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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

MAIRA CRISTINA SCHUSTER RUSSIANO

POTENCIAL ANTAGONISTA DE Bradyrhizobium spp. SOBRE

PATÓGENOS DE SOLO NA CULTURA DA SOJA

DISSERTAÇÃO

PATO BRANCO

2020




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Pato Branco, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Agronomia - Área de Concentração: Produção Vegetal.

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Miguel Mazaro Coorientador: Prof. Dr. Francisco Menino Des-

tefanis Vítola

PATO BRANCO

2020

Ministério da Educação Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Campus Pato Branco Diretoria de Pesquisa e Pós-Graduação

Programa de Pós-Graduação em Agronomia

TERMO DE APROVAÇÃO

Título da Dissertação n°



Por


Dissertação apresentada às 9 horas do dia 18 de fevereiro de 2020 como requisito parcial para obtenção do título de MESTRE EM AGRONOMIA, Linha de Pesquisa – Produção Vegetal, Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção vegetal) da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Pato Branco. A candidata foi arguida pela Banca Examinadora composta pelos membros abaixo designados. Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho APROVADO. Banca examinadora:

Dr. Marco Antônio Nogueira EMBRAPA Soja

Prof. Dra. Deborah Catharine de Assis Leite UTFPR/Dois VizinhosUFPR

Prof. Dr. Sérgio Miguel Mazaro UTFPR/Dois Vizinhos

Orientador

Prof. Dr. Alcir José Modolo Coordenador do PPGAG

“O Termo de Aprovação, devidamente assinado, encontra-se arquivado na Coordenação do PPGAG, conforme Norma

aprovada pelo Colegiado do Programa.”

Dedico este trabalho à Deus, aos meus pais, ao meu marido, e ao meu orientador, porque acreditaram, torceram, apoiaram e mantiveram-se ao meu lado nos bons e nos maus momentos.

AGRADECIMENTOS

Aqui expresso minha gratidão à Deus pela vida, saúde, pelas bênçãos

concedidas e por me manter em pé frente as provações.

Agradeço a minha mãe Edemilde C. V. Schuster, que desde pequena foi minha

principal apoiadora, sonhou por mim e nunca duvidou da minha capacidade. Pela

pessoa otimista que és, sempre dando esperança a todos, a ela toda a minha

admiração.

Ao meu pai Ilço Schuster, que enquanto esteve comigo, sempre manifestou o

seu amor e admiração por mim e pela nossa família, sempre apoiou e defendeu meus

estudos, demonstrando-se um pai orgulhoso pelo que conquistei, a ele todo o meu

amor e saudade.

Ao meu marido Carlos Guilherme S. Russiano, meu porto seguro, um

verdadeiro amigo e companheiro, o qual segurou as pontas em todos os momentos

difíceis, nunca saiu do meu lado, sendo a tranquilidade em meio a tribulação, a ele

todo o meu apreço.

Ao meu orientador Sérgio Miguel Mazaro, pela oportunidade de estar sob sua

orientação, pela confiança em mim depositada, por sempre ter um conselho e uma

palavra amiga nos momentos difíceis, por ter sido um paizão, por toda ajuda e tempo

dedicado, a ele toda minha gratidão.

Aos demais familiares, irmãos, cunhados, sobrinhos, sogros, amigos e colegas

meu muito obrigado.

“Estou em todo o caso convencido de que Deus não joga aos dados”. (Albert Einstein)

RESUMO SCHUSTER-RUSSIANO, Maira Cristina. Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp sobre patógenos de solo da cultura da soja 103 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção vegetal), Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2020. Bradyrhizobium spp. se caracteriza como um inoculante utilizado na fixação biológica de nitrogênio em soja, porém seu potencial no controle de fitopatógenos ainda é pouco explorado. Deste modo, o presente trabalho objetiva avaliar o potencial antagonista de quatro estirpes/estirpes de Bradyrhizobium spp. disponíveis no Brasil, sendo elas SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 no controle biológico de Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum. Em experimento in vitro foi avaliado o antagonismo exercido por Bradyrhizobium spp. por meio de confronto direto envolvendo dois métodos, sendo eles o método de confronto do agente de controle biológico versus o fitopatógeno em meio de cultura, que consiste em placas de Petri com meio YM, onde as estirpes de Bradyrhizobium spp. foram colocadas em um círculo de 4 cm de diâmetro, e no centro deste círculo foi transferido um disco de micélio de 7mm de diâmetro do fungo fitopatogênico; e pelo método da microbiolização de sementes de soja com as estirpes de Bradyrhizobium spp., onde as sementes microbiolizadas foram postas a 1cm de distância da borda da placa de Petri com meio BDA, e do lado oposto foi transferido um disco de micélio de 7mm de diâmetro do fitopatógeno à 1cm de distância da borda oposta. As amostras de cada tratamento do método do confronto em meio de cultura foram submetidas à microscopia eletrônica de varredura com ampliação de 500 vezes, a fim de observar as modificações morfológicas das hifas fúngicas quando em contato direto com as estirpes estudadas. Também foram realizados ensaios para verificar o potencial de antifúngico dos filtrados dos cultivos (metabólitos) das estirpes de Bradyrhizobium spp., isento de células, o qual foi incorporado em meio BDA fundente na concentração de 10% e transferido em placas de Petri, no centro da placa foi disposto um disco de micélio de 7mm de diâmetro do patógeno conforme tratamentos. Ainda avaliou-se a ação antifúngica dos metabólitos pela metodologia da Concentração Inibitória Mínima, através da microdiluição seriada de metabólitos das estirpes de Bradyrhizobium spp. Para ambos os métodos de confronto direto e para a avaliação antifúngica, as placas foram mantidas em BOD a 25°C com fotoperíodo de 12 horas, diariamente, quantificou-se o crescimento micelial dos fitopatógenos, até que o tratamento testemunha contendo apenas o fitopatógeno atingisse o crescimento completo na borda da placa de Petri. O delineamento experimental adotado em todos os experimentos, foi o inteiramente casualizado com quatro repetições. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de normalidade de Lilliefors; e por se tratarem de experimentos qualitativo x quantitativo, realizou-se a ANOVA seguido da análise de regressão no software Genes. Pode-se observar no confronto direto tanto pelo método das estirpes de Bradyrhizobium versus fitopatógenos, quanto pela microbiolização das sementes de soja, que as estirpes SEMIA 5080 e SEMIA 5019 foram as que obtiveram melhor controle dos quatro fitopatógenos estudados, seguido pelo bom desempenho da estirpe SEMIA 5079, sendo que a estirpe SEMIA 587 não demonstrou controle algum sobre os fitopatógenos. Os metabólitos das estirpes de Bradyrhizobium

spp. na concentração de 10%, não apresentaram ação antifúngica sobre os fitopatógenos estudados.

Palavras-chave: Fitopatógenos, cepas, competição, antibiose, confronto, metabólitos.

ABSTRACT SCHUSTER-RUSSIANO, Maira Cristina. potential antagonist of Bradyrhizobium spp. in the biological control of soybean diseases. 103 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Área de Concentração: Produção vegetal), Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Pato Branco, 2018. Bradyrhizobium spp., it is characterized as a good inoculant for biological nitrogen fixation in soybean, but its potential in the control of phytopathogens is still little known. Thus, the present work aims to evaluate the potential antagonist of four strains Bradyrhizobium spp. SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 and SEMIA 5080 in the biological control of Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, and Sclerotinia sclerotiorum. The in vitro experiment was evaluated or antagonized by Bradyrhizobium spp. through direct confrontation involving two methods, the method of confrontation with the biological control agent versus the adjustment in the culture medium, which consists of Petri plates with YM medium, where the strains of Bradyrhizobium spp. they were placed in a 4 cm diameter circle, and no center of this circle was transferred to a 7 mm diameter mycelium disk of the phytopathogenic fungus; and by the soybean seed microbiolization method with strains of Bradyrhizobium spp., where microbiolized seeds were placed 1 cm away from the edge of the Petri plate with BDA medium, and on the opposite side was transferred to a 7mm mycelium disk adjustment diameter 1 cm away from the opposite edge. As the samples of each treatment of the confrontation method in the culture medium were subjected to scanning electron microscopy with 500 times magnification, an end of observation as morphological changes of the fungal hyphae when in direct contact with the studied cephae. Assays were also performed to verify the antibiosis of Bradyrhizobium spp. Strains using the cell-free agent filtrate, which was incorporated into 10% concentration BDA flux media and transferred to Petri plates in the center of the plate, a 7mm diameter mycelium disc of the pathogen was arranged according to treatments. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) methodology was used for the verification of antibiosis through serial microdilution of Bradyrhizobium spp. free from living cells. For both confrontation methods and plaque antibiosis evaluation, mycelial growth evaluations were performed daily with the aid of a graduated ruler every 24 hours until the control containing only the phytopathogen reached full growth at the edge of the plate. Petri plate. The experimental design adopted in all experiments was completely randomized with four replications. The obtained data were submitted to the Lilliefors normality test; and because these were qualitative x quantitative experiments, ANOVA was performed followed by regression analysis in the Genes software. It can be observed in the confrontation by both the adapted method of the circle and the microbiolization of soybean seeds that the SEMIA 5080 and SEMIA 5019 strains obtained the best control of the four studied phytopathogens, followed by the good performance of the SEMIA 5079 strain. The SEMIA 587 strain showed no control over phytopathogens. The strains of Bradyrhizobium spp. showed no antibiosis on phytopathogens at 10% concentration, as well as on MIC. Keywords: Phytopathogens, strains, competition, antibiosis, confrontation, metabolites.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 01 - Quebra da ampola com o auxílio de instrumento de madeira..................33 Figura 02 - Retirada do algodão da embalagem, hidratação do material, retirada e

transferência do material em placa de Petri......................................34 Figura 03 - Repicagem de estirpes de Bradyrhizobium spp. utilizando becker...........35 Figura 04 - Placas contendo Fusarium crassistipitatum (CMES 24), Macrophomina

phaseolina (CMES 1574), Rhizoctonia solani (CMES1861) e Sclerotinia sclerotiorum (CMES 2131) aos nove dias de crescimento micelial......36

Figura 05 - Unidade experimental composta pela placa de Petri contendo o círculo

com Bradyrhizobium spp. de 4 cm de diâmetro formado pelo becker com um disco de micélio de 7mm do fitopatógeno no centro. A foto da direita apresenta os tratamentos acondicionados na BOD..................38

Figura 06 - Acompanhamento diário para medir o diâmetro da colónia com auxílio

de régua graduada..............................................................................38

Figura 07 - Unidade experimental composta por placa de Petri com meio BDA, do

lado esquerda a semente de soja microbiolizada com Bradyrhizobium spp. e a direita o disco de micélio do fitopatógeno..............................40

Figura 08 - Microscópio Hitachi TM 3000 a esquerda, e a direita o aparato com fita de cobre utilizado para leitura da amostra......................................41

Figura 09 - Tubo falcon contendo o sobrenadante das células de Bradyrhizobium

spp. após ser centrifugado a esquerda. A direita encontra-se a membrana Millipore® acoplada a seringa para a filtragem dos metabólitos.....................................................................................42

Figura 10 - Solução de trabalho correspondente aos quatro tratamentos contendo

as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587..................................................................................................44

Figura 11 - Adição de meio BD à placa de elisa, e na direita a realização da microdiluição da solução de trabalho..................................................45

Figura 12 - Resultado do potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA

5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum em 168 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo..................................................................................................48

Figura 13 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA

5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro

de Fusarium crassistipitatum aos nove dias após início do experimento........................................................................................49

Figura 14 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5079 de

Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum aos nove dias após início do experimento.................49


5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina em 168 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo..................................................................................................50


5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina aos nove dias após início do experimento........................................................................................51


5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani em 168 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo..................................................................................................52


5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani aos nove dias após início do experimento........................................................................................53

Figura 19 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5079 de

Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani aos nove dias após início do experimento..........................................53


5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum em 192 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo..................................................................................................54


5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias após início do experimento........................................................................................55


5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias após início do experimento........................................................................................55

Figura 23: Resultado do potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da

inoculação via semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum em 96 horas de avaliação..........................................57

Figura 24 - Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da inoculação via semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum...........58

Figura 25 - Comparação do crescimento micelial de Fusarium crassistipitatum através

da inoculação via semente com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos seis dias após início do experimento............................................59

Figura 26 - Resultado do potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da

inoculação via semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina em 72 horas de avaliação.................................................60

Figura 27 - Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da inoculação via

semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina..........61

Figura 28 - Comparação do crescimento micelial de Macrophomina phaseolina

através da inoculação via semente com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos nove dias após início do experimento........................................................................................61


inoculação via semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani em 96 horas de avaliação...................................................................62


semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani......................63

Figura 31 - Comparação do crescimento micelial de Rhizoctonia solani através da

inoculação via semente com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos nove dias após início do experimento.................................................63


inoculação via semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum em 72 horas de avaliação...............................................64


semente das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum........................................................................................65

Figura 34 - Comparação do crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum através da inoculação via semente com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos nove dias após início do experimento..........................................65

Figura 35 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado

as hifas da testemunha de Fusarium crassistipitatum aos nove dias de avaliação.............................................................................................66

Figura 36 - Microscopia eletrônica de varredura com ampliação de 500 vezes,

apresentado as hifas de Fusarium crassistipitatum quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 587 aos nove dias de avaliação.............................................................................................67


as hifas da testemunha de Macrophomina phaseolina aos nove dias de avaliação.............................................................................................68


apresentado as hifas de Macrophomina phaseolina quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 5080 aos nove dias de avaliação.............................................................................................69






apresentado as hifas de Macrophomina phaseolina quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 587 aos nove dias de avaliação.................................................................................72


as hifas da testemunha de Rhizoctonia solani aos nove dias de avaliação.............................................................................................73


apresentado as hifas de Rhizoctonia solani quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 587 aos nove dias de avaliação.............................................................................................74

Figura 44 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado as hifas da testemunha de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias de avaliação.............................................................................................75


as hifas de Sclerotinia sclerotiorum quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 5080 aos nove dias de avaliação.............................................................................................76


apresentado as hifas de Sclerotinia sclerotiorum quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 5079 aos nove dias de avaliação.............................................................................................77





Figura 49 - Efeito dos filtrados (metabólitos) das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079,

SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum em 120 horas de avaliação..................................................................81

Figura 50 - Aplicação dos filtrados metabólicos na concentração de 10%, obtidos das

estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum aos nove dias após início do experimento..................82


SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina em 72 horas de avaliação.................................................83


estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina aos nove dias após início do experimento.........................83


SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani em 72 horas de avaliação..............................................................................84

Figura 54 - Aplicação dos filtrados metabólicos na concentração de 10%, obtidos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani aos nove dias após início do experimento..........................................85


SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum em 72 horas de avaliação...................................................................86


estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias após início do experimento......................87

Figura 57 - Método da microdiluição realizada em placas de elisa para obtenção da

concentração inibitória mínima dos metabólitos das estirpes de Bradyrhizobium spp. para o controle dos fitopatógenos em estudo.....88

Figura 58 - Placas bipartidas contendo do lado esquerdo a estirpe fúngica de M.

phaseolina e na direita a testemunha com água destilada, SEMIA 5080 e SEMIA 5019 respectivamente, aos sete dias de avaliação...............95

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - ANOVA correspondente aos ensaios com Macrophomina phaseolina, Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium crassistipitatum................................47

Tabela 02 - ANOVA correspondente ao ensaio com Sclerotinia sclerotiorum...........47 Tabela 03 - ANOVA correspondente ao ensaio com Fusarium crassistipitatum........56 Tabela 04 - ANOVA correspondentes aos ensaios com Macrophomina phaseolina e

Sclerotinia sclerotiorum.............................................................................56 Tabela 05 - ANOVA correspondente ao ensaio com Rhizoctonia solani...................56 Tabela 06 - ANOVA correspondente ao ensaio com Fusarium crassistipitatum.......80 Tabela 07 - ANOVA correspondente aos ensaios com Macrophomina phaseolina,

Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium crassistipitatum.............................. 80

LISTA DE SIGLAS E ACRÔNIMOS

UTFPR Universidade Tecnológica Federal do Paraná PR Paraná Embrapa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento CONAB Companhia Nacional de Abastecimento PPGAG Programa de Pós-Graduação em Agronomia °C Unidade de medição de temperatura, graus célsius µL Unidade de volume equivalente à milionésima parte de um litro,

microlitro mL Unidade de volume L Unidade de volume, litro mm Unidade de medida, milímetros cm Unidade de medida, centímetros kg/ha Unidade de medida em rendimento, quilograma por hectare kg Unidade de grandeza em massa, quilogramas g Unidade de massa, gramas K2HPO4 Fosfato de Potássio dibásico MgSO4.7H2O Sulfato de Magnésio NaCl, Cloreto de Sódio YM Meio de cultivo yeast manitol, para cultivo de Bradyrhizobium spp. BDA Meio de cultivo, batata dextrose e ágar BD Meio de cultivo, batata e dextrose X Vezes : Divisão + Soma % Porcentagem ® Marca registrada BOD Estufa incubadora Demanda Química do Oxigênio ANOVA Análise de Variância MEV Microscopia Eletrônica de Varredura CIM Concentração Inibitória Mínima UFC Unidade formadora de colônias

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 22

1.2 OBJETIVO ........................................................................................................... 23

1.2.1 Geral................................................................................................................. 23

1.2.2 Específicos ....................................................................................................... 23

2 REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 25

2.1 A CULTURA DA SOJA ......................................................................................... 25

2.2 Bradyrhizobium COMO INOCULANTE ............................................................... 27

2.3 CONTROLE BIOLÓGICO ................................................................................... 28

2.3.1 Patógenos habitantes de solo .......................................................................... 30

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 33

3.1 CULTIVO DAS ESTIRPES DE Bradyrhizobium spp. ........................................... 33

3.2 CULTIVO E REPICAGEM DOS FITOPATÓGENOS ........................................... 35

3.3 AVALIAÇÃO DO ANTAGONISMO DE Bradyrhizobium spp. VERSUS

FITOPATÓGENOS EM CONFRONTO DIRETO EM MEIO DE CULTURA ............... 37

3.4 AVALIAÇÃO DO ANTAGONISMO DE Bradyrhizobium spp. VIA

MICROBIOLIZAÇÃO DA SEMENTE ......................................................................... 39

3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS HIFAS DOS PATÓGENOS POR MEIO DA MEV

.................................................................................................................................. 41

3.6 AVALIAÇÃO DOS METABÓLITOS DE Bradyrhizobium spp. SOBRE OS

FITOPATÓGENOS .................................................................................................... 42

3.6.1 Concentração Inibitória Mínima (CIM) .............................................................. 43

3.6.2 Efeito dos metabólitos voláteis de estirpes de Bradyrhizobium spp. sobre os

fitopatógenos ............................................................................................................. 46

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................... 47

4.1 POTENCIAL ANTAGONISTA DE Bradyrhizobium spp. POR MEIO DE

CONFRONTO DIRETO ............................................................................................. 47

4.1.1 Antagonismo pelo método de confronto das estirpes de Bradyrhizobium spp.

versus os fitopatógenos em meio YM....................................................................... 47

4.1.2 Antagonismo pela microbiolização das sementes em meio BDA ..................... 56

4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS HIFAS DOS PATÓGENOS CONFRONTADOS

POR Bradyrhizobium spp. ......................................................................................... 66

4.2.1 Fusarium crassistipitatum ................................................................................. 66

4.2.2 Macrophomina phaseolina ............................................................................... 68

4.2.3 Rhizoctonia solani ............................................................................................ 72

4.2.4 Sclerotinia sclerotiorum .................................................................................... 74

4.3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS METABÓLITÓS DE Bradyrhizobium spp. ... 79

4.3.1 Concentração Inibitória Mínima dos metabólitos das estirpes de

Bradyrhizobium spp. .................................................................................................. 87

4.4 DISCUSSÃO DO EFEITO ANTAGONISTA DE Bradyrhizobium spp. EM

CONFRONTO DIRETO ............................................................................................. 89

4.5 DISCUSSÃO DO EFEITO DOS METABÓLITOS DAS ESTIRPES DE

Bradyrhizobium spp. APLICADO SOBRE OS FITOPATÓGENOS ............................ 94

5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 96

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 97

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 98

22

1 INTRODUÇÃO

A cultura da soja adquire importância mundial, tendo o mercado estabelecido

para seus derivados como farelo e óleo (HENNING, 2017), além de ser destacada sua

importância no sistema de plantio direto, por ser uma boa opção na rotação de culturas

(ZITO et al. 2007).

Também se constitui uma cultura em ascensão no país, estimando-se um

aumento de 1,6%, atingindo 245,8 milhões de toneladas na safra 2019/2020 (CONAB,

2019). Que segundo a balança comercial do agronegócio de março de 2019, foi o

principal setor exportador do agronegócio em março de 2019, somando 46% do valor

total, atingindo vendas de US$ 3,98 bilhões.

Para sustentar esta alta produtividade, deve-se levar em consideração a

demanda nutricional, sendo o nitrogênio o elemento de maior exigência pela planta. A

cada tonelada de grãos, são requeridos 80 kg de nitrogênio, dos quais 65% saem da

cultura pelos grãos (ZITO et al. 2007). Cerca de 50 a 60% desta demanda é suprida

pela fixação biológica, realizada pela simbiose com bactérias do gênero

Bradyrhizobium spp. (ADAMI et al. 2017).

Tais bactérias pertencem à família Bradyrhizobiaceae, conhecidas como

“rizóbios” (REIS; TEIXEIRA, 2006). Estas penetram via pelo radicular, formando

nódulos nas raízes, e através da enzima nitrogenase adquirem a capacidade de

reduzir nitrogênio atmosférico a amônio (FERNANDES, RODRIGUES, 2012).

Por tanto nota-se a importância desta bactéria no suprimento de nitrogênio na

cultura da soja, porém outros aspectos ainda foram pouco explorados cientificamente,

como sua capacidade antagonista no controle biológico.

O controle biológico é a ação de introduzir organismos vivos capazes de

suprimir um ou mais organismos patogênicos na planta (PAL, GARDENER, 2006).

Bradyrhizobium spp. é considerado uma rizobactéria, pois atua na rizosfera. Agentes

de biocontrole da rizosfera são considerados promissores, tendo em vista que o solo

é um ambiente com condições estáveis de temperatura e umidade, em contraste com

a parte aérea, que sofre variações climáticas afetando a dinâmica da microbiota

(BETTIOL, MORANDI, 2009).

Dentre os mecanismos de ação das rizobactérias, pode-se destacar a

competição por nutrientes e espaço, onde competem por nichos ecológicos ou

nutrientes; e produção de substâncias antimicrobianas capazes de suprimir

microrganismos (ROMEIRO, 2007).

Espécies de rizóbio, tem sido estudadas no biocontrole, como Rizhobium

23

japonicum, em trabalho descrito por Rakib et al. (2012) o utilizaram no controle de

patógenos de solo, constatando o controle in vitro, em casa de vegetação e a campo

em plantas de soja.

Quanto aos patógenos de solo, pode-se destacar para a cultura da soja os

fungos Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e

Sclerotinia sclerotiorum. Fusarium crassistipitatum ocasiona podridão de raízes,

formando micélio branco-acinzentado; o gênero Rhizoctonia causa damping off ou

tombamento de plântula (AMORIN, REZENDE, BERGAMIN FILHO, 2011);

Macrophomina phaseolina causa podridão de carvão em soja, atingindo raiz e caule

(ALMEIDA et. al. 2014); e Sclerotinia sclerotiorum é o agente causal da doença

chamada mofo branco, ou podridão branca da haste e da vagem (GOULART, 2005).

Para tanto, é de importância científica verificar o potencial antagonista de

estirpes/estirpes de Bradyrhizobium spp. disponíveis no Brasil (SEMIA 587, SEMIA

5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080) sobre os fitopatógenos Fusarium crassistipitatum,

Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum.

1.2 OBJETIVO

1.2.1 Geral

Verificar o potencial antagonista de quatro estirpes de Bradyrhizobium spp.

disponíveis no Brasil (SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080) no

controle biológico de Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina,

Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum.

1.2.2 Específicos

• Avaliar se Bradyrhizobium spp. possui potencial no controle sobre Fusarium

solani, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum

em condições in vitro;

24

• Verificar quais os modos de ação são utilizados por Bradyrhizobium spp. no

controle dos fitopatógenos em estudo;

• Observar a melhor estirpe em específico de Bradyrhizobium spp. (SEMIA 587,

SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080) para o controle de cada

fitopatógenos;

• Avaliar os possíveis danos nas hifas dos fitopatógenos proporcionados pelo

contato direto com Bradyrhizobium spp;

• Verificar o efeito dos metabólitos produzidos pelas estirpes de Bradyrhizobium

spp. sobre os fitopatógenos.

25

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 A CULTURA DA SOJA

A soja (Glycine max (L.) Merrill) pertence à família Fabaceae, subfamília

Faboideae, tribo Phaseoleae, subtribo Glycininae e gênero Glycine. O processo de

domesticação iniciou-se entre os séculos 17 a.C e 11 a.C na região centro-leste do

norte da China (BARBIERI, STUMPF, 2008).

É um vegetal muito presente na alimentação mundial, tendo seu emprego na

forma de farinha, usado em rações para bovinos, aves e suínos, e no enriquecimento

de pães, bolos e biscoitos; óleo, utilizado no preparo de alimentos, representando 30%

do total de óleos vegetais produzido mundialmente; leite de soja, isento de lactose,

colesterol e com baixo teor de gordura; proteína texturizada de soja, ou carne de soja,

usado em salsichas, hambúrgueres, massas, etc.; além do shoyu e brotos, entre

outras formas da utilização alimentícia da soja pelos japoneses e chineses

(SEDIYAMA, 2009).

A planta é uma leguminosa anual, nativa da Ásia oriental, tendo como seu

primeiro relato de cultivo no Brasil em 1882 na Bahia. Possui em sua composição

cerca de 35-45% de proteína, 25-30% de materiais feculentos, 18-20% óleos, 5%

minerais e 10% de água, o que revela sua importância nutricional (SANTOS, 1995).

É uma cultura bastante dependente de luminosidade, fotoperíodo, umidade,

temperatura e latitude. Caracteriza-se por ser herbácea, ereta e autógama, atingindo

de 30 a 200 cm de altura. O ciclo de uma cultivar pode variar de 70 a 200 dias;

cultivares precoces geralmente possuem porte baixo, as de ciclo longo apresentam

porte alto e de fácil acamamento, já a maioria das cultivares brasileiras tem ciclo de

90 a 150 dias (SEDIYAMA, 2009).

Preferem solos com pH entre 6,0 a 6,8 (preferência do rizóbio), com fertilidade

média, pois solos muito férteis podem comprometer a nodulação das raízes, exige

solos com textura média (15-35%de argila) a argilosa (35-60% de argila), com

profundidade de 1-2 metros, sendo a temperatura de 30°C a ideal para

desenvolvimento da cultura (CASTRO, KLUGE, SESTARI, 2008).

Considerada uma cultura exigente em nitrogênio, onde cerca de 50 a 60% da

26

demanda é suprida pela fixação biológica de nitrogênio (FBN) realizada por

Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium elkanii, e tem se otimizado o processo

através da coinoculação com Azospirillum brasilence que é um microrganismo

promotor de crescimento (ADAMI, 2017).

Tal cultura adquire importância mundial, tendo o mercado estabelecido para

importação e exportação de seus derivados, como óleo e farelo. O farelo é insumo na

produção animal, sendo utilizado sobretudo na alimentação de suínos, aves e

ruminantes. Com o aumento mundial no consumo de proteína animal, tem-se um

aumento na comercialização do farelo, em especial no Brasil e China (HENNING,

2017).

Em 2017, o PIB do agronegócio correspondeu a 21,58% do PIB brasileiro, com

um aumento de 7,6% em relação ao ano anterior. Neste ano ocorreu queda no

faturamento da soja, contudo foi marcado pela maior área cultivada de soja no Brasil,

com incremento na produção em 19,53% (CEPEA, 2017).

O primeiro levantamento da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB)

para a safra 2019/2020 revela uma produção estimada de 245,8 milhões de toneladas,

com um aumento de 1,6%, ou seja 3,9 milhões de toneladas em relação a safra

2018/2019. Com previsão de 63,9 milhões de hectares de plantada no país, 1,1%

maior que a última safra.

Segundo a balança comercial do agronegócio de março de 2019, publicada

pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), o principal setor

exportador do agronegócio em março foi o complexo soja, representando 46% do

valor total exportado, com vendas de US$ 3,98 bilhões. Houve o recorde na

exportação de soja em grão em 3%, atingindo 9,1 milhões de toneladas, contudo com

a redução no preço de 6,8%, houve uma queda de 3,9% chegando a 3,30 bilhões. A

exportação do farelo de soja também atingiu seu recorde no mês de março de 2019,

com 1,61 milhão de tonelada, um aumento de 21,3%, atingindo o valor de US$ 597,30

milhões, um aumento de 17,8% em relação a última safra, mesmo com a queda de

2,9% no preço. A exportação de óleo rendeu US$ 81,53 milhões.

27

2.2 Bradyrhizobium COMO INOCULANTE

Anteriormente conhecido como Rhizobium japonicum, foi renomeado a

Bradyrhizobium japonicum, a qual inclui as mais importantes estirpes utilizadas na

cultura da soja, e é conhecido por seu crescimento lento (ARAÚJO, HUNGRIA, 1994).

É uma bactéria pertencente à família Bradyrhizobiaceae, fixadora de nitrogênio,

conhecida por “rizóbio”. Por possuir a enzima nitrogenase, capaz de reduzir nitrogênio

atmosférico na forma de íons amônio assimilável para plantas (REIS, TEIXEIRA,

2006).

São consideradas bactérias gram-negativas, ovais, que apresentam relações

simbióticas com leguminosas formando nódulos nas raízes. Estes nódulos surgem

após o reconhecimento e adesão do microrganismo nos pelos radiculares, em seguida

há o deslocamento para a raiz principal, e neste local ocorre a diferenciação celular,

formando nódulos (FERNANDES, RODRIGUES, 2012).

Os nódulos na planta de soja podem indicar a eficiência do método. Nódulos

presentes na raiz principal, como descrito acima, são provenientes da inoculação, e

nódulos dispostos nas raízes secundárias, na parte inferior, indicam nodulação tardia

por estirpes já presentes no solo. O ideal é que o interior dos nódulos esteja róseo,

indicando a presença de hemoglobina, responsável pelo transporte de oxigênio para

as células que fixam nitrogênio. Nódulos brancos indicam deficiência nutricional ou

ineficiência da estirpe (SEDIYAMA, 2009).

A inoculação por Bradyrhizobium spp. é amplamente utilizada com sucesso em

diversas culturas agrícolas. Guimarães et al. (2016) mostrou que diferentes estirpes

de rizóbios isoladas de feijão caupi e inoculadas em feijão guandu resultaram em um

incremento produtivo na cultura. Outros experimentos demonstram sua eficiência na

inoculação em feijão-fava (Phaseolus lunatus L.) (ANTUNES, et al. 2011), em feijão

comum (Phaseolus vulgaris L.) (SOARES, et al. 2006), (RUFFINI et al. 2011), em soja

(Glycine max L. Merrill) (HUNGRIA, CAMPO, MENDES, 2001), em amendoim

(Arachis hypogaea L.) (SILVA, et al. 2017), entre outras culturas de interesse

agronômico.

Contudo, devido a elevada importância na economia mundial, a soja merece

destaque neste processo. Esta cultura demanda grande quantidade de nitrogênio para

sustentar sua produtividade, a cada uma tonelada de grãos, são requeridos 80 kg de

28

nitrogênio, dos quais 65% saem da cultura pelos grãos (ZITO, et al. 2007). Logo o

emprego da simbiose com Bradyrhizobium é indispensável para reduzir custos de

produção. Se somente utilizasse fertilizantes para suprir a demanda de nitrogênio, a

quantidade exigida dobraria (160 kg). Além dos custos com a aplicação de nitrogênio

serem elevados, outros fatores ambientais como a lixiviação e contaminação de

corpos hídricos seriam agravantes (CAMPO, HUNGRIA, 2000).

Os fertilizantes nitrogenados estão prontamente disponíveis para as plantas, e

são rapidamente assimilados, enquanto que para a fixação biológica de nitrogênio

(FBN) há um gasto inicial de energia para a formação dos nódulos, por isso nos

primeiros dez dias após emergência, onde surgem os primeiros nódulos (quatro a oito

nódulos por planta), as plantas apresentam-se amareladas em comparação às que

receberam aplicação inicial de nitrogênio, porém os sintomas desaparecem

rapidamente e não há diferença em termos de produtividade (HUNGRIA, CAMPO,

MENDES, 2007). Entretanto a presença de adubação nitrogenada inibe a nodulação

por Bradyrhizobium (SEDIYAMA, 2009).

Os inoculante comerciais no Brasil utilizam quatro estirpes de Bradyrhizobium

spp. na cultura da soja, são eles SEMIA 5019, SEMINA 5080, SEMIA 5079 E SEMIA

578, Chueire et al. (2003), distinguiram as estirpes em dois grupos, onde SEMIA 587

e SEMIA 5019, estirpes de B. elkanii; e SEMIA 5080 e SEMIA 5079, estirpes de B.

japonicum. Contudo, Delamuta et al. (2013) de acordo com as características de

SEMIA 5080 a reclassificou como B. diazoefficiens.

2.3 CONTROLE BIOLÓGICO

Controle biológico é a ação de introduzir organismos vivos capazes de suprimir

um ou mais organismos patogênicos na planta (PAL, GARDENER, 2006). Tem se

buscado cada vez mais esta prática, além da utilização de produtos e metodologias

alternativas para o controle de doenças, visando a redução da aplicação de defensivos

agrícolas. Para tanto, novos estudos vêm sendo feitos a fim de explorar a capacidade

dos agentes de biocontrole, entre eles fungos e bactérias, no controle de doenças

vegetais.

29

Neste sentido, rizobactérias ganham destaque, pois podem atuar no controle

biológico e contribuir como promotoras de crescimento em plantas, quando aplicadas

de forma massiva no solo (VIEIRA JUNIOR, et al. 2013). O solo é um ambiente mais

constante em relação às oscilações climáticas do que a filosfera, por exemplo,

microrganismos habitantes da parte aérea sofrem mais com alterações climáticas de

temperatura e umidade do que microrganismos habitantes de solo (BETTIOL,

MORANDI, 2009), por isso, agentes de biocontrole da rizosfera são altamente

promissores no controle de doenças.

Como exemplo do sucesso das rizobactérias no controle biológico, tem-se o

gênero Bacillus spp., uma rizobactéria com diferentes mecanismos de ação, a qual foi

utilizada para a produção de diversos bioprodutos, entre eles o Serenade (com B.

subtilis), Sonata (B. pumilus), ambos com registro no Brasil. Além de diferentes

espécies de Pseudomonas, usadas como produtos de biocontrole, como o Biomonas

a base P. fluorescens, usado no tratamento de sementes para o controle de Sclerotinia

spp., Rhizoctonia spp., Pythium spp., entre outros patógenos de solo (BETTIOL,

2012).

Quanto aos modos de ação das rizobactérias, pode-se citar a competição por

nutrientes e espaço, onde competem por nichos ecológicos ou nutrientes; produção

de substâncias antimicrobianas capazes de suprimir microrganismos, podendo ser ou

não voláteis; predação e parasitismo, onde o agente de biocontrole se nutre do

patógeno; produção de sideróforos, que são sequestradores de ferro, elemento

essencial para microrganismos; e através da indução de resistência (ROMEIRO,

2007).

No caso da indução de resistência, o microrganismo age como um eliciador,

fazendo com que a planta responda rapidamente ao ataque patogênico, pois é levada

ao estado de indução. Neste momento ocorre a síntese de compostos químicos,

através da ativação dos genes de resistência, e a indução de resistência pode ser

mensurada pelo aumento da atividade de enzimas como quitinases, β-1,3-

glucanases, fenilalanina amônia-liases, lipoxigenases e peroxidases (BETTIOL,

MORANDI, 2009).

30

2.3.1 Patógenos habitantes de solo

Entre os fitopatógenos habitantes do solo que atingem a cultura da soja,

podem-se destacar os fungos Fusarium spp., Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia

solani e Sclerotinia sclerotiorum.

Entre as espécies de Fusarium spp. que estão relacionadas com a podridão

vermelha das raízes estão F. brasiliense, F. crassistipitatum e F. tucumaniae. Estes

fitopatógenos apresentam hifas septadas, formando micélio branco-acinzentado. As

hifas desenvolvem os clamidósporos, que são as estruturas de resistência do fungo,

estas apresentam parede lisa ou rugosa, de formato globoso a oval. A forma perfeita

se dá pelo Haematonectria haenatococca (AMORIN, REZENDE, BERGAMIN FILHO,

2011). O sintoma inicia-se abaixo do solo, através de mancha avermelhada na raiz

principal, se expandindo e atingindo uma coloração mais arroxeada e por fim negra.

Sob alta umidade há a formação de anel vermelho na base da haste, coberta por

conídios de cor bege; ocorre então a formação de folhas “carijó” e as raízes

secundariam apodrecem ficando apenas a raiz principal (KIMATI et al. 1997);

Já a Macrophomina phaseolina causa podridão de carvão em soja, atingindo

raiz e caule. Apresenta micélio uninucleado, com presença de picnídios de coloração

marrom escura, sendo os conídios hialinos, de formato elipso a oval. A forma de

sobrevivência do fungo é através de microescleródios, os quais sobrevivem a

condições adversas no solo, capazes de germinar em contato com o hospedeiro, na

região do colo ou raiz, disseminando-se via semente. Prefere baixa umidade de solo

e alta temperatura; plantas infectadas apresentam amarelecimento na época de

formação das vagens (ALMEIDA et. al. 2014).

Macrophomina phaseolina pode acometer plântulas apresentando manchas no

hipocótilo de coloração marrom avermelhadas, podendo ocasionar a morte em locais

quentes e secos. Já em plantas, aparece acima das raízes até o caule, sob cor

marrom-clara. Inicialmente não há sintomas na parte aérea, porém com a progressão

da doença ocorre amarelecimento e morde das folhas, ficando presas à planta. Há a

formação de escleródios dando um aspecto cinza a região atacada. Com corte

longitudinal da hasta observam-se estrias escuras e escleródios na medula (SANTOS,

31

1995).

O gênero Rhizoctonia spp. causa damping off ou tombamento de plântula.

Durante a fase vegetativa não produz esporos, possui micélio inicialmente hialino, que

evolui para marrom claro, e posteriormente para marrom escuro. Apresentam

escleródios de formato irregular e coloração escura. A fase perfeita do fungo

corresponde ao Thanatephorus cucumeris (AMORIN, REZENDE, BERGAMIN FILHO,

2011).

Damping off na pré-emergência faz com não haja a emergência da semente,

ao desenterrá-la está em estado de putrefação. Na fase pós-emergência apresenta

no colo manchas encharcadas, que com o progresso da doença atingem coloração

marrom, formato elíptico e deprimidas, causando estrangulamento na região da haste.

Nestas lesões que podem chegar até o sistema radicular, pode-se verificar o micélio

de coloração castanho claro (GALLI, 1980).

O patógeno Sclerotinia sclerotiorum é o agente causal do mofo branco, ou

podridão branca da haste e da vagem. Sobre os escleródios, o fungo produz

apotécios, estes geralmente apresentam-se pedicelados, e os ascósporos hialinos,

unicelulares, de formato oval alongado (GOULART, 2005). A doença é favorecida por

alta umidade, e atinge principalmente tecidos da parte aérea que entram em contato

com o solo. A temperatura ideal para o desenvolvimento da doença é de 15-21°C, e

por apresentar estruturas de resistência, os escleródios, é de difícil controle, e pode

disseminar-se via semente (LOPES, AVILA, 2005).

Os sintomas iniciam-se através de manchas de anasarca que progridem para

lesões de cor castanho claro, desenvolvendo micélio denso e branco; seguido de um

adensamento deste micélio, que formam escleródios negros na superfície e interior

das hastes e das vagens; as plantas afetadas murcham, secam e morrem (SEIXAS,

MAZARO, REY, 2017).

Tais patógenos descritos são de importância agrícola devido às enfermidades

que ocasionam em soja. Deste modo, inúmeros estudos com agentes de controle

biológico vêm sendo realizados com vistas a reduzir a incidência e severidade de

doenças oriundas destes patógenos de solo.

Em experimento realizado por Rakib et. al. (2012) avaliou-se o potencial de

Rizhobium japonicum no biocontrole de F. solani e M. phaseolina. Constatando-se a

redução no crescimento dos fundos em meio de cultura, redução da doença em vasos

32

e a campo, e apresentando maior porcentagem de germinação. Alice e Sundravadana

(2012) observaram que através da aplicação de produtos comerciais a base de

Trichoderma viride e Pseudomonas fluorescens houve inibição do crescimento

micelial de M. phaseolina e controle da doença a campo.

Souza Junior, et al. (2010) estudaram o emprego de isolados de rizobactérias

no controle de R. solani, causador da queima-das-bainhas em arroz, destacando que

Pseudomonas synxantha combinada com outro isolado controlou eficientemente R.

solani, atuando também como um indutor de crescimento nas plântulas de arroz.

Silva et. al. (2015) ao estudarem o controle biológico por meio de Trichoderma

spp. nativo em solo com a presença de mofo branco e nativos em solo sem histórico

de mofo branco, observou que o agente de biocontrole isolado de solo com histórico

de mofo branco foi efetivo no controle da doença, apresentando um desenvolvimento

de plântulas sadio na presença do patógeno.

33

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos na Universidade Tecnológica Federal do

Paraná, campus Dois Vizinhos, no laboratório de fitopatologia e no laboratório de

sementes.

3.1 CULTIVO DAS ESTIRPES DE Bradyrhizobium spp.

Foi utilizado o protocolo de recuperação de estirpes liofilizadas da Embrapa

Soja, para as estirpes de Bradyrhizobium spp. oriundas do laboratório da Emprapa

Soja – Londrina PR. Em câmara de fluxo laminar, as ampolas contendo as quatro

cepas: SEMIA 5080 (Bradyrhizobium diazoefficiens), SEMIA 5079 (Bradyrhizobium

japonicum), SEMIA 5019 (Bradyrhizobium elkanii) e SEMIA 587 (Bradyrhizobium

elkanii) foram rompidas utilizando um instrumento cilíndrico de madeira de 20 cm de

comprimento, composto por duas partes iguais, esterilizado em autoclave por 20

minutos a 120°C, no qual a ampola foi acoplada nas extremidades onde havia um

orifício com o mesmo diâmetro da ampola, quebrando com cuidado para evitar a perca

do material (Figura 01).

Figura 01 - Quebra da ampola com o auxílio de instrumento de madeira.

Fonte: Arquivo pessoal (2020)

34

Em seguida, com o auxílio de uma pinça estéril foi retirado o algodão contido

na ampola, e 200 µL do meio de cultivo YM (Yeast Manitol) líquido, formulado seguindo

o mesmo protocolo da Embrapa, foi transferido para dentro da ampola com o intuito

de hidratar as estirpes liofilizadas, homogeneizando por um período de cinco minutos.

Quantidades de 20 µL dessa mistura foram vertidos em placa de Petri contendo meio

YM sólido, e incubados em BOD a 28°C (Figura 02).

Figura 02 - Retirada do algodão da embalagem, hidratação do material, retirada e transferência do material em placa de Petri.


Formulação do meio YM: Para a produção de 1 L utilizou-se 0,5 g de K2HPO4;

0,2 g de MgSO4.7H2O; 0,1 g de NaCl, 5,0 g de manitol; 0,4 g de extrato de levedura;

10 mL de solução de vermelho Congo (composta por 0,25g de vermelho congo em

100 mL de água deionizada) 1000 mL de água deionizada e para meio sólido

35

adicionou-se de 10-15 g de ágar. O meio pronto foi vertido em frascos de Erlenmeyer,

tampados com algodão, e fechados com papel kraft e fita crepe, transferidos para a

autoclave e esterilizados por 20 minutos a 120°C.

Após passados 15 dias do procedimento de recuperação das estirpes e

crescimento em placas de Petri, estas foram repicadas em câmara de fluxo laminar.

Aproximadamente 15 mL do meio YM sólido foi vertido em placas de Petri. Utilizaram-

se beckers de 50 mL autoclavados para repicar as estirpes, as extremidades do

becker foram postas em contato com as placas contendo as cepas, em seguida

utilizou-se o becker para “carimbar”, ou seja, encostá-lo na placa de Petri para

repicagem (Figura 03).

Figura 03 - Repicagem de estirpes de Bradyrhizobium spp. utilizando becker.


3.2 CULTIVO E REPICAGEM DOS FITOPATÓGENOS

Os fitopatógenos Fusarium crassistipitatum (CMES 24), Macrophomina

phaseolina (CMES 1574), Rhizoctonia solani (CMES1861) e Sclerotinia sclerotiorum

36

(CMES 2131) foram obtidos da Embrapa Soja em Londrina, PR. Estes foram

recebidos em placas de Petri, que foram repicadas com auxílio de ponteiras

autoclavadas, obtendo-se discos de meio com 7mm de diâmetro. Cada disco de

micélio formado foi transferido utilizando alça de platina estéril, para placas de Petri

contendo meio BDA, e posteriormente acondicionadas em BOD a 25°C, com

fotoperíodo de 12 horas por um período de 8 dias (Figura 04).

Figura 04 - Placas contendo Fusarium crassistipitatum (CMES 24), Macrophomina phaseolina (CMES 1574), Rhizoctonia solani (CMES1861) e Sclerotinia sclerotiorum (CMES 2131) respectivamente, aos nove dias de crescimento micelial.


37

Em todo o trabalho foi utilizado meio BD comercial para a repicagem dos

fitopatógenos, sendo 21g deste meio, mais a adição de 15g de ágar, e 1L de água

deionizada, compondo 1L do meio BDA, seguido de autoclavagem durante 20 minutos

a 120°C.

3.3 AVALIAÇÃO DO ANTAGONISMO DE Bradyrhizobium spp. VERSUS FITOPATÓGENOS EM CONFRONTO DIRETO EM MEIO DE CULTURA

Para o teste de confronto direto, foram utilizadas placas de Petri descartáveis

com 8,3 cm de diâmetro, que compuseram a unidade experimental deste estudo. Em

câmara de fluxo laminar, cada placa recebeu aproximadamente 15 mL de meio YM.

Com o uso de beckers autoclavados, de 4 cm de diâmetro, sendo a boca do mesmo,

em contato com as estirpes repicadas citadas no item 3.1, com 10 dias de

crescimento, foi “carimbado” no centro da placa contendo o meio YM, formando um

círculo de Bradyrhizobium spp., método adaptado de Mariano (1993).

Todas as placas foram fechadas e vedadas com filme de PVC em seu entorno,

em seguida alocadas em BOD a 25°C com fotoperíodo de 12 horas por um período

de 7 dias. Este procedimento ocorreu devido Bradyrhizobium spp. ser uma bactéria

de crescimento lento, foi dado assim um período de uma semana para que pudesse

se estabelecer no meio.

Passados os 7 dias, as placas foram transferidas novamente para a câmara de

fluxo laminar e abertas. Com o auxílio de uma alça de platina estéril foi posto no centro

de cada placa um disco de micélio de 7 mm de diâmetro de cada fitopatógeno do

referido tratamento. As placas foram fechadas e vedadas com filme de PVC e

retornaram a BOD sob o mesmo regime de temperatura e fotoperíodo (figura 05).

38

Figura 05 - Unidade experimental composta pela placa de Petri contendo o círculo com Bradyrhizobium spp. de 4 cm de diâmetro formado pelo becker, com um disco de micélio de 7mm do fitopatógeno no centro. A foto da direita apresenta os tratamentos acondicionados na BOD.


A testemunha foi composta apenas pelo disco de micélio do patógeno de cada

tratamento, isento do círculo de Bradyrhizobium spp. formado pelo becker.

Diariamente foi realizado o acompanhamento do crescimento micelial dos

fitopatógenos, por meio de uma régua graduada. Duas retas foram feitas na placa de

Petri, uma vertical e uma horizontal, para acompanhar o crescimento em diâmetro da

colônia (figura 06).

Figura 06 - Acompanhamento diário para medir o diâmetro da colônia com auxílio

de régua graduada.


39

A cada 24 horas foi realizado o acompanhamento do crescimento micelial com

régua graduada, até a testemunha atingir o crescimento completo da placa.

Cada placa obteve por dia duas medidas, uma do diâmetro vertical e outra do

diâmetro horizontal, deste modo as duas medidas foram somadas e divididas por 2,

para obtenção da média, que foi usada na estatística.

A porcentagem de inibição do crescimento micelial foi calculada com base na

fórmula de Menten et al. (1976): X = (Crescimento da testemunha - Crescimento do

tratamento) x 100) : crescimento da testemunha.

Em resumo, o experimento foi composto por quatro patógenos, quatro estirpes

de Bradyrhizobium spp., mais testemunha, com quatro repetições. O delineamento

experimental adotado foi o inteiramente casualizado, em esquema bifatorial para cada

patógeno, levando em consideração os diferentes tratamentos x o crescimento mice-

lial diário. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de normalidade de Lilliefors;

por se tratar de um experimento qualitativo x quantitativo, realizou-se a ANOVA se-

guido da análise de regressão no software Genes (CRUZ, 2016).

3.4 AVALIAÇÃO DO ANTAGONISMO DE Bradyrhizobium spp. VIA MICROBIOLIZAÇÃO DA SEMENTE

As sementes de soja utilizadas foram da cultivar NIDERA 5909, as quais foram

imersas em solução de hipoclorito de sódio a 5% por 15 minutos, posteriormente

lavadas com água deionizada conforme RAS (BRASIL, 2009) e submetidas ao UV por

um período de 20 minutos.

A suspensão utilizada para a microbiolização das sementes de soja, foi

composta por 150 mL de meio YM autoclavado em erlenmeyer, acrescidos de 3 discos

de cada estirpe de Bradyrhizobium spp. com crescimento num período de dez dias

em BOD a 28°C, posto em agitador diariamente para aeração do meio.

Após a higienização das sementes, estas foram postas em um becker

autoclavado para cada cepa, foram transferidos 1 mL da suspensão para cada 20

semente no becker, isto para os tratamentos correspondentes a estirpe SEMIA 5080,

SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587, quanto a testemunha foi utilizado água

deionizada autoclavada. As sementes ficaram no becker por um período de 15

minutos antes de serem transferidas para a placa de Petri.

Utilizaram-se discos de micélios de 7mm obtidos das placas de F.

40

crassistipitatum, M. phaseolina, R. solani e S. sclerotiorum repicados do item 3.2.

Cada disco de micélio de cada patógeno do respectivo tratamento foi posto de um

lado da placa de Petri, numa distância de 1 cm da borda, do outro lado da placa foi

colocada a semente microbiolizada com a mesma distância da borda (figura 07). As

placas foram fechadas e vedadas com papel filme de PVC em seu entorno, em

seguida alocadas em BOD a 25°C com fotoperíodo de 12 horas.

Figura 07 - Unidade experimental composta por placa de Petri com meio BDA, do lado esquerda a semente de soja microbiolizada com Bradyrhizobium spp. e a direita o disco de micélio do fitopatógeno.


Foram utilizadas placas de Petri descartáveis com 8,3 cm de diâmetro, com

meio BDA.

O acompanhamento do crescimento micelial dos fitopatógenos, foi realizado

diariamente por meio de uma régua graduada. Duas retas foram feitas na placa de

Petri, uma vertical e uma horizontal, as duas medidas obtidas das retas foram

somadas e divididas por 2 para obtenção da média, que foi usada na estatística.

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com qua-

tro repetições, em esquema bifatorial para cada patógeno, levando em consideração

41

os diferentes tratamentos x o crescimento micelial diário. Os dados obtidos foram sub-

metidos ao teste de normalidade de Lilliefors; por se tratar de um experimento quali-

tativo x quantitativo, realizou-se a ANOVA seguido da análise de regressão no software

Genes (CRUZ, 2016).

3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS HIFAS DOS PATÓGENOS POR MEIO DA MEV

Para as análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foram utili-

zadas amostras de hifas dos fitopatógenos do item 3.3 do ensaio do método adap-

tado do círculo.

Utilizou-se o microscópio Hitachi TM 3000 para as avaliações.

Para a realização das leituras, uma fita de cobre era colada sobre o aparato

visto na imagem (figura 08), em seguida este aparato com a fita era posto em

contato com as placas de cada tratamento, para que as hifas fúngicas pudessem

se aderir a fita de cobre, para a realização da leitura no microscópio.

Figura 08 - Microscópio Hitachi TM 3000 a esquerda, e a direita o aparato com fita de cobre utilizado para leitura da amostra.


As leituras foram padronizadas numa ampliação de 500 vezes, numa escala de

visualização de 200 µm.

42

3.6 AVALIAÇÃO DOS METABÓLITOS DE Bradyrhizobium spp. SOBRE OS FITOPATÓGENOS

Em câmara de fluxo laminar, erlenmeyers com 150 mL de meio YM líquido

autoclavado foram abertos e 3 discos das estirpes de Bradyrhizobium spp. foram

transferidos, após fechados com algodão e papel kraft foram alocados em BOD a

28°C, com fotoperíodo de 12 horas, por um período de 10 dias e posto em agitador

diariamente para aeração do meio.

Em câmara de fluxo laminar foram retirados 10 mL de cada erlenmeyer que

continha a solução de cada estirpe (SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA

587), além de água deionizada autoclavada, foram transferidas para tubos falcon com

capacidade de 15 mL, e centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi

retirado e filtrado com membrana Millipore® com espessura do poro de 0,22 µm e

diâmetro de 33 mm, com o uso de uma seringa acoplada (Figura 09).

Figura 09 - Tubo falcon contendo o sobrenadante das células de Bradyrhizobium spp. após ser centrifugado a esquerda. A direita encontra-se a membrana Millipore® acoplada a seringa para a filtragem dos metabólitos.


43

Foram utilizados 1,5mL do metabólito filtrado incorporado e homogeneizado em

15 mL de meio DBA fundente para cada placa de Petri, obtendo a concentração de

10% de metabólito. No centro da placa foi depositado um disco de micélio do patógeno

de 7mm de diâmetro conforme tratamentos (Adaptado de SOLINO et al. 2017).

Diariamente, de 24 em 24 horas, com o auxílio de uma régua graduada foi

medido o diâmetro vertical e horizontal do crescimento micelial em cada placa e

posteriormente feito a média, até que a testemunha contendo água destilada

crescesse por toda a placa.

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com qua-

tro repetições, em esquema bifatorial para cada patógeno, levando em consideração

os diferentes tratamentos x o crescimento micelial diário. Os dados obtidos foram sub-

metidos ao teste de normalidade de Lilliefors; por se tratar de um experimento quali-

tativo x quantitativo, realizou-se a ANOVA seguido da análise de regressão no software

Genes (CRUZ, 2016).

3.6.1 Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A concentração inibitória mínima é a menor concentração de um antifúngico

que aplicado é capaz de cessar o crescimento de um organismo (Normas NCCLS,

2002).

A metodologia empregada foi baseada em Vismara (2019).

A solução de trabalho foi preparada utilizando 150 mL de meio de cultivo YM

líquido vertido em erlenmeyers com capacidade de 250 mL, autoclavados a 120°C por

20 minutos. Após autoclavagem transferiu-se três discos das estirpes de

Bradyrhizobium spp. de 7 mm de diâmetro, em seguida o orifício da vidraria foi fechada

com algodão e papel kraft e alocado em BOD a 28°C, com fotoperíodo de 12 horas,

por um período de 10 dias e diariamente posto em agitador para aeração do meio. Em

seguida 5mL da solução de trabalho de cada tratamento foi filtrada por membrana do

tipo Millipore® com diâmetro de poro de 0,22 µm, para a extração dos metabólitos

livres de célula. A solução de trabalho foi considerada o tratamento de 100% (Figura

10).

44

Figura 10 - Solução de trabalho correspondente aos quatro tratamentos contendo as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587.


Já a suspensão fúngica foi composta por uma placa de Petri contendo a colônia

fúngica fitopatogênica com 7 dias de crescimento, sobre a placa foram vertidos 10 mL

de solução fisiológica e raspado o micélio com auxílio de uma alça de platina estéril.

A suspensão foi transferida para um becker autoclavado e realizou-se a contagem dos

esporos realizando diluições com solução fisiológica até atingir 105 UFC . mL-1, a

contagem foi feita em câmara de Neubauer, segundo apresentado por Alfenas e Mafia

(2007).

Para o experimento foram utilizadas 8 placas de elisa de 96 poços, sendo 12

poços na vertical e 8 poços na horizontal (nominados da letra A até H), onde:

As três primeiras linhas A, B e C eram destinadas a um tratamento (tratamento

01), sendo que cada linha formada por 12 poços, foi considerada uma repetição.

A linha D era a testemunha contendo apenas o meio de cultura. As linhas E, F

e G continham outro tratamento (tratamento 02); e a linha H apresentava nos 4

primeiros poços o meio de cultura com a suspenção fúngica utilizada no tratamento

01; os quatro próximos poços, a suspenção fúngica utilizada no tratamento 02; e nos

quatro últimos poços, a solução de trabalho utilizada.

Nas oito placas de elisa, com o auxílio de uma micropipeta multicanal com 12

canais foram adicionados 100 µL de meio de cultura BD autoclavado em cada poço.

No primeiro poço das linhas A, B, C, E, F e G adicionaram-se 100 mL da solução de

trabalho correspondente a cada tratamento (SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019

45

e SEMIA 587), a partir daí fez-se a microdiluição para os demais 11 poços na

sequência (Figura 11).

Figura 11 - Adição de meio BD à placa de elisa, e na direita a realização da microdiluição da solução de trabalho.


Por fim, 20 µL da suspenção fúngica foram adicionados conforme tratamento

(F. crassistipitatum, M. phaseolina, R. solani e S. sclerotiorum), exceto na linha D e

nos quatro últimos poços da linha H.

Em seguida utilizou-se filme plástico de PVC para vedar as placas de elisa, que

na sequência foram acondicionadas em BOD a 25°C por um período de 48 horas.

Passadas as 48 horas foram adicionados 10 µL de tetrazólio a 1% em todos os

poços de todas as placas. O tetrazólio está ligado as enzimas desidrogenases, as

quais reduzem o 2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio nos tecidos vivos durante a glicólise

no ciclo de Krebs, fazendo com que quando adicionado de forma incolor fique após a

reação num tom vermelho (FRANÇA NETO et al. 1988). Por ser fotossensível foi

mantido em BOD no escuro a 25°C por mais 48 horas para revelação do resultado.

A avaliação é visual e qualitativa, nos poços onde houve a presença da

coloração vermelha, é porque o fitopatógeno se manteve vivo, e não teve seu

crescimento inibido pela solução de trabalho.

46

3.6.2 Efeito dos metabólitos voláteis de estirpes de Bradyrhizobium spp. sobre os fitopatógenos

Para avaliar o efeito dos metabólitos voláteis de Bradyrhizobium spp., foram

utilizadas placas bipartidas descartáveis com 8,3 cm de diâmetro, que compuseram a

unidade experimental deste estudo. Em câmara de fluxo laminar, foi transferido meio

YM de um lado da placa. Após o meio solidificar, foi vertido 100 µL do meio líquido de

dez dias, contendo as com as quatro estirpes de Bradyrhizobium spp., descrito no item

3.6.

As placas foram fechadas com filme plástico de PVC e colocadas em BOD a

25°C com fotoperíodo de 12 horas por um período de 7 dias. Foi realizado o mesmo

procedimento proposto no item 3.6, tendo em vista que Bradyrhizobium spp. é uma

bactéria de crescimento lento, dando um período de sete dias para que a mesma

pudesse se estabelecer no meio.

Passados os sete dias, em câmara de fluxo laminar, as placas bipartidas foram

abertas, e no lado vazio da placa, onde não havia meio de cultura, foi transferido meio

BDA. Sobre este meio foi colocado um disco de micélio de 7 mm de diâmetro do

respectivo fitopatógeno (F. crassistipitatum; M. phaseolina, R. solani e S.

sclerotiorum). As placas foram fechadas com filme de PVC e levadas à BOD a 25°C

com fotoperíodo de 12 horas até o fitopatógeno atingir o crescimento total na metade

da placa em que estava localizado.

47

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 POTENCIAL ANTAGONISTA DE Bradyrhizobium spp. POR MEIO DE CONFRONTO DIRETO

4.1.1 Antagonismo pelo método de confronto das estirpes de Bradyrhizobium spp. versus os fitopatógenos em meio YM

Nas tabelas 01 e 02 encontram-se as ANOVAS dos ensaios realizados com

Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e

Macrophomina phaseolina.

Tabela 01 - ANOVA correspondente aos ensaios com Macrophomina phaseolina, Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium crassistipitatum.

QM

Causas da variação GL Macrophomina Rizhoctonia Fusarium

Cepas 4 191.0629* 448.3381* 219.3017*

Tempo 7 30.1851* 4.9717* 25.3742*

Tempo x Cepas 28 4.3735* 1.5319* 5.3528*

Erro 120 0.0938 0.0042 0.0061

Total 159

Média 3.8084 4.0112 3.1428

CV (%) 8.0430 1.6191 2.4784


Tabela 02: ANOVA correspondente ao ensaio com Sclerotinia sclerotiorum.

Causas da variação GL QM

Cepas 4 67.3044*

Tempo 8 13.8878*

Tempo x Cepas 32 3.0679*

Erro 135 0.0669

Total 179

Média 2.1922

CV (%) 11.8065


48

Houve interação significativa entre as estirpes e o tempo para todos os

fitopatógenos em estudo.

Pode-se perceber pela figura 12, que em relação a testemunha nas 168 horas,

houve redução do crescimento micelial de Fusarium crassistipitatum de 49,40% com

a utilização da estirpe SEMIA 5079, e de 91,97% com as estirpes SEMIA 5080 e

SEMIA 5019. Já a estirpe SEMIA 587 não diferiu com a testemunha.

Figura 12 - Resultado do potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum em 168 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo.

Brady.. Equação Rajustado Pmáx.

x Y

TESTEMUNHA Y= 1,9635+0,0642x-0,0002x2 95,58 160,50 7,12

SEMIA 5080 ȳ= 0,70 - - -

SEMIA 5079 Y= 0,9875+0,0184x 96,12 - -

SEMIA 5019 ȳ= 0,70 - - -

SEMIA 587 Y= 2,8177+0,0372x 94,01 - -


Notou-se neste ensaio que com as estirpes SEMIA 5080 e SEMIA 5079, não

houve crescimento do patógeno (figura 13), e a estirpe SEMIA 5079 não impediu o

crescimento micelial de Fusarium crassistipitatum, porém obteve um bom resultado

no controle, como observado na figura 14.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

0 24 48 72 96 120 144 168

Cre

scim

en

to m

ice

lial (

cm)

Tempo (horas)

Teste SEMIA 5080 SEMIA 5079 SEMIA 5019 SEMIA 587

49

Figura 13 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum aos nove dias após início do experimento.


Figura 14 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5079 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum aos nove dias após início do experimento.

SEMIA 5079 SEMIA 5080



Testemunha


50

Na figura 15, para Macrophomina phaseolina há uma redução de 81,45%; 0%;

76,63% e de 16,14% para as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e

SEMIA 587 respectivamente, quando comprado à testemunha às 168 horas de

avaliação.

Figura 15 - Resultado do potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina em 168 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo.

Cepa Equação ou média Rajustado Pmáx.

X y

TESTEMUNHA y = 3.2005+ 0.0882x-0.0004x2 96.69 110.25 8.06

SEMIA 5080 y = 0.9229+0.0031x 88.7

SEMIA 5079 y= 1.5998+0.0375x 97.84

SEMIA 5019 y = 1.0843+0.0054x 98.15

SEMIA 587 y = 2.125+0.0288x 98.14 Fonte: Arquivo pessoal (2020)

Nota-se para este fitopatógeno, que a estirpe 5079 não impediu o crescimento

micelial, porém o crescimento do mesmo não acompanhou a testemunha, houve uma

supressão no crescimento no decorrer do tempo, fazendo com que este atingisse o

diâmetro da testemunha apenas no final das 168 horas. Ao comparar a avaliação de

72 horas, há uma redução de 52,13% da estirpe SEMIA 5079 e de 42,77% de SEMIA

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 24 48 72 96 120 144 168

Cre

scim

ento

mic

elia

l (cm

)


51

587 em comparação a testemunha.

Portanto como observado na figura 16, a estirpe não impediu o crescimento,

porém o retardou.

Figura 16 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina aos nove dias após início do experimento.


Para Rhizoctonia solani, a eficácia das estirpes SEMIA 5080 e SEMIA 5019 se

repetem, como o observado na figura 17. Há uma redução no crescimento micelial em

comparação com a testemunha aos 168 dias, de 91,57% para as estirpes SEMIA 5080

e 5019; de 51,81% para SEMIA 5079 e de 0% para SEMIA 587 que atingiu o

crescimento completo da placa em 72 horas, juntamente com a testemunha.



Testemunha

52

Figura 17 - Resultado do potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani em 168 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo.

Brady.. Equação R ajustado Pmáx.

x Y

TESTEMUNHA Y= 6,963+0,0295x-0,0001x2 53,33 147,50 9,14

SEMIA 5080 ȳ= 0,70 - - -

SEMIA 5079 Y= 0,8031+0,0216x 90,17 - -

SEMIA 5019 ȳ= 0,70 - - -

SEMIA 587 Y= 6,6094+0,0357x-0,0002x2 70,96 89,25 8,20


Já para a estirpe SEMIA 5079, a partir das 144 horas o fitopatógeno atingiu o

diâmetro de 4cm, ou seja, houve o crescimento micelial até próximo ao

Bradyrhizobium, porém não ultrapassou o mesmo até os 168 dias (figura 18 e 19).

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

0 24 48 72 96 120 144 168

Cre

scim

en

to m

ice

lial (

cm)

Tempo (horas)


53

Figura 18 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani aos nove dias após início do experimento.


Figura 19 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5079 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani aos nove dias após início do experimento.




Testemunha

54


Por meio da figura 20, observa-se uma redução de crescimento micelial de

Sclerotinia sclerotiorum nas 192 horas de 79,48%; 82,46%; 82,71% e 50,25% paras

as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 respectivamente,

em comparação com a testemunha.

Figura 20 - Resultado do potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum em 192 horas de avaliação utilizando o método adaptado do círculo.

Brady.. Equação R ajustado P. máx.

x y

TESTEMUNHA Y= 1,0868+0,0321x 95,59 - -

SEMIA 5080 Y= 0,5453+0,0151x-0,00005x2 87,57 151 1,68

SEMIA 5079 Y= 0,6406+0,009x-0,00005x2 93,12 90 1,05

SEMIA 5019 Y= 0,648+0,0102x-0,00005x2 88,62 102 1,17

SEMIA 587 Y= 0,625+0,0471x-0,0002x2 98,22 117,75 3,40 Fonte: Arquivo pessoal (2020)

As médias de SEMIA 5080, SEMIA 5079 e SEMIA 5019 não diferiram

significativamente entre sí, logo obtiveram a mesma eficácia na redução do

crescimento deste fitopatógeno.

Já a estirpe SEMIA 587, reduziu o crescimento micelial, que se tornou

constante a partir das 144 horas, onde atingiu diâmetro de 4cm. Desde modo,

percebe-se que o crescimento foi restringido ao local em que estava a colônia de

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Cre

scim

en

to m

ice

lial (

cm)

Tempo (horas)


55

Bradyrhizobium spp. demarcada pelo diâmetro do becker. Observando que este

fitopatógeno não ultrapassou esta barreira da bactéria (figura 21 e 22), ficando contido

pela mesma.

Figura 21 - Potencial antagonista das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias após início do experimento.


Figura 22 - Estirpe SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias após início do experimento.

SEMIA 587



Testemunha


56

4.1.2 Antagonismo pela microbiolização das sementes em meio BDA

Nas tabelas 03, 04 e 05 encontram-se as ANOVAS dos ensaios realizados com



Tabela 03 - ANOVA correspondente ao ensaio com Fusarium crassistipitatum.

Fonte de variação gl QM

Estirpes (A) 4 1.4573* Tempo (B) 6 54.1553*

A x B 24 0.4303* Erro 105 0.0413 Total 139 345.4295

Média - 4.71 CV(%) - 4.32


Tabela 04 - ANOVA correspondentes aos ensaios com Macrophomina phaseolina e

Sclerotinia sclerotiorum.

Fonte de variação GL

QM

Sclerotinia Macrophomina

Estirpes (A) 4 1.737* 1.63098* Tempo (B) 3 9.48608* 2.93311*

A x B 12 0.23202* 0.2883* Erro 60 0.0240 0.0182 Total 79

Média 5.87 6.08

CV(%) 2.64 2.22 Fonte: Arquivo pessoal (2020)

Tabela 05 - ANOVA correspondente ao ensaio com Rhizoctonia solani

Fonte de variação GL QM

Estirpes (A) 4 1.58766* Tempo (B) 4 32.75673*

A x B 16 0.30047* Erro 75 0.0289

Total 99 144.3489

Média 5.38 CV(%) 3.16


57

Pode-se observar que houve diferença significativa no crescimento micelial de

todos os fitopatógenos em estudo.

Pela figura 23 observa-se que a testemunha e a estirpe SEMIA 587 não

diferiram entre sí, o mesmo ocorre para as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079 e

SEMIA 5019 que não diferem entre sí, porém diferem da testemunha, havendo uma

redução de 20,55% no crescimento micelial de F. crassistipitatum nas 96 horas de

avaliação.

Figura 23: Resultado do potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum em 96 horas de avaliação.

Cepa Equação ou média Rajustado Pmáx.

x y

Testemunha y = 0.0001x2 + 0.0552x + 1.9848 0.9728

SEMIA 5080 y = -0.0002x2 + 0.06x + 1.7941 0.9786

SEMIA5079 y = -0.0001x2 + 0.0552x + 1.9848 0.9939

SEMIA 5019 y = 1.9707+ 0.0624x-0.0003x2 0.9757 104 5.21

SEMIA 587 ȳ= 4.94


58

Este controle observado pelo gráfico, pode ser verificado nas figuras 24 e 25.

Onde há o crescimento de F. crassistipitatum sobre a estirpe SEMIA 587, enquanto

para as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079 e SEMIA 5019 o fitopatógeno não cresce

por sobre a semente, a mantendo protegida do mesmo.

Figura 24 - Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum.




Testemunha

59

Figura 25 - Comparação do crescimento micelial de Fusarium crassistipitatum através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos seis dias após início do experimento.


Da mesma forma, não há diferença estatística no crescimento micelial de M.

phaseolina em relação a testemunha e a estirpe SEMIA 587. Já as estirpes SEMIA

5079 e SEMIA 5019 também não diferem entre sí, havendo uma redução de 20% no

crescimento micelial do fitopatógeno para estas estirpes em relação a testemunha, e

uma redução de 13,42% no crescimento micelial quando a semente é inoculada com

a estirpe SEMIA 5079 (Figura 26).


60

Figura 26 - Resultado do potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina em 72 horas de avaliação.

Cepa Equação ou média R² ajustado(%) Pmáx.

x y

Testemunha y = 5.8314+0.0446x-0.0004x2 78.54 55.75 7.07

SEMIA 5080 y = 5.3931+0.026x-0.0003x2 84.61 43.33 5.96

SEMIA5079 y = 5.6309+0.0258x-0.0003x2 94.37 43.00 6.19

SEMIA 5019 y = 5.2774+0.0307x-0.0003x2 84.70 51.17 6.06

SEMIA 587 y = 5.8095+0.046x-0.0004x2 81.18 57.50 7.13


Este resultado pode ser evidenciado pelas figuras 27 e 28, onde mostram que

não há o crescimento micelial de M. phaseolina por sobre as sementes inoculadas

com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079 e SEMIA 5019.

61

Figura 27 - Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina.


Figura 28 - Comparação do crescimento micelial de Macrophomina phaseolina através da microbiolização com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080.





Testemunha

62

Pela figura 29 observa-se que a estirpe SEMIA 587 também não diferencia-se

estatisticamente da testemunha, atingindo o crescimento micelial por toda a placa às

96 horas de avaliação. Enquanto SEMIA 5019 e SEMIA 5080 reduzem em torno de

17,62% do crescimento micelial e SEMIA 5079 reduz 12,86% do crescimento micelial

de R. solani.

Figura 29 - Resultado do potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani em 96 horas de avaliação.


x y

Testemunha y = 3.8244+0.039x 91.75

SEMIA 5080 y = 3.3592+0.0685x-0.0004x2 96.38 85.63 6.29

SEMIA5079 y = 3.5171+ 0.0667x-0.0004x2 98.49 83.38 6.30

SEMIA 5019 y = 3.2913+0.0716x-0.0005x2 99.09 71.60 5.85

SEMIA 587 y = 3.7846+0.039x 92.13


As figuras 30 e 31 ilustram os resultados observados na figura 29. Onde as

estirpes SEMIA 5080, 5079 e SEMIA 5019 apresentam uma proteção à semente

quando inoculadas; enquanto a estirpe SEMIA 587 observada também na figura 20,

63

não protege a semente, ocorrendo o crescimento de R. solani por sobre a semente.

Figura 30 - Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani.


Figura 31 - Comparação do crescimento micelial de Rhizoctonia solani através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos nove dias após início do experimento.




Testemunha


64

Observa-se pela figura 32 que a estirpe SEMIA 587 não diferiu da testemunha,

enquanto que as demais estirpes reduziram o crescimento micelial de Sclerotinia

sclerotiorum em 13,47% e 17,34% para SEMIA 5079 e SEMIA 5019-SEMIA 5080

respectivamente.

Figura 32 - Resultado do potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum em 72 horas de avaliação.


x y

Testemunha y = 5.1482+0.0294x 97.40

SEMIA 5080 y = 4.7582+ 0.0462x -0.0004x2 93.41 57.75 8.76

SEMIA5079 y = 4.9763+ 0.0428x-0.0004x2 98.73 53.50 8.41

SEMIA 5019 y = 4.7819+0.043x-0.0004x2 93.11 53.75 8.25

SEMIA 587 y = 5.1944+0.0287x 97.02


Da mesma forma as figuras 33 e 34 ilustram os resultados apontados na

figura 32, mostrando que quando a semente foi inoculada com a estirpe SEMIA 587

não houve proteção na semente, pois o fitopatógeno cresceu sobre a mesma,

enquanto nas sementes inoculada com as demais estirpes não houve crescimento

micelial sobre as sementes.

65

Figura 33 - Potencial antagonista de Bradyrhizobium spp. através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum


Figura 34 - Comparação do crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum através da microbiolização das sementes com as estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5080 aos nove dias após início do experimento.





Testemunha

66

4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS HIFAS DOS PATÓGENOS CONFRONTADOS POR Bradyrhizobium spp.

4.2.1 Fusarium crassistipitatum

Por meio de amostras obtidas do experimento com o confronto direto em meio

de cultura, foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV), a fim de

observar as mudanças presentes nas hifas dos fungos fitopatogênicos estudados.

A figura 35 mostra as hifas da testemunha aos nove dias de crescimento

micelial. Nota-se pelos círculos vermelhos a produção de esporos de Fusarium

crassistipitatum, e nenhum dano nas hifas.

Figura 35 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado as hifas da testemunha de Fusarium crassistipitatum aos nove dias de avaliação.


67

Para as amostras dos tratamentos contendo as estirpes SEMIA 5080, SEMIA

5079 e SEMIA 5019 não foi conseguido realizar a microscopia, devido a ausência de

crescimento, e da forma como se apresentou no meio de cultivo.

Na figura 36, pode-se perceber que não houve grandes diferenças nas hifas

que estiveram na presença da estirpe SEMIA 587, em relação a testemunha (figura

35). Observa-se que há a produção de esporos (círculo em vermelho) e nenhum dano

visível na hifa. O que vem de encontro com o observado na figura 12, onde o

crescimento micelial de F. crassistipitatum foi muito similar ao da testemunha ao longo

do tempo.

Figura 36 - Microscopia eletrônica de varredura com ampliação de 500 vezes, apresentado as hifas de Fusarium crassistipitatum quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 587 aos nove dias de avaliação.


68

4.2.2 Macrophomina phaseolina

Na figura 37 são vistas as hifas da testemunha de Macrophomina phaseolina

aos nove dias de crescimento micelial.

Figura 37 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado as hifas da testemunha de Macrophomina phaseolina aos nove dias de avaliação.


Na figura 38 observam-se as hifas de M. phaseolina quando confrontadas com

a estirpe SEMIA 5080, pelos círculos em amarelo, nota-se que há o estreitamento das

hifas seguido pelo rompimento da mesma em diversos pontos da imagem. Nos

círculos em azul há a percepção do início do estreitamento da hifa, onde as

extremidades apresentam-se mais espessas enquanto o meio é estreitado.

69

Figura 38 - Microscopia eletrônica de varredura com ampliação de 500 vezes, apresentado as hifas de Macrophomina phaseolina quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 5080 aos nove dias de avaliação.


Pela figura 39 são vistas as hifas de M. phaseolina confrontadas pela estirpe

SEMIA 5079. Na imagem é visível o início do estreitamento das hifas (círculos em

azul), bem como o dobramento das hifas mostrado nos círculos em amarelo, podendo

ter sido proporcionado devido a perca do conteúdo celular.

70



Quando confrontado pela estirpe SEMIA 5019, também é percebido na figura

40, o inicio do processo de estreitamento de hifa (círculos em azul), o que torna a hifa

bastante fina em alguns pontos (círculo em amarelo), e o que ocorre com maior

intensidade neste caso, é o dobramento das hifas (círculos em verde).

71



Na figura 41, quando o fitopatógeno é confrontado com a estirpe SEMIA 587, é

observado o estreitamento das hifas (círculo em amarelo), bem como o dobramento

das hifas proporcionado pela perca do conteúdo celular (círculos em verde). A figura

entra em concordância com o resultado obtido na figura 15 e 16, onde mesmo o

crescimento micelial passando por sobre o círculo formado pelo Bradyrhizobium, há

um retardo no crescimento, evidenciando na figura 41 os danos causados pela estirpe

SEMIA 587 sobre as hifas de M. phaseolina.

72



4.2.3 Rhizoctonia solani

No confronto entre Rhizoctonia solani e as estirpes de Bradyrhizobium spp. não

foram observados os confrontos com SEMIA 5080, SEMIA 5079 e SEMIA 5019, pelo

mesmo motivo apurado no confronto com F. crassistipitatum.

Ainda pela testemunha e o confronto com a estirpe SEMIA 587, nas figuras 42

e 43, é difícil verificar diferenças e similaridades entre imagens, pois há um grande

aglomerado de hifas num aumento de 500 vezes, e não foi possível observar numa

73

ampliação maior, visto que a amostra era queimada pelo feixes de elétrons do

equipamento de microscopia de varredura.

Figura 42 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado as hifas da testemunha de Rhizoctonia solani aos nove dias de avaliação.


74

Figura 43 - Microscopia eletrônica de varredura com ampliação de 500 vezes, apresentado as hifas de Rhizoctonia solani quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 587 aos nove dias de avaliação.


4.2.4 Sclerotinia sclerotiorum

Observa-se pela figura 44 a microscopia das hifas da testemunha de Sclerotinia

sclerotiorum, numa ampliação de 500 vezes.

75

Figura 44 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado as hifas da testemunha de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias de avaliação.


Quando S. sclerotiorum é confrontada pela estirpe SEMIA 5080, na figura 45, é

percebido um estreitamento de hifa, seguido do rompimento e extravasamento do

conteúdo celular.

76

Figura 45 - Microscopia eletrônica de varredura ampliada em 500 vezes apresentado as hifas de Sclerotinia sclerotiorum quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 5080 aos nove dias de avaliação.


Na figura 46 é visto o dano proporcionado ao fitopatógeno no confronto com

SEMIA 5079, observa-se pelos círculos em amarelo alguns pontos onde houve

afinamento da hifa, seguido do rompimento da mesma; e nos círculos em verde o

dobramento da hifa, apontando a perca de conteúdo celular.

77

Figura 46 - Microscopia eletrônica de varredura com ampliação de 500 vezes, apresentado as hifas de Sclerotinia sclerotiorum quando confrontado pelo método do círculo com a estirpe SEMIA 5079 aos nove dias de avaliação.


Já a figura 47 ilustra o confronto com SEMIA 5019, onde ainda há maior dano

morfológico, apresentando alto estreitamento de hifa, que comparado a testemunha

da figura 44 é bastante agravado.

78



A figura 48 mostra a microscopia do confronto com SEMIA 587, apresentando

alguns danos pontuais nas hifas, como o estreitamento visto nos círculos em amarelo.

Porém não há grandes danos se comparado com as figuras 45, 46 e 47, pois a maioria

das hifas ainda se apresentam morfologicamente similares à testemunha (figura 44).

79



4.3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DOS METABÓLITÓS DE Bradyrhizobium spp.

Nas tabelas 07 e 08 encontram-se as ANOVAS dos ensaios realizados com



80

Tabela 06 - ANOVA correspondente ao ensaio com Fusarium crassistipitatum.

Fonte de variação GL QM

Estirpes (A) 4 0,01680ns

Tempos (B) 6 108,32199*

A x B 24 0,0214ns

Erro 105 0,02371

Total 139 -

Média - 4,93

CV(%) - 3,13 Fonte: Arquivo pessoal (2020)

Tabela 07 - ANOVA correspondente aos ensaios com Macrophomina phaseolina, Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium crassistipitatum

QM

Fonte de variação GL Rizhoctonia Macrophomina Sclerotinia

Estirpes (A) 4 0,09495* 0,03083ns 0,12434ns

Tempos (B) 3 126,37521* 188,00561* 138,01361*

A x B 12 0,0432* 0,00845ns 0,12039*

Erro 60 0,0218 0,0354 0,0563

Total 79

Média 5,53 5,73 6,67

CV(%) 2,67 3,28 3,56 Fonte: Arquivo pessoal (2020)

Nota-se pelas tabelas 08 e 09 que não houve interação significativa no

crescimento micelial de F. crassistipitatum e M. phaseolina entre o tempo x metabolitos

obtidos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 na

concentração de 10%.

Na figura 49, como não houve diferença, formou-se uma única curva no

processo de regressão para os cinco tratamentos, incluindo a testemunha com água

destilada.

81

Figura 49 - Efeito dos filtrados (metabólitos) das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum em 120 horas de avaliação.


Observa-se também pela figura 50 que não houve efeito de antibiose das

estirpes de Bradyrhizobium spp. estudadas sobre F. crassistipitatum na concentração

de 10%, não havendo diferença dos tratamentos com a testemunha.

82

Figura 50 - Aplicação dos filtrados metabólicos na concentração de 10%, obtidos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Fusarium crassistipitatum aos nove dias após início do experimento.


O mesmo resultado pode ser visto na figura 51, onde os metabólitos obtidos

das estirpes de Bradyrhizobium spp. não diferiram significativamente da testemunha

com água destilada no crescimento micelial de M. phaseolina. Mostrando desta forma,

que não houve efeito de antibiose na aplicação dos metabólitos, como observado na

figura 52.


SEMIA 5019

SEMIA 587

Testemunha

83

Figura 51 - Efeito dos filtrados (metabólitos) das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina em 72 horas de avaliação.


Figura 52 - Aplicação dos filtrados metabólicos na concentração de 10%, obtidos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Macrophomina phaseolina aos nove dias após início do experimento.



Testemunha


84

Para o crescimento micelial de Rhizoctonia solani os metabólitos de R. solani

também não se mostraram eficientes, pois nas 72 horas de avaliação as retas se

encontram, observado na figura 53, indicando que o crescimento micelial atingiu a

placa toda em todos os tratamentos.

Figura 53 - Efeito dos filtrados (metabólitos) das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani em 72 horas de avaliação.

Cepas Equação ou média Rajustado

Testemunha y = 2,8682+0,0776x 98,99

SEMIA 5080 y = 2,6396+0,0798x 99,56

SEMIA5079 y = 2,5207+0,0819x 99,50

SEMIA 5019 y = 2,5234+0,0838x 98,03

SEMIA 587 y = 2,5498+0,0815x 99,53


A figura 54 ilustra o crescimento do fitopatógeno em placas de Petri, mostrando

que não houve diferença dos tratamento com metabólitos sobre o crescimento

micelial, havendo o fechamento completo da placa.

85

Figura 54 - Aplicação dos filtrados metabólicos na concentração de 10%, obtidos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Rhizoctonia solani aos nove dias após início do experimento.


Os metabólitos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA

587 na concentração de 10% também não impediram o fechamento da placa de Petri,

pelo crescimento micelial de S. sclerotiorum como observado nas 72 horas pela figura

55 e figura 56. Não apresentando antibiose sobre o fitopatógeno.



Testemunha

86

Figura 55 - Efeito dos filtrados (metabólitos) das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. na concentração de 10% aplicado no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum em 72 horas de avaliação.

Cepa Equação ou média Rajustado Pmáx,

x y

Testemunha y = 3,3038+ 0,2004x-0,0018x2 94,48 55,67 8,88

SEMIA 5080 y = 3,1638+ 0,1951x-0,0017x2 97,42 57,38 8,76

SEMIA5079 y = 2,5613+0,2286x-0,0021x2 95,29 54,43 8,78

SEMIA 5019 y = 2,697+0,2238x-0,0021x2 94,27 53,29 8,66

SEMIA 587 y = 2,8613+0,2182x-0,002x2 94,78 54,55 8,81


87

Figura 56 - Aplicação dos filtrados metabólicos na concentração de 10%, obtidos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079, SEMIA 5019 e SEMIA 587 de Bradyrhizobium spp. no controle biológico in vitro de Sclerotinia sclerotiorum aos nove dias após início do experimento.


4.3.1 Concentração Inibitória Mínima dos metabólitos das estirpes de Bradyrhizobium spp.

Tendo em vista que os metabolitos das estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079,

SEMIA 5019 e SEMIA 587 na concentração de 10% não exerceram antibiose sobre

os fitopatógenos Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia

solani e Sclerotinia sclerotiorum, foi realizada a metodologia da Concentração

Inibitória Mínima (CIM), obtido através da microdiluição dos metabólitos extraídos pela

filtragem do meio líquido contendo as estirpes de Bradyrhizobium spp.



Testemunha

88

Nesta metodologia observou-se que em nenhum dos poços diluídos, nem

mesmo na maior dose de 100%, houve inibição do crescimento ou morte dos quatro

fitopatógenos em estudo, como ilustrado na figura 57.

Figura 57 - Método da microdiluição realizada em placas de elisa para obtenção da concentração inibitória mínima dos metabólitos das estirpes de Bradyrhizobium spp. para o controle dos fitopatógenos em estudo.


Percebeu-se que os metabólitos de Bradyrhizobium spp. não exerceram

antibiose sobre os fitopatógenos em nenhuma concentração, notando que em todos

os poços houve ativação do tetrazólio (coloração vermelha) através da respiração

celular, exceto na linha testemunha contendo apenas o meio de cultura BD, e nos

quatro últimos poços da última linha, contendo o filtrado dos metabólitos da estirpe de

Bradyrhizobium spp.

Sclerotinia sclerotiorum x Microdiluição dos metabólitos filtrados da estirpe SEMIA 5080

Fusarium crassistipitatum x Microdiluição dos metabólitos filtrados da estirpe SEMIA 5080

R1 R2 R3

R1 R2 R3

Linha Testemunha

Sclerotinia sclerotiorum Fusarium crassistipitatum SEMIA 5080

89

4.4 DISCUSSÃO DO EFEITO ANTAGONISTA DE Bradyrhizobium spp. EM CONFRONTO DIRETO

Percebe-se no confronto direto entre os patógenos versus as estirpes de

Bradyrhizobium spp. um destaque na redução do crescimento micelial para as estirpes

SEMIA 5080 e SEMIA 5019, as quais foram as mais eficazes no controle de Fusarium

crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotinia

sclerotiorum em todos os confrontos, tanto pelo método adaptado do círculo, quanto

pela inoculação das sementes com as cepas; seguido pelo bom desempenho da

estirpe SEMIA 5079.

Verificou-se que dentro das quatro estirpes de Bradyrhizobium spp. estudadas,

duas se destacaram, portanto cabe elucidar que num mesmo gênero de bactéria,

existem diferentes respostas no controle à determinados fitopatógenos; o mesmo foi

visto em outras espécies de rizobacterias retratadas por Lima et al. (2014) em

condições de experimento in vitro e por Carrer-Filho et al. (2015) em casa de

vegetação.

A mesma variação ocorre entre fitopatógenos, onde cada estirpe desempenha

um papel diferenciado no controle de cada patógeno em estudo, como ocorre com a

estirpe SEMIA 5079, a qual obteve maior eficiência no controle do crescimento micelial

de Sclerotinia sclerotiorum na metodologia adaptada do círculo (figura 21), e não nos

demais patógenos testados. Isto também é verificado por Pane et al. (2014), ao

testarem novas linhagens de Bacillus spp. no controle biológico de Rhizoctonia

solani, Sclerotinia minor e Fusarium solani, constataram uma distinta eficácia para

cada estirpe no controle de cada patógeno, atribuindo a este resultado à complexidade

do mecanismo adquirido nas interações bióticas, as quais considera distintas para

cada caso em particular.

Enquanto a estirpe 5079 obteve um maior desempenho na redução do

crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum pelo método adaptado do círculo em

meio YMA (figura 21 e figura 22), não controlando o crescimento micelial de

Macrophomina phaseolina, pois ainda que tenha retardado o crescimento micelial em

tempo, houve o crescimento do fitopatógeno por sobre o círculo/barreira formada pelo

Bradyrhizobium; e contendo também, o crescimento de Fusarium crassistipitatum

(figura 12 e figura 14), e de Rhizoctonia solani (figura 17 e figura 19), onde o

90

crescimento micelial foi restrito até próximo a barreira formada pelo círculo contendo

Bradyrhizobium spp., apresentando para os últimos três patógenos citados uma

resposta de controle inferior para a estirpe SEMIA 5079 em comparação com as

estirpes SEMIA 5019 e 5080.

Enquanto que no método utilizando a inoculação das sementes de soja com as

estirpes de Bradyrhizobium spp. em meio BDA houve uma resposta muito próxima

entre as estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5019-SEMIA 5080 na redução do crescimento

micelial de Fusarium crassistipitatum, e inferior porém muito próxima no controle de

Macrophomina phaseolina (figura 26 e figura 27), Rhizoctonia solani (figura 29 e figura

30) e Sclerotinia sclerotiorum (figura 32 e 33).

Estes resultados comparativos entre o método adaptado do círculo, com a

microbiolização da semente, mostram ainda que as estirpes SEMIA 5019 e SEMIA

5080 apresentam destaque no controle em relação as demais, e comprovam que a

estirpe SEMIA 587 não apresenta qualquer efeito antagonista sobre os fitopatógenos

testados. Esta diferença apresentada entre os métodos estudados pode ser explicada

em especial pela diferença inerente entre cada método, em que mostra que há uma

certa inibição nas estirpes SEMIA 5019 e SEMIA 5019, pois os fitopatógenos não se

aproximam da barreira formada pelo Bradyrhizobium spp, no método adaptado do

círculo. Além de serem métodos diferentes, o meio utilizado também contribui para as

pequenas diferenças, onde o meio YMA sem a presença do corante vermelho congo,

é específico para o crescimento de Bradyrhizobium spp. enquanto o meio BDA

utilizado na metodologia de inoculação das sementes é específico para fungos, logo

o crescimento micelial dos patógenos é diferenciado em cada meio, podendo-se

perceber e comparar pelas figuras 13, 16, 18, 21, 25, 28, 31 e 34 que a morfologia

das colônias são diferentes em cada meio, porém não impedem o controle exercido

pelas estirpes de Bradyrhizobium spp. sobre os fitopatógenos.

O mesmo foi observado por Nozaki, Camargo e Barreto (2004) mostrando que

o regime de luz, temperatura e diferentes meios de cultura corroboram para um

crescimento micelial diferenciado visto em dez isolados de Diaporthe citri agente

causal da melanose em citros.

Quanto ao antagonismo direto desempenhado contra cada patógeno em

estudo, segundo Leelasuphakul et al. (2008), tem suas justificativas pautadas nos

mecanismos de antibiose, através da produção de compostos voláteis, substâncias

91

antimicrobianas, competição por espaço, e também a competição por nutrientes

exercida pelos microrganismos desafiados.

Em trabalhos utilizando outras rizobactérias, como o de Lima et al. (2014),

verificaram que seis espécies do gênero Bacillus spp. apresentaram efeito antagonista

sobre F. oxysporum f. sp. lycopersici, reduzindo em diferentes taxas, o crescimento

micelial do fitopatógeno utilizando o método do círculo, muito similar ao usado no

presente trabalho. Os autores justificaram tal resultado devido aos diferentes

mecanismos de ação que a rizobactéria apresenta, sendo produção de compostos

voláteis, ácido cianídrico e anbibiose, atuando de forma isolada ou de forma conjunta.

Outro meio pelo qual os microorganismos podem exercer o controle biológico,

se dá pela produção de enzimas hidrolíticas, como apurado em estudo realizado por

Solanki et al. (2013), no qual isolou-se 220 bactérias da rizosfera de tomate, dentre

elas Alcaligenes sp., Enterobacter sp., Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas

fluorescens, verificando o potencial antagonista sobre Rhizoctonia solani. As

rizobactérias Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas fluorescens apresentaram o

maior efeito antagonista sobre R. solani, constatando também a produção de enzimas

hidrolíticas, cianeto de hidrogênio e ácido indolacético por tais bactérias, o que

segundo o autor auxiliou no resultado obtido, tendo em vista que as enzimas quitinase

e b-1,3-glucanase sintetizadas pelas rizobactérias degradaram as paredes celulares

do fitopatógeno.

Há relatos na bibliografia onde outras bactérias diazotróficas atuam no controle

biológico de fitopatógenos, como o estudo de Brito et al. (2018) que utilizaram

bactérias diazotróficas isoladas da cultura do milho, sendo elas Acinetobacter

johnsonii, Burkholderia ambifaria e Burkholderia sp. em confornto com os

fitopatógenos Giberela zeae, Macrophomina phaseolina, Bipolaris sorokiniana e

Colletotrichum musae, perceberam que a bactéria A. jonhsonii inibiu o crescimento de

fungo G. zeae, porém não houve redução no crescimento de M. phaseolina, C. musae

e B. sorokiniana; Já para B. ambifaria houve redução de 50% para o fungo B.

sorokiniana e 36% para G. zeae, não havendo redução do crescimento de M.

phaseolina e C. musae. E para a terceira bactéria Burkholderia sp. obtiveram redução

no crescimento micelial de 36% para C. musae, 26% para M. phaseolina e 32% para

G. zeae. Portanto, apenas Burkholderia sp. obteve controle sobre o fitopatógeno M.

phaseolina.

92

Rakib et al. (2012), observaram uma redução no crescimento micelial de

Fusarium solani e de Macrophomina phaseolina ao serem confrontados in vitro com

Rhizobium japonicum. Houve também uma redução da severidade da podridão

radicular ocasionada por estes patógenos, maior emergência e promoção de

crescimento das plantas em condições de campo e de casa de vegetação, quando

inoculadas com R. japonicum. O autor justifica este controle, ao antagonista ser um

bom simbionte, o qual além de fixar nitrogênio, produz substâncias que promovem o

crescimento, como auxina (AIA), giberelina (GA3) e citocinina (Zeatina) (CASSÁN et

al., 2009), podendo suprimir indiretamente o patógeno por meio de metabólitos que

protegem as raízes através de antibiose, inibição da germinação de esporos e indução

de resistência da planta.

Há estudos, ainda que muito antigos, que apontam a atividade antagonista

exercida por o Rhizobium spp. ou Bradyrhizobium spp., como o trabalho realizado por

Tu (1978), onde a severidade da podridão das raízes ocasionada por Phytophthora

megasperma foi reduzida com a inoculação de Rhizobium sp. no solo. Tais bactérias

colonizaram e recobriram as pontas das hifas, impedindo o contato entre o tecido das

raízes e Phytophthora megasperma.

Chakraborty e Purkayastha (1984) verificaram a mesma inibição do

crescimento de Macrophomina phaseolina exercida por Rhizobium japonicum,

constatando por meio de análises espectrofotométricas cromatográficas, ultravioletas

e infravermelha a produção de uma substância tóxica sintetizada pela bactéria,

denominada de rizobitoxina, observada nas raízes da soja inoculada de forma isolada

ou em combinação com R. japonicum e M. phaseolina. Já Sharif, Khalil e Ahmed

(2003) apresentam o controle de Rhizobium sp. isolado do sistema radicular de grão-

de-bico sobre Alternaria alternata, Fusarium sp. Ascochyta rabiei, Drechslera sp. e

Curvularia sp.

Siddiqui; Haque e Ghaffar (1998) mostram que o uso de duas estirpes

combinadas de Bradyrhizobium spp. apresentam melhores respostas no

controle de M. phaseolina e R. solani do que as estirpes utilizadas em separado

em plantas de girassol e grão de bico.

A combinação de duas estirpes é comumente utilizada na fabricação de

inoculantes comerciais, com a finalidade de nodular a soja para fixação de nitrogênio.

O RELARE (Rede de Laboratórios para Recomendação, Padronização e Difusão de

93

Tecnologia de Inoculantes Microbianos de Interesse Agrícola) orientou em 1994 o uso

combinado de duas estirpes de Bradyrhizobium sp. na formulação do inoculante, mas

a partir de 2007 apresentou a possibilidade de ser utilizada apenas uma cepa. Quanto

a recomendação, em 1979 as estirpes indicadas eram SEMIA 587 e SEMIA 5019,

havendo uma mudança em 1992 para as estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080

(HUNGRIA; CAMPO; MENDES, 2007). Portanto, as estirpes mais utilizadas nos

produtos comerciais do Brasil, são as mesmas indicadas desde 1992, SEMIA 5079 e

SEMIA 5080, com o uso unicamente para nodulação e fixação biológica de nutrientes,

não existindo nenhum produto para controle biológico com tais cepas, tendo em vista

que mesmo havendo estudos muito antigos que comprovem a eficácia de

Bradyrhizobium spp., estes pararam ao longo do tempo.

Outro ponto que pode ser observado nas figuras 13, 16, 18 e 21 é que tanto

SEMIA 5080, quanto SEMIA 5019, são as que mais se destacaram também no

desenvolvimento morfológico nas placas, obtendo uma consistência mucosa e

espessa, enquanto as estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 587 apresentam-se mais

“ressecadas” ou menos mucoides no meio de cultura.

Segundo Martins et al. (1997) B. japonicum apresenta muco butirico e B. elkanii

muco viscoso. Alguns pesquisadores ao desenvolverem seus experimentos se

comparados, entram em controvérsia quanto ao desempenho destas estirpes a

campo, como os de Furhmann (1990) o qual observou que estirpes com colônias

viscosas e grandes apresentaram maior fixação de N2 em comparação as estirpes

com colônias pequenas e secas. Já para Herridge e Roughley (1975) a maior

eficiência na fixação de N2 veio de colônias pequenas e secas.

Portanto percebe-se que comparar a consistência da colônia com o

desempenho da cultura da soja em campo, é um tanto falho, tendo em vista que

pesquisas se divergem neste ponto. Sendo necessário realizar mais estudos em

ambiente controlado para afirmar se há similaridade entre as características da colônia

in vitro com o desempenho das mesmas a campo.

94

4.5 DISCUSSÃO DO EFEITO DOS METABÓLITOS DAS ESTIRPES DE Bradyrhizobium spp. APLICADO SOBRE OS FITOPATÓGENOS

Como já percebido e discutido no confronto direto entre fitopatógenos e as

estirpes de Bradyrhizobium spp. há uma restrição no crescimento de cada

fitopatógeno quando confrontados pelas estirpes SEMIA 5080, SEMIA 5079 e SEMIA

5019; porém quando em contato com os filtrados metabólicos das cepas, não houve

a mesma restrição no crescimento micelial, como visto nas figuras 49 até 57.

Chakraborty e Purkayastha (1984) afirmaram que o crescimento de

Macrophomina phaseolina em meio líquido foi inibido por filtrados de Rhizobium

japonicum, e não pela competição por nutrientes, porém os filtrados foram obtidos

através de centrifugação 8500 g por 20 minutos, e o sobrenadante foi usado como

filtrado da cultura, porém apenas a centrifugação não retira as células vivas, portanto

não foram utilizados os metabólitos livres de célula no experimento, não podendo ser

afirmado o potencial de antibiose de R. japonicum. Quanto a rizobitoxina, esta foi

extraída pelos autores por meio de nódulos de plantas inoculadas com R. japonicum

ou com R. japonicum + M. phaseolina, o uso do fitopatógeno pode ter sido um elicitor

que provocou estresse na bactéria, modificando a rizobitoxina, além de ter sido usada

de forma isolada.

Os elicitores atuam ativando a defesa da planta, ou neste caso do

microrganismo, fazendo com que ocorra a produção de metabólitos que o defendam

contra o ataque do patógeno (TAIZ; ZEIGER, 2004). Assim, é necessário realizar um

estudo envolvendo diferentes elicitores, entre eles o próprio patógeno, para verificar

se há a produção de metabólitos de defesa.

Outro ponto levantado por Pal e Gardener (2006) é que para o biocontrole do

patógeno ser efetivo, a substância antimicrobiana deve ser produzida numa escala

tóxica o suficiente para controlar o fitopatógeno. Pensando nesta questão, foi

realizada a metodologia da Concentração Inibitória Mínima, observado na figura 57,

verificando em diversas microdiluições/concentrações se há o controle do

fitopatógeno, contudo em nenhum ensaio se obteve tal resultado. Logo, a necessidade

expressa anteriormente de realizar ensaios com elicitores diversos, entre eles

estresse por temperatura, luz, luz negra, salino, utilização de microrganismo vivo,

entre outros.

Wang et al. (2013) notaram que a utilização de paredes celulares e filtrados

95

fúngicos de Penicillium chrysogenum usados como elicitores, aumentaram a produção

de natamicina, um antibiótico utilizado contra bolores e leveduras, produzido por

Streptomyces natalensis.

Ratanasakchaicharn e Thapanapongworakul (2019) constataram o efeito volátil

de isolados de rizobactérias extraídas da rizosfera de Neptunia natans sobre

Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani em sistema “sanduiche”, onde um disco do

patógeno era posto na placa de Petri de baixo, e na placa de cima era posto a

rizobactéria.

Alguns testes do presente trabalho, utilizando as estirpes SEMIA 5080 e SEMIA

5019 em placa bibartida, verificou que não houve efeito volátil destas estirpes sobre

os fitopatógenos (Figura 58).

Figura 58 - Placas bipartidas contendo do lado esquerdo a estirpe fúngica de M. phaseolina e na direita a testemunha com água destilada, SEMIA 5080 e SEMIA 5019 respectivamente, aos sete dias de avaliação.

96

5 CONCLUSÕES

Pode-se observar o potencial de Bradyrhizobium spp. no controle dos

patógenos Fusarium crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani

e Sclerotinia sclerotiorum ,nos dois estudos realizados em confronto in vitro, sendo

que as estirpes SEMIA 5080 e SEMIA 5019 foram as que obtiveram melhor potencial

de supressão do crescimento dos mesmos, seguido pelo bom desempenho da estirpe

SEMIA 5079, sendo que a estirpe SEMIA 587 não demonstrou controle algum sobre

os fitopatógenos.

Os danos morfológicos mais comuns proporcionados pelo confronto direto

entre os fitopatógenos e as estirpes de Bradyrhizobium spp. nas hifas fúngicas, foi a

ruptura e o estreitamento das hifas.

Os metabólitos das estirpes de Bradyrhizobium spp. tanto na concentração de

10%, quanto no CIM, e compostos voláteis não apresentaram ação antifúngica sobre

os fitopatógenos estudados.

97

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O emprego de Bradyrhizobium spp. no controle biológico de Fusarium

crassistipitatum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotinia

sclerotiorum obteve êxito nos experimentos realizados in vitro. Cabe agora verificar

sua eficácia no controle de doenças a campo.

Outra metodologia deve ser empregada para verificar a capacidade de

produção de metabólitos pelas estirpes de Bradyrhizobium spp., como o uso de

elicitores, que promovam estresse e estimulem a produção de compostos

antifúngicos.

98

REFERÊNCIAS

ADAMI, Paulo Fernando et al. In MAZARO, Sérgio Miguel (Org.). Sistema de produção de soja orgânica. Porto Alegre, RS: Cinco Continentes, 2017. 244 p. ISBN 9788586466595. ALFENAS, A. C. A.; MAFIA, R. G. Métodos em fitopatologia. Viçosa, MG: Editora UFV, 2007. 382 p. ALICE, Devadason; SUNDRAVADA Subramanian. Effects of Biocontrol Agents and Plant Products on Macrophomina phaseolina and Colchicine Content in Gloriosa superba. Revista Plant Protect. Sci. Vol. 48, 2012, No. 3: 110–115. ALMEIDA, A.M.R. et al. Macrophomina phaseolina em soja. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Soja, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Maio, 2014. ISSN 2176-2937. AMORIN, L., REZENDE, J.A.M., BERGAMIN FILHO, A. Manual de fitopatologia. Vol.01. 4 ed. Editora Agronômica Ceres Ltda. São Paulo, SP, 2011. ISSN 978-85-318-0052-8. ANTUNES, J. E. L. et al. Eficiência simbiótica de isolados de rizóbio noduladores de feijão-fava (Phaseolus lunatus L.). Rev. Bras. Ciênc. Solo, Viçosa , v. 35, n. 3, p. 751-757, jun. 2011 . ARAÚJO, R., HUNGRIA, M. Microrganismos de importância agrícola. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão (CNPAF) e Centro Nacional de Pesquisa de soja (CNPSo). Brasília, DF, 1994. BARBIERI, R.L., STUMPF, E.R.T., PEREIRA, R.M. Origem e evolução de plantas cultivadas. Brasilia , DF: Embrapa, 2008. 909 p. ISBN 97885732211. BETTIOL, W. Produtos comerciais à base de agentes de biocontrole de doenças de plantas. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisa de Monitoramento e Avaliação de Impacto Ambiental, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Agosto, 2012. ISSN 1516-4691. BETTIOL, W., MORANDI, M. A. B. Biocontrole de doenças em plantas: usos e perspectivas. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Meio Ambiente, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Jaguariuna, SP, 2009. BRITO, T.S., LIMA, W.F., PAN, R., PORFIRIO, M.D., CANELLO, K.T., CHAVES, E.I.D. Antagonismo de bactérias diazotróficas isoladas de plantas de milho no biocontrole de fitopatógenos. Revista Cultivando o saber. ISSN 2175-2214 Volume 11 - n˚1, p. 81 a 91. Janeiro a Março de 2018. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa

99

Agropecuária. Regras para análise de sementes. Brasília: p. 399, 2009. CAMPO, R.J; HUNGRIA, M. Compatibilidade de uso de inoculantes e fungicidas no tratamento de sementes de soja. Embrapa soja, 2000. ISSN 1516-7860. CARRER FILHO, Renato; DIANESE, Érico de Campos e CUNHA, Marcos Gomes da. Supressão da murcha de fusário em tomateiro por rizobactérias do gênero Bacillus1. Pesqui. Agropecu. Trop. [online]. 2015, vol.45, n.3 [citado 2019-11-18], pp.356-363. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1983-40632015000300014&lng=pt&nrm=iso>. ISSN 1517-6398. http://dx.doi.org/10.1590/1983-40632015v4535397. CASSÁN, F.; PERRIG, D.; SGROY, V.; MASCIARELLI, O.; PENNA, C.; LUNA, V. Azospirillum brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea mays L.) and soybean (Glycine max L.). European Journal of Soil Biology, Montrouge, v.45, n.1, p.28–35, 2009b. CASTRO, P. R. C., KLUGE, R. A., SESTARI, I. Manual de fisiologia vegetal: fisiologia de cultivos. Piracicaba, SP: Agronômica Ceres, 2008. 864 p. ISBN 9788531800498. CEPEA – Centro de Estudos Avançados em Economia Aplicada – ESALQ/USP. PIB do Agronegócio Brasil. Dezembro de 2017. Chakraborty, U., & Purkayastha, R. P. (1984). Role of rhizobitoxine in protecting soybean roots from Macrophomina phaseolina infection. Canadian Journal of Microbiology, 30(3), 285–289. doi:10.1139/m84-043. CHUEIRE, L. M. O., BANGEL, E. V., MOSTASSO, F. L., CAMPO, R. J., PEDROSA, F. O., & HUNGRIA, M.. (2003). Classificação taxonômica das estirpes de rizóbio recomendadas para as culturas da soja e do feijoeiro baseada no seqüenciamento do gene 16S rRNA. Revista Brasileira de Ciência do Solo, 27(5), 833-840. https://dx.doi.org/10.1590/S0100-06832003000500007 CONAB – Companhia Nacional de Abastecimento. Coletim da safra de grãos. Disponível em: http://www.agricultura.gov.br/noticias/safra-de-graos-2019-20-indica-producao-de-245-milhoes-de-toneladas-divulga-conab CRUZ, C.D. Genes Software – extended and integrated with the R, Matlab and Selegen. Acta Scientiarum. v.38, n.4, p.547-552, 2016. DELAMUTA, J.R.M.; RIBEIRO, R.A.; ORMENÕ-ORRILLO, E.; MELO, I.S.; MARTINÉZ-ROMERO, E.; HUNGRIA, M. Polyphasic evidence supporting the reclassification of Bradyrhizobium japonicum group Ia strains as Bradyrhizobium diazoefficiens sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.63, p.3342–3351, 2013. FERNANDES, J.R.C., RODRIGUES, P. Importância da inoculação com bactérias rhizobium e bradyrhizobium na produção de leguminosas e o uso do azoto. Revista

http://dx.doi.org/10.1590/1983-40632015v4535397

https://dx.doi.org/10.1590/S0100-06832003000500007

http://www.agricultura.gov.br/noticias/safra-de-graos-2019-20-indica-producao-de-245-milhoes-de-toneladas-divulga-conab

http://www.agricultura.gov.br/noticias/safra-de-graos-2019-20-indica-producao-de-245-milhoes-de-toneladas-divulga-conab

100

Agrotec – Revista técnico cientifica agrícola. Portugal. Junho de 2012. FUHRMANN, J. Symbiotic effectiveness of indigenous soybean Bradyrhizobia as related to serological, morphological, rhizobitoxine and hydrogenase phenotypes. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v.56,p.224-229, 1990. FRANCA NETO, J.B., PEREIRA, L.A.G., COSTA, N.P., KRYZANOWSKI, F.C., HENNING, A.A. Metodologia do teste de tetrazólio em sementes de soja. Embrapa Soja, Londrina PR, 1988. GALLI, F. Manual de fitopatologia – Doenças em plantas cultivadas. Editora agronômica ceres, 2 ed. São Paulo, 1980. GOULART, A.C.P. Fungos em semente de soja, detecção, importância e controle. Embrapa Agropecuária Oeste, Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Dourados, MS – 2005. GUIMARAES, S. L. et al. DEVELOPMENT OF PIGEON PEA INOCULATED WITH RHIZOBIUM ISOLATED FROM COWPEA TRAP HOST PLANTS.Rev. Caatinga, Mossoró , v. 29, n. 4, p. 789-795, dez. 2016 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1983-21252016000400789&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 30 abr. 2018. HERRIDGE, D.F., ROUGHLEY, R.J. Variation in colony characteristics and symbiotic effectiveness of Rhizobium. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v.38, p. 19-27, 1975. HENNING, Ademir Assis, et al. Qualidade de sementes e Grãos Comerciais de Soja no Brasil - safra 2015/16. Embrapa soja, Londrina Paraná, 2017. ISSN 2176-2937 HUNGRIA, M, CAMPO, R.J., MENDES, I.C. A importância do processo de fixação biológica do nitrogênio para a cultura da soja: componente essencial para a competitividade do produto brasileiro. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa soja, Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Junho de 2007. ISSN 1516-781X. KIMATI.H., AMORIN, L., BERGAMIN FILHO, A., CAMARGO, L.E.A., REZENDE, A.M. Manual de Fitopatologia. Vol. 02. Doenças das Plantas Cultivadas. Editora Agronomica Ceres, São Paulo, 1997. LEELASUPHAKUL, W.; HEMMANEE, P.; CHUENCHITT, S. Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strains and their metabolite against the green mold pathogen (Penicillium digitatum Sacc.) of citrus fruit. Postharvest Biology and Technology, Curitiba, v. 48, n. 1, p. 113-121, 2008. LIMA, O.D.R., OLIVEIRA, L.J.M.G., SILVA, M.S.B.S., RODRIGUES, A.A.C. Ação antifúngica in vitro de isolados de Bacillus spp. sobre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Revista Caatinga , Mossoró, v. 27, n. 4, p. 57 –64, out. –dez., 2014 LOPES, C.A.; AVILA, A.C. Doenças do tomateiro. Empresa Brasileira de Pesquisa

101

Agropecuária, Embrapa hortaliças, Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Brasília, DF – 2005. MAPA – Ministerio da agricultura, pecuária e abastecimento. Balança comercia do agronegócio do mês de março de 2019. Disponível em: http://www.agricultura.gov.br/noticias/participacao-do-agronegocio-nas-exportacoes-brasileiras-cresce-1-5-em-marco MARIANO, R. L. R. Métodos de seleção in vitro para o controle microbiológico de patógeno de plantas. Revisão Anual de Patologia de Plantas . Passo Fundo, v. 1, p. 369-409, 1993. MARTINS, L.M.V., XAVIER, G.R., NEVES, M.C.O., RUMJANEK, N.G. Características relativas ao crescimento em meio de cultura e a morfologia de colônias de “rizobio”. Comunicado Técnico Embrapa N.19, Dez. 97, p.1/14. IDDN 0104-8945. MENTEN, J. O. M; MACHADO, C. C; MINUSSI, E; CASTRO, C; KIMATI, H. Efeito de alguns fungicidas no crescimento micelial de Macrophomina phaseolina (Tass.) Goid. “in vitro”. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 1, n. 2, p. 57-66, 1976. NCCLS. Método de referência para testes de diluição em caldo para a determinação da sensibilidade a terapia antifúngica dos fungos filamentosos: norma aprovada. Wayne,Pensilvânia, USA: NCCLS/CLSI by Anvisa (tradução), 2002. 50 p. NOZAKI, M.H., CAMARGO, M., BARRETO, M. Caracterização de Diaporthe citri em Diferentes Meios de Cultura, Condições de Temperatura e Luminosidade. Rev. Fitopatol. bras. 29(4), jul - ago 2004. PAL, K. K; B., GARDENER, McSpadden. Biological Control of Plant Pathogens. The Plant Health Instructor, 2006. DOI: 10.1094/PHI-A-2006-1117-02. PANE, C.,VILLECCO, D., CAMPANILE, F., ZACCARDELLI, M. Novel strains of Bacillus, isolated from compost and compost-amended soils, as biological control agents against soil-borne phytopathogenic fungi. Biocontrol Science and Technology, 01 December 2012, Vol.22(12), pp.1373-1388. RAKIB, A. Al-Ani et al. Rhizobium japonicum as a Biocontrol Agent of Soybean Root Rot Disease Caused by Fusarium solani and Macrophomina phaseolina. Revista Plant Protect. Sci. Vol. 48, 2012, No. 4: 149–155. RATANASAKCHAICHARN, C., THAPANAPONGWORAKUL P. Efficiency of Antagonistic Rhizobacteria from Neptunia natans and Their Secondary Metabolites Against Soil-borne Plant Pathogenic Fungi. Journal of Agriculture, Faculty of Agriculture, Chiang Mai University, 2019. REIS, V.M., TEIXEIRA, K.R.S. Fixação biológica de nitrogênio – Estado da Arte. Capitulo 06. 2006. Disponível em: < https://www.agencia.cnptia.embrapa.br/recursos/biotacap6ID-cgUrYruYKy.pdf>. Acesso em: 01 de maio de 2018.

http://www.agricultura.gov.br/noticias/participacao-do-agronegocio-nas-exportacoes-brasileiras-cresce-1-5-em-marco

http://www.agricultura.gov.br/noticias/participacao-do-agronegocio-nas-exportacoes-brasileiras-cresce-1-5-em-marco

102

ROMEIRO, R.S. Controle biológico de doenças em plantas. Editora UFV – Universidade Federal de Viçosa, 2007. RUFFINI, Márcia et al . Simbiose de bactérias fixadoras de nitrogênio com feijoeiro-comum em diferentes valores de pH. Pesq. agropec. bras., Brasília , v. 46, n. 1, p. 81-88, Jan. 2011 . Available from <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-204X2011000100011&lng=en&nrm=iso>. access on 06 May 2018. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-204X2011000100011. SANTOS, O.S. A cultura da soja - 1: Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná. 2. ed. Rio de Janeiro: Editora Globo S.A., 1995. 299 p. (grãos ; publicações globo rural Coleção do agricultor) ISBN 85-250-0593-3. SEDIYAMA, T. TECNOLOGIAS de produção e usos da soja. Londrina, PR: Mecenas, 2009. 314 p. ISBN 9788589687089. SEIXAS; MAZARO, S.M., REY, M. In MAZARO, Sérgio Miguel (Org.). Sistema de produção de soja orgânica. Porto Alegre, RS: Cinco Continentes, 2017. 244 p. ISBN 9788586466595. SHARIF,T., KHALIL, S., AHMED, S. Effect of Rhizobium sp., on Growth of Pathogenic Fungi under in vitro Conditions. Pakistan Journal of Biological Sciences, 6: 1597-1599, 2003. SIDDIQUI, I.A., E. HAQUE AND A. GHAFFAR. Effect of rhizobia and fungal antagonists in the control of root infecting fungi on sunflower and chickpea. Pak. J. Bot., 1998. SOARES, A.L.L. et al. Eficiência agronômica de rizóbios selecionados e diversidade de populações nativas nodulíferas em Perdões (MG): II - feijoeiro. Rev. Bras. Ciênc. Solo, Viçosa , v. 30, n. 5, p. 803-811, out. 2006 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-06832006000500006&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 30 abr. 2018. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-06832006000500006. SOLANKI,M.K., SINGH, R.K., SRIVASTAVA,S., KUMAR, S., KASHYAP, P.L., SRIVASTAVA, A.K.,ARORA, D.K.Isolation and characterization of siderophore producing antagonistic rhizobacteria against Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology, June 2014, Vol.54(6), pp.585-597. SOLINO, A.J.S., OLIVEIRA, J.B.S., SCHWAN-ESTRADA, K.R.F., ALENCAR, M.S.R., RIBEIRO, L.M. Potencial antagonista e controle in vitro de Alternaria solani por fungos sapróbios. Summa Phytopathol., Botucatu, v. 43, n. 3, p. 199-204, 2017. SOUZA JUNIOR, Ismail Teodoro de et al . Biocontrole da queima-das-bainhas e do nematoide-das-galhas e promoção de crescimento de plantas de arroz por rizobactérias. Pesq. agropec. bras., Brasília , v. 45, n. 11, p. 1259-

http://link.periodicos.capes.gov.br/sfxlcl41/?frbrVersion=3&ctx_ver=Z39.88-2004&ctx_enc=info:ofi/enc:UTF-8&ctx_tim=2019-11-17T11%3A03%3A38IST&url_ver=Z39.88-2004&url_ctx_fmt=infofi/fmt:kev:mtx:ctx&rfr_id=info:sid/primo.exlibrisgroup.com:primo3-Article-wj&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:&rft.genre=article&rft.atitle=Isolation%20and%20characterization%20of%20siderophore%20producing%20antagonistic%20rhizobacteria%20against%20Rhizoctonia%20solani&rft.jtitle=Journal%20of%20Basic%20Microbiology&rft.btitle=&rft.aulast=Solanki&rft.auinit=&rft.auinit1=&rft.auinitm=&rft.ausuffix=&rft.au=Solanki,%20Manoj%20Kumar&rft.aucorp=&rft.date=2014-06&rft.volume=54&rft.issue=6&rft.part=&rft.quarter=&rft.ssn=&rft.spage=585&rft.epage=597&rft.pages=585-97&rft.artnum=&rft.issn=0233-111X&rft.eissn=1521-4028&rft.isbn=&rft.sici=&rft.coden=&rft_id=info:doi/10.1002/jobm.201200564&rft.object_id=&svc_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:sch_svc&rft.eisbn=&rft_dat=%3Cwj%3E10.1002/jobm.201200564%3C/wj%3E%3Cgrp_id%3E5618901901315394715%3C/grp_id%3E%3Coa%3E%3C/oa%3E%3Curl%3E%3C/url%3E&rft_id=info:oai/&svc.fulltext=yes&req.language=por&rft_pqid=1532949066&rft_id=info:pmid/&rft_galeid=&rft_cupid=&rft_eruid=&rft_nurid=&rft_ingid=




103

1267, nov. 2010 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-204X2010001100005&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 06 maio 2018. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-204X2010001100005 SILVA, E. et al. Coinoculação de Bradyrhizobium japonicum e Azospirillum brasilense em sementes de amendoim de diferentes tamanhos. Revista de Agricultura Neotropical. Cassilândia-MS, v. 4, Suplemento 1, p. 93-102, dez. 2017. SILVA, G.B et al . IDENTIFICAÇÃO E UTILIZAÇÃO DE Trichoderma spp. ARMAZENADOS E NATIVOS NO BIOCONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum. Rev. Caatinga, Mossoró , v. 28, n. 4, p. 33-42, dez. 2015 . Disponível em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1983-21252015000400033&lng=pt&nrm=iso>. acessos em 06 maio 2018. http://dx.doi.org/10.1590/1983-21252015v28n404rc. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3ª ed. Porto Alegre: Artmed. p. 309-332, 2004 TU, J. C. (1978). Protection of soybean from severe Phytophthora root rot by Rhizobium. Physiological Plant Pathology, 12(2), 233–240. doi:10.1016/0048-4059(78)90065-6 VIEIRA JUNIOR, J.B. et al. Rizobactérias como agentes de controle biológico e promotores de crescimento de plantas. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Rondônia, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Novembro de 2013, ISSN 0103-9865. VISMARA, L.S. Óleos essenciais na indução de resistência em morangos ao mofo cinzento, à Botrytis cinerea in vitro e ação toxicológica. Tese (Doutorado) - Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Pato Branco, PR, 2019. ZITO, Roberto Kazuhiko, et al. In PAULA Jr., Trazilbo José; VENZON, Madelaine. 101 CULTURAS: manual de tecnologias agrícolas. Belo Horizonte, MG: EPAMIG, c2007. 800 p. ISBN 9788599764046. WANG D, YUAN J, GU S, SHI Q. Influence of fungal elicitors on biosynthesis of natamycin by Streptomyces natalensis HW-2. Applied Microbiology and Biotechnology. 2013;97(12):5527-5534

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-204X2010001100005

universidade tecnolÓgica federal do...

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