universidade federal do paranÁ stephanie bath de …

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

STEPHANIE BATH DE MORAIS

ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 EM

CARCINOMAS MAMÁRIOS

CURITIBA

2014

1

STEPHANIE BATH DE MORAIS

ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 EM

CARCINOMAS MAMÁRIOS

Monografia apresentada à disciplina Trabalho de

Conclusão de Curso II (Bmed006) como requisito

parcial à conclusão do curso de Biomedicina,

Setor de Ciências Biológicas, Universidade

Federal do Paraná.

Orientadora: Prof.ª Enilze Maria de Souza

Fonseca Ribeiro

CURITIBA

2014

2

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e pelo sustento durante todos esses anos. Pela graça e

misericórdia renovadas em mim todos os dias. Sem Ele eu não seria capaz de coisa

alguma.

À minha orientadora Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro pela

orientação e oportunidade de desenvolver meu trabalho junto a ela. Foi uma grande

alegria e honra participar de sua linha de pesquisa durante este ano.

Ao Prof. Dr. Iglenir João Cavalli pela dedicação e paciência em me ensinar.

Aos membros da banca por aceitarem me avaliar e pelas contribuições ao

trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética pela

amizade, pelos momentos de descontração e pelas várias ajudas durante este ano.

Às pacientes que estiveram envolvidas neste estudo, sem elas esta pesquisa

não seria possível.

À Drª Tatiana A. C. B. de Souza, minha supervisora do estágio obrigatório no

Instituto Carlos Chagas/Fiocruz-PR, pela amizade e pelos ensinamentos. Agradeço

por tantas vezes ter sido compreensiva nos momentos em que precisei me dedicar

um pouco mais ao TCC.

A meus colegas do Laboratório de Proteômica e Engenharia de Proteínas por

aquilo que me ensinaram e ajudaram durante esse ano.

A meus pais, Claudimir e Karin, pelo cuidado e amor. Por me ensinarem a

enfrentar todas as dificuldades, por serem meu exemplo de vida. Obrigada pela

compreensão e proteção. Obrigada por tantas vezes me ajudarem com minhas

necessidades. Obrigada por estarem sempre presentes em minha vida, sei que

posso sempre confiar em vocês. É uma honra ser sua filha, amo vocês!

A meu irmão Abner que esteve sempre ao meu lado para me incentivar e

fazer rir. Pela alegria em ter um irmão tão companheiro, protetor e querido. Obrigada

por sempre me fazer sentir capaz.

Ao Lucas pelo amor, carinho e incentivo. Mesmo estando distante sempre me

fez sentir amada e muitas vezes me ajudou em minhas dúvidas e dificuldades.

Obrigada por sempre se orgulhar de mim e por compreender quando eu precisava

estudar. Quero contigo crescer e aprender, eu te amo!

3

Às amigas do curso de Biomedicina com quem tive a oportunidade de estar

durante todos estes anos. Com quem aprendi e me diverti. Agradeço pelo

companheirismo e pela paciência comigo.

Aos amigos que me são como irmãos. Agradeço pela amizade, pelo amor,

pela preocupação e por toda a compreensão durante todos estes anos de estudo.

4

RESUMO

O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer em mulheres de todo o

mundo. A incidência dessa doença maligna vem aumentando a cada ano, de forma

que depois do câncer de pele não melanoma, o câncer de mama é o mais incidente

na população feminina brasileira e mundial. A análise de genes envolvidos no início

e na progressão tumoral é uma das estratégias que pode ser adotada para auxiliar a

compreensão da doença e a orientação de pesquisas para o desenvolvimento

terapêutico. O gene do receptor de neurotensina do tipo 1 (NTSR1) tem sido descrito

como contribuinte da progressão tumoral do câncer de mama. A sua expressão

aumentada é considerada um marcador prognóstico desfavorável em diversos

tumores, incluindo carcinomas mamários e o ganho do número de cópias gênicas,

na maioria dos casos, associa-se ao aumento da expressão gênica. O objetivo deste

trabalho foi analisar a alteração do número de cópias do gene NTSR1 em 78

amostras de carcinomas mamários primários e associá-la à diferenciação e

progressão dos subtipos deste câncer presentes na nossa amostra. Essa análise foi

realizada por meio de ensaios de PCR quantitativa em tempo real em grupos de

amostras tumorais dos subtipos nomeados luminal A, luminal B, HER2 positivo e

triplo negativo. Os subtipos moleculares apresentam diferentes fatores de risco,

aspectos clínicos e patológicos e respostas aos tratamentos, evidenciando a

importância de marcadores que auxiliem na subclassificação dos tumores de mama.

Verificamos que a alteração do número de cópias do gene NTSR1 depende do

subtipo do câncer de mama e foi maior nos subtipos de maior agressividade (triplo

negativo e HER2 positivo). Além disso, foi verificada uma associação entre os

maiores números de cópias do gene e as amostras de maior grau histológico. O

gene NTSR1 e suas alterações do número de cópias podem ser um importante

marcador para os subtipos mais agressivos do câncer de mama, além de ser um

potencial alvo terapêutico para estes subtipos, que, no caso do triplo negativo, não

possui uma estratégia de tratamento específica.

Palavras-chave: Câncer de mama. Gene NTSR1. Classificação imunohistoquímica.

Alteração do número de cópias. Marcadores.

5

ABSTRACT

Breast cancer is the leading cause of cancer death in women worldwide. The

incidence of this malignant disease has been increasing every year, in a way that,

breast cancer is the most frequent cancer in the Brazilian and worldwide women,

after non-melanoma skin cancer. The analysis of genes involved in the emergence

and progression of tumors is one of the strategies that may be adopted to support the

understanding of the disease and the guidance of researches for therapeutic

development. The neurotensin receptor type 1 gene (NTSR1) has been described

as contributor to breast cancer’s tumor progression. Its overexpression is considered

a negative prognostic marker in various tumors, including breast carcinomas and the

copy number gain of NTSR1 gene, in most cases, is associated with increased gene

expression. The objective of this study was to analyze the copy number alterations of

the NTSR1 gene in 78 samples of primary breast carcinomas and relate it to the

differentiation and progression in the detected immunohistochemistry subtypes in our

sample. This analysis was carried out by real time quantitative PCR assay in tumors

sample groups denominated as luminal A, luminal B, HER2 positive and triple

negative subtypes. The molecular subtypes present different risk factors, clinical and

pathological aspects and responses to treatments, highlighting the importance of

markers which aid in the sub-classification of breast tumors. It was found that the

copy number alterations of the NTSR1 gene depends on the breast cancer subtype

and was higher in more aggressive subtypes (triple negative and HER2 positive).

Furthermore, it was observed an association between increase copy numbers of the

gene and the samples with higher histological grade. The NTSR1 gene and its copy

number alterations may be an important marker for more aggressive breast cancer

subtypes, as well as being a potential therapeutic target for these subtypes, which in

the triple negative’s case, does not have a specific treatment strategy.

Keywords: Breast cancer. NTSR1 gene. Immunohistochemistry classification. Copy

number alterations. Markers.

6

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................7

2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................................................9

2.1 CÂNCER DE MAMA...............................................................................................9

2.2 CLASSIFICAÇÃO MOLECULAR DO CÂNCER DE MAMA.................................12

2.3 FATORES GENÉTICOS......................................................................................16

2.4 ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS............................................................17

2.5 GENE NTSR1 E PROTEÍNA NTSR1...................................................................17

3 JUSTIFICATIVA......................................................................................................24

4 OBJETIVOS............................................................................................................25

4.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................25

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................25

5 METODOLOGIA.....................................................................................................26

5.1 AMOSTRAS.........................................................................................................26

5.2 EXTRAÇÃO DE DNA...........................................................................................30

5.3 PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL............................................................31

5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................32

6 RESULTADOS........................................................................................................33

6.1 SUBTIPOS MOLECULARES...............................................................................33

6.2 IDADE...................................................................................................................37

6.3 METÁSTASE EM LINFONODOS AXILARES......................................................38

6.4 GRAU HISTOLÓGICO.........................................................................................39

7 DISCUSSÃO...........................................................................................................41

8 CONCLUSÃO.........................................................................................................45

REFERÊNCIAS..........................................................................................................46

7

1 INTRODUÇÃO

O câncer abrange mais de 100 doenças que têm em comum a proliferação

celular desordenada e constitui um problema de saúde pública mundial. Em 2012

foram registrados 14,1 milhões de novos casos mundiais e 8,2 milhões de mortes

por câncer. As perspectivas para o futuro revelam um quadro ainda mais

preocupante, é esperada a ocorrência de 21,4 milhões de novos casos no nível

global e 13,2 milhões de mortes por câncer para o ano de 2030. A prevenção, o

diagnóstico e o controle do câncer precisam receber uma significativa atenção, pois

o crescente número de novos casos poderá esgotar os recursos suficientes para seu

tratamento e acompanhamento (INCA, 2014).

O Brasil não apresenta um quadro diferente do mundial. Para este ano de

2014 as estimativas apontaram para o surgimento de 576 mil novos casos de

câncer. Desconsiderando o câncer de pele não melanoma, o câncer de mama é o

mais incidente e a principal causa de morte por câncer na população brasileira

feminina (INCA, 2014).

Atualmente, diversas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de

identificar alterações genéticas que possam ser utilizadas como marcadores

capazes de facilitar o diagnóstico precoce e a compreensão das diversas vias de

sinalização intracelular que contribuem para a iniciação e a progressão do câncer de

mama. Além disso, os marcadores ideais são aqueles que possibilitam a realização

de testes pouco invasivos, possuem alta eficiência e sensibilidade e auxiliam na

criação de propostas de novas abordagens terapêuticas mais específicas para cada

caso identificado.

Marcadores como a superexpressão da proteína HER2 e presença dos

receptores hormonais (estrogênio e progesterona) representam importantes

ferramentas de classificação do câncer de mama e de seleção da melhor terapia

disponível (RAKHA et al., 2010). A subdivisão do câncer de mama através da

análise de expressão gênica (classificação molecular) foi primeiramente descrita por

Perou e colaboradores (2000) e Sorlie e colaboradores (2001, 2003). Em uma

versão atualizada da classificação original, podem ser identificados quatro subtipos

moleculares do câncer de mama descritos em ordem crescente de agressividade

tumoral: Luminal A, Luminal B, HER2 positivo e Basal (GOLDHIRSCH et al., 2011).

8

O gene do receptor de neurotensina do tipo 1 apresenta-se como um

potencial marcador para o câncer de mama. Assim como outros receptores de

peptídeos que promovem o crescimento celular, o receptor da neurotensina tem sido

descrito com expressão aumentada em alguns tumores atuando em proliferação

celular, sobrevivência, invasão, angiogênese e metástase (SOUAZÉ et al., 2006). No

câncer de mama a expressão aumentada deste receptor é um marcador prognóstico

desfavorável, sendo um provável marcador da progressão tumoral nos diferentes

subtipos moleculares (DUPOUY et al., 2014).

Considerando a importância da classificação molecular e o potencial papel

desempenhado pelo receptor de neurotensina do tipo 1 no câncer de mama, o

objetivo deste trabalho foi avaliar a alteração do número de cópias (CNA, do inglês:

Copy Number Alterations) do gene NTSR1 em amostras de quatro subtipos de

carcinoma mamário.

9

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Câncer de mama

O câncer de mama é o câncer mais frequentemente diagnosticado e é a

principal causa de morte por câncer em mulheres de todo o mundo, tanto em países

desenvolvidos como em países em desenvolvimento. É responsável por 23% dos

novos casos totais de câncer e por 14% do total de mortes por câncer (JEMAL et al.,

2011). De acordo com o INCA (2014), a estimativa de novos casos para o Brasil é

de 57.120 para o biênio de 2014/2015, com um risco estimado de 56,09 casos a

cada 100 mil habitantes. Em países da América do Norte e da Europa as taxas de

mortalidade do câncer de mama têm diminuído, devido à detecção precoce e aos

melhores tratamentos (JEMAL et al., 2011). Entretanto no Brasil as taxas de

mortalidade por câncer de mama ainda são altas, provavelmente porque o

diagnóstico ocorre em estágios mais avançados da progressão tumoral (INCA,

2014). O diagnóstico precoce do câncer permite que o tratamento seja iniciado

quando o câncer ainda não se espalhou e, desta forma, é possível observar uma

redução das taxas de mortalidade (IARC, 2002; LITAKER; TOMOLO, 2007; VOGT et

al., 2014).

O sintoma mais comum e palpável é a formação de nódulos de consistência

dura e irregular nas mamas, acompanhada ou não de dor. Além disso, podem

aparecer nódulos palpáveis na axila, secreção no mamilo, alterações na pele da

mama, como abaulamento ou retração e aspecto das mamas semelhante à casca

de uma laranja. As formas atuais mais frequentes de diagnóstico do câncer de

mama são o exame clínico e a mamografia. O exame clínico das mamas é realizado

por um médico ou por enfermeiros treinados na busca por nódulos superficiais e

deve ocorrer a cada um ano em mulheres a partir de 40 anos. A mamografia

consiste na radiografia da mama que permite a visualização de lesões ainda iniciais,

devendo ser realizada uma vez a cada dois anos em mulheres entre 50 e 69 anos

ou de acordo com a recomendação médica (INCA, 2014).

O carcinoma mamário não possui uma causa única, mas resulta de um

conjunto de fatores que podem contribuir para o desenvolvimento tumoral. Entre eles

estão os fatores endócrinos relacionados à exposição ao estrógeno, como menarca

precoce (antes dos 11 anos de idade), menopausa tardia (após os 50 anos), uso de

10

contraceptivos orais e da terapia hormonal pós-menopausa. Constituem-se ainda

como parte dos fatores de risco a nuliparidade, a primeira gravidez tardia (após os

30 anos), a idade avançada, a raça (mulheres brancas são aquelas que apresentam

maior suscetibilidade ao câncer de mama), o excesso de peso, o consumo

exagerado de álcool e a exposição a radiações ionizantes em idade inferior a 35

anos (NEWCOMB; WERNLI, 2010; JEMAL et al., 2011; SCHNEBLE et al., 2014;

INCA, 2014).

A predisposição genética também se apresenta como um fator de risco para o

câncer de mama. Embora represente menos de 10% dos casos, o histórico familiar

positivo é bem consolidado como sendo um fator de risco para este câncer.

Mulheres com casos de um parente de primeiro grau diagnosticado com câncer de

mama apresentam um aumento de aproximadamente duas vezes no risco para o

câncer de mama. Este risco aumenta de acordo com o número de parentes

afetados (DUMALAON-CANARIA et al., 2014).

O sistema mais utilizado para a classificação dos tumores malignos é o

sistema TNM, que categoriza o câncer dependendo da extensão do tumor primário

(T), da ausência ou presença de metástases em linfonodos regionais (N) e a

ausência ou presença de metástases à distância (M). A cada uma destas categorias

é adicionado um número para indicar a extensão da doença maligna (QUADRO 1).

Esta classificação é disponibilizada pelo INCA (2014) e está de acordo com os

padrões da União Internacional de Combate ao Câncer (UICC).

T- Tumor primário N - Linfonodos regionais M – Metástase à distância

TX - O tumor primário não

pode ser avaliado

NX - Os linfonodos regionais não

podem ser avaliados

M0 - Ausência de

metástase à distância

T0 - Não há evidência de

tumor primário

N0 - Ausência de metástase em

linfonodos regionais

M1 - Metástase à distância

Tis - Carcinoma in situ N1-N3 - Comprometimento crescente

dos linfonodos regionais

T1-T4 - Tamanho crescente

e/ou extensão local do tumor

primário

QUADRO 1 - CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA DE TUMORES MALIGNOS DE ACORDO COM O SISTEMA TNM FONTE: O autor (2014), http://www.cancer.org.br/tnm

11

Os carcinomas mamários podem também ser classificados de acordo com o

seu grau histológico. O sistema Nottingham Grandin, modificação do sistema Scarf-

Bloom-Richardson, é o mais recomendado para a realização da graduação

histológica. O grau histológico oferece um panorama das características biológicas e

dos comportamentos clínicos. Baseia-se no grau de diferenciação do tecido tumoral

e indica o potencial de malignidade dos tumores invasivos.

Grau I (baixo): bem diferenciado e com melhor prognóstico.

Grau II (intermediário): moderadamente diferenciado.

Grau III (alto): pouco diferenciado e com pior prognóstico.

O alto grau histológico, além de ser relacionado a um pior prognóstico,

também é descrito com maior probabilidade de recorrência mais precoce e de morte

(RAKHA et al., 2010).

A maior parte dos casos de câncer de mama acomete as células epiteliais

que revestem os ductos e os lóbulos mamários, sendo denominados de carcinomas

ductais e carcinomas lobulares, respectivamente. Há ainda outros subtipos

histológicos, como os mucinosos, os medulares, os tubulares e os papilares, mas

que correspondem a uma parcela muito menor dos casos (GUIMARÃES, 2008). O

primeiro estágio da neoplasia mamária é o carcinoma in situ (CIS), as células

apresentam atipia e possuem um significativo aumento das taxas mitóticas e das

alterações genéticas. O estágio mais avançado desta neoplasia é o carcinoma

invasor (CI), que é caracterizado pelo rompimento da membrana basal pelas células

epiteliais, resultando na invasão do estroma circundante (TLSTY et al., 2004).

Muitos aspectos contribuem para a grande importância clínica do câncer de

mama, entre eles está a alta taxa de recorrência da doença. Mesmo após o

tratamento curativo é necessário um acompanhamento das pacientes por toda a sua

vida, visto que cerca de 15% destas mulheres irão desenvolver uma segunda

neoplasia maligna dentro de dez anos. Estas recorrências ocorrem principalmente

na forma de metástases que atingem um órgão distinto do local original. No câncer

de mama, as metástases podem ser encontradas nos linfonodos regionais

(linfonodos axilares, infraclaviculares, mamários internos e supraclaviculares) e em

órgãos distantes. Conforme mostra a FIGURA 1 as metástases em locais distantes

para o câncer de mama estão preferencialmente localizadas no pulmão, no fígado e

nos ossos. A heterogeneidade das metástases dificulta a definição de cura e dos

12

fatores de risco do carcinoma mamário (UICC, 2004; WEIGELT et al., 2005;

SCHNEBLE et al., 2014).

FIGURA 1 - METÁSTASES MAIS COMUNS DO CÂNCER DE MAMA FONTE: WEIGELT et al. (2005)

2.2 Classificação Molecular do Câncer de Mama

A classificação molecular do carcinoma mamário é esquematizada tomando

como base a expressão gênica dos diversos fenótipos tumorais. Descrita

inicialmente por Perou e colaboradores (2000), foi demonstrado que os carcinomas

mamários podem ser classificados em quatro grupos de acordo com o perfil de

expressão gênica: luminal, basal, normal-like e HER2 positivo. Estudos posteriores

realizados por Sorlie e colaboradores (2001, 2003) subdividiram o grupo luminal em

luminal A e B. Algumas das diferenças entre os subtipos são relacionadas ao status

dos receptores hormonais de estrogênio (ER) e progesterona (PR) e à amplificação

do oncogene ERBB2 (também denominado HER2). Em alguns casos também têm

sido medida a expressão da proteína Ki-67 (marcador de proliferação celular) e de

marcadores basais como citoqueratinas de alto peso molecular, porém, a sua

utilização ainda não está completamente estabelecida (RAKHA, E. A et al., 2010).

Luminal A: Este grupo apresenta um perfil de expressão semelhante ao das

células luminais do epitélio mamário normal e representa 50-60% dos carcinomas

mamários. Em geral apresenta alta expressão de ER e expressa genes regulados

pelo estrogênio. Além disso, os carcinomas enquadrados neste subtipo expressam

PR, não possuem amplificação do gene HER2 e têm baixa expressão de genes

13

relacionados à proliferação celular, como o gene da proteína Ki-67. Sua ocorrência

está associada a tumores de menor grau histológico, com o melhor prognóstico e

alta taxa de sobrevida (2,2 anos). Estes pacientes não possuem uma boa resposta à

quimioterapia, por isso o mais utilizado para eles é a terapia adjuvante com o

tamoxifeno (GOLDHIRSCH et al., 2011; REIS-FILHO & PUSZTAI, 2011; ALIZART et

al., 2012; EROLES et al., 2012).

Luminal B: Tumores com o perfil molecular do tipo luminal B representam 10

a 20% dos casos de câncer de mama. Assim como o grupo luminal A, eles

expressam ER e PR, porém possuem um fenótipo mais agressivo: prognóstico

inferior, maior grau histológico e menor taxa de sobrevida (1,6 anos). Além disso, o

grupo luminal B é definido como ER+/PR+/HER2+ ou ER+/PR+/HER2- e alto Ki-67.

Portanto, outra diferença encontra-se na amplificação do gene HER2 ou na

expressão de genes proliferativos. A terapia é realizada de forma satisfatória com

quimioterápicos (GOLDHIRSCH et al., 2011; REIS-FILHO & PUSZTAI, 2011;

ALIZART et al., 2012; EROLES et al., 2012).

HER2 positivo: A principal característica deste grupo é a alta expressão do

gene HER2. Mas também é encontrada uma alta expressão de genes relacionados

à proliferação celular, altos valores de Ki-67 e negatividade para os receptores

hormonais. A terapia é realizada através da combinação da quimioterapia com

drogas anti-HER2. Os tumores mamários deste tipo correspondem entre 15 e 20%

do total e são clinicamente caracterizados por possuírem um prognóstico

desfavorável e alto grau histológico. Outra característica observada neste grupo é a

presença de mutações no gene TP53 em mais de 40% das pacientes

(GOLDHIRSCH et al., 2011; REIS-FILHO & PUSZTAI, 2011; ALIZART et al., 2012;

EROLES et al., 2012).

Normal-like: Apresentam perfil de expressão semelhante às células do

parênquima mamário normal e aos fibroadenomas. São ER+/PR+/HER2- com alta

expressão de Ki-67. Seu prognóstico clínico é considerado intermediário e com

baixo grau histológico. Representando a minoria dos carcinomas mamários (5-10%)

são pouco caracterizados e existem dúvidas sobre a sua real existência, algumas

pesquisas sustentam a hipótese de que este grupo seja uma contaminação com

tecido normal durante os ensaios (REIS-FILHO; PUSZTAI, 2011; EROLES et al.,

2012).

14

Basal: Dentre os cinco grupos propostos por Perou et al. (2000) e Sorlie et al.

(2001, 2003) o grupo basal é considerado o mais agressivo, com o maior grau

histológico, prognóstico desfavorável e surgimento em idade precoce (antes dos 50

anos). Possui um fenótipo normalmente ER-/PR-/HER2- e alto Ki-67. A expressão é

semelhante ao das células basais mioepiteliais mamárias, composta de uma ou mais

citoqueratinas de alto peso molecular (CK 5/6, CK 14, CK 17), vimentina e EGFR

(receptor do fator de crescimento epidermal). Tem sido encontrada uma forte relação

do subtipo basal e mutações no gene BRCA1 e cerca de 85% das pacientes deste

subtipo são portadoras de mutações no gene TP53. Sua frequência é de 10-20% e o

tratamento mais indicado é a quimioterapia (TURNER; REIS-FILHO, 2006; BADVE

et al., 2011; GOLDHIRSCH et al., 2011; REIS-FILHO & PUSZTAI, 2011; ALIZART et

al., 2012; EROLES et al., 2012).

Com o objetivo de reduzir a heterogeneidade existente dentro dos subtipos já

definidos, nos últimos anos têm sido propostos novos subtipos moleculares com

base em suas características específicas, como claudina baixa (do inglês, claudin

low) e apócrino molecular (do inglês, molecular apocrine).

Claudina baixa: Identificado em 2007 por Herschkowitz e colaboradores, este

subtipo se particulariza pela baixa expressão das claudinas 3, 4 e 7 e da e-caderina

e alta expressão de marcadores de Transição Epitelial-Mesenquimal (EMT, do

inglês, epithelial-to-mesenchymal transition). Essa expressão gênica faz com que as

células tumorais deste subtipo apresentem características similares a células tronco

iniciadoras de tumor. Seu perfil molecular é descrito como ER-/PR-/HER2-. Abrange

aproximadamente 13% dos carcinomas mamários e possui um prognóstico

considerado intermediário e alto grau histológico (PRAT et al., 2010; REIS-FILHO &

PUSZTAI, 2011; ALIZART et al., 2012).

Apócrino molecular: Os tumores deste tipo são definidos como ER-/PR- e

HER2 positivo ou negativo. O prognóstico é desfavorável e o grau histológico é alto.

A característica peculiar deste subtipo encontra-se na alta expressão do receptor de

androgênio (AR) (FARMER et al., 2005; REIS-FILHO & PUSZTAI, 2011; ALIZART et

al., 2012).

Os subtipos moleculares do câncer de mama apresentam diferentes fatores

de risco, diferentes aspectos clínicos e patológicos e diferentes respostas às

terapias empregadas. Desta forma, a classificação molecular pode auxiliar na

determinação da melhor abordagem terapêutica específica para cada indivíduo, e

15

não simplesmente para a média das pacientes (GOLDHIRSCH et al., 2011;

EROLES et al., 2012). As principais diferenças entre os subtipos encontram-se

resumidas na TABELA 1.

TABELA 1 - CARACTERÍSTICAS DOS SUBTIPOS MOLECULARES DO CÂNCER DE MAMA

Subtipo Molecular

Marcadores imunohistoquímicos

Ki-67 Marcadores

basais Grau

histológico Prognóstico Frequência

Luminal A ER+ PR+ HER2- Baixo - I ou II Bom 50-60%

Luminal B ER+ PR+ HER2+ ER+ PR+ HER2-

Baixo Alto

- II ou III Intermediário/ Desfavorável

10-20%

HER2 positivo ER- PR- HER2+ Alto + II ou III Desfavorável 15-20%

Basal ER- PR- HER2- Alto -/+ III Desfavorável 10-20%

Normal-like ER+ PR+ HER2- Alto -/+ I Intermediário 5-10%

Claudina baixa ER- PR- HER2- Médio -/+ III Intermediário 12-14%

Apócrino Molecular

ER- PR- HER2+/- Alta -/+ II ou III Desfavorável -

FONTE: GOLDHIRSCH et al. (2011); REIS-FILHO & PUSZTAI (2011); ALIZART et al. (2012); EROLES et al. (2012).

Existe ainda um grupo heterogêneo definido como tumores triplo negativos

(TNBC) que são caracterizados pela ausência de expressão dos receptores ER, PR

e de amplificação do gene HER2, daí o termo ―triplo negativos‖. Eles não se

encaixam na classificação molecular atual, porém representam 10-17% de todos os

tipos de câncer de mama. Apesar de apresentarem-se semelhantes em nível de

transcrição aos tumores do grupo basal, não existe uma sobreposição completa

entre eles. No estudo desenvolvido por Bertucci e colaboradores (2008) apenas 71%

dos TNBC se encaixaram no subtipo basal e apenas 77% dos tumores basais foram

triplo negativos. Os TNBC possuem um histórico clínico ainda mais agressivo. Estão

associados a uma maior incidência de metástases viscerais e cerebrais do que

ósseas, uma baixa taxa de sobrevida, uma alta taxa de recidiva local e idade

precoce de início da doença. Devido a rotas alternativas de metastatização, a

maioria das mortes neste subtipo ocorre nos cinco primeiros anos de tratamento e

existe uma maior probabilidade de recorrência entre o primeiro e o terceiro ano. Por

falta de tratamento específico é aplicado o tratamento convencional com

quimioterápicos, mas isso deixa margens para o aparecimento da recidiva local

(CLEATOR et al., 2007; BADVE et al., 2011).

16

2.3 Fatores Genéticos

O câncer de mama, bem como outros carcinomas, resulta de um acúmulo de

alterações genéticas e epigenéticas, que transformam células normais em células

tumorais. As alterações genéticas acontecem devido a instabilidades no genoma e

podem ser perda de genes, amplificações gênicas, mutações de ponto e

translocações cromossômicas. A maioria destas alterações leva à morte celular, mas

o envolvimento de alguns genes chaves, como os proto-oncogenes e os genes

supressores de tumor, pode culminar na formação de um tumor (OSBORNE et al.,

2004).

Os proto-oncogenes são responsáveis por codificar proteínas que recebem e

processam sinais estimuladores do crescimento celular que surgem no meio

extracelular e têm a sua expressão regulada de acordo com as necessidades da

célula. Quando estes genes sofrem alguma mutação, são transformados nos

chamados oncogenes, promovendo uma proliferação celular desregulada

característica de tumores (WEINBERG, 2008). Os oncogenes mais frequentemente

encontrados no carcinoma mamário são ERBB2, MYC, CCND1 e PI3KCA (LEE;

MULLER, 2010).

Genes supressores de tumor realizam a manutenção da integridade do

genoma e o controle da proliferação celular através de proteínas regulatórias, as

quais impedem a progressão do ciclo celular quando são encontrados danos ao

DNA a fim de repará-los. Dois eventos de mutação em um destes genes podem

desequilibrar o funcionamento normal da célula, levando-a a uma proliferação

desordenada sem que ocorra a checagem e o reparo dos danos ao genoma

(OSBORNE et al., 2004; WEINBERG, 2008).

Os genes supressores de tumor mais frequentemente envolvidos com o

câncer de mama podem ser divididos em dois grupos: de ―alto risco‖ e de ―baixo a

moderado risco‖ para o desenvolvimento tumoral. O grupo de ―alto risco‖ é

constituído principalmente dos genes BRCA1, BRCA2, PTEN, TP53, LKB1/STK11 e

CDH1; e no segundo grupo estão os genes CHK2, TGFB1, CASP8 e ATM

(OLDENBURG et al., 2007). Estes genes compreendem apenas 25% dos tumores

de mama de causa hereditária, pode-se então inferir que devem existir outros genes

ainda não identificados envolvidos na susceptibilidade ao câncer de mama

(BRADBURY & OLOPADE, 2007).

17

2.4 Alteração do número de cópias de DNA

CNA pode ser definido como alterações somáticas do número de cópias de

um segmento de DNA com tamanho variável entre 1 kilobase (kb) e 1 megabase

(Mb) que são encontradas em uma sub-população de células clonais. Ou seja,

apresentam uma alteração do número de cópias quando comparada ao DNA

genômico constitucional do mesmo indivíduo (BEROUKHIM et al., 2010). Essas

mudanças estão presentes no genoma humano na forma de ganhos ou perdas de

segmentos cromossômicos (COOPER et al., 2008). Análises genéticas e de

citogenética têm revelado muitas dessas alterações no genoma humano

desempenhando um importante papel na etiologia de doenças complexas (WEIR,

ZHAO e MEYERSON, 2004).

As alterações do número de cópias de DNA são comuns em câncer e alteram

a expressão e função dos genes localizados na região afetada. A identificação de

regiões de cromossomos com alteração no número de cópias e dos genes

envolvidos é de extrema importância na compreensão do desenvolvimento tumoral e

na busca por novos diagnósticos e alvos terapêuticos (KALLIONIEMI, 2008).

Um ganho em alterações do número de cópias de DNA está ligado a um pior

prognóstico em diversos tumores como câncer de ovário (BIRRER et al., 2007),

câncer colorretal (KIM et al., 2006), mieloma (CARRASCO et al., 2006),

meduloblastoma (MENDRZYK et al., 2005) e câncer de mama (JAIN et al., 2001).

2.5 Gene NTSR1 e proteína NTRS1

O gene humano NTSR1 está localizado no braço longo (20q13.33) do

cromossomo 20 (FIGURA 2) e é expresso principalmente no cérebro e no trato

gastrointestinal (TGI). O gene possui mais de 10 kb e contém 4 éxons e 3 íntrons

(FIGURA 3), sendo que todos os três íntrons estão localizados na região codificante

(LE et al., 1997; VINCENT et al., 1999). Na caracterização do gene realizada por Le

e colaboradores (1997) foram identificados polimorfismos de repetição

tetranucleotídea com pelo menos 23 alelos que têm sido relacionados a distúrbios

neuropsiquiátricos (LI et al., 2011; MA et al., 2013).

18

FIGURA 2 - CROMOSSOMO 20 FONTE: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=NTSR1 LEGENDA: Em vermelho, localização do gene NTSR1 no cromossomo 20 (20q13.33).

FIGURA 3 - ESTRUTURA DO GENE NTSR1 FONTE: http://refgene.com/gene/4923, adaptado pelo autor (2014)

O receptor de neurotensina do tipo 1 (NTSR1) (FIGURA 4) é uma proteína de

418 aminoácidos com sete domínios transmembrana que pertence à família dos

receptores acoplados à proteína G (FIGURA 5). Existem ainda outros receptores de

neurotensina descritos na literatura. O NTSR1 é o receptor de alta afinidade e o

NTSR2 de baixa afinidade, ambos são acoplados à proteína G. O NTSR3 é um

receptor não específico codificado pelo gene SORT1 (VINCENT et al., 1999).

FIGURA 4 - ESTRUTURA DO RECEPTOR DE NEUROTENSINA DO TIPO 1 (NTSR1) FONTE: O autor (2014), PyMol Molecular Graphics System

19

FIGURA 5 - REPRESENTAÇÃO DO NTSR1 COM OS SETE DOMÍNIOS TRANSMEMBRANA FONTE: LE et al. (1997) LEGENDA: I-VII, domínios transmembrana numerados.

A neurotensina (NTS) é o principal agonista do NTSR1 e foi descoberta em

1973 por Carraway e Leeman. A NTS exerce funções no sistema nervoso e em

órgãos periféricos. No cérebro ela atua como um neuromodulador da transmissão da

dopamina e da secreção hormonal da glândula pituitária anterior. Na periferia é um

modulador parácrino e endócrino no TGI e no sistema cardiovascular. Suas

atividades no TGI envolvem motilidade gastrointestinal, estimulação das secreções

pancreática e biliar, e age como facilitadora da translocação de ácidos graxos para o

lúmen intestinal. Além disso, a NTS é bem retratada por estimular o crescimento

celular de diversos tecidos normais e cancerosos (VINCENT et al., 1999; EVERS,

2006).

Devido a este papel no crescimento celular, a NTS e seu receptor NTSR1 têm

sido relacionados à progressão de diversas neoplasias como câncer pancreático,

câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de pulmão, carcinoma de células

escamosas de cabeça e pescoço (Head and neck squamous cell carcinoma,

HNSCC) e câncer de mama (SOUAZÉ et al., 2006; EVERS, 2006; DUPOUY et al.,

2011). O NTSR1 possui um papel fundamental na ativação de inúmeros efeitos da

NTS relacionados à progressão e ao crescimento tumoral. Dentre estes efeitos

podem ser citados a proliferação, a sobrevivência, a propagação metastática, a

20

proteção contra apoptose, efeitos pró-migratórios e pró-invasivos (SOMAÏ et al.,

2002; SOUAZÉ et al., 2006; DUPOUY et al., 2011).

A contribuição da NTS e do seu receptor NTSR1 no crescimento celular de

tecidos normais e, principalmente, tecidos tumorais se inicia pela ligação da NTS ao

sítio de ligação do NTSR1, que está acoplado à proteína Gq (FIGURA 6). Este

evento leva à substituição de GDP (difosfato de guanosina) por GTP (trifosfato de

guanosina) na proteína Gq. A subunidade Gαq/11, ligada ao GTP, move-se até a

fosfolipase C (PLC) ativando-a. A PLC ativada cliva o fosfatidil-inositol-4,5-bifosfato

(PIP2) em inositol-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O IP3 se liga a um receptor

específico no retículo endoplasmático abrindo os canais de cálcio (Ca2+) que serão

liberados para o citosol. O Ca2+ juntamente com o DAG ativa a proteína quinase C

(PKC) (COX; NELSON, 2011; DUPOUY et al., 2011).

Existem outras cascatas de sinalização que podem resultar da ligação da

NTS com o NTSR1, porém a maioria dos efeitos oncogênicos do NTSR1 dependem

da ativação da PKC (DUPOUY et al., 2011).

As duas isoformas mais comuns da PKC (α e β1) inibem o NTSR1 quando são

ativadas. Porém, as isoformas δ e ε mantém o NTSR1 em funcionamento. São

através destas duas últimas isoformas que se dão os efeitos oncogênicos (DUPOUY

et al., 2011).

21

FIGURA 6 - CASCATA DE SINALIZAÇÃO DESENCADEADA PELA LIGAÇÃO DE UM LIGANTE A SEU RECEPTOR LIGADO À PROTEÍNA G FONTE: Adaptado de COX; NELSON(2011) NOTA: No caso estudado, o hormônio (H) corresponde à neurotensina e o receptor específico ao receptor de neurotensina (NTSR1).

A partir da PKC será ativada a cascata das MAPKs (proteínas quinases

ativadas por mitógenos), principalmente as ERKs (quinases ativadas por fatores de

crescimento) (FIGURA 7). ERKs são proteínas relacionadas com a ativação da

transcrição de genes da proliferação celular, do bloqueio da apoptose e da

diferenciação celular. A PKC ativada pode realizar a ativação das ERKs diretamente

pela fosforilação da enzima Raf-1, ou indiretamente pela ativação do proto-oncogene

SRC. A Src fosforila a Raf-1, que foi levada até a membrana plasmática pela

proteína Ras. A Raf-1 fosforila MEK (quinase regulada por mitógeno), que por sua

vez irá fosforilar ERK. Existe ainda outro mecanismo de atuação da PKC, porém ele

ainda não é completamente elucidado. Este mecanismo ocorre pela ativação de

EGFR (receptor do fator de crescimento epidermico) por ligantes ―EGF-like‖ que são

liberados na membrana plasmática por clivagem proteolítica de enzimas como as

MMPs (metaloproteinases de matriz). O EGFR irá ativar fosfatidil-inositol-3-quinase

22

(PI3K), que irá fosforilar AKT (ou proteína quinase B, PKB). A via MAPK resultará na

transcrição de genes como o gene de resposta precoce ao crescimento (ERG1), os

genes das proteínas Elk-1 do domínio Ets e do fator de transcrição AP-1 (LENZ,

2000; DUPOUY et al., 2011; WU et al., 2012).

FIGURA 7 - CASCATA DE SINALIZAÇÃO INICIALIZADA PELA LIGAÇÃO NTS-NTSR1 FONTE: DUPOUY et al. (2011), adaptado pelo autor (2014)

O NTSR1 tem sido relacionado não só à progressão tumoral, mas também à

tumorigênese, principalmente em câncer de mama. Isso porque o gene NTSR1 é um

alvo das vias oncogênicas Wnt/APC relacionadas com o complexo de transcrição de

h-catenina/Tcf, o qual ativa genes envolvidos na proliferação e transformação

celular. Genes Wnt possuem uma regulação positiva em câncer de mama e estão

associados com a sua tumorigênese (SOUAZÉ et al., 2006).

O uso do NTSR1 como um potencial marcador para a progressão tumoral

pode ser justificada no nível transcricional. Em diversos tipos de câncer têm sido

observadas altas expressões de NTSR1, como tumor pancreático, HNSCC,

carcinoma de pulmão e câncer de mama (DUPOUY et al., 2011). No câncer de

mama, a alta expressão de NTSR1 tem sido relacionada a um pior prognóstico em

carcinoma mamário ductal (DUPOUY et al., 2009), a tumores mais agressivos com

23

parâmetros clínicos e histopatológicos desfavoráveis, como tamanho do tumor, grau

histológico, número de metástases em linfonodos e mortalidade (DUPOUY et al.,

2014). É ainda interessante observar que não é detectada expressão do gene

NTSR1 no epitélio mamário normal (SOUAZÉ et al., 2006), corroborando as

evidências da participação do gene NTSR1 no câncer de mama.

24

3 JUSTIFICATIVA

O número de novos casos mundiais do câncer de mama vem aumentando

nas últimas décadas e as estimativas para os próximos anos expõem a possibilidade

de uma ampliação na ocorrência de novos casos. A população feminina de países

em desenvolvimento é a mais afetada, possuindo as maiores incidências da doença

e as maiores taxas de mortalidade por câncer de mama, principalmente devido a

ausência de screening adequado.

Os diversos subtipos moleculares do câncer de mama (Luminal A, Luminal B,

HER2 positivo e Basal) apresentam diferentes características de expressão dos

receptores hormonais de estrogênio e progesterona e do oncogene HER2. As

pacientes classificadas em cada um dos subtipos possuem diferentes quadros

clínicos e, portanto, necessitam de terapias específicas. A agregação de novos

marcadores que aprimorem a classificação molecular é importante para

compreender a iniciação, progressão e/ou melhor abordagem terapêutica para os

diferentes subtipos do câncer de mama.

Dentro do contexto da busca por identificar regiões cromossômicas

potencialmente portadoras de genes relacionados com a iniciação e progressão

tumoral desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa, TORRESAN (2011) realizou

em estudo genômico que objetivou investigar CNAs do DNA em amostras de

tumores de mama primários e metástases em linfonodos axilares. Através da técnica

de CGH-array foi verificado que as alterações mais frequentes estavam localizadas

em diversas regiões cromossômicas, dentre elas a região 20q13.33, onde foi

identificado o gene NTSR1.

As CNAs do gene NTSR1 podem contribuir na diferenciação dos subtipos

moleculares do câncer de mama, facilitando a compreensão dos processos de

iniciação e progressão tumoral.

25

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

Analisar a associação da alteração do número de cópias do gene NTSR1 com

a diferenciação e progressão de quatro subtipos imunohistoquímicos de carcinomas

mamários.

4.2 Objetivos Específicos

Avaliar as alterações do número de cópias do gene NTSR1 dos subtipos

Luminal A, Luminal B, HER2 positivo e Triplo Negativo de carcinomas

primários de mama;

Correlacionar as alterações do número de cópias do gene NTSR1 com

fatores clínicos e prognósticos como idade da paciente, grau do tumor e

presença ou ausência de metástases em linfonodos axilares;

Comparar os resultados obtidos com os descritos na literatura.

26

5 METODOLOGIA

5.1 Amostras

As amostras de carcinomas mamários são rotineiramente coletadas após o

procedimento cirúrgico no Hospital Nossa Senhora das Graças (HNSG), Curitiba,

Paraná. Para obtenção das amostras, cada uma das pacientes recebeu as

informações sobre os objetivos da pesquisa e assinou o Termo de Consentimento

Informado Livre e Esclarecido. A coleta foi realizada com aprovação do Comitê de

Ética do Hospital Nossa Senhora das Graças (HNSG).

Foram utilizadas neste trabalho 78 amostras de pacientes portadoras de

carcinoma mamário primário não tratado, das quais, 74 amostras (95%) foram

classificadas como carcinoma ductal invasor. As amostras estão caracterizadas de

acordo com o seu quadro clínico e histopatológico no QUADRO 2. Foram tabuladas

as informações encontradas relativas à idade, diagnóstico do carcinoma mamário,

presença de metástase em linfonodos axilares, grau do tumor, status dos receptores

de estrogênio e progesterona e amplificação do gene HER2.

As amostras foram divididas em quatro grupos baseados em análise

imunohistoquímica, de acordo com o status dos receptores hormonais (ER e PR) e a

amplificação do gene HER2. Esta classificação foi baseada na definição clínico-

patológica dos subtipos de câncer de mama de Goldhirsch et al., 2011. O QUADRO

3 mostra os parâmetros clínicos e histopatológicos gerais para cada um dos quatro

grupos, sendo eles:

Triplo Negativo: ER negativo, PR negativo e HER2 negativo. Devido à falta

de dados como a identificação das citoqueratinas CK 5/6, CK 14 e CK 17, não

foi possível diferenciar os tumores triplo negativo dos tumores do subtipo

basal, por isso todo o grupo foi denominado apenas como triplo negativo.

HER2 positivo: ER negativo, PR negativo e HER2 positivo.

Luminal A: ER positivo, PR, positivo e HER2 negativo. Não foi possível

diferenciar o subtipo Luminal B (HER2 negativo) em virtude da falta de

informações referentes ao grau expressão da proteína Ki-67. Considerando

que a porcentagem dos carcinomas mamários do subtipo Luminal A é maior

que do Luminal B, os tumores com este perfil de expressão foram nomeados

como Luminal A.

27

Luminal B: ER positivo, PR positivo e HER2 positivo.

Após a coleta as amostras foram submetidas à remoção do tecido adiposo, do

tecido estromal e dos vasos sanguíneos através de tesouras e pinças esterilizadas e

de placas de Petri descartáveis. O material foi estocado em tubos tipo eppendorfs a -

80°C.

Paciente Idade Diagnóstico L G ER PR HER2

1 59 Carcinoma Ductal Invasor P II NEG NEG NEG

2 42 Carcinoma Ductal Invasor A III NEG NEG NEG

3 45 Carcinoma Ductal Invasor, associado a

Carcinoma Intraductal (>5%) P II NEG NEG NEG


Carcinoma Intraductal (>5%) A I POS POS POS (3+)

5 69 Carcinoma Ductal Invasor, associado a Doença

de Paget A III NEG NEG POS (3+)


Carcinoma Intraductal (5%) P III POS POS POS (3+)


Carcinoma Intraductal (5%) A II NEG NEG NEG (0)


Carcinoma Intraductal (20%) P III NEG NEG POS (3+)


Carcinoma Intraductal (9%) A I POS POS POS (3+)

10 53 Carcinoma Ductal Invasor A II NEG NEG POS (3+)

11 72 Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG POS (3+)

12 51 Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS POS (3+)

13 71 Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS POS (3+)

14 45 Carcinoma Ductal Invasor P III POS POS NEG (1+)

15 46 Carcinoma Lobular Invasor A II POS POS POS (3+)

16 43 Carcinoma Ductal Invasor A II NEG NEG POS

17 44 Carcinoma Ductal P - NEG NEG POS


Carcinoma Intraductal P II POS POS POS

QUADRO 2 CONTINUA - CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CARCINOMA MAMÁRIO FONTE: O autor (2014) LEGENDA: Idade, idade da paciente em anos no momento do diagnóstico; L, presença ou ausência de metástases nos linfonodos axilares; P, presença; A, ausência; G, grau do tumor; T, tamanho do tumor em mm; ER, status do receptor de estrogênio; PR, status do receptor de progesterona; HER2, amplificação do oncogene HER2; SOE, sem outra especificação.

28

19 72 Carcinoma Ductal Invasor Multicêntrico,

associado a Carcinoma Intraductal A I POS POS POS

20 55 Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG POS

21 54 Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG

22 63 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS POS (+2)


Carcinoma Intraductal (5%) P II POS POS POS (+3)

24 51 Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS POS (+3)


Carcinoma Intraductal (5%) A III NEG NEG POS

26 47 Carcinoma Ductal Invasor P III POS POS POS


Carcinoma Intraductal P - POS POS NEG

28 43 Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG NEG


30 59 Carcinoma Ductal Invasor P II NEG NEG NEG

31 65 Carcinoma Ductal Invasor P III POS POS NEG


Carcinoma Intraductal (5%) P II POS POS POS

33 47 Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS POS

34 89 Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG (2+)

35 60 Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS POS (3+)


Carcinoma Intraductal A II POS POS POS (3+)

37 82 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS POS


Carcinoma Intraductal P I POS POS POS(2+)


Carcinoma Intraductal (10%) P II POS POS POS(3+)

40 - Carcinoma Ductal Invasor (core biopsy) P - POS POS NEG

41 76 Carcinoma Ductal Invasor A I POS POS NEG

42 44 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS POS (2+)

43 70 Carcinoma Ductal Invasor multifocal P - POS POS POS

(2+/3+)

44 58 Carcinoma Ductal Invasor SOE associado a

CDIS e comedocarcinoma P II NEG NEG POS (1+)

45 66 Carcinoma Ductal Invasor SOE P II NEG NEG NEG


29

46 97 Carcinoma Ductal Invasor (luminal) - - POS POS NEG

47 33 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG

48 42 Carcinoma Intraductal subtipo Comedocarcinoma P III POS POS POS (3+)

49 62 Carcinoma Ductal Invasor A II NEG NEG NEG

50 72 Carcinoma Ductal Invasor SOE P II POS POS POS (2+)

51 67 Carcinoma Ductal Invasor SOE associado a

carcinoma intraductal comedocarcinoma P III POS POS NEG (1+)

52 44 Carcinoma Ductal Invasor SOE P II POS POS NEG

53 57 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS POS (3+)

54 62 Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG (1+)

55 72 Carcinoma Ductal Invasor associado a carcinoma

intraductal comedocarcinoma A II POS POS NEG

56 62 Carcinoma Invasor Mucinoso, associado a

carcinoma ductal invasor SOE A I POS POS POS (3+)

57 86 Carcinoma Ductal Invasor assiciado a CDIS

padrao sólido A III POS POS NEG

58 45 Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS POS (2+)



Carcinoma Ductal in situ sólido cibriforme P III POS POS NEG

61 89 Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG POS (2+)

62 42 Carcinoma Ductal Invasor SOE - II POS POS POS (3+)

63 50 Carcinoma Ductal invasor (40%) com áreas

mucinosas (60%) A I POS POS POS (3+)

64 84 Carcinoma Ductal Invasor; comedocarcinoma P III NEG NEG POS (3+)

65 81 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG


67 42 Carcinoma Ductal Invasor; associado a

carcinoma in situ cribriforme A II POS POS NEG (2+)

68 - Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG (1+)

69 78 Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS NEG (0)

70 50 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG (1+)

71 - Carcinoma Ductal Invasor A I POS POS NEG (1+)

72 48 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG (0)


30

73 - Carcinoma Ductal Invasor A III NEG NEG NEG (0)

74 35 Carcinoma Ductal Invasor A III NEG NEG NEG (0)

75 59 Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG (+1)

76 68 Carcinoma Ductal Invasor A I POS POS NEG

77 41 Carcinoma Ductal Invasor P (II/III) NEG NEG NEG (0)

78 - Carcinoma Ductal Invasor A I POS POS NEG

QUADRO 2 CONCLUSÃO - CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CARCINOMA MAMÁRIO FONTE: O autor (2014) LEGENDA: Idade, idade da paciente em anos no momento do diagnóstico; L, presença ou ausência de metástases nos linfonodos axilares; P, presença; A, ausência; G, grau do tumor; T, tamanho do tumor em mm; ER, status do receptor de estrogênio; PR, status do receptor de progesterona; HER2, amplificação do oncogene HER2; SOE, sem outra especificação.

Subtipo Número de amostras

Idade (Média) Grau histológico Metástase em

Linfonodos

Triplo Negativo

11 50,3 Grau I (0%)

Grau II (60%) Grau III (40%)

Ausente (45%) Presente (55%)

HER2 positivo 11 64,5 Grau I (0%)

Grau II (30%) Grau III (70%)


Luminal A 28 61 Grau I (16%) Grau II (60%) Grau III (24%)


Luminal B 28 56,8 Grau I (23%) Grau II (50%) Grau III (27%)


QUADRO 3 - PARÂMETROS CLÍNICOS E HISTOPATOLÓGICOS GERAIS DOS SUBTIPOS MOLECULARES DAS AMOSTRAS DE CÂNCER DE MAMA DESTE ESTUDO FONTE: O autor (2014)

5.2 Extração de DNA

A extração de DNA de tumor mamário foi realizada a partir de um fragmento

de cada amostra que foi homogeneizado no vórtex em 130 µL de tampão de

proteinase K e 70 µL de proteinase K 10 µg/mL e incubado em banho-maria a 55°C

por 16 horas. Em seguida a proteinase K sofreu inativação por 10 minutos em banho

seco a 95°C. Foi então adicionado 1 volume de fenol:clorofórmio:álcool iso-amílico

(25:24:1 v/v), seguido de homogeneização no vórtex por 15 segundos e

centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos. Após a retirada do sobrenadante da

solução resultante, as etapas de adição de fenol, homogeneização e centrifugação

31

foram repetidas. Posteriormente à retirada do sobrenadante, foram adicionados 2

volumes de etanol absoluto e 0,2 volumes de acetato de amônio 7,5 M. A solução foi

mantida a -20 °C por 16 horas. Sendo em seguida centrifugada a 14.000 rpm por 15

minutos e seu sobrenadante descartado. Houve então adição de 1 mL de etanol

70% e centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o

DNA ressuspendido em 40 µL de água ultra pura.

As soluções de extração de DNA tiveram suas concentrações e qualidades

determinadas pelo equipamento Nanodrop® 2000, e diluídas até uma concentração

de 5 ng/µL.

5.3 PCR quantitativa em tempo real

Para determinação do número de cópias do gene NTSR1 nas 78 amostras de

DNA extraídos de tumor mamário foi empregada a técnica de PCR quantitativa em

tempo real (qPCR).

A avaliação do número de cópias do gene NTSR1 foi realizada através do

ensaio TaqMan® Copy Number Assays da empresa Life Technologies™. Esta

metodologia é baseada em uma reação dupla de PCR em tempo real que detecta a

sequência do gene alvo do estudo e a sequência de um gene de referência (RNASE

P) conhecido por apresentar duas cópias em um genoma diplóide. Este método de

detecção relativa é usado para determinar o número de cópias do gene de interesse

em um DNA de referência. Neste trabalho, para fins de simplificação, este ensaio

(TaqMan® Copy Number Assays) será referido como qPCR.

Em todas as placas, contendo as amostras tumorais, foi incluído um DNA

controle com o número de cópias dos genes de interesse conhecido. Este DNA

controle é um DNA genômico composto por um pool de amostras de indivíduos que

não apresentam a doença. Para cada reação foram utilizados: 5 µL de Master Mix, 2

µL de DNA (na concentração de 5 ng/µL), 0,5µL de mix do gene de estudo

(contendo o par de primers e a sonda TaqMan®), 0,5 µL de mix do gene RNASE P

(contendo os primers e a sonda TaqMan®) e 2 µL de água ultra pura, totalizando 10

µL de volume final de reação. Todas as amostras, incluindo o DNA controle, foram

analisadas em triplicatas na placa. Os reagentes utilizados nestas reações de qPCR

encontram-se descritos na TABELA 2. O equipamento utilizado para a realização

deste trabalho foi o Viia 7 (Applied Biosystems™).

32

TABELA 2 - COMPONENTES DA REAÇÃO DA qPCR PARA ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE EM ESTUDO

Componente Volume por reação (µL)

TaqMan Genotyping Master Mix (2x) 5,0

TaqMan Copy Number Assay (20x) 0,5

TaqMan Copy Number Reference Assay (20x) 0,5

Água ultra pura 2,0

DNA (5ng/µL) 2,0

Volume total da reação (µL) 10,0

FONTE: TaqMan® Copy Number Assays Protocol (Applied biosystems by life technologies)

As análises foram realizadas através do software Copy Caller (Life

Technologies™). Foram desconsideradas as amostras que apresentaram valor de

CT > 33 ciclos e valor de z-score ≥ 2.65. O número de cópias do DNA alvo foi

calculado pelo método da quantificação relativa: 2– ΔΔCT multiplicado por 2 (indivíduos

diploides). Este método é adotado devido à padronização prévia dos ensaios dos

primers e das sondas comercializados pela empresa que fornecem uma eficiência

de reação de 100% possibilitando que as curvas de amplificação entre os genes

alvos e o gene de referência possam ser comparadas com alta precisão.

5.4 Análise Estatística

Os resultados obtidos foram analisados por testes não paramétricos Teste t

de Student ou Teste de Kruskal-Wallis seguido da comparação entre os grupos pelo

método de Dunn. Os resultados significativos alcançados pelos testes mencionados

foram submetidos a uma análise de regressão linear. Para todas as análises foi

utilizado o sotware GraphPad Prism version 6.01 para Windows (Disponível em:

www.graphpad.com).

33

6 RESULTADOS

A análise da CNA do gene NTSR1 nas 78 amostras de câncer de mama

utilizadas neste estudo revelou, de forma geral, um ganho no número de cópias

(número de cópias >2) em 48 amostras (62%) (GRÁFICO 1). Observando-se, dessa

forma, uma significativa influência do gene NTSR1 em alguns parâmetros do câncer

de mama apresentados a seguir.

GRÁFICO 1 - ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 EM CARCINOMAS MAMÁRIOS FONTE: O autor (2014)

6.1 Subtipos Moleculares

A avaliação da CNA do gene NTSR1 nas 78 amostras dos quatro subtipos

moleculares do câncer de mama (luminal A, luminal B, HER2 positivo e triplo

negativo) foi realizada através da técnica de qPCR usando o ensaio TaqMan® Copy

Number Assays. Os GRÁFICOS 2, 3, 4 e 5 mostram o número de cópias do gene

NTSR1 para cada um dos subtipos. As médias do número de cópias para cada um

deles foi de 2,46 para luminal A, 2,68 para luminal B, 4,65 para HER2 positivo e 4,93

para triplo negativo.

62%

33%

5%

Ganho

Normal

Perda

34

14 21 27 29 31 34 40 41 46 47 51 52 54 55 57 59 60 65 66 67 68 69 70 71 72 75 76 78 NC

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Amostra Tumoral

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 2 - NÚMERO DE CÓPIAS DAS AMOSTRAS TUMORAIS MAMÁRIAS DO SUBTIPO MOLECULAR LUMINAL A FONTE: O autor (2014) LEGENDA:NC, DNA controle.

4 6 9 12 13 15 18 19 22 23 24 26 32 33 35 36 37 38 39 42 43 48 50 53 56 58 62 63 NC

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Amostra Tumoral

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 3 - NÚMERO DE CÓPIAS DAS AMOSTRAS TUMORAIS MAMÁRIAS DO SUBTIPO MOLECULAR LUMINAL B FONTE: O autor (2014) LEGENDA: NC, DNA controle.

35

5 8 10 11 16 17 20 25 44 61 64 NC0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Amostra Tumoral

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 4 - NÚMERO DE CÓPIAS DAS AMOSTRAS TUMORAIS MAMÁRIAS DO SUBTIPO MOLECULAR HER2 positivo FONTE: O autor (2014) LEGENDA: NC, DNA controle.

1 2 3 7 28 30 45 49 73 74 77 NC0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Amostra Tumoral

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 5 - NÚMERO DE CÓPIAS DAS AMOSTRAS TUMORAIS MAMÁRIAS DO SUBTIPO MOLECULAR TRIPLO NEGATIVO FONTE: O autor (2014) LEGENDA: NC, DNA controle.

36

Mediante a submissão dos dados obtidos ao teste de Kruskal-Wallis foi

possível averiguar uma diferença significativa entre os grupos (p<0,0001). O

GRÁFICO 6 mostra a CNA para os grupos com as medianas e os percentis 25% e

75% (TABELA 3). Com o intuito de identificar entre quais grupos se encontravam

esta diferença foi aplicado o método de Dunn, pelo qual se observou que houve

diferença significativa (p<0,05) entre os números de cópias das amostras dos grupos

triplo negativo/luminal A, triplo negativo/luminal B, HER2 positivo/luminal A e HER2

positivo/luminal B. Não sendo verificada diferença entre os subtipos luminais e entre

os subtipos triplo negativo e HER2 positivo.

Uma análise de regressão linear permitiu ainda, inferir que a CNA do gene

NTSR1 depende do subtipo de câncer de mama (b=0,9045, r2=0,4271, p<0,0001).

Os maiores ganhos do número de cópias do gene estão relacionados a subtipos

moleculares mais agressivos de carcinoma mamário (triplo negativo e HER2

positivo) (GRÁFICO 7).

Triplo

Neg

ativ

o

HER

2 Posi

tivo

Lumin

al A

Lumin

al B

0

2

4

6

8

10

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 6 - ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 DOS SUBTIPOS MOLECULARES DE CARCINOMA MAMÁRIO FONTE: O autor (2014)

37

TABELA 3 - DADOS DO TESTE DE KRUSKAL-WALLIS DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 NOS SUBTIPOS MOLECULARES DO CÂNCER DE MAMA

Subtipo Mediana Percentil 25% Percentil 75% Mínimo Máximo Valor de p

Triplo Negativo 4,260 3,870 6,530 3,290 8,740 HER2 positivo 4,330 4,110 5,700 2,920 6,030 <0,0001

Luminal A 2,130 1,908 2,975 0,940 4,960 Luminal B 2,535 2,353 4,960 1,580 4,890

FONTE: O autor (2014)

1 2 3 40

2

4

6

Subtipo Molecular

1) Luminal A

2) Luminal B3) HER2 positivo

4) Triplo Negativo

Subtipo Molecular

Nú

mero

de c

óp

ias

GRÁFICO 7 - ANÁLISE DE REGRESSÃO LINEAR DAS ALTERAÇÔES DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 NOS SUBTIPOS MOLECULARES DO CÂNCER DE MAMA FONTE: O autor (2014)

6.2 Idade

A CNA do gene NTSR1 foi também avaliada em dois grupos de idade,

pacientes em pré-menopausa e pacientes em pós-menopausa. Havia informações

sobre a idade em que se iniciou a menopausa de algumas pacientes, mas para a

grande maioria foi utilizado como critério de divisão a idade de 50 anos (idade média

em que as mulheres entram na menopausa).

Excluindo-se cinco amostras, das quais não havia informação relativa à idade,

a maioria das pacientes encontra-se em idade considerada pós-menopausa (68%

conforme mostra o GRÁFICO 8).

b=0,9045 r2=0,4271 p<0,0001

38

GRÁFICO 8 - DISTRIBUIÇÃO POR IDADE DAS PACIENTES ESTUDADAS NESTE TRABALHO FONTE: O autor (2014)

A relação entre a CNA e a menopausa foi avaliada pelo teste t de Student,

porém não houve significância estatística (p=0,2840). O GRÁFICO 9 mostra esta

relação.

Pré-menopausa Pós-menopausa0

2

4

6

8

10

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 9 - ANÁLISE DAS ALTERAÇÕES DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 NOS GRUPOS PRÉ E PÓS-MENOPAUSA DAS PACIENTES DESTE ESTUDO FONTE: O autor (2014)

6.3 Metástase em Linfonodo Axilar

As amostras das pacientes deste estudo foram divididas entre presença ou

ausência de metástase em linfonodo axilar. Cada um dos dois grupos contou com 38

pacientes, sendo que não foi possível classificar duas das 78 pacientes. Através do

teste t de Student concluiu-se que não existe relação significativa entre a CNA do

gene NTSR1 e a presença ou ausência de metástase no linfonodo axilar (p=0,5356)

(GRÁFICO 10).

Pré-menopausa

32%Pós-menopausa

68%

39

Presente Ausente0

2

4

6

8

10

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 10 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 QUANTO A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE METÁSTASE NOS LINFONODOS AXILARES EM PACIENTES COM CARCINOMA MAMÁRIO FONTE: O autor (2014)

6.4 Grau histológico

O grau histológico foi inserido como categoria 1 entre os fatores prognósticos

para o câncer de mama por Fitzgibbons et al. (1999) e Hammond et al. (1999),

sendo considerado, portanto, um importante parâmetro de avaliação da

agressividade tumoral. Por isso, as pacientes foram classificadas em dois grupos:

aquelas com tumor em grau histológico I e II (47 pacientes) e aquelas com grau

histológico III (26 pacientes). Não havia informações sobre o grau histológico de

cinco pacientes.

Após a submissão ao teste t de Student dos dados encontrados referentes à

CNA do gene NTSR1, observou-se uma diferença significativa (p=0,0015) entre os

grupos, com um maior ganho do número de cópias nas amostras de grau histológico

III (regressão linear, b=1,1111, r2=0,1327, p=0,0015) (GRÁFICOS 11 E 12).

40

Grau I ou II Grau III0

2

4

6

8

10

Nú

me

ro d

e c

óp

ias

GRÁFICO 11 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 QUANTO AO GRAU HISTOLÓGICO EM AMOSTRAS DE CARCINOMA MAMÁRIO FONTE: O autor (2014)

1 20

1

2

3

4

5

Legenda:1 - Grau I ou II2 - Grau III

Grau histológico

Nú

mero

de c

óp

ias

GRÁFICO 12 - ANÁLISE DE REGRESSÃO LINEAR DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE NTSR1 NOS DIFERENTES GRAUS HISTOLÓGICOS DO CÂNCER DE MAMA FONTE: O autor (2014)

b=1,1111 r2=0,4271 p<0,0001

41

7 DISCUSSÃO

O avanço de tecnologias em ensaios com genes e seus produtos têm

permitido a criação de novas classificações do câncer de mama baseadas em

padrões de expressão gênica e CNAs de genes (RAKHA et al., 2010). O

aprimoramento da classificação do câncer de mama em diversos subtipos possui

grande relevância na realização de diagnósticos e desenvolvimento de tratamentos

mais específicos de acordo com as características apresentadas por cada grupo. A

necessidade de marcadores específicos é justificada inclusive pela epidemiologia da

doença. O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente em mulheres no

mundo, contribuindo com 23% dos novos casos de câncer por ano, sendo

responsável por 14% do total de mortes por câncer (JEMAL et al., 2011).

Através de seus receptores a NTS atua em diversas funções no sistema

nervoso e periférico; em cânceres sua principal atuação é no crescimento celular

(WU et al., 2012). Embora existam outros receptores da NTS, o NTSR1 é o principal

mediador da sua atuação na proliferação, migração, invasão e sobrevivência dos

tumores (SOUAZÉ et al., 2006). DUPOUY et al. (2009) concluíram que a NTS

isolada não pode ser considerada um marcador no câncer de mama, pois seus

efeitos oncogênicos só ocorrem em tumores que possuem expressão do NTSR1.

Dessa forma, na última década, o NTSR1 tem sido associado à progressão tumoral

em diversos tecidos (YOUNES et al., 2014). A ação tumoral deste receptor envolve a

ativação da rota Ras→Raf→Mek→Erk da cascata de sinalização das MAPKs. A Erk

no final desta cascata atua na fosforilação de fatores de transcrição que irão regular

genes reguladores do crescimento, além de conferir independência de ancoragem e

perda de inibição por contato (WEINBERG, 2008; DUPOUY et al., 2011).

O NTSR1 não é expresso constitutivamente nas células normais do epitélio

mamário, porém nas células tumorais são encontradas inclusive altas expressões

desse gene. Uma hipótese para essa expressão anormal é a influência da via

oncogênica de sinalização Wnt/APC na ativação do controle transcricional do gene

NTSR1 (DUPOUY et al., 2009, 2011). A expressão protéica de NTSR1 pode ser

aumentada pela alteração do número de cópias do segmento do cromossomo que

contém o gene NTSR1. Os processos que dão origem a essas aberrações ainda não

são completamente elucidados, porém sabe-se que segmentos de cromossomos

com um ganho do número de cópias podem fazer com que os genes contidos na

42

região afetada tenham uma expressão amplificada (WEIR et al., 2004; POLLACK et

al., 2002).

CHIN et al. (2006) encontraram uma relação entre a amplificação do número

de cópias da região cromossômica 20q13 e a alta expressão de genes localizados

na região em tumores de mama primários. Como continuidade do trabalho de

TORRESAN (2011), que também encontrou alterações no número de cópias desta

região cromossômica em câncer de mama, nós estudamos a alteração do número

de cópias do gene NTSR1 e encontramos um ganho do número de cópias em 62%

das amostras de carcinoma mamário.

Esse resultado está em concordância com as pesquisas que vêm relatando

expressão do gene NTSR1 em câncer de mama (SOUAZÉ et al., 2006; DUPOUY et

al., 2009, 2014). Estes estudos demonstram que o NTSR1 participa da progressão

neoplásica em câncer de mama em pelo menos 35% de todos os casos da doença.

A presença do NTSR1 está fortemente relacionada com o carcinoma mamário

ductal invasivo. Dentre as 78 amostras analisadas, 74 eram do tipo carcinoma ductal

invasivo, e dentre essas 45 amostras (61%) apresentaram ganho do número de

cópias do gene NTSR1. SOUAZÉ et al. (2006) observaram que 91% dos carcinomas

ductais invasivos expressavam o gene; e DUPOUY et al. (2009) estimou positividade

para NTSR1 em 50-100% das amostras ductais invasivas.

Através do presente estudo foi possível demonstrar a relação do gene NTSR1

com subtipos moleculares mais agressivos do câncer de mama, os tumores triplo

negativos e os HER2 positivos, os quais apresentaram as maiores alterações do

número de cópias do gene. DUPOUY et al. (2014) e YOUNES et al. (2014)

constataram que, nos carcinomas de mama e pulmão, respectivamente, o complexo

NTS/NTSR1 estimula a expressão de HERs e EGFR, corroborando a relação entre o

NTSR1 e os tumores do subtipo HER2 positivo. Além disso, a baixa expressão de

NTSR1 é correlacionada à positividade de ER (DUPOUY et al., 2009), característica

comum dos subtipos luminal A e B, que apresentaram uma menor alteração do

número de cópias do gene.

Além de estar relacionado aos subtipos de pior prognóstico, o NTSR1 é

também associado a outros parâmetros de prognóstico desfavorável. Nós

observamos uma relação entre as maiores alterações do número de cópias do gene

e grau histológico III do câncer de mama. Esta constatação corroborou outros

estudos que verificaram a alta expressão do gene NTSR1 em graus histológicos

43

mais avançados (SOUAZÉ et al., 2006; DUPOUY et al., 2009). Estes estudos

demonstraram ainda que a alta expressão de NTSR1 é plausivelmente encontrada

em carcinomas mamários de maior tamanho tumoral, com alta mortalidade e grande

número de metástases em linfonodos. Porém, nós não encontramos relação

significante entre a alteração do número de cópias do gene NTSR1 e metástases em

linfonodos axilares.

Os métodos convencionais de tratamento do câncer de mama incluem

cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapia hormonal. Mas na maioria dos casos,

esses tratamentos somente oferecem às pacientes um suporte. Por isso, novas

opções de tratamento são bem vindas no desenvolvimento terapêutico do câncer de

mama (WU et al., 2012). Além disso, novas abordagens terapêuticas podem

solucionar a demanda por tratamentos específicos que esteja de acordo com as

características de cada tipo tumoral. Como é o caso dos carcinomas mamários com

fenótipo triplo negativo, que possuem uma carência por tratamentos específicos. O

sistema da neurotensina representa um potencial alvo terapêutico no câncer de

mama devido a frequente expressão do NTSR1, evidenciada por trabalhos de

expressão gênica e alteração do número de cópias do gene NTSR1, e a sua relação

com a progressão e a malignidade do tumor, verificados também neste trabalho.

Alguns estudos já demonstraram que uma interferência negativa sobre o

NTSR1 resulta em redução do potencial de progressão tumoral. O tratamento de

células de câncer colorretal injetadas em camundongo com um antagonista

específico do NTSR1 (SR 48692) promoveu o controle do crescimento tumoral. Após

o tratamento foi observada uma redução de 38% do volume tumoral (MAORET et

al., 1999). Moody e colaboradores (2001) demonstraram que este mesmo

antagonista do NTSR1 é capaz de reduzir o número de colônias de uma linhagem

de carcinoma de pequenas células de pulmão (Small cell lung cancer, SCLC) e

também inibir a proliferação dessas células quando injetadas em camundongo. A

inibição da expressão de NTSR1 em células da linhagem MDA-MB-231 injetadas em

camundongo diminuiu o desenvolvimento tumoral comparado aos animais em que a

expressão do NTSR1 não foi inibida (SOUAZÉ et al., 2006). Um experimento

semelhante a este foi realizado em células de câncer de pulmão e observou-se

redução do crescimento tumoral e de metástases (YOUNES et al., 2014).

Recentemente, Castillo-Rodríguez e colaboradores (2014) realizaram o

tratamento de um modelo animal para câncer de mama triplo negativo com células

44

MDA-MB-231 com NTS-polyplex, o qual resultou em inibição do crescimento

tumoral. NTS-polypex são nanopartículas sintéticas que podem transferir um DNA

plasmidial contendo como inserto um gene de interesse a células que possuam

NTSR1 em sua membrana plasmática, incluindo células cancerosas. Neste estudo o

gene inserido no DNA plasmidial foi o HSVtk, o qual está envolvido com a indução

de apoptose. Diante destes estudos, é possível inferir que abordagens terapêuticas

que incluam a inibição da expressão e função do NTSR1 apresentam um promissor

potencial em pesquisas e na terapia do câncer de mama, particularmente no subtipo

de fenótipo triplo negativo.

45

8 CONCLUSÃO

O gene NTSR1 apresenta-se em diferentes níveis de alterações do número

de cópias dependendo do subtipo do câncer de mama: luminal A, luminal B, HER2

positivo e triplo negativo.

O número de cópias é maior para os subtipos mais agressivos e de pior

prognóstico, os tumores triplo negativos e HER2 positivos.

A relação do gene NTSR1 com um pior prognóstico no câncer de mama pode

ser evidenciada também pelo significativo ganho do número de cópias em

tumores com grau histológico III em relação aos tumores com grau histológico

I e II. A associação entre a alteração do número de cópias do gene em estudo

e os fatores de idade da paciente e presença ou ausência de metástases em

linfonodos axilares não é estatisticamente significante.

Os resultados encontrados corroboram aqueles descritos na literatura, visto

que a maioria dos tumores analisados possui relação com o gene NTSR1,

principalmente os tumores de pior prognóstico clínico. A alteração do número

de cópias contribui para a sinalização desencadeada pela ativação da NTSR1

que está envolvida na progressão tumoral do câncer de mama.

46

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALIZART, M.; SAUNUS, J.; CUMMINGS, M.; LAKHANI, S. R. Molecular classification of breast carcinoma. Diagnostic Histopathology, v. 18, n. 3, p. 97–103, 2012.

BADVE, S.; DABBS, D. J.; SCHNITT, S. J.; et al. Basal-like and triple-negative breast cancers: a critical review with an emphasis on the implications for pathologists and oncologists. Modern pathology, v. 24, n. 2, p. 157–67, 2011.

BERTUCCI, F.; FINETTI, P.; CERVERA, N.; et al. How basal are triple-negative breast cancers? International journal of cancer, v. 123, n. 1, p. 236–40, 2008.

BIRRER, M. J.; JOHNSON, M. E.; HAO, K.; et al. Whole genome oligonucleotide-based array comparative genomic hybridization analysis identified fibroblast growth factor 1 as a prognostic marker for advanced-stage serous ovarian adenocarcinomas. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, v. 25, n. 16, p. 2281–7, 2007.

BRADBURY, A. R.; OLOPADE, O. I. Genetic susceptibility to breast cancer. Reviews in endocrine & metabolic disorders, v. 8, n. 3, p. 255–67, 2007.

CARRASCO, D. R.; TONON, G.; HUANG, Y.; et al. High-resolution genomic profiles define distinct clinico-pathogenetic subgroups of multiple myeloma patients. Cancer cell, v. 9, n. 4, p. 313–25, 2006.

CARRAWAY, R.; LEEMAN, S. E. The isolation of a new hypotensive peptide, neurotensin, from bovine hypothalam. Journal of Biological Chemistry, v.248, n.29, p. 6854-61, 1973.

CASTILLO-RODRÍGUEZ, R. A; ARANGO-RODRÍGUEZ, M. L.; ESCOBEDO, L.; et al. Suicide HSVtk gene delivery by neurotensin-polyplex nanoparticles via the bloodstream and GCV Treatment specifically inhibit the growth of human MDA-MB-231 triple negative breast cancer tumors xenografted in athymic mice. PloS one, v. 9, n. 5, p. 1-12, 2014.

CHIN, K.; DEVRIES, S.; FRIDLYAND, J.; et al. Genomic and transcriptional aberrations linked to breast cancer pathophysiologies. Cancer cell, v. 10, n. 6, p. 529–41, 2006.

CLEATOR, S.; HELLER, W.; COOMBES, R. Triple-negative breast cancer: therapeutic options. Lancet Oncology, v. 8, n. 3, p. 235–244, 2007.

COOPER, G. M. M.; ZERR, T.; KIDD, J. M.; et al. Systematic assessment of copy number variant detection via genome-wide snp genotyping. Nature genetics. v. 40, n. 10, p. 1199-203, 2008.

COX, M.; NELSON, D. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.

47

DUMALAON-CANARIA, J. A.; HUTCHINSON, A. D.; PRICHARD, I.; WILSON, C. What causes breast cancer? A systematic review of causal attributions among breast cancer survivors and how these compare to expert-endorsed risk factors. Cancer causes & control : CCC, 2014.

DUPOUY, S.; DOAN, V. K.; WU, Z.; MOURRA, N.; LIU, J. Activation of EGFR , HER2 and HER3 by neurotensin / neurotensin receptor 1 renders breast tumors aggressive yet highly responsive to lapatinib and metformin in mice. Oncotarget, v. 5, n. 18, p. 8235–8251, 2014.

DUPOUY, S.; MOURRA, N.; DOAN, V. K.; et al. The potential use of the neurotensin high affinity receptor 1 as a biomarker for cancer progression and as a component of personalized medicine in selective cancers. Biochimie, v. 93, n. 9, p. 1369–78, 2011.

DUPOUY, S.; VIARDOT-FOUCAULT, V.; ALIFANO, M.; et al. The neurotensin receptor-1 pathway contributes to human ductal breast cancer progression. PloS one, v. 4, n. 1, p. 1-7, 2009.

EROLES, P.; BOSCH, A.; PÉREZ-FIDALGO, J. A.; LLUCH, A. Molecular biology in breast cancer: intrinsic subtypes and signaling pathways. Cancer treatment reviews, v. 38, n. 6, p. 698–707, 2012.

EVERS, B. M. Neurotensin and growth of normal and neoplastic tissues. Peptides, v. 27, n. 10, p. 2424–33, 2006.

FARMER, P.; BONNEFOI, H.; BECETTE, V.; et al. Identification of molecular apocrine breast tumours by microarray analysis. Oncogene, v. 24, n. 29, p. 4660–71, 2005.

FITZGIBBONS, P. L.; PAGE, D. L.; WEAVER, D.; et al. Prognostic Factors in Breast Cancer. Archives of Pathology and Laboratory Medicine, v.124, p.966-78, 1999.

GOLDHIRSCH, A; WOOD, W. C.; COATES, A S.; et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO, v. 22, n. 8, p. 1736–47, 2011.

GUIMARÃES, J.R. Manual de oncologia. 3. ed. São Paulo: Libbs Farmacêutica, 2008.

HAMMOND, M. E. H.; FITZGIBBONS, P. L.; COMPTON, C. C.; et al. College of American Pathologists Conference XXXV : Solid Tumor Prognostic Factors — Which , How and So What ? Archives of Pathology and Laboratory Medicine, v.124, p.958-65, 1999.

HERSCHKOWITZ, J. I.; SIMIN, K.; WEIGMAN, V. J.; et al. Identification of conserved gene expression features between murine mammary carcinoma models and human breast tumors. Genome biology, v. 8, n. 5, p. R76, 2007.

48

IARC. Breast Cancer Screening. 7th ed. Lyon, 2002.

INCA. Instituto Nacional de Câncer. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Coordenação de Prevenção e Vigilância. Estimativas 2014: Incidências de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro. Disponível em: <http://www.inca.gov.br>. Acesso em novembro de 2014.

JAIN, A. N.; CHIN, K.; ERIKSTEIN, B. K.; et al. Quantitative analysis of chromosomal CGH in human breast tumors associates copy number abnormalities with p53 status and patient survival. Pnas, v. 98, n. 14, 2001.

JEMAL, A.; BRAY, F.; FERLAY, J. Global Cancer Statistics. CA Cancer J Clin, v. 61, n. 2, p. 69–90, 2011.

KALLIONIEMI, A. CGH microarrays and cancer. Current opinion in biotechnology, v. 19, n. 1, p. 36–40, 2008.

KIM, M.-Y.; YIM, S.-H.; KWON, M.-S.; et al. Recurrent genomic alterations with impact on survival in colorectal cancer identified by genome-wide array comparative genomic hybridization. Gastroenterology, v. 131, n. 6, p. 1913–24, 2006.

LE, F.; GROSHAN, K.; ZENG, X. P.; RICHELSON, E. Characterization of the Genomic Structure, Promoter Region, and a Tetranucleotide Repeat Polymorphism of the Human Neurotensin Receptor Gene. Journal of Biological Chemistry, v. 272, n. 2, p. 1315–1322, 1997.

LEE, E. Y. H. P.; MULLER, W. J. Oncogenes and tumor suppressor genes. Cold Spring Harbor perspectives in biology, v. 2, n. 10, p. 361-377, 2010.

LENZ, G. Mecanismos de Transdução de Sinal Ativados por Purinas , Pirimidinas e Fatores de Crescimento em Culturas de Astrócitos. 164 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2000.

LI, J.; CHEN, C.; CHEN, C.; et al. Neurotensin receptor 1 gene (NTSR1) polymorphism is associated with working memory. PloS one, v. 6, n. 3, p. 1-7, 2011.

LITAKER, D.; TOMOLO, A. Association of contextual factors and breast cancer screening: finding new targets to promote early detection. Journal of women’s health (2002), v. 16, n. 1, p. 36–45, 2007.

MA, H.; HUANG, Y.; ZHANG, B.; et al. Association between neurotensin receptor 1 (NTR1) gene polymorphisms and schizophrenia in a Han Chinese population. Journal of molecular neuroscience, v. 50, n. 2, p. 345–52, 2013.

MAORET, J.-J.; ANINI, Y.; ROUYER-FESSARD, C.; GULLY, D.; M, L. Neurotensin and a non-peptide neurotensin receptor antagonist control human colon cancer cell growth in cell culture. International Journal Cancer, v. 454, n. 80, p. 448–454, 1999.

49

MENDRZYK, F.; RADLWIMMER, B.; JOOS, S.; et al. Genomic and protein expression profiling identifies CDK6 as novel independent prognostic marker in medulloblastoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, v. 23, n. 34, p. 8853–62, 2005.

MOODY, T. W.; CHILES, J.; CASIBANG, M.; et al. SR48692 is a neurotensin receptor antagonist which inhibits the growth of small cell lung cancer cells. Peptides, v. 22, n. 1, p. 109–115, 2001.

NEWCOMB, P. A.; WERNLI, K. J. Risk Factors. In: E. R. Sauter; M. B. Daly. Breast Cancer Risk Reduction and Early Detection. Boston: Springer, 2010. p. 3-18.

OLDENBURG, R. A; MEIJERS-HEIJBOER, H.; CORNELISSE, C. J.; DEVILEE, P. Genetic susceptibility for breast cancer: how many more genes to be found? Critical reviews in oncology/hematology, v. 63, n. 2, p. 125–49, 2007.

OSBORNE, C.; WILSON, P.; TRIPATHY, D. Oncogenes and Tumor Suppressor Genes in Breast Cancer: Potencial Diagnostic and Therapeutic Applications. The Oncologist, v. 9, p. 361–377, 2004.

PEROU, C. M.; SORLIE, T.; EISEN, M. B.; et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature, v. 406, n. 6797, p. 747–52, 2000.

PRAT, A.; PARKER, J. S.; KARGINOVA, O.; et al. Phenotypic and molecular characterization of the claudin-low intrinsic subtype of breast cancer. Breast Cancer Research, v. R68, n. 12, p. 1-18, 2010.

POLLACK, J. R.; SORLIE, T.; PEROU, C. M.; et al. Microarray analysis reveals a major direct role of DNA copy number alteration in the transcriptional program of human breast tumors. Pnas, v. 99, n. 20, 2002.

RAKHA, E. A; REIS-FILHO, J. S.; ELLIS, I. O. Combinatorial biomarker expression in breast cancer. Breast cancer research and treatment, v. 120, n. 2, p. 293–308, 2010.

RAKHA, E. A.; REIS-FILHO, J. S.; BAEHNER, F.; et al. Breast cancer prognostic classification in the molecular era : the role of histological grade. Breast Cancer Research, v. 207, n. 12, p. 1-12, 2010.

REIS-FILHO, J. S.; PUSZTAI, L. Gene expression profiling in breast cancer: classification, prognostication, and prediction. Lancet, v. 378, n. 9805, p. 1812–23, 2011.

SCHNEBLE, E. J.; GRAHAM, L. J.; SHUPE, M. P.; et al. Future Directions for the Early Detection of Recurrent Breast Cancer. Journal of Cancer, v. 5, n. 4, p. 291–300, 2014.

SOMAÏ, S.; GOMPEL, A.; ROSTÈNE, W.; FORGEZ, P. Neurotensin counteracts apoptosis in breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 295, p. 482–488, 2002.

50

SORLIE, T.; PEROU, C. M.; TIBSHIRANI, R.; et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, n. 19, p. 10869–74, 2001.

SORLIE, T.; TIBSHIRANI, R.; PARKER, J.; et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 100, n. 14, p. 8418–23, 2003.

SOUAZÉ, F.; DUPOUY, S.; VIARDOT-FOUCAULT, V.; et al. Expression of neurotensin and NT1 receptor in human breast cancer: a potential role in tumor progression. Cancer research, v. 66, n. 12, p. 6243–9, 2006.

TLSTY, T.D.; CRAWFORD, Y.G.; HOLST, C.R.; FORDYCE, C.A.; ZHANG, J.; MCDERMOTT, K.; KOZAKIEWICZ, K.; GAUTHIER, M.L. Genetic and Epigenetic Changes in Mammary Epithelial Cells May Mimic Early Events in Carcinogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. v. 9, n. 3, 2004.

TORRESAN C. Identificação de marcadores moleculares em metástases de linfonodos sentinela mamários. 168 f. Tese (Doutorado em Genética) – Programa de Pós-graduação em Genética, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2011.

TURNER, N. C.; REIS-FILHO, J. S. Basal-like breast cancer and the BRCA1 phenotype. Oncogene, v. 25, n. 43, p. 5846–53, 2006.

VINCENT, J.; MAZELLA, J.; KITABGI, P. Neurotensin and neurotensin receptors. TiPS, v. 20, n. July, p. 302–309, 1999.

VOGT, V.; SIEGEL, M.; SUNDMACHER, L. Examining regional variation in the use of cancer screening in Germany. Social science & medicine, v. 110, p. 74–80, 2014.

WEIGELT, B.; PETERSE, J. L.; ’T VEER, L. J. VAN. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature reviews. Cancer, v. 5, n. 8, p. 591–602, 2005.

WEINBERG, R. A. O circuito de sinalização citoplasmática programa muitos dos traços de câncer. In:______. A biologia do câncer. Porto Alegre: Artmed, 2008. p.159–208, 2008.

WEIR, B.; ZHAO, X.; MEYERSON, M. Somatic alterations in the human cancer genome. Cancer cell, v. 6, n. 5, p. 433-8, 2004.

WU, Z.; MARTINEZ-FONG, D.; TRÉDANIEL, J.; FORGEZ, P. Neurotensin and its high affinity receptor 1 as a potential pharmacological target in cancer therapy. Frontiers in endocrinology, v. 3, n. 184, p. 1-9, 2012.

YOUNES, M.; WU, Z.; DUPOUY, S.; et al. Neurotensin (NTS) and its receptor (NTSR1 ) causes EGFR , HER2 and HER3 over-expression and their autocrine /

51

paracrine activation in lung tumors , confirming responsiveness to erlotinib. Oncotarget, v. 5, n. 18, 2014.

ZHANG, D.; QIAN, Y.; AKULA, N.; et al. Accuracy of CNV Detection from GWAS Data. PloS one, v. 6, n. 1, p. 1-9, 2011.

universidade federal do paranÁ stephanie bath de …

Documents