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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIAS DE ALIMENTOS BIODEGRADAÇÃO DE AFLATOXINAS Helen Cristina dos Santos Hackbart Profª Drª Eliana Badiale-Furlong Orientadora Rio Grande, RS 2013

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIAS DE

ALIMENTOS

BIODEGRADAÇÃO DE AFLATOXINAS

Helen Cristina dos Santos Hackbart

Profª Drª Eliana Badiale-Furlong

Orientadora

Rio Grande, RS

2013

2

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIAS DE

ALIMENTOS

BIODEGRADAÇÃO DE AFLATOXINAS

Helen Cristina dos Santos Hackbart

Tese apresentada como parte dos

requisitos para a obtenção do título de

doutor em Engenharia e Ciências de

Alimentos.

Profa. Dra. Eliana Badiale-Furlong

Orientadora

Rio Grande, RS

2013

3

Ao meu noivo Ricardo.

4

À minha família, especialmente meus pais, Enildo

e Cleusa, sempre me incentivando e acreditando

em mim. Aos meus irmãos Mauro, Vivian, Liege,

Ana Maria e Marcos pelo apoio, aos meus

cunhados, Simone, Guilherme, Jonas e sobrinhas

Fernanda e Juliana pela torcida.

Amo vocês.

5

“... Pai concede-nos, especialmente, a dádiva de compreender tua vontade, seja qual

for.

Que possamos confiar em teus desígnios superiores, já que o ontem, o hoje e o

amanhã são três etapas da mesma jornada.

A todo o momento é possível semear e colher, e os nossos anseios do coração serão

realizados, na ocasião oportuna e segundo a tua vontade.

Agradecemos a ti, hoje e sempre...”

Assim Seja

Psicografia de Francisco do Espírito Santo Neto.

6

AGRADECIMENTOS

A Prof.ª Dr.ª Eliana Badiale-Furlong agradeço a orientação não só por este

trabalho e sim pelos 7 anos de orientação e convívio, minha mestre, com quem

aprendi muito, obrigada por ter acreditado em mim, pela amizade, paciência,

disponibilidade, apoio e incentivo. Muito obrigada.

A Prof.ª Dr.ª Ana Paula Votto e Prof.ª Dr.ª Gilma Trindade pela atenção,

apoio e disponibilidade durante a realização das análises no Laboratório de Cultura

Celular, do instituto de Ciências Biológicas (ICB).

Ao Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel pelo apoio durante a realização das

análises no laboratório de análises de compostos orgânicos e metais (LACOM).

Aos membros da banca: Prof.ª Dr.ª Ana Paula Votto, Prof.ª Dr.ª Lucielen

Oliveira dos Santos, Prof.ª Dr.ª Giniani Carla Dors, Prof.ª Dr.ª Jaqueline Garda Buffon,

Prof.ª Dr.ª Leonor Almeida de Souza Soares pelas contribuições.

A colega Renata Vasconcellos, pela ajuda no estudo de toxicidade, sem

você esta etapa não seria possível, muito obrigada.

A todos os colegas e professores do Laboratório de Micotoxinas em

especial Priscila e Muriele pela ajuda no início deste trabalho.

A minha querida amiga Jesus, pela ajuda técnica, pela força, pelas

palavras de carinho e de confiança, muito obrigada.

A minha amiga Islanda, pela ajuda burocrática em relação a matricula,

bolsas e programação de horários, sempre disponível a ajudar e sempre de muito bom

humor, obrigada pelas palavras de carinho, incentivo e apoio.

Ao meu amigo Cristiano pelo apoio e palavras de incentivo.

As minhas amigas Anelise e Adriana, pela ajuda incondicional, por todo o

trabalho realizado, por horas e horas de análises, muito obrigada gurias.

A minha amiga Renata por estar sempre disposta a ajudar, muito obrigada.

A minha amiga Michele por me escutar e ser minha confidente, sempre me

dando apoio e confiando em mim. Pelas noites e finais de semana de muito trabalho e,

claro, pelos bolos de chocolate.

A minha amiga Luciana por fazer com que eu olhe as dificuldades por

outro ponto de vista, por estar disponível a ajudar em qualquer horário e dia da

semana, obrigada por tudo.

7

Aos meus amigos, Alisson e Leonardo, pelas festas e palavras de

confiança nos momentos difíceis ao longo destes anos.

As minhas amigas Ana Paula, Daiane e Silvana pelos poucos momentos

de descontração, pelas jantas, caminhadas, inúmeras risadas, apoio, paciência, enfim,

o que seria de mim sem vocês minhas melhores amigas. Obrigada pela torcida.

A minha sogra e sogro, Loiva e Lauro pela torcida e pelas orações, muito

obrigada.

A minha prima Karina, pela estadia, cafés e jantas sempre acompanhadas

de incentivo, bons conselhos e muitas risadas, obrigada por tudo.

Aos meus familiares, obrigada pela torcida.

Aos meus irmãos, cunhados e sobrinhas que estão longe Mauro, Simone,

Fernanda e Juliana, Vivian e Guilherme, pela torcida e incentivo. Amo vocês e estou

com saudades.

Aos meus irmãos e cunhado que estão por perto Liege, Marcos, Ana Maria

e Jonas, pelas jantas e churrascos, pela paciência e pelo apoio. Amo vocês.

Aos meus pais que me propiciaram a oportunidade de estudar, pelo apoio,

carinho, dedicação, cuidado, paciência, compreensão, orações e amor incondicional,

me suportando nos momentos mais difíceis, meus pilares, meus mestres, os melhores

pais do mundo, amo vocês.

Ao meu noivo Ricardo, pela compreensão e carinho, pelos intermináveis

finais de semana de trabalho e não de descanso, pelo incentivo não me deixando

desistir nos momentos mais difíceis. Muito obrigada meu amor.

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste

trabalho.

A Capes pela Bolsa de Doutorado.

8

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ................................................................................................................ 12

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ 14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS ......................................................................... 17

CAPITULO I .............................................................................................................................. 19

RESUMO GERAL .................................................................................................................... 20

ABSTRACT ............................................................................................................................... 21

1. INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 22

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 24

2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 24

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 24

CAPITULO II ............................................................................................................................. 25

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 26

3.1 FUNGOS ......................................................................................................................... 26

3.1.1. Fungos produtores de metabolitos GRAS ......................................................... 29

3.1.2 Fungos Toxigenicos e Micotoxinas ..................................................................... 32

3.1.3 Aspergillus sp. ......................................................................................................... 35

3.1.4 Aflatoxinas ............................................................................................................... 37

3.1.5 Determinação de aflatoxinas ................................................................................ 45

3.1.6 Degradação de aflatoxinas ................................................................................... 47

3.1.7 Testes de toxicidade .............................................................................................. 49

CAPITULO III ............................................................................................................................ 51

ARTIGOS ................................................................................................................................... 52

Artigo 1 ....................................................................................................................................... 53

Validação de método para extração, detecção e quantificação de aflatoxinas.............. 53

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 56

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................... 57

2.1 Instrumentação .............................................................................................................. 57

9

2.2 Padrões analíticos, reagentes e solventes ................................................................ 58

2.3 Preparo de Amostras .................................................................................................... 58

2.4 Preparo das soluções estoque e trabalho ................................................................. 58

2.5 Adequação das condições cromatográficas .............................................................. 59

2.6 Determinação das aflatoxinas ..................................................................................... 60

2.7 Validação da técnica cromatográfica .......................................................................... 61

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 62

3.1 Adequação das condições cromatográficas .............................................................. 62

3.2 Validação da técnica cromatográfica .......................................................................... 67

3.3 Validação do método de extração e purificação ....................................................... 70

4. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 72

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 72

Artigo 2 ....................................................................................................................................... 76

Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei ................... 76

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 79

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................... 80

2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes ................................................................ 80

2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho ................................................................. 81

2.3 Preparo do meio de cultivo .......................................................................................... 81

2.4 Preparo do inóculo ........................................................................................................ 82

2.5 Determinação das aflatoxinas ..................................................................................... 82

2.6 Instrumentação .............................................................................................................. 83

2.7 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo .............. 83

2.8 Determinações de glicosamina e ergosterol ............................................................. 84

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 85

3.1 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo .............. 86

3.2 Determinações de glicosamina e ergosterol ............................................................. 93

4. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 95

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 95

Artigo 3 ..................................................................................................................................... 102

10

Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1 pelos micro-organismos

Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei. ............................................................................. 102

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 105

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 106

2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes .............................................................. 106

2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho ............................................................... 107

2.3 Preparo do meio de cultivo ........................................................................................ 107

2.4 Preparo do inóculo ...................................................................................................... 107

2.5 Experimento da biodegradação................................................................................. 108

2.6 Determinação das aflatoxinas ................................................................................... 108

2.7 Instrumentação ............................................................................................................ 109

2.8 Validação ...................................................................................................................... 110

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 111

3.1 Produtos da degradação ............................................................................................ 111

4. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 118

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 118

Artigo 4 ..................................................................................................................................... 122

Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae e seu potencial

carcinogênico .......................................................................................................................... 122

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 125

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 126

2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes .............................................................. 126

2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho ............................................................... 127

2.3 Preparo do meio de cultivo ........................................................................................ 127

2.4 Preparo do inóculo ...................................................................................................... 127

2.5 Experimento da biodegradação................................................................................. 128

2.6 Determinação das aflatoxinas ................................................................................... 128

2.7 Instrumentação ............................................................................................................ 129

2.8 Avaliação da toxicidade dos extratos ....................................................................... 130

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 131

4. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 138

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 138

11

CONCLUSÃO GERAL ........................................................................................................... 142

SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................................ 143

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 144

ANEXOS .................................................................................................................................. 158

ANEXO 1 ................................................................................................................................. 159

Equações que descrevem as respostas previstas pelo modelo em função das variáveis

independentes do planejamento DCCR. ............................................................................ 159

ANEXO 2 ................................................................................................................................. 159

Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCCR. ................................................. 159

ANEXO 3. Figuras do experimento DCCR ......................................................................... 161

ANEXO 4 ................................................................................................................................. 166

Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCC. .................................................... 166

ANEXO 5. Figura dos experimentos DCC. ........................................................................ 167

ANEXO 6. Separação CLAE-IEN-EM/EM .......................................................................... 169

ANEXO 7 ................................................................................................................................. 169

Parâmetros validados para CLAE-IEN-EM/EM. ................................................................ 169

12

LISTA DE TABELAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Tabela 1. Limites máximos tolerados (LMT) para aflatoxinas em alimentos, no

Brasil, aplicação imediata.

33

Tabela 2. Micotoxinas das principais espécies de Aspegillus. 35

Tabela 3. Propriedades das aflatoxinas. 39

Tabela 4. Ocorrência de aflatoxinas no Brasil nos anos entre 2011 e 2013. 44

CAPITULO III

ARTIGO 1

Tabela 1. Valores utilizados no DCCR para os três fatores. 58

Tabela 2. Valores utilizados no DCC para os dois fatores. 59

Tabela 3. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de

capacidade e resolução das aflatoxinas estudadas.

64

Tabela 4. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de

capacidade e resolução das aflatoxinas, no planejamento DCC.

67

Tabela 5. Equações que descrevem as repostasm previstas pelo modelo em

função das variáveis independentes.

67

Tabela 6. Recuperação para as cinco aflatoxinas estudadas nos métodos de

extração.

70

ARTIGO 2

Tabela 1. Níveis das aflatoxinas (µg/kg) e coeficiente de variação (%), no cultivo. 87

13

Tabela 2. Percentuais de descontaminação (D) nos níveis iniciais das aflatoxinas

nos meios de cultivo.

88

Tabela 3. Constantes de degradação das aflatoxinas pelos micro-organismos no

experimento 3.

91

Tabela 4. Níveis residuais das aflatoxinas (µg kg-1) e coeficiente de variação (%),

ao longo do intervalo de cultivo.

92

Tabela 5. Porcentagens de descontaminação nos níveis das aflatoxinas durante

o cultivo com Rhizopus oryzae.

92

Tabela 6. Valores de médios de ergosterol, glicosamina e níveis médios de

redução das aflatoxinas nos cultivos.

93

ARTIGO 3

Tabela 1. Parâmetros cromatográficos validados. 109

Tabela 2. Níveis (µg kg-1) e coeficiente de variação (%) da AFLAB1 no cultivo. 111

ARTIGO 4

Tabela 1. Níveis residuais de AFLAB1 (µg kg-1) e da mistura de aflatoxinas (µg

kg-1) na biomassa de Rhizopus oryzae.

129

14

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1. Esquema das formas de reprodução da maioria das espécies fúngicas. 27

Figura 2. Colônia de Rhizopus oryzae no 1º e 5º dia de cultivo. 29

Figura 3. Imagem microscópica (100 µm) do fungo Rhizopus oryzae (Mycology,

2012).

30

Figura 4. Colônia de Trichoderma reesei no 1º e 5º dia de cultivo. 31

Figura 5. Imagem microscópica do Trichoderma reesei (400x) (Infante et al.,

2009).

32

Figura 6. Imagem microscopia do Aspergillus flavus (Adaptado de Calvo et al.,

2012).

36

Figura 7. Estrutura química das principais aflatoxinas. 38

Figura 8. Estruturas químicas dos principais intermediários da síntese da

AFLAB1.

41

Figura 9. Mecanismo de ativação da aflatoxina B1. 41

Figura 10. Biotransformação da AFLAB1 (Adaptada de Hsieh, 1986). 43

CAPITULO III

ARTIGO 1

Figura 1. Curvas de contorno para Y1, Y2 e Y3 para as variávies significativas. 65

Figura 2. Curvas de contorno para Y1’ em função da vazão e temperatura. 68

Figura 3. Curvas de contorno para Y2’ e Y3’ em função da vazão e temperatura. 68

15

Figura 4. Separação cromatográfica das aflatoxinas em CLAE-FL. 68

ARTIGO 2

Figura 1. Taxas de degradação das aflatoxinas nos experimentos (1)

4 x 102 esporos g-1 (A, D), experimento (2) 4 x 104 esporos g-1 (B, E) e

experimento (3) 4 x 106 esporos g-1 (C, F) para os micro-organismos Rhizopus

oryzae e Trichoderma reesei, respectivamente.

90

Figura 2. Taxas de degradação das aflatoxinas em mistura. 91

Figura 3. Valores de glicosamina e ergosterol presentes na biomassa do

Rhizopus oryzae (A, B) e Trichoderma reesei (C, D).

93

ARTIGO 3

Figura 1. Estrutura química das aflatoxinas. 103

Figura 2. Cromatogramas da AFB1 (100 µg kg-1), no tempo de cultivo 0 hora,

para o micro-organismo Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.

110

Figura 3. Cromatogramas da AFLAB1 com Rhizopus oryzae e Trichoderma

ressei.

112

Figura 4. Espectros dos produtos formados pelo Rhizopus oryzae (72, 96 e

120 h).

114

Figura 5. Espectros dos produtos formados pelo Trichoderma ressei (72,96 e

120 h).

115

ARTIGO 4

Figura 1. Estruturas químicas das principais aflatoxinas. 123

Figura 2. Espectros de massa no 5º e 6º dia de cultivo para AFLAB1 isolada. 131

16

Figura 3. Espectros de massa 5º e 6º dia de cultivo para AFLAB1 em mistura. 132

Figura 4. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 1º, 2º e 3º dia. 133

Figura 5. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 4º, 5º e 6º dia. 134

Figura 6. Aflatoxina B1 padrão puro 100 µg kg-1. 135

17

LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS

Acn – Acetonitrila.

AFLAB1 – Aflatoxina B1

AFLAB2 – Aflatoxina B2

AFLAB2a – Aflatoxina B2a

AFLAG1 – Aflatoxina G1

AFLAG2 – Aflatoxina G2

AFLAH1 – Aflatoxina H1

AFLAM1 – Aflatoxina M1

AFLAM2 – Aflatoxina M2

AFLAOL – Aflatoxicol

AFLAP1 – Aflatoxina P1

AFLAQ1 – Aflatoxina Q1

ANOVA – Análise de Variância, do inglês Analysis of variance.

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

AOAC – Associação Oficial de Química Analítica, do inglês Association Official

Analytical Chemists.

API – Ionização a Pressão Atmosférica, do inglês Atmospheric Pressure Ionization.

ABD – Ágar Batata Dextrose.

Benz – Benzeno.

CAST – Conselho de Ciências Agrárias e Tecnologia, do inglês Council for Agricultural

Sciences and Tecnology.

CCD – Cromatografia de Camada Delgada.

CCDAE – Cromatografia de Camada Delgada de Alta Eficiência.

CFR – Code of Federal Regulations

CG – Cromatografia Gasosa.

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

CV – Coeficiente de Variação.

DAB – pdimetilaminobenzaldeído.

DCC – Delineamento Composto Central.

DCCR – Delineamento Composto Central Rotacional.

DNA – ácido desoxirribonucleico, do inglês deoxyribonucleic acid.

18

ELISA – Ensaio imunoenzimático, do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.

EM – Espectrometria de Massas.

FAO – Organização para a Alimentação e Agricultura, do inglês Food and Agriculture

Organization

FDA – Food and Drug Administration.

FL – Fluorescencia.

FM – Fase Móvel.

FR – Fase Reversa.

GRAS – Geralmente Reconhecido Como Seguro, do inglês General Recognized as

Safe.

IARC – International Agency for Research on Cancer.

IEN – Ionização por Eletronebulização.

INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial.

ISO – International Standard Organisation.

IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada, do inglês International

Union of Pure and Applied Chemistry.

JEFCA – Joint Expert Committee on Food Additives.

LMT – Limites máximos tolerados.

LOD – Limite de Detecção.

LODI – Limite de Detecção do Instrumento.

LODM – Limite de Detecção do Método.

LOQ – Limite de Quantificação.

LOQI – Limite de Quantificação do Instrumento.

LOQM – Limite de Quantificação do Método.

MTT – 3-4,5-dimetiltiazol-2-il,2,5-difeniltetrazolium.

nd – não detectado.

OTA – Ocratoxina A.

QuEChERS – do inglês ... (rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro).

RNA – ácido ribonucleico.

UFLC – Cromatógrafo Líquido Ultra Rápido de Alta Eficiência, do inglês Ultra Fast

Liquid Chromatograph.

UV – Ultravioleta.

19

CAPITULO I

20

RESUMO GERAL

A determinação simultânea de aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1,

AFLAG2, e AFLAM1 foram otimizadas utilizando planejamento fatorial considerando as

variáveis dependentes os tempos de retenção, fator de capacidade e resolução como

respostas da separação cromatográfica. As condições ótimas foram alcançadas

utilizando como fase móvel água ultra pura acidificada com ácido acético

(99:1 v/v):acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) numa vazão de 0,6 mL.min-1 e

temperatura da coluna de 45ºC. O procedimento de extração utilizado foi o proposto

por Soares e Rodriguez-Amaya modificado, com recuperções médias de 66; 92; 74; 88

e 71% respectivamente para as aflatoxinas AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e

AFLAB1. A capacidade dos fungos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei para

diminuírem os níveis de AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1 foi avaliado em

razão do número de esporos inicial no inóculo e o tempo de cultivo, onde foram

necessários 4 x 106 esporos.g-1 para que os níveis desta aflatoxinas fossem reduzidos

em aproximadamente 100% pelo Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei. Os fungos

Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei foram cultivados em meios fortificados com

AFLAB1 e os produtos da degradação foram avaliados, onde dez principais

composições moleculares foram produzidas. As estruturas formadas pelo micro-

organismo Rhizopus oryzae foram avaliadas em experimentos da AFLAB1 individual e

em mistura com as outras aflatoxinas, onde os produtos formados desta degradação

mostram que, quando degradada isoladamente a AFLAB1 forma produtos que não

possuem mais características toxigênicas e carcinogênicas, no entanto, quando em

mistura com outras aflatoxinas, os produtos de degradação sem características

toxigênicas são formados em 120 h de cultivo.

Palavras-chave: Biodegradação, Aflatoxinas, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei,

Toxicidade.

21

ABSTRACT

Simultaneous determination of aflatoxins AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1,

AFLAG2 and AFLAM1 were optimized using factorial design considering the dependent

variable retention times, capacity factor and resolution of chromatographic separation

as answers. Optimal conditions were achieved by using as the mobile phase ultrapure

water acidified with acetic acid (99:1 v / v) acetonitrile: methanol (60:8:32 v/v/v) at a

flow rate of 0.6 ml.min-1 and column temperature of 45 °C. The extraction procedure

was proposed by Soares and Rodriguez-Amaya modified recuperções with averages of

66, 92, 74, 88 and 71% respectively for aflatoxins AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2

and AFLAB1. The ability of fungi Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei for

decreasing levels AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 and AFLAB1 and was valued

according to the number of spores in the initial inoculum and cultivation time, which

took 4 x 106 spores.g-1 for that levels of this aflatoxin were reduced by approximately

100% by Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei. The fungi Rhizopus oryzae and

Trichoderma reesei were cultured in medium fortified with AFLAB1 and the degradation

products were evaluated, where ten major molecular compositions were produced. The

structures formed by the micro-organism Rhizopus oryzae were evaluated as the

AFLAB1 individually and in mixture with other aflatoxins, where the degradation

products formed in this show that when degraded alone AFLAB1 to form products with

no more features toxigenic and carcinogenic in However, when mixed with other

aflatoxins, the degradation products are formed without toxigenic characteristics at 120

hours of cultivation.

Keywords: Biodegradation, Aflatoxins, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei, toxicity.

22

1. INTRODUÇÃO GERAL

As micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos

contaminantes de vegetais, matérias primas e alimentos. Estes compostos podem ser

produzidos na planta ou após a colheita e tem preocupado as autoridades sanitárias

de todo o mundo por serem carcinogênicas, neurotóxicas, teratogênicas, depressoras

do sistema imunológico e hematológico (BERTHILLER et al., 2013; SAEGER e

EGMOND, 2012). As espécies de fungos toxigênicos envolvidos na cadeia alimentar

humana pertencem com mais freqüência a três gêneros Aspergillus, Penicillium e

Fusarium e esporadicamente Alternaria (PETERSON 2012; HAVRÁNKOVÁ e

OVESNÁ, 2012; CHANG e EHRLICH, 2013; KOZLOVSKII et al., 2013).

O Aspergillus está entre os gêneros fúngicos que ocorrem em alimentos e

possuem espécies toxigênicas, tais como Aspergillus flavus (KURTZMAN et al., 1987;

CHANG e EHRLICH, 2013), Aspergillus nomius (GOTO et al., 1997; TALUKDER et al.,

2013) e Aspergillus pseudotamarii (ITO et al., 2001; VARGA et al., 2009) produtores

das aflatoxinas. Elas estão classificadas em dois grupos: as

difurocumarociclopentanonas (Aflatoxinas B1 e B2) e as difurocumarolactonas

(Aflatoxinas G1 e G2) (WAGACHA e MUTHOMI, 2008). Os dois grupos estão

associadas a danos em humanos expostos ao consumo continuo de alimentos

contaminados o que resulta no aumento de deficiências nutritivas, imunosupressão e

carcinoma hepatocelular (JENTE et al., 2012; RUADREW et al., 2013; XUEIJIAO et

al., 2013).

A redução de aflatoxinas em alimentos utilizando procedimentos físicos e

químicos ainda não comprovou ser eficaz e economicamente fatível, pois resulta em

perdas nutricionais e tecnologicas (MISHRA e DAS, 2003). Contudo, a

descontaminação biológica empregando bactérias, leveduras e fungos filamentosos

parece ser uma alternativa promissora para degradar aflatoxinas e estabelecer

condições que podem melhorar as características funcionais dos alimentos, visto que

pode ocorrer aumento de nutrientes em materiais lignocelulosicos (OLIVEIRA et al.,

2011)

As bactérias que vêm sendo utilizadas para degradar aflatoxinas são todas

Actinomicetales da subordem Corinebacterineae, como Nocardia corynebacterioides

23

(HORMISCH et al., 2004, ALBERTS et al., 2006), Rhodococcus eritropolis e

Micobacterium fluorantheniorans sp. (TENIOLA et al., 2005). Para biodegradação

fungica de aflatoxinas os principais micro-organismos utilizados são zigomicetos do

gênero Rhizopus sp. e Mucor sp., ascomicetous do gênero Aspergillus níger e

Trichoderma sp. e ainda, basidiomicetous do genero Armillariella tabescens

(ALBERTS et al., 2006). As leveduras são pouco utilizadas para o processo de

biodegradação de aflatoxinas, pois atuam mais como adsorventes do que como

degradadores da estrutura toxica, mas são interessantes pela rapidez de sua

multiplicação (KHLANGWISETP e WU et al., 2010). No entanto, a eficiência de fungos

para utilização de substratos em condições de atividade de água intermediária e baixa

(40 – 70%) os torna interessantes para aplicação em cereais in natura ou parcialmente

processados contaminados com micotoxinass (DORS et al., 2009).

Dentre os materiais passíveis de contaminação micotoxicologica estão os

farelos de cereais, coprodutos abundantes e ainda possuidores de valor nutricional de

destaque. Porém antes de adotar espécies fungicas não toxigenicas para diminuir os

níveis de micotoxinas em alimentos necessários conhecer a real potencialidade deles

e se os produtos resultantes da metabolização são efetivamente menos tóxicos

(CACCIAMANI et al., 2007). As espécies fungicas Rhizopus oryzae (CCT7560) nativa

do arroz e Trichoderma reesei (QM9414) modificada geneticamente para produção de

celulases são produtoras de enzimas consideradas GRAS (Generally Recognized as

Safe) e tem se mostrado promissoras para promover a disponibilização de nutrientes a

partir de farelos de cereais (SCHIMIDT e BADIALE-FURLONG 2012). Sua

multiplicação eficiente nestes materiais usualmente contaminados com aflatoxinas

(DORS et al., 2009) sugere que estes possuem mecanismos enzimáticos para superar

o efeito danoso destes compostos tóxicos (CACCIAMANI et al., 2007).

Para avaliar este potencial pioneiramente é necessário avaliar sua ação

sobre as aflatoxinas, verificar a toxicidade dos produtos de degradação delas,

identificar as principais classes de enzimas envolvidas e potencialmente avaliar a ação

deles nos substratos de interesse (CACCIAMANI et al., 2007).

24

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar a biodegradação das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1,

AFLAG2 e AFLAM1 empregando os micro-organismos Rhizopus oryzae (CCT7560) e

Thricoderma ressei (QM9414).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Validar metodologia para extração, detecção e quantificação das

aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1 simultaneamente.

Avaliar o potencial de biodegradação dos fungos Rhizopus oryzae

(CCT7560) e Thricoderma ressei (QM9414) nas aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2,

AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1.

Identificar os produtos formados a partir da degradação da AFLAB1 pelos

fungos Rhizopus oryzae (CCT7560) e Thricoderma ressei (QM9414).

Avaliar a toxicidade dos produtos formados a partir da degradação da

AFLAB1 pelo fungo Rhizopus oryzae (CCT7560).

25

CAPITULO II

26

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 FUNGOS

Os fungos são organismos eucarióticos que podem aparecer sob forma

microscópica ou macroscópica (GRIFFIN, 1994; PRICE et al., 2001). Suas formas

unicelulares são conhecidas como leveduras, e formas filamentosas, as hifas

denomidadas bolores, mofos ou fungos. Estas formas fúngicas podem ser

encontradas no solo, na água, em plantas, em animais, no ser humano e em detritos

orgânicos (PRICE et al., 2001).

O corpo de um fungo filamentoso é formado por uma estrutura chamada

micélio constituído por filamentos individuais em forma de tubo, as hifas, que

correspondem a células multinucleadas presentes no ciclo de vida da maioria das

espécies fúngicas (LACAZ et. al., 1998; PAPAGIANNI, 2004). Neste ciclo estão

compreendidas fases reprodutivas sexuadas e assexuadas (Figura 1).

Todos os fungos são heterótrofos e sua digestão é extracelular. Para isto

lançam no ambiente, enzimas que degradam as moléculas orgânicas complexas para

posterior absoção das moléculas menores e mais simples formadas, mecanismo que

lhes confere a classificação de heterótrofos por absorção (GARCÍA-PEÑA et al.,

2001). O modo mais simples de reprodução assexuada de um fungo filamentoso é

conhecido como fragmentação e consiste na ruptura do micélio (SOUZA et al., 2003).

A reprodução fúngica também se da através de células haploides (n) especializadas,

os esporos, formados pelo processo de esporulação. Em algumas regiões do micélio,

existem hifas especiais, que crescem eretas em relação ao substrato. Na extremidade

dessas hifas, há uma estrutura dilatada, de formato esférico, o esporângio em cujo

interior ocorre à produção dos esporos, que são liberados pelo rompimento da parede

do esporângio. Após um período de dispersão, e sob condições ambientais favoráveis,

os esporos podem originar uma nova hifa, processo conhecido como germinação. A

nova hifa pode formar um novo micélio e, assim, dar continuidade a esse ciclo de vida

(SOUZA et al., 2003; RAVEN et al., 2007).

Na reprodução sexuada o mecanismo segue um padrão básico, comum à

maioria dos membros do reino Fungi (SOUZA et al., 2003; PINTO et al., 2004;

RAVEN et al., 2007). Em condições ambientais adequadas, a primeira etapa da

27

reprodução entre fungos distintos é a fusão das hifas haploides (n), que recebe o

nome de plasmogamia (fusão dos citoplasmas). A fusão dos núcleos gaméticos

haploides (n), chamada cariogamia, não ocorre imediatamente após a união

citoplasmática. Assim, a plasmogamia gera uma estrutura celular composta por dois

núcleos haploides (n + n) oriundos de hifas pertencentes a micélios distintos. Por isso

as hifas que resultam desse processo são denominadas dicarióticas. Após um tempo,

os núcleos gaméticos se fundem e originam um zigoto diploide (2n), o qual, por sua

vez, entra em processo de divisão meiótica, produzindo células-filhas que darão

origem a esporos haploides (n) (Figura 1). Os esporos que se formam pelo modo

sexuado são comumente chamados esporos sexuais (SOUZA et al., 2003; RAVEN et

al., 2007).

Figura 1. Esquema das formas de reprodução da maioria das espécies fúngicas.

Segundo a classificação de fungos de Alexopoulos (1996), o Reino dos

fungos está dividido em quatro filos, em função do modo de reprodução sexuada:

Chitridiomicota, Zigomicota, Basidiomicota e Ascomicota. No filo Chitridiomicota estão

identificadas 1000 espécies, a maioria aquáticas, presentes em águas doces, é

considerado o mais primitivo filo dentro dos fungos (ROCHA e ZOTTARELLI, 2002).

28

No filo Zigomicota estão caracterizadas 600 espécies de zigomicetos que

produzem esporos sexuais zigósporos, que permanecem dormentes até que as

condições de atividade de água permitam a nova germinação (TIMOTHY e

O’DONNELL, 2007). Suas hifas são cenocíticas (não têm septo), os zigomicetos vivem

no solo, sobre matéria orgânica animal ou vegetal em decomposição e alguns

são parasitas de plantas e animais (Tanabe et al., 2005). Algumas espécies podem ser

utilizadas para a elaboração de produtos comercialmente valiosos, como molho de

soja, ácidos orgânicos, esteróides para drogas contraceptivas e antiinflamatórias

(TANABE et al., 2005).

No filo Basidiomicota estão classificadas 25.000 espécies onde estão

incluídos fungos conhecidos como os cogumelos, as orelhas-de-pau, parasitas de

plantas e vivem principalmente em ambiente terrestre (MATHENY et al., 2007).

No filo Ascomicota está um grande grupo de aproximadamente 30.000

espécies já descritas. Os fungos de saco, como são conhecidos, pois, seus esporos

sexuais são produzidos em pequenos sacos chamados ascos (DAVID, 2002). Os

ascomicetos variam em complexidade, desde leveduras unicelulares até mofos

multicelulares e fungos em forma de taça. Os ascomicetos desempenham um papel

ecológico importante na degradação de moléculas animais e vegetais resistentes

como a celulose, lignina e o colágeno (DAVID, 2002).

Os fungos cujo estado de reprodução sexuada não é conhecido designam-

se de fungos imperfeitos, ou deuteromicetos, são constituídos por cerca de 20 mil

espécies conhecidas, a maioria saprófaga e parasita. Os gêneros Aspergillus,

Fusarium e Penicillium pertencem a este grupo (RAVEN et al., 2007).

Os deuteromicetos reproduzem-se assexualmente por estruturas

especializadas designadas conidia, que são esporos mitóticos que se formam em

estruturas proprias, os conidióforos. Não há um consenso entre os micologistas em

relação à classificação desses fungos. Dessa forma, os fungos conidiais não

constituem um filo propriamente dito. São encontrados nos meios terrestres e

aquáticos, no ar, no organismo humano, sobre a matéria orgânica de vegetais e

animais vivos ou mortos (SOUZA et al., 2003; RAVEN et al., 2007).

29

3.1.1. Fungos produtores de metabolitos GRAS

O termo GRAS, do inglês Generally Recognized As Safe (GRAS), em

português “Geralmente Reconhecido Como Seguro” é empregado para designar um

produto químico ou substância adicionada ao alimento considerado seguro por

especialistas da Food and Drug Administration (FDA-EUA). Dentre estas substâncias

estão algumas produzidas por fungos filamentosos, tais como Rhizopus oryzae e

Trichoderma reesei, sendo consideradas seguras podendo estes micro-organismos

ser utilizados para fins comerciais (ZHANG e LYND, 2006; KARMAKAR e RAY, 2011).

O fungo Rhizopus oryzae, também conhecido por Rhizopus arrhizus,

pertence ao Filo Zigomicota; classe zigomicetos; ordem Mucorales; família

Mucoraceae; gênero Rhizopus; espécies Rhizopus oryzae. A linhagem de Rhizopus

oryzae é não patogênica e não produtora de toxinas (CFR, 2012a).

A maioria das cepas do Rhizopus foi isolada como componentes ativos na

produção de alimentos ou bebidas alcoólicas orientais na Indonésia, China e Japão

(MERTENS et al., 2006). Em relação à morfologia da colônia pode-se dizer que possui

crescimento rápido a 37ºC ocupando o ambiente de cultivo após 4 dias. Inicialmente

suas hifas possuem coloração branca mudando para marrom acinzentado (Figura 2).

Não se desenvolvem a 45 ºC.

Figura 2. Colônia de Rhizopus oryzae no 1º e 5º dia de cultivo.

As colônias de Rhizopus oryzae possuem os micélios sem septos, os

esporângios são esféricos com diâmetro na faixa de 50 a 300 µm de coloração

30

marrom acinzentado a preto e as hifas podem atingir comprimento de 1500 µm. Os

esporangiósporos são angulares, subesféricos e elipsoidais e com faixas longitudinais

e até 8 µm de comprimento e rizoides formados, geralmente, em grupos de 2 a 3

(Figura 3).

Na indústria o Rhizopus oryzae é utilizado para a produção de amplo

espectro de metabolitos, tais como enzimas, ésteres, ácidos orgânicos, materiais

voláteis, polímeros e álcool. As enzimas extra e intra celulares produzidas pela

espécie são as celulases, hemicelulases, pectinases, tanases, fitases, amilases,

lipases, proteases e outras enzimas de importância industrial (MERTENS e SKORY,

2007; KARMAKAR e RAY, 2011). Além disso, esta espécie é produtora de ácido

láctico. O biodiesel pode ser produzido por metanólise e reações de transesterificação

utilizando famílias específicas de Rhizopus oryzae com as enzimas correspondentes

(KAZUHIRO, et al., 2001).

Figura 3. Imagem microscópica (100 µm) do fungo Rhizopus oryzae (MYCOLOGY,

2012).

Na indústria o Rhizopus oryzae é utilizado para a produção de amplo

espectro de metabolitos, tais como enzimas, ésteres, ácidos orgânicos, materiais

voláteis, polímeros e álcool. As enzimas extra e intra celulares produzidas pela

espécie são as celulases, hemicelulases, pectinases, tanases, fitases, amilases,

lipases, proteases e outras enzimas de importância industrial (MERTENS e SKORY,

2007; KARMAKAR e RAY, 2011). Além disso, esta espécie é produtora de ácido

láctico. O biodiesel pode ser produzido por metanólise e reações de transesterificação

utilizando famílias específicas de Rhizopus oryzae com as enzimas correspondentes

(KAZUHIRO, et al., 2001).

31

A Food and Agriculture Organization (FAO/WHO), Joint Expert Committee

on Food Additives (JEFCA) e Food and Drug Administration (FDA), do Departamento

de Saúde e Serviços Humanos, EUA, certifica que as enzimas extraídas do Rhizopus

oryzae podem ser utilizadas como aditivos alimentares para consumo humano, tendo

possibilitado que estas linhagens de fungos sejam amplamente utilizadas para fins

comerciais (GHOSH e RAY, 2011).

O fungo Trichoderma reesei é classificado como Filo Ascomicota; classe

Sordariomicetos; ordem Hipocreales; família Hipocreaceae; gênero Trichoderma;

espécies Trichoderma reesei considerada não patogênica e não tóxica (CFR, 2012b).

O gênero Trichoderma é um dos mais estudados entre os fungos

filamentosos devido ao seu grande potencial de aplicação industrial (ZHANG e LYND,

2006). Este gênero está amplamente distribuído por todo o mundo e ocorre em quase

todos os tipos de solos e ambientes naturais contendo matérias orgânicas (ZHANG e

LYND, 2006).

As espécies do gênero Trichoderma produzem grandes quantidades de

celulases e outras enzimas hidrolíticas, sendo Trichoderma reesei um conhecido

produtor de múltiplas enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. O gênero é

caracteristicamente reconhecido pela produção de diversos sistemas extracelulares de

enzimas envolvidas na hidrólise de polissacarídeos (PRIETO et al.,1997; ZHANG e

LYND, 2006).

O gênero Trichoderma compreende espécies de fungos filamentosos,

mesofílicos (30°C), que normalmente habitam o solo. O Trichoderma reesei apresenta

hifas septadas, ramificadas (de 5 a 10 μm de diâmetro), polinucleadas, com núcleos

haplóides, que formam colônias brancas que crescem rapidamente formando

superfície de colônias verdes ou amarelas de filamentos de esporulação (Figura 4).

Os filamentos férteis, conidióforos, produzem fileiras laterais com

pequenas fiálides e, os esporos (conídios), geralmente de cor verde com 3 a 5 μm de

diâmetro, são produzidos no extremo da fiálide e agrupados em pequenas massas

(Figura 5).

32

Figura 4. Colônia de Trichoderma reesei no 1º e 5º dia de cultivo.

Figura 5. Imagem microscópica do Trichoderma reesei (400x) (INFANTE et al., 2009).

3.1.2 Fungos Toxigenicos e Micotoxinas

Alguns fungos são capazes de produzir em condições naturais e

laboratoriais, metabolitos secundários tóxicos. Os metabolitos secundários são

compostos biossintetizados e excretados através de um conjunto de vias metabólicas

que embora secundárias sejam essenciais para sobrevivência do organismo sobre

determinadas condições (PETERSON, 2012; RUADREW et al., 2013; KOZLOVSKII et

al., 2013).

Alguns metabolitos secundários fúngicos têm propriedades antibióticas

outros demonstram toxicidade também para animais, esses metabólitos são

designados genericamente de micotoxinas (CAST, 2003; HUSSEIN e BRASEL, 2001).

33

O termo micotoxina tem sua origem da palavra grega “mykes”, que significa fungo, e

do latim “toxicum”, que significa veneno ou toxina (BULLERMAN, 1979).

As micotoxinas são um grupo diverso de substâncias químicas, se

ingeridas por outras espécies podem afetar muitos órgãos e sistemas, principalmente

o fígado, rins e sistema nervoso, endócrino e imunitário. Cerca de 400 tipos de

micotoxinas são conhecidos, embora, somente algumas delas tenham sido

profundamente estudadas (ETZEL, 2002; KHLANGWISET et al., 2011; BOONEN et

al., 2012) e o número das micotoxinas detectadas com frequência em alimentos é

reduzido, entre 20 e 30. A relação entre a micotoxina e o fungo produtor não é única,

uma dada micotoxina pode ser produzida por espécies diferentes, e uma espécie

fúngica pode produzir várias micotoxinas (BERTHILLER et al., 2013).

Os fungos filamentosos responsáveis pela produção de micotoxinas

consideradas mais relevantes para a saúde humana e de animais de criação

pertencem aos generos Aspergillus, Fusarium e Penicillium, que permitem classificar

micotoxinas pela origem fungica (BERTHILLER et al., 2013).

As aflatoxinas são metabólitos biossintetizados por Aspergillus flavus, A.

parasiticus, A. pseudotamari e A. nominus; Fusariotoxinas são as produzidas por

espécies do gênero Fusarium, cujos principais representates são a zearalenona,

fumonisinas e os tricotecenos, e por último as ocratoxinas, produzidas por A.

ochraceus e por diversas espécies do gênero Penicillium (ETZEL, 2002; SKRBIC et

al., 2011; HAVRÁNKOVÁ e OVESNÁ, 2012; KOZLOVSKII et al., 2013).

A exposição a essas toxinas ocorrem predominantemente a partir da

ingestão de alimentos elaborados a base de milho, amendoim, trigo, arroz entre

outros, que podem ser contaminadas com elas. Desta forma as micotoxinas podem

entrar na dieta humana e animal, por meio de contaminação direta ou indireta destes

alimentos (RODRÍGUEZ-AMAYA e SABINO, 2002; MAZIERO e BERSOT, 2010).

Os fungos produtores de micotoxinas podem crescer e produzir suas

toxinas em produtos agrícolas, no campo, no armazenamento, durante o transporte,

na industrialização ou em qualquer outro ponto da cadeia alimentar, desde que as

condições ambientais propiciem estresse ao micro-organismo. A contaminação de

grãos por micotoxinas pode acarretar perdas econômicas também associadas ao

impacto na saúde humana, produtividade animal e comércio internacional destes

produtos, pois, muitos países estabelecem limites para micotoxinas em alimentos,

incluindo o Brasil, Tabela 1. De acordo com a FAO, as perdas mundiais de alimentos

34

contaminados por micotoxinas estão em torno de milhões de toneladas por ano

(CAST, 2003; DUARTE et al., 2010; FAO, 2013).

Tabela 1. Limites máximos tolerados (LMT) para aflatoxinas em alimentos, no Brasil,

aplicação imediata.

Micotoxinas Alimento LMT (µg/kg)

Aflatoxina M1 Leite fluído 0,5

Leite em pó 5

Queijos 2,5

Aflatoxinas

B1, B2, G1, G2

Cereais e produtos de cereais, exceto milho e

derivados, incluindo cevada malteada

5

Feijão 5

Castanhas exceto Castanha-do-Brasil, incluindo

nozes, pistachios, avelãs e amêndoas

10

Frutas desidratadas e secas 10

Castanha-do-Brasil com casca para consumo direto 20

Castanha-do-Brasil sem casca para consumo direto 10

Castanha-do-Brasil sem casca para processamento 15

Alimentos à base de cereais para alimentação

infantil

1

Fórmulas infantis para lactentes e fórmulas infantis

de seguimento para lactentes e crianças de primeira

infância

1

Amêndoas de cacau 10

Produtos de cacau e chocolate 5

Especiarias 20

Amendoim (com casca), (descascado, cru ou

tostado), pasta de amendoim ou manteiga de

amendoim

20

Milho, milho em grão (inteiro, partido, amassado,

moído), farinhas ou sêmolas de milho

20

Fonte: Resolução – RDC Nº 7, de 18 de fevereiro de 2011. (ANVISA).

35

3.1.3 Aspergillus sp.

O gênero Aspergillus foi inicialmente descrito em 1729 pelo botânico Pier

Antonio Michelli, no entanto, Johann Heinrich Friedrich Link em 1809, foi o primeiro a

defini-lo de forma clara (SMITH e ROSS, 1991). Com o advento da microscopia óptica,

em 1856, Rudolf Virchow apresentou as características micromorfológicas do

Aspergillus ssp. associado a lesões pulmonares em papagaios, falcões e no homem

(BENNETT, 2009).

Aspergillus é um gênero composto por mais de 180 espécies anamórficas

aceitas com o telemorfismo descrito em nove gêneros diferentes (PITT e SAMSOM,

2000). Este gênero é dividido em sete subgêneros, que são posteriormente divididos

em seções (KLICH, 2002). Embora o gênero possua mais de 260 espécies bastante

estudadas, sua sistemática ainda está evoluindo (SAMSOM e VARGA, 2009),

especialmente porque muitas espécies do gênero Aspergillus são capazes de produzir

metabólitos tóxicos (Tabela 2).

O gênero é facilmente identificado pelas características do conidióforo,

mas a identificação das espécies e diferenciação é complexa sendo tradicionalmente

realizada através das características morfológicas e mais recentemente por técnicas

moleculares (RODRIGUES et al., 2007).

O Aspergillus flavus pertence ao filo Ascomicota, classe ascomicetos,

ordem Eurotiales e a família Trhichomaceae; gênero Aspergillus, espécie Aspergillus

flavus (KIRK et. al., 2008). As colônias de A. flavus são caracteristicamente verdes ou

amarelo oliva, embora eventualmente possam apresentar coloração amarelo puro,

tornando-se acinzentadas com o decorrer do ciclo de vida (GEISER et al., 2007).

Os conidióforos de A. flavus e A. parasiticus surgem a partir de hifas

vegetativas septadas (Figura 6). As fiálides podem surgir diretamente de uma vesícula

globosa (condição unisseriada) ou a partir da métula que envolve a superfície da

vesícula (condição bisseriada) (CALVO et al., 2012).

A umidade relativa do ar entre 80-90% e temperatura acima de 25ºC

favorece o desenvolvimento de A. flavus, caracterizando-o como fungo de

armazenamento, classificação não apropriada para regiões tropicais, onde esta

espécie também pode ser isolada em grãos recém-colhidos ou durante o cultivo

(CAST, 2003; SHMIDT-HEYDT et al., 2009). O crescimento do A. flavus ocorre a uma

temperatura de 35ºC (SHMIDT-HEYDT et al., 2009) e atividade de água entre 0,76 e

0,94, conforme a espécie (MOUSA et al., 2011). A contaminação por fungos do gênero

36

Aspergillus e a produção de aflatoxinas no campo está frequentemente associada aos

danos causados por insetos e ao estresse do fungo (ARRUS et al., 2005). A espécie

A. flavus destaca-se por ser a mais importante produtora das aflatoxinas AFLAB1 e

AFLAB2 (SAIFELDIN et al., 2012).

Tabela 2. Micotoxinas das principais espécies de Aspegillus.

Espécies Micotoxinas

A. candidus Ácido kojico, candidulina, terfenilina, xantoacina

A. clavatus Citochalasina E, patulina, ascladiol, clavatol, triptoquivalinas

A. carbonarius Rubrofusarin B

A. flavus Aflatoxinas B1 e B2, aflatrem, ácido aspergílico, ácido ciclopiazonico,

ácido kójico, aflavininas, ácido 3-nitropropionico, paspalininas

A. fumigatus Fumitremorginas A e C, gliotoxinas, fumigaclavinas, fumitoxinas,

fumigatinas, fumgilinas, espinulosinas, triptoquivalinas, verruculogen

A. niger Ocratoxinas, malforminas, naptoquinonas

A. nominus Aflatixinas B e G, ácido aspergílico, ácido kójico

A. ochraceus Ocratoxinas, ácido penicílico, ácido kójico, ácido secalonico A,

xantomegnina, viomeleina

A. oryzae Ácido ciclopiazonico, ácido kójico, ácido 3-nitropropiônico

A. parasiticus Aflatoxinas B e G, ácido aspergílico, ácido kójico, aflavininas

A. tamarii Ácido ciclopiazonico, ácido kójico

A. terreus Citrinina, patulina, citreviridina, mevionolina, territrems, ácido terreico,

terramide A

A. ustus Austamida, austidiol, austinas, austocistina

A. versicolor Sterigmatocistina, versicolorinas, nidulotoxinas

A. wentii Metilxantonas, ácido 3-nitropropionico, ácido kójico

Fonte: Adaptado de Cabreira e Gonçalves, 2003.

37

Figura 6. Imagem microscopia do Aspergillus flavus (Adaptado de CALVO et al.,

2012).

3.1.4 Aflatoxinas

A identificação das aflatoxinas ocorreu durante o estudo das causas de um

acidente econômico, em 1960, na Inglaterra, com a morte de 400.000 perus devido a

uma doença sem causa aparente, chamada de “Turkey X Disease”, e que

posteriormente foi associada ao consumo de ração contaminada (ZOLLNER e

MAYER-HELM, 2006). Em 1961 atribuiu-se a ração proveniente do Brasil de conter o

princípio tóxico causador da doença, embora o composto tenha sido detectado

também em rações de outros países (KHLANGWISET et al., 2011). A ração

contaminada chamou a atenção pela abundancia de hifas motivando a preparação do

extrato e a vizualização do composto por cromatografia em camada delgada (CCD)

através de sua fluorescência. A denomiação dele foi aflatoxina cujas fluorescências

azul e verde, sob luz ultravioleta (UV) foram usadas para classifica-las em aflatoxinas

AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 onde a AFLAB1 é a mais tóxica (KELLER et al.,

2005). Duas outras micotoxinas são derivadas hidroxiladas resultantes do

metabolismo das AFLAB1 e AFLAB2, denominadas aflatoxina M1 (AFLAM1) e aflatoxina

M2 (AFLAM2) e têm sido detectadas em leite e seus derivados, urina e fezes de

mamíferos. Estas formas são menos toxicas que a AFLAB1, porém não menos

38

importante por estarem presentes em alimentos infantis (WU e SANTELLA, 2012;

RAHIMI e AMERI, 2012).

A série G das aflatoxinas difere quimicamente da série B pela presença de

um anel 3-lactona, no lugar do anel ciclopentanona. Uma dupla ligação 8,9 é

encontrada na forma de um éter vinil no anel terminal furano nas aflatoxinas B1 e G1,

mas não nas aflatoxinas B2 e G2. Essas variações estruturais estão diretamente

relacionadas com suas atividades fiológicas, sendo as AFLAB1 e AFLAG1

carcinogênicas e consideravelmente mais tóxicas que as AFLAB2 e AFLAG2 (Figura 7)

(JAIMEZ et al., 2000).

A fluorescência característica das aflatoxinas as torna facilmente

identificavies e quantificáveis sob luz ultravioleta (CHIAVARO et al., 2001). Sua

extração das matrizes é realizada empregando solventes como o clorofórmio, metanol

e benzeno, pois é pouco polar e bastante estável a temperatura acima de 150°C. Isto

as torna estáveis sob condições normais de cozimento, pasteurização e torrefação de

alguns tipos de alimentos (SADEGHI et al., 2009; HWANG e LEE, 2006; SIDDAPPA et

al., 2011). Algumas propriedades físicas das principais aflatoxinas estão ilustradas na

Tabela 3.

São mais 20 tipos de moléculas derivadas destas aflatoxinas como as

AFLAP1, AFLAQ1 e aflatoxicol (Figura 8), ocorrem como produtos do metabolismo

fúngico ou da biotransformação hepática. São 23 reações enzimáticas envolvidas na

formação das aflatoxinas, estruturalmente definidos quinze estruturas intermediárias

(GUO ta. al., 2008).

As aflatoxinas presentes nos alimentos têm sido associadas a fatores

desencadeantes do câncer hepático em humanos. A International Agency for

Research on Cancer (IARC, 1993) classificou a AFLAB1 como carcinógeno humano do

Grupo I, portanto a exposição crônica através da dieta, é considerada de risco para a

saúde humana (CALONI et al., 2006; GIRAY, 2007) provocando a aflatoxicose crônica.

O carcinoma hepático decorre de alterações que suprimem o gene P53 e pela

ativação de oncogenes dominantes (KIN-TAK et al., 2003; GIRAY, 2007).

A ingestão de alimentos contaminados em curto prazo ocasiona

aflatoxicose aguda e se caracteriza se por efeitos hepatotóxicos (HUSSEIN e

BRASEL, 2001) causados pela reatividade da forma 8,9-epóxido-AFLAB1, formada

durante a degradação hepática, inibindo a síntese protéica, depressão do metabolismo

de glicose, inibição de síntese de lipídeos, fosfolipídios, ácidos graxos livres, entre

39

outros. Em consequência o sistema imunológico é afetado reduzindo a resistência às

doenças podendo levar a morte (XU et al., 2010).

Figura 7. Estrutura química das principais aflatoxinas.

As doses e o tipo de resposta aos contaminantes é característica da

susceptibilidade de cada espécie animal, idade, estado nutricional e o sexo. Outros

efeitos associados a contaminação com aflatoxinas são cirrose, necrose do fígado,

40

proliferação dos canais biliares, síndrome de Reye (encefalopatia com degeneração

gordurosa do cérebro), hemorragias nos rins e lesões na pele desencadeadas pelo

contato (BOONEN et al., 2012; YANG et al., 2013; HUUSKONEN et al., 2013).

Tabela 3. Propriedades das aflatoxinas.

Aflatoxinas Solventes Comprimento

de onda (nm)

Absortividade

Molar (mol cm-1)

Massa molecular

(g/mol)

B1 Metanol

Benz:acn

(98:2)

Clorofórmio

Heptano

Tolueno

360

350

350

345

350

21800

19800

20600

20300

19100

312

B2 Metanol

Benz:acn

(98:2)

362

350

24000

20900

314

G1 Metanol

Benz:acn

(98:2)

362

350

17700

17100

328

G2 Metanol

Benz:acn

(98:2)

362

350

19300

18200

330

M1 Benz:acn

(9:1)

350 18815 328

Fonte: Adaptado de AOAC (2000).

Estudos epidemiológicos mostraram que a exposição à aflatoxinas

associada com o vírus da hepatite B aumenta o risco de carcinoma hepatocelular, e a

presença desse vírus parece aumentar a potência das aflatoxinas (IARC, 1993). Por

seu efeito mutagênico e carcinogênico, os testes de laboratório e os estudos

epidemiológicos ligam o consumo de aflatoxinas ao aumento da incidência do câncer

de fígado (XU et al., 2010).

41

A absorção das aflatoxinas ocorre no trato gastrintestinal e a sua

biotransformação ocorre primariamente no fígado (PETERSON et al., 2006). As

aflatoxinas ingeridas são lipofílicas de baixa massa molecular e absorvidas por difusão

passiva no intestino, passando para a corrente sangüínea. No sangue cerca de 90%

da AFLAB1 liga-se à albumina e pequenos volumes são distribuídos para diversos

tecidos. O metabolismo hepático se da por ação de oxidorredutases microssomais,

associadas ao citocromo P-450 de onde resultam derivados 8,9-epóxido-AFLAB1 que

confere a atividade toxica mais acentuada se não puder ser excretado, pois pode

atravessar a membrana nuclear e formar adutos com a guanina (STORVIK et al.,

2011; GROSS-STEINMEYER e EATON, 2012; YANG et al., 2012). Para excreção o

derivado hidroxilado é conjugado com ácido glicuronico ou sulfato e carregados

através da urina ou sais biliares (QIAN et al., 2013; JHA et al., 2013).

A molécula da aflatoxina pode ser ativada através de seis diferentes

processos (LUO et al., 2013). As possíveis alterações produzidas na biotransformação

da aflatoxina B1 estão na Figura 9.

A forma ativada da AFLAB1 pode se ligar covalentemente a nucleófilos

celulares como ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA) e proteínas

resultando em lesão bioquímica primária produzida pelas aflatoxinas (BEHROOZIKHA

et al., 1992). A AFLAB1 8,9-epóxido também pode sofrer uma conjugação enzimática

com uma molécula de glutationa reduzida, através de glutationa S-transferase, e ser

excretada na urina ou pela bile (ZORAN et al., 2010). A ligação da AFLAB1-epóxido

com DNA ou RNA do fígado foi demonstrada in vivo e in vitro. Interações deste tipo

são incontestavelmente responsáveis pela carcinogênese e mutagênese das

micotoxinas (YEN et al., 2009; ILIC et al., 2011; YANG et al., 2012).

Esses adutos formados especialmente na molécula de DNA, na posição

N7 ao nível do códon 249 do gene supressor de tumores p53. Eles podemser retirados

da molécula após a sua formação, deixando sítios vagos, que tendem a ser

preenchidos com adenina, resultando em pontos de mutação (KIN-TAK et al., 2003;

HABIB et al., 2006; GOUAS et al., 2009).

42

Figura 8. Estruturas químicas dos principais intermediários da síntese da AFLAB1.

Figura 9. Mecanismo de ativação da aflatoxina B1.

Onde: A = ataque redutivo ou hidratação da dupla ligação do éter vinílico; B = abertura

da estrutura bi-furanóide; C = desmetilação da estrutura metoxicumarina; D = fissão

hidrolítica da lactona cumarínica; E = redução da ciclopentanona; F = hidroxilação em

um ou mais pontos da molécula antes da conjugação (Adaptada de Hsieh, 1986).

O aflatoxicol (AFLAOL) é produzido pela redução da AFLAB1 por uma

enzima citoplasmática NADPH-dependente presente na fração solúvel do fígado. A

43

toxicidade do AFLAOL é aparentemente muito menor que AFLAB1, mas a conversão é

reversível e o AFLAOL pode servir como reservatório de toxicidade da AFLAB1.

AFLAOL pode também ser metabolizado à AFLAM1 e AFLAH1 (RAWAL e

COULOMBE, 2011).

O aflatoxicol (AFLAOL) é produzido pela redução da AFLAB1 por uma

enzima citoplasmática NADPH-dependente presente na fração solúvel do fígado. A

toxicidade do AFLAOL é aparentemente muito menor que AFLAB1, mas a conversão é

reversível e o AFLAOL pode servir como reservatório de toxicidade da AFLAB1.

AFLAOL pode também ser metabolizado à AFLAM1 e AFLAH1 (RAWAL e

COULOMBE, 2011).

Figura 10. Biotransformação da AFLAB1 (Adaptada de HSIEH, 1986).

44

O processo de carcinogênese, demonstrado experimentalmente, envolve,

geralmente, duas fases distintas, a iniciação e a promoção do câncer. A fase de

iniciação é resultante de alterações mutagênicas nas células, ao passo que a de

promoção relaciona-se com a expressão fenotípica das modificações ocorridas na

primeira fase (PARTANEN et al., 2010). Neste contexto, as mutações determinadas

pelas aflatoxinas representam alterações genéticas permanentes nas células afetadas,

o que possibilita a iniciação do processo cancerígeno (RAWAL e COULOMBE, 2011).

Tabela 4. Ocorrência de aflatoxinas no Brasil nos anos entre 2011 e 2013.

Aflatoxinas Matriz Contaminação Estado Referência

B1 G1 B2 G2 Amendoim,

Castanha

6,7 – 36,9 ug/kg DF Andrade et al., 2013

B1 G1 B2 G2 Castanha 0,1 – 8 ug/kg AM– SP Calderari et al., 2013

B1 Milho 2 – 100 ug/kg SP– RJ Keller(a) et al., 2013

B1 G1 B2 G2 Amendoim 1 – 117,8 ug/kg SP Atayde et al. 2012

B1 G1 B2 G2 Chocolate 0,43 – 0,66 ug/kg AM Copetti et al., 2012a.

B1 Amendoim 22 – 87,5 ug/kg RS Hoeltz et al. 2012

M1 Leite, Queijo 10 – 529 ng/kg SP Ilha et al., 2011

B1 G1 B2 G2 Amendoim Nd MG de Lima et al., 2012

B1 G1 B2 G2 Nozes Nd AM Baquião et al., 2012

B1 G1 B2 G2 Amêndoas 0 – 8ug/kg AM Reis et al., 2012

B1 G1 B2 G2 Castanha 1,7 – 35mg/kg AM Freitas-Silva et al.,

2011

B1 G1 B2 G2 Castanha Nd AM Vargas et al., 2011

B1 G1 B2 G2 Cacau Nd AM Copetti et al., 2011b

B1 G1 B2 G2 Amendoim 0,5 – 113 ng/g PR Magrine et al., 2011

M1 Queijo 0,037-0,313 ng/g SP Oliveira et al., 2011

As vias de biotransformação da AFLAB1 variam entre espécies animais

explicando os diferentes graus de susceptibilidade à AFLAB1 entre eles (GROSS-

STEINMEYER e EATON, 2012; KULANTHAIVEL et al., 2012). A presença ou

ausência de citocromo P-450 bem como sua atividade determinam a susceptibilidade

da espécie animal à AFLAB1, dentre outros fatores (HABIB et al., 2006). A maioria das

45

aflatoxinas é excretada entre 72 e 96 horas, o fígado e o rim retem os resíduos por

mais tempo que outros tecidos (BAMMLER et al, 2000; PARTANEN et al., 2010).

Diversos trabalhos têm sido desenvolvidos visando o estudo da ocorrência

de aflatoxinas em alimentos no Brasil em diferentes matrizes. A distribuição dessas

toxinas em tecidos vegetais pode resultar na possibilidade para contaminação dos

produtos de origem animal afetando humanos de forma direta ou indireta (OLIVEIRA

et al., 2003; D’ANGELO et al., 2007). Na Tabela 4 estão alguns relatos de ocorrência

de aflatoxinas em alimentos.

3.1.5 Determinação de aflatoxinas

As micotoxinas possuem uma grande diversidade estrutural e propriedades

físico-químicas entre elas, o que tem levado ao desenvolvimento de uma variedade de

métodos analíticos para sua extração, detecção e quantificação. No caso especifico

das aflatoxinas cujos efeitos sinérgicos e co-ocorrências em matrizes foram muito

estudadas quanto a possibilidade de determinação simultânea (RAHIMI e AMERI,

2012).

Para métodos de extração das aflatoxinas, verifica-se a tendência de

emprego de procedimentos que minimizem o impacto ambiental, o tempo de

exposição dos analistas a solventes tóxicos, direcionando para a proposição de

multimétodos que determinem uma ampla variedade de substancias em uma única

extração (HERNANDEZ-HIERRO et al., 2008; ZOUGAGH e RÍOS, 2008; HANS et al.,

2008).

A contaminação natural das micotoxinas ocorre em concentrações traço

em matrizes complexas como os cereais, onde os interferentes como gorduras e

pigmentos dificultam o preparo da amostra durante a extração e purificação para a

determinação (HANS et al., 2008).

A extração líquido-sólido é a mais utilizada para extrair aflatoxinas, sendo

estas amplamente encontradas em matrizes sólidas. Os métodos são simples

empregando solventes tais como metanol, acetonitrila e água. Sendo a matriz

constituída de compostos hidrossolúveis, os solventes polares (metanol, acetona e

etilacetato) são os mais indicados, no entanto, se a matriz for constituída por

compostos não hidrossolúveis a acetonitrila é o indicado (STROKA et al., 1999).

46

Alguns métodos de extração envolvem a utilização de equipamentos ou

vidrarias, tais como, a utilização de blender, mesa agitadora orbital, ultrassom e gral. O

uso do blender auxilia na extração devido à homogeinização da matriz com o solvente

extrator, necessitando de pouco tempo de análise (SOARES e RODRIGUES AMAYA,

1989). A mesa agitadora orbital, também homogeiniza a matriz com o solvente, no

entanto, necessitando de maior tempo de analise que a utilização do blender, sendo

este, em alguns casos, podendo ser substituído por agitador de tubos ou até mesmo

ultrassom (AMATE et al, 2010; CAPRIOTTI et al, 2010; HACKBART et al., 2011).

Método de extração de dispersão da matriz em fase sólida utiliza gral e

pistilo como mecanismo de homogeineização da matriz com adsorventes adequados

que, em seguida, são eluidos, com auxilido de um cartucho, com solventes

apropriados. Este método vem sendo bastante estudado e empregado em matrizes

com alta atividade de água (RUBERT et al, 2010; CARVALHO et al., 2013). A

microextração em fase sólida pode ser empregada diretamente no extrato de diversas

matrizes, sem a necessidade de tratamentos prévios (NONAKA et al., 2009). A

extração em fase sólida, vem sendo aplicada a muitos anos para análise de diferentes

micotoxinas em diversas matrizes, sendo uma metodologia bastante aplicável pois

permite em uma única etapa a extração, pré concentração e purificação da matriz a

ser analisada (ALCAIDE-MOLINA et al., 2009).

A metodologia de QuEChERS (do inglês rápido, fácil, barato, eficaz,

robusto e seguro) , antes utilizadada para extração de agrotóxicos em matrizes como

cereais, frutas e água, agora vem sendo adaptado para extração de micotoxinas

(HACKBART et al., 2013; BENVENUTTI et al., 2012), este método tem como

vantagem a utilização de menos reagentes, vidrarias e etapas intermediárias

(DESMARCHELIER et al., 2010).

Os tipos de cromatografia utilizadas na separação e detecção de

micotoxinas são: Cromatografia em Camada Delgada (CCD), Cromatografia em

Camada Delgada de Alta Eficiência (CCDAE), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG), além destas, as técnicas hifenadas que

confirmam a identificação como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à

Espectrometria de Massa (CLAE/EM ou CLAE-EM/EM) e Cromatografia Gasosa

acoplada à Espectrometria de Massa (CG/EM ou CG-EM/EM) (TURNER, 2009).

O método mais popular usado para análise de micotoxinas é CCD, que

permite a determinação simultânea de um grande número de amostras e é mais

47

econômica, porém, apresenta a desvantagem de ser semiquantitativa. A quantificação

empregando imagens fotográficas podem conferir maior exatidão e precisão a

determinação por CCD (NOLL et al., 2007). A CLAE acoplada a detector de

fluorescência é a técnica analítica de separação mais usada para análise de

micotoxinas, devido à sensibilidade, capacidade para efetuar determinações precisas

e de separar espécies não voláteis (TURNER et al., 2009; KRSKA et al., 2008;

MENEELY et al., 2011).

3.1.6 Degradação de aflatoxinas

A remoção de aflatoxinas dos alimentos e nutrientes contaminados por

métodos físicos, químicos ou biológicos (RUSTOM, 1997; MISHRA e DAS, 2003;

ZUCCHI et al., 2008). Estão sendo estudadas, extensivamente, a inativação desses

compostos por métodos físicos e químicos que, têm se mostrado pouco eficientes pois

para produzirem reduções importantes causam danos nutricionais e tecnológicos

(MISHRA e DAS, 2003; MÉNDEZ-ALBORES et al., 2009; TRIPATHI e MISHRA,

2010). A degradação biológica é promissora por propiciar melhoras nas propriedades

funcionais simultaneamente a redução dos níveis das toxinas sob condições

moderadas (ZUCCHI et al., 2008).

Procedimentos menos convencionais que cozimento e autoclavagem, tais

como a extrusão, fotodegradação sob UV, vem se mostrando interessantes, porém os

custos nem sempre são viáveis (SAALIA e PHILIPS, 2011; LIU et al., 2010).

O uso dos solventes metanol, etanol e hexano, e a amoniação são úteis

para aplicação em produtos agrícolas (PRUDENTE e KING, 2002; VELAZHAHAN et

al., 2010). A ozonização é um procedimento químico aprovado pela Food and Drug

Administration, mas como os métodos físicos são de difícil viabilidade econômica

(GUZEL-SEYDIM et al., 2004; ZORLUGENÇ et. al., 2008, FREITAS e VENÂNCIO,

2010, ALENCAR, 2011; SHAN et al., 2012).

Há evidências que as aflatoxinas podem ser metabolizadas por alguns

micro-organismos, que estão sendo avaliados quanto ao seu modo de atuação como

alternativa para degradação biológica bem como suas enzimas, purificadas ou não

(NOGUEIRA et al., 2010).

48

Extratos aquosos obtidos a partir de tecidos vegetais, tais como as

sementes de Trachyspermum Ami, foram efetivos para diminuir em 65% na forma

bruta e 90% na forma purificada a AFLAG1 (VELAZHAHAN et al., 2010).

Extratos de Ageratum conyzoides inibiu o crescimento fungico e a

produção de micotoxina quando aplicado na ordem de 0,1g/mL (NOGUEIRA et al.,

2010).

A bactéria Rhodococcus erythropolis em cultivo submerso reduziu em 96%

os teores de AFLAB1 (KONG et al., 2012). Outras bactérias como a Bacillus subtilis

foram avaliadas em amostras de pistache, com resultados na faixa de 86% e 95% de

degradação da AFLAB1 após 24 h (FARZANEH et al., 2012). Outro estudo utilizando a

mesma bactéria (Bacillus subtilis) foi avaliado para degradação das AFLAB1, AFLAM1

e AFLAG1 em cultivo submerso mostrando percentuais de 81,5%, 60% e 80,7%,

respectivamente (GAO et al., 2011). No mesmo sistema submerso a Pseudomonas

stutzeri, reduziu em 90% a AFLAB1 ao longo de 72 h (LI et al., 2012). A triagem do

potencial de metabolizar compostos cumarinicos por bactérias diversas mostrou que a

Stenotrophomonas maltophilia, reduzia em 82% a AFLAB1 após 72h, sendo o efeito

atribuído a ação de proteases (GUAN et. al. 2008).

Os principais fungos que tem demostrado esta propriedade são, de todas

as classes, os zigomicetos (Rhizopus sp.), os ascomicetos (A. niger e Trichoderma

sp.), agentes patogênicos de plantas (Phoma sp. e Alternaria sp.) bem como os

basidiomicetos (Armillariella) (YAO et al., 1998; LEONOWICZ et al., 1999). Culturas

mistas dos fungos A. niger, Rhizopus oryzae e Bacillus stearothermophilus,

degradaram a AFLAB1 em 80, 70 e 87%, respectivamente. Verificou-se ainda que o

Rhizopus spp. foi capaz de converter a AFLAB1 a compostos isoméricos hidroxilados

(MISHRA e DAS, 2003). Os micro-organismos Aspergillus oryzae e Rhizopus sp.

foram avaliados em relação a sua capacidade de degradação da AFLAB1 e ocratoxina

A (OTA) em amostras de farelo de arroz utilizando fermentação sólida sendo que o

primeiro degradou 80% da AFLAB1 e o segundo 80% da OTA (CACCIAMANI et al.,

2007). Fungos comestíveis como o Pleurotus ostreatus também foi avaliado quanto o

seu potencial degradador de AFLAB1, ficando demonstrado que estge produzia uma

enzima extracelular que degradava 70% da micotoxina no meio (MOTOMURA et al.,

2003).

As enzimas envolvidas na degradação de micotoxinas ainda são pouco

estudada, (TENIOLA et al., 2005; ALBERTS et al., 2006; GRAHAM, 2010; TAYLOR et

49

al., 2010; LAPALIKAR et al., 2012) no entanto, as enzimas extracelulares purificadas

do micro-organismo Myxococcus fulvus tem sido avaliadas quanto a degradação das

AFLAB1, AFLAG1 e AFLAM1, em cultivo submerso demosntrando resultados

interessantes após 48 h (ZHAO et al., 2011). As peroxidases de pimentão,

parcialmente purificada, aplicada a degradação da AFLAB1, degradou 66% após 24 h

de incubação (TRIPATHI e MISHRA, 2010). Associada de ação enzimática e radiação

UV forma eficientes quando aplicada a pimentas (TRIPATHI e MISHRA, 2011). A

lacase, extraída dos micro-organismos Peniophora e Pleurotus ostreatus em cultivo

submerso com álcool e bagaço de cana, atingiram níveis de 40 e 36%,

respectivamente para AFLAB1 (ALBERTS et al., 2010).

3.1.7 Testes de toxicidade

A aflatoxina foi a primeira das micotoxinas a ser investigada quanto aos

seus efeitos tóxicos em aquicultura (LLEWELLYN et al.,1977). Os efeitos biológicos da

AFLAB1 em peixes são diretamente ligados a sua alimentação, idade e espécie do

animal e os efeitos são hepatotóxicos (MANNING et al., 2005; WILLIAMS et al., 2009).

Em vista disto estes vinham sendo usados em testes biológicos, porém, com as

restrições ao uso de animais de laboratório, há a necessidade de desenvolver e

padronizar testes in vitro que possam detectar a toxicidade destes compostos para

extrapolar os efeitos para animais e humanos. Vários métodos in vitro, para avaliar a

toxicidade de diferentes compostos, foram então padronizados utilizando-se culturas

celulares (ROGERO (a) et al., 2000).

Estes testes de toxicidade consistem em colocar o material direta ou

indiretamente em contato com uma cultura de células, verificando-se as alterações

celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a incorporação de corantes vitais

ou a inibição da formação de colônias celulares (ROGERO (b) et al., 2000). O

parâmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade é a viabilidade celular, que pode ser

evidenciada pelo teste de ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Diversar células são utilizadas para investigação do potencial toxigênico

das micotoxinas (TROXEL et al., 1997), dentre elas as células de mamíferos, como

por exemplo as células da linhagem de carcinoma humano (HepG2) onde os efeitos

da AFLAB1 foram estudados em relação a análise de citotoxicidade, a apoptose e a

expressão do p53, avaliados após a exposição a diferentes concentrações de AFLAB1.

50

A citotoxicidade e a expressão da proteína p53 da AFLAB1 diminuíram em comparação

com o controle na maior concentração e 1000 µg L-1 (MCKEAN et al., 2006). Estudo

com a mesma célula HepG2 em coexposição a OTA e AFLAB1 durante 24 horas,

mostrou que a AFLAB1 teve resposta genotóxica após 3 horas de experimento, no

entanto na presença da OTA esses efeitos foram diminuídos ocorrendo após 24 horas,

isto pode ser explicado pela competitividade destas micotoxinas pelo citrocomo P-450,

formando menos adutos de AFLAB1 (CORCUERA, et al., 2011).

As células HepG2 foram tratadas com AFLAB1 (10µM) durante 48 horas

para avaliação de sua viabilidade, onde o resultado não mostrou diferença significativa

em relação ao controle, no entanto houve um aumento dos níveis do mRNA, sugerindo

que esta alteração pode estar estreitamente ligada a toxicidade desta micotoxina

(HANIOKA et al., 2012). Estudos em células podem fornecer um método

biologicamente seguro e eficaz para avaliar a presença de micotoxinas e seus

produtos de degradação em produtos agrícolas.

As células de peixes de aquário, tais como o peixe-zebra (Danio rerio) é

útil como modelo em tais investigações (STERN e ZON, 2003; SAID e HASSAN,

2009). A expectativa de vida curta desses peixes resulta em respostas rapidas,

facilidade e baixo custo de manutenção têm sido citados também como vantagens

para o uso de peixes de aquário em experimentos de carcinogênese in vitro e in vivo

(ACKERMANN e PAW, 2003).

51

CAPITULO III

52

ARTIGOS

Neste capítulo encontram-se descritos os procedimentos experimentais

utilizados no desenvolvimento do trabalho, bem como os resultados obtidos, escritos

na forma de artigos científicos com os seguintes títulos:

Artigo 1: Validação de método para extração, detecção e quantificação

cromatográfica das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1

Artigo 2: Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma

reesei

Artigo 3: Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1

pelos micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei

Artigo 4: Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae

e seu potencial carcinogênico

53

Artigo 1

Validação de método para extração, detecção e quantificação de aflatoxinas.

54

Validação de método para extração, detecção e quantificação de

aflatoxinas.

Resumo

Neste trabalho foi validado um método para determinação simultânea

aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e AFLAM1. As condições

cromatográficas foram otimizadas utilizando planejamento fatorial considerando as

variáveis dependentes tempos de retenção, fator de capacidade e resolução como

respostas. Um delineamento composto central rotacional (DCCR) indicou que a fase

móvel ideal constituída pelas proporções de água ultra pura acidificada com ácido

acético (99:1):acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) e com um delineamento composto

central (DCC) a vazão da fase móvel e temperatura da coluna em 0,6 mL.min-1 e 45ºC

foram definidas. Também foram avaliados cinco procedimentos de extração e

purificação dos extratos sendo o proposto por Soares e Rodriguez-Amaya modificado,

o mais adequado indicado pela recuperação média de 66; 92; 74; 88 e 71%

respectivamente para as aflatoxinas AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1.

Palavras chave: aflatoxinas, separação, extração

55

Validation method for the extraction, detection and quantification of

aflatoxins AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and AFM1

Abstract

This work was validated a method for simultaneous determination

aflatoxins AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and AFM1. The chromatographic conditions were

optimized using factorial design as a tool of study. We defined the dependent variables

(retention times, capacity factor and resolution) that consisted of responses

evaluated. The central composite design (DCCR) was determined that the mobile

phase was composed of the proportions of ultra pure water: acetonitrile: methanol

(60:8:32 v/v/v) and the central composite design (DCC) were defined flow rate of

mobile phase and column temperature at 0.6 ml.min-1 and 45ºC. We also evaluated

five procedures for the extraction and purification of extracts being proposed by Soares

and Rodriguez-Amaya modified the most suitable for the average recovery of 66, 92,

74, 88 and 71% respectively for aflatoxin AFM1, AFG2, AFG1, AFB2 and AFB1.

Keywords: Aflatoxins, separation, extraction.

56

1. INTRODUÇÃO

A determinação simultânea de compostos de ocorrência aleatória em

concentração traço e com estruturas similares, pode ser melhor estabelecida usando

métodos estatísticos que avaliem o efeito combinado de diferentes variáveis

(SOBRINHO et al., 2006; STROKA, 2000).

Neste caso estão as aflatoxinas B1 e B2 (AFLAB1 e AFLAB2) produzidas

por cepas de Aspergillus flavus; as aflatoxinas G1 e G2 (AFLAG1 e AFLAG2)

produzidas pelos A. parasiticus e nominus (SAMSON e VARGA, 2009) que podem

ocorrer simultaneamente em alimentos bem como sua derivada M1 (AFLAM1). A

AFLAB1 é classificada pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC,

2002) como carcinogeno para humanos, pois metabolicamente podem ser produzidos

derivados capazes de atravessar a membrana nuclear e formar adutos com a guanina

(STROKA, 2000) ou transformar-se na AFLAM1 e ser escretada através do leite, urina

e fezes (STROKA, 2000; IHA et al., 2011).

Os diversos métodos analíticos disponíveis para a determinação de

aflatoxinas em alimentos e rações para animais incluem a cromatografia de camada

delgada (CCD), cromatografia de camada delgada de alta eficiência (CCDAE) e

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (STROKA e ANKLAM, 2000; ARDIC et

al., 2008; LI et al., 2009; FEDOROWSKI e LACOURSE 2010). A CCD e a CCDAE são

procedimentos simples, econômicos, porém com resultados semiquantitativos ou com

sensibilidade questionável (STROKA e ANKLAM, 2000; OTTA, et. al., 2000). O

método CLAE é rápido e sensível e seu emprego, na detecção e quantificação de

aflatoxinas, em diversos produtos alimentícios, tem sido amplamente utilizado (IQBAL

et al., 2013; EL TAWILA et al., 2013; KHAYOON et al., 2012; LUTFULLAH e

HUSSAIN, 2012). Em qualquer dos sitemas cromatográficos o desafio é a separação

das aflatoxinas cujas propriedades cromatográficas são muito semelhantes (JAIMEZ et

al., 2000).

Após a década de 90, com a disponibilização de equipamentos a CLAE

empregando colunas de fase reversa propiciaram melhor separação das aflatoxinas

(TURNER et al., 2009). Na cromatografia de fase reversa (FR) a separação dos

analitos é determinada principalmente pelas características da fase móvel (AFSAH-

HEJRI et al., 2011). Outros parâmetros que afetam a eficiência da coluna, para

separação, são a vazão da fase móvel, a viscosidade da fase móvel, a temperatura e

57

comprimento da coluna (AFSAH-HEJRI et al., 2011; ZHANG et al., 2013). Estes

fatores são difíceis de serem combinados de forma adequada quando as misturas a

serem separadas são constituídas por estruturas muito semelhantes, como é o caso

das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1 (TURNER et al., 2009).

A modelagem estatística utilizando Delineamento Composto Central (DCC)

é uma ferramenta utilizada para a determinação da relação entre vários parâmetros de

um processo e suas respostas de acordo com os diferentes critérios desejados

(STROKA, 2000). Trata-se, portanto, de procedimento útil para estudos de adequação

de métodos analíticos, pois combinam de forma fatorial, diversos fatores e diminui o

número de experimentos para ajustar as condições operacionais (FU et al., 2008;

GARDA et al., 2005; HACKBART et al., 2012).

Neste trabalho os procedimentos Delineamento Composto Central e

Delineamento Composto Central Rotacional foram utilizados como ferramenta para

investigar o efeito simultâneo das condições cromatográficas em relação à proporção

da fase móvel, vazão da fase móvel e temperatura da coluna, na separação de cinco

aflatoxinas (AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e AFLAM1). Foram avaliados

diferentes métodos de extração, em termos de recuperação, repetitividade, limites de

detecção e quantificação, com o objetivo de disponibilizar um método acessível para

extração e determinação simultânea das cinco aflatoxinas.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Instrumentação

Para separação e detecção das aflatoxinas foi utilizado cromatógrafo

líquido Shimadzu Prominende UFLC constituído por um sistema de bombas (LC-AT),

desgaseificador da fase móvel (DGU), controlador (CBM-20A), injetor manual com alça

de injeção de 20 μL (7725i), detecção por fluorescência (FL-10AXL) programada para

comprimento de onda do espectro de excitação de fluorescência máxima ex = 360 nm

e comprimento de onda do espectro de emissão de fluorescência máxima

em = 435 nm. A aquisição de dados foi realizada pelo programa LC Solution. Foi

empregada coluna cromatográfica Nucleosil®, C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm, Bellefonte,

PA, USA).

58

2.2 Padrões analíticos, reagentes e solventes

Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2

e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.

O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau

cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e

separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).

O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),

hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck

(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de

amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de

sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra

diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura

utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração

Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada

com ácido acético glacial (99:1 v/v).

2.3 Preparo de Amostras

As amostras de farelo de arroz foram adquiridas de indústrias do Rio

Grande do Sul. Cerca de 10 kg de amostra foram aleatoriamente coletados,

homogeneizadas e peneiradas. Em seguida as amostras foram embaladas em sacos

de polietileno e armazenadas a 4-8ºC até a sua utilização.

2.4 Preparo das soluções estoque e trabalho

Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila

(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,

AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração

de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo

a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µg.mL-1 para as aflatoxinas

AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg.mL-1 para AFLAM1. As concentrações

foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)

empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e

59

18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,

respectivamente (AOAC, 2000).

2.5 Adequação das condições cromatográficas

O efeito simultâneo das condições cromatográficas em relação à

proporção da fase móvel (água ultra pura acidificada com ácido acético (99:1

v/v):acetonitrila: metanol), vazão da fase móvel e temperatura da coluna, na separação

cromatográfica de cinco aflatoxinas foram avaliados em relação ao tempo de retenção,

fator de capacidade e resolução, em dois planejamentos experimentais.

A matriz do primeiro planejamento experimental 23 com 3 pontos centrais e

pontos axiais (Delineamentos Composto Central Rotacional – DCCR) foi realizado nas

combinações descritas na Tabela 1. De acordo com os resultados do primeiro

planejamento foi realizado um segundo planejamento experimental 22 com 3 pontos

centrais (Delineamento Composto Central – DCC) descrito na Tabela 2.

Para o primeiro planejamento experimental DCCR (Tabela 1) a proporção

da fase móvel (água ultra pura acidificada:acetonitrila: metanol), vazão da fase móvel

e temperatura da coluna foram as variáveis independentes. Neste planejamento

experimental a proporção da fase móvel foi variada com o aumento da porcentagem

de acetonitrila e diminuição de metanol, mantendo a água em 60%.

Para o segundo planejamento experimental DCC (Tabela 2) a vazão da

fase móvel e temperatura da coluna foram as variáveis independentes.

Foram determinados os coeficientes de regressão, análises de variância

(ANOVA) e análises das superfícies de respostas e curvas de contorno (AFSAH-

HEJRI et al., 2011) através do programa Statistica 7.0 utilizando um intervalo de

confiança de 95%, ou seja, p < 0,05. (Anexo).

Tabela 1. Valores utilizados no DCCR para os três fatores.

Variáveis independentes Código Níveis das variáveis independentes

-1,68 -1 0 1 1,68

Proporção da FM* (%) x1 60:10:30 60:8:32 60:6:34 60:4:36 60:2:38

Vazão da FM* (mL.min-1) x2 0,2 0,4 0,5 0,6 0,8

Temperatura (ºC) x3 25 30 40 50 55

* FM: fase móvel: (água ultra pura acidificada com ácido acético (99:1 v/v):acetonitrila: metanol).

60

Tabela 2. Valores utilizados no DCC para os dois fatores.

Variáveis independentes Código Níveis das variáveis independentes

-1 0 1

Vazão da FM* (mL.min-1) x4 0,4 0,5 0,6

Temperatura (ºC) x5 35 40 45

* FM: fase móvel: (água ultra pura acidificada com ácido acético (99:1 v/v):acetonitrila: metanol).

2.6 Determinação das aflatoxinas

Foram testados cinco métodos de extração em termos de resíduos,

recuperação, limites de detecção e quantificação, além da capacidade de extrair as

cinco aflatoxinas simultaneamente.

Os procedimentos de extração foram avaliados (recuperação) em

amostras de farelo de arroz, o estudo foi realizado em três níveis 12,0; 20,0 e

40,0 µg.kg-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 2,0; 4,0 e 8,0 µg.kg-1 para AFLAG2 e

AFLAB2 para o procedimento 1 (método de SOARES e RODRIGUEZ-AMAYA, 1989,

modificado) e 3,0; 5,0 e 10,0 µg.kg-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,05; 0,1 e

0,2 µg kg-1 para AFLAG2 e AFLAB2 para os procedimentos 2 (método QuEChERS

ANASTASSIADES et al., 2003), 3 (método QuEChERS metanol ANASTASSIADES), 4

(método QuEChERS modificado HACKBART et al., 2012) e 5 (método QuEChERS

metanol HACKBART). Os valores dos limites de detecção e quantificação do

instrumento (LODi e LOQi) multiplicados pelos fatores de diluição para o método de

extração resultou nos limites de detecção (LODm) e quantificação do método (LOQm).

O método de extração e purificação descrito por Soares e Rodriguez-

Amaya (1989), procedimento 1, foi modificado visando à minimização da quantidade

de amostra e solventes extratores utilizados e, consistiu, no uso de 10g de amostra de

farelo de arroz, homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio

4% (9:1 v/v) por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do

filtrado e adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10cm3 de terra diatomácea.

A mistura foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida

filtrada novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e

adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com

10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e

os frascos secos armazenados a -18ºC.

61

O método de extração QuEChERS descrito por Anastassiades et al.

(2003), procedimento 2, foi aplicado com modificações. O método consistiu no uso de

10g de amostra de farelo de arroz homogeneizadas com 10 mL de água destilada em

tubo de teflon® de 50 mL, onde foram adicionados 10 mL de acetonitrila. Os tubos

foram agitados manualmente durante 1 min. Após foram adicionados 4 g de sulfato de

magnésio e 1 g de cloreto de sódio seguido de nova agitação durante 1 min. O

material foi centrifugado a 3220xg durante 8 min, o sobrenadante foi recolhido em tubo

de teflon® e a este foram adicionados 0,15 g de sulfato de magnésio e 0,25 g de terra

diatomácea seguido de agitação manual durante 1 min. A separação foi realizada por

centrifugação a 3220xg por 8 min. O sobrenadante foi recolhido e os frascos contendo

os resíduos secos e armazenados a -18ºC. Este método foi repetido utilizando metanol

como solvente extrator, procedimento 3, sendo identificado como QuEChERS metanol

Anastassiades.

O método de extração QuEChERS descrito por Hackbart et al. (2012),

procedimento 4, consistiu na adição de 10g de amostra de farelo de arroz em

erlenmeyer ao qual foram adicionados 10 mL de água destilada e 10 mL de acetonitrila

acidificada com 0,2 mL de ácido acético glacial. A homogeneização foi realizada em

mesa agitadora orbital durante 10 min, a 200 rpm, com adição de 1,50 g de sulfato de

magnésio e 0,85 g de acetato de sódio e nova agitação durante 10 min, a 200 rpm. O

material foi centrifugado por 8 min, a 3220xg, ao sobrenadante foram adicionados

0,30 g de sulfato de magnésio e 0,20 g de terra diatomácea, agitados manualmente

durante 1 min e nova centrifugação por 8 min a 3220xg. O sobrenadante foi seco e os

frascos armazenados a -18ºC. Este método foi repetido utilizando metanol como

solvente extrator, procedimento 5, sendo identificado como QuEChERS metanol

Hackbart.

2.7 Validação da técnica cromatográfica

Após a adequacidade das condições ótimas de separação, a técnica

cromatográfica foi validada de acordo com os parâmetros sugeridos pela Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2011), pelo Instituto Nacional de Metrologia,

Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO, 2003) e de acordo com o protocolo

da União Internaciona de Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and

Applied Chemistry - IUPAC/AOAC/ISO, HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000). Na

62

maioria dos casos, os métodos devem obedecer a um intervalo de recuperação de 70

- 110% com desvio padrão e desvio padrão relativo de 20% e 30%, respectivamente

(HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000).

Os parâmetros considerados na validação foram limites de detecção e

quantificação, curva analítica, linearidade, seletividade e recuperação. Os limites de

detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do instrumento (LODi e LOQi,

respectivamente) foram estimados considerando-se pelo menos 3 e 10 vezes a razão

entre o sinal pela linha de base (ruído), respectivamente. Os limites instrumentais

foram obtidos por padronização externa com a preparação de soluções analíticas de

diferentes concentrações na fase móvel. Os valores de LODi e LOQi multiplicados

pelos fatores de diluição para o método de extração resultou nos limites de detecção

(LODm) e quantificação do método (LOQm) estimado. Para construir a curva analítica

foram preparadas soluções analíticas nas concentrações de 2,0; 20,0; 30,0; 45,0; 75,0;

e 100 ng.mL-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e

2,0 ng.mL-1 para AFLAG2 e AFLAB2. Cada ponto da curva analítica foi injetada em

triplicata e os dados de regressão linear foram obtidos com auxílio do programa LC

Solution. Foram consideradas com boa linearidade curvas com valores de R2 > 0,90

(HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000). A seletividade foi avaliada comparando o sinal

gerado pela injeção da matriz isenta das aflatoxinas e desta adicionada de padrão

(HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000; RIBANI, 2004).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Adequação das condições cromatográficas

As variáveis independentes, proporção da fase móvel (x1), vazão da fase

móvel (x2) e temperatura da coluna (x3), foram estudadas no primeiro planejamento

(DCCR) para obter redução do tempo de retenção (Y1) sem perda no fator de

capacidade (Y2) e resolução (Y3) dos analitos, estabelecendo-se como tempo total de

corrida de no máximo 30 min. (Tabela 3), uma vez que corridas longas propiciam

alargamento de picos, tempo de análise limitante, gasto de solventes e geração de

resíduos. Os resultados da análise estatística, aplicados aos dados experimentais Y1,

Y2 e Y3 foram determinados através de SS residual e o efeito estimado indica o quanto

cada fator influiu nas respostas. A ordem de eluição das aflatoxinas nas condições

63

estudadas foi AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1. O tempo de retenção

esperado para a AFLAM1, primeira a eluir, era ao redor de 7 min, e o tempo de

retenção esperado para a AFLAB1, última a eluir, era de no máximo 25 min.

Os parâmetros estatísticos teste t e valor p (p < 0,05) foram utilizados para

confirmar a significância dos efeitos dos fatores estudados, sendo o erro puro

associado aos experimentos e calculado pelos pontos centrais para demonstrar a

repetibilidade do processo (TEÓFILO e FERREIRA, 2006).

Os valores dos tempos de retenção (Y1), fator de capacidade (Y2) e

resolução (Y3) foram empregados para calcular os coeficientes de regressão onde

este, foi altamente significativo (p < 0,05), mostrando que existe boa repetibilidade dos

dados experimentais e descrevendo as respostas Y1, Y2, e Y3 (variáveis dependentes)

em função das variáveis independentes x1, x2 e x3, em modelos de primeira e segunda

ordem. Para o ajuste do modelo que pode predizer o tempo de retenção (Y1), o fator

de capacidade (Y2) e a resolução (Y3), em função da proporção da fase móvel (x1),

vazão da fase móvel (x2) e temperatura da coluna (x3) foi utilizada análise de variância

(ANOVA) para avaliar a validade do modelo ajustado (TEÓFILO e FERRERIA, 2006).

(Anexo 1).

As variáveis dependentes Y1,Y2 e Y3 apresentaram valores de Fcal

superiores ao Ftab para todos os casos, valores superiores a 3 (Fcal/Ftab), mostrando

que todos os modelos foram preditivos. No entanto, os coeficientes de regressão não

apresentaram valores superiores a 0,90 para todos os casos, portanto não foram

preditivos e significativos. (Anexo 2).

Apenas os tempos de retenção (Y1) e fator de capacidade (Y2) da AFLAB2

e AFLAB1, apresentaram valores preditivos e significativos para gerar curvas de

contorno dos efeitos x1, x2 e x3. A resolução (Y3) apresentou valores preditivos e

significativos para as AFLAM1, em todas as variáveis independentes (x1, x2 e x3),

AFLAG2 e AFLAG1 para as variáveis x1 e x3 (Figura 1).

Os melhores tempos de retenção ocorreram na menor vazão da fase

móvel (x2) e menor temperatura da coluna (x3) para AFLAB2 e AFLAB1 (Figura 1 A, B).

No entanto, para variável x2, os tempos de retenção são superiores a 30 min, assim,

foi considerado apenas o resultado para a variável x3 com tempos de retenção de 19,8

e 24,5 min para AFLAB2 e AFLAB1, respectivamente. O melhor fator de capacidade

(valores superiores a 0,5) ocorreu na menor proporção da fase móvel (x1) e

temperatura da coluna (x3) para AFLAB2 e AFLAB1 (Figura 1 C, D). Na resolução os

64

melhores valores para AFLAG2 e AFLAG1 ocorreram na menor temperatura da coluna

(Figura 1 E, F). Para a AFLAM1 observa-se que a melhor resolução foi alcançada na

menor proporção e vazão da fase móvel e maior temperatura (Figura 1 G, H).

Os resultados mostraram que a proporção da fase móvel tinha efeito

significativo sobre a maioria das respostas, portanto, um parâmetro crítico. As

aflatoxinas são compostos hidrofóbicos ligeiramente solúveis em solventes polares e

em CLAE eluem em ordem descrescente de polaridade (Turner et al., 2009), assim, as

respostas referentes a uma eficiente separação (fator de capacidade e resolução)

foram alcançadas pela proporção correta de água, metanol e acetonitrila. A proporção

da fase móvel água ultra pura acidificada:acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) foi a que

resultou nos melhores valores de tempo de retenção que não ultrapassaram 30 min.,

valores de fator de capacidade entre 0,5 e 10, e valores de resolução acima de 1

semelhante ao de outros autores (CHIAVARO et al., 2001; TURNER et al., 2009).

A influência da vazão da fase móvel e temperatura da coluna, não

puderam ser definidas neste experimento, tornando necessária a realização de um

novo planejamento experimental (Tabela 2) para ajustar a temperatura da coluna (x4) e

vazão da fase móvel (x5) das condições cromatográficas. A Tabela 4 apresenta a

matriz do segundo planejamento fatorial DCC estudado considerando novamente o

tempo de retenção (Y1’), fator de capacidade (Y2’) e resolução (Y3’) como variáveis

respostas.

Os coeficientes de regressão foram calculados com um intervalo de

confiança de 95% (p < 0,05), onde estes mostraram boa repetibilidade dos dados

experimentais descrevendo as respostas das variáveis dependentes Y1’, Y2’ e Y3’

como em função das variáveis independentes x4 e x5, em modelos de primeira ordem

(Tabela 5). Para o ajuste do modelo foi utilizada análise de variância (ANOVA) para

avaliar a validade do modelo ajustado, onde os valores de Fcal superiores ao Ftab foram

considerados preditivos e significativos. (Anexo 4).

Os modelos preditivos e significativos foram utilizados para gerar as

curvas de contorno. Para o tempo de retenção (Y1’) todas as aflatoxinas apresentaram

valores preditivos e significativos (Figura 2). Para a capacidade de separação (Y2’)

apenas as AFLAG1 e AFLAB2 e para a resolução (Y3’) as aflatoxinas AFLAM1, AFLAG2

e AFLAG1 apresentaram esses valores (Figura 3).

65

Tabela 3. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de capacidade e resolução das aflatoxinas estudadas.

Exp. x1 x2 x3 (Y1) Tempo de Retenção (Y2) Fator de capacidade (Y3) Resolução

M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1

1 -1 -1 -1 13,86 14,61 17,78 22,61 27,81 0,19 0,25 0,53 0,94 1,39 2,66 1,29 4,73 5,44 4,85

2 1 -1 -1 12,85 13,92 16,74 20,80 25,31 0,18 0,28 0,54 0,91 1,32 2,46 1,81 4,12 5,03 4,69

3 -1 1 -1 9,34 9,83 11,93 15,17 18,63 0,18 0,25 0,52 0,93 1,36 2,56 1,24 4,27 5,39 4,76

4 1 1 -1 8,60 9,32 11,20 13,91 16,91 0,16 0,26 0,51 0,88 1,28 2,05 1,76 3,99 4,87 4,53

5 -1 -1 1 9,78 10,24 11,92 14,71 17,34 0,18 0,24 0,44 0,78 1,09 2,93 1,10 3,31 4,33 3,44

6 1 -1 1 9,16 9,79 11,29 13,71 16,05 0,17 0,25 0,44 0,75 1,05 2,66 1,45 2,96 4,10 3,31

7 -1 1 1 6,51 6,82 7,92 9,76 11,50 0,18 0,23 0,43 0,77 1,08 2,71 1,08 3,32 4,45 3,53

8 1 1 1 6,16 6,59 7,59 9,22 10,57 0,17 0,26 0,45 0,76 1,05 2,50 1,11 2,98 4,19 3,38

9 -1,68 0 0 9,60 9,95 11,91 15,02 18,18 0,19 0,24 0,48 0,87 1,26 2,96 0,98 4,26 5,09 4,25

10 1,68 0 0 8,34 9,08 10,65 12,94 15,3 0,18 0,28 0,50 0,83 1,17 2,25 1,79 3,22 4,11 3,72

11 0 -1,68 0 22,11 23,43 27,66 32,10 36,55 0,18 0,24 0,47 0,86 1,24 2,85 1,36 4,32 5,89 3,31

12 0 1,68 0 5,69 6,05 7,15 8,88 10,6 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,17 1,31 3,46 4,38 3,81

13 0 0 -1,68 11,99 12,84 15,67 19,87 24,51 0,16 0,24 0,51 0,92 1,36 2,18 1,55 4,41 5,28 4,76

14 0 0 1,68 5,89 6,22 7,13 8,66 10,05 0,17 0,24 0,42 0,73 1,00 2,64 1,22 2,90 4,13 3,18

15 0 0 0 8,97 9,53 11,26 13,97 16,71 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,35 1,38 3,60 4,64 3,94

16 0 0 0 8,94 9,51 11,23 13,94 16,66 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,45 1,32 3,51 4,55 3,92

17 0 0 0 8,96 9,52 11,25 13,95 16,69 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,4 1,37 3,55 4,60 3,93

Exp. Experimentos; x1: proporção da fase móvel; x2: vazão da fase móvel; x3: temperatura; M1, G2, G1, B2, B1.: aflatoxinas. (Anexo 3).

66

Figura 1. Curvas de contorno para Y1 para AFLAB2 (A), AFLA B1 (B) Y2 para AFLAB2

(C), AFLA B1 (D) e Y3 AFLAG2 (E), AFLA G1 (F) e AFLAM1 (G,H) para as variávies

significativas.

67

Para o tempo de retenção (Y1’), em todos os casos, o comportamento foi

semelhante entre as aflatoxinas estudadas, onde o melhor experimento ocorreu na

maior vazão da fase móvel e maior temperatura da coluna com tempos de retenção de

11,6; 12,6; 15,0; 18,6 e 22,4 min. para AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1,

respectivamente. Para a capacidade de separação (Y2’) (Figura 3 A, B) observa-se

que as melhores condições foram a maior vazão e temperatura da coluna resultando

em valores de 0,18; 0,28; 0,52; 0,88 e 1,27 para as AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1,

AFLAB2 e AFLAB1, respectivamente. No entanto, a diminuição da temperatura da

coluna não promoveu grandes alterações nos valores da capacidade de separação

(Tabela 4). Para a resolução (Y3’) (Figura 3 C, D, E) observa-se que os melhores

experimentos ocorreram na maior temperatura e maior vazão para as AFLAG2 e

AFLAG1, sendo que apenas para AFLAM1 a menor vazão promoveu uma melhora na

resolução. Assim, para a resolução os valores alcançados foram de 2,34; 1,71; 3,67;

4,52 e 4,08 para AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1 respectivamente. A

separação cromatográfica alcançada para a condição estabelecida de detecção e

separação da cinco aflatoxinas no CLAE-FL (Figura 4) foi constituída de proporção de

fase móvel de 60:8:32 (água ultra pura acidificada:acetonitrila: metanol), vazão da fase

móvel de 0,6 mL.min-1, temperatura da coluna de 45ºC e tempo total de corrida de

25 min.

3.2 Validação da técnica cromatográfica

Os parâmetros de validação estabelecidos foram de limites de detecção e

quantificação de 0,75 e 2,0 ng.mL-1 para as AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,03 e

0,1 ng.mL-1 para AFLAG2 e AFLAB2, estando estes de acordo com o recomendado

pelos órgãos de legislação e fiscalização. As linearidades ficaram na faixa de 2,0-

100 ng.mL-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,1 - 2,0 ng.mL-1 para AFLAG2 e

AFLAB2. O modelo de regressão linear foi adequado para a determinação, pois os

coeficientes de correlação (R2) foram maiores que 0,90, e os coeficientes de variação

abaixo de 20%, conforme recomendação do INMETRO, ANVISA e IUPAC. A técnica

mostrou-se seletiva, pois nenhum interferente da amostra eluiu nos mesmos tempos

de retenção das aflatoxinas estudadas. As curvas analíticas (y=ax+b) tiveram valores

de 5,33 106 + 2187,57; 3,92 108 - 20977,1; 6,01 106 + 7027,42; 4,14 108 +

15828,8 e 1,16 107 + 23445,2 para AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1,

respectivamente.

68

Tabela 4. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de capacidade e resolução das aflatoxinas, no planejamento DCC.

Exp. x4 x5 (Y1’) Tempo de retenção (Y2’) Fator de capacidade (Y3’) Resolução

M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1

1 1 1 11,6 12,5 15,0 18,5 22,4 0,18 0,28 0,52 0,88 1,27 2,34 1,71 3,67 4,52 4,08

2 -1 1 9,94 10,7 12,5 15,2 18,0 0,18 0,27 0,48 0,80 0,89 2,52 1,49 3,08 3,96 1,26

3 1 -1 7,86 8,56 10,1 12,4 15,0 0,18 0,27 0,51 0,87 1,25 2,21 1,64 3,60 4,51 4,09

4 -1 -1 6,61 7,10 8,33 10,1 11,9 0,18 0,27 0,47 0,80 1,12 2,42 1,45 3,06 4,04 3,49

5 0 0 8,62 9,31 10,91 13,5 16,0 0,18 0,27 0,52 0,85 1,18 2,36 1,56 3,39 4,26 3,78

6 0 0 8,65 9,31 10,90 13,3 16,1 0,18 0,27 0,50 0,82 1,17 2,39 1,58 3,33 4,28 3,77

7 0 0 8,61 9,33 10,93 13,5 16,3 0,18 0,27 0,55 0,84 1,19 2,37 1,55 3,35 4,23 3,76

Exp. Experimentos. x4.: vazão da fase móvel; x5.; temperatura da coluna.; M1, G2, G1, B2, B1.: aflatoxinas. (Anexo 5).

Tabela 5. Equações que descrevem as repostasm previstas pelo modelo em função das variáveis independentes.

Aflatoxinas Equações dos modelos ajustados

Tempo de retenção (Y1’) Capacidade de separação (Y2’) Resolução (Y3’)

AFLAM1 -

AFLAG2

AFLAG1

AFLAB2

AFLAB1 -

x4: vazão da fase móvel; x5: temperatura da coluna.; AFLA.; aflatoxina.; (-) não apresentaram valores significativos.

69

Figura 2. Curvas de contorno para Y1’ em função da vazão e temperatura.

Figura 3. Curvas de contorno para Y2’ para as AFLAG1 (A), AFLAB2 (B) e Y3’ para as AFLAM1 (C), AFLA G2 (D) e AFLAG1 (E) em função da vazão e temperatura.

70

Figura 4. Separação cromatográfica das aflatoxinas M1, G2, G1, B2 E B1 em CLAE-FL.

3.3 Validação do método de extração e purificação

Os valores de recuperação e repetibilidade de cada procedimento,

quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de

fluorescência (Tabela 6) foram satisfatórios, sendo o método preconizado por Soares e

Rodrigues Amaya (1989), o que teve melhores resultados de recuperação para todas

as aflatoxinas estudadas, mesmo com a redução da massa inicial da amostra. As

recuperações médias foram de 66,0; 92,3; 74,3; 88,4 e 70,7% para AFLAM1, AFLAG2,

AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1, respectivamente. Os limites de detecção e quantificação

do método de 0,3 e 0,8 µg.kg-1para as AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,012 e

0,04 µg kg-1para AFLAG2 e AFLAB2, estando estes de acordo com o recomendado

pelos órgãos de legislação e fiscalização.

O método de Soares e Rodrigues Amaya (1989) e CLAE-FL, após ser

validado, foram aplicados para determinação dos residuais de aflatoxinas em estudos

de biodegradação utilizando os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma

ressei.

71

Tabela 6. Recuperação para as cinco aflatoxinas estudadas nos métodos de extração.

Aflatoxinas Procedimento 1 Procedimento 2 Procedimento 3 Procedimento 4 Procedimenot 5

Fortif

(µg kg-1)

Rec

(%)

CV

(%)

Fortif

(µg kg-1)

Rec

(%)

CV

(%)

Fortif

(µg kg-1)

Rec

(%)

CV

(%)

Fortif

(µg kg-1)

Rec

(%)

CV

(%)

Fortif

(µg kg-1)

Rec

(%)

CV

(%)

AFLAM1 12 66,2 3,4 1 10,9 2,3 1 48,9 4,2 1 10,2 5,9 1 10,0 2,7

20 62,7 4,1 3 11,3 4,1 3 51,1 3,7 3 8,8 3,1 3 9,9 5,1

40 69,1 1,2 5 9,8 6,0 5 43,2 4,5 5 9,1 4,2 5 10,3 2,9

AFLAG2 2 90,2 1,8 0,05 28,3 3,4 0,05 60,1 2,1 0,05 59,8 1,2 0,05 66,0 8,1

4 92,7 1,3 0,1 23,4 1,6 0,1 57,2 3,1 0,1 60,1 6,3 0,1 59,1 7,8

8 94,1 1,6 0,2 24,6 2,7 0,2 61,3 4,0 0,2 66,0 3,3 0,2 62,3 2,1

AFLAG1 12 77,1 2,6 1 15,0 7,1 1 40,2 2,4 1 27,9 5,7 1 18,7 2,5

20 76,0 3,8 3 19,2 2,6 3 46,2 6,1 3 30,9 2,8 3 17,9 3,8

40 69,9 1,2 5 18,1 4,9 5 41,1 3,9 5 26,4 2,8 5 22,0 2,3

AFLAB2 2 88,9 1,1 0,05 34,6 5,6 0,05 63,3 6,1 0,05 77,0 4,4 0,05 59,2 7,1

4 89,1 2,0 0,1 34,0 9,5 0,1 67,1 6,9 0,1 69,9 4,9 0,1 63,1 7,3

8 87,3 1,1 0,2 36,2 3,9 0,2 68,0 2,5 0,2 71,1 2,1 0,2 60,6 2.8

AFLAB1 12 68,9 4,2 1 18,6 5,8 1 50,5 5,7 1 47,8 2,1 1 19,9 3,9

20 72,4 2,6 3 21,9 3,9 3 50,1 4,9 3 48,8 1,6 3 23,4 6,1

40 70,9 3,7 5 17,0 4,9 5 48,8 3,1 5 50,3 5,0 5 36,1 4,3

Procedimento 1.: Soares e Rodriguez-Amaya; Procedimento 2.: QuEChERS Anastassiades et al., 2003; Procedimento 3: QuEChERS metanol Anastassiades; Procedimento 4:

QuEChERS modificado Hackbart et al., 2012: Procedimento 5: QuEChERS metanol Hackbart.

72

4. CONCLUSÃO

O primeiro procedimento DCCR indicou a proporção da fase móvel ideal

de 60:8:32 (v/v/v) constituida de água ultra pura acidificada:acetonitrila:metanol, e o

segundo procedimento DCC indicou que a vazão da fase móvel e temperatura da

coluna ideais de 0,6 mL.min-1 e 45ºC. O método preconizado por Soares e Rodriguez-

Amaya, modificado para minimização da utilização de amostra e solvente extrator, foi

o que apresentou melhores recuperações médias das cinco aflatoxinas estudadas.

Esta metodologia proposta (técnica de detecção, quantificação e método de extração)

representa uma análise útil a ser usada como ferramenta na determinação simultanea

de aflatoxinas em farelo de arroz uma matriz complexa.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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76

Artigo 2

Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei

77

Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei

Resumo

Este trabalho avaliou a capacidade dos fungos Rhizopus oryzae e

Trichoderma reesei para diminuírem os níveis de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1 tendo

como variáveis o número de esporos inicial no inóculo e o tempo de cultivo. Para

tanto, o cultivo dos micro-organismos foi realizado previamente em meio Agar Batata

Dextrose 4% (ABD) contaminado e as micotoxinas residuais foram determinadas a

cada 24 h empregando CLAE-FL. Foram necessários 4 x 106 esporos.g-1 e 96 h de

cultivo para as aflatoxinas B1 e G1 e 120 h para as aflatoxinas B2, G2 e M1, serem seus

níveis reduzidos em aproximadamente 100% pelo Rhizopus oryzae. Com o

Trichoderma reesei as aflatoxinas B1, B2 e M1 atingiram estes níveis em 96 h e a

aflatoxina G1 em 120 h. A maior taxa de degradação ocorreu após 96 h no meio de

cultivo Rhizopus oryzae.

Palavras-chave: Biodegradação, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei, aflatoxinas.

78

Biodegradation of aflatoxins by Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei

Abstract

This study evaluated the ability of the fungi Rhizopus oryzae and

Trichoderma reesei to reduce the levels of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and M1; the

variables were the initial number of spores in the inoculum and the culturing time.

Microorganism culturing was previously conducted in contaminated Potato Dextrose

Agar 4% (PDA) medium and the residual mycotoxins were determined every 24 hours

by HPLC-FL. Aflatoxins B1 and G1 needed 4 x 106 spores g-1 and a 96 hour culturing

time whereas aflatoxins B2, G2 and M1 needed 120 hours to have their levels reduced

by approximately 100% by Rhizopus oryzae. With Trichoderma reesei, aflatoxins B1, B2

and M1 reached these levels in 96 hours and aflatoxin G1, in 120 hours. The highest

rate of degradation occurred after 96 hours in the Rhizopus oryzae culture medium.

Keywords: Biodegradation, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei, aflatoxins.

79

1. INTRODUÇÃO

A contaminação de alimentos por espécies fúngicas degradadoras ou

toxigênicas é determinada por uma série de variáveis bióticas e abióticas, o que torna

difícil a obtenção de matérias primas onde estes micro-organismos não estejam

presentes (BETINA, 1989; CAST, 2003). O problema se agrava no caso de infecção

por espécies toxigênicas, cuja produção de micotoxinas pode ocorrer aleatoriamente

(ETZEL, 2002). Fato que norteia a busca por estratégias que propiciem a redução dos

níveis de compostos tóxicos produzidos por estas espécies (GARDA-BUFFON et. al.,

2005).

As condições de processo e preparo de produtos alimentícios eliminam

formas viáveis dos micro-organismos, mas não das micotoxinas por eles produzidas,

que em geral, possuem estruturas estáveis, inclusive em condições extremas de pH e

temperatura (TANIWAKI E SILVA 2001; GARDA-BUFFON et. al., 2005). Para evitar o

dano toxicológico o que se busca é alterar na estrutura das micotoxinas o grupamento

responsável pelo efeito biológico, utilizando mecanismos físicos, químicos ou

biológicos de descontaminação (MISHRA e DAS, 2003; CANCIAMANI et.al., 2005;

SAALIA e PHILLIPS, 2010).

As aflatoxinas constituem uma família de contaminantes amplamente

distribuídas em diferentes alimentos, produzidas por espécies toxigênicas de

Aspegillus. Entre elas, destaca-se a aflatoxina B1, classificada pela IARC (1993) como

cancerígena que, simultaneamente, pode, com outras aflatoxinas, ter seu efeito

potencializado (CARBONE et. al., 2007, DE PEÑA, 2007). Aflatoxicose é a

denominação do conjunto de sintomas decorrentes de ingestão de doses elevadas de

aflatoxinas desencadeantes de efeito agudo, que tem sido a causa da morte de

animais de criação em diferentes regiões do mundo (YU et. al., 2009; FIRMIN et. al.

2010; KHLANGWISET e WU, 2010). A exposição crônica, a baixas doses de toxina

por longos períodos, característica da dieta humana, pode levar ao desenvolvimento

de cancro do fígado, atraso no crescimento entre outras patologias (VAN EGMOND et.

al., 2003; WAGACHA e MUTHOMI, 2008). Em função disto muitos países

estabelecerem limites para os níveis destas micotoxinas em seus alimentos visando

reduzir riscos de danos à saúde da população (FAO, 2010).

A redução dos teores de aflatoxinas em alimentos utilizando

procedimentos físicos e químicos não tem se mostrado eficaz ou economicamente

80

viável (MISHRA e DAS, 2003), pois, afetam as características nutricionais, funcionais,

tecnológicas e sensoriais das matérias primas e alimentos. Contudo, a

descontaminação biológica empregando bactérias, leveduras e fungos filamentosos

parece ser uma alternativa promissora para degradar aflatoxinas e estabelecer

condições que podem melhorar as características funcionais dos alimentos (VARGA

et. al., 2000; OLIVEIRA et. al., 2011; SILVEIRA et. al., 2009). A ação de fungos para

degradar as aflatoxinas tem se mostrado mais eficiente que os demais micro-

organismos (CANCIAMANI et.al., 2005; KHLANGWISETP & WU et. al., 2010).

Os fungos dos gêneros Rhizopus e Trichoderma, classificados como

GRAS (Generally Recognized as Safe) são utilizados para modificação de substratos

para produção de insumos para a indústria de alimentos (Food and Drug

Administration FDA-EUA, 2003). Aliada a esta capacidade, estes fungos, podem

melhorar a disponibilidade de nutrientes e compostos funcionais em coprodutos e

resíduos da agroindústria para aplicação na alimentação humana ou de animais de

criação (GARDA-BUFFON et. al. 2010; OLIVEIRA et. al., 2011; SCHIMDT & BADIALE-

FURLONG, 2012). Para isto, primeiramente é necessário conhecer a taxa de

degradação promovida pelo micro-organismo em função da quantidade inicial de

esporos que permita alterar o substrato sem torná-lo inaceitável para uso, num menor

intervalo possível e, a sua capacidade de multiplicar-se em um meio contaminado

(SAALIA e PHILLIPS, 2010).

Neste trabalho foi avaliada a capacidade dos fungos Rhizopus oryzae

(CCT7560) e Trichoderma reesei (QM9414) em diminuírem os níveis de aflatoxinas

AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1, em meio Batata Dextrose Agar (BDA)

4%, tendo como variáveis o número de esporos do inoculo e tempo de fermentação,

visando aplicar estas condições para estabelecimento de processo fermentativo para

degradar as aflatoxinas em resíduos e coprodutos agroindustriais a serem

empregados em formulações alimentícias.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes

Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2

e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.

81

O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau

cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e

separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).

O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),

hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck

(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de

amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de

sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra

diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura

utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração

Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω.cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada

com ácido acético glacial (99:1 v/v).

2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho

Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila

(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,

AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração

de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo

a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µg.mL-1 para as aflatoxinas

AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg mL-1 para AFLAM1. As concentrações

foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)

empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e

18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,

respectivamente (AOAC, 2000).

2.3 Preparo do meio de cultivo

O meio de cultivo foi preparado utilizando 39g de Agar Batata Dextrose

(ABD – Himedia), correspondente a 15g de Agar, 4g de infusão de batata desidratada

e 20g de dextrose para o volume de 1 litro de água destilada. O meio de cultivo foi

submetido ao processo de esterilização por autoclavagem durante 30 min. Em

seguida, foi vertido em placas de Petri em condições assépticas.

82

2.4 Preparo do inóculo

As cepas dos micro-organismos Rhizopus oryzae (CCT7560) e

Trichoderma reesei (QM9414) foram adquiridas da coleção de culturas da Fundação

André Tosello e mantidas a 4-8ºC em meio Ágar Batata Dextrose (ABD), em tubos de

ensaio, até o momento do uso. Os esporos foram propagados, para repicagem, em

emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%), empregando raspagem com alça de cromo-

níquel e novamente inoculada em meio ABD 4% em placas de Petri. As culturas foram

incubadas em câmaras de germinação (Tecnal) durante 7 dias a 30ºC até nova e

completa esporulação. Para retirada dos esporos foram adicionados 50 mL de uma

emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%) no cultivo raspando com alça de cromo-níquel e

enumerando em câmara de Neubauer. A concentração dos esporos foi estimada por

enumeração no quadrante C da câmara. A contagem de esporos foi realizada a partir

da equação 1.

C = (M × 1000 × dil)/0,004 equação 1.

onde: M é número médio de esporos contados no quadrante C da câmara de

Neubauer; 1000: fator de correção da câmara de Neubauer para mL; dil: 10, pois foi

colocado 1mL de solução de esporos em 9 mL de água; 0,004: fator de correção da

câmara de Neubauer para 1 mL.

2.5 Determinação das aflatoxinas

As aflatoxinas foram extraídas pelo método descrito por Soares e

Rodrigues Amaya (1989) adaptado para minimizar a quantidade de amostra e

solventes utilizados e, consistiu, no uso de 10 g de amostra de farelo de arroz,

homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio 4% (9:1 v/v)

por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do filtrado e

adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10 cm3 de terra diatomácea. A mistura

foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida filtrada

novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e

adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com

10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e

os frascos secos armazenados a -18ºC.

83

2.6 Instrumentação

Para separação e detecção das aflatoxinas foi utilizado cromatógrafo

líquido Shimadzu Prominende UFLC constituído por um sistema de bombas (LC-AT),

desgaseificador da fase móvel (DGU), controlador (CBM-20A), injetor manual com alça

de injeção de 20 μL (7725i), detecção por fluorescência (FL-10AXL) programada para

comprimento de onda do espectro de excitação de fluorescência máxima ex = 360 nm

e comprimento de onda do espectro de emissão de fluorescência máxima em =

435 nm. A aquisição de dados foi realizada pelo programa LC Solution. Foi empregada

coluna cromatográfica Nucleosil®, C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm, Bellefonte, PA, USA) e

como fase móvel uma mistura de água ultra pura acidificada com ácido acético

(99:1 v/v):acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) eluida no modo isocrático, vazão de

0,6 mL/min, temperatura da coluna de 45ºC, alça de injeção com loop de 20 µL e

tempo de corrida de 25 min.

Os indicativos de linearidade, precisão, limites de detecção e

quantificação, parâmetros sugeridos pelo Instituto Nacional de Metrologia, Nor-

malização, Qualidade Industrial (INMETRO, 2003) Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA, 2011) e de acordo com o protocolo da União Internaciona de

Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemistry -

IUPAC/AOAC/ISO, HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000) foram avaliados previamente.

2.7 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo

Para isto os cultivos foram conduzidos empregando três níveis de esporos

(OLIVEIRA et. al., 2007), sendo o experimento 1 o que continha 4 x 102 esporos.g-1, o

experimento 2, 4 x 104 esporos.g-1 e o experimento 3, 4 x 106 esporos g-1, em placas

contendo o meio ABD 4% (Agar Batata Dextrose - Himedia) previamente fortificadas

com 100 µg.kg-1 das aflatoxinas AFLAB1,AFLAG1, AFLAM1 e 10 µg.kg-1 de AFLAB2,

AFLAG2. A biodegradação de cada aflatoxina foi avaliada individualmente e em

mistura, sendo os experimentos, conduzidos em triplicata para cada condição de

estudo.

Os cultivos foram realizados em câmaras de germinação (Tecnal) a

temperatura de 30°C durante 6 dias (0, 24, 48, 72, 96 e 120 h). Após o término dos

cultivos, as placas contendo as cepas dos micro-organismos foram armazenadas a -

18ºC, para interrupção do processo metabólico. O experimento foi realizado em

triplicata para cada micro-organismo. As aflatoxinas residuais foram extraídas pelo

84

método descrito, dos resultados foram calculados os percentuais de descontaminação

(D) de cada micotoxina em cada micro-organismo de acordo com a equação 2.

D = [100 (C – Co)]/Co equação 2.

onde: Co é o valor da concentração inicial; C é o valor da concentração residual das

aflatoxinas.

Foram calculadas as taxas de degradação (TD) dos três experimentos

conforme a equação 3, e as constantes de velocidades de degradação (K), equação 4,

das aflatoxinas em relação ao tempo de exposição destas aos micro-organismos.

TD = C/Co equação 3.

onde Co é a concentração inicial; C é a concentração residual das aflatoxinas.

K = TD/t equação 4.

onde TD é a taxa de degradação; e t é o tempo de cultivo.

Os resultados foram avaliados estatisticamente a partir do teste de Tukey

empregando o programa Statistica 7.0, utilizando um intervalo de confiança de 95 %

(p < 0,05) para as variáveis, níveis de esporos e tempo de cultivo.

2.8 Determinações de glicosamina e ergosterol

A solução padrão de glicosamina continha 0,1 mg de glicosamina.mL-1 de

água, que foi diluída para obter as concentrações entre 3,0 e 20,0 µg de

glicosamina.mL-1. As absorvâncias das soluções foram medidas a 530 nm em

espectrofotômetro, e a absortividade da glicosamina estimada pela declividade da

curva padrão (SOUZA et. al., 2012).

Em 0,2 g de biomassa seca foram adicionados 5 mL de ácido clorídrico 6M

seguido de autoclavagem a 121°C e 1,1 atm, durante 8 minutos. A mistura foi resfriada

e filtrada para balão volumétrico de 5 mL e o volume completado com água destilada

sendo 1 mL transferido para balão volumétrico de 25 mL e neutralizando com solução

de NaOH 3M, tendo fenolftaleína 0,5% como indicador. Foi realizada a titulação

reversa com KHSO4 1% (p/v), até que a coloração rosa desaparecesse seguida por

elevação do volume do balão com água destilada. Após a extração, 1 mL da solução

foi transferida para tubos de ensaio, aos quais foram adicionados 1 mL da solução de

acetilcetona em 50 mL de Na2CO3 0,5N, seguido por aquecimento em banho de água

fervente por 20 minutos. As amostras foram resfriadas e adicionados 6 mL de etanol e

1mL de reagente de Erlich (2,67g DAB - pdimetilaminobenzaldeído - dissolvido em

15 mL de etanol e 15 mL ácido clorídrico). Os tubos reatores foram incubados a 65°C

em estufa durante 10 minutos. A absorvância foi lida em espectrofotômetro a 530nm e

85

o teor de glicosamina estimado através da absortividade da curva padrão. A

recuperação do método foi determinada em níveis de fortificação que variaram de 1 a

3 mg de glicosamina/g micélio seco, estes níveis foram escolhidos conforme o limite

de detecção do composto nas condições do método (SOUZA et. al., 2012).

Para a determinação do ergosterol a solução padrão continha 0,3 mg de

ergosterol/mL de metanol (Sigma, Estados Unidos, pureza mínima de 90%) que foi

diluída para obter as concentrações entre 1,5 e 16,5 µg de ergosterol/mL de metanol.

As absorvâncias das soluções foram medidas a 283 nm em espectrofotômetro de feixe

duplo Varian 100, obtendo-se uma curva de calibração para estimativa da

concentração do analito (SOUZA et. al., 2012).

Foi empregado o método modificado de Gutarowska e Zakowska (2009)

para determinar o conteúdo de ergosterol na biomassa seca e homogeneizada. O

procedimento consistiu em homogeneizar 0,2 g biomassa fúngica com 10 mL de

metanol sob agitação orbital a 200 rpm por 30 minutos. A fração metanólica foi

separada e ao resíduo da biomassa fúngica foram adicionados mais 10 mL de metanol

seguindo-se mais 20 minutos de agitação. Os sobrenadantes metanólicos foram

homogeneizados e centrifugados a 3000 g a 20°C por 10 minutos. Ao sobrenadante

da mistura centrifugada foram adicionados 20 mL de KOH/metanol, aquecido sob

refluxo por 30 minutos e resfriado a 4ºC. A mistura refluxada foi submetida a quatro

partições com 20 mL de hexano. As frações hexânicas foram homogeneizadas e

evaporadas em rotaevaporador a 60ºC e 40 rpm . O resíduo foi dissolvido com 10 mL

de metanol e a transmitância determinada a 283 nm em espectrofotômetro. O

conteúdo de ergosterol foi estimado a partir de uma curva de calibração de ergosterol

e expresso em mg g-1 de biomassa seca (SOUZA et. al., 2012).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A técnica cromatográfica empregada para detecção das aflatoxinas

residuais nos meios de cultura apresentou características analíticas como limites de

detecção, quantificação de 0,8 e 1,2 µg.kg-1 e linearidade de 2 – 100 ng.mL-1 para as

aflatoxinas B1, G1, M1 e 0,04 e 1 µg.kg-1 e linearidade de 0,1 – 2,5 ng.mL-1 para as

aflatoxinas B2 e G2.

O método de extração Soares e Rodrigues Amaya (1989), foi adotado por

sua eficiência demonstrada na sua aplicação em rotina para determinação de

aflatoxinas (NUNES et al., 2003; DORS et. al., 2009; HEIDTMANN-BEMVENUTI et.

86

al., 2011). Os limites de detecção e quantificação das aflatoxinas na técnica

cromatográfica empregada e a tendência atual por métodos de extração que resultem

em resíduos mínimos motivaram a adaptação do procedimento para minimização dos

reagentes.

A adaptação mostrou que a minimização da quantidade de solventes,

recuperações médias de 71, 88, 74, 92 e 66% para as aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1,

respectivamente, e coeficientes de variação inferiores a 20%. Associada aos

indicativos de mérito da técnica cromatográfica e ao método analítico proposto para

determinação das aflatoxinas, estes mostraram que é possível atender aos critérios

estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2011) e do

Codex Alimentarius para a determinação de compostos traços em matrizes

complexas. Além disso, a sensibilidade deles é adequada para acompanhar as

variações na concentração das aflatoxinas em decorrência da ação dos micro-

organismos em estudo neste trabalho.

3.1 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo

O nível de fortificação inicial dos meios com as aflatoxinas observou os

níveis e freqüências usuais na literatura (NUNES et. al., 2003; CANCIAMANI et.al.,

2005; DORS et. al., 2009), ou seja, uma proporção 10:1 entre as aflatoxinas B1, G1, M1

e aflatoxinas B2 e G2. Para definição do número de esporos inicial foi considerado o

que vêm sendo utilizado para obtenção de insumos e descontaminação empregando

estes micro-organismos em fermentação sólida e submersa (GARDA-BUFFON et. al.,

2005; OLIVEIRA et. al., 2011; SCHIMDT & BADIALE-FURLONG, 2012).

Os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtêm

energia para seu metabolismo degradando compostos orgânicos disponíveis no meio.

Para isto, fazem uso de enzimas exo e endocelulares, para transformar estruturas em

substrato de forma a torná-los adequados para obtenção de energia ou síntese de

suas próprias biomoléculas (KARMAKAR e RAY, 2011; OLIVEIRA et. al., 2011). Este

aumento de atividade metabólica pode ser acompanhado pela produção de

oxirredutases sendo, as peroxidases, as que atuam sobre as moléculas doadoras de

elétrons que, durante os processos de obtenção de energia ou para degradação de

compostos, afetam a integridade celular com os radicais livres ou outros xenobióticos

(TOMASINI et. al., 2008; AGUIAR et. al., 2010; OLIVEIRA et.al., 2011). Nesta

categoria de moléculas as aflatoxinas são passíveis de serem utilizadas como

87

substrato para peroxidases que as oxidam para outras formas mais polares e

possivelmente menos tóxicas (MISHRA, 2003; GUO ta. al., 2008).

A abertura do anel da difurocumarina da aflatoxina B1, seguido por

hidrólise do grupo vinílico do anel difurano é uma via que vem sendo demonstrada em

estudos envolvendo diferentes micro-organismos como agentes degradadores,

destacando-se os fungos Pleurotus ostreatus (MOTOMURA et. al., 2003; ALBERTS et.

al., 2010), Aspergillus oryzae e Rhizopus oryzae (CACCIAMANI et. al., 2007) e as

bactérias Micobacterium smegmatis (TAYLOR et. al., 2010), Peniophora (ALBERTS et.

al., 2010). O efeito desta alteração estrutural se reflete na diminuição dos níveis das

aflatoxinas detectadas, pois esta alteração afeta diretamente a fluorescência dos

compostos analisados por esta propriedade. Esta via pode ter sido a utilizada pelos

fungos empregados neste trabalho, cujos efeitos nos níveis residuais (µg/kg) das

aflatoxinas determinadas no meio ao longo de 120 h de cultivo, com as respectivas

significâncias estão nas Tabelas 1.

Em situação ideal se pretende atingir degradação total do contaminante e

isto foi possível para todas as aflatoxinas, em 96 h de cultivo, com exceção da

aflatoxina G2. Para avaliar a significância das diferenças ocasionadas pelo efeito do

número de esporos inicial e intervalos de cultivo microbiano foram estimados os

percentuais de descontaminação (D), de acordo com a equação 2, de cada toxina

(Tabela 2).

Foram considerados 100% de degradação quando as aflatoxinas não eram

detectadas e acima de 85% de degradação quando sua concentração ficava abaixo do

limite de quantificação, perdendo a confiabilidade da afirmação da ausência.

O mínimo inicial de esporos não afetou de forma significativa os

percentuais de descontaminação nas primeiras 24 h de cultivo. Depois, em função do

próprio desenvolvimento microbiano, as diferenças começaram a ser significativas.

Para a aflatoxina B1 ser degradada no percentual máximo pelo Rhizopus

oryzae foram necessárias em 96 h. Enquanto que o micro-organismo Trichoderma

reesei foram necessárias 120 h de cultivo para atingir o mesmo nível de diminuição a

partir de um nível inicial de esporos igual ou superior a 4 x 104 esporos/g. Com o

mesmo perfil para a degradação da aflatoxina G1 foram necessárias 96 h de cultivo

para o Rhizopus oryzae e 120 h para o Trichoderma reesei. No entanto, o Trichoderma

reesei pareceu mais eficiente para degradar a aflatoxina M1 que o Rhizopus oryzae,

mostrado pelos elevados percentuais de descontaminação após 96 h de cultivo.

Tabela 1. Níveis das aflatoxinas (µg/kg) e coeficiente de variação (%), no cultivo.

88

Exp./Cult. Tempo (h)

0 24 48 72 96 120

B1 exp 1 R 101,6 2,1 92,8 1,5 92,8 3,2 40,8 1,5 Nd Nd

B1 exp 2 R. 101,4 1,8 95,1 2,0 72,7 3,6 46,2 3,6 Nd Nd

B1 exp 3 R. 96,0 2,3 89,9 2,5 79,2 1,5 25,6 1,5 Nd Nd

B1 exp 1 T. 91,4 1,7 71,2 1,1 70,5 1,0 30,9 3,2 Nd Nd

B1 exp 2 T. 101,6 1,7 80,8 3,5 72,8 4,0 35,2 0 28,8 1 Nd

B1 exp 3 T. 96,5 2,1 85,1 4,3 66,1 0 23,5 0,5 Nd Nd

B2 exp 1 R. 7,9 1,7 4,5 3,0 4,2 2,3 <LOQ <LOQ Nd

B2 exp 2 R. 8,3 1,3 4,4 1,1 <LOQ <LOQ Nd Nd

B2 exp 3 R. 10,1 0,3 4,0 3,6 <LOQ <LOQ Nd Nd

B2 exp 1 T. 7,9 1,1 7,8 1,5 7,6 5,0 7,8 1,0 6,9 2,0 2,2 6,0

B2 exp 2 T. 7,4 2,3 3,9 2,3 3,7 4,0 3,8 4,0 Nd Nd

B2 exp 3 T. 7,0 2,7 5,1 3,6 <LOQ <LOQ Nd Nd

G1 exp 1 R. 99,2 0,8 76,8 4,5 66,4 6,0 42,4 3,0 Nd Nd

G1 exp 2 R. 79,3 0,3 74,1 1,5 56,1 2,5 38,3 4,0 Nd Nd

G1 exp 3 R. 94,2 0,8 82,6 4,1 41,0 2,0 24,3 3,6 Nd Nd

G1 exp 1 T. 104,1 0,2 52,0 7,0 38,5 2,5 34,3 3,6 33,5 5,3 Nd

G1 exp 2 T. 99,2 0,3 58,4 1,5 59,2 1,5 30,4 3,5 29,6 6,0 Nd

G1 exp 3 T. 93,7 0,3 21,4 2,6 49,0 2,6 45,3 6,0 20,3 1,0 Nd

G2 exp 1 R. 6,5 1,3 4,0 1,5 2,7 0,6 2,0 3,5 0,9 4,3 Nd

G2 exp 2 R. 7,2 0,8 5,4 4,0 2,4 1,0 2,1 4,2 1,2 2,6 Nd

G2 exp 3 R. 7,1 0,7 2,1 4,0 <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ

G2 exp 1 T. 7,2 0,9 6,8 2,6 5,9 1,7 4,7 3,0 4,7 2,6 2,5 7,0

G2 exp 2 T. 6,8 1,4 5,6 2,5 5,0 3,0 3,2 4,2 2,2 1,0 1,5 2,6

G2 exp 3 T. 7,2 1,1 6,7 4,6 4,0 4,1 3,6 2,0 2,3 6,0 1,4 4,3

M1 exp 1 R. 68,6 2,1 68,3 1,5 34,3 3,2 30,1 4,0 18,2 2,0 <LOQ

M1 exp 2 R. 89,7 1,9 69,3 2,5 36,6 2,0 31,2 3,0 28,5 1,0 21,7

M1 exp 3 R. 89,7 1,8 85,7 4,0 36,5 0,5 29,8 3,4 27,1 3,6 <LOQ

M1 exp 1 T. 68,6 1,9 60,2 5,6 52,4 3,6 Nd Nd Nd

M1 exp 2 T. 95,0 1,7 80,6 2,0 76,2 3,7 25,1 0,6 Nd Nd

M1 exp 3 T. 84,4 2,3 79,9 6,0 68,4 2,0 27,4 1,5 23,6 2,08 Nd

Exp.: experimento; Cult.: Cultivo; R.: Rhizopus oryzae; T.: Trichoderma reesei.; exp 1.: experimento 1; exp 2.: experimento 2.; exp 3.: experimento 3.; Nd.: não detectado.; LOQ: limite de quantificação.

Para melhor visualizar a eficiência dos micro-organismos para degradação

das aflatoxinas foram considerados as taxas de degradação (TD) e os intervalos de

cultivo para ambos os micro-organismos nos três experimentos (Figura 1).

A velocidade de degradação (k dia-1) para ambos os micro-organismos

(Tabela 3) foi estimada no experimento 3 (4 x 106 esporos g-1), o que apresentou os

melhores resultados de descontaminação.

89

Tabela 2. Percentuais de descontaminação (D) nos níveis iniciais das aflatoxinas nos

meios de cultivo.

Exp./Cul. Tempo (h)

24 48 72 96 120

B1 exp 1 R 11Aa 11Aa 76Ab 100Ac 100Ac

B1 exp 2 R. 8Aa 36Bb 69Bc 100Ad 100Ad

B1 exp 3 R. 8Aa 22Cb 93Cc 100Ad 100Ad

B1 exp 1 T. 28Ba 29Da 84Db 100Ac 100Ac

B1 exp 2 T. 26Ba 36Bb 83Dc 91Bd 100Ae

B1 exp 3 T. 15Aa 40Eb 96Cc 100Ad 100Ad

B2 exp 1 R. 47Aa 51Ab 91Ac 95AC 100Ac

B2 exp 2 R. 51Aa 87Bb 95Ac 100Bc 100Ac

B2 exp 3 R. 66Ba 90Bb 98ABc 100Bc 100Ac

B2 exp 1 T. 1Ca 4Ca 1Ca 13Cb 79Bc

B2 exp 2 T. 51Aa 54Aa 52Da 100Bb 100Ab

B2 exp 3 T. 29Da 85Bb 96ABc 100Bc 100Ac

G1 exp 1 R. 28Aa 41Ab 71Ac 100Ad 100Ad

G1 exp 2 R. 8Ba 36Ab 64Bc 96Ad 100Ad

G1 exp 3 R. 15Ba 70Bb 92Cc 100Ad 100Ad

G1 exp 1 T. 62Ca 78Bb 83Dc 84Bc 100Ad

G1 exp 2 T. 51Da 50Ca 86CDb 87Bb 100Ac

G1 exp 3 T. 96CDa 59Db 64Bb 97Aa 100Aa

G2 exp 1 R. 42Aa 63Ab 74Ac 91Ad 100Ae

G2 exp 2 R. 26Ba 71Bb 75Ab 88Ac 100Ad

G2 exp 3 R. 74Ca 89Cb 92Bb 93Ab 98Ac

G2 exp 1 T. 5Da 19Db 37Cc 36Bc 69Bd

G2 exp 2 T. 18Ba 27Eb 55Dc 71Cd 82Ce

G2 exp 3 T. 6Da 47Fb 52Db 72Cc 85Cd

M1 exp 1 R. 1Aa 66Ab 74Ac 97Ad 98Ad

M1 exp 2 R. 30Ba 78Bb 86Bc 90Bc 100Ad

M1 exp 3 R. 6ACa 78Bb 88BCc 92Bcd 99Ae

M1 exp 1 T. 16CDa 31Cb 100Cc 100Ac 100Ac

M1 exp 2 T. 20BDa 26Cb 97Cc 100Ac 100Ac

M1 exp 3 T. 7ACa 25Cb 89BCc 95ABc 100Ac

Letras maiúsculas diferem entre si, para cada experimento e cada micotoxina, nas colunas e letras minúsculas diferem entre si, para cada intervalo de tempo, em linha (p<0,05) pelo teste de Tukey; Exp.: experimento; Cult.: Cultivo; R.: Rhizopus oryzae; T.: Trichoderma reesei.; exp 1.: experimento 1; exp 2.: experimento 2.; exp 3.: experimento 3.; Nd.: não detectado. LOQ: limite de quantificação.

Foram observadas as diferença significativas nas velocidades de

degradação das aflatoxinas, sendo novamente o micro-organismo Rhizopus oryzae o

mais eficiente, no terceiro dia (72 h de cultivo), confirmando o que foi indicado pelas

taxas de degradação estimadas.

90

A partir destes resultados o Rhizopus oryzae, que demonstrou ser o mais

eficiente para degradar as aflatoxinas isoladamente, foi empregado com o maior

número de esporos (4 x 106 esporos g-1) para verificar sua capacidade de degradação

simultânea das cinco aflatoxinas no meio durante o cultivo. O efeito foi estimado após

a determinação dos níveis residuais (µg kg-1) da aflatoxinas estão ilustrados na

(Tabela 4).

Convém ressaltar que à medida que os teores de aflatoxina B1 diminuíam

os de afltatoxina M1 atingiam níveis superiores aos iniciais. Na Tabela 5, estão os

percentuais de descontaminação obtidos a cada 24 h de cultivo, na Figura 2, estão às

taxas de degradação das aflatoxinas em mistura. O intervalo total de cultivo neste

experimento foi mantido por considerar que o micro-organismo encontraria maior

dificuldade para degradar as aflatoxinas presentes em mistura que perfaziam um total

de 320 µg kg_1.

Ao atuar em um meio contaminado simultaneamente com as cinco

aflatoxinas o Rhizopus oryzae não mostrou a mesma eficiência demonstrada com

cada uma isoladamente. Fato demonstrado pelo intervalo necessário (120 horas) para

atingir percentuais de descontaminação que variaram de 14% (aflatoxina M1) e 98%

(aflatoxina B1) (Tabela 5). Com relação à aflatoxina M1 os percentuais de

descontaminação estimados foram negativos ao longo do cultivo, como já mencionado

este comportamento mostra que o micro-organismo ao degradar a aflatoxina B1

emprega uma via metabólica que oxida esta para aflatoxina M1.

As taxas de degradação, Figura 2, ilustram que para o micro-organismo

Rhizopus oryzae, a maior taxa ocorreu para a aflatoxina B1, enquanto que a menor foi

para a aflatoxina M1. Nos tempos de cultivo é possível observar que em 48 e 96 h

existe uma variabilidade na taxa de degradação da aflatoxina M1, causando uma

diminuição da taxa de degradação decorrentes do aumento da concentração desta

mesma aflatoxina como mostra a Tabela 5. Ao mesmo tempo, ocorre uma diminuição

acentuada da aflatoxina B1, sendo esta aflatoxina a que possui a maior taxa de

degradação, sugerindo a já mencionada possibilidade da formação da aflatoxina M1

durante o processo de degradação da aflatoxina B1 pelo micro-organismo Rhizopus

oryzae, pela reação de hidroxilação da aflatoxina B1 tornando a toxina mais polar

(aflatoxina M1).

Cacciamani et. al. (2007) avaliaram a degradação de aflatoxina B1 e

ocratoxina A simultaneamente presentes em farelos de arroz desengordurados através

de fermentação sólida utilizando os micro organismos Aspergillus oryzae e Rhizopus

91

sp. O Aspergillus oryzae demonstrou maior capacidade de descontaminação da

aflatoxina B1 (80%) enquanto que o Rhizopus sp. demonstrou melhores resultados

para descontaminação da ocratoxina A (80%).

Figura 1. Taxas de degradação das aflatoxinas nos experimentos (1)

4 x 102 esporos g-1 (A, D), experimento (2) 4 x 104 esporos g-1 (B, E) e experimento (3)

4 x 106 esporos g-1 (C, F) para os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma

reesei, respectivamente.

92

Kusumaningtyas et. al. (2006) estudaram fungos como o Rhizopus

oligosporus R. arrhizus, R. stolonifer e A. arrhizus na sua capacidade de degradar a

aflatoxina B1. O Rhizopus oligosporus teve a melhor capacidade degradando a

micotoxina no quinto dia. Motomura et. al. (2003) avaliou dezenove fungos quanto à

capacidade de degradar aflatoxina B1. Uma enzima extracelular do cogumelo

comestível Pleurotus ostreatus mostrou atividade de degradação da aflatoxina B1, os

resultados das determinações de fluorescência sugerem que a enzima clivava o anel

lactona da aflatoxina.

Tabela 3. Constantes de degradação das aflatoxinas pelos micro-organismos no

experimento 3.

Exp./Cul. Tempo (Dias)

1º 2º 3º 4º 5º

B1 exp 3 R. 0,937Aa 0,413Aa 0,089Ab 0,053Ab 0,043Ab

B1 exp 3 T. 0,882Ba 0,343Bb 0,081Bc 0,053Ad 0,043Ad

B2 exp 3 R. 0,398Aa 0,046Ab 0,030Ac 0,023Ad 0,018Ad

B2 exp 3 T. 0,734Ba 0,046Ab 0,030Aa 0,023Ac 0,018Ac

G1 exp 3 R. 0,877Aa 0,218Ab 0,086Ab 0,048Ac 0,039Ac

G1 exp 3 T. 0,229Ba 0,262Bb 0,161Bc 0,054Ac 0,039Ac

G2 exp 3 R. 0,301Aa 0,033Ab 0,022Ac 0,016Ac 0,013Ac

G2 exp 3 T. 0,928Ba 0,279Bb 0,168Bc 0,081Bc 0,040Bc

M1 exp 3 R. 0,955Aa 0,204Ab 0,111Ac 0,076Ac 0,048Ac

M1 exp 3 T. 0,947Aa 0,405Bb 0,108Ac 0,070Ac 0,048Ac

Letras maiúsculas diferem entre si, para cada micotoxinas, nas colunas e letras minúsculas diferem entre si, para cada micro-organismo em linha (p<0,05) pelo teste de Tukey; R.: Rhizopus oryzae; T.: Trichoderma reesei.; B1: aflatoxina B1; B2: aflatoxina B2; G1: aflatoxina G1; G2: aflatoxina G2; M1: aflatoxina M1.

Figura 2. Taxas de degradação das aflatoxinas em mistura.

93

Tabela 4. Níveis residuais das aflatoxinas (µg kg-1) e coeficiente de variação (%), ao

longo do intervalo de cultivo.

Aflatoxinas Tempo (h)

0 24 48 72 96 120

B1 96,5 2,3 36,6 4,2 22,4 1,1 14,2 1,4 6,6 0,8 1,9 2,1

B2 10,1 3,7 6,8 1,4 3,3 0,9 3,2 0,3 2,6 1,0 2,6 0,7

G1 96,7 1,8 57,0 1,6 55,1 3,6 23,3 2,4 20,3 1,0 10,4 2,3

G2 8,6 2,1 8,4 1,3 8,2 0,6 5,1 1,2 5,1 1,1 4,1 1,3

M1 89,8 3,8 77,1 2,1 128,3 1,0 89,8 1,3 218,1 1,1 77,6 0,9

Tabela 5. Porcentagens de descontaminação nos níveis das aflatoxinas durante o

cultivo com Rhizopus oryzae.

Aflatoxinas Tempo (h)

24 48 72 96 120

B1 62Aa 77Ab 85Ac 93Ad 98Ad

B2 33Ba 67Bb 68Bb 74Bc 74Bc

G1 41Ca 43Ca 76Cb 79Cb 89Cc

G2 2Da 4Da 41Db 41Db 52Dc

M1 14Ea -43Eb 0Ec -143Ed 14Ea

Letras maiúsculas diferem entre si, para cada experimento e cada micotoxina, nas colunas e letras minúsculas diferem entre si, para cada hora em linha (p<0,05) pelo teste de Tukey; B1: aflatoxina B1; B2: aflatoxina B2; G1: aflatoxina G1; G2: aflatoxina G2; M1: aflatoxina M1.

3.2 Determinações de glicosamina e ergosterol

Os métodos analíticos para determinar ergosterol e glicosamina foram

padronizados anteriormente para atender os indicativos de eficiência adequados para

garantir a confiabilidade dos resultados estimados, visando empregá-los para

determinação quantitativa durante a multiplicação da biomassa fúngica em meio

contaminado com as aflatoxinas. Os resultados da variação no teor de glicosamina e

ergosterol estão ilustrados nas Figuras 3 para todas as aflatoxinas estudadas.

A Tabela 6 ilustra a variação ocorrida nos teores médios de glicosamina,

ergosterol e o percentual de descontaminação para ambos os micro-organismo

durante o cultivo no experimento 3.

94

Figura 3. Valores de glicosamina e ergosterol presentes na biomassa do Rhizopus

oryzae (A, B) e Trichoderma reesei (C, D).

Tabela 6. Valores de médios de ergosterol, glicosamina e níveis médios de redução

das aflatoxinas nos cultivos.

Aflatoxinas Ergosterol (µg g-1) Glicosamina (µg g-1) Níveis médios

residuais (µg kg-1)

R. oryzae T. reesei R. oryzae T. reesei R. oryzae T. reesei

B1 106 112 6861 4270 73 68

B2 91 127 7232 5189 7 6

G1 129 111 7622 4973 61 46

G2 189 113 8272 4715 5 4

M1 143 116 6660 5612 54 57

Em presença de aflatoxina G1, G2 e M1 os níveis médiosde ergosterol na

biomassa de R.oryzae foram maiores que em presença da aflatoxinas B1 e B2. O que

95

sugere que há um desvio na rota metabólica de lipídios (ergosterol) para compensar a

presença delas. No caso do T. reesei os teores médios de ergosterol variaram menos

entre as aflatoxinas.

4. CONCLUSÃO

A biodegradação das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1 utilizando micro-

organismos Generally Recognized as Safe (GRAS) Rhizopus oryzae e Trichoderma

reesei foram eficazes. No entanto o Rhizopus oryzae foi o micro-organismo que

apresentou as maiores taxas de degradação reduzindo os níveis iniciais de

contaminação com as aflatoxinas para valores não detectáveis em menor intervalo de

cultivo. Quando as cinco aflatoxinas estudadas ocorrem simultaneamente em um meio

perfazendo um total de 320 µg kg-1 a eficiência do micro-organismo fica diminuída e

não são atingidos níveis não detectáveis de nenhuma delas. A medida que os

percentuas de aflatoxina B1 são diminuídos os de aflatoxina M1 são aumentados.

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– 1262.

102

Artigo 3

Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1 pelos micro-

organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.

103

Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1 pelos micro-

organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.

Resumo

Os fungos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei foram cultivados em

meios fortificados com aflatoxina B1. Os produtos da degradação foram avaliados por

cromatografia liquída acoplada a espectrômetro de massas triplo quadrupolo, as

estruturas formadas foram avaliadas de acordo com as razões massa-por-carga (m/z)

e as fórmulas moleculares estimadas. De acordo com os resultados avaliados, dez

principais composições moleculares foram produzidas. O Rhizopus oryzae, produziu

estruturas químicas sem ligação dupla terminal no anel furano o que indica a redução

da toxicidade dos contaminantes, portanto, trata-se de um promissor uso para

processos destinados a degradação de aflatoxinas.

Palavras-chave: produtos de degradação, Rhizopus oryzae, Trichoderma ressei,

CLAE-EM/EM.

104

Identification of the products of biodegradation of aflatoxin B1 by microorganisms

Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei.

Abstract

The fungus Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei were grown in media

fortified with aflatoxin B1. The degradation products were evaluated by liquid

chromatography-triple quadrupole mass spectrometer, the structures formed were

assessed according to the reasons mass/charge and molecular formulas estimated.

According to the results evaluated ten key molecular compositions were produced. The

Rhizopus oryzae produced without chemical structures terminal double bond in the

furan ring which shows the reduction in toxicity of contaminants therefore it is a

promising for use degradation processes for aflatoxin.

Keywords: degradation products, Rhizopus oryzae, Trichoderma ressei, HPLC-MS/MS

105

1. INTRODUÇÃO

As aflatoxinas são furocumarinas complexas com intensa fluorescência

quando expostas à luz ultravioleta. Elas são pouco polares, solúveis em solventes

como clorofórmio, metanol e benzeno (XIAOHU et al., 2013). Esses compostos são

estáveis a temperaturas acima de 250°C e não são afetadas por temperaturas

inferiores a 10ºC (XUEJIAO et al., 2013). A série G das aflatoxinas difere

quimicamente da série B pela presença de um anel 3-lactona, no lugar do anel

ciclopentanona (YI-MING, 2009). Uma dupla ligação 8,9 é encontrada na forma de um

éter vinil no anel terminal furano nas aflatoxinas B1 e G1, mas não nas aflatoxinas B2 e

G2. Essas diferenças estruturais estão associadas também as suas atividades

biológicas, sendo as aflatoxinas B1 e G1 carcinogênicas e consideravelmente mais

tóxicas que as aflatoxinas B2 e G2. Outra estrutura de aflatoxina é uma derivada

hidroxilada resultante do metabolismo da aflatoxinas B1, denominada aflatoxina M1

(XIAOHU et al., 2013).

As aflatoxinas podem ser removidas ou detoxificadas dos alimentos e

nutrientes contaminados por métodos físicos, químicos ou biológicos. Várias

pesquisas têm sido realizadas objetivando a redução de matérias primas utilizando

métodos físicos e químicos. No entanto, por serem termoestáveis, os tratamentos pelo

calor, como cocção e autoclavagem não causam modificações nos níveis dessas

micotoxinas ativas (BAMMLER et al., 2000; SAALIA e PHILIPS, 2011). Solventes,

incluindo metanol, etanol e hexano, podem efetivamente extrair aflatoxinas de

produtos, porém, os efeitos na qualidade nutricional são questionáveis (LI et al., 2010).

Diversas pesquisas vêm demonstrando que as aflatoxinas são

susceptíveis a micro-organismos e que por esta razão, estão sendo estudados para

introdução em processos de matérias primas alimentares visando a produção de

alimentos de menos contaminados (LI et al., 2012). Os fungos estão entre os micro-

organismos que tem se destacado como promotores de degradação das aflatoxinas

em especial a aflatoxina B1 (MOTOMURA et al., 2003; CACCIAMNANI et al., 2007).

O fungo Rhizopus oryzae, também conhecido por Rhizopus arrhizus, é

utilizado na indústria para a produção de um amplo espectro de metabólitos, na forma

de enzimas extra e intra celulares, que inclui, celulases, hemicelulases, pectinases,

tanases, fitases, amilases, lípases e proteases (KARMAKAR e RAY, 2011;

106

BERTHILLER et al., 2013). O fungo Trichoderma reesei é conhecido, principalmente,

por sua capacidade de produzir múltiplas enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. As

enzimas produzidas por ambos os organismos são consideradas pela Food and

Agriculture Organization (FAO/WHO), Joint Expert Committee on Food Additives

(JEFCA) e Food and Drug Administration (FDA) como metabólitos Geralmente

Reconhecidos como Seguras (GRAS), podendo ser utilizadas como aditivos

alimentares (CFR, 2012). Assim, esses fungos são interessantes para serem

pesquisados quanto ao seu potencial para biodegradação das aflatoxinas em materiais

contaminados destinados a alimentação (CACCIAMNANI et al., 2007).

Poucas pesquisas têm sido realizadas na identificação e toxicidade dos

compostos de biodegradação das aflatoxinas, no entanto, técnicas como a

cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a detector de massas triplo

quadrupolo e tempo de voo (UPLC-MS-TOF) são úteis para detecção das estruturas

química formadas nos produtos da degradação de aflatoxinas (LI, et al., 2010; QIAN et

al., 2013; XIAOHU et al., 2013). A cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a

detector de massas triplo quadrupolo, devido a sua alta sensibilidade, seletividade e

resolução dos picos, fornecem informações para a dedução das estruturas destes

produtos.

Este trabalho tem como objetivo, analisar as estruturas formadas a partir

da degradação da aflatoxina B1 pela ação dos micro-organismos Rhizopus oryzae e

Trichoderma reesei através da técnica de cromatografia líquida acoplada a detector de

massas.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes

Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2

e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.

O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau

cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e

separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).

O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),

hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck

107

(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de

amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de

sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra

diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura

utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração

Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω.cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada

com ácido acético glacial (99:1 v/v).

2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho

Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila

(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,

AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração

de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo

a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µ.mL-1 para as aflatoxinas

AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg.mL-1 para AFLAM1. As concentrações

foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)

empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e

18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,

respectivamente (AOAC, 2000).

2.3 Preparo do meio de cultivo

O meio de cultivo foi preparado utilizando 39g de Agar Batata Dextrose

(ABD – Himedia), correspondente a 15 g de Agar, 4 g de infusão de batata desidratada

e 20 g de dextrose para o volume de 1 litro de água destilada. O meio de cultivo foi

submetido ao processo de esterilização por autoclavagem durante 30 min. Em

seguida, foi vertido em placas de Petri em condições assépticas.

2.4 Preparo do inóculo

As cepas dos micro-organismos Rhizopus oryzae (CCT7560) e

Trichoderma reesei (QM9414) foram adquiridas da coleção de culturas da Fundação

André Tosello e mantidas a 4-8ºC em meio Ágar Batata Dextrose (ABD), em tubos de

ensaio, até o momento do uso. Os esporos foram propagados, para repicagem, em

emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%), empregando raspagem com alça de cromo-

108

níquel e novamente inoculada em meio ABD 4% em placas de Petri. As culturas foram

incubadas em câmaras de germinação (Tecnal) durante 7 dias a 30ºC até nova e

completa esporulação. Para retirada dos esporos foram adicionados 50 mL de uma

emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%) no cultivo raspando com alça de cromo-níquel e

enumerando em câmara de Neubauer. A concentração dos esporos foi estimada por

enumeração no quadrante C da câmara. A contagem de esporos foi realizada a partir

da equação 1. A suspensão foi diluída de forma a resultar em 4 x 106 esporos.g-1 para

adição nas placas de cultivo.

C = (M × 1000 × dil)/0,004 Equação 1.

onde: M é número médio de esporos contados no quadrante C da câmara de

Neubauer; 1000: fator de correção da câmara de Neubauer para mL; dil: 10, pois foi

colocado 1mL de solução de esporos em 9 mL de água; 0,004: fator de correção da

câmara de Neubauer para 1 mL.

2.5 Experimento da biodegradação

O meio de cultura ABD, foi vertido em placas de Petri e fortificado com

100 µg.kg-1 da AFLAB1 onde, foi adicionada uma suspensão de esporos contendo

4 x 106 esporos.g-1. Os cultivos foram realizados em câmaras de germinação (Tecnal)

a temperatura de 30°C durante 6 dias (0, 24, 48, 72, 96 e 120 h). Após o término dos

cultivos, as placas contendo as cepas dos micro-organismos foram armazenadas a

-18ºC, para interrupção do processo metabólico. O experimento foi realizado em

triplicata para cada micro-organismo.

2.6 Determinação das aflatoxinas

As aflatoxinas foram extraídas pelo método descrito por Soares e

Rodrigues Amaya (1989) adaptado para minimizar a quantidade de amostra e

solventes utilizados e, consistiu, no uso de 10 g de amostra de farelo de arroz,

homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio 4% (9:1 v/v)

por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do filtrado e

adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10 cm3 de terra diatomácea. A mistura

foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida filtrada

novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e

109

adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com

10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e

os frascos secos armazenados a -18ºC.

2.7 Instrumentação

Os extratos foram analisados em cromatografo Waters Alliance

Separations modelo 2695 equipado com bomba quaternária, injector automático e

compartimento de colunas termostatizado (Waters, Milford, MA, EUA). A separação

cromatográfica foi realizada com coluna C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm) Nucleosil®

(Bellefonte, PA, USA). Os componetes da fase móvel água ultra pura e acetonitrila,

ambos solventes acidificado com ácido acético com eluição em gradiente utilizando

adição crescente de acetonitrila iniciando com 0 min - 12%; 3 min - 45%; 3,8 min -

100% em seguida a diminuição da acetonitrila com 4,3 min - 12% e 10 min -12%, a

uma taxa de vazão de 1 mL.min-1, resultando em um tempo de corrida de 9 min e

volume de injeção de 10 µL (Anexo 6).

O detector Quatro MicroTM API (triplo quadrupolo) de espectrômetro de

massas, equipado com ionização por eletronebulização (IEN) Micromass (Waters,

Milford, MA, EUA) foi utilizado. O gás de secagem, bem como o de nebulização, foi

gerado a partir de nitrogênio pressurizado num gerador NG-7 (Aquilo, Etten-Leur, NL).

O fluxo de gás por nebulização foi ajustado para 100 L.h-1 e o fluxo de gás de

dessolvatação, para 500 L.h-1. Para a operação no modo EM-EM, o gás colisão foi

argônio (White Martins, Rio Grande do Sul, Brasil), com uma pressão de 2,5 x 10-3

mbar na célula de colisão. Os valores otimizados foram: tensões capilares, 5,0 kV;

temperatura da fonte de 120ºC, temperatura dessolvatação 400ºC; multiplicador 650V;

e o intervalo de varredura, 50 a 350 m/z. Após a otimização da energia de célula de

colisão do triplo quadrupolo, dois diferentes íons de transição (íon precursor e íon

produto) foram selecionados, uma para quantificação e uma para a qualificação, e

esses íons foram monitorados no tempo programado na condição de monitoramento

de múltipla reação.

O processamento de dados e análise da estrutura foi realizada por meio do

programa MassLynx versão 4.1 (Micromass, Manchester, UK). Com o qual podem ser

identificadas as composições elementares, com base nos dados recolhidos sobre a

massa exata de cada composto, e ao mesmo tempo, obter informações sobre os íons

precursores e íons produtos, coletados a partir dos dados de uma injeção de amostra.

110

2.8 Validação

A técnica cromatográfica foi validada de acordo com os parâmetros

sugeridos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), pelo Instituto

Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO), e de acordo

com o protocolo IUPAC/AOAC/ISO (HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000). Na maioria

dos casos, as técnicas validadas devem obedecer a um intervalo de recuperação de

70 - 110% com desvio padrão e desvio padrão relativo de 20% e 30%,

respectivamente (HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000).

Os parâmetros considerados na validação foram limites de detecção e

quantificação, curva analítica, linearidade, seletividade, recuperação e efeito matriz.

Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do instrumento (LODi e LOQi,

respectivamente) foram estimados considerando-se pelo menos 3 e 10 vezes a razão

entre o sinal pela linha de base (ruído), respectivamente. Os limites instrumentais

foram obtidos por padronização externa com a preparação de soluções analíticas de

diferentes concentrações na fase móvel. Os valores de LODi e LOQi multiplicados

pelos fatores de diluição para o método de extração resultou nos limites de detecção

(LODm) e quantificação do método (LOQm) estimado. Para construir a curva analítica

foram preparadas soluções analíticas nas concentrações de 0,5; 1,0; 5,0; 50,0 e

100,0 ng.mL-1. Cada ponto da curva analítica foi injetada em triplicata e os dados de

regressão linear foram obtidos com auxílio do programa MassLynx versão 4.1. Foram

consideradas com boa linearidade curvas com valores de R2 > 0,90 (HORWITZ, 1995;

HORWITZ, 2000). A seletividade foi avaliada comparando o sinal gerado pela injeção

da matriz isenta das aflatoxinas e desta adicionada de padrão (HORWITZ, 1995;

HORWITZ, 2000).

A avaliação do efeito matriz foi realizada com base na comparação das

inclinações das curvas analíticas das aflatoxinas no solvente e na matriz. Para isso

foram preparadas soluções em seis níveis de concentração no solvente e na matriz

sendo realizadas injeções em triplicata para cada nível de concentração. O cálculo do

efeito da matriz foi realizado dividindo o valor da inclinação da curva no solvente pela

curva da matriz, esse valor foi diminuído de 1 e multiplicado por 100 para o valor em

porcentagem (ANVISA). O efeito matriz é considerado baixo para intervalos entre

-20% < C% <20%, médio para os intervalos -50% < C% <-20% ou 20%> C%> 50% e

elevado para os intervalos C% < -50% ou C%> 50% (ECONOMOU et al., 2009).

(Anexo 7).

111

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os valores de recuperação e coeficiente de variação foram de 69% (4),

72% (3) e 71% (4) para os três níveis estudados, estando de acordo com os valores

aceitos pela literatura (ANVISA; INMETRO; IUPAC). Na Tabela 1 estão apresentados

os limites de detecção e quantificação do instrumento, curva analítica do padrão, curva

analítica na matriz e o efeito da matriz.

Tabela 1. Parâmetros cromatográficos validados.

Parâmetros Aflatoxina B1

Tempo de retenção (min) 8,1

Limite de detecção instrumento (ng.mL-1) 0,1

Limite de detecção método (µg.kg-1) 0,04

Limite de quantificação instrumento (ng.mL-1) 0,5

Limite de quantificação método (µg.kg-1) 0,2

Curva analítica no solvente y = 6553,4 + 6,9

Coeficiente de correlação (R2) 0,98

Linearidade 0,5 – 100ng.mL-1

Curva analítica na matriz y = 6622,7 + 8,08

Coeficiente de correlação (R2) 0,97

Efeito matriz (%) 1,04

Os limites de detecção e quantificação foram adequados, assim como, o

modelo de regressão linear. O valor do efeito da matriz foi baixo, indicando que a

técnica cromatográfica empregada é confiável.

3.1 Produtos da degradação

Pesquisas tem demonstrado que há um grande número de produtos

formados na degração da AFLAB1 (LI et al., 2012; YANG et al., 2012; XUEJIAO et al.,

2013; XIAOHU et al., 2013), no entanto, a maioria destes produtos, são compostos

desconhecidos (YI-MING et al., 2009) e, os compostos conhecidos como AFLAP1,

AFLAQ1, AFLAB2a, AFLAH1, estão disponíveis apenas no mercado oriental, o que

torna difícil a sua aquisição, assim, com base na razão massa-por-carga (m/z) e na

informação espectral, alguns produtos da degradação podem ser identificados, não

necessitando do padrão comercial destes compostos derivados da AFLAB1. A Figura

112

1 (A e B) ilustra os cromatogramas da AFLAB1 no início do experimento para os micro-

organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.

A variação dos teores de AFLAB1 ao longo do cultivo com os micro-

organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei determinados pelo método Soares

e Rodrigues Amaya (1989) adaptado e cromatógrafo líquido acoplado a detector de

massas (CLAE-IEN-EM/EM) mostrou a diminuição de 96 para 25,6 µg.kg-1 e 96 para

23,5 µg.kg-1 entre 0 e 72 h, respectivamente, para cada micro-organismo (Tabela 2).

Figura 1. Cromatogramas da AFLAB1 (100 µg.kg-1), no tempo de cultivo 0 h, para o

micro-organismo Rhizopus oryzae (A) e Trichoderma reesei (B).

Tabela 2. Níveis (µg.kg-1) e coeficiente de variação (%) da AFLAB1 no cultivo.

Exp./Cult. Tempo (h)

0 24 48 72 96 120

B1 exp R. 96,0 2,3 89,9 2,5 79,2 1,5 25,6 1,5 Nd Nd

B1 exp T. 96,5 2,1 85,1 4,3 66,1 0 23,5 0,5 Nd Nd

exp. Experimento.; R.: Rhizopus oryzae.; T.: Trichoderma reesei.; Nd. Não detectado.

Os cromatogramas da AFLAB1 nos tempos de cultivo 72 e 120 h para os

micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei (Figura 2) tempo nos quais

se percebe a degradação da mesma, confirmam os dados da Tabela 2.

A AFLAB1 foi degradada pelos micro-organismos ao longo do tempo de

cultivo, até 72 h com a formação de diversos produtos de degradação determinados

A

B

113

pela rota metabólica utilizada pelo micro-organismo. As rotas mais prováveis são a

hidroxilação, epoxidação, metilação e isomerização espacial.

Para identificar os produtos formados foi utilizado o programa MassLynx

versão 4.1 (Micromass, Manchester, UK) para analisar as composições elementares,

bem como possíveis fórmulas moleculares.

A AFLAB1 é composta por três elementos, ou seja, 17 átomos de carbono,

12 átomos de hidrogênio e 6 átomos de oxigênio, com razão m/z 312. Durante o

processo de degradação desta micotoxina, a primeira ligação a ser quebrada é a

ligação dupla, que possívelmente ocorre no carbono C8 e C9 da AFLAB1 (THEUMER

et al., 2010; XIAOHU et al., 2013). Os produtos formados, a partir dos espectros

obtidos pelo programa MassLynx, estão na Figura 3 e 4 para os micro-organismos

Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, respectivamente, nos tempos de cultivo 72, 96

e 120 h.

Os produtos formados com m/z acima de 312 (C17H12O6) mostram que

houve reações de adição na molécula da AFLAB1, essas reações ocorreram com

hidratação da ligação dupla do anel furano terminal e possíveis hidroxilações em

diferentes pontos, além da abertura da estrutura bi-furanóide e até mesmo da fissão

hidrolítica da lactona cumarínica (LIN, 2013; YANG et al., 2012).

Os principais produtos formados da fragmentação da AFLAB1 onde houve

a adição ou perda de hidrogênio e oxigênio, assim, os produtos formados, como o m/z

331(C17H13O7) possui três hidrogênios e um oxigênio a mais que a molécula da

AFLAB1 sendo uma reação de adição rompendo a dupla do anel furano terminal, o

produto m/z 284 (C16H12O5) apresenta uma molécula a menos de (CH2O) que a

AFLAB1, no entanto, as possíveis reações químicas mostram que a via de perda de

um monóxido de carbono (CO) é a principal formação do produto m/z 284, o produto

m/z 274 (C15H13O5) foi formado pela perda de C3H2.

O produto m/z 319 (C16H14O7), que apresenta um carbono a menos que a

AFLAB1, mas, dois átomos de hidrogênio e um de oxigênio a mais, é formado por uma

reação de adição no anel furano terminal, e a desmetilação da estrutura

metoxicumarina. O produto m/z 349 (C17H16O8) tem a molécula H4O2 a mais que a

AFLAB1, isto ocorre provavelmente devido à reação de adição de dois grupos

hidroxilas sobre a dupla ligação do anel furano terminal, no entanto, a estrutura mais

provável é aquela onde os grupos hidroxila e metoxi sejam adjacentes, devido a

reação de impedimento estérico, assim, a hidroxila reage com o anel furano terminal,

enquanto que o grupo metoxi é substituído por outra hidroxila no anel benzeno. Para

114

formação do produto 305 (C17H15O6) ocorreu a desmetilação da estrutura

metoxicumarina e a hidroxilação na ligação dupla do anel furano terminal, na

ciclopentanona e na lactona cumarínica.

Figura 2. Cromatogramas da AFLAB1 com Rhizopus oryzae 72 h (A) e 120 h (B) e

Trichoderma ressei 72 h (C) e 120 h (D).

O produto m/z 298 é conhecido, sendo este, possivelmente a aflatoxina P1

(AFLAP1) formada a partir da reação de ortodemetilação da AFLAB1 (MARROQUÍN-

CARDONA et al., 2011; OLIVEIRA, 2003) As estruturas químicas foram formadas por

ação dos micro-organismos possivelmente para aproveitamento da cadeia carbonada

ou detoxificação (INFANTE et al., 2009; KARMAKAR e RAY, 2011). As estruturas

químicas formadas indicam que a ligação dupla terminal do anel furano da AFLAB1 foi

quebrada em todos os produtos resultantes da ação das enzimas do Rhizopus oryzae.

Esta quebra causa uma diminuição da toxicidade desta micotoxina (KARMAKAR e

A

C

B

D

115

RAY, 2011) o que não ocorreu com o produto do Trichoderma ressei cuja razão

m/z 298 (AFLAP1) indica que a ligação não foi quebrada, portanto, não favorece a

diminuição da toxicidade (ZHANG e LYND, 2006; XIAOHU et al., 2013).

Neste estudo ficou demostrado que o micro-organismo Rhizopus oryzae é

o mais indicado para uso em processos para degradar a AFLAB1 visando diminuir os

riscos de danos tóxicos de produtos e insumos alimentícios. Os produtos de

degradação da AFLAB1 ainda são pouco estudados, devido a isto, estes compostos

são praticamente desconhecidos, pois as técnicas para a identificação destes

compostos desconhecidos são trabalhosas para ser conclusivas, porém, pela sua

sensibilidade e resolução a espectrometria de massas permite uma boa avaliação

preliminar de descontaminação através da identificação de produtos formados (QIAN

et al., 2013; XUEJIAO et al., 2013).

116

Figura 3. Espectros dos produtos formados pelo Rhizopus oryzae 72 h (A) 96 h (B) e

120 h (C).

117

Figura 4. Espectros dos produtos formados pelo Trichoderma ressei 72 h (A) 96 h (B)

e 120 h (C).

118

4. CONCLUSÃO

A degradação da aflatoxina B1 utilizando os micro-organismos Rhizopus

oryzae e Trichoderma reesei foi avaliada. Houve a formação de dez principais

compostos desta biodegradação, onde pelas razões massa-por-carga (m/z) foi

possível identificar as estruturas químicas formadas. Os produtos formados pelo

Rhizopus oryzae indicam a quebra da ligação dupla terminal do anel furano, sugerindo

uma possível diminuição do potencial toxigênico dos compostos formados. O

Trichoderma ressei não foi tão eficiente nesta degradação.

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ZHANG, Y.H.; LYND, L.R. 2006. A functionally based model for hydrolysis of cellulose

by fungal cellulase. Biotechnology and Bioengineering, 94(5): 888-898.

122

Artigo 4

Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae e seu potencial

carcinogênico

123

Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae e seu

potencial carcinogênico

Resumo

O fungo Rhizopus oryzae foi cultivado em meio fortificado com aflatoxina

B1 isolada e em mistura com outra aflatoxinas. Os produtos da degradação foram

avaliados por cromatografia liquída acoplada a espectrômetro de massas triplo

quadrupolo, seguindo-se da avaliação da toxicidade dos produtos formados a partir de

experimentos in vitro com hepatócitos de Danio rerio, da linhagem ZFL. O micro-

organismo Rhizopus oryzae é capaz de degradar a aflatoxina B1 isoladamente e em

mistura, os produtos formados desta degradação mostram que, quando degradada

isoladamente a AFLAB1 forma produtos com potencial carcinogênico diminuidos, no

entanto, quando em mistura com outras aflatoxinas, os produtos de degradação com

diminuição da carcinogeinidade são formados em 72 h de cultivo.

Palavras-chave: Rhizopus oryzae, aflatoxinas, toxicidade

124

Products of biodegradation of aflatoxin B1 by Rhizopus oryzae and its

carcinogenic potential

Abstract

The fungus Rhizopus oryzae was grown in medium supplemented with

aflatoxin B1 alone and in combination with other aflatoxins. The degradation products

were evaluated by liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer,

followed by evaluation of the toxicity of the products formed from experiments in vitro

hepatocyte cell Danio rerio ZFL strain. The microorganism is Rhizopus oryzae capable

of degrading aflatoxin B1 alone and in mixture, the products formed in this degradation

show that when the degraded isolation AFB1 form products that do not have

carcinogenic potential. However, when mixed with other aflatoxins, in degradation

products are formed toxigenic characteristics at 72 hours of culture.

Keywords:Rhizopus oryzae, aflatoxins, toxicity

125

1. INTRODUÇÃO

As aflatoxinas são um grupo de metabolitos secundários altamente tóxicas

produzidas principalmente por espécies fúngicas do gênero Aspergillus. O fungo A.

flavus produz apenas aflatoxinas B, enquanto que o A. parasiticus produz aflatoxinas B

e G. Entre os 18 tipos diferentes de aflatoxinas as mais conhecidas são AFLAB1,

AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, AFLAP1, AFLAQ1, AFLAM1, AFLAM2, AFLAB2a (XIAOHU et

al., 2013). A maioria das aflatoxinas que ocorrem naturalmente em alimentos são as

aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e, em seguida, aflatoxinas M1 (Figura 1). As outras formas

são consideradas metabolitos de transformação intermediária e aparecem em

quantidades que dificultam a purificação para fins científicos ou comerciais (ZORAN et

al., 2010; XIAOHU et al., 2013).

Figura 1. Estruturas químicas das principais aflatoxinas.

A aflatoxina B1 (AFLAB1) é classificada pela Agência Internacional para

Pesquisa sobre o Câncer (IARC) como carcinógeno do grupo 1, ou seja, cancerígeno

para os seres humanos (IARC, 2002). A toxicidade das aflatoxinas diminuem a partir

da AFLAB1, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAG2. Quando a AFLAB1 e AFLAB2 são

consumidas na dieta dos mamíferos, estas podem ser metabolizadas a aflatoxina M1

(AFLAM1) e AFLAM2 e, em seguida, distribuídas a tecidos e fluidos biológicos como o

leite (VAN EGMOND et al., 2007; WAGACHA e MUTHOMI, 2008).

A degradação das aflatoxinas, usando micro-organismos ou enzimas, é

uma das estratégias estudadas para avaliação do risco dos danos decorrentes do

consumo destes compostos através de alimentos ou rações. As vantagens dos

processos que envolvem biodegradação são a especificidade do mecanismo de

decomposição, a aplicação em condições moderadas que alteram de forma suave as

126

propriedades nutricionais e tecnológicas das matrizes alimentares, além de melhorar

as propriedades funcionais (VARGA et. al., 2005; THEUMER et al., 2010).

A biodegradação de aflatoxinas utilizando ação de espécies fúngicas utiliza

os zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.), ascomicetos (Aspergillus níger e

Trichoderma sp.) e ainda, basidiomicetos (Armillariella tabescens) que, têm se

mostrado eficientes para reduzir os níveis totais das aflatoxinas (CACCIAMNANI et al.,

2007; DORS et al., 2009; ZORAN et al., 2010). As pesquisas realizadas para

identificação e avaliação de toxicidade dos compostos de biodegradação das

aflatoxinas ainda são incipientes e têm sido realizadas in vitro para estimar a eficiência

da degradação das aflatoxinas empregando animais ou, conforme a tendência mais

recente, cultura de tecidos. (THEUMER et al., 2010; MARROQUÍN-CARDONA et al.,

2011).

Considerando-se que o alvo destas micotoxinas é o fígado, em geral, o

foco das avaliações in vivo e em in vitro são para este órgão e, embora, nos animais a

perda de peso, a diminuição da velocidade de crescimento e a depressão do sistema

imunológico sejam sintomas importantes para compreensão do nível de toxicidade

(WILLIAMS et al., 2009). Nos testes utilizando apenas culturas celulares, o material é

colocado direta ou indiretamente em contato com a cultura e as alterações celulares

ocorrem por diferentes mecanismos, neste caso, culturas de células hepáticas, de

animais e humanos são promissoras para investigação da toxicidade da AFLAB1

(MCKEAN et al., 2006; SHEN et al., 2012; CORCUERA, et al., 2011).

Neste trabalho foi usado o micro-organismo Rhizopus oryzae, isolado do

arroz, para degradar a AFLAB1, presente em meio de cultura, seguindo-se a avaliação

da toxicidade dos produtos formados a partir de experimentos in vitro com células

hepáticas do peixe zebra Danio rerio da linhagem celular ZFL.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes

Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2

e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.

O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau

cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e

127

separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).

O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),

hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck

(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de

amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de

sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra

diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura

utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração

Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω.cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada

com ácido acético glacial (99:1 v/v).

2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho

Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila

(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,

AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração

de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo

a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µg.mL-1 para as aflatoxinas

AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg.mL-1 para AFLAM1. As concentrações

foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)

empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e

18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,

respectivamente (AOAC, 2000).

2.3 Preparo do meio de cultivo

O meio de cultivo foi preparado utilizando 39 g de Agar Batata Dextrose

(ABD – Himedia), correspondente a 15 g de Agar, 4 g de infusão de batata desidratada

e 20 g de dextrose para o volume de 1 litro de água destilada. O meio de cultivo foi

submetido ao processo de esterilização por autoclavagem durante 30 min. Em

seguida, foi vertido em placas de Petri em condições assépticas.

2.4 Preparo do inóculo

As cepas do micro-organismo Rhizopus oryzae (CCT7560) foram

adquiridas da coleção de culturas da Fundação André Tosello e mantidas a 4-8ºC em

128

meio Ágar Batata Dextrose (ABD), em tubos de ensaio, até o momento do uso. Os

esporos foram propagados, para repicagem, em emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%),

empregando raspagem com alça de cromo-níquel e novamente inoculada em meio

ABD 4% em placas de Petri. As culturas foram incubadas em câmaras de germinação

(Tecnal) durante 7 dias a 30ºC até nova e completa esporulação. Para retirada dos

esporos foram adicionados 50 mL de uma emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%) no

cultivo raspando com alça de cromo-níquel e enumerando em câmara de Neubauer. A

concentração dos esporos foi estimada por enumeração no quadrante C da câmara. A

contagem de esporos foi realizada a partir da equação 1. A suspensão foi diluída de

forma a resultar em 4 x 106 esporos g-1 para adição nas placas de cultivo.

C = (M × 1000 × dil)/0,004 Equação 1.

onde: M é número médio de esporos contados no quadrante C da câmara de

Neubauer; 1000: fator de correção da câmara de Neubauer para mL; dil: 10, pois foi

colocado 1mL de solução de esporos em 9 mL de água; 0,004: fator de correção da

câmara de Neubauer para 1 mL.

2.5 Experimento da biodegradação

O meio de cultura ABD, foi vertido em placas de Petri e fortificado com

100 µg.kg-1 da AFLAB1 isoladamente e 100 µg.kg-1 das AFLAB1 AFLAG1, AFLAM1 e

10 µg.kg-1 de AFLAB2, AFLAG2 no experimento em mistura. Foi adicionada uma

suspensão de esporos contendo 4 x 106 esporos.g-1. Os cultivos foram realizados em

câmaras de germinação (Tecnal) a temperatura de 30°C durante 6 dias: 1º (0 h), 2º

(24 h), 3º (48 h), 4º (72 h), 5º (96 h) e 6º (120 h). Após o término dos cultivos, as

placas contendo as cepas dos micro-organismos foram armazenadas a -18ºC, para

interrupção do processo metabólico. O experimento foi realizado em triplicata.

2.6 Determinação das aflatoxinas

As aflatoxinas foram extraídas pelo método descrito por Soares e

Rodrigues Amaya (1989) adaptado para minimizar a quantidade de amostra e

solventes utilizados e, consistiu, no uso de 10 g de amostra de farelo de arroz,

homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio 4% (9:1 v/v)

por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do filtrado e

129

adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10 cm3 de terra diatomácea. A mistura

foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida filtrada

novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e

adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com

10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e

os frascos secos armazenados a -18ºC.

2.7 Instrumentação

Os extratos foram analisados em cromatografo Waters Alliance

Separations modelo 2695 equipado com bomba quaternária, injector automático e

compartimento de colunas termostatizado (Waters, Milford, MA, EUA). A separação

cromatográfica foi realizada com coluna C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm) Nucleosil®

(Bellefonte, PA, USA). Os componetes da fase móvel água ultra pura e acetonitrila,

ambos solventes acidificado com ácido acético com eluição em gradiente utilizando

adição crescente de acetonitrila iniciando com 0 min - 12%; 3 min - 45%; 3,8 min -

100% em seguida a diminuição da acetonitrila com 4,3 min - 12% e 10 min -12%, a

uma taxa de vazão de 1 mL.min-1, resultando em um tempo de corrida de 9 min e

volume de injeção de 10 µL.

O detector Quatro MicroTM API (triplo quadrupolo) de espectrômetro de

massas, equipado com ionização por eletronebulização (IEN) Micromass (Waters,

Milford, MA, EUA) foi utilizado. O gás de secagem, bem como o de nebulização, foi

gerado a partir de nitrogênio pressurizado num gerador NG-7 (Aquilo, Etten-Leur, NL).

O fluxo de gás por nebulização foi ajustado para 100 L.h-1 e o fluxo de gás de

dessolvatação, para 500 L.h-1. Para a operação no modo EM-EM, o gás colisão foi

argônio (White Martins, Rio Grande do Sul, Brasil), com uma pressão de 2,5 x 10-3

mbar na célula de colisão. Os valores otimizados foram: tensões capilares, 5,0 kV;

temperatura da fonte de 120ºC, temperatura dessolvatação 400ºC; multiplicador 650V;

e o intervalo de varredura, 50 a 350 m/z. Após a otimização da energia de célula de

colisão do triplo quadrupolo, dois diferentes íons de transição (íon precursor e íon

produto) foram selecionados, uma para quantificação e uma para a qualificação, e

esses íons foram monitorados no tempo programado na condição de monitoramento

de múltipla reação.

O processamento de dados e análise da estrutura foi realizada por meio do

programa MassLynx versão 4.1 (Micromass, Manchester, UK). Com o qual podem ser

130

identificadas as composições elementares, com base nos dados recolhidos sobre a

massa exata de cada composto, e ao mesmo tempo, obter informações sobre os íons

precursores e íons produtos, coletados a partir dos dados de uma injeção de amostra.

(Anexo 8).

2.8 Avaliação da toxicidade dos extratos

A linhagem celular ZFL, de hepatócitos de Danio rerio, foi mantida com

meio de cultura RPMI 1640, suplementado com bicarbonato de sódio (0,2 g.L-1), L-

glutamina (0,3 g.L-1) e Hepes (3 g.L-1), com 10% de soro fetal bovino e 1% de

antibiótico e antimicótico, em garrafas de cultura a 28ºC (TRINDADE et al., 1999).

As células ZFL (3 x 105 células.mL-1) foram incubadas por 48 h para

aderência em placas de cultura de 96 poços a 28ºC. As células foram então tratadas

em meio contendo diferentes concentrações (12,5; 25; 50 e 100 ng.mL-1) da AFLAB1

pura e degradada por até seis dias e, as células controle receberam o mesmo volume

de DMSO, oqual foi utilizado para solubilizar a aflatoxina (0,05%). Após tratadas, as

linhagens celulares foram incubadas a 28ºC por 24, 48 e 72 h, sendo que uma das

placas foi utilizada para leitura imediata 28ºC (TRINDADE et al., 1999).

A viabilidade celular foi avaliada pelo método 3-4,5-dimetiltiazol-2-il,2,5-

difeniltetrazolium (MTT) imediatamente, 24, 48 e 72 h, após a exposição, de acordo

com Trindade e colaboradores (1999). As células após a incubação, foram lavadas

com PBS e foram adicionados 200 L de meio de cultura sem micotoxina e 20 L de

solução de MTT (5 mg.mL-1) em cada poço. As placas foram incubadas por 3 h a

28ºC. O meio contendo MTT foi removido e os cristais de formazan dissolvidos em

200 L de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). Os valores de absorbância a 490 nm foram

determinados no leitor ELISA (ELX 800 Universal Leitora, Bio-TEK).

Cada experimento foi repetido em três ocasiões independentes usando

tréplicas das amostras. Os dados dos experimentos referentes à avaliação da

sensibilidade aos tratamentos foram apresentados como médias ± erro padrão,

analisados utilizando ANOVA com pós-teste de Tukey. Os valores de p menores que

0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

131

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os parâmetros de confiabilidade analítica previamente validados para

determinação das AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1 residuais foram os

limites de detecção e quantificação do instrumento e do método com valores de 0,1 e

0,5 ng.mL-1 e 0,04 e 0,2 µg.kg-1, repectivamente para todas as aflatoxinas em estudo,

com linearidade na faixa de 0,5 – 100 ng.mL-1 e recuperações de 71, 88, 74, 92 e 66%,

respectivamente.

O modelo de regressão linear foi adequado para a determinação das

aflatoxinas e os coeficientes de variação abaixo de 20%, conforme recomendação do

INMETRO e IUPAC. O valor do efeito da matriz nas condições empregadas era

insuficiente para afetar os resultados de quantificação das aflatoxinas usadas no

estudo de biodegradação, pois, variaram de 1,04 a 8,56%.

Os níveis de degradação da AFLAB1 pelo micro-organismo Rhizopus

oryzae individualmente e em mistura com outras aflatoxinas, ao longo dos cinco dias

de cultivo, extraídos pelo método Soares e Rodrigues Amaya (1989) estão

apresentados na Tabela 1.

O micro-organismo degradou a AFLAB1 a níveis não detectáveis após o 5º

dia de cultivo individualmente. Na mistura das cinco aflatoxinas, sob as mesmas

condições, nenhuma delas teve seus níveis diminuídos a níveis não detectáveis pelo

método (Tabela 1). O espectros de massa, obtidos dos extratos dos cultivos de

AFLAB1 isolada durante o 5º e o 6º dia (Figura 2) e em mistura das aflatoxinas (Figura

3), foram analisados encontrando-se valores não detectaveis da AFLAB1 nos extratos

da biomassa contendo esta micotoxina isolada e valores inferiores a 7 µg.kg-1 da

AFLAB1 na mistura após 5º e o 6º dia de cultivo (Tabela 1).

A partir da Figura 2, percebe-se que, as razões massa-por-carga (m/z) dos

produtos formados pela degradação da AFLAB1 isolada (m/z 312), formaram

composições moleculares de razões massa-por-carda de m/z 349, 337, 319 e 305.

As razões massa-por-carga (m/z) dos produtos formados pela degradação

da AFLAB1 (m/z 312) na mistura (Figura 3) mostraram um aumento da concentração

da AFLAM1 (m/z 328) no 5º dia cultivo demonstrado no espectro de massas com o

produto de razão (m/z 327). No 6º dia de cultivo esta concentração diminuiu e se

detectaram produtos com razão massa-porcarga (m/z) semelhante aos produtos

formados quando a AFLAB1 não está em mistura.

132

Tabela 1. Níveis residuais de AFLAB1 (µg.kg-1) e da mistura de aflatoxinas (µg.kg-1) na

biomassa de Rhizopus oryzae.

Aflatoxina Cultivo isolado (dias)

1º 2º 3º 4º 5º 6º

AFB1 96,0 2,3 89,9 2,5 79,2 1,5 25,6 1,5 Nd Nd

Aflatoxinas Cultivo em mistura

AFB1 96,5 2,3 36,6 4,2 22,4 1,1 14,2 1,4 6,6 0,8 1,9 2,1

AFB2 10,1 3,7 6,8 1,4 3,3 0,9 3,2 0,3 2,6 1,0 2,6 0,7

AFG1 96,7 1,8 57,0 1,6 55,1 3,6 23,3 2,4 20,3 1,0 10,4 2,3

AFG2 8,6 2,1 8,4 1,3 8,2 0,6 5,1 1,2 5,1 1,1 4,1 1,3

AFM1 89,8 3,8 77,1 2,1 128,3 1,0 89,8 1,3 218,1 1,1 77,6 0,9

Nd.: não detectado.

A toxicidade da AFLAB1 está relacionada com a presença do anel

ciclopentanona e a ligação dupla entre os carbonos C8 e C9, que formam o éter

vinílico além do anel furano terminal (HUSSEIN & BRASEL, 2001; YU et al., 2004;

XIAOHU et al., 2013). O anel furano terminal é considerado a parte que determina o

potencial toxigênico desta estrutura, e também a sua atividade carcinogênica. A

remoção da ligação dupla do anel furano terminal é a melhor forma para a

detoxificação da AFB1 e das demais que possuem esta ligação (AFM1 e AFG1).

Em vista da busca de demonstrar a ação de detoxificação destes

compostos pelo Rhizopus oryzae durante seu desenvolvimento, foram conduzidos os

estudos de toxicidade da biomassa produzida em presença de AFB1 após cinco dias

de cultivo.

Em relação à atividade do padrão puro da AFLAB1 nas células ZFL, foi

possível observar um aumento de proliferação nas concentrações de 25 e 50 ng.mL-1

em 72 h em relação às células controle, comprovando o potencial toxigênico da

aflatoxina estudada.

No 1º dia de cultivo, onde o micro-organismo ainda não havia atingido sua

forma de crescimento ideal para degradar a AFLAB1, foi observado a proliferação

celular na concentração de 50 ng.mL-1. No 2º dia observa-se que não houve tendência

a proliferação celular, possívelmente pelo efeito do procedimento experimental, pois a

AFLB1 ainda apresentava 90% de concentração inicial. No 3º dia este efeito foi

observado na concentração de 50 ng.mL-1 em 72 h em relação às células controle.

(Figura 4).

133

No 4º e 6º dia não foram observadas diferenças na proliferação celular

sugerindo que nos produtos formados não degradação pelo micro-organismo

Rhizopus oryzae, as ligações que indicam o potencial toxigênico da AFLAB1 possam

ter sido quebradas. No entanto, no 5º dia houve uma tendência ao aumento do

número de células na concentração de 50 ng.mL-1 (Figura 5), isso pode ter ocorrido

pela formação do produto de razão massa-por-carga (m/z 328), possívelmente sendo

a AFLAM1 comprovado pela Tabela 1 e pela proliferação celular do padrão puro da

AFLAB1 (Figura 6).

134

Figura 2. Espectros de massa no 5º (A) e 6º (B) dia de cultivo para AFLAB1

isolada.

A

B

135

Figura 3. Espectros de massa 5º (A) e 6º (B) dia de cultivo para AFLAB1 em mistura.

A

B

136

imediata 24h 48h 72h0.0

0.1

0.2

0.3

0.4Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1 degradada 0h!

100ng/mL

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

imediata 24h 48h 72h0.0

0.1

0.2

0.3

0.4Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1 24h!

100ng/mL

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

imediata 24h 48h 72h0.0

0.2

0.4

0.6Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1 48h!

100ng/mL

*

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

Figura 4. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 1º (A), 2º (B) e

3º (C) dia.

2º dia de cultivo

1º dia de cultivo

3º dia de cultivo

A

B

C

137

imediata 24h 48h 72h0.0

0.2

0.4

0.6

0.8Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1 degradada 72 h

100ng/mL

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

imediata 24h 48h 72h0.0

0.2

0.4

0.6Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1 degradada 96h!

100ng/mL

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

imediata 24h 48h 72h0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1 120h!

100ng/mL

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

Figura 5. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 4º (A), 5º (B) e

6º (C) dia.

4º dia de cultivo

5º dia de cultivo

6º dia de cultivo

A

B

C

138

imediata 24h 48h 72h0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0Controle

12,5ng/mL

25ng/mL

50ng/mL

ZFL - Micotoxina B1

100ng/mL

**

Tempo

Den

sid

ad

e Ó

pti

ca

Figura 6. Aflatoxina B1 padrão puro 100µg.kg-1.

(*) Diferença significativa em relação ao controle.

4. CONCLUSÃO

O micro-organismo Rhizopus oryzae é capaz de degradar a aflatoxina B1

isoladamente e em mistura, os produtos formados desta degradação mostram que,

quando degradada isoladamente a AFB1 forma produtos que não possuem mais

características toxigênicas e carcinogênicas, no entanto, quando em mistura com

outras aflatoxinas, os produtos de degradação sem características toxigênicas são

formados em 120 h de cultivo.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CONCLUSÃO GERAL

As condições para separação das cinco aflatoxinas estudadas foi

estabelecida por planejamento experimental sendo a fase móvel uma mistura de água

acidificada com ácido acético (99:1 v/v), acetonitrila e metanol (60:8:32 v/v/v) na vazão

0,6 mL min-1 a 45ºC. A extração pelo método Soares e Rodrigues Amaya adaptado

resultou em recuperações médias de 70, 88, 74, 92 e 66% para AFLAB1, AFLAB2,

AFLAG1, AFLAG2, e AFLAM1, respectivamente, com desvios inferiores a 20%.

No estudo de degradação das AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e

AFLAM1, envolvendo os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei,

ficou demonstrado que o Rhizopus oryzae foi mais eficiente utilizando uma quantidade

de esporos de 4 x 106 esporors g-1 em um tempo de 72 h de cultivo chegando a níveis

não detectáveis, tanto nos estudos individuais da AFLAB1, bem como no meio com a

mistura. Uma relação inversa entre níveis de AFLAB1 e AFLAM1 foi demonstrada no

meio fortificado com todas as aflatoxinas.

O acompanhamento da degradação da AFLAB1 pelos micro-organismos

Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei mostrou que se formaram dez derivados cuja

dupla ligação do anel furano terminal foi quebrada, apenas para o Trichoderma reesei

um dos derivados não teve esta característica, mantendo a toxicidade do composto.

No estudo de toxicidade as células do hepatócito ZFL não mostraram

tendência à proliferação celular no meio fortificado com AFLAB1 cultivado com

Rhizopus oryzae em 72 h de cultivo da biomassa.

143

SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Avaliar a toxicidade dos produtos formados pela degradação das AFLAG1,

AFLAG2, AFLAB2 e AFLAM1 pelos micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma

reesei.

Avaliação das enzimas produzidas pelos micro-organismos Rhizopus

oryzae e Trichoderma reesei em presença das AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e

AFLAM1.

Estudar o efeito dos micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma

reesei durante a fermentação semi sólida tendo o farelo de arroz fortificados com as

aflatoxinas como substrato.

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158

ANEXOS

159

ANEXO 1

Equações que descrevem as respostas previstas pelo modelo em função das variáveis independentes do planejamento DCCR.

Aflatoxinas Equações dos modelos ajustados

Tempo de retenção (Y1) Fator de separação (Y2) Resolução (Y3)

AFM1

AFG2

AFG1

AFB2

AFB1

x1: proporção da fase móvel; x2: vazão da fase móvel; x3: temperatura da coluna.

ANEXO 2

Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCCR.

Tempo de retenção (Y1) Fator de capacidade (Y2) Resolução (Y3)

Fonte V. SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2

AFM1

Regres. 172,8 2 86,4 16,9 4,5 0,84 0,0007 2 0,00035 13,3 3,6 0,81 1,02 4 0,256 28,4 8,7 0,95

Resíduo 71,8 14 5,1 0,0003 14 0,00002 0,11 12 0,009

Total 244,6 0,0011 1,14

160

(Continuação)

Tempo de retenção (Y1) Fator de capacidade (Y2) Resolução (Y3)

Fonte V. SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2

AFG2

Regres. 196,8 2 98,4 17,5 4,7 0,84 0,0015 1 0,00158 15,3 3,4 0,71 0,89 3 0,297 42,4 12,4 0,95

Resíduo 78,8 14 5,6 0,0015 15 0,00010 0,09 13 0,007

Total 275,7 0,0031 0,98

AFG1

Regres. 291,3 2 145,6 18,7 5,0 0,85 0,0176 1 0,01768 105,2 23,2 0,93 3,94 2 1,974 44,9 12,0 0,93

Resíduo 109,1 14 7,8 0,0025 15 0,00016 0,62 14 0,044

Total 400,4 0,0202 4,57

AFB2

Regres. 430,1 2 215,1 24,2 6,5 0,90 0,0644 2 0,03224 161,2 43,2 0,98 2,97 2 1,485 95,7 25,6 0,80

Resíduo 125,4 14 8,9 0,0030 14 0,00020 1,68 14 0,120

Total 555,5 0,0674 4,65

AFB1

Regres. 691,1 3 230,4 38,8 11,4 0,95 0,2181 2 0,10906 205,8 55,2 0,98 4,47 1 4,475 79,9 17,6 0,91

Resíduo 77,2 13 5,9 0,0074 14 0,00053 0,84 15 0,056

Total 768,3 0,2255 5,32

Fonte V.: Fonte de Variação; AF.: Aflatoxina; Regres.: Regressão; SQ.: Soma quadrática; GL.: Graus de Liberdade; MQ.: Média quadrática; Fcal: F calculado (1:15-4,54; 2:14-

3,73; 3:13-3,41; 4:12-3,25); Ftab: F tabelado; R2: coeficiente de regressão.

161

ANEXO 3. Figuras do experimento DCCR

Figura 1. Experimento 1 do planejamento DCCR.

Figura 2. Experimento 2 do planejamento DCCR.

Figura 3. Experimento 3 do planejamento DCCR.

162

Figura 4. Experimento 4 do planejamento DCCR.

Figura 5. Experimento 5 do planejamento DCCR.

Figura 6. Experimento 6 do planejamento DCCR.

163

Figura 7. Experimento 7 do planejamento DCCR.

Figura 8. Experimento 8 do planejamento DCCR.

Figura 9. Experimento 9 do planejamento DCCR.

164

Figura 10. Experimento 10 do planejamento DCCR.

Figura 11. Experimento 11 do planejamento DCCR.

Figura 12. Experimento 12 do planejamento DCCR.

165

Figura 13. Experimento 13 do planejamento DCCR.

Figura 14. Experimento 14 do planejamento DCCR.

Figura 15. Experimento 15 do planejamento DCCR.

166

ANEXO 4

Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCC. Tempo de retenção (Y1’) Fator de capacidade (Y2’) Resolução (Y3’)

Fonte V. SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2

SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2

SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2

AFM1

Regressão 14,6 2 7,29 104,3 15,0 0,99 - - - - - - 0,0515 2 0,02578 644,5 92,8 0,99

Resíduo 0,3 4 0,07 - - - 0,0002 4 0,00004

Total 14,8 - 0,0517

AFG2

Regressão 14,2 2 7,11 82,4 11,9 0,99 0,00068 2 0,00034 1,4 0,2 0,98 0,0458 2 0,0229 229,0 32,9 0,99

Resíduo 0,3 4 0,08 0,000001 4 0,0000002 0,0005 4 0,0001

Total 17,6 0,000069 0,0463

AFG1

Regressão 25,2 2 12,60 92,3 13,3 0,98 0,001765 2 0,0008825 566,6 81,6 0,99 0,3201 2 0,1600 1600 231 0,99

Resíduo 0,5 4 0,13 0,000006 4 0,0000015 0,0005 4 0,0001

Total 25,8 0,001771 0,3206

AFB2

Regressão 39,3 2 19,65 85,9 12,4 0,98 0,005791 2 0,0028955 373,6 53,8 0,99 0,2606 1 0,2606 41,4 6,2 0,99

Resíduo 0,9 4 0,22 0,000031 4 0,0000077 0,0032 5 0,0063

Total 40,2 0,005822 0,2638

AFB1

Regressão 58,9 2 29,43 79,3 11,4 0,98 0,064262 1 0,064262 9,6 1,4 0,81 - - - - - -

Resíduo 1,5 4 0,37 0,033200 5 0,00664 - - -

Total 60,4 0,097462 -

Fcal: F calculado (2:4-6,94; 5:1-6,60); Ftab: F tabelado; R2: coeficiente de regressão; AF.: aflatoxina; (-) não apresentaram valores signficativos.

167

ANEXO 5. Figura dos experimentos DCC.

Figura 16. Experimento 1 do planejamento DCC.

Figura 17. Experimento 2 do planejamento DCC.

Figura 18. Experimento 3 do planejamento DCC.

168

Figura 19. Experimento 4 do planejamento DCC.

Figura 20. Experimento 5 do planejamento DCC.

169

ANEXO 6. Separação CLAE-IEN-EM/EM

Figura 21. Separação cromatográfica das aflatoxinas em CLAE-IEN-EM/EM

ANEXO 7

Parâmetros validados para CLAE-IEN-EM/EM.

AFS CLAE-IEN-EM/EM

TR (min) Curva analítica R2 Curva matriz EM (%)

AFLAM1 7,2 5706,4 + 1,9 0,98 5503,5 + 2,8 3,68

AFLAG2 7,5 5258,6 + 2,7 0,97 5514,9 + 10,1 4,64

AFLAG1 7,8 12595,7 -0,02 0,98 13775,8 - 0,1 8,56

AFLAB2 8,0 7610,1 + 6,0 0,98 7800,1 + 2,1 2,43

AFLAB1 8,1 6553,4 + 6,9 0,98 6622,7 + 8,08 1,04

AFLAS.: Aflatoxinas; TR.: tempo de retenção; EM.: efeito matriz.