspondentes, caso particular ocorrido na Colômbia (Pinheiro
et al., 1997), mas, que não resultou em nenhum registro de evolução clínica da
doença em humanos. Finalmente, foi estimado que pelo menos 356.413 pessoas no
mundo foram acometidas por este arbovírus desde 1961 (Pinheiro et al., 1997),
embora atualmente tenha sido sugerido que pelo menos 500.000 pessoas foram
infectadas pelo VORO (Pinheiro et al., 2004, Vasconcelos et al., 2009).
1.4.4. Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico da febre do Oropouche, assim como de outras arboviroses, é
realizado por meio de provas laboratoriais específicas para a virose. A comprovação
da virose é realizada com o isolamento do vírus a partir do sangue dos pacientes ou
através do uso de testes sorológicos específicos para a infecção (Pinheiro et al,
1981).
Para que seja efetuado o isolamento do vírus, as amostras de sangue devem
ser colhidas até o quinto ou sexto dia da doença, entretanto, o material coletado nos
dois primeiros dias é o mais indicado para análise, pois nesse período a viremia
provavelmente se faz presente em 100% dos casos (Pinheiro et al., 1997). O vírus
pode ser isolado mediante a inoculação do sangue pelas vias i.c. e i.p. em
camundongos lactentes ou em hamsters jovens, estes últimos também pela via s.c..
O isolamento também pode ser obtido utilizando-se cultivos celulares, tais como
VERO ou BHK-21.
A identificação do vírus é efetuada por meio do teste de fixação do
complemento (FC) ou do teste de neutralização (TN), utilizando anti-soro ou fluido
ascítico específico para o vírus. O diagnóstico sorológico é efetuado com a
comprovação de viragem sorológica em amostras pareadas de soro colhidas nas
fases agudas e de convalescença da virose; para este fim, as técnicas de inibição de
hemaglutinação, FC ou TN podem ser utilizadas (Pinheiro et al., 1997). O teste
imunoenzimático (Mac ELISA) para detecção de anticorpos IgM, RT-PCR (Moreli et
al., 2001) e RT-PCR em tempo real (Weidmann et al., 2003) para detecção do
genoma viral são métodos bastante sensíveis e específicos que podem ser
utilizados com sucesso para o rápido diagnóstico das infecções causadas pelo
VORO.
37
1.4.5 Organização Genômica
O genoma do VORO, assim como os demais orthobunyavírus, é constituído
por três moléculas de RNA fita simples, polaridade negativa, denominados SRNA,
MRNA e LRNA correspondentes aos segmentos pequeno, médio e grande,
respectivamente (Fauquet et al., 2005). Em relação aos seus tamanhos, há
variações em cada segmento sendo, o SRNA constituído por 754 nucleotídeos (nts)
e os segmentos M e L constituídos por 4.385 e 6.846 nts, respectivamente (Saeed et
al., 2000; Aquino et al., 2003; Aquino et al., 2004).
Estes segmentos são responsáveis pela codificação de seis proteínas: a
proteína de nucleocapsídeo (N) e a proteína não estrutural NSs são codificadas pelo
segmento SRNA ao longo de duas CALs (cadeia de leitura aberta) (Saeed et al.,
2000). As duas glicoproteínas de superfície (Gn e Gc) e uma proteína não estrutural
NSm são codificadas pelo segmento MRNA ao longo de uma única CAL, assim
como a proteína L (RdRp) codificada pelo segmento LRNA (Fauquet et al., 2005)
(Fig. 6).
Apesar dos grandes avanços moleculares no que tange o sequenciamento
nucleotídico de diferentes cepas do VORO, o que culminou na caracterização dos
quatro genótipos (I, II, III e IV) circulantes nas Américas do Sul e Central (Saeed et
al,, 2000; Nunes et al., 2005; Azevedo et al., 2007; Nunes et al., 2007; Vasconcelos
et al., 2009), pouco se sabe a respeito dos mecanismos de replicação e
empacotamento viral.
1.5. GENÉTICA REVERSA
Figura 6- Organização genômica do vírus Oropouche. Fonte: Adaptado de Fauquet et al., 2005.
38
1.5.1. Genética Reversa de vírus de filamento negativo
Na genética clássica, as pesquisas têm como objetivo a busca de genes que
são responsáveis por determinar um genótipo específico. A genética reversa
corresponde ao objetivo contrário: verificar a função de um gene específico
modificando-o por processo mutagênico indutivo para análise dos efeitos fenotípicos.
Mais especificamente na virologia molecular, a genética reversa refere-se à geração
de um vírus infeccioso a partir de um cDNA clonado, dessa forma, esta técnica
permite várias possibilidades de manipulação dos genomas virais permitindo
estudos básicos de uma simples proteína e sequências regulatórias até a
identificação de fatores de virulência e geração de vacinas de vírus atenuados
(Neumann et al., 2002).
Os sistemas de genética reversa utilizam a tecnologia de DNA recombinante
para introduzir alvos com modificações genéticas que podem ser posteriormente
estudados in vivo ou in vitro, assim sugerindo uma ligação entre um fenótipo
observado e modificações genéticas (Kawaoka, 2004). Atualmente, existem três
diferentes métodos para estudar os vírus de RNA de filamentos negativos usando a
genética reversa. Primeiro, o sistema de minireplicon ou minigenoma consiste no
genoma de um vírus similar ao vírus selvagem flanqueado em regiões regulatórios
do vírus o qual é co-transfectado em cultivo celular com plasmídeos que expressam
as proteínas virais necessárias à replicação. Segundo, o método de Partículas
Semelhantes a Vírus- “Virus Like Particle” (VLP) que é a extensão do sistema de
minireplicon, com a adição de plasmídeos que expressam glicoproteínas virais que
permitem o empacotamento e transferência do gene repórter. Terceiro, o sistema de
recuperação que gera partículas virais infecciosas que contém modificações
genéticas específicas (Elliott & Blakqori, 2011).
A recuperação de partículas virais infecciosas é obtida de forma mais fácil
para vírus de RNA de filamento positivo do que para vírus de RNA de filamento
negativo, pois a transfecção do cDNA é suficiente para alcançar a expressão do
genoma viral devido o RNAm dos vírus de RNA de filamento positivo ser
funcional,dessa forma, infeccioso. O primeiro vírus de RNA, o bacteriófago Q, teve
seu cDNA transfectado em E.coli (Taniguchi et al., 1978). Anos depois, o poliovírus
39
foi recuperado por transfecção em células de mamíferos com plasmídeos que
continham a cópia do cDNA do genoma viral (Racaniello & Baltimore, 1981).
A recuperação de vírus de RNA de filamento negativo parece ser mais
complicada, pois nem o genoma e nem o antigenoma viral são suficientes se obter a
replicação viral, ou seja, não são infecciosos. A estrutura mínima necessária para
esse objetivo é a ribonucleoproteína intacta formada pelo RNA genômico ou
antigenômico encapsulado em conjunto com a RdRp. O primeiro passo para se
obter o sistema de recuperação de vírus de RNA de filamento negativo foi realizado
por Luytjes et al em 1989, quando eles reconstituíram com sucesso as
ribonucleoproteínas do vírus influenza in vitro. O grupo utilizou um minigenoma que
consistia na presença do gene da proteína CAT (chloramphenicol acetyltransferase)
no sentido negativo flanqueado pela região não codificante do gene NS do vírus
Influenza A o qual foi transcrito in vitro. As ribonucleoproteínas foram construídas por
combinação das proteínas virais, NP, PA, PB1 e PB2 que foram posteriormente
transfectadas em células que estavam infectadas com um vírus acessório. Neste
sistema, o gene repórter foi amplificado, expresso e empacotado em partículas
virais. Apesar do sucesso, somente após 10 anos que o primeiro vírus Influenza foi
recuperado inteiramente do cDNA (Fodor et al., 1999; Neumann et al., 1999).
Um vírus da raiva foi o primeiro vírus não segmentado que foi recuperado
com sucesso a partir do cDNA e este sucesso estava relacionado a novas técnicas
implementadas na área de genética reversa, entre elas, a transfecção de
plasmídeos que contem o genoma viral no sentido positivo, ou seja, o antigenoma
(Schnell et al., 1994). Utilizando-se dessa inovação para o vírus da Raiva, outros
grupos conseguiram com sucesso a recuperação de distintos vírus não
segmentados, como o vírus da Estomatite Vesicular (VSV) (Whelan et al., 1995) e o
vírus Sendai (Garcin et al., 1995).
Schnell e colaboradores em 1994, utilizaram o promotor T7 para promover a
transcrição do genoma viral do cDNA pela RNA polimerase dependente de DNA do
bacteriófago T7 (T7RNAP). A T7RNAP pode ser expressa em larga escala de
linhagens celulares e não apenas em células de mamíferos e, esta enzima está
localizada no citoplasma onde a maioria dos vírus de filamento negativo se replica,
no entanto, a T7RNAP deve ser fornecida na forma trans, para isso, deve ser
utilizado tanto um vírus Vaccinia Recombinate, um plasmídeo de expressão ou uma
linhagem celular transgênica que expressa constitutivamente esta enzima. O uso do
40
T7RNAP tem suas limitações, pois o início da transcrição é mais eficiente em
amostras que contem seu genoma começando com uma guanosina (G) e o término
da transcrição não é preciso (Milligan et al., 1987; Kuzmine et al., 2003).
A adição de uma guanosina extra no final 5’ da amostra viral garante um
maior nível transcricional, mas pode resultar em um menor reconhecimento pela
polimerase viral. Como os genomas dos bunyavírus começam com adenosina (A) ou
Uracila (U), os transcritos possuem, geralmente, um ou dois nucleotídeos G
adicionais para garantir altos níveis transcricionais. Apesar de haver tolerância na
presença de nucleotídeos extras em alguns sistemas de recuperação, eles podem
diminuir o reconhecimento pela polimerase viral ou pela nucleoproteína e
possivelmente dificultar o sistema de recuperação para alguns bunyavírus. Este
problema pode ser superado por cortes pós transcricional de ribozimas para se obter
terminais 5’ e 3’ autênticos (Elliott & Blakqori, 2011).
A RNA-polimerase I dependente de DNA (RNAPI) pode alcançar uma
transcrição mais precisa, mas suas sequências promotoras são espécie específica,
restrigindo assim, a escolha de linhagens celulares, além disso, a RNAPI está
localizada no núcleo. Essa localização nuclear pode ter um impacto nas
modificações pós-transcricionais do transcrito viral (Neumann et al., 1999).
O número de sistemas de recuperação para os bunyavírus ainda é muito
limitado. As dificuldades advêm do número de plasmídeos que devem ser
transfectados nas células, assim como, na padronização da quantidade correta de
cada plasmídeo que deve ser transfectado e que levará a reprodução de uma
infecção viral em célula. A construção do VBUN partir de clone de cDNA por Bridgen
& Elliott em 1996 foi o primeiro sistema de recuperação realizado para qualquer
vírus de RNA tri-segmentado de filamento negativo. O sistema construído
necessitava de seis plasmídeos, três plasmídeos genômicos e três plasmídeos
suporte para conseguir a recuperação do vírus, no entanto, após alguns anos,
Lowen e colaboradores, em 2004, desenvolveram um sistema de recuperação em
que era utilizado apenas três plasmídeos genômicos.
Anos mais tarde, um sistema completamente diferente, utilizando-se a RNAPI
e RNAPII foi utilizado para recuperar vírus Influenza de cDNA. O cDNA de cada
segmento viral foi clonado sob o controle do promotor RNAPI humano, enquanto
que, os plasmídeos de expressão para as três subunidades da polimerase viral e a
nucleoproteína foram clonados sob o promotor RNAPII (Fodor et al., 1999; Neumann
41
et al.,1999). O grupo de Neumann utilizou um terminador RNAPI de camundongo
enquanto que o grupo de Fodor utilizou como terminador a ribozima do vírus da
Hepatite Delta. O sistema de recuperação de doze plasmídeos foi depois reduzido
para oito plasmídeos, por Hoffman e colaboradores, em 2000. Para conseguir o
sistema de recuperação do vírus Influenza com apenas oito plasmídeos
transfectados, um sistema de transcrição bidirecional, pol I-pol II foi construído. O
cDNA viral foi inserido no sentido negativo entre o promotor RNAPI e a sequência
terminal, depois este cassete foi inserido no sentido positivo entre os promotores
RNAPII e a calda sinalizadora poli (A), dessa forma, ambos o RNAm e o RNA
genômico foram transcritos do mesmo plasmídeo (Hoffmann & Webster, 2000).
Abaixo segue um quadro demonstrando diferentes sistemas de recuperação
para vírus de RNA segmentado de filamento negativo (Quadro 2).
Quadro 2- Sistemas de recuperação para vírus de RNA segmentado de filamento
negativo
Vírus Sistema Promotor
Proteína fornecidas em trans
Referência
Bunyamwera T7RNAP L, N, Gn e Gc (Bridgen & Elliott, 1996)
nenhuma (Lowen et al., 2004)
La Crosse T7RNAP nenhuma (Blakqori & Weber, 2005)
Influenza A hRNAPI CMV
PA, PB1, PB2 e NP (Fodor et al.,1999)
hRNAPI- hRNAPII
nenhuma (Neumann et al., 1999)
Influenza B hRNAPI- hRNAPII
nenhuma (Hoffmann, 2002)
Coriomeningite linfocítica
T7RNAP hRNAPII
L, NP e GP (Sanchez, 2006)
T7RNAP L, N, Gn e Gc (Ikegami et al., 2006)
Rift Valley T7RNAP mRNAPI
L e N (Billecocq et al., 2008)
T7RNAP nenhuma (Bird et al., 2008)
Akabane mRNAPI CMV
L, N, Gn e Gc (Ogawa et al., 2007)
Lassa T7RNAP nenhuma (Albarino et al., 2011)
Junin RNAPI RNAPII
L e N (Emonet et al., 2011)
Schmallenberg T7RNAP nenhuma (Elliott et al., 2012)
42
1.5.2. Genética Reversa dos Bunyavírus e suas aplicações
1.5.2.1. Sistema de Minireplicon ou Minigenoma
O sistema de minigenoma ou minireplicon é caracterizado por um gene
repórter (ex. gene da proteína verde fluorescente - GFP; clorafenicol
acetiltransferase -CAT; ou luciferase) clonado entre as regiões terminais 3’ e 5’ não
codificantes. O sistema de minigenoma pode ser transcrito e replicado pela co-
expressão com as proteínas virais (Elliott & Blakqori, 2011). A vantagem da
utilização da GFP como marcador biológico está no fato de a fluorescência desta
proteína não necessitar de um co-fator ou nenhum outro substrato. O cromóforo da
GFP é formado pela ciclização pós-traducional e oxidação de um tripeptídeo
codificado. Além disso, como não há necessidade de permeabilização para entrada
e fixação do substrato com a finalidade de localizar a GFP, proteínas, organelas e
células marcadas com esta proteína podem ser analisadas em tecido vivo
(Shimomura, 2006). A enzima clorafenicol acetiltransferase é codificada pelo gene
CAT e confere resistência ao clorafenicol a vários tipos de bactérias. A luciferase é
uma enzima que catalisa a conversão de um substrato a um produto com a
produção concomitante de luz que pode facilmente ser medida. Há dois tipos
principais de luciferase: Firefly Luciferase e Renilla luciferase derivadas dos
organismos Photinus pyralis e Renilla reniformis, respectivamente (Avison, 2007).
O sistema de minireplicon foi estabelecido para os orthobunyavírus, VBUN,
VLAC e VAKA (Blakqori, 2003; Dunn et al., 1995; Ogawa et al., 2007). Tanto a
utilização da RNAPI para o VLAC quanto o uso da T7RNAP para o VBUN garantem
a transcrição de um antigenoma semelhante ao do vírus. No sistema de minigenoma
do VBUN, o cDNA semelhante ao do vírus contém a região codificante de um gene
repórter, CAT ou Renilla Luciferase, flanqueada pela região não codificante do vírus.
Este minireplicon fica sobre o controle das sequências da região promotora e
terminal da T7RNAP e, a sequência da ribozima da hepatite localizada abaixo da
região não codificante do terminal 3’ do VBUN garante a exata sequência terminal
do vírus (Bridgen & Elliott, 1996). Os plasmídeos que expressam proteínas (ou
plasmídeos suportes) contem a região codificante viral sob controle do promotor
T7RNAP e permite a expressão de proteínas virais que são necessárias para
transcrição e replicação viral. Em todos os sistemas, a expressão do gene repórter
43
requer a presença da nucleoproteína N e da polimerase viral L, o que confirma o
conceito que somente as ribonucleoproteínas e não o RNA sozinho serve como
modelo para transcrição e replicação da polimerase. Além disso, a adição da
proteína NSs no sistema de minireplicon possui um efeito inibitório na expressão do
gene repórter (Weber et al., 2001; Blakqori, 2003).
O desenvolvimento do sistema de minigenoma para hantavírus e para
nairovírus provou ser mais difícil para ser desenvolvido devido ao alto “background”
da atividade do gene repórter (Flick et al., 2003; Zhang et al., 2008; Bergeron et al.,
2009). O sistema de minireplicon é um passo essencial para o sucesso na
construção de um sistema de recuperação de um vírus infeccioso a partir do cDNA
do vírus. Esse sistema também é uma ferramenta importante para estudar atividade
e conhecer o papel da nucleoproteína N e da polimerase viral L.
1.5.2.2. “Virus Like Particle” (VLP)
O sistema de VLP é uma extensão do sistema de minireplicon com a
diferença que há adição de plasmídeos que expressam as glicoproteínas Gn e Gc, o
genoma de minigenoma pode ser empacotado em uma partícula infecciosa
semelhante ao vírus. Os VLPs podem infectar novas células, mas não conseguem
proliferar ou produzir progênios de vírus. Na transfecção inicial, os genomas do
plasmídeos que expressam as proteínas dos segmentos L e N são fornecidos, mas
as glicoproteínas são fornecidas apenas como plasmídeos de expressão. Os VLPs
têm sido usados para o estudo do empacotamento do genoma viral tanto a nível
protéico quanto a nível genômico (Overby et al., 2006; Shi et al., 2007; Eifan &
Elliott, 2009; Shi et al., 2009).
Interessante notar que os VLPs purificados do phlebovírus Rift Valley iniciam
uma reposta imune protetora em camundongos (Näslund et al., 2009). Esse tipo de
proteção ainda não foi observado para membros do gênero Orthobunyavirus.
44
1.5.2.3. Sistema de Recuperação
O sistema de recuperação (rescue system) tem como base a capacidade dos
vírus infecciosos serem recuperados de células transfectadas com um determinado
cDNA (codificador do gene alvo) (Elliott & Blakqori, 2011).
O primeiro sistema de recuperação para um bunyavírus, VBUN, requeria
muito tempo e era ineficiente. Neste procedimento, as células HeLa eram
primeiramente infectadas com um vírus Vaccinia Recombinante que expressava
T7RNAP no citoplasma celular. Em seguida, as células eram transfectadas com três
plasmídeos suportes que codificavam todas as proteínas do VBUN. Após incubação,
outros três plasmídeos, estes codificavam os segmentos completos L, M e S no
sentido antigenômico, eram transfectados. Estes plasmídeos eram semelhantes ao
minigenoma, descrito anteriormente, com a região codificante do vírus substituída
pela sequência do gene repórter. Para isolar o VBUN do vírus da Vaccinia
Recombinante, o sobrenadante das células transfectadas sofria passagens para
células C6/36, em que o vírus da vaccínia não se replica, sendo assim, o VBUN
liberado era purificado em placa em células BHK-21. O procedimento continha uma
média de 10 a 100 placas por 107 de células transfectadas (Bridgen & Elliott, 1996).
A eficiência do sistema de recuperação foi aprimorada. O primeiro passo para
esse melhoramento foi a criação de uma célula derivada de BHK que expressa
constitutivamente a T7RNAP, a células BSR-T7/5 (Buchhol et al., 1999). O sistema
foi então simplificado pela redução do número de plasmídeos transfectados na
célula, de seis para três plasmídeos, usando-se apenas plasmídeos suportes que
expressavam as proteínas N e L (Lowen et al.,2004). O sistema de recuperação
baseado em três plasmídeos e com a utilização do T7RNAP foi utilizado com
sucesso para os VLAC e o VRVF (Blakqori & Weber, 2005; Ikegami et al., 2006).
Curiosamente, para o VLAC, a adição de plasmídeos suporte na mistura do
transfectado eliminou a recuperação do vírus. O sistema de recuperação por RNAPI
do VAKA requer a transfecção de plasmídeos suportes para as proteínas N e L
(Ogawa et al., 2007). A necessidade de transfecção de cinco plasmídeos também foi
observada para o VRVF quando usado o promotor da RNAPI (Billecocq et al., 2008).
A razão para estas diferenças não está completamente elucidada, mas pode explicar
diferentes níveis transcricionais entre as enzimas T7RNAP e do RNAPI.
45
A genética reversa é uma ferramenta importante para estudar a função gênica
e a replicação dos bunyavírus. Esta tecnologia tem sido usada para caracterizar o
papel da proteína NSs durante o ciclo replicativo de vários vírus incluindo o VBUN,
VRFV e o VLAC (Streitenfeld et al., 2003; Weber et al., 2002; Billecocq et al., 2004;
Blakqori et al., 2007). O papel da outra proteína não estrutural, NSm, na apoptose e
na montagem do vírus tem sido estudado usando o VRVF e o VBUN geneticamente
modificados, respectivamente (Won et al., 2007; Shi et al., 2006).
A facilidade para manipular o genoma viral também permitiu a fusão de
marcadores, como o marcador V5 ou a proteína fluorescente eGFP, em diferentes
proteínas virais. Além disso, a localização celular de proteínas virais pode ser
definida utilizando-se microscópio confocal (Brennan et al., 2011; Shi & Elliott, 2009)
ou imagem de células in vivo (Shi et al., 2010).
A manipulação das RNC resulta em vírus atenuados tanto em células quando
em camundongos, no entanto, mais estudos devem ser feitos para melhor
compreensão do potencial desses vírus como unidades para fabricação de vacinas
(Lowen et al., 2005), como o estudo com o VRVF recombinante que não continha as
regiões codificantes das proteínas não estruturais, NSm e NSs, e foi observado que
esse vírus recombinante conferia imunidade em camundongos e em ovelhas após
inoculação com esse vírus recombinante (Bird et al., 2012; Bird et al., 2008).
Recentemente, a genética reversa tem sido usada para construir vírus atenuados
que possam atuar como potenciais unidades de vacinas.
46
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Desenvolver um sistema de genética reversa para o vírus Oropouche.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Construir o sistema de minireplicon para VORO.
- Observar e analisar o padrão de expressão das proteínas codificadas pelo
segmento S (N e NSs) do VORO in vitro.
- Observar e analisar o padrão de expressão das proteínas codificadas pelo
segmento M (Gn, Gc e NSm) do VORO in vitro.
- Observar e analisar o padrão de expressão das proteínas codificadas pelo
segmento L (L) do VORO in vitro.
-Investigar o papel da proteína não-estrutural NSs na replicação do VORO em
cultivos celulares.
47
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. CULTIVO CELULAR E PROPAGAÇÃO DO VÍRUS
3.1.1. Cultivos de células BSR-T7/5
As células BSR-T7/5 são oriundas de cultivos de células BHK-21 transgênicas
que expressam constitutivamente o fago RNA polimerase T7. Estas células foram
gentilmente doadas por Klaus Conzelmann (Conzelmann, K.K, et al., 1999). As
monocamadas celulares foram mantidas em garrafas de cultivos celulares de
tamanho médio (75 cm2), grande (125 cm2) ou placas de cultivos de seis ou doze
poços contendo meio “Dulbecco´s modified Eagle´s medium” (DMEM-) com 10% de
NaHCO3, 100 mM de piruvato de sódio, 250 mM de glutamina e 1 M de NaOH
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) e antibióticos (50 E/mL de
penicilina e 50 µg/Ml de estreptomicina. Além disso, foi adicionado ao meio celular 1
µg/mL do antibiótico seletivo geneticina (G418-Life Technologies).
As células foram incubadas a 37ºC na presença de 5% de CO2. A passagem
de células foi realizada regularmente utilizando-se Tripsina/EDTA, no entanto, antes
da tripsinização, a monocamada celular foi lavada com tampão fosfato (PBS) com
volume de 3 mL ou 5 mL para as garrafas médias ou grandes, respectivamente.
Após adição da tripsina, os cultivos foram incubados por até 20 minutos para
dissociar as células das superfícies das garrafas. Para remoção da Tripsina/EDTA, a
mistura foi centrifugada por 3000 rpm, 5 minutos. O “pellet” celular foi ressuspendido
em um novo meio DMEM suplementado com SBF e 1/8 das células foram
transferidas para uma nova garrafa.
3.1.2. Preparação de Estoque Viral
Para preparar o estoque do VORO, células BHK-21 foram cultivadas em
frascos de 75 cm2 até atingirem 70% de confluência. Em seguida, lavadas com PBS
para retirar resquícios na monocamada celular de SBF. As células foram infectadas
com VORO a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 por 1 hora a 37ºC e 5%
de CO2. O meio foi trocado por meio DMEM contendo 10% de SBF e as células
48
foram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 por 48 a 72 horas, até a observação do
ECP. Os sobrenadantes foram coletados em tubos Falcon de 50 mL (Becton
Dickinson) e centrifugados por 3000 rpm a 4ºC para remoção de debris celulares.
Alíquotas do estoque viral foram estocadas a -70ºC.
3.1.3. Infecção viral
A infecção do VORO a determinados MOI foi realizada em meio DMEM sem
SBF. Antes de qualquer infecção, os cultivos celulares foram lavados com PBS para
remoção de resquícios de soro. A diluição viral de 200 µL foi adicionada as
monocamadas celulares. Estas foram incubadas por 1 hora a 37ºC e 5% de CO2
sendo gentilmente agitadas por 15 minutos. O inóculo foi removido e o meio DMEM
sem SBF foi adicionado a células em que foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2 por
tempo determinado de acordo com cada experimento.
3.2. IMUNOFLUORESCÊNCIA
Células subconfluentes cresceram em lamínulas colocadas em placas de 24
poços. Estas células foram transfectadas com plasmídeos de expressãoe também
células não transfectadas foram obtidas como controle negativo, não foram
transfectadas. Após 24 horas de transfecção, as células foram fixadas com 3% de
paraformaldeído por 5 minutos seguido de três etapas de lavagem com PBS. As
células foram permeabilizadas através da incubação com Triton X-100 (Sigma) a
0,5% em PBS por 5 minutos e, depois, lavadas 3 vezes com PBS para completa
remoção do detergente. As células foram incubadas com anticorpo primário
específico para o VORO. Os anticorpos foram diluídos 1:200 a 1:1000 em PBS
contendo 1% de SBF para atuar como bloqueador. Após 1 horas de incubação a
temperatura ambiente (TA), as células foram lavadas três vezes com PBS com 1%
de SBF para remover anticorpos primários que se ligaram inespecificamente.
Depois, as células foram incubadas com anticorpos secundários espécie-específico.
Estes continham fluorôcromos ligados covalentemente que foram diluídos de 1:50 a
1:200 em PBS com 1% de SBF. Para corar o DNA foi utilizado o corante DAPI
(1:500) incluído na mix com anticorpo secundário. As células foram incubadas com
49
anticorpo secundário por 1 hora e lavadas três vezes com PBS. Em seguida, as
células foram lavadas uma vez com água deionizada, as lamínulas onde se
depositavam as células foram enxutas e montadas em lâminas para observação em
microscópio com uma gota de meio para montagem (Fluorsave; Calbiochem). A
lâmina foi observada ao microscópio confocal Leica TCS SP2.
3.3. DNA PLASMIDIAL
3.3.1. Plasmídeos Usados no Estudo
Os plasmídeos pTVT7-OROV-S, pTVT7-OROV-M, pTVT7-OROV-L e pTVT7-
OROV-delNSs foram usados como modelo para amplificação do genoma viral, como
também, para subclonagem do inserto em outro plasmídeo, no caso o vetor de
expressão, pTM1. Outros plasmídeos foram construídos no laboratório de Biologia
Estrutural e Molecular da Universidade de St. Andrews, Escócia (Quadro 3).
Quadro 3- Descrição dos plasmídeos utilizados e construídos para a realização do
estudo em genética reversa do VORO
Plasmídeos Descrição
pTM1-OROV-L (A)
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região
codificante do segmento L do OROV (TRVL 9760). Este
plasmídeo foi construído no Laboratório de Virologia
Molecular do grupo do Dr. Manfred, Universidade de
Gottigen, Alemanha.
pTM1-OROV-L
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região
codificante do segmento L do OROV (BeAn 19991). Este
plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews.
pTM1-OROV-M
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região
codificante do segmento M do OROV (BeAn 19991). Este
plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews.
pTM1-OROV-S
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém a região
codificante do segmento S do OROV (BeAn 19991). Este
plasmídeo foi construído na Universidade de St. Andrews.
pTM1-OROV-N (A)
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém o gene da
nucleoproteína do OROV (TRVL 9760). Este plasmídeo foi
construído no Laboratório de Virologia Molecular do grupo
50
do Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha.
pTM1-OROV-N
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém o gene da
nucleoproteína do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi
construído na Universidade de St. Andrews.
pTM1-OROV-NSs
Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES. Contém o gene da
proteína NSs do OROV (BeAn 19991). Este plasmídeo foi
construído na Universidade de St. Andrews.
pTM1-FF-Luc Ampr, promotor T7-Pol, EMCV IRES.
pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL
Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta.
Plasmídeo minireplicon contendo o gene da Renilla
Luciferase flanqueado pela sequência regulatória do
quimérica do segmento M do VORO (TRVL 9760). Por
quimérica entenda que as primeiras 30 bases da região não
codificante do terminal 5’ foi oriunda da cepa TRVL 9760 do
VORO e o restante da sequência oriunda da cepa BeAn
19991. A sequência do terminal 3’ foi oriunda
completamente da cepa TRVL 9760. Este plasmídeo foi
construído no Laboratório de Virologia Molecular do grupo
do Dr. Manfred, Universidade de Gottigen, Alemanha.
pTVT7-OROV-M-Renilla (A)
Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta.
Plasmídeo minireplicon contendo o gene da Renilla
Luciferase flanqueado pela sequência regulatória do
segmento M do VORO (BeAn 19991). Este plasmídeo foi
construído na Universidade de St. Andrews.
pTVT7-OROV-S
Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta. Contém
a sequência regulatório 3’ e 5’ do segmento S do VORO
(BeAn 19991).
pTVT7-OROV-M
Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta. Contém
a sequência regulatório 3’ e 5’ do segmento M do VORO
(BeAn 19991).
pTVT7-OROV-L
Ampr, promotor T7-Pol, ribozima da Hepatite Delta. Contém
a sequência regulatório 3’ e 5’ do segmento L do VORO
(BeAn 19991).
Legenda: pTM1-OROV-L (A) e L/pTVT7-OROV-L: expressa a polimerase viral L; pTM1-OROV-M e
pTVT7-OROV-M: expressa as glicoproteínas, Gn, Gc e a proteína não estrutural, NSm; pTM1-OROV-
S: expressa a nucleoproteína, N e a proteína não estrutural, NSs; pTM1-OROV-N (A) e N: expressa
somente a nucleoproteína, N; pTM1-OROV-NSs: expressa somente a proteína não estrutural, NSs;
pTVT7-OROV-M-Renilla (A) e pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL: Expressa a proteína repórter Renilla;
pTM1-FF-Luc: expressa a proteína repórter Fifefly Luciferase.
51
3.3.2. Amplificação do DNA Plasmidial
Para amplificação do DNA plasmidial, bactérias Escherichia coli (E.coli), cepa
JM109, foram mantidas em 5 mL de meio Luria-Bertani (LB) contendo 10 g/L de
bacto-triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, pH 7,5 ou plaqueadas
em meio LB sólido suplementado com 1,5% de ágar. O meio foi suplementado com
ampicilina (100 µ/mL) para seleção.
3.3.3. Preparação de Bactérias Competentes
As bactérias competentes foram preparadas usando o kit “Z-Competent
Escherichia.coli (E.coli) Transformation kit” (Zymo Research). Um volume de 50 mL
de meio SOB foi inoculado em 500 µL de cultivo de E.coli overnight e incubado a
30ºC a 200 rpm em um agitador orbital até que OD560 atingisse 0,4-0,6. O cultivo
bacteriano foi incubado no gelo por 10 minutos e depois centrifugado por 6 minutos
a 3000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido
em 5 mL em tampão previamente congelado. Em seguida, o cultivo foi centrifugado
e finalmente ressuspendido em 5 mL de tampão competente (Zymo Research).
Alíquotas de 0,2 mL do cultivo bacteriano foram estocadas a -70ºC.
3.3.4. Transformação das Bactérias Competentes E.coli
Para transformar as bactérias E.coli JM109, 50-100 ng de DNA plasmidial foi
adicionado a 100 µL de células competentes e espalhados ao meio LB contendo
ampicilina. A reação foi homogeneizada e incubada por 30 minutos no gelo. Após a
incubação, o volume total da reação de transformação foi plaqueado em meio ágar
pré-aquecido a 37ºC contendo ampicilina por 12-16 horas.
3.3.5. Preparação do DNA Plasmidial
Para a preparação de pequenas quantidades de DNA plasmidial (~20 µg) foi
coletada uma única colônia de células E.coli transformadas e, em seguida, foram
52
cultivadas em 10 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 µg/mL),
incubadas a 37ºC overnight a 200 rpm em um agitador orbital. O sedimento de 3 mL
das células cultivadas overnight foi usado para isolar o DNA plasmidial usando o kit
QIAprep Spin Miniprep Kit (QUIAGEN) tanto manualmente ou usando o
equipamento QIACube de acordo conforme o protocolo do fabricante. O DNA foi
diluído em 50 µL de água.
Para a preparação de grandes quantidades de DNA plasmidial (>100 µg), 50
mL de células bacterianas foram cultivadas durante a noite a 37ºC em um agitador.
O DNA foi extraído utilizando-se o kit QUIAGEN Plasmid Maxi Kit de acordo com as
instruções do fabricante.
3.3.6. Determinação da Concentração do DNA
A quantidade de DNA utilizado foi determinada pela medição da absorbância
(Abs260) utilizando-se o espectofotômetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific). A
pureza da amostra de DNA foi estimada pelo cálculo da razão entre Abs260/Abs280.
Valores de razão maiores que 1,8 foram considerados aceitáveis.
3.4. MANIPULAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL
3.4.1. Oligonucleotídeos sintéticos
Para a construção dos minireplicons, utilizou-se o conjunto de
oligonucleotídeos desenhados com base na sequência da cepa BeAn 19991 do
VORO empregando no programa computacional descrito na seção 3.4.3 (Quadros 4
e 5).
Quadro 4- Oligonucleotídeos utilizados para construção do minireplicon do VORO
Oligonucleotídeo Sequência (5’ 3’)
OROVM-REN-FW1
TTATTTATATGAATTTTATTTATACCTGATTTTAGACCTGCCTACCCTTTTTAGCCAAATTTACTGCTCGTTCTTCAGCA
OROVM-REN-RV1 TGCTACCGGCAACAAACAGTGACAATGGCTTCCAAGGTGT
53
ACGA
OROVM-REN-RV2 GACAGAGAAGACATACCCAGTAGTGTGCTACCGGCAACAA
ACAGTGA
OROVM-REN-FW2g GACAGAGAAGACGTTATAGAGTAGTGTGCTACCGACAACA
ATTTTTGACTTTATTTATATGAATTTTATTTATA
OROVM-REN-FW2a GACAGAGAAGACGTTATAAGTAGTGTGCTACCGACAACAAT
TTTTGACTTTATTTATATGAATTTTATTTATA
OROV-N-SUB-FW-ORF ACGTAGTCGTCTCCCATGTCAGAGTTC
OROV-N-SUB-RV-ORF TGCTGATGAGCTCCTATATGTCAATTCCG
OROV-N-SUB-FW ACGTAGTCGTCTCCCATGGAGTAGTGTGC
OROV-N-SUB-RV TGCTGATGAGCTCAGTAGTGTG
pTM1-OROVS-FW-1409
AAACACGATAATACCATGTCAGAGTTCATTTTCAACGATGTACCAC
pTM1-OROVS-RV-2096 CTATATGTCAATTCCGAATTGGCGCAAGAAGTCTCTTGCTGC
pTM1-OROVM-FW-1409 AACACGATAATACCATGGCGAATTTAATAATTATTTCAATGGTTC
pTM1-OROVM-RV-5663 CTACTTGATTTTCTGCTCCATGGCATATTCTATTTCATGTCTGATT
pTM1-OROVL-FW-1409 AAAACACGATAATACCATGTCACAACTGTTGCTCAACCAATATCG
pTM1-OROVL-RV-8159 TACAAATTCTGCCAATGATCTTTTCTCATTTTTCATACACTC
Legenda: OROV: vírus Oropouche; pTM1: plasmídeo de expressão; L: segmento L; M: segmento M;
N: segmento N; S: segmento S; REN: Renilla; FW: “forward”; RV: “reverse”; ORF: “open reading
framing”.
Os plasmídeos construídos foram nomeados da seguinte forma: pTM1-
OROV-L (expressa a polimerase viral L), pTM1-OROV-M (expressa as
glicoproteínas, Gn, Gc e a proteína não estrutural, NSm), pTM1-OROV-S (expressa
a nucleoproteína, N e a proteína não estrutural, NSs), pTM1-OROV-N (expressa
somente a nucleoproteína, N) e pTM1-OROV-NSs (expressa somente a proteína
não estrutural, NSs). Os oligonucleotídeos foram desenhados a partir das
sequências publicadas no site do Genbank com os seguintes números de acesso:
54
NC_005777.1 (segmento S), NC_005775.1 (segmento M) e NC_005776.1
(segmento L), ver quadro 5.
Quadro 5- Oligonucleotídeos desenhados para amplificação dos genes dos
segmentos S, M e L.
Segmento Nº Genbank Comprimento
(nt)
Genes clonados Oligonucleotídeos*
L NC_005776.1 6846 RNA
Polimerase (L)
pTM1OROVL.1409.FW
pTM1OROVL.8159.RV
M NC_005775.1 4385 Proteínas Gn,
Gc e NSm
pTM1OROVM.1409.FW
pTM1OROVM.5663.RV
S NC_005777.1 754 Nucleoproteína
N e proteína
não estrutural
NSm
pTM1OROVS.1409.FW
pTM1OROVS.2096.RV
S NC_005777.1 754 Nucleoproteína
N
pTM1OROVS.1409.FW
pTM1OROVS.2096.RV
S NC_005777.1 754 Proteína não
estrutural NSs
OROV-NSs-FW-2
OROV-NSs-RV-2
*Para ver as sequências dos oligonucleotídeos utilizados ver quadro 4 3.4.2. Subclonagem do DNA Plasmidial do VORO
Para a subclonagem de fragmentos de DNA do VORO foi utilizado o kit In-
Fusion HD Cloning Kits (Clontech) de acordo com o protocolo do fabricante
(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Kits/
Cloning_Kits-HD-Liquid). O kit “In-Fusion HD Cloning”-Clontech foi utilizado para
clonar os genes L, M, S, N e NSs do VORO. Este protocolo contém a enzima In-
Fusion que liga fragmentos de DNA, para isso as sequências geradas de PCR e
vetores linearizados são reconhecidos precisamente e eficientemente por
sequências que se sobrepõem com tamanhos de 15 pb cada em suas sequências
terminais. Esta sequência de 15 pb foi construída através do desenho de
oligonucleotídeos para amplificação da sequência dos genes do VORO (Fig. 7).
55
Desenho primer gene-específico com 15 pb de extensão homólogas as sequências terminais do vetor (pTM1r)
15 pb
15 pb
Amplificação do gene de interesse (VORO-L, M, S, N e NSs)
OU
Produto do PCR
Adiciona-se 2 µL de “Cloning Enhancer” a 5 µL do Produto de PCR e incubar a 15
minutos a 37ºC, 15 minutos a 80ºC
Purifica-se o gel
Reação do kit “In-Fusion cloning”
Geração de um vetor linearizado
Transformação em bactérias competentes com a reação anterior
Busca por clones
2 µL 5X InFusion-Enzyme Premix x µL Vetor Linearizado x µL do Inserto x µL de água deionizada Volume total: 10 µL
Incubação da reação de clonagem
15 minutos a 50ºC
Figura 7- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol. A figura ilustra a clonagem dos genes L, M, S, N e NSs do VORO através da utilização do kit “In-Fusion HD Cloning”. O desenho de oligonucleotídeos contendo a sequências com tamanho de 15 pb, os quais fazem sobreposição com os terminais de cada sequência, foi essencial para o sucesso da clonagem dos genes do VORO de interesse no plasmídeo pTM1. Após incubação, screening de no máximo 24 colônias colhidas do cultivo bacteriano foram realizados, á 37ºC. Após purificação, análises com enzimas de restrições e sequencimento foram realizadas para determinar se o inserto contendo o gene de interesse foi corretamente inserido ao vetor pTM1.
56
3.4.3. Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR)
O PCR foram realizados utilizando-se a polimerase com atividade revisora
“KOD hot start polymerase” da marca Merck. As reações de PCR foram realizadas
de acordo com as instruções do fabricante utilizando tubos de 0,5 mL em volumes
específicos para serem utilizados em termocicladores, Em resumo, o mix de PCR foi
composto por 1X do tampão da polimerase KOD Hot Start, 1,5 mM de MgSO4, 0,2
mM de cada dNTP, 0,3 µM de iniciador na direção senso, 0,3 µM de iniciador na
direção anti-senso e 0,02 U/mL da polimerase KOD Start. A amostra de DNA foi
adicionada a um volume final de 50 µL de água (Quadro 6). De acordo com o
protocolo do fabricante, a polimerase KOD Start foi adicionada ao final do primeiro
passo de desnaturação. Os ciclos de PCR foram realizados conforme descrito no
Quadro 7. O PCR padrão e os ciclos foram realizados de acordo com os Quadros 8
e 9.
Quadro 6- Reação padrão para o kit KOD hot start polymerase (Merck) (volume de
reação para 50 µL):
Tampão 10X 5 µL
dNTPs (10 mM cada) 5 µL
Mg2SO4 2,5 µL
Amostra (10-50 ng) X µL
Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL
Oligonucleotídeo reverse (20 µM) 1,25 µL
Polimerase KOD (1 U/µL) 1 µL
Adição de H2O (volume final: 50 µL) Y µL
Quadro 7- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR
Ativação da polimerase 95ºC 2 min
Desnaturação 95ºC 30 segundos
Anelamento Ajuste aos iniciadores 30 segundos 18-40ciclos
Extensão 70ºC 30 segundos/kb
Extensão final 70ºC 10 minutos
“Hold” 10ºC ∞
57
Quadro 8- Reação padrão para o kit GoTaq DNA polymerase (Promega) (volume de
reação para 50 µL):
Tampão 5X (verde ou sem cor) 10 µL
dNTPs (10 mM cada) 1 µL
Amostra (10-50 ng) X µL
Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL
Oligonucleotídeo reverse (20 µM) 1,25 µL
Go Taq Polimerase (5 U/µL) 0,25 µL
Adição de H2O (volume final: 50 µL) Y µL
Quadro 9- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR (GoTaq polimerase)
Ativação da polimerase 95ºC 2 min
Desnaturação 95ºC 30 segundos
Anelamento Ajuste aos primers 30 segundos 25-35ciclos
Extensão 72ºC 30 segundos/kb
Extensão final 72ºC 10 minutos
“Hold” 10ºC ∞
3.4.4. Mutagênese Sítio Específica
O kit “QuickChange site-directed mutagenesis” foi utilizado para introduzir
mutação de ponto na sequência dos segmentos do VORO. Para isso, dois primers
complementares contendo a mutação desejada foram utilizados na reação de PCR.
O kit “KOD hot start polymerase” foi utilizado como DNA polimerase. Após a
transformação dos plasmídeos, a amostra foi tratada com a enzima DpnI para digerir
o plasmídeo metilado parental. Os plasmídeos recém-sintetizados não são
metilados, dessa forma, não são alvos da ação da enzima DpnI. Após a amplificação
e preparação do plasmídeo, o sequenciamento foi realizado para garantir a inserção
da mutação de ponto, conforme descritos nos quadros 10 e 11.
58
Quadro 10- Reação padrão para realização da mutação sítio-específica:
Tampão 10X 5 µL
dNTPs (10 mM cada) 5 µL
Mg2SO4 (25 mM) 2,5 µL
Amostra (10-50 ng) X µL
Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL
Oligonucleotídeo reverso (20 µM) 1,25 µL
polimerase KOD (1 U/µL) 1 µL
H2O destilada (volume final: 50 µL) Y µL
Quadro 11- Programa padrão dos ciclos para reação de PCR para realização da
mutação sítio-específica:
Tampão 10X 5 µL
dNTPs (10 mM cada) 5 µL
Mg2SO4 (25 mM) 2,5 µL
Amostra (10-50 ng) X µL
Oligonucleotídeo forward (20 µM) 1,25 µL
Oligonucleotídeo reverso (20 µM) 1,25 µL
Polimerase KOD (1 U/µL) 1 µL
H2O destilada (volume final: 50 µL) Y µL
3.4.5. Adição de Desoxiadenosina (DATP) no Produto de PCR e Clonagem T/A
Os fragmentos de DNA que foram gerados com polimerases “revisoras”
necessitam da adição de uma única desoxiadenosina logo ao final 3’ da sequência
amplificada para clonagem em vetores T/A. Para tal finalidade, o DNA amplificado foi
purificado com Taq polimerase, que contém a atividade terminal transferase. A
reação encontra-se sumarizada no quadro 12:
59
Quadro 12- Reação de adição de desoxiadenosina
Tampão Taq polimerase 10X 5 µL
Vetor DNA (PCR) 50 µL
dATP (5 mM) 5 µL
Taq DNA polimerase (0,5 U/ µL) 1 µL
A reação foi incubada por 15 minutos a 72ºC para logo depois ser utilizada na
clonagem T/A.
Em seguida, 1-2 µL do DNA foi clonado em vetores PGEM-T ou PGEM-T
Easy de acordo com as instruções do fabricante.
3.4.6. Digestão do DNA com Enzimas de Restrições
Digestões com enzimas de restrição foram realizadas em reações de 20 µL
de acordo com o protocolo das respectivas enzimas. Essas foram oriundas de
diferentes companhias, como Fermentas, New England Biolabs e Promega. Uma
reação final contendo 2 µL de tampão 10X, 1 µL de BSA, 1 unidade de enzima/ µg
de DNA foi utilizada além da adição de água para obtenção de um volume final de
20 µL. As reações foram incubadas a TA, 30ºC, 37ºC ou 55ºC de acordo com os
protocolos dos fabricantes.
3.4.7. Eletroforese em Gel de Agarose
O DNA foi separado em cubas horizontais de eletroforese contendo gel de
agarose com concentração variando entre 1-2% dependendo do tamanho dos
fragmentos de DNA. Os géis eram compostos por agarose (Invitrogen) em tampão
TAE, suplementado com 4 µg/mL de brometo de etídio. Os géis foram imersos em
tampão TAE 1X e as amostras misturadas com corante de corrida foram adicionadas
em cada poço do gel. As corridas foram realizadas a uma velocidade de 100 V por
30 a 60 minutos. Os fragmentos de DNA foram posteriormente visualizados em um
transiluminador de ultravioleta (260 nm) onde foi possível registrar os resultados por
fotoimagem.
60
3.4.8. Purificação do DNA em Gel de Agarose
Os produtos de DNA ou as reações de digestão por endonuclease foram
separados no gel de agarose, como descrito anteriormente. A banda contendo o
fragmento de DNA de interesse foi cortada do gel com auxílio de uma navalha. A
purificação do DNA foi realizada utilizando-se o kit “PCR purification kit” (Quiagen)
de acordo com o protocolo do fabricante.
3.4.9. Desfosforilação do Plasmídeo Linearizado
A enzima “Shrimp alkaline phosphatase” (SAP; Roche) foi utilizada para
remover a parte 5’ fosfatase do vetor plasmidial linearizado com a finalidade de
prevenir a recircularização durante a ligação das reações entre o vetor e o DNA
estudado. Dessa forma, o DNA plasmidial purificado e digerido (1-5 µg) foi incubado
em uma quantidade de 1 U de SAP por 1 hora a 37ºC no tampão de defosforilação
(Roche). A reação foi finalizada por uma segunda incubação por 15 minutos a 65ºC.
Os vetores defosforilados foram imediatamente usados para subsequente ligação.
3.4.10. Ligação dos Fragmentos de DNA
Moléculas de DNA recombinantes foram geradas pela formação de ligações
fosfodiésteres entre fragmentos de DNA utilizando-se a DNA ligase do bacteriófago
T4. (Invitrogen). Concentrações equimolares, como também, a razão 1:3, entre os
vetores e o inserto de DNA, foram misturadas em um volume total de 8 µL de água
destilada. As amostras foram incubadas por 5 minutos a 55ºC e novamente por 10
minutos a TA. Em seguida, 2 µL do tampão 5X e 0,5 U de DNA ligase T4 foram
adicionados. Após 30 minutos, a TA, as amostras foram incubadas a 16ºC
“overnight”. A reação foi interrompida por aquecimento por 5 minutos a 65ºC para
inativar a DNA ligase T4. Uma alíquota de 5 µL da reação de ligação foi
transformada em células competentes E.coli. Uma ligação mais rápida foi realizada
com a utilização do kit “Rapid Ligation kit” (Roche), que contém um tampão mais
específico e adequado para a enzima ligase.
61
3.5. INDUÇÃO DA FORMAÇÃO SINCICIAL EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM
GLICOPROTEÍNAS DO VORO POR MUDANÇA DE PH.
As células BHK-21 foram cultivadas em lamínulas para transfecção de 1 µg
de pTM1-VORO-M e 0,5 µg de pTM1-GFP. Após 16 horas pós-transfecção, o meio
DMEM foi trocado pelo tampão de fusão (10 mM de HEPES; 0,2% de SBF em
solução salina balanceada Earle’s-Sigma, pH 5,5) e incubados por 5 minutos a TA.
As células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas com meio DMEM contendo
10% de SBF a 37ºC. Após 4 horas, as células foram observadas ao microscópio de
epiluminescência para visualização da formação de sincício.
3.6. TRANSFECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO MEDIADA POR LIPOSSOMO
Este método foi utilizado para adicionar o DNA plasmidial nos cultivos
celulares. As células foram cultivadas em placas de 12 poços até atingir uma
confluência de 60-80% Duas soluções foram preparadas em meio (OptiMEM; Gibco)
sem SBF. Para a primeira solução, os ácidos nucléicos transfectados foram diluídos
em 125 µL de OptiMEM. A segunda solução consistia de 125 µL de OptiMEM
contendo 2 µL de agente de transfecção, lipofectamina (Life Technologies) para
cada µg de ácido nucléico. As duas soluções foram misturadas, brevemente
homogeneizadas e incubadas por 30 minutos a TA para formação dos lipossomos.
Durante a incubação, o meio da monocamada celular foi trocado por meio DMEM
sem SBF. O volume de 200 µL do transfectado foi adicionado cuidadosamente à
conta gotas em cada um dos 12 poços. O cultivo foi incubado em estufa a 37ºC por
24 horas para posterior leitura em espectofotômetro.
3.7. TESTE DE LUCIFERASE
O kit “Dual Luciferase Assay System” (Promega) foi utilizado para detecção
de luciferase, conforme recomendação do fabricante
(http://www.promega.com.br/protocols/techicalmanuals/0/dualluciferasereporter).
62
3.8. TESTE DE MINIREPLICON
O teste de minireplicon foi realizado de acordo com o Weber e colaboradores,
2001. As células BSR-T7/5 foram co-transfectadas com os plasmídeos de expressão
da nucleoproteína N e da proteína L do VORO, pTM1-OROV-N e pTM1-OROV-L e
com plasmídeos que codificavam a luciferase, o minigenoma. O plasmídeo pTM1-
FF-Luc, que expressava o gene da Firefly Luciferase sob o controle do promotor T7,
foi transfectados para servir como controle interno. Resumidamente, após
transfecção, o minigenoma foi transcrito pela polimerase T7 produzindo um
segmento de RNA parecido com o vírus. A proteína N encapsula o RNA genômico
para formar o complexo RNA-proteína N que foi reconhecido pela polimerase L. A
polimerase sintetizou o antigenoma e o RNA do modelo genômico. O RNAm da
proteína repórter Renilla Luciferase foram produzidos somente quando a
polimerase viral realizou a transcrição e replicação.
As células BSR-T7/5 foram cultivadas em placas de 12 poços (8 x 104
células/poço) ou em placas de 24 poços (4 x 104 células/poço). As transfecções
foram realizadas de acordo como descrito adiante, os plasmídeos foram
transfectados, nos poços de cultivo, em uma quantidade que variava de 200, 400,
600, 800 e 1000 ng/µL, dependendo do objetivo de cada teste. Após 24 horas de
transfecção, as células foram lisadas para ser realizado o teste de luciferase (Seção
3.7). O valor da Renilla do controle positivo foi considerado 100% em relação a
atividade de luz e todos os outros valores foram normalizados contra esse valor total
para ser calculado a porcentagem.
3.9. SEQUENCIAMENTO
O sequenciamento dos clones de DNA e dos produtos de PCR foi realizado
no laboratório “DNA Sequencing Service” da Universidade de Dundee, Escócia,
Reino Unido, como parte da atividade do Doutorado Sanduíche. O sequenciamento
foi realizado em ambos os sentidos, com os oligonucleotídeos específicos
anteriormente descritos (Quadro 4). O método descrito foi em reação em cadeia
(Sanger et al., 1977). O sequenciamento foi realizado em sequenciador automático
modelo ABI 3130 (Applied Biosystems).
63
3.10. EXTRAÇÃO DE RNA DE CULTIVOS CELULARES
O RNA total de células infectadas e não infectadas foi isolado utilizando o
reagente TriFast (Peqlab) de acordo com protocolo do fabricante. As células
cultivadas foram lisadas com 1 mL de Trifast, transferidas para um tubo de 1,5 mL e
incubadas por 5 minutos a TA. Em seguida, 0,2 mL de clorofórmio foram
adicionados, homogeneizado, sendo a mistura novamente incubada por 5 minutos.
Após incubação, a amostra foi centrifugada por 5 minutos a 12.000 rpm a 4ºC. A
parte aquosa foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, homogeneizada com 0,7
volumes de isopropanol e incubada por pelo menos 10 minutos a -80ºC para
precipitar o RNA. O RNA foi sedimentado por 10 minutos e centrifugado por 12.000
rpm a 4ºC e lavado duas vezes com etanol a 75%. O sedimento foi deixado a TA
para secagem, dissolvido em 50 µL de água para posterior quantificação de RNA em
espectofotômetro.
3.11. PREPARAÇÃO DO cDNA
O método utilizado foi usado para produzir a primeira fita de cDNA a partir do
RNA. Primeiro, 1 µg de RNA foi incubado com DNase I (Fermentas) para
degradação de possível contaminante DNA cromossomal. Para esta finalidade, foi
realizada a seguinte reação:
Tampão da reação 10X 1 µL
RNA purificado (1 µg) X µL
DNase I (1U) 1 µL
Adição água ao volume final de
10 µL
Y µL
A amostra foi incubada por 30 minutos a 37ºC. Em seguida, a reação foi
parada pela adição de 1 µL de EDTA (25 Mm) e aquecida a 65ºC por 10 minutos.
Hexanucleotídeos randômicos (100 ng) foram adicionados e anelados ao RNA a
65ºC por 5 minutos, seguido por 10 minutos de incubação a TA. A seguinte reação
foi realizada:
64
Tampão da reação 5X 4 µL
dNTP (10 mM) 2 µL
DTT(100 mM) 2 µL
Inibidor RNase (40 U) 1 µL
Depois de 2 minutos de incubação a 42ºC, foi adicionado a mistura 0,5 µL
(100 U) de “Superscript II reverse transcriptase” (Invitrogen). Após 1 hora de
incubação a 42ºC, a primeira fita de DNA foi terminada pelo aquecimento a 95ºC por
5 minutos. O cDNA foi estocado a -20ºC.
3.12. TRANSCRIÇÃO DO RNA IN VITRO
O DNA plasmidial foi digerido com as enzimas de restrições apropriadas
antes da síntese de RNA se nenhum sinal terminal T7 fosse verificado. Cada reação
de restrição foi composta pelos seguintes reagentes:
Tampão da reação 5X 10 µL
DNA plasmidial (2 µg) 10-20 µL
DTT(100 mM) 5 µL
BSA (10 mg/µL) 0,5 µL
Inibidor RNase (40 U) 1 µL
dNTP (10 mM) 10 µL
RNA polimerase T7 (2 U) 2 µL
Adicionar água até 50 µL
A reação foi realizada a 37ºC por 2 horas. Em seguida, 2 µL (2 U) de DNase I
foi adicionada para degradar o molde do DNA plasmidial. Após 15 minutos, foi
adicionada 500 µL de água e o RNA foi purificado, como descrito anteriormente.
65
Infecção dos cultivos celulares
Extração RNA viral
Síntese do cDNA
Construção dos plasmídeos
pTVT7- OROV-L/M/S/delNSs
PCR
VORO cDNA
EMCV-
IRES TT7 PT7
VORO cDNA
5’ 3’ pTM1
IRES T7
Inserto
Figura 8- Estratégia para construção dos plasmídeos de expressão do VORO transcritos por T7-Pol. O RNA foi isolado de cultivos celulares infectados com VORO (BeAN 19991). A primeira fita de cDNA foi construída a partir dos plasmídeos pTVT7-OROV-L/M/S previamente construídos e cedidos pelo Dr. Elliott da University of St. Andrews. PT7= Promotor T7, TT7= Terminador T7
66
4. RESULTADOS
4.1. ESTRATÉGIA DE CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO
CONTENDO OS GENES L, M E S DO VORO
4.1.1. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene L
Para construir os plasmídeos que expressavam a RNA polimerase viral L
foram utilizados os oligonucleotídeos, pTM1OROVL.1409.FW e
pTM1OROVL.8159.RV para amplificação do gene que codifica a proteína de
interesse. O plasmídeo modelo utilizado foi o pTVT7-OROV-L.
A amplificação da região codificante do fragmento L do VORO (6752 pb) foi
confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente
7000 pb foram observadas, tamanho este semelhante ao da região codificante do
gene L do VORO (Fig. 9). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do
sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão
pTM1-OROV-L, foi realizado uma busca de colônias bacterianas selecionadas após
incubação “overnight” e purificação, com as enzimas de restrição SalI e HindIIl nos
plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 10).
6752 pb
Figura 9- Amplificação do gene L do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene L do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximadamente 7000 pb.
67
(a)
(b)
(c) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Figura 10- Análise dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e HindIII dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-L. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, cinco fragmentos, entre 6041 a 401 pb, deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1-OROV-L com ambas as enzimas mencionadas. (b) Já para a incubação do plasmídeo controle, plasmídeo pTM1r-
sem inserto, com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas três bandas entre 3873 a 412. (c) As amostras selecionadas em caixa
brancas estão de acordo com a predição realizada pelo software tanto para os plasmídeos contendo o inserto (8, 10 e 12) quanto para o plasmídeo controle (13).
68
4.1.2. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene M
Para construir os plasmídeos que somente expressavam a poliproteína Gn,
Gc e a proteína não estrutural NSm foram utilizados os oligonucleotídeos,
pTM1OROVM.1409.FW e pTM1OROVM.5663.RV para amplificação do gene que
codifica as proteínas de interesse.
A amplificação da região codificante do fragmento M do VORO (4262 pb) foi
confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente
4250 pb foram observadas, tamanho este semelhante ao da região codificante do
gene M do VORO (Fig. 11). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do
sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão
pTM1-OROV-M, foi realizado uma busca de colônias bacterianas selecionadas após
incubação durante a noite e purificação, com as enzimas de restrição PmlI e Xbal
nos plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 12).
4262 pb
Figura 11- Amplificação do gene M do VORO por PCR de alta fidelidade.
Amplificação do gene M do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 4250 pb.
69
(a)
(b)
(c)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 10
Figura 12- Busca dos plasmídeos de expressão pela incubação com enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição PmlI e XbaI
dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-M. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, dois fragmentos, 4333 pb e 1026 pb, deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1-OROV-M com ambas as enzimas de restrição. (b) Controle pTM1-r sem inserto incubados com as mesmas enzimas
utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas duas bandas, 8455 pb, 1026 pb e 139 pb (Esta última não visível ao gel). (c) As bandas observadas estão de acordo
com a predição pelo software, Serial Cloner 2.5, tanto para os plasmídeos contendo o inserto (1-10) quanto para o plasmídeo controle (11).
70
4.1.3. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene N e NSs
Para construir os plasmídeos que expressavam a nucleoproteína N e a
proteína não estrutural NSs foram utilizados os oligonucleotídeos,
pTM1OROVS.1409.FW e pTM1OROVS.2096.RV para amplificação do gene S que
codifica as proteínas de interesse.
A amplificação da região codificante do fragmento S do VORO (695 pb) foi
confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente
700 pb foram observadas, tamanho este semelhante ao da região codificante do
gene S do VORO (Fig. 13). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do
sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão
pTM1-OROV-S, foi realizado um screening de colônias bacterianas selecionadas
após incubação overnight e purificação, com as enzimas de restrição SalI e Xbal nos
plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 14).
695 pb
Figura 13- Amplificação do gene S do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene S do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 695 pb.
71
(a)
(b)
(c)
1 2 3 4 5 6
Figura 14- Busca dos plasmídeos de expressão por enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e XbaI dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-S. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, dois fragmentos, 4011 pb e 1348 pb, deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1r-sem inserto com ambas as enzimas de restrição mencionadas anteriormente. (b) Já para a incubação do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-S, com as mesmas enzimas utilizadas, deveriam ser observadas duas bandas, 4011 pb e 2042 pb (c) Os tamanhos das bandas estão de acordo com a predição pelo
software, Serial Cloner 2.5, tanto para os plasmídeos contendo o inserto (2-6) quanto para o plasmídeo controle (1).
72
4.1.4. Construção do plasmídeo de expressão contendo apenas o gene N
Para construir plasmídeos que somente expressavam a nucleoproteína
VORO-N, a expressão da proteína não estrutural NSs no gene do plasmídeo pTVT7-
OROV-delNSs foi ab-rogada. Para isso, foram feitas três mudanças nucleotídicas no
começo da sequência do segmento VORO-S (nucleotídeo 24, T para C, nucleotídeo
69, T para C e nucleotídeo 72, G para A), ver figura 25. Estas mudanças foram
realizadas pelo kit de mutagênese (Fig. 15). A alteração não afetou a sequência
aminoacídica da proteína N. O plasmídeo recém-construído foi designado pTM1-
OROV-N.
Figura 15- Construção do plasmídeo de expressão da nucleoproteína N do
VORO-pTM1-OROV-N. O produto do PCR que contém alterações nucleotídicas codificadas pelo oligonucleotídeos desenhados na região de sobreposição entre os genes N e NSs foram gerados utilizando-se os pares de oligonucleotídeos pTM1OROVS.1409.FW/pTM1OROVS.2096.RV indicados pelas cabeças de setas e o plasmídeo pTVT7-OROV-delNSs como template. PT7= Promotor T7 e TT7= Terminador T7.
Clonagem em pTM1
pTM1-OROV-N
pTVT7-OROV-delNSs
ACG
PCR
C…A
TT7
NSs
N
PT7
IRES
TT7
N
IRES
PT7
73
A amplificação da região codificante do fragmento N do VORO (695 pb) foi
confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente
700 pb foram confirmadas. Este tamanho foi semelhante ao da região codificante do
gene S do VORO (Fig. 16). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do
sequenciamento da amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão
pTM1-OROV-N, foi realizada análise de colônias bacterianas selecionadas após
incubação overnight e purificação, com as enzimas de restrição HindIII e SalI nos
plasmídeos construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 17).
695 pb
Figura 16- Amplificação do gene N do VORO por PCR de alta
fidelidade. Amplificação do gene N do VORO por PCR de alta
definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 695 pb.
74
(c)
(a)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
(b)
Figura 17- Busca dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição SalI e
HindIII dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-N. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, três fragmentos, 3873 pb, 1074 pb e 412 pb deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1r-sem inserto com ambas as enzimas de restrição. (b) Já para a incubação do
plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas duas bandas de 3873 pb e 1106 pb de acordo com o software (c) Os tamanhos das bandas estão de acordo com a predição pelo software tanto para os plasmídeos contendo o inserto (1-12) quanto para o plasmídeo controle (13).
75
4.1.5. Construção do plasmídeo de expressão contendo o gene NSs
Para construir plasmídeos que somente expressavam a proteína não
estrutural NSs do VORO foram utilizados os oligonucleotídeos OROV-NSs-FW-2 e
OROV-NSs-RV-2 para amplificação do gene NSs que codifica a proteína de
interesse. O plasmídeo modelo utilizado foi, anteriormente construído, pTM1-OROV-
S em que não houve ab-rogação do gene NSs (Fig. 18).
ATG
pTM1-OROV-NSs
pTM1-OROV-S ATG
PCR
TT7 PT7
NSs
N
IRES
Clonagem em pTM1
TT7 PT7
NSs
IRES
Figura 18- Construção do plasmídeo de expressão da proteína não estrutural NSs do VORO-pTM1-OROV-NSs. O produto do PCR foram gerados utilizando-se os pares de oligonucleotídeos OROV-NSs-FW-2 e OROV-NSs-RV-2 indicados pelas cabeças de setas e o plasmídeo pTM1-OROV-S como template. PT7= Promotor T7 e TT7= Terminador T7.
76
A amplificação da região codificante do fragmento NSs do VORO foi
confirmada pelo produto do PCR de alta fidelidade. Bandas de aproximadamente
300 pb foram observadas. Este tamanho foi condizente com o tamanho da região
codificante do gene NSs do VORO, a qual traduz a NSs e abrange 275 nucleotídeos
(Fig. 19). Com objetivo de confirmar, juntamente com análise do sequenciamento da
amostra, o sucesso na construção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-NSs, foi
realizado um screening de colônias bacterianas selecionadas após incubação
overnight e purificação, com as enzimas de restrição PstI e Xbal nos plasmídeos
construídos e no plasmídeo controle pTM1r-sem inserto (Fig. 20).
275 pb
Figura 19- Amplificação do gene NSs do VORO por PCR de alta fidelidade. Amplificação do gene NSs do VORO por PCR de alta definição gerou uma banda com tamanho de aproximado a 275 pb.
77
(b)
(a)
(c)
Figura 20- Busca dos plasmídeos de expressão após incubação com enzimas de restrição. (a) Antevisão da digestão com as enzimas de restrição
SalI e HindIII dos possíveis plasmídeos de expressão pTM1-OROV-NSs. De acordo com a análise no programa Serial Cloner 2.5, dois fragmentos, 4039 pb e 1320 pb deveriam ser observados após incubação do plasmídeo pTM1r-sem inserto com ambas as enzimas de restrição. (b) Já para a incubação do
plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, com as mesmas enzimas utilizadas anteriormente, deveriam ser observadas uma banda de 5633 pb (c) Os
tamanhos das bandas estão de acordo com a predição pelo software tanto para os plasmídeos contendo o inserto (1-12) quanto para o plasmídeo controle (13).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
78
4.2. CONSTRUÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO
A atividade das proteínas recombinantes do VORO foi analisada pelas suas
habilidades em inicializar a transcrição e replicação do minireplicon. Os minireplicons
gerados no estudo foram transcritos pela polimerase celular T7 que continha o gene
repórter Renilla luciferase. O minireplicon do VORO foi construído em dois passos.
Primeiramente, o gene repórter foi amplificado por PCR de alta resolução de um
plasmídeo modelo, pHRL-CMV, para depois ser fusionado com a região consenso
da região não codificante do segmento M do VORO. O minireplicon construído foi
designado pTVT7-OROV-M-Renilla (Fig. 21).
Renilla Luciferase
BbsI ECORV
VORO-M-5’RNC VORO-M-3’RNC
Renilla Luciferase
PCR 1
OROVM-REN-FW2g
OROVM-REN-RV2
PCR 2
pHRL-CMV Renilla Luciferase
OROVM-REN-RV1
OROVM-REN-FW1
T7 T pol-I
pTVT7-OROV-M-Renilla
Renilla Luciferase VORO-M-3’RNC VORO-M-5’RNC
Clonagem em pTVT7
Figura 21- Geração do minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla. O gene repórter da Renilla Luciferase foi amplificado do plasmídeo modelo pHRL-CMV usando-se os oligonucleotídeos OROVM-REN-FW1 e OROVM-REN-RV1. O produto do primeiro PCR serviu como modelo para o segundo PCR o qual foram utilizados os oligonucleotídeos, OROVM-REN-FW2 e OROVM-REN-RV2, para introduzir no gene Renilla com RNAc do segmento M e os sítios de restrição ECORV. O produto final foi clonado no plasmídeo pTVT7 no sítio restrição BbsI e ECORV.
79
4.3. RECONSTITUIÇÃO IN VIVO DE RIBONUCLEOPROTEÍNAS
RECOMBINANTES
A atividade dos genes L e N, como também, dos genes S, NSs e M, em
experimentos divergentes, do VORO foi testada no sistema de minireplicon. Para
conseguir este objetivo, os plasmídeos que expressavam os genes L e N foram co-
expressos com um plasmídeo-minireplicon que continha o gene repórter no sentido
genômico (pVT7-OROV-M-Renilla). Os transcritos de sentido negativo construídos
deste plasmídeo não são traduzidos, dessa forma, o RNAm do gene Renilla
Luciferase no sentido positivo foi exclusivamente gerado pelo complexo de
polimerase recombinante do VORO e a quantidade de proteínas traduzidas do gene
repórter refletiu na atividade da reconstituição de ribonucleoproteínas virais. A
expressão do T7-Pol, que é necessária para a síntese do RNAm viral, foi gerada
pela linhagem celular, BSR-T7/5, que expressa constitutivamente o fago RNA
polimerase T7. O esquema abaixo mostra o resumo do sistema de minireplicon do
VORO (Fig. 22).
pTM1-OROV-L pTM1-OROV-N
pTVT7-OROV-M-Renilla
1
BSR-T7/5
T7-Pol
RENv
RNAm Ren
Teste de Luciferase
2
3 4
5
6
7
8
L+N OROV-RENc
Núcleo
Figura 22- Esquema e função do sistema de minireplicon do VORO. 1. Tranfecção das células BSR-T7/5 com plasmídeos de expressão e minigenoma do VORO. 2+3. Expressão das proteínas L e N mediada pela enzima T7-Pol no citoplasma. 4. Transcrição do minireplicon do VORO. 5+6. Replicação e Transcrição da ribonucleoproteína- Renilla reconstituídas pelas proteínas virais levando a síntese do RNAm da Renilla Luciferase. 7. Síntese da proteína Renilla Luciferase. 8. As células foram lisadas e a atividade da luciferase quantificada em experimentos in vitro.
80
4.4. COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE DO GENE REPÓRTER ENTRE DIFERENTES
SISTEMAS DE MINIREPLICON DO VORO
Antes da análise da atividade do minigenoma do VORO pela co-transfecção
dos plasmídeos de expressão, pTM1-OROV-L/M/S/N e NSs e do minireplicon pTV7-
OROV-M-Renilla construídos neste trabalho, foi realizada a comparação na
atividade do gene repórter da Renilla luciferase de diferentes sistemas de
minigenoma do vírus em estudo. Os plasmídeos usados para esta finalidade foram
anteriormente construídos pelo Laboratório de Biologia Molecular de vírus de RNA
de sentido negativo (LBMVRSN) da Universidade de St. Andrews, Escócia, como
também, pelo Departamento de Virologia da University Medical Center Gottingen,
Alemanha.
As células BSR-T7/5 foram co-transfectadas com os plasmídeos L, S, N e
com dois distintos sistemas de minireplicon do VORO, pTVT7-OROV-M-Renilla
(construído em St. Andrews) e pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (construído na
Alemanha) (Quadro 3). O controle negativo foi representado pela co-transfecção dos
plasmídeos N e minireplicon do VBUN e o controle positivo foi representado pela co-
transfecção dos plasmídeos de expressão L, N e minigenoma do VBUN.
A figura 23 mostra que a co-transfecção das células BSR-T7/5 com os
plasmídeos suporte, pTV7-OROV-N, pTV7-OROV-L e minireplicon do VORO,
pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (Gráfico: coluna 4) resultou em um aumento de
185,4% da atividade da transcrição do gene repórter, Renilla comparada a atividade
observada na co-transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos controle.
Em relação às outras combinações de plasmídeos, a atividade da transcrição do
gene repórter, Renilla, foi equivalente à observada ao resultado do controle negativo,
que no caso, a omissão da expressão do plasmídeo L aboliu completamente a
atividade repórter da proteína.
81
Plasmídeos-Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7
pT7ribo BUNV-M (500) + +
pTM1-BUNV-N (500) + +
pTM1-BUNV-L (500) +
pTVT7-OROV-M-Renilla (500) + +
pTVT7-OROV-S (300) + +
pTVT7-OROV-L (1000) + +
pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL + + +
pTM1-OROV-N (A) (300) + + +
pTM1-OROV-L (A) (1000) + + +
Figura 23- Comparação da atividade do gene repórter entre dois sistemas de minireplicon
distintos. As células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão dos segmentos L e N e minireplicon do VORO oriundos de fontes distintas. 1. Controle negativo. 2. Controle positivo. 3-7: comparação da atividade do gene repórter, Renilla, entre diferentes combinações com posterior co-transfecção dos plasmídeos suporte. média ± DPM (desvio padrão da média)
82
4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA
NUCLEOPROTEÍNA N DO VORO
A construção do plasmídeo que expressava a nucleoproteína N do VORO foi
realizada de acordo com o esquema da figura 15 representado anteriormente. Ao
final do cultivo de E.coli da linhagem JM109, após 18 horas de incubação a 37ºC,
onze colônias dessas células contendo ou não o inserto de interesse foram
selecionadas para serem purificadas e extraídos os plasmídeos de expressão da
nucleoproteína N. Estes plasmídeos foram denominados pTM1-OROV-N-1 a 11.
A figura 24 mostra a porcentagem da atividade da Renilla após co-transfecção
do plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-L (A), minireplicon pT7riboSM2-OROV-
vMpro-vRL com os respectivos plasmídeos de expressão da nucleoproteína N
recém-construídos, pTM1-OROV-N-1 a 11. Para este experimento foi considerado o
controle positivo a co-transfecção dos plasmídeos de expressão L, N e minigenoma
do VBUN.
A co-transfecção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N-1 levou a uma
diminuição de 40% na atividade do gene repórter Renilla comparado ao sistema de
minigenoma do VBUN. Em relação aos outros plasmídeos de expressão, pTM1-
OROV-N-2 a 11, a atividade da Renilla teve uma taxa de aumento entre 11 a 60%
comparado ao controle. A comparação das atividades do gene repórter entre a co-
tranfecção das células com os plasmídeos pTM1-OROV-N-1 e os plasmídeos,
pTM1-OROV-N-2 a 11, mostrou que o plasmídeo suporte pTM1-OROV-N-1 teve
uma diminuição de no mínimo 40% e no máximo 60% na atividade do minigenoma
do VORO. Entretanto, comparando a atividade da Renilla entre os plasmídeos
pTM1-OROV-N-2 a pTM1-OROV-N-11, observou-se que não houve diferenças
significativas. Diante dos resultados obtidos, um plasmídeo foi selecionado para ser
cultivado em bactéria JM109, repicado e purificado para servir de estoque e utilizado
em procedimentos posteriores. O plasmídeo escolhido para esta finalidade foi o
pTM1-OROV-N-11(Figs. 24 e 25).
As figuras 25 e 26 mostram o alinhamento entre os genomas dos plasmídeos
de expressão construídos, pTM1-OROV-N-2/11/12 e da sequência genômica da
cepa do VORO BeAn 19991 a qual foi utilizada como modelo para construção dos
mesmos. Observa-se a confirmação das mudanças nucleotídicas realizadas que
foram necessárias para a ab-rogação da proteína não estrutural NSs do VORO,
83
consequentemente, levando a expressão apenas da nucleoproteína N do VORO (ver
item 4.1.4).
A análise das sequências genômicas dos plasmídeos construídos, pTM1-
OROV-N-1/11 com a sequência genômica da cepa do VORO BeAn 19991 mostrou
que a sequência do plasmídeo pTM1-OROV-N-1 estava truncada no terminal 3’
quando comparado às sequências dos outros plasmídeos construídos e do vírus
selvagem, BeAn 19991 (Figs 25 e 26). Este fato pode ter levado a diminuição de
40% da atividade de minireplicon no cultivo celular co-transfectado com este
plasmídeo (Figs. 25 e 26).
A sequência do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N-11, apresentou uma
mudança nucleotídica, C para T, na posição 38 o que levou a uma mudança
traducional de uma proteína, T para I, no genoma desse plasmídeo suporte (Fig. 27).
Além disso, outras três mudanças nucleotídicas foram observadas na sequência dos
plasmídeos construídos em relação a sequência da cepa selvagem, nas posições
543 (G→A), 544 (A →C) e 558 (T→C) (Fig. 26).
Figura 24- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína N. As células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão das proteínas N e L (A) e minireplicon (A) do VORO. 1. Controle positivo: Transfecção dos plasmídeos pT7ribo BUNV-N, pT7ribo BUNV-L e minireplicon pT7ribo BUNV-M-Renilla. 2-12.Transfecção dos plasmídeos pTM1-OROV-L(A), miniregenoma do VORO, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL com os plasmídeos de expressão construídos, pTM1-OROV-N-1 a pTM1-OROV-N-11, colunas 2 a 12, respectivamente.
84
Figura 25- Alinhamento das sequências da região codificante do gene da nucleoproteína
N. Os resíduos de adenina, citosina, guanina e timina estão representados pelas cores, vermelha, azul, amarela e verde, respectivamente. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada nucleotídeo é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
85
Figura 26- Continuação da representação do alinhamento das sequências da região
codificante do gene da nucleoproteína N. Os resíduos de adenina, citosina, guanina e timina estão representados pelas cores, vermelha, azul, amarela e verde, respectivamente. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada nucleotídeo é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
86
Figura 27- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína N do VORO. Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pela caixa preta. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
87
4.5. ANÁLISE DA ATIVIDADE DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA
POLIMERASE VIRAL L E COMPARAÇÃO DE DOIS DIFERENTES PLASMÍDEOS
DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA N DO VORO
A construção do plasmídeo que expressava a proteína estrutural L do VORO
foi realizada de acordo com o esquema da figura 8 representado anteriormente. Ao
final do cultivo de E.coli da linhagem JM109 após 18 horas de incubação a 37ºC, 23
colônias dessas células foram selecionadas para serem purificadas e a partir destas
extraídos os plasmídeos de expressão da proteína L. Após digestão com as enzimas
HindIII e SalI e análise do gel de agarose, apenas três plasmídeos mostraram um
padrão de bandas semelhante ao projetado pela programa Serial Cloner 4.1 (Figs.
10 a-c), dessa forma, a continuação do protocolo de co-transfecção dos plasmídeos
de expressão da polimerase viral L foi realizada somente com esses três plasmídeos
que apresentaram este resultado condizente ao esperado. Estes plasmídeos foram
designados pTM1-OROV-L-1 a 3.
A Figura 28 mostra a porcentagem da atividade da Renilla após co-
transfecção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N (A), pTM1-OROV-L (A),
minireplicon pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL como controle positivo, como também, a
transfecção dos plasmídeos pTVT7-OROV-M-Renilla (A), pTM1-OROV-N com os
respectivos plasmídeos de expressão L recém-construídos, pTM1-OROV-L-1 a 3.
A co-transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos PTM1-OROV-L-1
a três levou a um aumento de 267%, 472% e 587%, respectivamente, da atividade
do minireplicon do VORO, comparado ao controle. Adicionalmente, observamos que
este aumento significativo pode ter sido elevado devido a co-transfecção com o
plasmídeo de expressão da proteína N recém-construído o que nos leva a crer que a
expressão das proteínas N e L dos plasmídeos recém-construídos é maior do que a
observada nos plasmídeos de expressão, pTM1-OROV-N (A) e pTM1-OROV-L (A)
(Fig. 28).
88
Plasmídeos-Concentração (ng/µL) 1 2 3 4
pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + pTM1-OROV-N (A) (300) + pTM1-OROV-L (A) (1000) + pTM1-OROV-N (300) + + + pTM1-OROV- L-1 (1000) + pTM1-OROV- L-2 (1000) + pTM1-OROV- L-3 (1000) +
Figura 28- Análise da atividade dos plasmídeos de expressão da proteína L. As células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão dos segmentos N, minireplicon (A) do VORO com os respectivos plasmídeos PTM1-OROV-L-1 a 3 recém-construídos. 1. Controle positivo: Transfecção dos plasmídeos pTM1-OROV-L (A), pTM1-OROV-N (A) e minireplicon pTV7 OROV-M-Renilla (A). 2-4.Transfecção dos plasmídeos pTM1-OROV-N, minigenoma do VORO, PTVT7-OROV-M-Renilla (A) com os plasmídeos de expressão construídos, pTM1-OROV-L-1 a pTM1-OROV-L-3, respectivamente. Média ± DPM (desvio padrão da média)
89
4.6. COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES SISTEMAS DE MINIGENOMA APÓS
CO-TRANSFECÇÃO COM NOVOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO DAS
PROTEÍNAS N E L DO VORO
Após a construção dos plasmídeos de expressão das proteínas L e N, pTM1-
OROV-L e pTM1-OROV-N, respectivamente, como também a constatação que o
minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla não apresentou um nível de atividade
satisfatória quando co-transfectado com os plasmídeos pTVT7-OROV-L e pTVT7-
OROV-N (Fig 23), foi realizado a comparação da atividade dos minigenomas do
VOROV, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (as primeiras 30 bases da região não
codificante do terminal 5’ foi oriunda da cepa TRVL 9760 do segmento M do VORO
e o restante da sequência oriunda da cepa BeAn 19991. A sequência do terminal 3’
foi oriunda completamente da cepa TRVL 9760) e pTVT7-OROV-M-Renilla (BeAn
19991) co-transfectados em células BSR-T7/5 com os diferentes plasmídeos de
expressão recém-construídos (pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N) e com os
plasmídeos doados gentilmente pelo Dr. Manfred (pTM1-OROV-L (A) e pTM1-
OROV-N (A)).
A figura 29 mostra ausência da atividade do minireplicon quando não houve a
co-transfecção com o plasmídeo de expressão da polimerase viral L, pTM1-OROV-L
(controle negativo-coluna 1).
A atividade do minigenoma pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL co-transfectado
com o plasmídeo de expressão da proteína L e N, pTM1-OROV-L (A) e pTM1-
OROV-N diminuiu em 53,4% (coluna 4) quando comparado com o controle (coluna
2), no entanto, houve um aumento na atividade deste minigenoma em 303% e
403% quando houve co-transfecção das células com o plasmídeo de expressão,
pTM1-OROV-N em conjunto com pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N (A) em conjunto
com pTM1-OROV-L, respectivamente (colunas 5 e 6) (Fig. 29).
Em relação a atividade do minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla, houve uma
diminuição da mesma em 66% e 75% quando houve co-transfecção das células com
o plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-N (A) + pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N +
pTM1-OROV-L (A), respectivamente (coluna 7 e 8) (Fig. 29).
90
Esses resultados mostraram que a atividade do minireplicon, pT7riboSM2-
OROV-vMpro-vRL, resultou em alta expressão da proteína do gene repórter Renilla,
fato não observado em relação a atividade do minireplicon, pTVT7-OROV-M-Renilla.
Também observamos uma diferença de 100% no aumento da atividade do
plasmídeo de expressão, pTM1-OROV-N (A), comparado ao plasmídeo suporte
pTM1-OROV-N. Além disso, observamos que o plasmídeo de expressão da proteína
L do VORO construído no presente estudo, pTM1-OROV-L, possui uma atividade
maior comparada a plasmídeo suporte construído pelo grupo da Alemanha, , pTM1-
OROV-L (A) (Fig. 29).
A comparação entre as sequências dos genes dos minireplicons,
pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL e pTVT7-OROV-M-Renilla, revelou que houve
apenas uma mudança nucleotídica na posição 15 na sequência dentro da região não
Plasmídeo-Concentração(ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8
pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + + pTM1-OROV-N (A) (300) + + + + pTM1-OROV-L (A) (1000) + + + pTVT7-OROV-M-Renilla (500) + + + pTM1-OROV-N (300) + + + + pTM1-OROV-L (1000) + + + +
Figura 29- Análise da atividade de diferentes sistemas de minigenoma do VORO. As
células foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão dos segmentos N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 7. Transfecção de diferentes combinações de plasmídeos de expressão do VORO e os 2 sistemas de minigenoma construídos.
91
codificante do terminal 5’ do segmento M do VORO (Fig. 30a), no entanto o
alinhamento das sequências nucleotídicas do terminal 3’ de ambos minigenomas
mostrou que houve duas alterações nas posições 9 e 15 (Fig. 30b).
A sequência dos genes funcionais dos segmentos L, S (contendo a ab-
rogação de três nucleotídeos da sequência que codifica a proteína não estrutural
NSs) e a sequência de ambos os minigenomas foram determinadas. Observamos
diferenças nucleotídicas dos genes dos plasmídeos pTM1-OROV-N e pTM1-OROV-
N (A) em seis posições (ver quadro 13), no entanto, essas diferenças não afetaram
as sequências nucleotídicas de ambos os produtos.
Figura 30 a-b- Alinhamento das sequências da região não codificante do terminal 3’ do
segmento M do VORO. a. Uma mudança nucleotídicas foi observada na sequência do terminal 5’ do segmento M entre os minigenomas do VORO, pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL e pTVT7-OROV-M-Renilla b. Duas mudanças nucleotídicas foram observadas em ambas as sequências genômicas dos minigenomas do VORO. Os resíduos de adenina, citosina, guanina e timina estão representados pelas cores, vermelha, azul, amarela e verde, respectivamente. Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pela caixa preta. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada nucleotídeo é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
a
Consenso
Conservação
b
Consenso
Conservação
92
Quadro 13- Diferenças nucleotídicas na sequência dos plasmídeos pTM1-OROV-N
e pTM1-OROV-N (A)
pTM1-OROV-N pTM1-OROV-N (A)
Posição nucleotídeo Nucleotídeo Nucleotídeo
72 A G
102 C A
105 T C
543 A G
544 C A
552 C T
A comparação da sequência do gene do pTM1-OROV-L com a sequência do
segmento L da cepa do VORO, BeAn19991, disponível no GenBank mostrou
diferenças nucleotídicas entre ambas, sendo que estas diferenças resultaram em 15
mudanças aminoacídicas na composição genômica do plasmídeo (Fig 31, 32 e 33
[caixas pretas]). Nenhuma diferença aminoacídica estava presente em alguma das
regiões referentes aos quatro motivos conservados da RNA polimerase dependente
de RNA do VORO.
Por outro lado, a comparação da sequência do gene do pTM1-OROV-L (A)
com a sequência do segmento L da cepa do VORO, TRVL 9760, disponível no
GenBank, mostrou diferenças nucleotídicas entre as ambas, sendo que estas
diferenças resultaram em 33 mudanças aminoacídicas na composição genômica do
plasmídeo suporte pTM1-OROV-L (A) (Fig 31, 32 e 33 [caixas vermelhas]).
Observamos mudanças aminoacídicas nas regiões referentes aos motivos um e dois
(1 modificação) e três (2 modificações) conservados da RNA polimerase dependente
de RNA do VORO.
Adicionalmente, entre os plasmídeos de expressão da polimerase viral L,
houve 20 mudanças aminoacídicas, sendo que na posição 1021, essa mudança
também foi diferente daquela observada nas sequências das cepas selvagens (Fig
32 [caixa verde]).
93
Figura 31- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase
dependente de RNA do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L(A) com as sequências do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991 (OROV-L-BEAN-19991) e da cepa do VORO TRVL9760 (OROV-L-TRVL9760). Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pela caixa vermelha. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
94
Figura 32- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase
dependente de RNA do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L(A) com as sequências do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991 (OROV-L-BEAN-19991) e da cepa do VORO TRVL9760 (OROV-L-TRVL9760). Os aminoácidos que diferem entre si estão
selecionados pelas caixas vermelhas e pretas. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
95
Figura 33- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína RNA polimerase dependente de RNA do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L(A) com as sequências do segmento L da cepa do VORO, BeAn19991 (OROV-L-BEAN-19991) e da cepa do VORO TRVL9760 (OROV-L-TRVL9760). Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pelas caixas vermelhas, pretas e caixa verde. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
96
4.7. ANÁLISE DA ATIVIDADE DA REGIÃO CODIFICANTE DO SEGMENTO M DO
VORO
4.7.1. Atividade de distintos plasmídeos de expressão do segmento M no
sistema de minireplicon do VORO
A construção do plasmídeo que expressava as proteínas traduzidas do
segmento M do VORO foi realizada de acordo com o esquema da figura 8
representado anteriormente. Ao final do cultivo de E.coli da linhagem JM109 após 18
horas de incubação a 37ºC, dez colônias dessas células foram selecionadas para
serem purificadas e a partir destas extraídos os plasmídeos de expressão advindos
do segmento M. Após digestão com as enzimas PmlI e XbaI e análise do gel de
agarose, os nove plasmídeos mostraram um padrão de bandas semelhante ao
projetado pela programa Serial Cloner 4.1 (Figs. 12 a-c), dessa forma, a continuação
do protocolo de co-transfecção dos plasmídeos de expressão das proteínas
traduzidos do segmento M do VORO foi realizado com os mesmos que
apresentaram o resultado condizente ao esperado. Estes plasmídeos foram
designados pTM1-OROV-M-1 a 9.
A figura 34 mostra a porcentagem da atividade da Renilla após co-
transfecção do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-L,
minireplicon pTVT7-OROV-M-Renilla (A) como controle positivo, como também, a
transfecção dos plasmídeos pTVT7-OROV-M-Renilla (A), pTM1-OROV-N com os
respectivos plasmídeos de expressão das proteínas traduzidas do segmento M
recém-construídos, pTM1-OROV-M-1 a 9.
A co-transfecção das células BSR-T7/5 com o plasmídeo de expressão pTM1-
OROV-M-1 mostrou uma atividade do minigenoma do VORO 80% menor comparado
ao controle positivo. Além disso, observamos que para a co-transfecção das células
com os plasmídeos de expressão pTM1-OROV-M 2 a 9 e o minireplicon do VORO
houve uma drástica diminuição na atividade do sistema em estudo (entre 88% e
92% (Fig. 34). Diante da análise do resultado do gráfico representativo da atividade
do minigenoma quando co-transfectado com os plasmídeos de expressão da
proteína M do VORO, o plasmídeo pTM1-OROV-M-1 foi escolhido para ser repicado
em bactéria JM109 e estocado para ser utilizado em experimentos posteriores. O
plasmídeo recém-construído foi denominado pTM1-OROV-M.
97
Plasmídeo-Concentração(ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500)
+ + + + + + + + + + +
pTM1-OROV-N (1000) + + + + + + + + + + + pTM1-OROV-L (1000) + + + + + + + + + + pTM1-OROV-M-1 (1000) + pTM1-OROV-M-2 (1000) + pTM1-OROV-M-3 (1000) + pTM1-OROV-M-4 (1000) + pTM1-OROV-M-5 (1000) + pTM1-OROV-M-6 (1000) + pTM1-OROV-M-7 (1000) + pTM1-OROV-M-8 (1000) + pTM1-OROV-M-9 (1000) +
Figura 34- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando a
expressão dos plasmídeos PTM1-OROV-M-1 a 9 obtidos das colônias selecionadas. As células foram co-transfectadas com plasmídeo de expressão do segmento M/N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 11. Co-transfecção de distintos plasmídeos PTM1-OROV-M-1 a 9.
98
4.7.2. Titulação da quantidade do plasmídeo de expressão do segmento M co-
tranfectado com o sistema de minigenoma do VORO
Após a construção e análise do plasmídeo, pTM1-OROV-M, que
presumivelmente, expressa as proteínas estruturais, Gn e Gc e a proteína não-
estrutural NSm, foi realizado a co-transfecção com diluições seriadas e progressivas
de 200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL, desse plasmídeo em células BSR-T7/5
conjuntamente com os plasmídeos pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-L e o minireplicon
do VORO.
O controle negativo (coluna 1) não mostrou atividade da proteína Renilla
confirmando que a presença da polimerase viral L é vital para a construção do
sistema de minigenoma do VORO. A adição das diluições de 200 a 600 ng/µL de
pTM1-OROV-M para co-transfecção em cultivo celular resultou em uma diminuição
de 37% da atividade do minireplicon do VORO, no entanto, para as diluições de 800
e 1000 ng/µL, foi observado uma diminuição de 64% e 79%, respectivamente, na
atividade da proteína repórter Renilla (Fig. 35).
Plasmídeo-Concentração(ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7
pTM1-OROV-L + + + + + + pTM1-OROV-N + + + + + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL + + + + + + + pTM1-OROV-M (200 ng/µL) + pTM1-OROV-M (400 ng/µL) + pTM1-OROV-M (600 ng/µL) + pTM1-OROV-M (800 ng/µL) + pTM1-OROV-M (1000 ng/µL) +
Figura 35- Análise da atividade da região codificante do segmento M do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-M eleito no estudo. As células foram co-transfectadas com diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) plasmídeo de expressão do segmento M em conjunto com pTM1-OROV-N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 7. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeos PTM1-OROV-M. Média ± DPM (desvio padrão da média).
99
4.8. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs NO
SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO
A construção do plasmídeo que expressava as proteínas traduzidas do
segmento S do VORO foi realizada de acordo com o esquema da figura 8
representado anteriormente. Ao final do cultivo de E.coli da linhagem JM109 após 18
horas de incubação a 37ºC, cinco colônias dessas células foram selecionadas para
serem purificadas e extraídos os plasmídeos de expressão advindos do segmento S.
Após digestão com as enzimas SalI e XbaI e análise do gel de agarose, os cinco
plasmídeos mostraram um padrão de bandas semelhante ao projetado pelo
programa Serial Cloner 4.1 (Figs. 14 a-c), dessa forma, a continuação do protocolo
de co-transfecção dos plasmídeos de expressão das proteínas traduzidos do
segmento S do VORO foi realizado com os mesmos que apresentaram o resultado
condizente ao esperado. Estes plasmídeos foram designados pTM1-OROV-S-1 a 5.
Para a construção do plasmídeo que somente expressava a proteína
estrutural NSs do VORO foram realizados os mesmos procedimentos descritos
anteriormente, no entanto, as enzimas de digestão SalI e HindIII foram utilizadas e
oito plasmídeos foram escolhidos por demonstrarem padrões de bandas adequados
ao previsto pelo software Serial Cloner 4.1 (Figs. 20 a-c). Os plasmídeos recém-
construídos foram denominados pTM1-OROV-NSs-1 a 8
Os plasmídeos, pTM1-OROV-S-1 a 5, presumivelmente expressavam as duas
proteínas, a nucleoproteína N e a proteína não-estrutural NSs. Para determinar o
papel da proteína não-estrutural NSs, na expressão do gene viral, o plasmídeo de
expressão destas proteínas, pTM1-OROV-S-1 a 5, foram comparados a um
plasmídeo que expressava apenas a nucleoproteína, pTM1-OROV-N. A figura 36
mostra que a substituição do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-S-1 a 5 com
igual quantidade do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N resultou em um
aumento de 88% a 93% da atividade de proteína repórter Renilla.
O papel inibitório da proteína não-estrutural NSs foi confirmado pela
expressão do sistema do minireplicon do VORO em conjunto com o plasmídeo de
expressão pTM1-OROV-N. A adição de 1000 ng/µL do plasmídeo pTM1-OROV-
NSs-1 a 8 a mistura de transfecção levou a diminuição drástica na atividade da
Renilla (Fig. 37). Como não houve diferenças significativas entre atividade do
plasmídeo pTM1-OROV-NSs-1 a 8 no sistema de minigenoma do VORO, o pTM1-
100
OROV-NSs-1 foi escolhido para ser repicado em bactéria JM109 e estocado para
ser utilizado em experimentos posteriores. O plasmídeo recém-construído foi
denominado pTM1-OROV-NSs.
Ao utilizarmos diluições seriadas (200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL) da
quantidade de plasmídeos que expressavam a proteína não-estrutural NSs co-
transfectado com pTM1-OROV-N no sistema de minireplicon do VORO, o papel
inibitório da proteína NSs do VORO foi comprovado novamente. Diminuições
drásticas da atividade da Renilla foram observadas, independente das diluições
utilizadas do plasmídeo que expressava somente a proteína NSs (Fig. 38). Estes
resultados sugerem que a proteína NSs do VORO é um regulador negativo da
expressão do gene viral.
Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 pTM1-OROV-L (1000) + + + + + + + pTM1-OROV-N (1000) + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500)
+ + + + + + +
pTM1-OROV-S-1 (1000) + pTM1-OROV-S-2 (1000) + pTM1-OROV-S-3 (1000) + pTM1-OROV-S-4 (1000) + pTM1-OROV-S-5 (1000) +
Figura 36- Análise da atividade da região codificante do segmento S do VORO. As células foram co-transfectadas com plasmídeo de expressão do segmento S/N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 11. Co-transfecção de distintos plasmídeos pTM1-OROV-S-1 a 5.
101
Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pTM1-OROV-L (1000) + + + + + + + + + + pTM1-OROV-N (1000) + + + + + + + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-Vrl (500) + + + + + + + + + + pTM1-OROV-NSs-1 (1000) + pTM1-OROV-NSs-2 (1000) + pTM1-OROV-NSs-3 (1000) + pTM1-OROV-NSs-4 (1000) + pTM1-OROV-NSs-5 (1000) + pTM1-OROV-NSs-6 (1000) + pTM1-OROV-NSs-7 (1000) + pTM1-OROV-NSs-8 (1000) +
Figura 37- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-NSs-1 a 8 obtidos das colônias selecionadas.. As células foram co-transfectadas com plasmídeo de expressão do segmento M/N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 11. Co-transfecção de distintos plasmídeos PTM1-OROV-NSs-1 a 8.
102
Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 pTM1-OROV-L (1000) + + + + + + + pTM1-OROV-N (1000) + + + + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + + + + pTM1-OROV-NSs (200) + pTM1-OROV-NSs (400) + pTM1-OROV-NSs (600) + pTM1-OROV-NSs (800) + pTM1-OROV-NSs (1000) +
Figura 38- Análise da atividade da região codificante da proteína NSs do VORO
considerando a expressão dos plasmídeos pTM1-OROV-NSs eleito no estudo. As células foram co-transfectadas com diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) plasmídeo que expressava a proteína não-estrutural NSs em conjunto com pTM1-OROV-N e minireplicon do VORO 1. Controle negativo. 2. Controle positivo 3 a 7. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeo PTM1-OROV-NSs. Média ± DPM (desvio padrão da média).
103
4.9. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS DO VORO POR IMUNOMARCAÇÃO
A imunomarcação anti-antígeno viral dos cultivos de células BSR-T7/5 não
transfectados com plasmídeo algum ou transfectado com os plasmídeos de
expressão PTM1-OROV-L/M e NSs foi negativa (Figs. 39 a-d) Ao passo que, a
replicação viral foi confirmada através da imunomarcação usando soro homólogo
hiperiume contra OROV. Os cultivos transfectados com pTM1-OROV-N, PTM1-
OROV-L e N e co-transfectados com pTM1-OROV-L/N e o minigenoma do VORO
mostraram uma imunomarcação positiva (Figs. 40 a-c). Observamos que esta
positividade foi observada nos cultivos que continham o plasmídeo que expressava
a nucleoproteína do VORO.
d
50 µm
c
50 µm
50 µm
a
50 µm
b
Figura 39 a-d- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. Transfecção do cultivo celular com os seguintes plasmídeos: a) pTM1-r-sem inserto; b) pTM1-OROV-L; c) pTM1-OROV-NSs e d) pTM1-OROV-M.
104
b
20 µm
a
20 µm
c
50 µm
Figura 40 a-c- Imunomarcação das células BSR-T7/5 transfectadas com os plasmídeos de expressão construídos neste estudo. Transfecção do cultivo celular com os seguintes plasmídeos: a) pTM1-OROV-N; b) pTM1-OROV-N + pTM1-OROV-L; c) Co-transfecção pTM1-OROV-N + pTM1-OROV-L e minigenoma do OROV
105
4.10. ANÁLISE DA TRANSFECÇÃO DO MINIREPLICON DO VORO COM O
MINIGENOMA DO VBUN
O VBUN é o protótipo da família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, assim
como o VORO, apresenta padrões genotípicos e fenotípicos semelhantes. Diante
desse fato, realizamos diferentes combinações entre os minigenomas do VBUN e
dos dois distintos minigenomas do VORO aqui em estudo para analisarmos a
habilidade replicativa de uma possível quimera dos vírus em questão.
As figuras 41 e 42 mostram que a atividade do minigenoma do VBUN é 2000
vezes maior que a atividade do gene repórter, Renilla luciferase, comparado a
ambos e distintos sistemas de minireplicon do VORO, atividade em unidades de luz
para ambos os sistemas, 119 e 238,3, respectivamente (1, 2 e 3). Observamos que
a co-transfecção dos plasmídeos de expressão das proteínas L e N do VBUN,
pTM1--BUNV-L e pTM1-BUNV-N com os dois minigenomas do VORO, pTVT7-
OROV-M-Renilla e pTVT7-OROV-M-Renilla (A) resultou na transcrição de ambos
minireplicons o que levou a expressão do gene repórter (5 e 11), apesar das
diferenças observadas na quantificação do sistema, 113,2 e 3075 unidades de luz,
respectivamente (Fig. 41). O resultado da quantificação da atividade do minireplicon
do VBUN co-transfectado com os plasmídeos de expressão das proteínas L e N do
VORO, pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-N, foi 1000 vezes maior e 2000 vezes menor
que os resultados descritos em texto anterior, respectivamente (Fig. 41). Em um
experimento separado, a combinação do minigenoma do VBUN com os plasmídeos
pTM1-OROV-L (A) e pTM1-OROV-N (A) também levou a ativação do gene repórter,
no entanto, em uma escala mais baixa, 87,48 unidades de luz (Fig. 42).
106
Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pTM1-BUNV-N (1000) + + + + + + + pTM1-BUNV-L (1000) + + + + + pTVT7-BUNV-M-Renilla (500) + + + + + pTM1-OROV-N (1000) + + + + pTM1-OROV-L (1000) + + + pTVT7-OROV-M-Renilla (500) + + + + + pTM1-OROV-N (A) (1000) + pTM1-OROV-L (A) (1000) + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + +
Figura 41- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. As células foram co-transfectadas com diferentes combinações de plasmídeos de expressão das proteínas L e nucleoproteínas, além dos mingenomas do VORO e VBUN 1. Controle positivo: minigenoma VBUN. 2. Controle positivo: minigema VBUN. 3. Controle positivo minireplicon VORO (A) 4 a 12. Diferentes combinações dos plasmídeos em estudo para transfecção em células BSR-T7/5.
107
Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pTM1-BUNV-N (1000) + + + pTM1-BUNV-L (1000) + + + + + pTVT7-BUNV-M-Renilla (500) + + + pTM1-OROV-N (1000) + + + pTM1-OROV-L (1000) + + + pTVT7-OROV-M-Renilla (500) + + + pTM1-OROV-N (A) (1000) + + + + + pTM1-OROV-L (A) (1000) + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + +
Figura 42- Análise da atividade do minireplicon do VORO com minigenoma do VBUN. As
células foram co-transfectadas com diferentes combinações de plasmídeos de expressão das proteínas L e nucleoproteínas, além dos mingenomas do VORO e VBUN 1. Controle positivo: minigenoma VBUN. 2. Controle positivo: minigema VBUN. 3. Controle positivo minireplicon VORO (A) 4 a 11. Diferentes combinações dos plasmídeos em estudo para transfecção em células BSR-T7/5.
108
4.11. EFEITOS DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA NÃO-ESTRUTURAL NSs DO
VBUN NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VORO E DA PROTEÍNA NÃO-
ESTRUTURAL NSs DO VORO NO SISTEMA DE MINIREPLICON DO VBUN
Para investigarmos uma possível função nos elementos das sequências
conservadas entre os vírus VBUN e VORO, pertencentes ao gênero
Orthobunyavirus, na regulação na reconstituição da polimerase do VORO e VBUN,
nós observamos o efeito da proteína NSs entre ambos os membros do genêro em
estudo em seus respectivos sistemas de minireplicon. A sequência da proteína NSs
do VBUN e VORO possuem 24% de identidade aminoacídica, no entanto, algumas
regiões conservadas foram observadas (Fig. 43)
Ao utilizarmos diluições seriadas (200, 400, 600, 800 e 1000 ng/µL) da
quantidade de plasmídeos que expressavam a proteína não-estrutural NSs do
VORO e do VBUN co-transfectados com pTM1-BUNV-N, pTM1-BUNV-L e
minigenoma do VBUN, assim como, pTM1-OROV-N, pTM1-OROV-L e minireplicon
do VORO, respectivamente, observou-se que a expressão da proteína não-estrutural
NSs do VBUN é um inibidor mais potente na atividade do minigenoma que a
expressão da proteína não-estrutural do deste vírus. O papel inibitório da proteína
NSs do VORO e do VBUN foi observado. (Fig. 44).
Figura 43- Alinhamento das sequências traduzidas da proteína não estrutural NSs do VORO. Comparação da sequência do gene dos plasmídeos suporte pTM1-BUNV-NSs e pTM1-OROV-NSs. Os aminoácidos que diferem entre si estão selecionados pelas caixas pretas. A sequência consenso está representada pela cor preta. A porcentagem de conservação de cada proteína é descrita pelas barras em rosa. --é usado para demonstrar espaços na sequência.
109
Plasmídeo- Concentração (ng/µL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pTM1-OROV-N (1000) + + + + + + + pTM1-OROV-L (1000) + + + + + + pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (500) + + + + + + + pTM1-BUNV-NSs (200) + pTM1-BUNV-NSs (400) + pTM1-BUNV-NSs (600) + pTM1-BUNV-NSs (800) + pTM1-BUNV-NSs (1000) + pTM1-BUNV-N (1000) + + + + + pTM1-BUNV-L (1000) + + + + + pTVT7-BUN-M-Renilla (500) + + + + + pTM1-OROV-NSs (400) + pTM1-OROV-NSs (600) + pTM1-OROV-NSs (800) + pTM1-OROV-NSs (1000) +
Figura 44- Efeitos da proteína não estrutural NSs. As células foram co-transfectadas
com diluições seriadas (400 a 1000 ng/µL) do plasmídeo que expressava a proteína não-estrutural NSs do VORO ou VBUN em conjunto com pTM1-BUNV-N e minireplicon do VBUN 1 e com pTM1-OROV-N e minireplicon do VORO 1, respectivamente. Controle negativo. 2. Controle positivo. 3 a 7. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeo PTM1-BUNV-NSs. 8. Controle positivo. 9-12. Diluições seriadas (200 a 1000 ng/µL) do plasmídeo PTM1-OROV-NSs.
110
5. DISCUSSÃO
O passo inicial em direção a construção de um sistema de recuperação viral é
a geração de um sistema de minireplicon que permite a reconstituição intracelular de
ribonucleoproteínas recombinantes do vírus em estudo. Esses sistemas são
ferramentas importantes para análise da replicação viral sem a necessidade da
realização de uma infecção viral.
No caso do VORO, um vírus tri-segmentado, os minigenomas correspondem
a segmentos artificiais semelhantes ao do vírus original que consistem nos genes
repórter flanqueados pelas regiões não codificantes do vírus. Essas regiões não
codificantes contêm os sinais regulatórios para transcrição e replicação da
polimerase viral. No sistema de minireplicon, as ribonucleoproteínas recombinantes
que contêm segmentos parecidos com os dos vírus são reconstituídas in vivo pela
expressão da polimerase L e nucleoproteína do VORO. A proteína N engloba o RNA
viral e somente as ribonucleoproteínas servem como modelo para ação da
polimerase viral L. A replicação e a transcrição das ribonucleoproteínas resultam na
expressão do minigenoma repórter que indica a funcionalidade de ambos a região
não codificante viral e expressão das proteínas (Fig. 22) (Dunn et al., 1995).
Os sistemas de minireplicon são instrumentos sofisticados para estudar a
transcrição, replicação e empacotamento de vírus de RNA de filamento negativo.
Para se obter um genoma de RNA de sentido negativo, um RNAm de sentido
positivo complementar e com a sequência completa, o antigenoma, deve ser
sintetizado. Esta molécula difere do RNAm de sentido positivo por não possuir o
iniciador para o começo da extensão no terminal 5’ e para extensão no terminal 3’ ao
terminal 5’, do modelo do RNA genômico (Dunn et al., 1995).
Para o VORO (Bunyaviridae, Orthobunyavirus), o segundo arbovírus mais
importante em termos de saúde pública depois do VDEN, o sistema de minireplicon
foi o primeiro a ser descrito para este agente viral. Os bunyavírus replicam-se no
citoplasma (Schmaljohn, 1996). Devido a este fato, o primeiro sistema de
minireplicon construído para os bunyavírus, VBUN e VRVF, recaem na utilização da
T7RNAP, que se localiza no citoplasma, para a transcrição dos seus respectivos
minigenomas (Dunn et al., 1995; Lopez et al., 1995), no entanto, os minireplicons do
111
VUUK e VLAC foram construídos sob o controle do promotor da enzima RNAPI,
localizada no núcleo das células (Flick & Pettersson, 1989a; Blakqori et al., 2003).
A enzima T7RNAP foi escolhida para a transcrição do minireplicon e dos
genes do VORO por ser funcional em vários tipos celulares e por localizar-se no
citoplasma, além disso, a razão pelo qual a RNAPI não foi escolhida foi em
decorrência de que as sequências promotoras dessa enzima são espécie-
específicas o que restringe as opções de uma determinada linhagem celular em que
um sistema de minigenoma pode ser usado. Adicionalmente, os transcritos dos
sistemas de genética reversa que são construídos sob o controle da RNAPI podem
sofrer splicing (emendas) no núcleo e os minireplicons tendem a apresentar baixo
sinal de atividade (Elliott & Blakqori, 2011).
Neste trabalho, um segmento modelo do VORO sob o controle da T7RNAP
consistindo do gene da Renilla Luciferase posicionado no sentido negativo e
flanqueado pela região consenso das regiões 3’ e 5’ não codificantes do segmento
MRNA foi eficientemente transcrito na presença dos segmentos dos genes do
VORO expressos, segmento L (polimerase viral L), segmento S (proteínas N e NSs)
e segmento S ab-rogado na região codificante da proteína não estrutural NSs
(proteína N apenas) (Figs. 23, 28, 29), Tal resultado confirmou que a enzima
T7RNAP foi uma escolha adequada para a construção do sistema de minireplicon do
VORO. A enzima tem sido utilizada para a construção de minigenomas para outros
bunyavírus, tais como o VBUN, VLAC e VRVF (Bridgen & Elliott, 1996; Blakqori &
Weber, 2005; Ikegami et al., 2006).
O transcrito do minireplicon e do RNAm da Renilla luciferase foram
exclusivamente produzidos pelo complexo de replicação do vírus, dessa forma, a
ativação da Renilla luciferase observada no sistema de minireplicon reflete a
replicação e transcrição das ribonucleoproteínas recombinantes do VORO
reconstituídas in vivo. Este resultado indica que a replicação e a transcrição do
VORO necessitam de ambas as proteínas, a polimerase viral L e a nucleoproteína
N, o que também foi observado para outros sistemas de minireplicon de bunyavírus,
e, assim como no presente estudo, esses trabalhos também utilizaram a região
consenso da região não codificante do segmento M para construção dos seus
respectivos sistemas de minigenoma (Figs. 24, 28 e 29) (Dunn, et al., 1995; Lopez,
et al., 1995)
112
A escolha do promotor do segmento M para construção do minigenoma do
VORO deveu-se ao fato de experimentos com outros minigenomas de bunyavírus
terem comparado a eficiência dos promotores existentes nos três segmentos virais
(S, M e LRNA). Estes experimentos demonstraram que em células de mamíferos o
promotor do segmento M foi o mais ativo, sendo que o promotor do segmento L
demonstrou um padrão de ativação intermediário e o promotor do segmento S
mostrou-se com o menor nível de ativação (Barr et al., 2003; Kohl et al., 2004).
Interessante notar que em células de mosquitos, o promotor do segmento M foi
novamente mais ativo, no entanto, os promotores dos segmentos S e L
demonstraram um padrão de atividade similar (Barr & Wertz, 2004; Kohl et al.,
2004).
Os dois minigenomas do VORO utilizados neste trabalho apresentaram níveis
de atividades divergentes para a proteína Renilla. O minigenoma, pT7riboSM2-
OROV-vMpro-vRL, mostrou-se ativo comparado ao minigenoma construído neste
estudo, pTVT7-OROV-M-Renilla (Figs. 23 e 29). Mesmo quando o minireplicon
pTVT7-OROV-M-Renilla foi co-transfectado com plasmídeos de expressão da
proteína N e L não houve uma aumento satisfatório da atividade do sistema (Fig.
29). Comparando as sequências das regiões não codificantes dos terminais 5’ e 3’
observou-se que houve mudanças nucleotídicas na posição 9 no terminal 3’ e na
posição 15 para ambos os terminais do minigenoma pTVT7-OROV-M-Renilla
comparado com as sequências das regiões não codificantes do vírus, BEAN 19991
e do minigenoma pT7riboSM2-OROV-vMpro-vRL (Figs. 30a-b).
Sabe-se que os 11 nucleotídeos das regiões terminais de cada segmento
genômico são aparentemente altamente conservados para todos os orthobunyavírus
(Elliott et al.,1990). Logo após a sequência terminal conservada, pequenas
sequências específicas dos segmentos são encontradas, em torno de 3 ou 4
nucleotídeos downstream, que são conservadas entre vírus do mesmo sorogrupo e,
após esses nucleotídeos, as sequências são altamente variáveis entre segmentos,
tanto entre cepas diferentes quanto segmentos análogos do mesmo vírus (Elliott et
al.,1990). As diferenças nas atividades da Renilla entre os minireplicons podem ter
sido observadas pela mudança nucleotídica na região altamente conservada da
sequência da região não codificante do terminal 3’, posição 9, como também, das
outras duas alterações apresentadas anteriormente no minigenoma pTVT7-OROV-
M-Renilla. Korl e colaboradores (2003 e 2004) demonstraram que uma única
113
mutação de ponto dentro da região promotora pode ocasionar eliminação ou
aumento da atividade promotora. Nesse trabalho, análises mutagênicas foram
realizadas nos 15 primeiros nucleotídeos das terminais 3’ e 5’ do segmento S do
VBUN. A maioria das alterações dentro dessa região diminuiu drasticamente a
atividade da proteína repórter CAT utilizada no estudo.
Flick e colaboradores (2004) introduziram mutações de ponto nas regiões
promotoras do segmento M do VUUK um membro da família Bunyaviridae, gênero
Phlebovirus. O estudo em questão observou duas regiões regulatórias importantes
dentro da região promotora (posições 3 a 5; posições 2 a 4 e posição 8). Mudanças
nucleotídicas complementares na região promotora, o que manteve a possibilidade
de pareamento nucleotídico entre os terminais 3’ e 5’, demonstrou que os
nucleotídeos nas duas regiões descritas eram essenciais para o reconhecimento de
um padrão base-específico, logo, a preservação do pareamento de base formando a
estrutura em forma de “panhandle” entre os terminais 5’ e 3’ não foi suficiente para
ativar o promotor. Em resumo, o estudo demonstrou que ambos os terminais do
segmento M constroem uma região promotora e estão envolvidos no
reconhecimento específico da polimerase viral L.
Outro fator que pode ter ocasionado as diferenças entre as atividades da
proteína repórter, Renilla, é a complementariedade, que junto com a definição da
sequência correta dos nucleotídeos, são necessárias para o funcionamento do
promotor (Barr & Wertz, 2004; Kohl et al., 2004). Trabalhos realizados com vírus de
RNA de filamento negativo demonstraram que os segmentos S, M e L dos
bunyavírus possuem uma complementariedade entre os terminais 3’ e 5’ das regiões
não codificantes. Essa característica foi confirmada pela visualização da
conformação circular das ribonucleoproteínas dos bunyavírus, como também,
análises bioquímicas demonstraram que os nucleotídeos dos terminais 3’ e 5’ das
regiões não codificantes dos bunyavírus pareiam-se em bases entre si (Pettersson
et al., 1975; Obijeski et al., 1976; Raju et al., 1989). Esse pareamento permite a
formação de estruturas “panhandle” (forma de cabo e raquete ou cabo de caçarola)
que são características de vírus segmentados de filamento negativo (Elliott et al.,
1991).
Estudos adicionais realizados com o VBUN demonstraram que a atividade da
proteína repórter CAT foi apenas observada quando 14 a 16 nucleotídeos eram
complementares entre si nas regiões terminais 3’ e 5’ do segmento S do vírus
114
demonstrando que complementariedade ultrapassada aos 11 nucleotídeos das
regiões conservadas é crítica para formação de estruturas secundárias nos terminais
para permitir a sinalização aos processos de transcrição e replicação (Barr & Wertz,
2004; Kohl et al., 2004)
A eficiência do minigenoma do VORO, ao ser co-transfectado com os
plasmídeos de expressão da polimerase L, em torna-se partícula viral foi alta, variou
entre 267%, 472% e 587% em relação ao controle positivo (Fig 28). Uma
comparação mais aprofundada utilizando-se combinações diferentes entre os
sistemas de minigenomas do VORO e plasmídeos suportes demonstrou que a co-
transfecção com o plasmídeo de expressão pTM1-OROV-L (A) diminuiu em 53,4% a
atividade da proteína repórter (coluna 4) comparado a co-transfecção do
minireplicon com o plasmídeo suporte pTM1-OROV-L, construído nesse estudo
(colunas 5 e 6) (Fig. 29).
Uma primeira comparação da sequência da região codificante da polimerase
L descrita no presente estudo com as sequências da região codificante do
plasmídeo de expressão pTM1-OROV-L e pTM1-OROV-L (A) com as sequências
dos vírus protótipo e topótipo do VORO, TRVL 9760 e BeAn19991 obtidas do
Genbank, mostrou 33 e 15 mudanças aminoacídicas, respectivamente (Figs. 31, 32
e 33).
A região codificante do segmento L do VORO obtida neste estudo foi
amplificada em um único experimento utilizando-se o kit “KOD hot-start polymerase”.
Este kit contém uma enzima KOD DNA polimerase proof-reading o que facilitou a
clonagem do gene L no plasmídeo pTM1_, pois esta enzima produz produtos de
PCR sem nucleotídeos protudentes, dessa forma, prontos para serem ligados ao
vetor. Além disso, a DNA polimerase KOD possui alta fidelidade nas sequências
amplificadas o que nos leva a crer que as mutações ressaltadas para o plasmídeo
pTM1-OROV-L pode ter sido de artefatos mediados pelo RT-PCR. Essa
desvantagem na técnica foi observada por outros estudos e deve ser levada em
consideração quando houver tentativa de amplificar corretamente fragmentos longos
de DNA (Yount et al., 2003).
As 33 mudanças aminoacídicas notadas entre a sequência do plasmídeo
pTM1-OROV-L (A) e da cepa TRVL 9760, foram observadas nas regiões referentes
aos motivos um e dois (1 modificação) e três (2 modificações) conservados da RNA
polimerase dependente de RNA do VORO (Figs. 31, 32 e 33). Essas mutações
115
podem ter ocasionado as alterações da atividade da proteína repórter observadas
quando houve co-transfecção com os plasmídeos de expressão pTM1-OROV-L (A)
e pTM1-OROV-L (Fig. 29). Análises das sequências do segmento L do VBUN
identificou seis motivos (premotivo A e motivos de A a E) que estão localizados no
centro da molécula e são comuns para todos as RNA polimerases dependentes de
RNA (Poch et al.,1989).
A grande semelhança entre a subunidade da polimerase PB1 e os vírus
Influenza sugere que esta região contém funções importantes da polimerase como a
ligação do RNA viral, adição de nucleotídeos e clivagem da região cap (Aquino et
al., 2003). Dunn e colaboradores em 1995 demonstraram que alterações de
aminoácidos altamente conservados nos motivos A, B ou C na proteína L do VBUN
ab-rogou a atividade da polimerase viral no sistema de minireplicon. Nenhuma
alteração nesses motivos foi observada para a sequência do plasmídeo pTM1-
OROV-L construído neste estudo evidenciando, desta forma, a perfeita atividade da
construção.
Blakqori et al (2001) introduziram mutações nos motivos A e B do segmento L
do VLAC o que levou a um leve aumento na atividade repórter do sistema de
minigenoma desse vírus, sendo esta alteração favorável ao funcionamento da
polimerase viral L no sistema de minireplicon.
Outro estudo que determinou os efeitos de mutações introduzidas ao acaso
em genomas virais, refere-se a insersões de mutações no genoma do VSV (vírus de
RNA de filamento negativo). O trabalho evidenciou que a combinação de mutações
criou um genótipo não viável, um caso extremo de “letalidade sintética”-mudanças
realizadas em genes leva a morte celular ou do organismo (Sanjuan et al., 2004).
Não se sabe ao certo se as mutações observadas neste estudo afetaram a
transcrição, a replicação ou ambos os processos. Estudos futuros no que tange a
obtenção de concentrações do RNA viral, das espécies de RNAm do minigenoma
através da técnica de Northen blot tornam-se necessários para a obtenção de
respostas sobre a ação das mutações nos processos de transcrição e replicação
viral.
O modelo para transcrição e replicação dos vírus de RNA de filamento
negativo não é o RNA, mas o RNA encapsulado pela proteína do nucleocapsídeo
viral, nucleoproteína N, na forma de complexos ribonucleoprotéicos
(ribonucleoproteínas). Tanto o RNA genômico quanto o antigenômico são
116
encontrados apenas na forma de ribonucleoproteínas, indicando que a
encapsulação do RNA é cotranscricional, no entanto, o RNAm viral não é
encapsulado pela proteína N para permitir o acesso da transcrição protéica. A
proteína N tem um papel importante na mudança da atividade de transcrição para a
atividade de replicação da polimerase viral L (Elliott, 2005)
Neste trabalho foi construído o plasmídeo de expressão da nucleoproteína N
do VORO, pTM1-OROV-N, pela ab-rogação de nucleotídeos, por mutagênese sítio
específico, nas posições 24 (T→ C), 69 (T→C) e 72 (G→A) do gene do segmento S
contendo a sequência codificadora da proteína NSs, assim, permitindo a construção
de um plasmídeo suporte que expressava apenas a nucleoproteína N do VORO
(Figs. 15, 16 e 17).
Os diferentes clones construídos neste estudo apresentaram mudanças
nucleotídicas e aminoacídicas em suas sequências genômicas quando comparados
a sequência do VORO, cepa BeAn 19991. A sequência do plasmídeo pTM1-OROV-
N-1 mostrou-se truncada a nível do terminal 3’ quando comparado às sequências
dos outros plasmídeos construídos e do vírus selvagem, BeAn 19991, sendo
observada a diminuição em 40% da atividade do minigenoma do VORO (Figs. 24, 25
e 26). Já a sequência do plasmídeo de expressão pTM1-OROV-N-11, apresentou
uma mudança nucleotídica (C →T) na posição 38 o que levou a uma mudança
traducional de uma proteína (T→ I) (Fig 27). Além disso, outras três mudanças
nucleotídicas foram observadas nas posições 543 (G→A), 544 (A →C) e 558 (T→C)
(Fig. 26). Aparentemente, as mudanças não acarretaram alterações na expressão
da proteína N do VORO no sistema de minigenoma.
Eifan & Elliott, 2009, utilizaram o sistema de minigenoma do VBUN para
estudar os efeitos de mutações de ponto em 10 resíduos do terminal N e em 17
resíduos do terminal C na proteína N do VBUN em relação a síntese de RNA. Este
estudo mostrou diferentes níveis de atividades dos mutantes das proteínas N do
VBUN no sistema de minigenoma pode ter ocorrido devido a proteína mutante N ser
defeituosa e não acontece o empacotamento das ribonucleoproteínas, montagem do
virion ou a proteína N é instável ou é pouco expressa pelo plasmídeo.
Após transfecção das células BSR-T7/5 com os plasmídeos de expressão das
proteínas N, L, NSs, M, observamos que após marcação com o anticorpo policlonal
anti-VORO, a imunofluorescência mostrou-se positiva apenas quando o cultivo
estava transfectado com a nucleoproteína N, com a proteína N combinada a
117
proteína L ou com o sistema de minireplicon do VORO (Figs. 40 a-c), não sendo
observado marcação nos outros experimentos realizados (Figs. 39 a-d), o que
demonstrou a expressão da proteína N e o papel importante dessa nucleoproteína e
da polimerase L na replicação e a transcrição do VORO.
A produção de partículas semelhantes a vírus, “virus-like particles”, e sua
utilização no processo de expressão de proteínas recombinantes tem mostrado ser
uma técnica importante para estudo da relação vírus/célula em termos da ligação
parasita/hospedeiro (Palucha et al., 2005). A ligação do vírus na célula
provavelmente necessita de todos os componentes da replicação viral, incluindo
proteínas estruturais e não estruturais, assim como, o genoma viral ou seu análogo.
No presente estudo, utilizou-se a incorporação do segmento do minigenoma do
VORO para realizar a medição da atividade da Renilla e determinam indiretamente a
produção de VLP.
Primeiramente, as células transfectadas com o minigenoma, pT7riboSM2-
OROV-vMpro-vRL, em conjunto com os plasmídeos de expressão da polimerase
viral L (pTM1-OROV-L) e da nucleoproteína N (pTM1-OROV-N) (Fig. 34, coluna 1)
ou com os plasmídeos de expressão das proteínas L, N e das glicoproteínas Gn/Gc
(pTM1-OROV-M) (Fig. 34, coluna 2) demonstrou que houve uma atividade da
proteína repórter Renilla. Resultados semelhantes foram observados para o VUUK,
no entanto, os experimentos para geração de VLP desse vírus foram caracterizados
pela utilização de outra proteína repórter, a proteína CAT (Overby et al., 2006).
Como a concentração das proteínas Gn/Gc é essencial para geração de VLP,
foi realizado no presente estudo, a análise da dependência do VLP em relação a
distintas concentrações das glicoproteínas do VORO. Diferentes quantidades de
plasmídeos que expressavam as glicoproteínas Gn/Gc, pTM1-OROV-M
(concentrações entre 200 a 1000 ng/µL), juntamente com os plasmídeos que
expressavam as proteínas L e N e o minireplicon do VORO foram co-transfectados
em células BSR-T7/5 (Fig. 35). Diferentemente dos resultados observados por
Overby e colaboradores (2006) para o VUUK, na construção do minireplicon
contendo as proteínas Gn/Gc para o VORO não foi observado um aumento dose-
dependente da atividade das proteínas repórter nas células transfectadas em
relação ao aumento da quantidade de glicoproteínas.
A diminuição da atividade da Renilla observada em todas as concentrações
utilizadas do plasmídeo pTM1-OROV-M pode ter sido causada por alterações nas
118
sequências nucleotídicas e aminoacídicas nesse plasmídeo. Shi e colaboradores,
2006, demonstraram que deleções no segmento completo NSm ou das regiões dos
domínios I, II, III ou V do segmento precursor da poliproteína M do VBUN não
produziram VLPs, no entanto, houve a recuperação de VLPs de plasmídeos que
continham deleções no domínio IV. Em relação às glicoproteínas virais, Overby et al
(2006) encontraram dois mecanismos diferentes responsáveis pela ausência de
atividade da proteína repórter mediada por VLP. Eles demonstraram que dois
resíduos da cauda citoplasmática da proteína Gn, L23 e L24, são importantes para
geração e montagem de VLP na membrana do Golgi. Outros três resíduos na cauda
Gn, L46, E47 e L50, foram considerados importantes na localização intracelular de
ambas as glicoproteínas, além disso, mutações nesses resíduos preveniu a ação
efetiva dessas duas glicoproteínas ao Golgi e subsequente formação de VLPs.
Novos estudos são necessários para análise de VLP do VORO e para o
aprimoramento da construção desse sistema para esse vírus.
Recentemente, as VLPs têm sido desenvolvidas para o VRVF, como também
utilizadas como um modelo de vacina em camundongos (Habjan et al., 2009;
Naslund et al., 2009). Essas VLPs, quando analisadas ao microscópio eletrônico,
tem uma morfologia semelhante às partículas de VRVF. Além disso, essas VLPs
contém glicoproteínas virais em seu envelope, proteínas estas que são reconhecidas
por antissoro e contém um minigenoma ativo, mas não se replicam ou produzem
progenes (Habjan et al., 2009). Em geral, as VLPs possuem propriedades similares
a cepas virulentas de seus agentes correspondentes, pois os antígenos estruturais
predominantes são apresentados ao sistema imune na conformação nativa (Grgacic
& Anderson, 2006).
As vacinas disponíveis contra o VRVF são baseadas em preparações com
vírus inativados. Apesar de algumas desvantagens terem sido relatadas sobre esta
vacina (Lubroth et al., 2007), um candidato a vacina “viva” contra VRVF foi produzido
em que era observado a deleção no genoma viral de dois fatores de virulência, as
proteínas não estruturais NSs e NSm (Bird et al., 2008). Como houve a completa
deleção desses dois genes envolvidos na virulência, acredita-se que seja improvável
que o vírus possa reverter e tornar-se virulento novamente, no entanto, outras
desvantagens de vacinas “vivas” são a necessidade de aumentar o nível de
biossegurança para produção das mesmas e o risco de utilizar vírus atenuados em
indivíduos imunocomprometidos (Naslund et al., 2009).
119
Este estudo demonstrou que a proteína não estrutural NSs do VORO regula
negativamente a polimerase viral no sistema de minireplicon que reconstitui o
nucleocapsídeo do VORO a partir do cDNA transfectados. A proteína NSs mostrou-
se altamente ativada, com a concentração plasmidial de 200 ng/mL a 1000ng/mL
resultando em 90% na redução da atividade da Renilla (Fig. 38). Para o VBUN foi
observado uma redução de aproximadamente 60% da atividade no sistema de
minigenoma (Weber et al., 2001). Em outro experimento com células de mamíferos,
a proteína NSs foi detectada até 6 horas após infecção e o nível de expressão foi
considerado semelhante ao da nucleoproteína N do VBUN que é traduzida do
mesmo RNAm (Scallan & Elliott, 1992).
A proteína não estrutural NSs é ativa em baixa concentração plasmidial,
assim como, em relação ao contexto natural da expressão do gene do segmento S
do VORO (Fig. 36) o que sugere que o efeito é autêntico e pode também ser
funcional na infecção do VORO, fato este também observado para o VBUN e VLAC
(Weber et al., 2001; Blakqori et al., 2003). Interessante notar que para o VRVF não
foi observado o efeito inibitório da proteína não estrutural NSs em relação ao
sistema de minigenoma, pelo contrário foi observado aumento da atividade do gene
repórter (Ikegami et al., 2005). Fato este distinto daqueles observados por outros
dois grupos de pesquisa que demostraram um efeito inibitório da proteína NSs no
minireplicon do VRVF (Ikegami et al., 2005; Bouloy & Weber, 2010; Brennan et al.,
2011).
O efeito inibitório da proteína NSs pode depender da presença de uma região
codificante intacta, o que foi observado neste estudo, já que as mutações de códons
de iniciação em um plasmídeo suporte do segmento S do VORO aboliu os efeitos da
proteína NSs (Fig. 37). Este episódio demonstra evidências que o efeito foi mediado
pela proteína NSs em vez de ter sido mediado pelo RNA. Em outro estudo, houve
relato que proteína NSs do VBUN afeta os promotores dos três segmentos virais, no
entanto, é possível que a proteína NSs iniba a atividade básica da polimerase viral,
tanto por interação direta quanto por ação de cofatores celulares (Scallan & Elliott,
2000).
No presente estudo, testou-se tendo sido observado que a mesma possui um
papel inibitório na polimerase do VORO (Fig. 44), indicando um mecanismo
altamente conservado que pode agir entre os limites do gênero do Orthobunyavirus.
Iroegbu & Pringle (1981) observaram que o rearranjo entre vírus compatíveis do
120
gênero Orthobunyavirus ocorre exclusivamente na fase inicial do ciclo replicativo.
Estudos anteriores com VBUN mostraram que a proteína NSs se acumula nas
células durante a infecção viral e está localizada no citoplasma, onde ocorre a
replicação da maioria do bunyavírus. Dessa forma, é possível que altos níveis da
proteína NSs alcançados durante a infecção possa suprimir o crescimento de um
segundo bunyavírus na mesma célula (Scallan & Elliott, 1992; Weber et al., 2001).
Um estudo com a proteína não estrutural do VRVF, membro do gênero
Phlebovirus, mostrou que a mesma não produz um efeito negativo em sistema de
minireplicon VBUN (Lopez et al., 1995). A proteína NSs dos vírus desses dois
gêneros da família Bunyaviridae são diferentes, em tamanho, sequência primária, e
no modo de codificação, sugerindo uma diversidade funcional; dessa forma, é
possível que as proteínas não estruturais NSs desses dois gêneros diferentes
tenham adotado funções diferentes ou que se sobrepõem em relação a replicação
viral (Scallan & Elliott, 2000). Interessante notar que a proteína NSs mostrou-se não
essencial para viabilidade dos vírus em sistemas de recuperação deficientes em
NSs, VBUN, VLAC e VAKA (Bridgen et al., 2001; Blakqori & Weber, 2005; Ogawa et
al., 2007).
A relevância do efeito inibitório da proteína NSs no sistema de minireplicon
não é totalmente clara, pois a ausência da proteína não afeta a titulação do VBUN
em células BHK e não causa detrimento para o VLAC em células VERO. (Bridgen et
al., 2001; Blakqori et al., 2007). Além disso, estudos recentes mostraram que ambas
as proteínas NSs do VBUN e VRVF possuem papel antagonista na resposta ao
interferon em camundongos IFN competentes e células mamárias, sendo esta
proteína identificada como um fator virulento e antagonista do sistema do interferon
(Haller et al., 2000; Bridgen et al., 2001).
As viroses com genomas segmentados podem trocar segmentos genômicos,
dando origem a viroses heterotípicas. Recombinações de segmentos de RNA entre
vírus com genomas segmentados pertencentes ao mesmo gênero ou sorogrupo
foram mostradas para membros da família Bunyaviridae tanto in vivo quanto in vitro
(Pringle, 1996; Sall et al., 1999). Com objetivo de avaliar a base molecular da
recombinação entre VORO e VBUN, ambos orthobunyavírus, em um modelo
heterólogo, nós investigamos se os respectivos complexos de transcrição seriam
ativos.
121
No presente trabalho, as células BSRT-7/5 foram transfectadas com
determinadas combinações possíveis entres os plasmídeos de expressão das
nucleoproteínas N, polimerase viral L e minigenomas do VORO e VBUN. A proteína
repórter Renilla foi detectada quando houve co-transfecção das células com os
plasmídeos de expressão das proteínas N e L do VBUN com transfecção com o
minigenoma do VORO ou quando houve co-transfecção das células com os
plasmídeos de expressão das proteínas N e L do VORO com transfecção com o
minigenoma do VBUN (Fig. 41, colunas 7 e 11; Fig 42), mostrando que o complexo
de transcrição de ambos os vírus podem reconhecer o terminal das sequências
genômicas do VORO e VBUN.
Adicionalmente, observamos que não houve atividade da proteína repórter
quando houve substituição da nucleoproteína N do VORO pela proteína L do VBUN,
quando houve substituição da nucleoproteína L do VORO pela proteína N do VBUN
ou vice-versa (Figs. 41 e 42). Presume-se que complexos funcionais de proteínas de
nucleocapsídeos heterólogas não tenham sido formados. Chandrika e
colaboradores, 1995, relataram que foi possível trocar a nucleoproteína do vírus
Sendai pela nucleoproteína do vírus do Sarampo, ambos Paramixovírus (vírus de
RNA, não segmentado, filamento negativo) sem dano a síntese dos respectivos
genomas. Várias tentativas foram realizadas para investigar se os complexos de
replicação de vírus de RNA de filamento negativo poderiam reconhecer modelos de
RNA heterólogos. Dimock & Collins (1993) demonstraram que a recuperação do
minigenoma do hPIV tipo 3 não foi suportada pelo RSV, como também, pelo PIV
bovino tipo 3.
Para o VSV, foi demonstrado que a substituição de partículas defeituosas
entre dois sorotipos diferentes, New Jersey e Indiana, foi apenas possível quando o
complexo replicativo foi fornecido pelo sorotipo do VSV- New Jersey e o minigenoma
do VSV-Indiana (Moyer, 1989), dessa forma, parecem que na maioria dos casos os
complexos de replicação são altamente específicos para RNA homólogos.
Ressaltamos que nossos resultados mostraram que o minigenoma do VORO foi
aceito como modelo para o complexo de replicação do VBUN e vice-versa, ou seja,
houve empacotamento, replicação, transcrição para ambos os vírus. A transcrição
do terminal 3’ e 5’ de ambos os vírus indica que os sinais de inicialização e de
parada não são altamente específicos para o VORO e VBUN, mas podem ser
reconhecidos para os dois orthobunyavírus.
122
Por fim, o sistema de minireplicon desenvolvido para o VORO constitui o
primeiro sistema genético construído para um vírus brasileiro e pode ser utilizado
para reconstruir geneticamente as regiões não codificantes e os genes virais
objetivando estudar as funções de determinadas regiões do genoma e regiões
gênicas ao longo de diferentes períodos do ciclo replicativo viral, tais como a
transcrição, replicação e empacotamento das ribonucleoproteínas. Ademais, o
sistema de minireplicon para o VORO pode constituir uma poderosa ferramenta para
a construção de proteínas recombinantes e desenvolvimento de antivirais em
potencial que possam ser utilizados em terapias antivirais em nível de saúde pública.
123
6. CONCLUSÃO
Este trabalho descreveu pela primeira vez o sistema de minireplicon para um
importante agente patogênico, o VORO, o segundo arbovírus causador de
doença em humanos, após o VDEN;
Primeiro sistema genético construído para um vírus brasileiro;
A enzima T7RNAP foi funcional para a transcrição do minireplicon e dos
genes do VORO;
O promotor do segmento M foi eficiente para ativação do sistema de
minigenoma do VORO;
A polimerase viral L e a nucleoproteína N do VORO mostraram-se funcionais
no sistema de minireplicon demostrando a formação das ribonucleoproteínas;
Os terminais do segmento M constroem uma região promotora e estão
envolvidos no reconhecimento da polimerase viral L;
Efeito autêntico e funcional da proteína não estrutural NSs;
A proteína não estrutural NSs do VORO regula negativamente a polimerase
viral no sistema de minireplicon dess vírus.
Tanto a proteína não estrutural NSs do VORO quanto a proteína não
estrutural do VBUN regularam negativamente o sistema de minigenoma do
VORO;
O sistema de minireplicon para o VORO pode constituir uma poderosa
ferramenta para a construção de proteínas recombinantes e desenvolvimento
de antivirais em potencial que possam ser utilizados em terapias antivirais em
nível de saúde pública;
Melhorar o entendimento da transcrição, do ciclo replicativo do genoma e das
funções das proteínas não estruturais e estruturais do VORO, levando a
geração de um sistema de recuperação capaz de formar um vírus atenuado
que poderá ser utilizado como modelo para futuras fabricações de vacinas
contra esse importante vírus.
124
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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