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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIAS DE
ALIMENTOS
BIODEGRADAÇÃO DE AFLATOXINAS
Helen Cristina dos Santos Hackbart
Profª Drª Eliana Badiale-Furlong
Orientadora
Rio Grande, RS
2013
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIAS DE
ALIMENTOS
BIODEGRADAÇÃO DE AFLATOXINAS
Helen Cristina dos Santos Hackbart
Tese apresentada como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
doutor em Engenharia e Ciências de
Alimentos.
Profa. Dra. Eliana Badiale-Furlong
Orientadora
Rio Grande, RS
2013
4
À minha família, especialmente meus pais, Enildo
e Cleusa, sempre me incentivando e acreditando
em mim. Aos meus irmãos Mauro, Vivian, Liege,
Ana Maria e Marcos pelo apoio, aos meus
cunhados, Simone, Guilherme, Jonas e sobrinhas
Fernanda e Juliana pela torcida.
Amo vocês.
5
“... Pai concede-nos, especialmente, a dádiva de compreender tua vontade, seja qual
for.
Que possamos confiar em teus desígnios superiores, já que o ontem, o hoje e o
amanhã são três etapas da mesma jornada.
A todo o momento é possível semear e colher, e os nossos anseios do coração serão
realizados, na ocasião oportuna e segundo a tua vontade.
Agradecemos a ti, hoje e sempre...”
Assim Seja
Psicografia de Francisco do Espírito Santo Neto.
6
AGRADECIMENTOS
A Prof.ª Dr.ª Eliana Badiale-Furlong agradeço a orientação não só por este
trabalho e sim pelos 7 anos de orientação e convívio, minha mestre, com quem
aprendi muito, obrigada por ter acreditado em mim, pela amizade, paciência,
disponibilidade, apoio e incentivo. Muito obrigada.
A Prof.ª Dr.ª Ana Paula Votto e Prof.ª Dr.ª Gilma Trindade pela atenção,
apoio e disponibilidade durante a realização das análises no Laboratório de Cultura
Celular, do instituto de Ciências Biológicas (ICB).
Ao Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel pelo apoio durante a realização das
análises no laboratório de análises de compostos orgânicos e metais (LACOM).
Aos membros da banca: Prof.ª Dr.ª Ana Paula Votto, Prof.ª Dr.ª Lucielen
Oliveira dos Santos, Prof.ª Dr.ª Giniani Carla Dors, Prof.ª Dr.ª Jaqueline Garda Buffon,
Prof.ª Dr.ª Leonor Almeida de Souza Soares pelas contribuições.
A colega Renata Vasconcellos, pela ajuda no estudo de toxicidade, sem
você esta etapa não seria possível, muito obrigada.
A todos os colegas e professores do Laboratório de Micotoxinas em
especial Priscila e Muriele pela ajuda no início deste trabalho.
A minha querida amiga Jesus, pela ajuda técnica, pela força, pelas
palavras de carinho e de confiança, muito obrigada.
A minha amiga Islanda, pela ajuda burocrática em relação a matricula,
bolsas e programação de horários, sempre disponível a ajudar e sempre de muito bom
humor, obrigada pelas palavras de carinho, incentivo e apoio.
Ao meu amigo Cristiano pelo apoio e palavras de incentivo.
As minhas amigas Anelise e Adriana, pela ajuda incondicional, por todo o
trabalho realizado, por horas e horas de análises, muito obrigada gurias.
A minha amiga Renata por estar sempre disposta a ajudar, muito obrigada.
A minha amiga Michele por me escutar e ser minha confidente, sempre me
dando apoio e confiando em mim. Pelas noites e finais de semana de muito trabalho e,
claro, pelos bolos de chocolate.
A minha amiga Luciana por fazer com que eu olhe as dificuldades por
outro ponto de vista, por estar disponível a ajudar em qualquer horário e dia da
semana, obrigada por tudo.
7
Aos meus amigos, Alisson e Leonardo, pelas festas e palavras de
confiança nos momentos difíceis ao longo destes anos.
As minhas amigas Ana Paula, Daiane e Silvana pelos poucos momentos
de descontração, pelas jantas, caminhadas, inúmeras risadas, apoio, paciência, enfim,
o que seria de mim sem vocês minhas melhores amigas. Obrigada pela torcida.
A minha sogra e sogro, Loiva e Lauro pela torcida e pelas orações, muito
obrigada.
A minha prima Karina, pela estadia, cafés e jantas sempre acompanhadas
de incentivo, bons conselhos e muitas risadas, obrigada por tudo.
Aos meus familiares, obrigada pela torcida.
Aos meus irmãos, cunhados e sobrinhas que estão longe Mauro, Simone,
Fernanda e Juliana, Vivian e Guilherme, pela torcida e incentivo. Amo vocês e estou
com saudades.
Aos meus irmãos e cunhado que estão por perto Liege, Marcos, Ana Maria
e Jonas, pelas jantas e churrascos, pela paciência e pelo apoio. Amo vocês.
Aos meus pais que me propiciaram a oportunidade de estudar, pelo apoio,
carinho, dedicação, cuidado, paciência, compreensão, orações e amor incondicional,
me suportando nos momentos mais difíceis, meus pilares, meus mestres, os melhores
pais do mundo, amo vocês.
Ao meu noivo Ricardo, pela compreensão e carinho, pelos intermináveis
finais de semana de trabalho e não de descanso, pelo incentivo não me deixando
desistir nos momentos mais difíceis. Muito obrigada meu amor.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho.
A Capes pela Bolsa de Doutorado.
8
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................ 12
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ 14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS ......................................................................... 17
CAPITULO I .............................................................................................................................. 19
RESUMO GERAL .................................................................................................................... 20
ABSTRACT ............................................................................................................................... 21
1. INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 22
2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 24
2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 24
CAPITULO II ............................................................................................................................. 25
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 26
3.1 FUNGOS ......................................................................................................................... 26
3.1.1. Fungos produtores de metabolitos GRAS ......................................................... 29
3.1.2 Fungos Toxigenicos e Micotoxinas ..................................................................... 32
3.1.3 Aspergillus sp. ......................................................................................................... 35
3.1.4 Aflatoxinas ............................................................................................................... 37
3.1.5 Determinação de aflatoxinas ................................................................................ 45
3.1.6 Degradação de aflatoxinas ................................................................................... 47
3.1.7 Testes de toxicidade .............................................................................................. 49
CAPITULO III ............................................................................................................................ 51
ARTIGOS ................................................................................................................................... 52
Artigo 1 ....................................................................................................................................... 53
Validação de método para extração, detecção e quantificação de aflatoxinas.............. 53
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 56
2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................... 57
2.1 Instrumentação .............................................................................................................. 57
9
2.2 Padrões analíticos, reagentes e solventes ................................................................ 58
2.3 Preparo de Amostras .................................................................................................... 58
2.4 Preparo das soluções estoque e trabalho ................................................................. 58
2.5 Adequação das condições cromatográficas .............................................................. 59
2.6 Determinação das aflatoxinas ..................................................................................... 60
2.7 Validação da técnica cromatográfica .......................................................................... 61
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 62
3.1 Adequação das condições cromatográficas .............................................................. 62
3.2 Validação da técnica cromatográfica .......................................................................... 67
3.3 Validação do método de extração e purificação ....................................................... 70
4. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 72
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 72
Artigo 2 ....................................................................................................................................... 76
Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei ................... 76
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 79
2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................... 80
2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes ................................................................ 80
2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho ................................................................. 81
2.3 Preparo do meio de cultivo .......................................................................................... 81
2.4 Preparo do inóculo ........................................................................................................ 82
2.5 Determinação das aflatoxinas ..................................................................................... 82
2.6 Instrumentação .............................................................................................................. 83
2.7 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo .............. 83
2.8 Determinações de glicosamina e ergosterol ............................................................. 84
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 85
3.1 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo .............. 86
3.2 Determinações de glicosamina e ergosterol ............................................................. 93
4. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 95
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 95
Artigo 3 ..................................................................................................................................... 102
10
Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1 pelos micro-organismos
Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei. ............................................................................. 102
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 105
2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 106
2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes .............................................................. 106
2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho ............................................................... 107
2.3 Preparo do meio de cultivo ........................................................................................ 107
2.4 Preparo do inóculo ...................................................................................................... 107
2.5 Experimento da biodegradação................................................................................. 108
2.6 Determinação das aflatoxinas ................................................................................... 108
2.7 Instrumentação ............................................................................................................ 109
2.8 Validação ...................................................................................................................... 110
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 111
3.1 Produtos da degradação ............................................................................................ 111
4. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 118
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 118
Artigo 4 ..................................................................................................................................... 122
Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae e seu potencial
carcinogênico .......................................................................................................................... 122
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 125
2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 126
2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes .............................................................. 126
2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho ............................................................... 127
2.3 Preparo do meio de cultivo ........................................................................................ 127
2.4 Preparo do inóculo ...................................................................................................... 127
2.5 Experimento da biodegradação................................................................................. 128
2.6 Determinação das aflatoxinas ................................................................................... 128
2.7 Instrumentação ............................................................................................................ 129
2.8 Avaliação da toxicidade dos extratos ....................................................................... 130
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 131
4. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 138
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 138
11
CONCLUSÃO GERAL ........................................................................................................... 142
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................................ 143
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 144
ANEXOS .................................................................................................................................. 158
ANEXO 1 ................................................................................................................................. 159
Equações que descrevem as respostas previstas pelo modelo em função das variáveis
independentes do planejamento DCCR. ............................................................................ 159
ANEXO 2 ................................................................................................................................. 159
Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCCR. ................................................. 159
ANEXO 3. Figuras do experimento DCCR ......................................................................... 161
ANEXO 4 ................................................................................................................................. 166
Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCC. .................................................... 166
ANEXO 5. Figura dos experimentos DCC. ........................................................................ 167
ANEXO 6. Separação CLAE-IEN-EM/EM .......................................................................... 169
ANEXO 7 ................................................................................................................................. 169
Parâmetros validados para CLAE-IEN-EM/EM. ................................................................ 169
12
LISTA DE TABELAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1. Limites máximos tolerados (LMT) para aflatoxinas em alimentos, no
Brasil, aplicação imediata.
33
Tabela 2. Micotoxinas das principais espécies de Aspegillus. 35
Tabela 3. Propriedades das aflatoxinas. 39
Tabela 4. Ocorrência de aflatoxinas no Brasil nos anos entre 2011 e 2013. 44
CAPITULO III
ARTIGO 1
Tabela 1. Valores utilizados no DCCR para os três fatores. 58
Tabela 2. Valores utilizados no DCC para os dois fatores. 59
Tabela 3. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de
capacidade e resolução das aflatoxinas estudadas.
64
Tabela 4. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de
capacidade e resolução das aflatoxinas, no planejamento DCC.
67
Tabela 5. Equações que descrevem as repostasm previstas pelo modelo em
função das variáveis independentes.
67
Tabela 6. Recuperação para as cinco aflatoxinas estudadas nos métodos de
extração.
70
ARTIGO 2
Tabela 1. Níveis das aflatoxinas (µg/kg) e coeficiente de variação (%), no cultivo. 87
13
Tabela 2. Percentuais de descontaminação (D) nos níveis iniciais das aflatoxinas
nos meios de cultivo.
88
Tabela 3. Constantes de degradação das aflatoxinas pelos micro-organismos no
experimento 3.
91
Tabela 4. Níveis residuais das aflatoxinas (µg kg-1) e coeficiente de variação (%),
ao longo do intervalo de cultivo.
92
Tabela 5. Porcentagens de descontaminação nos níveis das aflatoxinas durante
o cultivo com Rhizopus oryzae.
92
Tabela 6. Valores de médios de ergosterol, glicosamina e níveis médios de
redução das aflatoxinas nos cultivos.
93
ARTIGO 3
Tabela 1. Parâmetros cromatográficos validados. 109
Tabela 2. Níveis (µg kg-1) e coeficiente de variação (%) da AFLAB1 no cultivo. 111
ARTIGO 4
Tabela 1. Níveis residuais de AFLAB1 (µg kg-1) e da mistura de aflatoxinas (µg
kg-1) na biomassa de Rhizopus oryzae.
129
14
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Esquema das formas de reprodução da maioria das espécies fúngicas. 27
Figura 2. Colônia de Rhizopus oryzae no 1º e 5º dia de cultivo. 29
Figura 3. Imagem microscópica (100 µm) do fungo Rhizopus oryzae (Mycology,
2012).
30
Figura 4. Colônia de Trichoderma reesei no 1º e 5º dia de cultivo. 31
Figura 5. Imagem microscópica do Trichoderma reesei (400x) (Infante et al.,
2009).
32
Figura 6. Imagem microscopia do Aspergillus flavus (Adaptado de Calvo et al.,
2012).
36
Figura 7. Estrutura química das principais aflatoxinas. 38
Figura 8. Estruturas químicas dos principais intermediários da síntese da
AFLAB1.
41
Figura 9. Mecanismo de ativação da aflatoxina B1. 41
Figura 10. Biotransformação da AFLAB1 (Adaptada de Hsieh, 1986). 43
CAPITULO III
ARTIGO 1
Figura 1. Curvas de contorno para Y1, Y2 e Y3 para as variávies significativas. 65
Figura 2. Curvas de contorno para Y1’ em função da vazão e temperatura. 68
Figura 3. Curvas de contorno para Y2’ e Y3’ em função da vazão e temperatura. 68
15
Figura 4. Separação cromatográfica das aflatoxinas em CLAE-FL. 68
ARTIGO 2
Figura 1. Taxas de degradação das aflatoxinas nos experimentos (1)
4 x 102 esporos g-1 (A, D), experimento (2) 4 x 104 esporos g-1 (B, E) e
experimento (3) 4 x 106 esporos g-1 (C, F) para os micro-organismos Rhizopus
oryzae e Trichoderma reesei, respectivamente.
90
Figura 2. Taxas de degradação das aflatoxinas em mistura. 91
Figura 3. Valores de glicosamina e ergosterol presentes na biomassa do
Rhizopus oryzae (A, B) e Trichoderma reesei (C, D).
93
ARTIGO 3
Figura 1. Estrutura química das aflatoxinas. 103
Figura 2. Cromatogramas da AFB1 (100 µg kg-1), no tempo de cultivo 0 hora,
para o micro-organismo Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.
110
Figura 3. Cromatogramas da AFLAB1 com Rhizopus oryzae e Trichoderma
ressei.
112
Figura 4. Espectros dos produtos formados pelo Rhizopus oryzae (72, 96 e
120 h).
114
Figura 5. Espectros dos produtos formados pelo Trichoderma ressei (72,96 e
120 h).
115
ARTIGO 4
Figura 1. Estruturas químicas das principais aflatoxinas. 123
Figura 2. Espectros de massa no 5º e 6º dia de cultivo para AFLAB1 isolada. 131
16
Figura 3. Espectros de massa 5º e 6º dia de cultivo para AFLAB1 em mistura. 132
Figura 4. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 1º, 2º e 3º dia. 133
Figura 5. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 4º, 5º e 6º dia. 134
Figura 6. Aflatoxina B1 padrão puro 100 µg kg-1. 135
17
LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS
Acn – Acetonitrila.
AFLAB1 – Aflatoxina B1
AFLAB2 – Aflatoxina B2
AFLAB2a – Aflatoxina B2a
AFLAG1 – Aflatoxina G1
AFLAG2 – Aflatoxina G2
AFLAH1 – Aflatoxina H1
AFLAM1 – Aflatoxina M1
AFLAM2 – Aflatoxina M2
AFLAOL – Aflatoxicol
AFLAP1 – Aflatoxina P1
AFLAQ1 – Aflatoxina Q1
ANOVA – Análise de Variância, do inglês Analysis of variance.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
AOAC – Associação Oficial de Química Analítica, do inglês Association Official
Analytical Chemists.
API – Ionização a Pressão Atmosférica, do inglês Atmospheric Pressure Ionization.
ABD – Ágar Batata Dextrose.
Benz – Benzeno.
CAST – Conselho de Ciências Agrárias e Tecnologia, do inglês Council for Agricultural
Sciences and Tecnology.
CCD – Cromatografia de Camada Delgada.
CCDAE – Cromatografia de Camada Delgada de Alta Eficiência.
CFR – Code of Federal Regulations
CG – Cromatografia Gasosa.
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
CV – Coeficiente de Variação.
DAB – pdimetilaminobenzaldeído.
DCC – Delineamento Composto Central.
DCCR – Delineamento Composto Central Rotacional.
DNA – ácido desoxirribonucleico, do inglês deoxyribonucleic acid.
18
ELISA – Ensaio imunoenzimático, do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.
EM – Espectrometria de Massas.
FAO – Organização para a Alimentação e Agricultura, do inglês Food and Agriculture
Organization
FDA – Food and Drug Administration.
FL – Fluorescencia.
FM – Fase Móvel.
FR – Fase Reversa.
GRAS – Geralmente Reconhecido Como Seguro, do inglês General Recognized as
Safe.
IARC – International Agency for Research on Cancer.
IEN – Ionização por Eletronebulização.
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial.
ISO – International Standard Organisation.
IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada, do inglês International
Union of Pure and Applied Chemistry.
JEFCA – Joint Expert Committee on Food Additives.
LMT – Limites máximos tolerados.
LOD – Limite de Detecção.
LODI – Limite de Detecção do Instrumento.
LODM – Limite de Detecção do Método.
LOQ – Limite de Quantificação.
LOQI – Limite de Quantificação do Instrumento.
LOQM – Limite de Quantificação do Método.
MTT – 3-4,5-dimetiltiazol-2-il,2,5-difeniltetrazolium.
nd – não detectado.
OTA – Ocratoxina A.
QuEChERS – do inglês ... (rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro).
RNA – ácido ribonucleico.
UFLC – Cromatógrafo Líquido Ultra Rápido de Alta Eficiência, do inglês Ultra Fast
Liquid Chromatograph.
UV – Ultravioleta.
20
RESUMO GERAL
A determinação simultânea de aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1,
AFLAG2, e AFLAM1 foram otimizadas utilizando planejamento fatorial considerando as
variáveis dependentes os tempos de retenção, fator de capacidade e resolução como
respostas da separação cromatográfica. As condições ótimas foram alcançadas
utilizando como fase móvel água ultra pura acidificada com ácido acético
(99:1 v/v):acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) numa vazão de 0,6 mL.min-1 e
temperatura da coluna de 45ºC. O procedimento de extração utilizado foi o proposto
por Soares e Rodriguez-Amaya modificado, com recuperções médias de 66; 92; 74; 88
e 71% respectivamente para as aflatoxinas AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e
AFLAB1. A capacidade dos fungos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei para
diminuírem os níveis de AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1 foi avaliado em
razão do número de esporos inicial no inóculo e o tempo de cultivo, onde foram
necessários 4 x 106 esporos.g-1 para que os níveis desta aflatoxinas fossem reduzidos
em aproximadamente 100% pelo Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei. Os fungos
Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei foram cultivados em meios fortificados com
AFLAB1 e os produtos da degradação foram avaliados, onde dez principais
composições moleculares foram produzidas. As estruturas formadas pelo micro-
organismo Rhizopus oryzae foram avaliadas em experimentos da AFLAB1 individual e
em mistura com as outras aflatoxinas, onde os produtos formados desta degradação
mostram que, quando degradada isoladamente a AFLAB1 forma produtos que não
possuem mais características toxigênicas e carcinogênicas, no entanto, quando em
mistura com outras aflatoxinas, os produtos de degradação sem características
toxigênicas são formados em 120 h de cultivo.
Palavras-chave: Biodegradação, Aflatoxinas, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei,
Toxicidade.
21
ABSTRACT
Simultaneous determination of aflatoxins AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1,
AFLAG2 and AFLAM1 were optimized using factorial design considering the dependent
variable retention times, capacity factor and resolution of chromatographic separation
as answers. Optimal conditions were achieved by using as the mobile phase ultrapure
water acidified with acetic acid (99:1 v / v) acetonitrile: methanol (60:8:32 v/v/v) at a
flow rate of 0.6 ml.min-1 and column temperature of 45 °C. The extraction procedure
was proposed by Soares and Rodriguez-Amaya modified recuperções with averages of
66, 92, 74, 88 and 71% respectively for aflatoxins AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2
and AFLAB1. The ability of fungi Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei for
decreasing levels AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 and AFLAB1 and was valued
according to the number of spores in the initial inoculum and cultivation time, which
took 4 x 106 spores.g-1 for that levels of this aflatoxin were reduced by approximately
100% by Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei. The fungi Rhizopus oryzae and
Trichoderma reesei were cultured in medium fortified with AFLAB1 and the degradation
products were evaluated, where ten major molecular compositions were produced. The
structures formed by the micro-organism Rhizopus oryzae were evaluated as the
AFLAB1 individually and in mixture with other aflatoxins, where the degradation
products formed in this show that when degraded alone AFLAB1 to form products with
no more features toxigenic and carcinogenic in However, when mixed with other
aflatoxins, the degradation products are formed without toxigenic characteristics at 120
hours of cultivation.
Keywords: Biodegradation, Aflatoxins, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei, toxicity.
22
1. INTRODUÇÃO GERAL
As micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos
contaminantes de vegetais, matérias primas e alimentos. Estes compostos podem ser
produzidos na planta ou após a colheita e tem preocupado as autoridades sanitárias
de todo o mundo por serem carcinogênicas, neurotóxicas, teratogênicas, depressoras
do sistema imunológico e hematológico (BERTHILLER et al., 2013; SAEGER e
EGMOND, 2012). As espécies de fungos toxigênicos envolvidos na cadeia alimentar
humana pertencem com mais freqüência a três gêneros Aspergillus, Penicillium e
Fusarium e esporadicamente Alternaria (PETERSON 2012; HAVRÁNKOVÁ e
OVESNÁ, 2012; CHANG e EHRLICH, 2013; KOZLOVSKII et al., 2013).
O Aspergillus está entre os gêneros fúngicos que ocorrem em alimentos e
possuem espécies toxigênicas, tais como Aspergillus flavus (KURTZMAN et al., 1987;
CHANG e EHRLICH, 2013), Aspergillus nomius (GOTO et al., 1997; TALUKDER et al.,
2013) e Aspergillus pseudotamarii (ITO et al., 2001; VARGA et al., 2009) produtores
das aflatoxinas. Elas estão classificadas em dois grupos: as
difurocumarociclopentanonas (Aflatoxinas B1 e B2) e as difurocumarolactonas
(Aflatoxinas G1 e G2) (WAGACHA e MUTHOMI, 2008). Os dois grupos estão
associadas a danos em humanos expostos ao consumo continuo de alimentos
contaminados o que resulta no aumento de deficiências nutritivas, imunosupressão e
carcinoma hepatocelular (JENTE et al., 2012; RUADREW et al., 2013; XUEIJIAO et
al., 2013).
A redução de aflatoxinas em alimentos utilizando procedimentos físicos e
químicos ainda não comprovou ser eficaz e economicamente fatível, pois resulta em
perdas nutricionais e tecnologicas (MISHRA e DAS, 2003). Contudo, a
descontaminação biológica empregando bactérias, leveduras e fungos filamentosos
parece ser uma alternativa promissora para degradar aflatoxinas e estabelecer
condições que podem melhorar as características funcionais dos alimentos, visto que
pode ocorrer aumento de nutrientes em materiais lignocelulosicos (OLIVEIRA et al.,
2011)
As bactérias que vêm sendo utilizadas para degradar aflatoxinas são todas
Actinomicetales da subordem Corinebacterineae, como Nocardia corynebacterioides
23
(HORMISCH et al., 2004, ALBERTS et al., 2006), Rhodococcus eritropolis e
Micobacterium fluorantheniorans sp. (TENIOLA et al., 2005). Para biodegradação
fungica de aflatoxinas os principais micro-organismos utilizados são zigomicetos do
gênero Rhizopus sp. e Mucor sp., ascomicetous do gênero Aspergillus níger e
Trichoderma sp. e ainda, basidiomicetous do genero Armillariella tabescens
(ALBERTS et al., 2006). As leveduras são pouco utilizadas para o processo de
biodegradação de aflatoxinas, pois atuam mais como adsorventes do que como
degradadores da estrutura toxica, mas são interessantes pela rapidez de sua
multiplicação (KHLANGWISETP e WU et al., 2010). No entanto, a eficiência de fungos
para utilização de substratos em condições de atividade de água intermediária e baixa
(40 – 70%) os torna interessantes para aplicação em cereais in natura ou parcialmente
processados contaminados com micotoxinass (DORS et al., 2009).
Dentre os materiais passíveis de contaminação micotoxicologica estão os
farelos de cereais, coprodutos abundantes e ainda possuidores de valor nutricional de
destaque. Porém antes de adotar espécies fungicas não toxigenicas para diminuir os
níveis de micotoxinas em alimentos necessários conhecer a real potencialidade deles
e se os produtos resultantes da metabolização são efetivamente menos tóxicos
(CACCIAMANI et al., 2007). As espécies fungicas Rhizopus oryzae (CCT7560) nativa
do arroz e Trichoderma reesei (QM9414) modificada geneticamente para produção de
celulases são produtoras de enzimas consideradas GRAS (Generally Recognized as
Safe) e tem se mostrado promissoras para promover a disponibilização de nutrientes a
partir de farelos de cereais (SCHIMIDT e BADIALE-FURLONG 2012). Sua
multiplicação eficiente nestes materiais usualmente contaminados com aflatoxinas
(DORS et al., 2009) sugere que estes possuem mecanismos enzimáticos para superar
o efeito danoso destes compostos tóxicos (CACCIAMANI et al., 2007).
Para avaliar este potencial pioneiramente é necessário avaliar sua ação
sobre as aflatoxinas, verificar a toxicidade dos produtos de degradação delas,
identificar as principais classes de enzimas envolvidas e potencialmente avaliar a ação
deles nos substratos de interesse (CACCIAMANI et al., 2007).
24
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a biodegradação das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1,
AFLAG2 e AFLAM1 empregando os micro-organismos Rhizopus oryzae (CCT7560) e
Thricoderma ressei (QM9414).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Validar metodologia para extração, detecção e quantificação das
aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1 simultaneamente.
Avaliar o potencial de biodegradação dos fungos Rhizopus oryzae
(CCT7560) e Thricoderma ressei (QM9414) nas aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2,
AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1.
Identificar os produtos formados a partir da degradação da AFLAB1 pelos
fungos Rhizopus oryzae (CCT7560) e Thricoderma ressei (QM9414).
Avaliar a toxicidade dos produtos formados a partir da degradação da
AFLAB1 pelo fungo Rhizopus oryzae (CCT7560).
26
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 FUNGOS
Os fungos são organismos eucarióticos que podem aparecer sob forma
microscópica ou macroscópica (GRIFFIN, 1994; PRICE et al., 2001). Suas formas
unicelulares são conhecidas como leveduras, e formas filamentosas, as hifas
denomidadas bolores, mofos ou fungos. Estas formas fúngicas podem ser
encontradas no solo, na água, em plantas, em animais, no ser humano e em detritos
orgânicos (PRICE et al., 2001).
O corpo de um fungo filamentoso é formado por uma estrutura chamada
micélio constituído por filamentos individuais em forma de tubo, as hifas, que
correspondem a células multinucleadas presentes no ciclo de vida da maioria das
espécies fúngicas (LACAZ et. al., 1998; PAPAGIANNI, 2004). Neste ciclo estão
compreendidas fases reprodutivas sexuadas e assexuadas (Figura 1).
Todos os fungos são heterótrofos e sua digestão é extracelular. Para isto
lançam no ambiente, enzimas que degradam as moléculas orgânicas complexas para
posterior absoção das moléculas menores e mais simples formadas, mecanismo que
lhes confere a classificação de heterótrofos por absorção (GARCÍA-PEÑA et al.,
2001). O modo mais simples de reprodução assexuada de um fungo filamentoso é
conhecido como fragmentação e consiste na ruptura do micélio (SOUZA et al., 2003).
A reprodução fúngica também se da através de células haploides (n) especializadas,
os esporos, formados pelo processo de esporulação. Em algumas regiões do micélio,
existem hifas especiais, que crescem eretas em relação ao substrato. Na extremidade
dessas hifas, há uma estrutura dilatada, de formato esférico, o esporângio em cujo
interior ocorre à produção dos esporos, que são liberados pelo rompimento da parede
do esporângio. Após um período de dispersão, e sob condições ambientais favoráveis,
os esporos podem originar uma nova hifa, processo conhecido como germinação. A
nova hifa pode formar um novo micélio e, assim, dar continuidade a esse ciclo de vida
(SOUZA et al., 2003; RAVEN et al., 2007).
Na reprodução sexuada o mecanismo segue um padrão básico, comum à
maioria dos membros do reino Fungi (SOUZA et al., 2003; PINTO et al., 2004;
RAVEN et al., 2007). Em condições ambientais adequadas, a primeira etapa da
27
reprodução entre fungos distintos é a fusão das hifas haploides (n), que recebe o
nome de plasmogamia (fusão dos citoplasmas). A fusão dos núcleos gaméticos
haploides (n), chamada cariogamia, não ocorre imediatamente após a união
citoplasmática. Assim, a plasmogamia gera uma estrutura celular composta por dois
núcleos haploides (n + n) oriundos de hifas pertencentes a micélios distintos. Por isso
as hifas que resultam desse processo são denominadas dicarióticas. Após um tempo,
os núcleos gaméticos se fundem e originam um zigoto diploide (2n), o qual, por sua
vez, entra em processo de divisão meiótica, produzindo células-filhas que darão
origem a esporos haploides (n) (Figura 1). Os esporos que se formam pelo modo
sexuado são comumente chamados esporos sexuais (SOUZA et al., 2003; RAVEN et
al., 2007).
Figura 1. Esquema das formas de reprodução da maioria das espécies fúngicas.
Segundo a classificação de fungos de Alexopoulos (1996), o Reino dos
fungos está dividido em quatro filos, em função do modo de reprodução sexuada:
Chitridiomicota, Zigomicota, Basidiomicota e Ascomicota. No filo Chitridiomicota estão
identificadas 1000 espécies, a maioria aquáticas, presentes em águas doces, é
considerado o mais primitivo filo dentro dos fungos (ROCHA e ZOTTARELLI, 2002).
28
No filo Zigomicota estão caracterizadas 600 espécies de zigomicetos que
produzem esporos sexuais zigósporos, que permanecem dormentes até que as
condições de atividade de água permitam a nova germinação (TIMOTHY e
O’DONNELL, 2007). Suas hifas são cenocíticas (não têm septo), os zigomicetos vivem
no solo, sobre matéria orgânica animal ou vegetal em decomposição e alguns
são parasitas de plantas e animais (Tanabe et al., 2005). Algumas espécies podem ser
utilizadas para a elaboração de produtos comercialmente valiosos, como molho de
soja, ácidos orgânicos, esteróides para drogas contraceptivas e antiinflamatórias
(TANABE et al., 2005).
No filo Basidiomicota estão classificadas 25.000 espécies onde estão
incluídos fungos conhecidos como os cogumelos, as orelhas-de-pau, parasitas de
plantas e vivem principalmente em ambiente terrestre (MATHENY et al., 2007).
No filo Ascomicota está um grande grupo de aproximadamente 30.000
espécies já descritas. Os fungos de saco, como são conhecidos, pois, seus esporos
sexuais são produzidos em pequenos sacos chamados ascos (DAVID, 2002). Os
ascomicetos variam em complexidade, desde leveduras unicelulares até mofos
multicelulares e fungos em forma de taça. Os ascomicetos desempenham um papel
ecológico importante na degradação de moléculas animais e vegetais resistentes
como a celulose, lignina e o colágeno (DAVID, 2002).
Os fungos cujo estado de reprodução sexuada não é conhecido designam-
se de fungos imperfeitos, ou deuteromicetos, são constituídos por cerca de 20 mil
espécies conhecidas, a maioria saprófaga e parasita. Os gêneros Aspergillus,
Fusarium e Penicillium pertencem a este grupo (RAVEN et al., 2007).
Os deuteromicetos reproduzem-se assexualmente por estruturas
especializadas designadas conidia, que são esporos mitóticos que se formam em
estruturas proprias, os conidióforos. Não há um consenso entre os micologistas em
relação à classificação desses fungos. Dessa forma, os fungos conidiais não
constituem um filo propriamente dito. São encontrados nos meios terrestres e
aquáticos, no ar, no organismo humano, sobre a matéria orgânica de vegetais e
animais vivos ou mortos (SOUZA et al., 2003; RAVEN et al., 2007).
29
3.1.1. Fungos produtores de metabolitos GRAS
O termo GRAS, do inglês Generally Recognized As Safe (GRAS), em
português “Geralmente Reconhecido Como Seguro” é empregado para designar um
produto químico ou substância adicionada ao alimento considerado seguro por
especialistas da Food and Drug Administration (FDA-EUA). Dentre estas substâncias
estão algumas produzidas por fungos filamentosos, tais como Rhizopus oryzae e
Trichoderma reesei, sendo consideradas seguras podendo estes micro-organismos
ser utilizados para fins comerciais (ZHANG e LYND, 2006; KARMAKAR e RAY, 2011).
O fungo Rhizopus oryzae, também conhecido por Rhizopus arrhizus,
pertence ao Filo Zigomicota; classe zigomicetos; ordem Mucorales; família
Mucoraceae; gênero Rhizopus; espécies Rhizopus oryzae. A linhagem de Rhizopus
oryzae é não patogênica e não produtora de toxinas (CFR, 2012a).
A maioria das cepas do Rhizopus foi isolada como componentes ativos na
produção de alimentos ou bebidas alcoólicas orientais na Indonésia, China e Japão
(MERTENS et al., 2006). Em relação à morfologia da colônia pode-se dizer que possui
crescimento rápido a 37ºC ocupando o ambiente de cultivo após 4 dias. Inicialmente
suas hifas possuem coloração branca mudando para marrom acinzentado (Figura 2).
Não se desenvolvem a 45 ºC.
Figura 2. Colônia de Rhizopus oryzae no 1º e 5º dia de cultivo.
As colônias de Rhizopus oryzae possuem os micélios sem septos, os
esporângios são esféricos com diâmetro na faixa de 50 a 300 µm de coloração
30
marrom acinzentado a preto e as hifas podem atingir comprimento de 1500 µm. Os
esporangiósporos são angulares, subesféricos e elipsoidais e com faixas longitudinais
e até 8 µm de comprimento e rizoides formados, geralmente, em grupos de 2 a 3
(Figura 3).
Na indústria o Rhizopus oryzae é utilizado para a produção de amplo
espectro de metabolitos, tais como enzimas, ésteres, ácidos orgânicos, materiais
voláteis, polímeros e álcool. As enzimas extra e intra celulares produzidas pela
espécie são as celulases, hemicelulases, pectinases, tanases, fitases, amilases,
lipases, proteases e outras enzimas de importância industrial (MERTENS e SKORY,
2007; KARMAKAR e RAY, 2011). Além disso, esta espécie é produtora de ácido
láctico. O biodiesel pode ser produzido por metanólise e reações de transesterificação
utilizando famílias específicas de Rhizopus oryzae com as enzimas correspondentes
(KAZUHIRO, et al., 2001).
Figura 3. Imagem microscópica (100 µm) do fungo Rhizopus oryzae (MYCOLOGY,
2012).
Na indústria o Rhizopus oryzae é utilizado para a produção de amplo
espectro de metabolitos, tais como enzimas, ésteres, ácidos orgânicos, materiais
voláteis, polímeros e álcool. As enzimas extra e intra celulares produzidas pela
espécie são as celulases, hemicelulases, pectinases, tanases, fitases, amilases,
lipases, proteases e outras enzimas de importância industrial (MERTENS e SKORY,
2007; KARMAKAR e RAY, 2011). Além disso, esta espécie é produtora de ácido
láctico. O biodiesel pode ser produzido por metanólise e reações de transesterificação
utilizando famílias específicas de Rhizopus oryzae com as enzimas correspondentes
(KAZUHIRO, et al., 2001).
31
A Food and Agriculture Organization (FAO/WHO), Joint Expert Committee
on Food Additives (JEFCA) e Food and Drug Administration (FDA), do Departamento
de Saúde e Serviços Humanos, EUA, certifica que as enzimas extraídas do Rhizopus
oryzae podem ser utilizadas como aditivos alimentares para consumo humano, tendo
possibilitado que estas linhagens de fungos sejam amplamente utilizadas para fins
comerciais (GHOSH e RAY, 2011).
O fungo Trichoderma reesei é classificado como Filo Ascomicota; classe
Sordariomicetos; ordem Hipocreales; família Hipocreaceae; gênero Trichoderma;
espécies Trichoderma reesei considerada não patogênica e não tóxica (CFR, 2012b).
O gênero Trichoderma é um dos mais estudados entre os fungos
filamentosos devido ao seu grande potencial de aplicação industrial (ZHANG e LYND,
2006). Este gênero está amplamente distribuído por todo o mundo e ocorre em quase
todos os tipos de solos e ambientes naturais contendo matérias orgânicas (ZHANG e
LYND, 2006).
As espécies do gênero Trichoderma produzem grandes quantidades de
celulases e outras enzimas hidrolíticas, sendo Trichoderma reesei um conhecido
produtor de múltiplas enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. O gênero é
caracteristicamente reconhecido pela produção de diversos sistemas extracelulares de
enzimas envolvidas na hidrólise de polissacarídeos (PRIETO et al.,1997; ZHANG e
LYND, 2006).
O gênero Trichoderma compreende espécies de fungos filamentosos,
mesofílicos (30°C), que normalmente habitam o solo. O Trichoderma reesei apresenta
hifas septadas, ramificadas (de 5 a 10 μm de diâmetro), polinucleadas, com núcleos
haplóides, que formam colônias brancas que crescem rapidamente formando
superfície de colônias verdes ou amarelas de filamentos de esporulação (Figura 4).
Os filamentos férteis, conidióforos, produzem fileiras laterais com
pequenas fiálides e, os esporos (conídios), geralmente de cor verde com 3 a 5 μm de
diâmetro, são produzidos no extremo da fiálide e agrupados em pequenas massas
(Figura 5).
32
Figura 4. Colônia de Trichoderma reesei no 1º e 5º dia de cultivo.
Figura 5. Imagem microscópica do Trichoderma reesei (400x) (INFANTE et al., 2009).
3.1.2 Fungos Toxigenicos e Micotoxinas
Alguns fungos são capazes de produzir em condições naturais e
laboratoriais, metabolitos secundários tóxicos. Os metabolitos secundários são
compostos biossintetizados e excretados através de um conjunto de vias metabólicas
que embora secundárias sejam essenciais para sobrevivência do organismo sobre
determinadas condições (PETERSON, 2012; RUADREW et al., 2013; KOZLOVSKII et
al., 2013).
Alguns metabolitos secundários fúngicos têm propriedades antibióticas
outros demonstram toxicidade também para animais, esses metabólitos são
designados genericamente de micotoxinas (CAST, 2003; HUSSEIN e BRASEL, 2001).
33
O termo micotoxina tem sua origem da palavra grega “mykes”, que significa fungo, e
do latim “toxicum”, que significa veneno ou toxina (BULLERMAN, 1979).
As micotoxinas são um grupo diverso de substâncias químicas, se
ingeridas por outras espécies podem afetar muitos órgãos e sistemas, principalmente
o fígado, rins e sistema nervoso, endócrino e imunitário. Cerca de 400 tipos de
micotoxinas são conhecidos, embora, somente algumas delas tenham sido
profundamente estudadas (ETZEL, 2002; KHLANGWISET et al., 2011; BOONEN et
al., 2012) e o número das micotoxinas detectadas com frequência em alimentos é
reduzido, entre 20 e 30. A relação entre a micotoxina e o fungo produtor não é única,
uma dada micotoxina pode ser produzida por espécies diferentes, e uma espécie
fúngica pode produzir várias micotoxinas (BERTHILLER et al., 2013).
Os fungos filamentosos responsáveis pela produção de micotoxinas
consideradas mais relevantes para a saúde humana e de animais de criação
pertencem aos generos Aspergillus, Fusarium e Penicillium, que permitem classificar
micotoxinas pela origem fungica (BERTHILLER et al., 2013).
As aflatoxinas são metabólitos biossintetizados por Aspergillus flavus, A.
parasiticus, A. pseudotamari e A. nominus; Fusariotoxinas são as produzidas por
espécies do gênero Fusarium, cujos principais representates são a zearalenona,
fumonisinas e os tricotecenos, e por último as ocratoxinas, produzidas por A.
ochraceus e por diversas espécies do gênero Penicillium (ETZEL, 2002; SKRBIC et
al., 2011; HAVRÁNKOVÁ e OVESNÁ, 2012; KOZLOVSKII et al., 2013).
A exposição a essas toxinas ocorrem predominantemente a partir da
ingestão de alimentos elaborados a base de milho, amendoim, trigo, arroz entre
outros, que podem ser contaminadas com elas. Desta forma as micotoxinas podem
entrar na dieta humana e animal, por meio de contaminação direta ou indireta destes
alimentos (RODRÍGUEZ-AMAYA e SABINO, 2002; MAZIERO e BERSOT, 2010).
Os fungos produtores de micotoxinas podem crescer e produzir suas
toxinas em produtos agrícolas, no campo, no armazenamento, durante o transporte,
na industrialização ou em qualquer outro ponto da cadeia alimentar, desde que as
condições ambientais propiciem estresse ao micro-organismo. A contaminação de
grãos por micotoxinas pode acarretar perdas econômicas também associadas ao
impacto na saúde humana, produtividade animal e comércio internacional destes
produtos, pois, muitos países estabelecem limites para micotoxinas em alimentos,
incluindo o Brasil, Tabela 1. De acordo com a FAO, as perdas mundiais de alimentos
34
contaminados por micotoxinas estão em torno de milhões de toneladas por ano
(CAST, 2003; DUARTE et al., 2010; FAO, 2013).
Tabela 1. Limites máximos tolerados (LMT) para aflatoxinas em alimentos, no Brasil,
aplicação imediata.
Micotoxinas Alimento LMT (µg/kg)
Aflatoxina M1 Leite fluído 0,5
Leite em pó 5
Queijos 2,5
Aflatoxinas
B1, B2, G1, G2
Cereais e produtos de cereais, exceto milho e
derivados, incluindo cevada malteada
5
Feijão 5
Castanhas exceto Castanha-do-Brasil, incluindo
nozes, pistachios, avelãs e amêndoas
10
Frutas desidratadas e secas 10
Castanha-do-Brasil com casca para consumo direto 20
Castanha-do-Brasil sem casca para consumo direto 10
Castanha-do-Brasil sem casca para processamento 15
Alimentos à base de cereais para alimentação
infantil
1
Fórmulas infantis para lactentes e fórmulas infantis
de seguimento para lactentes e crianças de primeira
infância
1
Amêndoas de cacau 10
Produtos de cacau e chocolate 5
Especiarias 20
Amendoim (com casca), (descascado, cru ou
tostado), pasta de amendoim ou manteiga de
amendoim
20
Milho, milho em grão (inteiro, partido, amassado,
moído), farinhas ou sêmolas de milho
20
Fonte: Resolução – RDC Nº 7, de 18 de fevereiro de 2011. (ANVISA).
35
3.1.3 Aspergillus sp.
O gênero Aspergillus foi inicialmente descrito em 1729 pelo botânico Pier
Antonio Michelli, no entanto, Johann Heinrich Friedrich Link em 1809, foi o primeiro a
defini-lo de forma clara (SMITH e ROSS, 1991). Com o advento da microscopia óptica,
em 1856, Rudolf Virchow apresentou as características micromorfológicas do
Aspergillus ssp. associado a lesões pulmonares em papagaios, falcões e no homem
(BENNETT, 2009).
Aspergillus é um gênero composto por mais de 180 espécies anamórficas
aceitas com o telemorfismo descrito em nove gêneros diferentes (PITT e SAMSOM,
2000). Este gênero é dividido em sete subgêneros, que são posteriormente divididos
em seções (KLICH, 2002). Embora o gênero possua mais de 260 espécies bastante
estudadas, sua sistemática ainda está evoluindo (SAMSOM e VARGA, 2009),
especialmente porque muitas espécies do gênero Aspergillus são capazes de produzir
metabólitos tóxicos (Tabela 2).
O gênero é facilmente identificado pelas características do conidióforo,
mas a identificação das espécies e diferenciação é complexa sendo tradicionalmente
realizada através das características morfológicas e mais recentemente por técnicas
moleculares (RODRIGUES et al., 2007).
O Aspergillus flavus pertence ao filo Ascomicota, classe ascomicetos,
ordem Eurotiales e a família Trhichomaceae; gênero Aspergillus, espécie Aspergillus
flavus (KIRK et. al., 2008). As colônias de A. flavus são caracteristicamente verdes ou
amarelo oliva, embora eventualmente possam apresentar coloração amarelo puro,
tornando-se acinzentadas com o decorrer do ciclo de vida (GEISER et al., 2007).
Os conidióforos de A. flavus e A. parasiticus surgem a partir de hifas
vegetativas septadas (Figura 6). As fiálides podem surgir diretamente de uma vesícula
globosa (condição unisseriada) ou a partir da métula que envolve a superfície da
vesícula (condição bisseriada) (CALVO et al., 2012).
A umidade relativa do ar entre 80-90% e temperatura acima de 25ºC
favorece o desenvolvimento de A. flavus, caracterizando-o como fungo de
armazenamento, classificação não apropriada para regiões tropicais, onde esta
espécie também pode ser isolada em grãos recém-colhidos ou durante o cultivo
(CAST, 2003; SHMIDT-HEYDT et al., 2009). O crescimento do A. flavus ocorre a uma
temperatura de 35ºC (SHMIDT-HEYDT et al., 2009) e atividade de água entre 0,76 e
0,94, conforme a espécie (MOUSA et al., 2011). A contaminação por fungos do gênero
36
Aspergillus e a produção de aflatoxinas no campo está frequentemente associada aos
danos causados por insetos e ao estresse do fungo (ARRUS et al., 2005). A espécie
A. flavus destaca-se por ser a mais importante produtora das aflatoxinas AFLAB1 e
AFLAB2 (SAIFELDIN et al., 2012).
Tabela 2. Micotoxinas das principais espécies de Aspegillus.
Espécies Micotoxinas
A. candidus Ácido kojico, candidulina, terfenilina, xantoacina
A. clavatus Citochalasina E, patulina, ascladiol, clavatol, triptoquivalinas
A. carbonarius Rubrofusarin B
A. flavus Aflatoxinas B1 e B2, aflatrem, ácido aspergílico, ácido ciclopiazonico,
ácido kójico, aflavininas, ácido 3-nitropropionico, paspalininas
A. fumigatus Fumitremorginas A e C, gliotoxinas, fumigaclavinas, fumitoxinas,
fumigatinas, fumgilinas, espinulosinas, triptoquivalinas, verruculogen
A. niger Ocratoxinas, malforminas, naptoquinonas
A. nominus Aflatixinas B e G, ácido aspergílico, ácido kójico
A. ochraceus Ocratoxinas, ácido penicílico, ácido kójico, ácido secalonico A,
xantomegnina, viomeleina
A. oryzae Ácido ciclopiazonico, ácido kójico, ácido 3-nitropropiônico
A. parasiticus Aflatoxinas B e G, ácido aspergílico, ácido kójico, aflavininas
A. tamarii Ácido ciclopiazonico, ácido kójico
A. terreus Citrinina, patulina, citreviridina, mevionolina, territrems, ácido terreico,
terramide A
A. ustus Austamida, austidiol, austinas, austocistina
A. versicolor Sterigmatocistina, versicolorinas, nidulotoxinas
A. wentii Metilxantonas, ácido 3-nitropropionico, ácido kójico
Fonte: Adaptado de Cabreira e Gonçalves, 2003.
37
Figura 6. Imagem microscopia do Aspergillus flavus (Adaptado de CALVO et al.,
2012).
3.1.4 Aflatoxinas
A identificação das aflatoxinas ocorreu durante o estudo das causas de um
acidente econômico, em 1960, na Inglaterra, com a morte de 400.000 perus devido a
uma doença sem causa aparente, chamada de “Turkey X Disease”, e que
posteriormente foi associada ao consumo de ração contaminada (ZOLLNER e
MAYER-HELM, 2006). Em 1961 atribuiu-se a ração proveniente do Brasil de conter o
princípio tóxico causador da doença, embora o composto tenha sido detectado
também em rações de outros países (KHLANGWISET et al., 2011). A ração
contaminada chamou a atenção pela abundancia de hifas motivando a preparação do
extrato e a vizualização do composto por cromatografia em camada delgada (CCD)
através de sua fluorescência. A denomiação dele foi aflatoxina cujas fluorescências
azul e verde, sob luz ultravioleta (UV) foram usadas para classifica-las em aflatoxinas
AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 onde a AFLAB1 é a mais tóxica (KELLER et al.,
2005). Duas outras micotoxinas são derivadas hidroxiladas resultantes do
metabolismo das AFLAB1 e AFLAB2, denominadas aflatoxina M1 (AFLAM1) e aflatoxina
M2 (AFLAM2) e têm sido detectadas em leite e seus derivados, urina e fezes de
mamíferos. Estas formas são menos toxicas que a AFLAB1, porém não menos
38
importante por estarem presentes em alimentos infantis (WU e SANTELLA, 2012;
RAHIMI e AMERI, 2012).
A série G das aflatoxinas difere quimicamente da série B pela presença de
um anel 3-lactona, no lugar do anel ciclopentanona. Uma dupla ligação 8,9 é
encontrada na forma de um éter vinil no anel terminal furano nas aflatoxinas B1 e G1,
mas não nas aflatoxinas B2 e G2. Essas variações estruturais estão diretamente
relacionadas com suas atividades fiológicas, sendo as AFLAB1 e AFLAG1
carcinogênicas e consideravelmente mais tóxicas que as AFLAB2 e AFLAG2 (Figura 7)
(JAIMEZ et al., 2000).
A fluorescência característica das aflatoxinas as torna facilmente
identificavies e quantificáveis sob luz ultravioleta (CHIAVARO et al., 2001). Sua
extração das matrizes é realizada empregando solventes como o clorofórmio, metanol
e benzeno, pois é pouco polar e bastante estável a temperatura acima de 150°C. Isto
as torna estáveis sob condições normais de cozimento, pasteurização e torrefação de
alguns tipos de alimentos (SADEGHI et al., 2009; HWANG e LEE, 2006; SIDDAPPA et
al., 2011). Algumas propriedades físicas das principais aflatoxinas estão ilustradas na
Tabela 3.
São mais 20 tipos de moléculas derivadas destas aflatoxinas como as
AFLAP1, AFLAQ1 e aflatoxicol (Figura 8), ocorrem como produtos do metabolismo
fúngico ou da biotransformação hepática. São 23 reações enzimáticas envolvidas na
formação das aflatoxinas, estruturalmente definidos quinze estruturas intermediárias
(GUO ta. al., 2008).
As aflatoxinas presentes nos alimentos têm sido associadas a fatores
desencadeantes do câncer hepático em humanos. A International Agency for
Research on Cancer (IARC, 1993) classificou a AFLAB1 como carcinógeno humano do
Grupo I, portanto a exposição crônica através da dieta, é considerada de risco para a
saúde humana (CALONI et al., 2006; GIRAY, 2007) provocando a aflatoxicose crônica.
O carcinoma hepático decorre de alterações que suprimem o gene P53 e pela
ativação de oncogenes dominantes (KIN-TAK et al., 2003; GIRAY, 2007).
A ingestão de alimentos contaminados em curto prazo ocasiona
aflatoxicose aguda e se caracteriza se por efeitos hepatotóxicos (HUSSEIN e
BRASEL, 2001) causados pela reatividade da forma 8,9-epóxido-AFLAB1, formada
durante a degradação hepática, inibindo a síntese protéica, depressão do metabolismo
de glicose, inibição de síntese de lipídeos, fosfolipídios, ácidos graxos livres, entre
39
outros. Em consequência o sistema imunológico é afetado reduzindo a resistência às
doenças podendo levar a morte (XU et al., 2010).
Figura 7. Estrutura química das principais aflatoxinas.
As doses e o tipo de resposta aos contaminantes é característica da
susceptibilidade de cada espécie animal, idade, estado nutricional e o sexo. Outros
efeitos associados a contaminação com aflatoxinas são cirrose, necrose do fígado,
40
proliferação dos canais biliares, síndrome de Reye (encefalopatia com degeneração
gordurosa do cérebro), hemorragias nos rins e lesões na pele desencadeadas pelo
contato (BOONEN et al., 2012; YANG et al., 2013; HUUSKONEN et al., 2013).
Tabela 3. Propriedades das aflatoxinas.
Aflatoxinas Solventes Comprimento
de onda (nm)
Absortividade
Molar (mol cm-1)
Massa molecular
(g/mol)
B1 Metanol
Benz:acn
(98:2)
Clorofórmio
Heptano
Tolueno
360
350
350
345
350
21800
19800
20600
20300
19100
312
B2 Metanol
Benz:acn
(98:2)
362
350
24000
20900
314
G1 Metanol
Benz:acn
(98:2)
362
350
17700
17100
328
G2 Metanol
Benz:acn
(98:2)
362
350
19300
18200
330
M1 Benz:acn
(9:1)
350 18815 328
Fonte: Adaptado de AOAC (2000).
Estudos epidemiológicos mostraram que a exposição à aflatoxinas
associada com o vírus da hepatite B aumenta o risco de carcinoma hepatocelular, e a
presença desse vírus parece aumentar a potência das aflatoxinas (IARC, 1993). Por
seu efeito mutagênico e carcinogênico, os testes de laboratório e os estudos
epidemiológicos ligam o consumo de aflatoxinas ao aumento da incidência do câncer
de fígado (XU et al., 2010).
41
A absorção das aflatoxinas ocorre no trato gastrintestinal e a sua
biotransformação ocorre primariamente no fígado (PETERSON et al., 2006). As
aflatoxinas ingeridas são lipofílicas de baixa massa molecular e absorvidas por difusão
passiva no intestino, passando para a corrente sangüínea. No sangue cerca de 90%
da AFLAB1 liga-se à albumina e pequenos volumes são distribuídos para diversos
tecidos. O metabolismo hepático se da por ação de oxidorredutases microssomais,
associadas ao citocromo P-450 de onde resultam derivados 8,9-epóxido-AFLAB1 que
confere a atividade toxica mais acentuada se não puder ser excretado, pois pode
atravessar a membrana nuclear e formar adutos com a guanina (STORVIK et al.,
2011; GROSS-STEINMEYER e EATON, 2012; YANG et al., 2012). Para excreção o
derivado hidroxilado é conjugado com ácido glicuronico ou sulfato e carregados
através da urina ou sais biliares (QIAN et al., 2013; JHA et al., 2013).
A molécula da aflatoxina pode ser ativada através de seis diferentes
processos (LUO et al., 2013). As possíveis alterações produzidas na biotransformação
da aflatoxina B1 estão na Figura 9.
A forma ativada da AFLAB1 pode se ligar covalentemente a nucleófilos
celulares como ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA) e proteínas
resultando em lesão bioquímica primária produzida pelas aflatoxinas (BEHROOZIKHA
et al., 1992). A AFLAB1 8,9-epóxido também pode sofrer uma conjugação enzimática
com uma molécula de glutationa reduzida, através de glutationa S-transferase, e ser
excretada na urina ou pela bile (ZORAN et al., 2010). A ligação da AFLAB1-epóxido
com DNA ou RNA do fígado foi demonstrada in vivo e in vitro. Interações deste tipo
são incontestavelmente responsáveis pela carcinogênese e mutagênese das
micotoxinas (YEN et al., 2009; ILIC et al., 2011; YANG et al., 2012).
Esses adutos formados especialmente na molécula de DNA, na posição
N7 ao nível do códon 249 do gene supressor de tumores p53. Eles podemser retirados
da molécula após a sua formação, deixando sítios vagos, que tendem a ser
preenchidos com adenina, resultando em pontos de mutação (KIN-TAK et al., 2003;
HABIB et al., 2006; GOUAS et al., 2009).
42
Figura 8. Estruturas químicas dos principais intermediários da síntese da AFLAB1.
Figura 9. Mecanismo de ativação da aflatoxina B1.
Onde: A = ataque redutivo ou hidratação da dupla ligação do éter vinílico; B = abertura
da estrutura bi-furanóide; C = desmetilação da estrutura metoxicumarina; D = fissão
hidrolítica da lactona cumarínica; E = redução da ciclopentanona; F = hidroxilação em
um ou mais pontos da molécula antes da conjugação (Adaptada de Hsieh, 1986).
O aflatoxicol (AFLAOL) é produzido pela redução da AFLAB1 por uma
enzima citoplasmática NADPH-dependente presente na fração solúvel do fígado. A
43
toxicidade do AFLAOL é aparentemente muito menor que AFLAB1, mas a conversão é
reversível e o AFLAOL pode servir como reservatório de toxicidade da AFLAB1.
AFLAOL pode também ser metabolizado à AFLAM1 e AFLAH1 (RAWAL e
COULOMBE, 2011).
O aflatoxicol (AFLAOL) é produzido pela redução da AFLAB1 por uma
enzima citoplasmática NADPH-dependente presente na fração solúvel do fígado. A
toxicidade do AFLAOL é aparentemente muito menor que AFLAB1, mas a conversão é
reversível e o AFLAOL pode servir como reservatório de toxicidade da AFLAB1.
AFLAOL pode também ser metabolizado à AFLAM1 e AFLAH1 (RAWAL e
COULOMBE, 2011).
Figura 10. Biotransformação da AFLAB1 (Adaptada de HSIEH, 1986).
44
O processo de carcinogênese, demonstrado experimentalmente, envolve,
geralmente, duas fases distintas, a iniciação e a promoção do câncer. A fase de
iniciação é resultante de alterações mutagênicas nas células, ao passo que a de
promoção relaciona-se com a expressão fenotípica das modificações ocorridas na
primeira fase (PARTANEN et al., 2010). Neste contexto, as mutações determinadas
pelas aflatoxinas representam alterações genéticas permanentes nas células afetadas,
o que possibilita a iniciação do processo cancerígeno (RAWAL e COULOMBE, 2011).
Tabela 4. Ocorrência de aflatoxinas no Brasil nos anos entre 2011 e 2013.
Aflatoxinas Matriz Contaminação Estado Referência
B1 G1 B2 G2 Amendoim,
Castanha
6,7 – 36,9 ug/kg DF Andrade et al., 2013
B1 G1 B2 G2 Castanha 0,1 – 8 ug/kg AM– SP Calderari et al., 2013
B1 Milho 2 – 100 ug/kg SP– RJ Keller(a) et al., 2013
B1 G1 B2 G2 Amendoim 1 – 117,8 ug/kg SP Atayde et al. 2012
B1 G1 B2 G2 Chocolate 0,43 – 0,66 ug/kg AM Copetti et al., 2012a.
B1 Amendoim 22 – 87,5 ug/kg RS Hoeltz et al. 2012
M1 Leite, Queijo 10 – 529 ng/kg SP Ilha et al., 2011
B1 G1 B2 G2 Amendoim Nd MG de Lima et al., 2012
B1 G1 B2 G2 Nozes Nd AM Baquião et al., 2012
B1 G1 B2 G2 Amêndoas 0 – 8ug/kg AM Reis et al., 2012
B1 G1 B2 G2 Castanha 1,7 – 35mg/kg AM Freitas-Silva et al.,
2011
B1 G1 B2 G2 Castanha Nd AM Vargas et al., 2011
B1 G1 B2 G2 Cacau Nd AM Copetti et al., 2011b
B1 G1 B2 G2 Amendoim 0,5 – 113 ng/g PR Magrine et al., 2011
M1 Queijo 0,037-0,313 ng/g SP Oliveira et al., 2011
As vias de biotransformação da AFLAB1 variam entre espécies animais
explicando os diferentes graus de susceptibilidade à AFLAB1 entre eles (GROSS-
STEINMEYER e EATON, 2012; KULANTHAIVEL et al., 2012). A presença ou
ausência de citocromo P-450 bem como sua atividade determinam a susceptibilidade
da espécie animal à AFLAB1, dentre outros fatores (HABIB et al., 2006). A maioria das
45
aflatoxinas é excretada entre 72 e 96 horas, o fígado e o rim retem os resíduos por
mais tempo que outros tecidos (BAMMLER et al, 2000; PARTANEN et al., 2010).
Diversos trabalhos têm sido desenvolvidos visando o estudo da ocorrência
de aflatoxinas em alimentos no Brasil em diferentes matrizes. A distribuição dessas
toxinas em tecidos vegetais pode resultar na possibilidade para contaminação dos
produtos de origem animal afetando humanos de forma direta ou indireta (OLIVEIRA
et al., 2003; D’ANGELO et al., 2007). Na Tabela 4 estão alguns relatos de ocorrência
de aflatoxinas em alimentos.
3.1.5 Determinação de aflatoxinas
As micotoxinas possuem uma grande diversidade estrutural e propriedades
físico-químicas entre elas, o que tem levado ao desenvolvimento de uma variedade de
métodos analíticos para sua extração, detecção e quantificação. No caso especifico
das aflatoxinas cujos efeitos sinérgicos e co-ocorrências em matrizes foram muito
estudadas quanto a possibilidade de determinação simultânea (RAHIMI e AMERI,
2012).
Para métodos de extração das aflatoxinas, verifica-se a tendência de
emprego de procedimentos que minimizem o impacto ambiental, o tempo de
exposição dos analistas a solventes tóxicos, direcionando para a proposição de
multimétodos que determinem uma ampla variedade de substancias em uma única
extração (HERNANDEZ-HIERRO et al., 2008; ZOUGAGH e RÍOS, 2008; HANS et al.,
2008).
A contaminação natural das micotoxinas ocorre em concentrações traço
em matrizes complexas como os cereais, onde os interferentes como gorduras e
pigmentos dificultam o preparo da amostra durante a extração e purificação para a
determinação (HANS et al., 2008).
A extração líquido-sólido é a mais utilizada para extrair aflatoxinas, sendo
estas amplamente encontradas em matrizes sólidas. Os métodos são simples
empregando solventes tais como metanol, acetonitrila e água. Sendo a matriz
constituída de compostos hidrossolúveis, os solventes polares (metanol, acetona e
etilacetato) são os mais indicados, no entanto, se a matriz for constituída por
compostos não hidrossolúveis a acetonitrila é o indicado (STROKA et al., 1999).
46
Alguns métodos de extração envolvem a utilização de equipamentos ou
vidrarias, tais como, a utilização de blender, mesa agitadora orbital, ultrassom e gral. O
uso do blender auxilia na extração devido à homogeinização da matriz com o solvente
extrator, necessitando de pouco tempo de análise (SOARES e RODRIGUES AMAYA,
1989). A mesa agitadora orbital, também homogeiniza a matriz com o solvente, no
entanto, necessitando de maior tempo de analise que a utilização do blender, sendo
este, em alguns casos, podendo ser substituído por agitador de tubos ou até mesmo
ultrassom (AMATE et al, 2010; CAPRIOTTI et al, 2010; HACKBART et al., 2011).
Método de extração de dispersão da matriz em fase sólida utiliza gral e
pistilo como mecanismo de homogeineização da matriz com adsorventes adequados
que, em seguida, são eluidos, com auxilido de um cartucho, com solventes
apropriados. Este método vem sendo bastante estudado e empregado em matrizes
com alta atividade de água (RUBERT et al, 2010; CARVALHO et al., 2013). A
microextração em fase sólida pode ser empregada diretamente no extrato de diversas
matrizes, sem a necessidade de tratamentos prévios (NONAKA et al., 2009). A
extração em fase sólida, vem sendo aplicada a muitos anos para análise de diferentes
micotoxinas em diversas matrizes, sendo uma metodologia bastante aplicável pois
permite em uma única etapa a extração, pré concentração e purificação da matriz a
ser analisada (ALCAIDE-MOLINA et al., 2009).
A metodologia de QuEChERS (do inglês rápido, fácil, barato, eficaz,
robusto e seguro) , antes utilizadada para extração de agrotóxicos em matrizes como
cereais, frutas e água, agora vem sendo adaptado para extração de micotoxinas
(HACKBART et al., 2013; BENVENUTTI et al., 2012), este método tem como
vantagem a utilização de menos reagentes, vidrarias e etapas intermediárias
(DESMARCHELIER et al., 2010).
Os tipos de cromatografia utilizadas na separação e detecção de
micotoxinas são: Cromatografia em Camada Delgada (CCD), Cromatografia em
Camada Delgada de Alta Eficiência (CCDAE), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG), além destas, as técnicas hifenadas que
confirmam a identificação como a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à
Espectrometria de Massa (CLAE/EM ou CLAE-EM/EM) e Cromatografia Gasosa
acoplada à Espectrometria de Massa (CG/EM ou CG-EM/EM) (TURNER, 2009).
O método mais popular usado para análise de micotoxinas é CCD, que
permite a determinação simultânea de um grande número de amostras e é mais
47
econômica, porém, apresenta a desvantagem de ser semiquantitativa. A quantificação
empregando imagens fotográficas podem conferir maior exatidão e precisão a
determinação por CCD (NOLL et al., 2007). A CLAE acoplada a detector de
fluorescência é a técnica analítica de separação mais usada para análise de
micotoxinas, devido à sensibilidade, capacidade para efetuar determinações precisas
e de separar espécies não voláteis (TURNER et al., 2009; KRSKA et al., 2008;
MENEELY et al., 2011).
3.1.6 Degradação de aflatoxinas
A remoção de aflatoxinas dos alimentos e nutrientes contaminados por
métodos físicos, químicos ou biológicos (RUSTOM, 1997; MISHRA e DAS, 2003;
ZUCCHI et al., 2008). Estão sendo estudadas, extensivamente, a inativação desses
compostos por métodos físicos e químicos que, têm se mostrado pouco eficientes pois
para produzirem reduções importantes causam danos nutricionais e tecnológicos
(MISHRA e DAS, 2003; MÉNDEZ-ALBORES et al., 2009; TRIPATHI e MISHRA,
2010). A degradação biológica é promissora por propiciar melhoras nas propriedades
funcionais simultaneamente a redução dos níveis das toxinas sob condições
moderadas (ZUCCHI et al., 2008).
Procedimentos menos convencionais que cozimento e autoclavagem, tais
como a extrusão, fotodegradação sob UV, vem se mostrando interessantes, porém os
custos nem sempre são viáveis (SAALIA e PHILIPS, 2011; LIU et al., 2010).
O uso dos solventes metanol, etanol e hexano, e a amoniação são úteis
para aplicação em produtos agrícolas (PRUDENTE e KING, 2002; VELAZHAHAN et
al., 2010). A ozonização é um procedimento químico aprovado pela Food and Drug
Administration, mas como os métodos físicos são de difícil viabilidade econômica
(GUZEL-SEYDIM et al., 2004; ZORLUGENÇ et. al., 2008, FREITAS e VENÂNCIO,
2010, ALENCAR, 2011; SHAN et al., 2012).
Há evidências que as aflatoxinas podem ser metabolizadas por alguns
micro-organismos, que estão sendo avaliados quanto ao seu modo de atuação como
alternativa para degradação biológica bem como suas enzimas, purificadas ou não
(NOGUEIRA et al., 2010).
48
Extratos aquosos obtidos a partir de tecidos vegetais, tais como as
sementes de Trachyspermum Ami, foram efetivos para diminuir em 65% na forma
bruta e 90% na forma purificada a AFLAG1 (VELAZHAHAN et al., 2010).
Extratos de Ageratum conyzoides inibiu o crescimento fungico e a
produção de micotoxina quando aplicado na ordem de 0,1g/mL (NOGUEIRA et al.,
2010).
A bactéria Rhodococcus erythropolis em cultivo submerso reduziu em 96%
os teores de AFLAB1 (KONG et al., 2012). Outras bactérias como a Bacillus subtilis
foram avaliadas em amostras de pistache, com resultados na faixa de 86% e 95% de
degradação da AFLAB1 após 24 h (FARZANEH et al., 2012). Outro estudo utilizando a
mesma bactéria (Bacillus subtilis) foi avaliado para degradação das AFLAB1, AFLAM1
e AFLAG1 em cultivo submerso mostrando percentuais de 81,5%, 60% e 80,7%,
respectivamente (GAO et al., 2011). No mesmo sistema submerso a Pseudomonas
stutzeri, reduziu em 90% a AFLAB1 ao longo de 72 h (LI et al., 2012). A triagem do
potencial de metabolizar compostos cumarinicos por bactérias diversas mostrou que a
Stenotrophomonas maltophilia, reduzia em 82% a AFLAB1 após 72h, sendo o efeito
atribuído a ação de proteases (GUAN et. al. 2008).
Os principais fungos que tem demostrado esta propriedade são, de todas
as classes, os zigomicetos (Rhizopus sp.), os ascomicetos (A. niger e Trichoderma
sp.), agentes patogênicos de plantas (Phoma sp. e Alternaria sp.) bem como os
basidiomicetos (Armillariella) (YAO et al., 1998; LEONOWICZ et al., 1999). Culturas
mistas dos fungos A. niger, Rhizopus oryzae e Bacillus stearothermophilus,
degradaram a AFLAB1 em 80, 70 e 87%, respectivamente. Verificou-se ainda que o
Rhizopus spp. foi capaz de converter a AFLAB1 a compostos isoméricos hidroxilados
(MISHRA e DAS, 2003). Os micro-organismos Aspergillus oryzae e Rhizopus sp.
foram avaliados em relação a sua capacidade de degradação da AFLAB1 e ocratoxina
A (OTA) em amostras de farelo de arroz utilizando fermentação sólida sendo que o
primeiro degradou 80% da AFLAB1 e o segundo 80% da OTA (CACCIAMANI et al.,
2007). Fungos comestíveis como o Pleurotus ostreatus também foi avaliado quanto o
seu potencial degradador de AFLAB1, ficando demonstrado que estge produzia uma
enzima extracelular que degradava 70% da micotoxina no meio (MOTOMURA et al.,
2003).
As enzimas envolvidas na degradação de micotoxinas ainda são pouco
estudada, (TENIOLA et al., 2005; ALBERTS et al., 2006; GRAHAM, 2010; TAYLOR et
49
al., 2010; LAPALIKAR et al., 2012) no entanto, as enzimas extracelulares purificadas
do micro-organismo Myxococcus fulvus tem sido avaliadas quanto a degradação das
AFLAB1, AFLAG1 e AFLAM1, em cultivo submerso demosntrando resultados
interessantes após 48 h (ZHAO et al., 2011). As peroxidases de pimentão,
parcialmente purificada, aplicada a degradação da AFLAB1, degradou 66% após 24 h
de incubação (TRIPATHI e MISHRA, 2010). Associada de ação enzimática e radiação
UV forma eficientes quando aplicada a pimentas (TRIPATHI e MISHRA, 2011). A
lacase, extraída dos micro-organismos Peniophora e Pleurotus ostreatus em cultivo
submerso com álcool e bagaço de cana, atingiram níveis de 40 e 36%,
respectivamente para AFLAB1 (ALBERTS et al., 2010).
3.1.7 Testes de toxicidade
A aflatoxina foi a primeira das micotoxinas a ser investigada quanto aos
seus efeitos tóxicos em aquicultura (LLEWELLYN et al.,1977). Os efeitos biológicos da
AFLAB1 em peixes são diretamente ligados a sua alimentação, idade e espécie do
animal e os efeitos são hepatotóxicos (MANNING et al., 2005; WILLIAMS et al., 2009).
Em vista disto estes vinham sendo usados em testes biológicos, porém, com as
restrições ao uso de animais de laboratório, há a necessidade de desenvolver e
padronizar testes in vitro que possam detectar a toxicidade destes compostos para
extrapolar os efeitos para animais e humanos. Vários métodos in vitro, para avaliar a
toxicidade de diferentes compostos, foram então padronizados utilizando-se culturas
celulares (ROGERO (a) et al., 2000).
Estes testes de toxicidade consistem em colocar o material direta ou
indiretamente em contato com uma cultura de células, verificando-se as alterações
celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a incorporação de corantes vitais
ou a inibição da formação de colônias celulares (ROGERO (b) et al., 2000). O
parâmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade é a viabilidade celular, que pode ser
evidenciada pelo teste de ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Diversar células são utilizadas para investigação do potencial toxigênico
das micotoxinas (TROXEL et al., 1997), dentre elas as células de mamíferos, como
por exemplo as células da linhagem de carcinoma humano (HepG2) onde os efeitos
da AFLAB1 foram estudados em relação a análise de citotoxicidade, a apoptose e a
expressão do p53, avaliados após a exposição a diferentes concentrações de AFLAB1.
50
A citotoxicidade e a expressão da proteína p53 da AFLAB1 diminuíram em comparação
com o controle na maior concentração e 1000 µg L-1 (MCKEAN et al., 2006). Estudo
com a mesma célula HepG2 em coexposição a OTA e AFLAB1 durante 24 horas,
mostrou que a AFLAB1 teve resposta genotóxica após 3 horas de experimento, no
entanto na presença da OTA esses efeitos foram diminuídos ocorrendo após 24 horas,
isto pode ser explicado pela competitividade destas micotoxinas pelo citrocomo P-450,
formando menos adutos de AFLAB1 (CORCUERA, et al., 2011).
As células HepG2 foram tratadas com AFLAB1 (10µM) durante 48 horas
para avaliação de sua viabilidade, onde o resultado não mostrou diferença significativa
em relação ao controle, no entanto houve um aumento dos níveis do mRNA, sugerindo
que esta alteração pode estar estreitamente ligada a toxicidade desta micotoxina
(HANIOKA et al., 2012). Estudos em células podem fornecer um método
biologicamente seguro e eficaz para avaliar a presença de micotoxinas e seus
produtos de degradação em produtos agrícolas.
As células de peixes de aquário, tais como o peixe-zebra (Danio rerio) é
útil como modelo em tais investigações (STERN e ZON, 2003; SAID e HASSAN,
2009). A expectativa de vida curta desses peixes resulta em respostas rapidas,
facilidade e baixo custo de manutenção têm sido citados também como vantagens
para o uso de peixes de aquário em experimentos de carcinogênese in vitro e in vivo
(ACKERMANN e PAW, 2003).
52
ARTIGOS
Neste capítulo encontram-se descritos os procedimentos experimentais
utilizados no desenvolvimento do trabalho, bem como os resultados obtidos, escritos
na forma de artigos científicos com os seguintes títulos:
Artigo 1: Validação de método para extração, detecção e quantificação
cromatográfica das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1
Artigo 2: Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma
reesei
Artigo 3: Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1
pelos micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei
Artigo 4: Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae
e seu potencial carcinogênico
54
Validação de método para extração, detecção e quantificação de
aflatoxinas.
Resumo
Neste trabalho foi validado um método para determinação simultânea
aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e AFLAM1. As condições
cromatográficas foram otimizadas utilizando planejamento fatorial considerando as
variáveis dependentes tempos de retenção, fator de capacidade e resolução como
respostas. Um delineamento composto central rotacional (DCCR) indicou que a fase
móvel ideal constituída pelas proporções de água ultra pura acidificada com ácido
acético (99:1):acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) e com um delineamento composto
central (DCC) a vazão da fase móvel e temperatura da coluna em 0,6 mL.min-1 e 45ºC
foram definidas. Também foram avaliados cinco procedimentos de extração e
purificação dos extratos sendo o proposto por Soares e Rodriguez-Amaya modificado,
o mais adequado indicado pela recuperação média de 66; 92; 74; 88 e 71%
respectivamente para as aflatoxinas AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1.
Palavras chave: aflatoxinas, separação, extração
55
Validation method for the extraction, detection and quantification of
aflatoxins AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and AFM1
Abstract
This work was validated a method for simultaneous determination
aflatoxins AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 and AFM1. The chromatographic conditions were
optimized using factorial design as a tool of study. We defined the dependent variables
(retention times, capacity factor and resolution) that consisted of responses
evaluated. The central composite design (DCCR) was determined that the mobile
phase was composed of the proportions of ultra pure water: acetonitrile: methanol
(60:8:32 v/v/v) and the central composite design (DCC) were defined flow rate of
mobile phase and column temperature at 0.6 ml.min-1 and 45ºC. We also evaluated
five procedures for the extraction and purification of extracts being proposed by Soares
and Rodriguez-Amaya modified the most suitable for the average recovery of 66, 92,
74, 88 and 71% respectively for aflatoxin AFM1, AFG2, AFG1, AFB2 and AFB1.
Keywords: Aflatoxins, separation, extraction.
56
1. INTRODUÇÃO
A determinação simultânea de compostos de ocorrência aleatória em
concentração traço e com estruturas similares, pode ser melhor estabelecida usando
métodos estatísticos que avaliem o efeito combinado de diferentes variáveis
(SOBRINHO et al., 2006; STROKA, 2000).
Neste caso estão as aflatoxinas B1 e B2 (AFLAB1 e AFLAB2) produzidas
por cepas de Aspergillus flavus; as aflatoxinas G1 e G2 (AFLAG1 e AFLAG2)
produzidas pelos A. parasiticus e nominus (SAMSON e VARGA, 2009) que podem
ocorrer simultaneamente em alimentos bem como sua derivada M1 (AFLAM1). A
AFLAB1 é classificada pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC,
2002) como carcinogeno para humanos, pois metabolicamente podem ser produzidos
derivados capazes de atravessar a membrana nuclear e formar adutos com a guanina
(STROKA, 2000) ou transformar-se na AFLAM1 e ser escretada através do leite, urina
e fezes (STROKA, 2000; IHA et al., 2011).
Os diversos métodos analíticos disponíveis para a determinação de
aflatoxinas em alimentos e rações para animais incluem a cromatografia de camada
delgada (CCD), cromatografia de camada delgada de alta eficiência (CCDAE) e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (STROKA e ANKLAM, 2000; ARDIC et
al., 2008; LI et al., 2009; FEDOROWSKI e LACOURSE 2010). A CCD e a CCDAE são
procedimentos simples, econômicos, porém com resultados semiquantitativos ou com
sensibilidade questionável (STROKA e ANKLAM, 2000; OTTA, et. al., 2000). O
método CLAE é rápido e sensível e seu emprego, na detecção e quantificação de
aflatoxinas, em diversos produtos alimentícios, tem sido amplamente utilizado (IQBAL
et al., 2013; EL TAWILA et al., 2013; KHAYOON et al., 2012; LUTFULLAH e
HUSSAIN, 2012). Em qualquer dos sitemas cromatográficos o desafio é a separação
das aflatoxinas cujas propriedades cromatográficas são muito semelhantes (JAIMEZ et
al., 2000).
Após a década de 90, com a disponibilização de equipamentos a CLAE
empregando colunas de fase reversa propiciaram melhor separação das aflatoxinas
(TURNER et al., 2009). Na cromatografia de fase reversa (FR) a separação dos
analitos é determinada principalmente pelas características da fase móvel (AFSAH-
HEJRI et al., 2011). Outros parâmetros que afetam a eficiência da coluna, para
separação, são a vazão da fase móvel, a viscosidade da fase móvel, a temperatura e
57
comprimento da coluna (AFSAH-HEJRI et al., 2011; ZHANG et al., 2013). Estes
fatores são difíceis de serem combinados de forma adequada quando as misturas a
serem separadas são constituídas por estruturas muito semelhantes, como é o caso
das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1 (TURNER et al., 2009).
A modelagem estatística utilizando Delineamento Composto Central (DCC)
é uma ferramenta utilizada para a determinação da relação entre vários parâmetros de
um processo e suas respostas de acordo com os diferentes critérios desejados
(STROKA, 2000). Trata-se, portanto, de procedimento útil para estudos de adequação
de métodos analíticos, pois combinam de forma fatorial, diversos fatores e diminui o
número de experimentos para ajustar as condições operacionais (FU et al., 2008;
GARDA et al., 2005; HACKBART et al., 2012).
Neste trabalho os procedimentos Delineamento Composto Central e
Delineamento Composto Central Rotacional foram utilizados como ferramenta para
investigar o efeito simultâneo das condições cromatográficas em relação à proporção
da fase móvel, vazão da fase móvel e temperatura da coluna, na separação de cinco
aflatoxinas (AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e AFLAM1). Foram avaliados
diferentes métodos de extração, em termos de recuperação, repetitividade, limites de
detecção e quantificação, com o objetivo de disponibilizar um método acessível para
extração e determinação simultânea das cinco aflatoxinas.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1 Instrumentação
Para separação e detecção das aflatoxinas foi utilizado cromatógrafo
líquido Shimadzu Prominende UFLC constituído por um sistema de bombas (LC-AT),
desgaseificador da fase móvel (DGU), controlador (CBM-20A), injetor manual com alça
de injeção de 20 μL (7725i), detecção por fluorescência (FL-10AXL) programada para
comprimento de onda do espectro de excitação de fluorescência máxima ex = 360 nm
e comprimento de onda do espectro de emissão de fluorescência máxima
em = 435 nm. A aquisição de dados foi realizada pelo programa LC Solution. Foi
empregada coluna cromatográfica Nucleosil®, C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm, Bellefonte,
PA, USA).
58
2.2 Padrões analíticos, reagentes e solventes
Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2
e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.
O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau
cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e
separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).
O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),
hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck
(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de
amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de
sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra
diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura
utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração
Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada
com ácido acético glacial (99:1 v/v).
2.3 Preparo de Amostras
As amostras de farelo de arroz foram adquiridas de indústrias do Rio
Grande do Sul. Cerca de 10 kg de amostra foram aleatoriamente coletados,
homogeneizadas e peneiradas. Em seguida as amostras foram embaladas em sacos
de polietileno e armazenadas a 4-8ºC até a sua utilização.
2.4 Preparo das soluções estoque e trabalho
Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila
(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,
AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração
de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo
a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µg.mL-1 para as aflatoxinas
AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg.mL-1 para AFLAM1. As concentrações
foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)
empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e
59
18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,
respectivamente (AOAC, 2000).
2.5 Adequação das condições cromatográficas
O efeito simultâneo das condições cromatográficas em relação à
proporção da fase móvel (água ultra pura acidificada com ácido acético (99:1
v/v):acetonitrila: metanol), vazão da fase móvel e temperatura da coluna, na separação
cromatográfica de cinco aflatoxinas foram avaliados em relação ao tempo de retenção,
fator de capacidade e resolução, em dois planejamentos experimentais.
A matriz do primeiro planejamento experimental 23 com 3 pontos centrais e
pontos axiais (Delineamentos Composto Central Rotacional – DCCR) foi realizado nas
combinações descritas na Tabela 1. De acordo com os resultados do primeiro
planejamento foi realizado um segundo planejamento experimental 22 com 3 pontos
centrais (Delineamento Composto Central – DCC) descrito na Tabela 2.
Para o primeiro planejamento experimental DCCR (Tabela 1) a proporção
da fase móvel (água ultra pura acidificada:acetonitrila: metanol), vazão da fase móvel
e temperatura da coluna foram as variáveis independentes. Neste planejamento
experimental a proporção da fase móvel foi variada com o aumento da porcentagem
de acetonitrila e diminuição de metanol, mantendo a água em 60%.
Para o segundo planejamento experimental DCC (Tabela 2) a vazão da
fase móvel e temperatura da coluna foram as variáveis independentes.
Foram determinados os coeficientes de regressão, análises de variância
(ANOVA) e análises das superfícies de respostas e curvas de contorno (AFSAH-
HEJRI et al., 2011) através do programa Statistica 7.0 utilizando um intervalo de
confiança de 95%, ou seja, p < 0,05. (Anexo).
Tabela 1. Valores utilizados no DCCR para os três fatores.
Variáveis independentes Código Níveis das variáveis independentes
-1,68 -1 0 1 1,68
Proporção da FM* (%) x1 60:10:30 60:8:32 60:6:34 60:4:36 60:2:38
Vazão da FM* (mL.min-1) x2 0,2 0,4 0,5 0,6 0,8
Temperatura (ºC) x3 25 30 40 50 55
* FM: fase móvel: (água ultra pura acidificada com ácido acético (99:1 v/v):acetonitrila: metanol).
60
Tabela 2. Valores utilizados no DCC para os dois fatores.
Variáveis independentes Código Níveis das variáveis independentes
-1 0 1
Vazão da FM* (mL.min-1) x4 0,4 0,5 0,6
Temperatura (ºC) x5 35 40 45
* FM: fase móvel: (água ultra pura acidificada com ácido acético (99:1 v/v):acetonitrila: metanol).
2.6 Determinação das aflatoxinas
Foram testados cinco métodos de extração em termos de resíduos,
recuperação, limites de detecção e quantificação, além da capacidade de extrair as
cinco aflatoxinas simultaneamente.
Os procedimentos de extração foram avaliados (recuperação) em
amostras de farelo de arroz, o estudo foi realizado em três níveis 12,0; 20,0 e
40,0 µg.kg-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 2,0; 4,0 e 8,0 µg.kg-1 para AFLAG2 e
AFLAB2 para o procedimento 1 (método de SOARES e RODRIGUEZ-AMAYA, 1989,
modificado) e 3,0; 5,0 e 10,0 µg.kg-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,05; 0,1 e
0,2 µg kg-1 para AFLAG2 e AFLAB2 para os procedimentos 2 (método QuEChERS
ANASTASSIADES et al., 2003), 3 (método QuEChERS metanol ANASTASSIADES), 4
(método QuEChERS modificado HACKBART et al., 2012) e 5 (método QuEChERS
metanol HACKBART). Os valores dos limites de detecção e quantificação do
instrumento (LODi e LOQi) multiplicados pelos fatores de diluição para o método de
extração resultou nos limites de detecção (LODm) e quantificação do método (LOQm).
O método de extração e purificação descrito por Soares e Rodriguez-
Amaya (1989), procedimento 1, foi modificado visando à minimização da quantidade
de amostra e solventes extratores utilizados e, consistiu, no uso de 10g de amostra de
farelo de arroz, homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio
4% (9:1 v/v) por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do
filtrado e adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10cm3 de terra diatomácea.
A mistura foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida
filtrada novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e
adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com
10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e
os frascos secos armazenados a -18ºC.
61
O método de extração QuEChERS descrito por Anastassiades et al.
(2003), procedimento 2, foi aplicado com modificações. O método consistiu no uso de
10g de amostra de farelo de arroz homogeneizadas com 10 mL de água destilada em
tubo de teflon® de 50 mL, onde foram adicionados 10 mL de acetonitrila. Os tubos
foram agitados manualmente durante 1 min. Após foram adicionados 4 g de sulfato de
magnésio e 1 g de cloreto de sódio seguido de nova agitação durante 1 min. O
material foi centrifugado a 3220xg durante 8 min, o sobrenadante foi recolhido em tubo
de teflon® e a este foram adicionados 0,15 g de sulfato de magnésio e 0,25 g de terra
diatomácea seguido de agitação manual durante 1 min. A separação foi realizada por
centrifugação a 3220xg por 8 min. O sobrenadante foi recolhido e os frascos contendo
os resíduos secos e armazenados a -18ºC. Este método foi repetido utilizando metanol
como solvente extrator, procedimento 3, sendo identificado como QuEChERS metanol
Anastassiades.
O método de extração QuEChERS descrito por Hackbart et al. (2012),
procedimento 4, consistiu na adição de 10g de amostra de farelo de arroz em
erlenmeyer ao qual foram adicionados 10 mL de água destilada e 10 mL de acetonitrila
acidificada com 0,2 mL de ácido acético glacial. A homogeneização foi realizada em
mesa agitadora orbital durante 10 min, a 200 rpm, com adição de 1,50 g de sulfato de
magnésio e 0,85 g de acetato de sódio e nova agitação durante 10 min, a 200 rpm. O
material foi centrifugado por 8 min, a 3220xg, ao sobrenadante foram adicionados
0,30 g de sulfato de magnésio e 0,20 g de terra diatomácea, agitados manualmente
durante 1 min e nova centrifugação por 8 min a 3220xg. O sobrenadante foi seco e os
frascos armazenados a -18ºC. Este método foi repetido utilizando metanol como
solvente extrator, procedimento 5, sendo identificado como QuEChERS metanol
Hackbart.
2.7 Validação da técnica cromatográfica
Após a adequacidade das condições ótimas de separação, a técnica
cromatográfica foi validada de acordo com os parâmetros sugeridos pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2011), pelo Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO, 2003) e de acordo com o protocolo
da União Internaciona de Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and
Applied Chemistry - IUPAC/AOAC/ISO, HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000). Na
62
maioria dos casos, os métodos devem obedecer a um intervalo de recuperação de 70
- 110% com desvio padrão e desvio padrão relativo de 20% e 30%, respectivamente
(HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000).
Os parâmetros considerados na validação foram limites de detecção e
quantificação, curva analítica, linearidade, seletividade e recuperação. Os limites de
detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do instrumento (LODi e LOQi,
respectivamente) foram estimados considerando-se pelo menos 3 e 10 vezes a razão
entre o sinal pela linha de base (ruído), respectivamente. Os limites instrumentais
foram obtidos por padronização externa com a preparação de soluções analíticas de
diferentes concentrações na fase móvel. Os valores de LODi e LOQi multiplicados
pelos fatores de diluição para o método de extração resultou nos limites de detecção
(LODm) e quantificação do método (LOQm) estimado. Para construir a curva analítica
foram preparadas soluções analíticas nas concentrações de 2,0; 20,0; 30,0; 45,0; 75,0;
e 100 ng.mL-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e
2,0 ng.mL-1 para AFLAG2 e AFLAB2. Cada ponto da curva analítica foi injetada em
triplicata e os dados de regressão linear foram obtidos com auxílio do programa LC
Solution. Foram consideradas com boa linearidade curvas com valores de R2 > 0,90
(HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000). A seletividade foi avaliada comparando o sinal
gerado pela injeção da matriz isenta das aflatoxinas e desta adicionada de padrão
(HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000; RIBANI, 2004).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Adequação das condições cromatográficas
As variáveis independentes, proporção da fase móvel (x1), vazão da fase
móvel (x2) e temperatura da coluna (x3), foram estudadas no primeiro planejamento
(DCCR) para obter redução do tempo de retenção (Y1) sem perda no fator de
capacidade (Y2) e resolução (Y3) dos analitos, estabelecendo-se como tempo total de
corrida de no máximo 30 min. (Tabela 3), uma vez que corridas longas propiciam
alargamento de picos, tempo de análise limitante, gasto de solventes e geração de
resíduos. Os resultados da análise estatística, aplicados aos dados experimentais Y1,
Y2 e Y3 foram determinados através de SS residual e o efeito estimado indica o quanto
cada fator influiu nas respostas. A ordem de eluição das aflatoxinas nas condições
63
estudadas foi AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1. O tempo de retenção
esperado para a AFLAM1, primeira a eluir, era ao redor de 7 min, e o tempo de
retenção esperado para a AFLAB1, última a eluir, era de no máximo 25 min.
Os parâmetros estatísticos teste t e valor p (p < 0,05) foram utilizados para
confirmar a significância dos efeitos dos fatores estudados, sendo o erro puro
associado aos experimentos e calculado pelos pontos centrais para demonstrar a
repetibilidade do processo (TEÓFILO e FERREIRA, 2006).
Os valores dos tempos de retenção (Y1), fator de capacidade (Y2) e
resolução (Y3) foram empregados para calcular os coeficientes de regressão onde
este, foi altamente significativo (p < 0,05), mostrando que existe boa repetibilidade dos
dados experimentais e descrevendo as respostas Y1, Y2, e Y3 (variáveis dependentes)
em função das variáveis independentes x1, x2 e x3, em modelos de primeira e segunda
ordem. Para o ajuste do modelo que pode predizer o tempo de retenção (Y1), o fator
de capacidade (Y2) e a resolução (Y3), em função da proporção da fase móvel (x1),
vazão da fase móvel (x2) e temperatura da coluna (x3) foi utilizada análise de variância
(ANOVA) para avaliar a validade do modelo ajustado (TEÓFILO e FERRERIA, 2006).
(Anexo 1).
As variáveis dependentes Y1,Y2 e Y3 apresentaram valores de Fcal
superiores ao Ftab para todos os casos, valores superiores a 3 (Fcal/Ftab), mostrando
que todos os modelos foram preditivos. No entanto, os coeficientes de regressão não
apresentaram valores superiores a 0,90 para todos os casos, portanto não foram
preditivos e significativos. (Anexo 2).
Apenas os tempos de retenção (Y1) e fator de capacidade (Y2) da AFLAB2
e AFLAB1, apresentaram valores preditivos e significativos para gerar curvas de
contorno dos efeitos x1, x2 e x3. A resolução (Y3) apresentou valores preditivos e
significativos para as AFLAM1, em todas as variáveis independentes (x1, x2 e x3),
AFLAG2 e AFLAG1 para as variáveis x1 e x3 (Figura 1).
Os melhores tempos de retenção ocorreram na menor vazão da fase
móvel (x2) e menor temperatura da coluna (x3) para AFLAB2 e AFLAB1 (Figura 1 A, B).
No entanto, para variável x2, os tempos de retenção são superiores a 30 min, assim,
foi considerado apenas o resultado para a variável x3 com tempos de retenção de 19,8
e 24,5 min para AFLAB2 e AFLAB1, respectivamente. O melhor fator de capacidade
(valores superiores a 0,5) ocorreu na menor proporção da fase móvel (x1) e
temperatura da coluna (x3) para AFLAB2 e AFLAB1 (Figura 1 C, D). Na resolução os
64
melhores valores para AFLAG2 e AFLAG1 ocorreram na menor temperatura da coluna
(Figura 1 E, F). Para a AFLAM1 observa-se que a melhor resolução foi alcançada na
menor proporção e vazão da fase móvel e maior temperatura (Figura 1 G, H).
Os resultados mostraram que a proporção da fase móvel tinha efeito
significativo sobre a maioria das respostas, portanto, um parâmetro crítico. As
aflatoxinas são compostos hidrofóbicos ligeiramente solúveis em solventes polares e
em CLAE eluem em ordem descrescente de polaridade (Turner et al., 2009), assim, as
respostas referentes a uma eficiente separação (fator de capacidade e resolução)
foram alcançadas pela proporção correta de água, metanol e acetonitrila. A proporção
da fase móvel água ultra pura acidificada:acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) foi a que
resultou nos melhores valores de tempo de retenção que não ultrapassaram 30 min.,
valores de fator de capacidade entre 0,5 e 10, e valores de resolução acima de 1
semelhante ao de outros autores (CHIAVARO et al., 2001; TURNER et al., 2009).
A influência da vazão da fase móvel e temperatura da coluna, não
puderam ser definidas neste experimento, tornando necessária a realização de um
novo planejamento experimental (Tabela 2) para ajustar a temperatura da coluna (x4) e
vazão da fase móvel (x5) das condições cromatográficas. A Tabela 4 apresenta a
matriz do segundo planejamento fatorial DCC estudado considerando novamente o
tempo de retenção (Y1’), fator de capacidade (Y2’) e resolução (Y3’) como variáveis
respostas.
Os coeficientes de regressão foram calculados com um intervalo de
confiança de 95% (p < 0,05), onde estes mostraram boa repetibilidade dos dados
experimentais descrevendo as respostas das variáveis dependentes Y1’, Y2’ e Y3’
como em função das variáveis independentes x4 e x5, em modelos de primeira ordem
(Tabela 5). Para o ajuste do modelo foi utilizada análise de variância (ANOVA) para
avaliar a validade do modelo ajustado, onde os valores de Fcal superiores ao Ftab foram
considerados preditivos e significativos. (Anexo 4).
Os modelos preditivos e significativos foram utilizados para gerar as
curvas de contorno. Para o tempo de retenção (Y1’) todas as aflatoxinas apresentaram
valores preditivos e significativos (Figura 2). Para a capacidade de separação (Y2’)
apenas as AFLAG1 e AFLAB2 e para a resolução (Y3’) as aflatoxinas AFLAM1, AFLAG2
e AFLAG1 apresentaram esses valores (Figura 3).
65
Tabela 3. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de capacidade e resolução das aflatoxinas estudadas.
Exp. x1 x2 x3 (Y1) Tempo de Retenção (Y2) Fator de capacidade (Y3) Resolução
M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1
1 -1 -1 -1 13,86 14,61 17,78 22,61 27,81 0,19 0,25 0,53 0,94 1,39 2,66 1,29 4,73 5,44 4,85
2 1 -1 -1 12,85 13,92 16,74 20,80 25,31 0,18 0,28 0,54 0,91 1,32 2,46 1,81 4,12 5,03 4,69
3 -1 1 -1 9,34 9,83 11,93 15,17 18,63 0,18 0,25 0,52 0,93 1,36 2,56 1,24 4,27 5,39 4,76
4 1 1 -1 8,60 9,32 11,20 13,91 16,91 0,16 0,26 0,51 0,88 1,28 2,05 1,76 3,99 4,87 4,53
5 -1 -1 1 9,78 10,24 11,92 14,71 17,34 0,18 0,24 0,44 0,78 1,09 2,93 1,10 3,31 4,33 3,44
6 1 -1 1 9,16 9,79 11,29 13,71 16,05 0,17 0,25 0,44 0,75 1,05 2,66 1,45 2,96 4,10 3,31
7 -1 1 1 6,51 6,82 7,92 9,76 11,50 0,18 0,23 0,43 0,77 1,08 2,71 1,08 3,32 4,45 3,53
8 1 1 1 6,16 6,59 7,59 9,22 10,57 0,17 0,26 0,45 0,76 1,05 2,50 1,11 2,98 4,19 3,38
9 -1,68 0 0 9,60 9,95 11,91 15,02 18,18 0,19 0,24 0,48 0,87 1,26 2,96 0,98 4,26 5,09 4,25
10 1,68 0 0 8,34 9,08 10,65 12,94 15,3 0,18 0,28 0,50 0,83 1,17 2,25 1,79 3,22 4,11 3,72
11 0 -1,68 0 22,11 23,43 27,66 32,10 36,55 0,18 0,24 0,47 0,86 1,24 2,85 1,36 4,32 5,89 3,31
12 0 1,68 0 5,69 6,05 7,15 8,88 10,6 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,17 1,31 3,46 4,38 3,81
13 0 0 -1,68 11,99 12,84 15,67 19,87 24,51 0,16 0,24 0,51 0,92 1,36 2,18 1,55 4,41 5,28 4,76
14 0 0 1,68 5,89 6,22 7,13 8,66 10,05 0,17 0,24 0,42 0,73 1,00 2,64 1,22 2,90 4,13 3,18
15 0 0 0 8,97 9,53 11,26 13,97 16,71 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,35 1,38 3,60 4,64 3,94
16 0 0 0 8,94 9,51 11,23 13,94 16,66 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,45 1,32 3,51 4,55 3,92
17 0 0 0 8,96 9,52 11,25 13,95 16,69 0,18 0,26 0,48 0,84 1,20 2,4 1,37 3,55 4,60 3,93
Exp. Experimentos; x1: proporção da fase móvel; x2: vazão da fase móvel; x3: temperatura; M1, G2, G1, B2, B1.: aflatoxinas. (Anexo 3).
66
Figura 1. Curvas de contorno para Y1 para AFLAB2 (A), AFLA B1 (B) Y2 para AFLAB2
(C), AFLA B1 (D) e Y3 AFLAG2 (E), AFLA G1 (F) e AFLAM1 (G,H) para as variávies
significativas.
67
Para o tempo de retenção (Y1’), em todos os casos, o comportamento foi
semelhante entre as aflatoxinas estudadas, onde o melhor experimento ocorreu na
maior vazão da fase móvel e maior temperatura da coluna com tempos de retenção de
11,6; 12,6; 15,0; 18,6 e 22,4 min. para AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1,
respectivamente. Para a capacidade de separação (Y2’) (Figura 3 A, B) observa-se
que as melhores condições foram a maior vazão e temperatura da coluna resultando
em valores de 0,18; 0,28; 0,52; 0,88 e 1,27 para as AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1,
AFLAB2 e AFLAB1, respectivamente. No entanto, a diminuição da temperatura da
coluna não promoveu grandes alterações nos valores da capacidade de separação
(Tabela 4). Para a resolução (Y3’) (Figura 3 C, D, E) observa-se que os melhores
experimentos ocorreram na maior temperatura e maior vazão para as AFLAG2 e
AFLAG1, sendo que apenas para AFLAM1 a menor vazão promoveu uma melhora na
resolução. Assim, para a resolução os valores alcançados foram de 2,34; 1,71; 3,67;
4,52 e 4,08 para AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1 respectivamente. A
separação cromatográfica alcançada para a condição estabelecida de detecção e
separação da cinco aflatoxinas no CLAE-FL (Figura 4) foi constituída de proporção de
fase móvel de 60:8:32 (água ultra pura acidificada:acetonitrila: metanol), vazão da fase
móvel de 0,6 mL.min-1, temperatura da coluna de 45ºC e tempo total de corrida de
25 min.
3.2 Validação da técnica cromatográfica
Os parâmetros de validação estabelecidos foram de limites de detecção e
quantificação de 0,75 e 2,0 ng.mL-1 para as AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,03 e
0,1 ng.mL-1 para AFLAG2 e AFLAB2, estando estes de acordo com o recomendado
pelos órgãos de legislação e fiscalização. As linearidades ficaram na faixa de 2,0-
100 ng.mL-1 para AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,1 - 2,0 ng.mL-1 para AFLAG2 e
AFLAB2. O modelo de regressão linear foi adequado para a determinação, pois os
coeficientes de correlação (R2) foram maiores que 0,90, e os coeficientes de variação
abaixo de 20%, conforme recomendação do INMETRO, ANVISA e IUPAC. A técnica
mostrou-se seletiva, pois nenhum interferente da amostra eluiu nos mesmos tempos
de retenção das aflatoxinas estudadas. As curvas analíticas (y=ax+b) tiveram valores
de 5,33 106 + 2187,57; 3,92 108 - 20977,1; 6,01 106 + 7027,42; 4,14 108 +
15828,8 e 1,16 107 + 23445,2 para AFLAM1, AFLAG2, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1,
respectivamente.
68
Tabela 4. Valores codificados e respostas do tempo de retenção, fator de capacidade e resolução das aflatoxinas, no planejamento DCC.
Exp. x4 x5 (Y1’) Tempo de retenção (Y2’) Fator de capacidade (Y3’) Resolução
M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1 M1 G2 G1 B2 B1
1 1 1 11,6 12,5 15,0 18,5 22,4 0,18 0,28 0,52 0,88 1,27 2,34 1,71 3,67 4,52 4,08
2 -1 1 9,94 10,7 12,5 15,2 18,0 0,18 0,27 0,48 0,80 0,89 2,52 1,49 3,08 3,96 1,26
3 1 -1 7,86 8,56 10,1 12,4 15,0 0,18 0,27 0,51 0,87 1,25 2,21 1,64 3,60 4,51 4,09
4 -1 -1 6,61 7,10 8,33 10,1 11,9 0,18 0,27 0,47 0,80 1,12 2,42 1,45 3,06 4,04 3,49
5 0 0 8,62 9,31 10,91 13,5 16,0 0,18 0,27 0,52 0,85 1,18 2,36 1,56 3,39 4,26 3,78
6 0 0 8,65 9,31 10,90 13,3 16,1 0,18 0,27 0,50 0,82 1,17 2,39 1,58 3,33 4,28 3,77
7 0 0 8,61 9,33 10,93 13,5 16,3 0,18 0,27 0,55 0,84 1,19 2,37 1,55 3,35 4,23 3,76
Exp. Experimentos. x4.: vazão da fase móvel; x5.; temperatura da coluna.; M1, G2, G1, B2, B1.: aflatoxinas. (Anexo 5).
Tabela 5. Equações que descrevem as repostasm previstas pelo modelo em função das variáveis independentes.
Aflatoxinas Equações dos modelos ajustados
Tempo de retenção (Y1’) Capacidade de separação (Y2’) Resolução (Y3’)
AFLAM1 -
AFLAG2
AFLAG1
AFLAB2
AFLAB1 -
x4: vazão da fase móvel; x5: temperatura da coluna.; AFLA.; aflatoxina.; (-) não apresentaram valores significativos.
69
Figura 2. Curvas de contorno para Y1’ em função da vazão e temperatura.
Figura 3. Curvas de contorno para Y2’ para as AFLAG1 (A), AFLAB2 (B) e Y3’ para as AFLAM1 (C), AFLA G2 (D) e AFLAG1 (E) em função da vazão e temperatura.
70
Figura 4. Separação cromatográfica das aflatoxinas M1, G2, G1, B2 E B1 em CLAE-FL.
3.3 Validação do método de extração e purificação
Os valores de recuperação e repetibilidade de cada procedimento,
quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de
fluorescência (Tabela 6) foram satisfatórios, sendo o método preconizado por Soares e
Rodrigues Amaya (1989), o que teve melhores resultados de recuperação para todas
as aflatoxinas estudadas, mesmo com a redução da massa inicial da amostra. As
recuperações médias foram de 66,0; 92,3; 74,3; 88,4 e 70,7% para AFLAM1, AFLAG2,
AFLAG1, AFLAB2 e AFLAB1, respectivamente. Os limites de detecção e quantificação
do método de 0,3 e 0,8 µg.kg-1para as AFLAM1, AFLAG1 e AFLAB1 e 0,012 e
0,04 µg kg-1para AFLAG2 e AFLAB2, estando estes de acordo com o recomendado
pelos órgãos de legislação e fiscalização.
O método de Soares e Rodrigues Amaya (1989) e CLAE-FL, após ser
validado, foram aplicados para determinação dos residuais de aflatoxinas em estudos
de biodegradação utilizando os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma
ressei.
71
Tabela 6. Recuperação para as cinco aflatoxinas estudadas nos métodos de extração.
Aflatoxinas Procedimento 1 Procedimento 2 Procedimento 3 Procedimento 4 Procedimenot 5
Fortif
(µg kg-1)
Rec
(%)
CV
(%)
Fortif
(µg kg-1)
Rec
(%)
CV
(%)
Fortif
(µg kg-1)
Rec
(%)
CV
(%)
Fortif
(µg kg-1)
Rec
(%)
CV
(%)
Fortif
(µg kg-1)
Rec
(%)
CV
(%)
AFLAM1 12 66,2 3,4 1 10,9 2,3 1 48,9 4,2 1 10,2 5,9 1 10,0 2,7
20 62,7 4,1 3 11,3 4,1 3 51,1 3,7 3 8,8 3,1 3 9,9 5,1
40 69,1 1,2 5 9,8 6,0 5 43,2 4,5 5 9,1 4,2 5 10,3 2,9
AFLAG2 2 90,2 1,8 0,05 28,3 3,4 0,05 60,1 2,1 0,05 59,8 1,2 0,05 66,0 8,1
4 92,7 1,3 0,1 23,4 1,6 0,1 57,2 3,1 0,1 60,1 6,3 0,1 59,1 7,8
8 94,1 1,6 0,2 24,6 2,7 0,2 61,3 4,0 0,2 66,0 3,3 0,2 62,3 2,1
AFLAG1 12 77,1 2,6 1 15,0 7,1 1 40,2 2,4 1 27,9 5,7 1 18,7 2,5
20 76,0 3,8 3 19,2 2,6 3 46,2 6,1 3 30,9 2,8 3 17,9 3,8
40 69,9 1,2 5 18,1 4,9 5 41,1 3,9 5 26,4 2,8 5 22,0 2,3
AFLAB2 2 88,9 1,1 0,05 34,6 5,6 0,05 63,3 6,1 0,05 77,0 4,4 0,05 59,2 7,1
4 89,1 2,0 0,1 34,0 9,5 0,1 67,1 6,9 0,1 69,9 4,9 0,1 63,1 7,3
8 87,3 1,1 0,2 36,2 3,9 0,2 68,0 2,5 0,2 71,1 2,1 0,2 60,6 2.8
AFLAB1 12 68,9 4,2 1 18,6 5,8 1 50,5 5,7 1 47,8 2,1 1 19,9 3,9
20 72,4 2,6 3 21,9 3,9 3 50,1 4,9 3 48,8 1,6 3 23,4 6,1
40 70,9 3,7 5 17,0 4,9 5 48,8 3,1 5 50,3 5,0 5 36,1 4,3
Procedimento 1.: Soares e Rodriguez-Amaya; Procedimento 2.: QuEChERS Anastassiades et al., 2003; Procedimento 3: QuEChERS metanol Anastassiades; Procedimento 4:
QuEChERS modificado Hackbart et al., 2012: Procedimento 5: QuEChERS metanol Hackbart.
72
4. CONCLUSÃO
O primeiro procedimento DCCR indicou a proporção da fase móvel ideal
de 60:8:32 (v/v/v) constituida de água ultra pura acidificada:acetonitrila:metanol, e o
segundo procedimento DCC indicou que a vazão da fase móvel e temperatura da
coluna ideais de 0,6 mL.min-1 e 45ºC. O método preconizado por Soares e Rodriguez-
Amaya, modificado para minimização da utilização de amostra e solvente extrator, foi
o que apresentou melhores recuperações médias das cinco aflatoxinas estudadas.
Esta metodologia proposta (técnica de detecção, quantificação e método de extração)
representa uma análise útil a ser usada como ferramenta na determinação simultanea
de aflatoxinas em farelo de arroz uma matriz complexa.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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77
Biodegradação de Aflatoxinas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei
Resumo
Este trabalho avaliou a capacidade dos fungos Rhizopus oryzae e
Trichoderma reesei para diminuírem os níveis de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1 tendo
como variáveis o número de esporos inicial no inóculo e o tempo de cultivo. Para
tanto, o cultivo dos micro-organismos foi realizado previamente em meio Agar Batata
Dextrose 4% (ABD) contaminado e as micotoxinas residuais foram determinadas a
cada 24 h empregando CLAE-FL. Foram necessários 4 x 106 esporos.g-1 e 96 h de
cultivo para as aflatoxinas B1 e G1 e 120 h para as aflatoxinas B2, G2 e M1, serem seus
níveis reduzidos em aproximadamente 100% pelo Rhizopus oryzae. Com o
Trichoderma reesei as aflatoxinas B1, B2 e M1 atingiram estes níveis em 96 h e a
aflatoxina G1 em 120 h. A maior taxa de degradação ocorreu após 96 h no meio de
cultivo Rhizopus oryzae.
Palavras-chave: Biodegradação, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei, aflatoxinas.
78
Biodegradation of aflatoxins by Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei
Abstract
This study evaluated the ability of the fungi Rhizopus oryzae and
Trichoderma reesei to reduce the levels of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and M1; the
variables were the initial number of spores in the inoculum and the culturing time.
Microorganism culturing was previously conducted in contaminated Potato Dextrose
Agar 4% (PDA) medium and the residual mycotoxins were determined every 24 hours
by HPLC-FL. Aflatoxins B1 and G1 needed 4 x 106 spores g-1 and a 96 hour culturing
time whereas aflatoxins B2, G2 and M1 needed 120 hours to have their levels reduced
by approximately 100% by Rhizopus oryzae. With Trichoderma reesei, aflatoxins B1, B2
and M1 reached these levels in 96 hours and aflatoxin G1, in 120 hours. The highest
rate of degradation occurred after 96 hours in the Rhizopus oryzae culture medium.
Keywords: Biodegradation, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei, aflatoxins.
79
1. INTRODUÇÃO
A contaminação de alimentos por espécies fúngicas degradadoras ou
toxigênicas é determinada por uma série de variáveis bióticas e abióticas, o que torna
difícil a obtenção de matérias primas onde estes micro-organismos não estejam
presentes (BETINA, 1989; CAST, 2003). O problema se agrava no caso de infecção
por espécies toxigênicas, cuja produção de micotoxinas pode ocorrer aleatoriamente
(ETZEL, 2002). Fato que norteia a busca por estratégias que propiciem a redução dos
níveis de compostos tóxicos produzidos por estas espécies (GARDA-BUFFON et. al.,
2005).
As condições de processo e preparo de produtos alimentícios eliminam
formas viáveis dos micro-organismos, mas não das micotoxinas por eles produzidas,
que em geral, possuem estruturas estáveis, inclusive em condições extremas de pH e
temperatura (TANIWAKI E SILVA 2001; GARDA-BUFFON et. al., 2005). Para evitar o
dano toxicológico o que se busca é alterar na estrutura das micotoxinas o grupamento
responsável pelo efeito biológico, utilizando mecanismos físicos, químicos ou
biológicos de descontaminação (MISHRA e DAS, 2003; CANCIAMANI et.al., 2005;
SAALIA e PHILLIPS, 2010).
As aflatoxinas constituem uma família de contaminantes amplamente
distribuídas em diferentes alimentos, produzidas por espécies toxigênicas de
Aspegillus. Entre elas, destaca-se a aflatoxina B1, classificada pela IARC (1993) como
cancerígena que, simultaneamente, pode, com outras aflatoxinas, ter seu efeito
potencializado (CARBONE et. al., 2007, DE PEÑA, 2007). Aflatoxicose é a
denominação do conjunto de sintomas decorrentes de ingestão de doses elevadas de
aflatoxinas desencadeantes de efeito agudo, que tem sido a causa da morte de
animais de criação em diferentes regiões do mundo (YU et. al., 2009; FIRMIN et. al.
2010; KHLANGWISET e WU, 2010). A exposição crônica, a baixas doses de toxina
por longos períodos, característica da dieta humana, pode levar ao desenvolvimento
de cancro do fígado, atraso no crescimento entre outras patologias (VAN EGMOND et.
al., 2003; WAGACHA e MUTHOMI, 2008). Em função disto muitos países
estabelecerem limites para os níveis destas micotoxinas em seus alimentos visando
reduzir riscos de danos à saúde da população (FAO, 2010).
A redução dos teores de aflatoxinas em alimentos utilizando
procedimentos físicos e químicos não tem se mostrado eficaz ou economicamente
80
viável (MISHRA e DAS, 2003), pois, afetam as características nutricionais, funcionais,
tecnológicas e sensoriais das matérias primas e alimentos. Contudo, a
descontaminação biológica empregando bactérias, leveduras e fungos filamentosos
parece ser uma alternativa promissora para degradar aflatoxinas e estabelecer
condições que podem melhorar as características funcionais dos alimentos (VARGA
et. al., 2000; OLIVEIRA et. al., 2011; SILVEIRA et. al., 2009). A ação de fungos para
degradar as aflatoxinas tem se mostrado mais eficiente que os demais micro-
organismos (CANCIAMANI et.al., 2005; KHLANGWISETP & WU et. al., 2010).
Os fungos dos gêneros Rhizopus e Trichoderma, classificados como
GRAS (Generally Recognized as Safe) são utilizados para modificação de substratos
para produção de insumos para a indústria de alimentos (Food and Drug
Administration FDA-EUA, 2003). Aliada a esta capacidade, estes fungos, podem
melhorar a disponibilidade de nutrientes e compostos funcionais em coprodutos e
resíduos da agroindústria para aplicação na alimentação humana ou de animais de
criação (GARDA-BUFFON et. al. 2010; OLIVEIRA et. al., 2011; SCHIMDT & BADIALE-
FURLONG, 2012). Para isto, primeiramente é necessário conhecer a taxa de
degradação promovida pelo micro-organismo em função da quantidade inicial de
esporos que permita alterar o substrato sem torná-lo inaceitável para uso, num menor
intervalo possível e, a sua capacidade de multiplicar-se em um meio contaminado
(SAALIA e PHILLIPS, 2010).
Neste trabalho foi avaliada a capacidade dos fungos Rhizopus oryzae
(CCT7560) e Trichoderma reesei (QM9414) em diminuírem os níveis de aflatoxinas
AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1, em meio Batata Dextrose Agar (BDA)
4%, tendo como variáveis o número de esporos do inoculo e tempo de fermentação,
visando aplicar estas condições para estabelecimento de processo fermentativo para
degradar as aflatoxinas em resíduos e coprodutos agroindustriais a serem
empregados em formulações alimentícias.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes
Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2
e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.
81
O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau
cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e
separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).
O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),
hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck
(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de
amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de
sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra
diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura
utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração
Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω.cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada
com ácido acético glacial (99:1 v/v).
2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho
Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila
(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,
AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração
de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo
a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µg.mL-1 para as aflatoxinas
AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg mL-1 para AFLAM1. As concentrações
foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)
empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e
18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,
respectivamente (AOAC, 2000).
2.3 Preparo do meio de cultivo
O meio de cultivo foi preparado utilizando 39g de Agar Batata Dextrose
(ABD – Himedia), correspondente a 15g de Agar, 4g de infusão de batata desidratada
e 20g de dextrose para o volume de 1 litro de água destilada. O meio de cultivo foi
submetido ao processo de esterilização por autoclavagem durante 30 min. Em
seguida, foi vertido em placas de Petri em condições assépticas.
82
2.4 Preparo do inóculo
As cepas dos micro-organismos Rhizopus oryzae (CCT7560) e
Trichoderma reesei (QM9414) foram adquiridas da coleção de culturas da Fundação
André Tosello e mantidas a 4-8ºC em meio Ágar Batata Dextrose (ABD), em tubos de
ensaio, até o momento do uso. Os esporos foram propagados, para repicagem, em
emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%), empregando raspagem com alça de cromo-
níquel e novamente inoculada em meio ABD 4% em placas de Petri. As culturas foram
incubadas em câmaras de germinação (Tecnal) durante 7 dias a 30ºC até nova e
completa esporulação. Para retirada dos esporos foram adicionados 50 mL de uma
emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%) no cultivo raspando com alça de cromo-níquel e
enumerando em câmara de Neubauer. A concentração dos esporos foi estimada por
enumeração no quadrante C da câmara. A contagem de esporos foi realizada a partir
da equação 1.
C = (M × 1000 × dil)/0,004 equação 1.
onde: M é número médio de esporos contados no quadrante C da câmara de
Neubauer; 1000: fator de correção da câmara de Neubauer para mL; dil: 10, pois foi
colocado 1mL de solução de esporos em 9 mL de água; 0,004: fator de correção da
câmara de Neubauer para 1 mL.
2.5 Determinação das aflatoxinas
As aflatoxinas foram extraídas pelo método descrito por Soares e
Rodrigues Amaya (1989) adaptado para minimizar a quantidade de amostra e
solventes utilizados e, consistiu, no uso de 10 g de amostra de farelo de arroz,
homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio 4% (9:1 v/v)
por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do filtrado e
adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10 cm3 de terra diatomácea. A mistura
foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida filtrada
novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e
adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com
10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e
os frascos secos armazenados a -18ºC.
83
2.6 Instrumentação
Para separação e detecção das aflatoxinas foi utilizado cromatógrafo
líquido Shimadzu Prominende UFLC constituído por um sistema de bombas (LC-AT),
desgaseificador da fase móvel (DGU), controlador (CBM-20A), injetor manual com alça
de injeção de 20 μL (7725i), detecção por fluorescência (FL-10AXL) programada para
comprimento de onda do espectro de excitação de fluorescência máxima ex = 360 nm
e comprimento de onda do espectro de emissão de fluorescência máxima em =
435 nm. A aquisição de dados foi realizada pelo programa LC Solution. Foi empregada
coluna cromatográfica Nucleosil®, C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm, Bellefonte, PA, USA) e
como fase móvel uma mistura de água ultra pura acidificada com ácido acético
(99:1 v/v):acetonitrila:metanol (60:8:32 v/v/v) eluida no modo isocrático, vazão de
0,6 mL/min, temperatura da coluna de 45ºC, alça de injeção com loop de 20 µL e
tempo de corrida de 25 min.
Os indicativos de linearidade, precisão, limites de detecção e
quantificação, parâmetros sugeridos pelo Instituto Nacional de Metrologia, Nor-
malização, Qualidade Industrial (INMETRO, 2003) Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA, 2011) e de acordo com o protocolo da União Internaciona de
Química Pura e Aplicada (International Union of Pure and Applied Chemistry -
IUPAC/AOAC/ISO, HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000) foram avaliados previamente.
2.7 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo
Para isto os cultivos foram conduzidos empregando três níveis de esporos
(OLIVEIRA et. al., 2007), sendo o experimento 1 o que continha 4 x 102 esporos.g-1, o
experimento 2, 4 x 104 esporos.g-1 e o experimento 3, 4 x 106 esporos g-1, em placas
contendo o meio ABD 4% (Agar Batata Dextrose - Himedia) previamente fortificadas
com 100 µg.kg-1 das aflatoxinas AFLAB1,AFLAG1, AFLAM1 e 10 µg.kg-1 de AFLAB2,
AFLAG2. A biodegradação de cada aflatoxina foi avaliada individualmente e em
mistura, sendo os experimentos, conduzidos em triplicata para cada condição de
estudo.
Os cultivos foram realizados em câmaras de germinação (Tecnal) a
temperatura de 30°C durante 6 dias (0, 24, 48, 72, 96 e 120 h). Após o término dos
cultivos, as placas contendo as cepas dos micro-organismos foram armazenadas a -
18ºC, para interrupção do processo metabólico. O experimento foi realizado em
triplicata para cada micro-organismo. As aflatoxinas residuais foram extraídas pelo
84
método descrito, dos resultados foram calculados os percentuais de descontaminação
(D) de cada micotoxina em cada micro-organismo de acordo com a equação 2.
D = [100 (C – Co)]/Co equação 2.
onde: Co é o valor da concentração inicial; C é o valor da concentração residual das
aflatoxinas.
Foram calculadas as taxas de degradação (TD) dos três experimentos
conforme a equação 3, e as constantes de velocidades de degradação (K), equação 4,
das aflatoxinas em relação ao tempo de exposição destas aos micro-organismos.
TD = C/Co equação 3.
onde Co é a concentração inicial; C é a concentração residual das aflatoxinas.
K = TD/t equação 4.
onde TD é a taxa de degradação; e t é o tempo de cultivo.
Os resultados foram avaliados estatisticamente a partir do teste de Tukey
empregando o programa Statistica 7.0, utilizando um intervalo de confiança de 95 %
(p < 0,05) para as variáveis, níveis de esporos e tempo de cultivo.
2.8 Determinações de glicosamina e ergosterol
A solução padrão de glicosamina continha 0,1 mg de glicosamina.mL-1 de
água, que foi diluída para obter as concentrações entre 3,0 e 20,0 µg de
glicosamina.mL-1. As absorvâncias das soluções foram medidas a 530 nm em
espectrofotômetro, e a absortividade da glicosamina estimada pela declividade da
curva padrão (SOUZA et. al., 2012).
Em 0,2 g de biomassa seca foram adicionados 5 mL de ácido clorídrico 6M
seguido de autoclavagem a 121°C e 1,1 atm, durante 8 minutos. A mistura foi resfriada
e filtrada para balão volumétrico de 5 mL e o volume completado com água destilada
sendo 1 mL transferido para balão volumétrico de 25 mL e neutralizando com solução
de NaOH 3M, tendo fenolftaleína 0,5% como indicador. Foi realizada a titulação
reversa com KHSO4 1% (p/v), até que a coloração rosa desaparecesse seguida por
elevação do volume do balão com água destilada. Após a extração, 1 mL da solução
foi transferida para tubos de ensaio, aos quais foram adicionados 1 mL da solução de
acetilcetona em 50 mL de Na2CO3 0,5N, seguido por aquecimento em banho de água
fervente por 20 minutos. As amostras foram resfriadas e adicionados 6 mL de etanol e
1mL de reagente de Erlich (2,67g DAB - pdimetilaminobenzaldeído - dissolvido em
15 mL de etanol e 15 mL ácido clorídrico). Os tubos reatores foram incubados a 65°C
em estufa durante 10 minutos. A absorvância foi lida em espectrofotômetro a 530nm e
85
o teor de glicosamina estimado através da absortividade da curva padrão. A
recuperação do método foi determinada em níveis de fortificação que variaram de 1 a
3 mg de glicosamina/g micélio seco, estes níveis foram escolhidos conforme o limite
de detecção do composto nas condições do método (SOUZA et. al., 2012).
Para a determinação do ergosterol a solução padrão continha 0,3 mg de
ergosterol/mL de metanol (Sigma, Estados Unidos, pureza mínima de 90%) que foi
diluída para obter as concentrações entre 1,5 e 16,5 µg de ergosterol/mL de metanol.
As absorvâncias das soluções foram medidas a 283 nm em espectrofotômetro de feixe
duplo Varian 100, obtendo-se uma curva de calibração para estimativa da
concentração do analito (SOUZA et. al., 2012).
Foi empregado o método modificado de Gutarowska e Zakowska (2009)
para determinar o conteúdo de ergosterol na biomassa seca e homogeneizada. O
procedimento consistiu em homogeneizar 0,2 g biomassa fúngica com 10 mL de
metanol sob agitação orbital a 200 rpm por 30 minutos. A fração metanólica foi
separada e ao resíduo da biomassa fúngica foram adicionados mais 10 mL de metanol
seguindo-se mais 20 minutos de agitação. Os sobrenadantes metanólicos foram
homogeneizados e centrifugados a 3000 g a 20°C por 10 minutos. Ao sobrenadante
da mistura centrifugada foram adicionados 20 mL de KOH/metanol, aquecido sob
refluxo por 30 minutos e resfriado a 4ºC. A mistura refluxada foi submetida a quatro
partições com 20 mL de hexano. As frações hexânicas foram homogeneizadas e
evaporadas em rotaevaporador a 60ºC e 40 rpm . O resíduo foi dissolvido com 10 mL
de metanol e a transmitância determinada a 283 nm em espectrofotômetro. O
conteúdo de ergosterol foi estimado a partir de uma curva de calibração de ergosterol
e expresso em mg g-1 de biomassa seca (SOUZA et. al., 2012).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A técnica cromatográfica empregada para detecção das aflatoxinas
residuais nos meios de cultura apresentou características analíticas como limites de
detecção, quantificação de 0,8 e 1,2 µg.kg-1 e linearidade de 2 – 100 ng.mL-1 para as
aflatoxinas B1, G1, M1 e 0,04 e 1 µg.kg-1 e linearidade de 0,1 – 2,5 ng.mL-1 para as
aflatoxinas B2 e G2.
O método de extração Soares e Rodrigues Amaya (1989), foi adotado por
sua eficiência demonstrada na sua aplicação em rotina para determinação de
aflatoxinas (NUNES et al., 2003; DORS et. al., 2009; HEIDTMANN-BEMVENUTI et.
86
al., 2011). Os limites de detecção e quantificação das aflatoxinas na técnica
cromatográfica empregada e a tendência atual por métodos de extração que resultem
em resíduos mínimos motivaram a adaptação do procedimento para minimização dos
reagentes.
A adaptação mostrou que a minimização da quantidade de solventes,
recuperações médias de 71, 88, 74, 92 e 66% para as aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1,
respectivamente, e coeficientes de variação inferiores a 20%. Associada aos
indicativos de mérito da técnica cromatográfica e ao método analítico proposto para
determinação das aflatoxinas, estes mostraram que é possível atender aos critérios
estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2011) e do
Codex Alimentarius para a determinação de compostos traços em matrizes
complexas. Além disso, a sensibilidade deles é adequada para acompanhar as
variações na concentração das aflatoxinas em decorrência da ação dos micro-
organismos em estudo neste trabalho.
3.1 Efeito da ação microbiana nos níveis iniciais das aflatoxinas no cultivo
O nível de fortificação inicial dos meios com as aflatoxinas observou os
níveis e freqüências usuais na literatura (NUNES et. al., 2003; CANCIAMANI et.al.,
2005; DORS et. al., 2009), ou seja, uma proporção 10:1 entre as aflatoxinas B1, G1, M1
e aflatoxinas B2 e G2. Para definição do número de esporos inicial foi considerado o
que vêm sendo utilizado para obtenção de insumos e descontaminação empregando
estes micro-organismos em fermentação sólida e submersa (GARDA-BUFFON et. al.,
2005; OLIVEIRA et. al., 2011; SCHIMDT & BADIALE-FURLONG, 2012).
Os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtêm
energia para seu metabolismo degradando compostos orgânicos disponíveis no meio.
Para isto, fazem uso de enzimas exo e endocelulares, para transformar estruturas em
substrato de forma a torná-los adequados para obtenção de energia ou síntese de
suas próprias biomoléculas (KARMAKAR e RAY, 2011; OLIVEIRA et. al., 2011). Este
aumento de atividade metabólica pode ser acompanhado pela produção de
oxirredutases sendo, as peroxidases, as que atuam sobre as moléculas doadoras de
elétrons que, durante os processos de obtenção de energia ou para degradação de
compostos, afetam a integridade celular com os radicais livres ou outros xenobióticos
(TOMASINI et. al., 2008; AGUIAR et. al., 2010; OLIVEIRA et.al., 2011). Nesta
categoria de moléculas as aflatoxinas são passíveis de serem utilizadas como
87
substrato para peroxidases que as oxidam para outras formas mais polares e
possivelmente menos tóxicas (MISHRA, 2003; GUO ta. al., 2008).
A abertura do anel da difurocumarina da aflatoxina B1, seguido por
hidrólise do grupo vinílico do anel difurano é uma via que vem sendo demonstrada em
estudos envolvendo diferentes micro-organismos como agentes degradadores,
destacando-se os fungos Pleurotus ostreatus (MOTOMURA et. al., 2003; ALBERTS et.
al., 2010), Aspergillus oryzae e Rhizopus oryzae (CACCIAMANI et. al., 2007) e as
bactérias Micobacterium smegmatis (TAYLOR et. al., 2010), Peniophora (ALBERTS et.
al., 2010). O efeito desta alteração estrutural se reflete na diminuição dos níveis das
aflatoxinas detectadas, pois esta alteração afeta diretamente a fluorescência dos
compostos analisados por esta propriedade. Esta via pode ter sido a utilizada pelos
fungos empregados neste trabalho, cujos efeitos nos níveis residuais (µg/kg) das
aflatoxinas determinadas no meio ao longo de 120 h de cultivo, com as respectivas
significâncias estão nas Tabelas 1.
Em situação ideal se pretende atingir degradação total do contaminante e
isto foi possível para todas as aflatoxinas, em 96 h de cultivo, com exceção da
aflatoxina G2. Para avaliar a significância das diferenças ocasionadas pelo efeito do
número de esporos inicial e intervalos de cultivo microbiano foram estimados os
percentuais de descontaminação (D), de acordo com a equação 2, de cada toxina
(Tabela 2).
Foram considerados 100% de degradação quando as aflatoxinas não eram
detectadas e acima de 85% de degradação quando sua concentração ficava abaixo do
limite de quantificação, perdendo a confiabilidade da afirmação da ausência.
O mínimo inicial de esporos não afetou de forma significativa os
percentuais de descontaminação nas primeiras 24 h de cultivo. Depois, em função do
próprio desenvolvimento microbiano, as diferenças começaram a ser significativas.
Para a aflatoxina B1 ser degradada no percentual máximo pelo Rhizopus
oryzae foram necessárias em 96 h. Enquanto que o micro-organismo Trichoderma
reesei foram necessárias 120 h de cultivo para atingir o mesmo nível de diminuição a
partir de um nível inicial de esporos igual ou superior a 4 x 104 esporos/g. Com o
mesmo perfil para a degradação da aflatoxina G1 foram necessárias 96 h de cultivo
para o Rhizopus oryzae e 120 h para o Trichoderma reesei. No entanto, o Trichoderma
reesei pareceu mais eficiente para degradar a aflatoxina M1 que o Rhizopus oryzae,
mostrado pelos elevados percentuais de descontaminação após 96 h de cultivo.
Tabela 1. Níveis das aflatoxinas (µg/kg) e coeficiente de variação (%), no cultivo.
88
Exp./Cult. Tempo (h)
0 24 48 72 96 120
B1 exp 1 R 101,6 2,1 92,8 1,5 92,8 3,2 40,8 1,5 Nd Nd
B1 exp 2 R. 101,4 1,8 95,1 2,0 72,7 3,6 46,2 3,6 Nd Nd
B1 exp 3 R. 96,0 2,3 89,9 2,5 79,2 1,5 25,6 1,5 Nd Nd
B1 exp 1 T. 91,4 1,7 71,2 1,1 70,5 1,0 30,9 3,2 Nd Nd
B1 exp 2 T. 101,6 1,7 80,8 3,5 72,8 4,0 35,2 0 28,8 1 Nd
B1 exp 3 T. 96,5 2,1 85,1 4,3 66,1 0 23,5 0,5 Nd Nd
B2 exp 1 R. 7,9 1,7 4,5 3,0 4,2 2,3 <LOQ <LOQ Nd
B2 exp 2 R. 8,3 1,3 4,4 1,1 <LOQ <LOQ Nd Nd
B2 exp 3 R. 10,1 0,3 4,0 3,6 <LOQ <LOQ Nd Nd
B2 exp 1 T. 7,9 1,1 7,8 1,5 7,6 5,0 7,8 1,0 6,9 2,0 2,2 6,0
B2 exp 2 T. 7,4 2,3 3,9 2,3 3,7 4,0 3,8 4,0 Nd Nd
B2 exp 3 T. 7,0 2,7 5,1 3,6 <LOQ <LOQ Nd Nd
G1 exp 1 R. 99,2 0,8 76,8 4,5 66,4 6,0 42,4 3,0 Nd Nd
G1 exp 2 R. 79,3 0,3 74,1 1,5 56,1 2,5 38,3 4,0 Nd Nd
G1 exp 3 R. 94,2 0,8 82,6 4,1 41,0 2,0 24,3 3,6 Nd Nd
G1 exp 1 T. 104,1 0,2 52,0 7,0 38,5 2,5 34,3 3,6 33,5 5,3 Nd
G1 exp 2 T. 99,2 0,3 58,4 1,5 59,2 1,5 30,4 3,5 29,6 6,0 Nd
G1 exp 3 T. 93,7 0,3 21,4 2,6 49,0 2,6 45,3 6,0 20,3 1,0 Nd
G2 exp 1 R. 6,5 1,3 4,0 1,5 2,7 0,6 2,0 3,5 0,9 4,3 Nd
G2 exp 2 R. 7,2 0,8 5,4 4,0 2,4 1,0 2,1 4,2 1,2 2,6 Nd
G2 exp 3 R. 7,1 0,7 2,1 4,0 <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ
G2 exp 1 T. 7,2 0,9 6,8 2,6 5,9 1,7 4,7 3,0 4,7 2,6 2,5 7,0
G2 exp 2 T. 6,8 1,4 5,6 2,5 5,0 3,0 3,2 4,2 2,2 1,0 1,5 2,6
G2 exp 3 T. 7,2 1,1 6,7 4,6 4,0 4,1 3,6 2,0 2,3 6,0 1,4 4,3
M1 exp 1 R. 68,6 2,1 68,3 1,5 34,3 3,2 30,1 4,0 18,2 2,0 <LOQ
M1 exp 2 R. 89,7 1,9 69,3 2,5 36,6 2,0 31,2 3,0 28,5 1,0 21,7
M1 exp 3 R. 89,7 1,8 85,7 4,0 36,5 0,5 29,8 3,4 27,1 3,6 <LOQ
M1 exp 1 T. 68,6 1,9 60,2 5,6 52,4 3,6 Nd Nd Nd
M1 exp 2 T. 95,0 1,7 80,6 2,0 76,2 3,7 25,1 0,6 Nd Nd
M1 exp 3 T. 84,4 2,3 79,9 6,0 68,4 2,0 27,4 1,5 23,6 2,08 Nd
Exp.: experimento; Cult.: Cultivo; R.: Rhizopus oryzae; T.: Trichoderma reesei.; exp 1.: experimento 1; exp 2.: experimento 2.; exp 3.: experimento 3.; Nd.: não detectado.; LOQ: limite de quantificação.
Para melhor visualizar a eficiência dos micro-organismos para degradação
das aflatoxinas foram considerados as taxas de degradação (TD) e os intervalos de
cultivo para ambos os micro-organismos nos três experimentos (Figura 1).
A velocidade de degradação (k dia-1) para ambos os micro-organismos
(Tabela 3) foi estimada no experimento 3 (4 x 106 esporos g-1), o que apresentou os
melhores resultados de descontaminação.
89
Tabela 2. Percentuais de descontaminação (D) nos níveis iniciais das aflatoxinas nos
meios de cultivo.
Exp./Cul. Tempo (h)
24 48 72 96 120
B1 exp 1 R 11Aa 11Aa 76Ab 100Ac 100Ac
B1 exp 2 R. 8Aa 36Bb 69Bc 100Ad 100Ad
B1 exp 3 R. 8Aa 22Cb 93Cc 100Ad 100Ad
B1 exp 1 T. 28Ba 29Da 84Db 100Ac 100Ac
B1 exp 2 T. 26Ba 36Bb 83Dc 91Bd 100Ae
B1 exp 3 T. 15Aa 40Eb 96Cc 100Ad 100Ad
B2 exp 1 R. 47Aa 51Ab 91Ac 95AC 100Ac
B2 exp 2 R. 51Aa 87Bb 95Ac 100Bc 100Ac
B2 exp 3 R. 66Ba 90Bb 98ABc 100Bc 100Ac
B2 exp 1 T. 1Ca 4Ca 1Ca 13Cb 79Bc
B2 exp 2 T. 51Aa 54Aa 52Da 100Bb 100Ab
B2 exp 3 T. 29Da 85Bb 96ABc 100Bc 100Ac
G1 exp 1 R. 28Aa 41Ab 71Ac 100Ad 100Ad
G1 exp 2 R. 8Ba 36Ab 64Bc 96Ad 100Ad
G1 exp 3 R. 15Ba 70Bb 92Cc 100Ad 100Ad
G1 exp 1 T. 62Ca 78Bb 83Dc 84Bc 100Ad
G1 exp 2 T. 51Da 50Ca 86CDb 87Bb 100Ac
G1 exp 3 T. 96CDa 59Db 64Bb 97Aa 100Aa
G2 exp 1 R. 42Aa 63Ab 74Ac 91Ad 100Ae
G2 exp 2 R. 26Ba 71Bb 75Ab 88Ac 100Ad
G2 exp 3 R. 74Ca 89Cb 92Bb 93Ab 98Ac
G2 exp 1 T. 5Da 19Db 37Cc 36Bc 69Bd
G2 exp 2 T. 18Ba 27Eb 55Dc 71Cd 82Ce
G2 exp 3 T. 6Da 47Fb 52Db 72Cc 85Cd
M1 exp 1 R. 1Aa 66Ab 74Ac 97Ad 98Ad
M1 exp 2 R. 30Ba 78Bb 86Bc 90Bc 100Ad
M1 exp 3 R. 6ACa 78Bb 88BCc 92Bcd 99Ae
M1 exp 1 T. 16CDa 31Cb 100Cc 100Ac 100Ac
M1 exp 2 T. 20BDa 26Cb 97Cc 100Ac 100Ac
M1 exp 3 T. 7ACa 25Cb 89BCc 95ABc 100Ac
Letras maiúsculas diferem entre si, para cada experimento e cada micotoxina, nas colunas e letras minúsculas diferem entre si, para cada intervalo de tempo, em linha (p<0,05) pelo teste de Tukey; Exp.: experimento; Cult.: Cultivo; R.: Rhizopus oryzae; T.: Trichoderma reesei.; exp 1.: experimento 1; exp 2.: experimento 2.; exp 3.: experimento 3.; Nd.: não detectado. LOQ: limite de quantificação.
Foram observadas as diferença significativas nas velocidades de
degradação das aflatoxinas, sendo novamente o micro-organismo Rhizopus oryzae o
mais eficiente, no terceiro dia (72 h de cultivo), confirmando o que foi indicado pelas
taxas de degradação estimadas.
90
A partir destes resultados o Rhizopus oryzae, que demonstrou ser o mais
eficiente para degradar as aflatoxinas isoladamente, foi empregado com o maior
número de esporos (4 x 106 esporos g-1) para verificar sua capacidade de degradação
simultânea das cinco aflatoxinas no meio durante o cultivo. O efeito foi estimado após
a determinação dos níveis residuais (µg kg-1) da aflatoxinas estão ilustrados na
(Tabela 4).
Convém ressaltar que à medida que os teores de aflatoxina B1 diminuíam
os de afltatoxina M1 atingiam níveis superiores aos iniciais. Na Tabela 5, estão os
percentuais de descontaminação obtidos a cada 24 h de cultivo, na Figura 2, estão às
taxas de degradação das aflatoxinas em mistura. O intervalo total de cultivo neste
experimento foi mantido por considerar que o micro-organismo encontraria maior
dificuldade para degradar as aflatoxinas presentes em mistura que perfaziam um total
de 320 µg kg_1.
Ao atuar em um meio contaminado simultaneamente com as cinco
aflatoxinas o Rhizopus oryzae não mostrou a mesma eficiência demonstrada com
cada uma isoladamente. Fato demonstrado pelo intervalo necessário (120 horas) para
atingir percentuais de descontaminação que variaram de 14% (aflatoxina M1) e 98%
(aflatoxina B1) (Tabela 5). Com relação à aflatoxina M1 os percentuais de
descontaminação estimados foram negativos ao longo do cultivo, como já mencionado
este comportamento mostra que o micro-organismo ao degradar a aflatoxina B1
emprega uma via metabólica que oxida esta para aflatoxina M1.
As taxas de degradação, Figura 2, ilustram que para o micro-organismo
Rhizopus oryzae, a maior taxa ocorreu para a aflatoxina B1, enquanto que a menor foi
para a aflatoxina M1. Nos tempos de cultivo é possível observar que em 48 e 96 h
existe uma variabilidade na taxa de degradação da aflatoxina M1, causando uma
diminuição da taxa de degradação decorrentes do aumento da concentração desta
mesma aflatoxina como mostra a Tabela 5. Ao mesmo tempo, ocorre uma diminuição
acentuada da aflatoxina B1, sendo esta aflatoxina a que possui a maior taxa de
degradação, sugerindo a já mencionada possibilidade da formação da aflatoxina M1
durante o processo de degradação da aflatoxina B1 pelo micro-organismo Rhizopus
oryzae, pela reação de hidroxilação da aflatoxina B1 tornando a toxina mais polar
(aflatoxina M1).
Cacciamani et. al. (2007) avaliaram a degradação de aflatoxina B1 e
ocratoxina A simultaneamente presentes em farelos de arroz desengordurados através
de fermentação sólida utilizando os micro organismos Aspergillus oryzae e Rhizopus
91
sp. O Aspergillus oryzae demonstrou maior capacidade de descontaminação da
aflatoxina B1 (80%) enquanto que o Rhizopus sp. demonstrou melhores resultados
para descontaminação da ocratoxina A (80%).
Figura 1. Taxas de degradação das aflatoxinas nos experimentos (1)
4 x 102 esporos g-1 (A, D), experimento (2) 4 x 104 esporos g-1 (B, E) e experimento (3)
4 x 106 esporos g-1 (C, F) para os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma
reesei, respectivamente.
92
Kusumaningtyas et. al. (2006) estudaram fungos como o Rhizopus
oligosporus R. arrhizus, R. stolonifer e A. arrhizus na sua capacidade de degradar a
aflatoxina B1. O Rhizopus oligosporus teve a melhor capacidade degradando a
micotoxina no quinto dia. Motomura et. al. (2003) avaliou dezenove fungos quanto à
capacidade de degradar aflatoxina B1. Uma enzima extracelular do cogumelo
comestível Pleurotus ostreatus mostrou atividade de degradação da aflatoxina B1, os
resultados das determinações de fluorescência sugerem que a enzima clivava o anel
lactona da aflatoxina.
Tabela 3. Constantes de degradação das aflatoxinas pelos micro-organismos no
experimento 3.
Exp./Cul. Tempo (Dias)
1º 2º 3º 4º 5º
B1 exp 3 R. 0,937Aa 0,413Aa 0,089Ab 0,053Ab 0,043Ab
B1 exp 3 T. 0,882Ba 0,343Bb 0,081Bc 0,053Ad 0,043Ad
B2 exp 3 R. 0,398Aa 0,046Ab 0,030Ac 0,023Ad 0,018Ad
B2 exp 3 T. 0,734Ba 0,046Ab 0,030Aa 0,023Ac 0,018Ac
G1 exp 3 R. 0,877Aa 0,218Ab 0,086Ab 0,048Ac 0,039Ac
G1 exp 3 T. 0,229Ba 0,262Bb 0,161Bc 0,054Ac 0,039Ac
G2 exp 3 R. 0,301Aa 0,033Ab 0,022Ac 0,016Ac 0,013Ac
G2 exp 3 T. 0,928Ba 0,279Bb 0,168Bc 0,081Bc 0,040Bc
M1 exp 3 R. 0,955Aa 0,204Ab 0,111Ac 0,076Ac 0,048Ac
M1 exp 3 T. 0,947Aa 0,405Bb 0,108Ac 0,070Ac 0,048Ac
Letras maiúsculas diferem entre si, para cada micotoxinas, nas colunas e letras minúsculas diferem entre si, para cada micro-organismo em linha (p<0,05) pelo teste de Tukey; R.: Rhizopus oryzae; T.: Trichoderma reesei.; B1: aflatoxina B1; B2: aflatoxina B2; G1: aflatoxina G1; G2: aflatoxina G2; M1: aflatoxina M1.
Figura 2. Taxas de degradação das aflatoxinas em mistura.
93
Tabela 4. Níveis residuais das aflatoxinas (µg kg-1) e coeficiente de variação (%), ao
longo do intervalo de cultivo.
Aflatoxinas Tempo (h)
0 24 48 72 96 120
B1 96,5 2,3 36,6 4,2 22,4 1,1 14,2 1,4 6,6 0,8 1,9 2,1
B2 10,1 3,7 6,8 1,4 3,3 0,9 3,2 0,3 2,6 1,0 2,6 0,7
G1 96,7 1,8 57,0 1,6 55,1 3,6 23,3 2,4 20,3 1,0 10,4 2,3
G2 8,6 2,1 8,4 1,3 8,2 0,6 5,1 1,2 5,1 1,1 4,1 1,3
M1 89,8 3,8 77,1 2,1 128,3 1,0 89,8 1,3 218,1 1,1 77,6 0,9
Tabela 5. Porcentagens de descontaminação nos níveis das aflatoxinas durante o
cultivo com Rhizopus oryzae.
Aflatoxinas Tempo (h)
24 48 72 96 120
B1 62Aa 77Ab 85Ac 93Ad 98Ad
B2 33Ba 67Bb 68Bb 74Bc 74Bc
G1 41Ca 43Ca 76Cb 79Cb 89Cc
G2 2Da 4Da 41Db 41Db 52Dc
M1 14Ea -43Eb 0Ec -143Ed 14Ea
Letras maiúsculas diferem entre si, para cada experimento e cada micotoxina, nas colunas e letras minúsculas diferem entre si, para cada hora em linha (p<0,05) pelo teste de Tukey; B1: aflatoxina B1; B2: aflatoxina B2; G1: aflatoxina G1; G2: aflatoxina G2; M1: aflatoxina M1.
3.2 Determinações de glicosamina e ergosterol
Os métodos analíticos para determinar ergosterol e glicosamina foram
padronizados anteriormente para atender os indicativos de eficiência adequados para
garantir a confiabilidade dos resultados estimados, visando empregá-los para
determinação quantitativa durante a multiplicação da biomassa fúngica em meio
contaminado com as aflatoxinas. Os resultados da variação no teor de glicosamina e
ergosterol estão ilustrados nas Figuras 3 para todas as aflatoxinas estudadas.
A Tabela 6 ilustra a variação ocorrida nos teores médios de glicosamina,
ergosterol e o percentual de descontaminação para ambos os micro-organismo
durante o cultivo no experimento 3.
94
Figura 3. Valores de glicosamina e ergosterol presentes na biomassa do Rhizopus
oryzae (A, B) e Trichoderma reesei (C, D).
Tabela 6. Valores de médios de ergosterol, glicosamina e níveis médios de redução
das aflatoxinas nos cultivos.
Aflatoxinas Ergosterol (µg g-1) Glicosamina (µg g-1) Níveis médios
residuais (µg kg-1)
R. oryzae T. reesei R. oryzae T. reesei R. oryzae T. reesei
B1 106 112 6861 4270 73 68
B2 91 127 7232 5189 7 6
G1 129 111 7622 4973 61 46
G2 189 113 8272 4715 5 4
M1 143 116 6660 5612 54 57
Em presença de aflatoxina G1, G2 e M1 os níveis médiosde ergosterol na
biomassa de R.oryzae foram maiores que em presença da aflatoxinas B1 e B2. O que
95
sugere que há um desvio na rota metabólica de lipídios (ergosterol) para compensar a
presença delas. No caso do T. reesei os teores médios de ergosterol variaram menos
entre as aflatoxinas.
4. CONCLUSÃO
A biodegradação das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e M1 utilizando micro-
organismos Generally Recognized as Safe (GRAS) Rhizopus oryzae e Trichoderma
reesei foram eficazes. No entanto o Rhizopus oryzae foi o micro-organismo que
apresentou as maiores taxas de degradação reduzindo os níveis iniciais de
contaminação com as aflatoxinas para valores não detectáveis em menor intervalo de
cultivo. Quando as cinco aflatoxinas estudadas ocorrem simultaneamente em um meio
perfazendo um total de 320 µg kg-1 a eficiência do micro-organismo fica diminuída e
não são atingidos níveis não detectáveis de nenhuma delas. A medida que os
percentuas de aflatoxina B1 são diminuídos os de aflatoxina M1 são aumentados.
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– 1262.
102
Artigo 3
Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1 pelos micro-
organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.
103
Identificação dos produtos da biodegradação da aflatoxina B1 pelos micro-
organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.
Resumo
Os fungos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei foram cultivados em
meios fortificados com aflatoxina B1. Os produtos da degradação foram avaliados por
cromatografia liquída acoplada a espectrômetro de massas triplo quadrupolo, as
estruturas formadas foram avaliadas de acordo com as razões massa-por-carga (m/z)
e as fórmulas moleculares estimadas. De acordo com os resultados avaliados, dez
principais composições moleculares foram produzidas. O Rhizopus oryzae, produziu
estruturas químicas sem ligação dupla terminal no anel furano o que indica a redução
da toxicidade dos contaminantes, portanto, trata-se de um promissor uso para
processos destinados a degradação de aflatoxinas.
Palavras-chave: produtos de degradação, Rhizopus oryzae, Trichoderma ressei,
CLAE-EM/EM.
104
Identification of the products of biodegradation of aflatoxin B1 by microorganisms
Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei.
Abstract
The fungus Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei were grown in media
fortified with aflatoxin B1. The degradation products were evaluated by liquid
chromatography-triple quadrupole mass spectrometer, the structures formed were
assessed according to the reasons mass/charge and molecular formulas estimated.
According to the results evaluated ten key molecular compositions were produced. The
Rhizopus oryzae produced without chemical structures terminal double bond in the
furan ring which shows the reduction in toxicity of contaminants therefore it is a
promising for use degradation processes for aflatoxin.
Keywords: degradation products, Rhizopus oryzae, Trichoderma ressei, HPLC-MS/MS
105
1. INTRODUÇÃO
As aflatoxinas são furocumarinas complexas com intensa fluorescência
quando expostas à luz ultravioleta. Elas são pouco polares, solúveis em solventes
como clorofórmio, metanol e benzeno (XIAOHU et al., 2013). Esses compostos são
estáveis a temperaturas acima de 250°C e não são afetadas por temperaturas
inferiores a 10ºC (XUEJIAO et al., 2013). A série G das aflatoxinas difere
quimicamente da série B pela presença de um anel 3-lactona, no lugar do anel
ciclopentanona (YI-MING, 2009). Uma dupla ligação 8,9 é encontrada na forma de um
éter vinil no anel terminal furano nas aflatoxinas B1 e G1, mas não nas aflatoxinas B2 e
G2. Essas diferenças estruturais estão associadas também as suas atividades
biológicas, sendo as aflatoxinas B1 e G1 carcinogênicas e consideravelmente mais
tóxicas que as aflatoxinas B2 e G2. Outra estrutura de aflatoxina é uma derivada
hidroxilada resultante do metabolismo da aflatoxinas B1, denominada aflatoxina M1
(XIAOHU et al., 2013).
As aflatoxinas podem ser removidas ou detoxificadas dos alimentos e
nutrientes contaminados por métodos físicos, químicos ou biológicos. Várias
pesquisas têm sido realizadas objetivando a redução de matérias primas utilizando
métodos físicos e químicos. No entanto, por serem termoestáveis, os tratamentos pelo
calor, como cocção e autoclavagem não causam modificações nos níveis dessas
micotoxinas ativas (BAMMLER et al., 2000; SAALIA e PHILIPS, 2011). Solventes,
incluindo metanol, etanol e hexano, podem efetivamente extrair aflatoxinas de
produtos, porém, os efeitos na qualidade nutricional são questionáveis (LI et al., 2010).
Diversas pesquisas vêm demonstrando que as aflatoxinas são
susceptíveis a micro-organismos e que por esta razão, estão sendo estudados para
introdução em processos de matérias primas alimentares visando a produção de
alimentos de menos contaminados (LI et al., 2012). Os fungos estão entre os micro-
organismos que tem se destacado como promotores de degradação das aflatoxinas
em especial a aflatoxina B1 (MOTOMURA et al., 2003; CACCIAMNANI et al., 2007).
O fungo Rhizopus oryzae, também conhecido por Rhizopus arrhizus, é
utilizado na indústria para a produção de um amplo espectro de metabólitos, na forma
de enzimas extra e intra celulares, que inclui, celulases, hemicelulases, pectinases,
tanases, fitases, amilases, lípases e proteases (KARMAKAR e RAY, 2011;
106
BERTHILLER et al., 2013). O fungo Trichoderma reesei é conhecido, principalmente,
por sua capacidade de produzir múltiplas enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas. As
enzimas produzidas por ambos os organismos são consideradas pela Food and
Agriculture Organization (FAO/WHO), Joint Expert Committee on Food Additives
(JEFCA) e Food and Drug Administration (FDA) como metabólitos Geralmente
Reconhecidos como Seguras (GRAS), podendo ser utilizadas como aditivos
alimentares (CFR, 2012). Assim, esses fungos são interessantes para serem
pesquisados quanto ao seu potencial para biodegradação das aflatoxinas em materiais
contaminados destinados a alimentação (CACCIAMNANI et al., 2007).
Poucas pesquisas têm sido realizadas na identificação e toxicidade dos
compostos de biodegradação das aflatoxinas, no entanto, técnicas como a
cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada a detector de massas triplo
quadrupolo e tempo de voo (UPLC-MS-TOF) são úteis para detecção das estruturas
química formadas nos produtos da degradação de aflatoxinas (LI, et al., 2010; QIAN et
al., 2013; XIAOHU et al., 2013). A cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a
detector de massas triplo quadrupolo, devido a sua alta sensibilidade, seletividade e
resolução dos picos, fornecem informações para a dedução das estruturas destes
produtos.
Este trabalho tem como objetivo, analisar as estruturas formadas a partir
da degradação da aflatoxina B1 pela ação dos micro-organismos Rhizopus oryzae e
Trichoderma reesei através da técnica de cromatografia líquida acoplada a detector de
massas.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes
Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2
e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.
O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau
cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e
separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).
O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),
hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck
107
(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de
amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de
sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra
diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura
utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração
Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω.cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada
com ácido acético glacial (99:1 v/v).
2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho
Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila
(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,
AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração
de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo
a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µ.mL-1 para as aflatoxinas
AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg.mL-1 para AFLAM1. As concentrações
foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)
empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e
18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,
respectivamente (AOAC, 2000).
2.3 Preparo do meio de cultivo
O meio de cultivo foi preparado utilizando 39g de Agar Batata Dextrose
(ABD – Himedia), correspondente a 15 g de Agar, 4 g de infusão de batata desidratada
e 20 g de dextrose para o volume de 1 litro de água destilada. O meio de cultivo foi
submetido ao processo de esterilização por autoclavagem durante 30 min. Em
seguida, foi vertido em placas de Petri em condições assépticas.
2.4 Preparo do inóculo
As cepas dos micro-organismos Rhizopus oryzae (CCT7560) e
Trichoderma reesei (QM9414) foram adquiridas da coleção de culturas da Fundação
André Tosello e mantidas a 4-8ºC em meio Ágar Batata Dextrose (ABD), em tubos de
ensaio, até o momento do uso. Os esporos foram propagados, para repicagem, em
emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%), empregando raspagem com alça de cromo-
108
níquel e novamente inoculada em meio ABD 4% em placas de Petri. As culturas foram
incubadas em câmaras de germinação (Tecnal) durante 7 dias a 30ºC até nova e
completa esporulação. Para retirada dos esporos foram adicionados 50 mL de uma
emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%) no cultivo raspando com alça de cromo-níquel e
enumerando em câmara de Neubauer. A concentração dos esporos foi estimada por
enumeração no quadrante C da câmara. A contagem de esporos foi realizada a partir
da equação 1. A suspensão foi diluída de forma a resultar em 4 x 106 esporos.g-1 para
adição nas placas de cultivo.
C = (M × 1000 × dil)/0,004 Equação 1.
onde: M é número médio de esporos contados no quadrante C da câmara de
Neubauer; 1000: fator de correção da câmara de Neubauer para mL; dil: 10, pois foi
colocado 1mL de solução de esporos em 9 mL de água; 0,004: fator de correção da
câmara de Neubauer para 1 mL.
2.5 Experimento da biodegradação
O meio de cultura ABD, foi vertido em placas de Petri e fortificado com
100 µg.kg-1 da AFLAB1 onde, foi adicionada uma suspensão de esporos contendo
4 x 106 esporos.g-1. Os cultivos foram realizados em câmaras de germinação (Tecnal)
a temperatura de 30°C durante 6 dias (0, 24, 48, 72, 96 e 120 h). Após o término dos
cultivos, as placas contendo as cepas dos micro-organismos foram armazenadas a
-18ºC, para interrupção do processo metabólico. O experimento foi realizado em
triplicata para cada micro-organismo.
2.6 Determinação das aflatoxinas
As aflatoxinas foram extraídas pelo método descrito por Soares e
Rodrigues Amaya (1989) adaptado para minimizar a quantidade de amostra e
solventes utilizados e, consistiu, no uso de 10 g de amostra de farelo de arroz,
homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio 4% (9:1 v/v)
por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do filtrado e
adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10 cm3 de terra diatomácea. A mistura
foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida filtrada
novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e
109
adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com
10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e
os frascos secos armazenados a -18ºC.
2.7 Instrumentação
Os extratos foram analisados em cromatografo Waters Alliance
Separations modelo 2695 equipado com bomba quaternária, injector automático e
compartimento de colunas termostatizado (Waters, Milford, MA, EUA). A separação
cromatográfica foi realizada com coluna C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm) Nucleosil®
(Bellefonte, PA, USA). Os componetes da fase móvel água ultra pura e acetonitrila,
ambos solventes acidificado com ácido acético com eluição em gradiente utilizando
adição crescente de acetonitrila iniciando com 0 min - 12%; 3 min - 45%; 3,8 min -
100% em seguida a diminuição da acetonitrila com 4,3 min - 12% e 10 min -12%, a
uma taxa de vazão de 1 mL.min-1, resultando em um tempo de corrida de 9 min e
volume de injeção de 10 µL (Anexo 6).
O detector Quatro MicroTM API (triplo quadrupolo) de espectrômetro de
massas, equipado com ionização por eletronebulização (IEN) Micromass (Waters,
Milford, MA, EUA) foi utilizado. O gás de secagem, bem como o de nebulização, foi
gerado a partir de nitrogênio pressurizado num gerador NG-7 (Aquilo, Etten-Leur, NL).
O fluxo de gás por nebulização foi ajustado para 100 L.h-1 e o fluxo de gás de
dessolvatação, para 500 L.h-1. Para a operação no modo EM-EM, o gás colisão foi
argônio (White Martins, Rio Grande do Sul, Brasil), com uma pressão de 2,5 x 10-3
mbar na célula de colisão. Os valores otimizados foram: tensões capilares, 5,0 kV;
temperatura da fonte de 120ºC, temperatura dessolvatação 400ºC; multiplicador 650V;
e o intervalo de varredura, 50 a 350 m/z. Após a otimização da energia de célula de
colisão do triplo quadrupolo, dois diferentes íons de transição (íon precursor e íon
produto) foram selecionados, uma para quantificação e uma para a qualificação, e
esses íons foram monitorados no tempo programado na condição de monitoramento
de múltipla reação.
O processamento de dados e análise da estrutura foi realizada por meio do
programa MassLynx versão 4.1 (Micromass, Manchester, UK). Com o qual podem ser
identificadas as composições elementares, com base nos dados recolhidos sobre a
massa exata de cada composto, e ao mesmo tempo, obter informações sobre os íons
precursores e íons produtos, coletados a partir dos dados de uma injeção de amostra.
110
2.8 Validação
A técnica cromatográfica foi validada de acordo com os parâmetros
sugeridos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), pelo Instituto
Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO), e de acordo
com o protocolo IUPAC/AOAC/ISO (HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000). Na maioria
dos casos, as técnicas validadas devem obedecer a um intervalo de recuperação de
70 - 110% com desvio padrão e desvio padrão relativo de 20% e 30%,
respectivamente (HORWITZ, 1995; HORWITZ, 2000).
Os parâmetros considerados na validação foram limites de detecção e
quantificação, curva analítica, linearidade, seletividade, recuperação e efeito matriz.
Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do instrumento (LODi e LOQi,
respectivamente) foram estimados considerando-se pelo menos 3 e 10 vezes a razão
entre o sinal pela linha de base (ruído), respectivamente. Os limites instrumentais
foram obtidos por padronização externa com a preparação de soluções analíticas de
diferentes concentrações na fase móvel. Os valores de LODi e LOQi multiplicados
pelos fatores de diluição para o método de extração resultou nos limites de detecção
(LODm) e quantificação do método (LOQm) estimado. Para construir a curva analítica
foram preparadas soluções analíticas nas concentrações de 0,5; 1,0; 5,0; 50,0 e
100,0 ng.mL-1. Cada ponto da curva analítica foi injetada em triplicata e os dados de
regressão linear foram obtidos com auxílio do programa MassLynx versão 4.1. Foram
consideradas com boa linearidade curvas com valores de R2 > 0,90 (HORWITZ, 1995;
HORWITZ, 2000). A seletividade foi avaliada comparando o sinal gerado pela injeção
da matriz isenta das aflatoxinas e desta adicionada de padrão (HORWITZ, 1995;
HORWITZ, 2000).
A avaliação do efeito matriz foi realizada com base na comparação das
inclinações das curvas analíticas das aflatoxinas no solvente e na matriz. Para isso
foram preparadas soluções em seis níveis de concentração no solvente e na matriz
sendo realizadas injeções em triplicata para cada nível de concentração. O cálculo do
efeito da matriz foi realizado dividindo o valor da inclinação da curva no solvente pela
curva da matriz, esse valor foi diminuído de 1 e multiplicado por 100 para o valor em
porcentagem (ANVISA). O efeito matriz é considerado baixo para intervalos entre
-20% < C% <20%, médio para os intervalos -50% < C% <-20% ou 20%> C%> 50% e
elevado para os intervalos C% < -50% ou C%> 50% (ECONOMOU et al., 2009).
(Anexo 7).
111
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores de recuperação e coeficiente de variação foram de 69% (4),
72% (3) e 71% (4) para os três níveis estudados, estando de acordo com os valores
aceitos pela literatura (ANVISA; INMETRO; IUPAC). Na Tabela 1 estão apresentados
os limites de detecção e quantificação do instrumento, curva analítica do padrão, curva
analítica na matriz e o efeito da matriz.
Tabela 1. Parâmetros cromatográficos validados.
Parâmetros Aflatoxina B1
Tempo de retenção (min) 8,1
Limite de detecção instrumento (ng.mL-1) 0,1
Limite de detecção método (µg.kg-1) 0,04
Limite de quantificação instrumento (ng.mL-1) 0,5
Limite de quantificação método (µg.kg-1) 0,2
Curva analítica no solvente y = 6553,4 + 6,9
Coeficiente de correlação (R2) 0,98
Linearidade 0,5 – 100ng.mL-1
Curva analítica na matriz y = 6622,7 + 8,08
Coeficiente de correlação (R2) 0,97
Efeito matriz (%) 1,04
Os limites de detecção e quantificação foram adequados, assim como, o
modelo de regressão linear. O valor do efeito da matriz foi baixo, indicando que a
técnica cromatográfica empregada é confiável.
3.1 Produtos da degradação
Pesquisas tem demonstrado que há um grande número de produtos
formados na degração da AFLAB1 (LI et al., 2012; YANG et al., 2012; XUEJIAO et al.,
2013; XIAOHU et al., 2013), no entanto, a maioria destes produtos, são compostos
desconhecidos (YI-MING et al., 2009) e, os compostos conhecidos como AFLAP1,
AFLAQ1, AFLAB2a, AFLAH1, estão disponíveis apenas no mercado oriental, o que
torna difícil a sua aquisição, assim, com base na razão massa-por-carga (m/z) e na
informação espectral, alguns produtos da degradação podem ser identificados, não
necessitando do padrão comercial destes compostos derivados da AFLAB1. A Figura
112
1 (A e B) ilustra os cromatogramas da AFLAB1 no início do experimento para os micro-
organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei.
A variação dos teores de AFLAB1 ao longo do cultivo com os micro-
organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei determinados pelo método Soares
e Rodrigues Amaya (1989) adaptado e cromatógrafo líquido acoplado a detector de
massas (CLAE-IEN-EM/EM) mostrou a diminuição de 96 para 25,6 µg.kg-1 e 96 para
23,5 µg.kg-1 entre 0 e 72 h, respectivamente, para cada micro-organismo (Tabela 2).
Figura 1. Cromatogramas da AFLAB1 (100 µg.kg-1), no tempo de cultivo 0 h, para o
micro-organismo Rhizopus oryzae (A) e Trichoderma reesei (B).
Tabela 2. Níveis (µg.kg-1) e coeficiente de variação (%) da AFLAB1 no cultivo.
Exp./Cult. Tempo (h)
0 24 48 72 96 120
B1 exp R. 96,0 2,3 89,9 2,5 79,2 1,5 25,6 1,5 Nd Nd
B1 exp T. 96,5 2,1 85,1 4,3 66,1 0 23,5 0,5 Nd Nd
exp. Experimento.; R.: Rhizopus oryzae.; T.: Trichoderma reesei.; Nd. Não detectado.
Os cromatogramas da AFLAB1 nos tempos de cultivo 72 e 120 h para os
micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei (Figura 2) tempo nos quais
se percebe a degradação da mesma, confirmam os dados da Tabela 2.
A AFLAB1 foi degradada pelos micro-organismos ao longo do tempo de
cultivo, até 72 h com a formação de diversos produtos de degradação determinados
A
B
113
pela rota metabólica utilizada pelo micro-organismo. As rotas mais prováveis são a
hidroxilação, epoxidação, metilação e isomerização espacial.
Para identificar os produtos formados foi utilizado o programa MassLynx
versão 4.1 (Micromass, Manchester, UK) para analisar as composições elementares,
bem como possíveis fórmulas moleculares.
A AFLAB1 é composta por três elementos, ou seja, 17 átomos de carbono,
12 átomos de hidrogênio e 6 átomos de oxigênio, com razão m/z 312. Durante o
processo de degradação desta micotoxina, a primeira ligação a ser quebrada é a
ligação dupla, que possívelmente ocorre no carbono C8 e C9 da AFLAB1 (THEUMER
et al., 2010; XIAOHU et al., 2013). Os produtos formados, a partir dos espectros
obtidos pelo programa MassLynx, estão na Figura 3 e 4 para os micro-organismos
Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, respectivamente, nos tempos de cultivo 72, 96
e 120 h.
Os produtos formados com m/z acima de 312 (C17H12O6) mostram que
houve reações de adição na molécula da AFLAB1, essas reações ocorreram com
hidratação da ligação dupla do anel furano terminal e possíveis hidroxilações em
diferentes pontos, além da abertura da estrutura bi-furanóide e até mesmo da fissão
hidrolítica da lactona cumarínica (LIN, 2013; YANG et al., 2012).
Os principais produtos formados da fragmentação da AFLAB1 onde houve
a adição ou perda de hidrogênio e oxigênio, assim, os produtos formados, como o m/z
331(C17H13O7) possui três hidrogênios e um oxigênio a mais que a molécula da
AFLAB1 sendo uma reação de adição rompendo a dupla do anel furano terminal, o
produto m/z 284 (C16H12O5) apresenta uma molécula a menos de (CH2O) que a
AFLAB1, no entanto, as possíveis reações químicas mostram que a via de perda de
um monóxido de carbono (CO) é a principal formação do produto m/z 284, o produto
m/z 274 (C15H13O5) foi formado pela perda de C3H2.
O produto m/z 319 (C16H14O7), que apresenta um carbono a menos que a
AFLAB1, mas, dois átomos de hidrogênio e um de oxigênio a mais, é formado por uma
reação de adição no anel furano terminal, e a desmetilação da estrutura
metoxicumarina. O produto m/z 349 (C17H16O8) tem a molécula H4O2 a mais que a
AFLAB1, isto ocorre provavelmente devido à reação de adição de dois grupos
hidroxilas sobre a dupla ligação do anel furano terminal, no entanto, a estrutura mais
provável é aquela onde os grupos hidroxila e metoxi sejam adjacentes, devido a
reação de impedimento estérico, assim, a hidroxila reage com o anel furano terminal,
enquanto que o grupo metoxi é substituído por outra hidroxila no anel benzeno. Para
114
formação do produto 305 (C17H15O6) ocorreu a desmetilação da estrutura
metoxicumarina e a hidroxilação na ligação dupla do anel furano terminal, na
ciclopentanona e na lactona cumarínica.
Figura 2. Cromatogramas da AFLAB1 com Rhizopus oryzae 72 h (A) e 120 h (B) e
Trichoderma ressei 72 h (C) e 120 h (D).
O produto m/z 298 é conhecido, sendo este, possivelmente a aflatoxina P1
(AFLAP1) formada a partir da reação de ortodemetilação da AFLAB1 (MARROQUÍN-
CARDONA et al., 2011; OLIVEIRA, 2003) As estruturas químicas foram formadas por
ação dos micro-organismos possivelmente para aproveitamento da cadeia carbonada
ou detoxificação (INFANTE et al., 2009; KARMAKAR e RAY, 2011). As estruturas
químicas formadas indicam que a ligação dupla terminal do anel furano da AFLAB1 foi
quebrada em todos os produtos resultantes da ação das enzimas do Rhizopus oryzae.
Esta quebra causa uma diminuição da toxicidade desta micotoxina (KARMAKAR e
A
C
B
D
115
RAY, 2011) o que não ocorreu com o produto do Trichoderma ressei cuja razão
m/z 298 (AFLAP1) indica que a ligação não foi quebrada, portanto, não favorece a
diminuição da toxicidade (ZHANG e LYND, 2006; XIAOHU et al., 2013).
Neste estudo ficou demostrado que o micro-organismo Rhizopus oryzae é
o mais indicado para uso em processos para degradar a AFLAB1 visando diminuir os
riscos de danos tóxicos de produtos e insumos alimentícios. Os produtos de
degradação da AFLAB1 ainda são pouco estudados, devido a isto, estes compostos
são praticamente desconhecidos, pois as técnicas para a identificação destes
compostos desconhecidos são trabalhosas para ser conclusivas, porém, pela sua
sensibilidade e resolução a espectrometria de massas permite uma boa avaliação
preliminar de descontaminação através da identificação de produtos formados (QIAN
et al., 2013; XUEJIAO et al., 2013).
117
Figura 4. Espectros dos produtos formados pelo Trichoderma ressei 72 h (A) 96 h (B)
e 120 h (C).
118
4. CONCLUSÃO
A degradação da aflatoxina B1 utilizando os micro-organismos Rhizopus
oryzae e Trichoderma reesei foi avaliada. Houve a formação de dez principais
compostos desta biodegradação, onde pelas razões massa-por-carga (m/z) foi
possível identificar as estruturas químicas formadas. Os produtos formados pelo
Rhizopus oryzae indicam a quebra da ligação dupla terminal do anel furano, sugerindo
uma possível diminuição do potencial toxigênico dos compostos formados. O
Trichoderma ressei não foi tão eficiente nesta degradação.
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122
Artigo 4
Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae e seu potencial
carcinogênico
123
Produtos da biodegradação da aflatoxina B1 por Rhizopus oryzae e seu
potencial carcinogênico
Resumo
O fungo Rhizopus oryzae foi cultivado em meio fortificado com aflatoxina
B1 isolada e em mistura com outra aflatoxinas. Os produtos da degradação foram
avaliados por cromatografia liquída acoplada a espectrômetro de massas triplo
quadrupolo, seguindo-se da avaliação da toxicidade dos produtos formados a partir de
experimentos in vitro com hepatócitos de Danio rerio, da linhagem ZFL. O micro-
organismo Rhizopus oryzae é capaz de degradar a aflatoxina B1 isoladamente e em
mistura, os produtos formados desta degradação mostram que, quando degradada
isoladamente a AFLAB1 forma produtos com potencial carcinogênico diminuidos, no
entanto, quando em mistura com outras aflatoxinas, os produtos de degradação com
diminuição da carcinogeinidade são formados em 72 h de cultivo.
Palavras-chave: Rhizopus oryzae, aflatoxinas, toxicidade
124
Products of biodegradation of aflatoxin B1 by Rhizopus oryzae and its
carcinogenic potential
Abstract
The fungus Rhizopus oryzae was grown in medium supplemented with
aflatoxin B1 alone and in combination with other aflatoxins. The degradation products
were evaluated by liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer,
followed by evaluation of the toxicity of the products formed from experiments in vitro
hepatocyte cell Danio rerio ZFL strain. The microorganism is Rhizopus oryzae capable
of degrading aflatoxin B1 alone and in mixture, the products formed in this degradation
show that when the degraded isolation AFB1 form products that do not have
carcinogenic potential. However, when mixed with other aflatoxins, in degradation
products are formed toxigenic characteristics at 72 hours of culture.
Keywords:Rhizopus oryzae, aflatoxins, toxicity
125
1. INTRODUÇÃO
As aflatoxinas são um grupo de metabolitos secundários altamente tóxicas
produzidas principalmente por espécies fúngicas do gênero Aspergillus. O fungo A.
flavus produz apenas aflatoxinas B, enquanto que o A. parasiticus produz aflatoxinas B
e G. Entre os 18 tipos diferentes de aflatoxinas as mais conhecidas são AFLAB1,
AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, AFLAP1, AFLAQ1, AFLAM1, AFLAM2, AFLAB2a (XIAOHU et
al., 2013). A maioria das aflatoxinas que ocorrem naturalmente em alimentos são as
aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e, em seguida, aflatoxinas M1 (Figura 1). As outras formas
são consideradas metabolitos de transformação intermediária e aparecem em
quantidades que dificultam a purificação para fins científicos ou comerciais (ZORAN et
al., 2010; XIAOHU et al., 2013).
Figura 1. Estruturas químicas das principais aflatoxinas.
A aflatoxina B1 (AFLAB1) é classificada pela Agência Internacional para
Pesquisa sobre o Câncer (IARC) como carcinógeno do grupo 1, ou seja, cancerígeno
para os seres humanos (IARC, 2002). A toxicidade das aflatoxinas diminuem a partir
da AFLAB1, AFLAG1, AFLAB2 e AFLAG2. Quando a AFLAB1 e AFLAB2 são
consumidas na dieta dos mamíferos, estas podem ser metabolizadas a aflatoxina M1
(AFLAM1) e AFLAM2 e, em seguida, distribuídas a tecidos e fluidos biológicos como o
leite (VAN EGMOND et al., 2007; WAGACHA e MUTHOMI, 2008).
A degradação das aflatoxinas, usando micro-organismos ou enzimas, é
uma das estratégias estudadas para avaliação do risco dos danos decorrentes do
consumo destes compostos através de alimentos ou rações. As vantagens dos
processos que envolvem biodegradação são a especificidade do mecanismo de
decomposição, a aplicação em condições moderadas que alteram de forma suave as
126
propriedades nutricionais e tecnológicas das matrizes alimentares, além de melhorar
as propriedades funcionais (VARGA et. al., 2005; THEUMER et al., 2010).
A biodegradação de aflatoxinas utilizando ação de espécies fúngicas utiliza
os zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.), ascomicetos (Aspergillus níger e
Trichoderma sp.) e ainda, basidiomicetos (Armillariella tabescens) que, têm se
mostrado eficientes para reduzir os níveis totais das aflatoxinas (CACCIAMNANI et al.,
2007; DORS et al., 2009; ZORAN et al., 2010). As pesquisas realizadas para
identificação e avaliação de toxicidade dos compostos de biodegradação das
aflatoxinas ainda são incipientes e têm sido realizadas in vitro para estimar a eficiência
da degradação das aflatoxinas empregando animais ou, conforme a tendência mais
recente, cultura de tecidos. (THEUMER et al., 2010; MARROQUÍN-CARDONA et al.,
2011).
Considerando-se que o alvo destas micotoxinas é o fígado, em geral, o
foco das avaliações in vivo e em in vitro são para este órgão e, embora, nos animais a
perda de peso, a diminuição da velocidade de crescimento e a depressão do sistema
imunológico sejam sintomas importantes para compreensão do nível de toxicidade
(WILLIAMS et al., 2009). Nos testes utilizando apenas culturas celulares, o material é
colocado direta ou indiretamente em contato com a cultura e as alterações celulares
ocorrem por diferentes mecanismos, neste caso, culturas de células hepáticas, de
animais e humanos são promissoras para investigação da toxicidade da AFLAB1
(MCKEAN et al., 2006; SHEN et al., 2012; CORCUERA, et al., 2011).
Neste trabalho foi usado o micro-organismo Rhizopus oryzae, isolado do
arroz, para degradar a AFLAB1, presente em meio de cultura, seguindo-se a avaliação
da toxicidade dos produtos formados a partir de experimentos in vitro com células
hepáticas do peixe zebra Danio rerio da linhagem celular ZFL.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1 Padrões analíticos, reagentes e solventes
Os padrões analíticos das aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2
e AFLAM1 foram adquiridas da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil), com pureza 98 %.
O metanol (pureza 99,95 %) e acetonitrila (pureza 99,98 %) de grau
cromatográfico foram adquiridos da Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, USA) e
127
separadamente filtrados através de membrana de nylon de 0,45 mm (Whatman, UK).
O ácido fosfórico (pureza 85 %) grau analítico, ácido acético glacial (pureza 98 %),
hexano (pureza 96 %) e benzeno (pureza 99 %) foram adquiridos da Merck
(Darmstadt, Alemanha). Clorofórmio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, sulfato de
amônio e sulfato de magnésio foram obtidos da Synth (São Paulo, Brasil). Acetato de
sódio e citrato de sódio foram obtidos da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil) e a terra
diatomácea foi obtida da Nuclear (Celite 545, São Paulo, Brasil). A água ultra pura
utilizada no preparo da fase móvel foi obtida por sistema de purificação e filtração
Direct-Q UV3® de resistividade 18 Ω.cm-1(Millipore, Bedford, MA, USA) e acidificada
com ácido acético glacial (99:1 v/v).
2.2 Preparo das soluções estoque e trabalho
Os padrões das micotoxinas foram dissolvidas em benzeno:acetonitrila
(98:2 v/v), resultando em concentração de 100 µg.mL-1 para aflatoxinas AFLAB1,
AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e benzeno:acetonitrila (9:1), resultando na concentração
de 1 µg.mL-1 para a aflatoxina AFLAM1. As soluções estoques foram diluídas de modo
a resultar em soluções trabalho cujas concentrações de 10 µg.mL-1 para as aflatoxinas
AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1 e AFLAG2 e 0,5 µg.mL-1 para AFLAM1. As concentrações
foram determinadas em espectrofotômetro modelo Cary 100 (Varian, EUA)
empregando os valores das absortividades molares ( ), 19800, 20900, 17100, 18200 e
18815 mol.cm-1 para as aflatoxinas AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1,
respectivamente (AOAC, 2000).
2.3 Preparo do meio de cultivo
O meio de cultivo foi preparado utilizando 39 g de Agar Batata Dextrose
(ABD – Himedia), correspondente a 15 g de Agar, 4 g de infusão de batata desidratada
e 20 g de dextrose para o volume de 1 litro de água destilada. O meio de cultivo foi
submetido ao processo de esterilização por autoclavagem durante 30 min. Em
seguida, foi vertido em placas de Petri em condições assépticas.
2.4 Preparo do inóculo
As cepas do micro-organismo Rhizopus oryzae (CCT7560) foram
adquiridas da coleção de culturas da Fundação André Tosello e mantidas a 4-8ºC em
128
meio Ágar Batata Dextrose (ABD), em tubos de ensaio, até o momento do uso. Os
esporos foram propagados, para repicagem, em emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%),
empregando raspagem com alça de cromo-níquel e novamente inoculada em meio
ABD 4% em placas de Petri. As culturas foram incubadas em câmaras de germinação
(Tecnal) durante 7 dias a 30ºC até nova e completa esporulação. Para retirada dos
esporos foram adicionados 50 mL de uma emulsão aquosa de Tween 80 (0,2%) no
cultivo raspando com alça de cromo-níquel e enumerando em câmara de Neubauer. A
concentração dos esporos foi estimada por enumeração no quadrante C da câmara. A
contagem de esporos foi realizada a partir da equação 1. A suspensão foi diluída de
forma a resultar em 4 x 106 esporos g-1 para adição nas placas de cultivo.
C = (M × 1000 × dil)/0,004 Equação 1.
onde: M é número médio de esporos contados no quadrante C da câmara de
Neubauer; 1000: fator de correção da câmara de Neubauer para mL; dil: 10, pois foi
colocado 1mL de solução de esporos em 9 mL de água; 0,004: fator de correção da
câmara de Neubauer para 1 mL.
2.5 Experimento da biodegradação
O meio de cultura ABD, foi vertido em placas de Petri e fortificado com
100 µg.kg-1 da AFLAB1 isoladamente e 100 µg.kg-1 das AFLAB1 AFLAG1, AFLAM1 e
10 µg.kg-1 de AFLAB2, AFLAG2 no experimento em mistura. Foi adicionada uma
suspensão de esporos contendo 4 x 106 esporos.g-1. Os cultivos foram realizados em
câmaras de germinação (Tecnal) a temperatura de 30°C durante 6 dias: 1º (0 h), 2º
(24 h), 3º (48 h), 4º (72 h), 5º (96 h) e 6º (120 h). Após o término dos cultivos, as
placas contendo as cepas dos micro-organismos foram armazenadas a -18ºC, para
interrupção do processo metabólico. O experimento foi realizado em triplicata.
2.6 Determinação das aflatoxinas
As aflatoxinas foram extraídas pelo método descrito por Soares e
Rodrigues Amaya (1989) adaptado para minimizar a quantidade de amostra e
solventes utilizados e, consistiu, no uso de 10 g de amostra de farelo de arroz,
homogeneizada em blender com 60 mL de metanol:cloreto de potássio 4% (9:1 v/v)
por 5 min. Em seguida, realizada a filtração foram recolhidos 30 mL do filtrado e
129
adicionados 30 mL de sulfato de amônio 30% e 10 cm3 de terra diatomácea. A mistura
foi agitada manualmente e deixada em repouso por 5 min e em seguida filtrada
novamente. Do filtrado foram recolhidos 30 mL para um funil de separação e
adicionados 30 mL de água destilada. Logo, foram realizadas duas partições com
10 mL de clorofórmio cada. Os extratos foram evaporados em banho-maria a 40ºC e
os frascos secos armazenados a -18ºC.
2.7 Instrumentação
Os extratos foram analisados em cromatografo Waters Alliance
Separations modelo 2695 equipado com bomba quaternária, injector automático e
compartimento de colunas termostatizado (Waters, Milford, MA, EUA). A separação
cromatográfica foi realizada com coluna C18 (10 cm 4,6 mm, 3 µm) Nucleosil®
(Bellefonte, PA, USA). Os componetes da fase móvel água ultra pura e acetonitrila,
ambos solventes acidificado com ácido acético com eluição em gradiente utilizando
adição crescente de acetonitrila iniciando com 0 min - 12%; 3 min - 45%; 3,8 min -
100% em seguida a diminuição da acetonitrila com 4,3 min - 12% e 10 min -12%, a
uma taxa de vazão de 1 mL.min-1, resultando em um tempo de corrida de 9 min e
volume de injeção de 10 µL.
O detector Quatro MicroTM API (triplo quadrupolo) de espectrômetro de
massas, equipado com ionização por eletronebulização (IEN) Micromass (Waters,
Milford, MA, EUA) foi utilizado. O gás de secagem, bem como o de nebulização, foi
gerado a partir de nitrogênio pressurizado num gerador NG-7 (Aquilo, Etten-Leur, NL).
O fluxo de gás por nebulização foi ajustado para 100 L.h-1 e o fluxo de gás de
dessolvatação, para 500 L.h-1. Para a operação no modo EM-EM, o gás colisão foi
argônio (White Martins, Rio Grande do Sul, Brasil), com uma pressão de 2,5 x 10-3
mbar na célula de colisão. Os valores otimizados foram: tensões capilares, 5,0 kV;
temperatura da fonte de 120ºC, temperatura dessolvatação 400ºC; multiplicador 650V;
e o intervalo de varredura, 50 a 350 m/z. Após a otimização da energia de célula de
colisão do triplo quadrupolo, dois diferentes íons de transição (íon precursor e íon
produto) foram selecionados, uma para quantificação e uma para a qualificação, e
esses íons foram monitorados no tempo programado na condição de monitoramento
de múltipla reação.
O processamento de dados e análise da estrutura foi realizada por meio do
programa MassLynx versão 4.1 (Micromass, Manchester, UK). Com o qual podem ser
130
identificadas as composições elementares, com base nos dados recolhidos sobre a
massa exata de cada composto, e ao mesmo tempo, obter informações sobre os íons
precursores e íons produtos, coletados a partir dos dados de uma injeção de amostra.
(Anexo 8).
2.8 Avaliação da toxicidade dos extratos
A linhagem celular ZFL, de hepatócitos de Danio rerio, foi mantida com
meio de cultura RPMI 1640, suplementado com bicarbonato de sódio (0,2 g.L-1), L-
glutamina (0,3 g.L-1) e Hepes (3 g.L-1), com 10% de soro fetal bovino e 1% de
antibiótico e antimicótico, em garrafas de cultura a 28ºC (TRINDADE et al., 1999).
As células ZFL (3 x 105 células.mL-1) foram incubadas por 48 h para
aderência em placas de cultura de 96 poços a 28ºC. As células foram então tratadas
em meio contendo diferentes concentrações (12,5; 25; 50 e 100 ng.mL-1) da AFLAB1
pura e degradada por até seis dias e, as células controle receberam o mesmo volume
de DMSO, oqual foi utilizado para solubilizar a aflatoxina (0,05%). Após tratadas, as
linhagens celulares foram incubadas a 28ºC por 24, 48 e 72 h, sendo que uma das
placas foi utilizada para leitura imediata 28ºC (TRINDADE et al., 1999).
A viabilidade celular foi avaliada pelo método 3-4,5-dimetiltiazol-2-il,2,5-
difeniltetrazolium (MTT) imediatamente, 24, 48 e 72 h, após a exposição, de acordo
com Trindade e colaboradores (1999). As células após a incubação, foram lavadas
com PBS e foram adicionados 200 L de meio de cultura sem micotoxina e 20 L de
solução de MTT (5 mg.mL-1) em cada poço. As placas foram incubadas por 3 h a
28ºC. O meio contendo MTT foi removido e os cristais de formazan dissolvidos em
200 L de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). Os valores de absorbância a 490 nm foram
determinados no leitor ELISA (ELX 800 Universal Leitora, Bio-TEK).
Cada experimento foi repetido em três ocasiões independentes usando
tréplicas das amostras. Os dados dos experimentos referentes à avaliação da
sensibilidade aos tratamentos foram apresentados como médias ± erro padrão,
analisados utilizando ANOVA com pós-teste de Tukey. Os valores de p menores que
0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
131
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os parâmetros de confiabilidade analítica previamente validados para
determinação das AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2 e AFLAM1 residuais foram os
limites de detecção e quantificação do instrumento e do método com valores de 0,1 e
0,5 ng.mL-1 e 0,04 e 0,2 µg.kg-1, repectivamente para todas as aflatoxinas em estudo,
com linearidade na faixa de 0,5 – 100 ng.mL-1 e recuperações de 71, 88, 74, 92 e 66%,
respectivamente.
O modelo de regressão linear foi adequado para a determinação das
aflatoxinas e os coeficientes de variação abaixo de 20%, conforme recomendação do
INMETRO e IUPAC. O valor do efeito da matriz nas condições empregadas era
insuficiente para afetar os resultados de quantificação das aflatoxinas usadas no
estudo de biodegradação, pois, variaram de 1,04 a 8,56%.
Os níveis de degradação da AFLAB1 pelo micro-organismo Rhizopus
oryzae individualmente e em mistura com outras aflatoxinas, ao longo dos cinco dias
de cultivo, extraídos pelo método Soares e Rodrigues Amaya (1989) estão
apresentados na Tabela 1.
O micro-organismo degradou a AFLAB1 a níveis não detectáveis após o 5º
dia de cultivo individualmente. Na mistura das cinco aflatoxinas, sob as mesmas
condições, nenhuma delas teve seus níveis diminuídos a níveis não detectáveis pelo
método (Tabela 1). O espectros de massa, obtidos dos extratos dos cultivos de
AFLAB1 isolada durante o 5º e o 6º dia (Figura 2) e em mistura das aflatoxinas (Figura
3), foram analisados encontrando-se valores não detectaveis da AFLAB1 nos extratos
da biomassa contendo esta micotoxina isolada e valores inferiores a 7 µg.kg-1 da
AFLAB1 na mistura após 5º e o 6º dia de cultivo (Tabela 1).
A partir da Figura 2, percebe-se que, as razões massa-por-carga (m/z) dos
produtos formados pela degradação da AFLAB1 isolada (m/z 312), formaram
composições moleculares de razões massa-por-carda de m/z 349, 337, 319 e 305.
As razões massa-por-carga (m/z) dos produtos formados pela degradação
da AFLAB1 (m/z 312) na mistura (Figura 3) mostraram um aumento da concentração
da AFLAM1 (m/z 328) no 5º dia cultivo demonstrado no espectro de massas com o
produto de razão (m/z 327). No 6º dia de cultivo esta concentração diminuiu e se
detectaram produtos com razão massa-porcarga (m/z) semelhante aos produtos
formados quando a AFLAB1 não está em mistura.
132
Tabela 1. Níveis residuais de AFLAB1 (µg.kg-1) e da mistura de aflatoxinas (µg.kg-1) na
biomassa de Rhizopus oryzae.
Aflatoxina Cultivo isolado (dias)
1º 2º 3º 4º 5º 6º
AFB1 96,0 2,3 89,9 2,5 79,2 1,5 25,6 1,5 Nd Nd
Aflatoxinas Cultivo em mistura
AFB1 96,5 2,3 36,6 4,2 22,4 1,1 14,2 1,4 6,6 0,8 1,9 2,1
AFB2 10,1 3,7 6,8 1,4 3,3 0,9 3,2 0,3 2,6 1,0 2,6 0,7
AFG1 96,7 1,8 57,0 1,6 55,1 3,6 23,3 2,4 20,3 1,0 10,4 2,3
AFG2 8,6 2,1 8,4 1,3 8,2 0,6 5,1 1,2 5,1 1,1 4,1 1,3
AFM1 89,8 3,8 77,1 2,1 128,3 1,0 89,8 1,3 218,1 1,1 77,6 0,9
Nd.: não detectado.
A toxicidade da AFLAB1 está relacionada com a presença do anel
ciclopentanona e a ligação dupla entre os carbonos C8 e C9, que formam o éter
vinílico além do anel furano terminal (HUSSEIN & BRASEL, 2001; YU et al., 2004;
XIAOHU et al., 2013). O anel furano terminal é considerado a parte que determina o
potencial toxigênico desta estrutura, e também a sua atividade carcinogênica. A
remoção da ligação dupla do anel furano terminal é a melhor forma para a
detoxificação da AFB1 e das demais que possuem esta ligação (AFM1 e AFG1).
Em vista da busca de demonstrar a ação de detoxificação destes
compostos pelo Rhizopus oryzae durante seu desenvolvimento, foram conduzidos os
estudos de toxicidade da biomassa produzida em presença de AFB1 após cinco dias
de cultivo.
Em relação à atividade do padrão puro da AFLAB1 nas células ZFL, foi
possível observar um aumento de proliferação nas concentrações de 25 e 50 ng.mL-1
em 72 h em relação às células controle, comprovando o potencial toxigênico da
aflatoxina estudada.
No 1º dia de cultivo, onde o micro-organismo ainda não havia atingido sua
forma de crescimento ideal para degradar a AFLAB1, foi observado a proliferação
celular na concentração de 50 ng.mL-1. No 2º dia observa-se que não houve tendência
a proliferação celular, possívelmente pelo efeito do procedimento experimental, pois a
AFLB1 ainda apresentava 90% de concentração inicial. No 3º dia este efeito foi
observado na concentração de 50 ng.mL-1 em 72 h em relação às células controle.
(Figura 4).
133
No 4º e 6º dia não foram observadas diferenças na proliferação celular
sugerindo que nos produtos formados não degradação pelo micro-organismo
Rhizopus oryzae, as ligações que indicam o potencial toxigênico da AFLAB1 possam
ter sido quebradas. No entanto, no 5º dia houve uma tendência ao aumento do
número de células na concentração de 50 ng.mL-1 (Figura 5), isso pode ter ocorrido
pela formação do produto de razão massa-por-carga (m/z 328), possívelmente sendo
a AFLAM1 comprovado pela Tabela 1 e pela proliferação celular do padrão puro da
AFLAB1 (Figura 6).
136
imediata 24h 48h 72h0.0
0.1
0.2
0.3
0.4Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1 degradada 0h!
100ng/mL
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
imediata 24h 48h 72h0.0
0.1
0.2
0.3
0.4Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1 24h!
100ng/mL
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
imediata 24h 48h 72h0.0
0.2
0.4
0.6Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1 48h!
100ng/mL
*
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
Figura 4. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 1º (A), 2º (B) e
3º (C) dia.
2º dia de cultivo
1º dia de cultivo
3º dia de cultivo
A
B
C
137
imediata 24h 48h 72h0.0
0.2
0.4
0.6
0.8Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1 degradada 72 h
100ng/mL
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
imediata 24h 48h 72h0.0
0.2
0.4
0.6Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1 degradada 96h!
100ng/mL
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
imediata 24h 48h 72h0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1 120h!
100ng/mL
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
Figura 5. Proliferação celular em meio fortificado cultivado no 4º (A), 5º (B) e
6º (C) dia.
4º dia de cultivo
5º dia de cultivo
6º dia de cultivo
A
B
C
138
imediata 24h 48h 72h0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0Controle
12,5ng/mL
25ng/mL
50ng/mL
ZFL - Micotoxina B1
100ng/mL
**
Tempo
Den
sid
ad
e Ó
pti
ca
Figura 6. Aflatoxina B1 padrão puro 100µg.kg-1.
(*) Diferença significativa em relação ao controle.
4. CONCLUSÃO
O micro-organismo Rhizopus oryzae é capaz de degradar a aflatoxina B1
isoladamente e em mistura, os produtos formados desta degradação mostram que,
quando degradada isoladamente a AFB1 forma produtos que não possuem mais
características toxigênicas e carcinogênicas, no entanto, quando em mistura com
outras aflatoxinas, os produtos de degradação sem características toxigênicas são
formados em 120 h de cultivo.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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AOAC international, 17th ed., AOAC: Arlington, 2000.
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2012. 21CFR173.130.
CFR, 2012b.: Code of Federal Regulations, Title 21, Volume 3, Revised as of April 1,
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142
CONCLUSÃO GERAL
As condições para separação das cinco aflatoxinas estudadas foi
estabelecida por planejamento experimental sendo a fase móvel uma mistura de água
acidificada com ácido acético (99:1 v/v), acetonitrila e metanol (60:8:32 v/v/v) na vazão
0,6 mL min-1 a 45ºC. A extração pelo método Soares e Rodrigues Amaya adaptado
resultou em recuperações médias de 70, 88, 74, 92 e 66% para AFLAB1, AFLAB2,
AFLAG1, AFLAG2, e AFLAM1, respectivamente, com desvios inferiores a 20%.
No estudo de degradação das AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e
AFLAM1, envolvendo os micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei,
ficou demonstrado que o Rhizopus oryzae foi mais eficiente utilizando uma quantidade
de esporos de 4 x 106 esporors g-1 em um tempo de 72 h de cultivo chegando a níveis
não detectáveis, tanto nos estudos individuais da AFLAB1, bem como no meio com a
mistura. Uma relação inversa entre níveis de AFLAB1 e AFLAM1 foi demonstrada no
meio fortificado com todas as aflatoxinas.
O acompanhamento da degradação da AFLAB1 pelos micro-organismos
Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei mostrou que se formaram dez derivados cuja
dupla ligação do anel furano terminal foi quebrada, apenas para o Trichoderma reesei
um dos derivados não teve esta característica, mantendo a toxicidade do composto.
No estudo de toxicidade as células do hepatócito ZFL não mostraram
tendência à proliferação celular no meio fortificado com AFLAB1 cultivado com
Rhizopus oryzae em 72 h de cultivo da biomassa.
143
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Avaliar a toxicidade dos produtos formados pela degradação das AFLAG1,
AFLAG2, AFLAB2 e AFLAM1 pelos micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma
reesei.
Avaliação das enzimas produzidas pelos micro-organismos Rhizopus
oryzae e Trichoderma reesei em presença das AFLAB1, AFLAB2, AFLAG1, AFLAG2, e
AFLAM1.
Estudar o efeito dos micro-organismos Rhizopus oryzae e Trichoderma
reesei durante a fermentação semi sólida tendo o farelo de arroz fortificados com as
aflatoxinas como substrato.
144
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159
ANEXO 1
Equações que descrevem as respostas previstas pelo modelo em função das variáveis independentes do planejamento DCCR.
Aflatoxinas Equações dos modelos ajustados
Tempo de retenção (Y1) Fator de separação (Y2) Resolução (Y3)
AFM1
AFG2
AFG1
AFB2
AFB1
x1: proporção da fase móvel; x2: vazão da fase móvel; x3: temperatura da coluna.
ANEXO 2
Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCCR.
Tempo de retenção (Y1) Fator de capacidade (Y2) Resolução (Y3)
Fonte V. SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2
AFM1
Regres. 172,8 2 86,4 16,9 4,5 0,84 0,0007 2 0,00035 13,3 3,6 0,81 1,02 4 0,256 28,4 8,7 0,95
Resíduo 71,8 14 5,1 0,0003 14 0,00002 0,11 12 0,009
Total 244,6 0,0011 1,14
160
(Continuação)
Tempo de retenção (Y1) Fator de capacidade (Y2) Resolução (Y3)
Fonte V. SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2 SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2
AFG2
Regres. 196,8 2 98,4 17,5 4,7 0,84 0,0015 1 0,00158 15,3 3,4 0,71 0,89 3 0,297 42,4 12,4 0,95
Resíduo 78,8 14 5,6 0,0015 15 0,00010 0,09 13 0,007
Total 275,7 0,0031 0,98
AFG1
Regres. 291,3 2 145,6 18,7 5,0 0,85 0,0176 1 0,01768 105,2 23,2 0,93 3,94 2 1,974 44,9 12,0 0,93
Resíduo 109,1 14 7,8 0,0025 15 0,00016 0,62 14 0,044
Total 400,4 0,0202 4,57
AFB2
Regres. 430,1 2 215,1 24,2 6,5 0,90 0,0644 2 0,03224 161,2 43,2 0,98 2,97 2 1,485 95,7 25,6 0,80
Resíduo 125,4 14 8,9 0,0030 14 0,00020 1,68 14 0,120
Total 555,5 0,0674 4,65
AFB1
Regres. 691,1 3 230,4 38,8 11,4 0,95 0,2181 2 0,10906 205,8 55,2 0,98 4,47 1 4,475 79,9 17,6 0,91
Resíduo 77,2 13 5,9 0,0074 14 0,00053 0,84 15 0,056
Total 768,3 0,2255 5,32
Fonte V.: Fonte de Variação; AF.: Aflatoxina; Regres.: Regressão; SQ.: Soma quadrática; GL.: Graus de Liberdade; MQ.: Média quadrática; Fcal: F calculado (1:15-4,54; 2:14-
3,73; 3:13-3,41; 4:12-3,25); Ftab: F tabelado; R2: coeficiente de regressão.
161
ANEXO 3. Figuras do experimento DCCR
Figura 1. Experimento 1 do planejamento DCCR.
Figura 2. Experimento 2 do planejamento DCCR.
Figura 3. Experimento 3 do planejamento DCCR.
162
Figura 4. Experimento 4 do planejamento DCCR.
Figura 5. Experimento 5 do planejamento DCCR.
Figura 6. Experimento 6 do planejamento DCCR.
163
Figura 7. Experimento 7 do planejamento DCCR.
Figura 8. Experimento 8 do planejamento DCCR.
Figura 9. Experimento 9 do planejamento DCCR.
164
Figura 10. Experimento 10 do planejamento DCCR.
Figura 11. Experimento 11 do planejamento DCCR.
Figura 12. Experimento 12 do planejamento DCCR.
165
Figura 13. Experimento 13 do planejamento DCCR.
Figura 14. Experimento 14 do planejamento DCCR.
Figura 15. Experimento 15 do planejamento DCCR.
166
ANEXO 4
Análise de variância (ANOVA) do planejamento DCC. Tempo de retenção (Y1’) Fator de capacidade (Y2’) Resolução (Y3’)
Fonte V. SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2
SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2
SQ GL MQ Fcal Fcal/Ftab R2
AFM1
Regressão 14,6 2 7,29 104,3 15,0 0,99 - - - - - - 0,0515 2 0,02578 644,5 92,8 0,99
Resíduo 0,3 4 0,07 - - - 0,0002 4 0,00004
Total 14,8 - 0,0517
AFG2
Regressão 14,2 2 7,11 82,4 11,9 0,99 0,00068 2 0,00034 1,4 0,2 0,98 0,0458 2 0,0229 229,0 32,9 0,99
Resíduo 0,3 4 0,08 0,000001 4 0,0000002 0,0005 4 0,0001
Total 17,6 0,000069 0,0463
AFG1
Regressão 25,2 2 12,60 92,3 13,3 0,98 0,001765 2 0,0008825 566,6 81,6 0,99 0,3201 2 0,1600 1600 231 0,99
Resíduo 0,5 4 0,13 0,000006 4 0,0000015 0,0005 4 0,0001
Total 25,8 0,001771 0,3206
AFB2
Regressão 39,3 2 19,65 85,9 12,4 0,98 0,005791 2 0,0028955 373,6 53,8 0,99 0,2606 1 0,2606 41,4 6,2 0,99
Resíduo 0,9 4 0,22 0,000031 4 0,0000077 0,0032 5 0,0063
Total 40,2 0,005822 0,2638
AFB1
Regressão 58,9 2 29,43 79,3 11,4 0,98 0,064262 1 0,064262 9,6 1,4 0,81 - - - - - -
Resíduo 1,5 4 0,37 0,033200 5 0,00664 - - -
Total 60,4 0,097462 -
Fcal: F calculado (2:4-6,94; 5:1-6,60); Ftab: F tabelado; R2: coeficiente de regressão; AF.: aflatoxina; (-) não apresentaram valores signficativos.
167
ANEXO 5. Figura dos experimentos DCC.
Figura 16. Experimento 1 do planejamento DCC.
Figura 17. Experimento 2 do planejamento DCC.
Figura 18. Experimento 3 do planejamento DCC.
169
ANEXO 6. Separação CLAE-IEN-EM/EM
Figura 21. Separação cromatográfica das aflatoxinas em CLAE-IEN-EM/EM
ANEXO 7
Parâmetros validados para CLAE-IEN-EM/EM.
AFS CLAE-IEN-EM/EM
TR (min) Curva analítica R2 Curva matriz EM (%)
AFLAM1 7,2 5706,4 + 1,9 0,98 5503,5 + 2,8 3,68
AFLAG2 7,5 5258,6 + 2,7 0,97 5514,9 + 10,1 4,64
AFLAG1 7,8 12595,7 -0,02 0,98 13775,8 - 0,1 8,56
AFLAB2 8,0 7610,1 + 6,0 0,98 7800,1 + 2,1 2,43
AFLAB1 8,1 6553,4 + 6,9 0,98 6622,7 + 8,08 1,04
AFLAS.: Aflatoxinas; TR.: tempo de retenção; EM.: efeito matriz.