UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

ROK HROVAT

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

Ljubljana, 2015

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

ROK HROVAT

ANALIZA HLAPNIH SPOJIN DESTILATOV JANTARJA IN IZ

NJIH PRIDOBLJENEGA UMETNEGA MOŠUSA

ANALYSIS OF VOLATILE COMPOUNDS DISTILLED FROM

AMBER AND FROM THEM DERIVED ARTIFICIAL MUSK

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA

Ljubljana, 2015

Magistrsko nalogo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo na Katedri za farmacevtsko

biologijo pod mentorstvom doc. dr. Damjana Janeša, mag. farm.

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Damjanu Janešu, mag. farm. za vso pomoč in strokovne

nasvete pri izdelavi magistrske naloge.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelal pod vodstvom mentorja doc. dr.

Damjana Janeša, mag. farm.

Rok Hrovat

Predsednik komisije: izr. prof. dr. Iztok Grabnar, mag. farm.

Član komisije: asist. dr. Rok Frlan, mag. farm.

i

KAZALO VSEBINE

KAZALO VSEBINE ............................................................................................................ i

KAZALO SLIK .................................................................................................................. iii

KAZALO TABEL .............................................................................................................. iv

POVZETEK ......................................................................................................................... v

ABSTRACT ....................................................................................................................... vii

SEZNAM OKRAJŠAV ...................................................................................................... ix

1 UVOD ............................................................................................................................. 1

1.1 Jantar ....................................................................................................................... 1

1.2 Jantarno olje ............................................................................................................ 3

1.3 Mošus ....................................................................................................................... 3

1.3.1 Makrociklični mošusi ........................................................................................ 4

1.3.2 Nitro mošusi ...................................................................................................... 5

1.3.3 Policiklični mošusi ............................................................................................ 5

1.3.4 Linearni mošusi ................................................................................................. 6

1.3.5 Dienonski mošusi .............................................................................................. 6

1.4 Kronološki pregled pridobivanja, uporabe in analitike jantarnega olja in iz njega

pridobljenega umetnega mošusa ...................................................................................... 6

1.5 Nitriranje ................................................................................................................ 11

1.5.1 Zgodovina nitriranja ........................................................................................ 11

1.6 Destilacija ............................................................................................................... 11

1.6.1 Suha destilacija ................................................................................................ 12

1.6.2 Destilacija z vodno paro .................................................................................. 12

1.7 Plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo ................................. 12

1.7.1 Plinska kromatografija ..................................................................................... 13

1.7.2 Masna spektrometrija ...................................................................................... 14

2 NAMEN DELA ............................................................................................................ 16

3 MATERIALI IN METODE ....................................................................................... 17

3.1 Materiali ................................................................................................................. 17

3.1.1 Jantar in jantarno olje ...................................................................................... 17

3.1.2 Kemikalije ....................................................................................................... 17

3.1.3 Aparature in laboratorijska oprema ................................................................. 17

3.2 Metode .................................................................................................................... 18

3.2.1 Suha destilacija jantarja ................................................................................... 18

ii

3.2.2 Čiščenje surovega jantarnega olja ................................................................... 18

3.2.3 Priprava umetnega mošusa .............................................................................. 18

3.2.4 Plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo ............................. 18

4 EKSPERIMENTALNI DEL ...................................................................................... 21

4.1 Suha destilacija jantarja ........................................................................................ 21

4.2 Prva kvalitativna GC-MS analiza pridobljenega jantarnega olja na nepolarni

koloni ............................................................................................................................... 23

4.3 Čiščenje jantarnega olja z destilacijo z vodno paro .............................................. 23

4.4 Priprava umetnega mošusa ................................................................................... 24

4.5 GC-MS analiza produktov ..................................................................................... 24

4.5.1 Kvalitativna analiza na nepolarni koloni ......................................................... 24

4.5.2 Kvalitativna analiza na polarni koloni ............................................................. 25

4.5.3 Kvantitativna analiza na nepolarni koloni ....................................................... 26

4.5.4 Priprava umeritvenih premic za kvantitativno analizo .................................... 26

4.5.4.1 Umetni mošus in jantarno olje na nepolarni koloni ................................. 26

4.5.4.2 Vodne faze na polarni koloni .................................................................... 28

5 REZULTATI IN RAZPRAVA ................................................................................... 30

5.1 Suha destilacija jantarja ........................................................................................ 30

5.2 Prva kvalitativna GC-MS analiza pridobljenega jantarnega olja na nepolarni

koloni ............................................................................................................................... 32

5.3 Čiščenje jantarnega olja z destilacijo z vodno paro .............................................. 33

5.4 Priprava umetnega mošusa ................................................................................... 34

5.5 Kvalitativna GC-MS analiza produktov ................................................................ 36

5.5.1 Kvalitativna analiza na nepolarni koloni ......................................................... 36

5.5.1.1 Odstranjevanje vode iz umetnega mošusa ................................................ 37

5.5.2 Kvalitativna analiza na polarni koloni ............................................................. 39

5.5.3 Primerjava rezultatov kvalitativnih analiz na nepolarni in polarni koloni ...... 39

5.5.4 Analiza sublimata ............................................................................................ 40

5.6 Kvantitativna GC-MS analiza produktov .............................................................. 42

5.6.1 Jantarno olje ..................................................................................................... 43

5.6.2 Umetni mošus .................................................................................................. 45

5.6.3 Vodne faze ....................................................................................................... 49

6 SKLEP .......................................................................................................................... 51

7 LITERATURA ............................................................................................................ 53

8 PRILOGE ..................................................................................................................... 56

iii

KAZALO SLIK

Slika 1: Surov, neobdelan jantar. .......................................................................................... 1

Slika 2: Pižmar (Moschus moschiferus) in mošusna žleza (12). ........................................... 4

Slika 3: (R)-Muskon. ............................................................................................................. 4

Slika 4: Nitro mošusi. ............................................................................................................ 5

Slika 5: Policiklični mošusi. .................................................................................................. 5

Slika 6: Cyclomusk. ............................................................................................................... 6

Slika 7: Spojina vodnica za dienonske mošuse. .................................................................... 6

Slika 8: Izsek iz Naturgeschichte des Succins z navedenimi deleži produktov suhe

destilacije jantarja (24). ........................................................................................................ 9

Slika 9: Shema plinskega kromatografa (35). ..................................................................... 13

Slika 10: Shema masnega spektrometra (36). ..................................................................... 15

Slika 11: Aparatura za suho destilacijo jantarja ................................................................ 21

Slika 12: Bučka z jantarjem pred (levo) in po destilaciji (desno). ...................................... 22

Slika 13: Ostanek v bučki po čiščenju pridobljenega surovega jantarnega olja z vodno

paro. ..................................................................................................................................... 23

Slika 14: Produkti suhih destilacij jantarja (levo) in kupljeno jantarno olje (desno). ....... 30

Slika 15: Prečiščeno pridobljeno jantarno olje. ................................................................. 33

Slika 16: Umetni mošus. ...................................................................................................... 35

iv

KAZALO TABEL

Tabela I: Zatehte umetnega mošusa za kvalitativno analizo na nepolarni koloni. ............. 25

Tabela II: Zatehte jantarnega olja za kvantitativno analizo na nepolarni koloni. ............. 26

Tabela III: Zatehte umetnega mošusa za kvantitativno analizo na nepolarni koloni. ....... 26

Tabela IV: Referenčne spojine za umeritveno premico za jantarno olje. ........................... 27

Tabela V: Referenčne spojine za umeritveno premico za umetni mošus. ........................... 28

Tabela VI: Hidrofilne referenčne spojine za umeritveno premico za vodne frakcije. ........ 29

Tabela VII: Lipofilne referenčne spojine za umeritveno premico za vodne frakcije. ......... 29

Tabela VIII: Število prepoznanih spojin v vzorcih. ............................................................ 40

Tabela IX: Rezultati kvantitativne analize vzorcev jantarnega olja, spojine v visokih

koncentracijah so v krepkem tisku. ...................................................................................... 43

Tabela X: Rezultati kvantitativne analize vzorcev umetnega mošusa, spojine v visokih

koncentracijah so v krepkem tisku. ...................................................................................... 45

Tabela XI: Rezultati kvantitativne analize vzorcev vodnih frakcij suhe destilacije in vode,

ki je ostala po čiščenju jantarnega olja, spojine v visokih koncentracijah so v krepkem

tisku. ..................................................................................................................................... 49

v

POVZETEK

Jantarno olje in iz njega pridobljeni umetni mošus sta bila nekoč del seznama zdravilnih

snovi (materia medica), a sta pred približno 100 leti popolnoma izginila iz vseh

farmakopej.

Po pregledu literature, ki je obsegala obdobje od 16. do začetka 20. stol., smo naredili

povzetek vseh postopkov izolacije jantarnega olja, njegovega čiščenja in pridobivanja

umetnega mošusa. Postopke smo zaradi obsoletnosti nekatere opreme opisane v literaturi,

zlasti pa varnostnih razlogov priredili za delo v laboratoriju. Člankov, v katerih bi raziskali

sestavo olja in mošusa, nismo našli, zato nam je za primerjalni vzorec služilo le po enakih

postopkih obdelano in analizirano industrijsko pridobljeno jantarno olje.

Povprečni izplen suhe destilacije jantarja (5,48 %) je bil v primerjavi z literaturnimi

podatki (25-52 %, povzeto po različnih avtorjih) zelo nizek. Vzrok za to je bila

spremenjena aparatura, v kateri težje hlapne komponente olja niso destilirale. Olje smo

tudi organoleptično ovrednotili. Neprijeten, oster vonj po zažgani organski snovi je

ustrezal opisom, barva pa ne. Olje je bilo oranžnorjavo ter lahko tekoče in ne temno rjavo s

sirupasto konsistenco, kot navaja literatura. Izpleni čiščenja z vodno paro (71,3 % za

pridobljeno in 44,8 % za kupljeno olje) so se bolj približali literaturnim vrednostim (65-70

%), saj sprememba aparature na proces čiščenja praktično ni vplivala. Prečiščeno olje je

bilo svetlorumeno, vonj pa je v primerjavi s surovim oljem ostal skoraj nespremenjen, kar

je ustrezalo starim opisom. Umetni mošus smo pripravili iz olja z dodajanjem kadeče

dušikove kisline, saj z uporabo 65-odstotne dušikove kisline nismo bili uspešni.

Za analizo vzorcev smo izbrali plinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo.

Analizirali smo jantarno olje, umetni mošus, sublimat, ki je nastajal med destilacijo, vodno

frakcijo suhe destilacije in vodo, ki je ostala po čiščenju olja. Sestava olja in umetnega

mošusa je zelo kompleksna, saj vsebujeta več kot 250 oziroma 400 različnih spojin. V olju

smo našli zlasti s kratkimi alkilnimi verigami substituirane aromate in terpene ter

terpenoide. V mošusu je bilo veliko enakih spojin kot v olju, precejšnji delež aromatskih

spojin se je pod vplivom dušikove kisline nitriral, terpenoidi pa so se oksidirali. Večkrat

substituiranih nitroaromatov nismo odkrili. V vodni frakciji so bile velike koncentracije

alifatskih karboksilnih kislin, ketonov in alkoholov ter z alkilnimi verigami substituiranih

fenolov. Prisotne so bile tudi nekatere spojine, ki smo jih odkrili že v olju in artefakti

jantarne kisline. V vodi, ki je ostala po čiščenju olja, so bile, z izjemo artefaktov jantarne

vi

kisline, večinoma prisotne enake spojine kot v vodni frakciji, a v manjših količinah. Pri

analizi sublimata smo odkrili, da je le-ta anhidrid jantarne kisline. S tem smo ovrgli

zmotno prepričanje, da je sublimat sestavljen iz jantarne kisline.

Ključne besede: jantar, jantarno olje, suha destilacija, dušikova kislina, umetni mošus

vii

ABSTRACT

Amber oil and from it derived artificial musk, have once been an important part of

»materia medica«, but completely disappeared from all Pharmacopoeias about 100 years

ago. After reviewing the literature, covering the period from 16th to the beginnings of 20th

century, a summary of procedures was made describing the isolation of amber oil, its

purification and preparation of artificial musk. Due to obsoleteness of equipment and from

the standpoint of safe laboratory work, some modifications to the procedures were

introduced. No articles on the topic of chemical composition of amber oil and artificial

musk were found; therefore, the only reference was an industrially produced amber oil.

Average yield of dry distillation of amber (5,48 %) was very low compared to the literature

data (25-52 %, summarized from different authors). The cause of that was the modified

apparatus, in which hardly volatile oil components did not distil. The oil was also

organoleptically evaluated. Unpleasant, pungent odour of burnt organic substance fitted the

descriptions, however, the colour did not. The oil was orange brown and easily fluent, as

opposed to literature that described a dark brown oil of a syrupy consistency. Yields of

purification of the oil with water vapour (71,3 % for distilled and 44,8 % for bought oil)

came close to the literature values (65-70 %), as the modified apparatus had practically no

effect on the process. The purified oil was light yellow with no change in odour compared

to the raw oil. That fitted the descriptions. For the preparation of artificial musk, fuming

nitric acid was used because 65-% nitric acid was not strong enough.

Gas chromatography coupled with mass spectrometry was the method of choice for sample

analysis. Samples of amber oil, artificial musk, sublimate, formed during distillation,

watery fraction of dry distillation and of water, left over after purification of oil, were

analysed. The composition of oil and artificial musk proved to be extremely complex, with

over 250 and 400 different compounds, respectively. In oil, terpenes, terpenoids and arenes

substituted with short alkyl chains were found. There were many identical compounds

found both, in oil and in artificial musk. In musk, substantial amounts of aromatic

compounds were nitrated and terpenoids oxidised under the influence of nitric acid.

Arenes, substituted with multiple nitro groups were not found. In watery fraction high

concentrations of aliphatic carboxylic acids, ketones and alcohols along with phenols,

substituted with alkyl chains were discovered, some already found in the oil, and also a

few artefacts of succinic acid. In water, left over after purification, mostly the same

viii

compounds as in water fraction were found in smaller quantities. Analysis of the

sublimate, proved that it consisted of succinic anhydride. With this discovery, the

misconception that the sublimate is pure succinic acid was disproved.

Keywords: amber, amber oil, dry distillation, nitric acid, artificial musk

ix

SEZNAM OKRAJŠAV

CITES ang.: Convention on International Trade in Endangered Species of Wild

Fauna and Flora

GC plinska kromatografija

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

m/z razmerje med maso in nabojem

MF mobilna faza

MS masna spektrometrija

ppb število delcev na milijardo

ppm število delcev na milijon

RI retencijski indeks

rpm obrati na minuto

SF stacionarna faza

tR retencijski čas

1

1 UVOD

1.1 Jantar

Jantar je fosilizirana drevesna smola. Nastal je s strjevanjem smolnatih izločkov (1, 2) v

drevesu samem, ali po iztekanju iz drevesa, določenih izumrlih vrst iglavcev iz reda

Pinales, redkeje pa tudi drugih redov (1, 2, 3). Drevesa, ki so izločala smolo iz katere je

nastal jantar, so bila najpogosteje golosemenke iz družin aravkarijevk (Araucariaceae),

cipresovk (Cupressaceae), borovk (Pinaceae), podokarpovk (Podocarpaceae), družine

Sciadopityaceae in tisovk (Taxaceae). Redkeje najdemo tudi jantar kritosemenk iz družin

metuljnic (Fabaceae), nepozebnikovk (Hamamelidaceae), mimozovk (Mimosaceae) in

cesalpinovk (Caesalpiniaceae), čeprav mnogi avtorji menijo, da zaradi mnogo nižje starosti

smole pri tem še ne gre za pravi jantar, ampak za delno fosilizirano smolo, ki jo

imenujemo kopal (2, 3).

Slika 1: Surov, neobdelan jantar.

Drevesne smole so kompleksna zmes zlasti raznih diterpenov in diterpenoidov, v jantarju

so to najpogosteje derivati labdana (1, 2). Hlapne in nestabilne komponente kmalu po

izločanju oleorezina iz drevesa izhlapijo ali razpadejo, nehlapne spojine, ki so zmožne

kljubovati vplivom iz okolja, pa sčasoma prekrijejo razni sedimenti (2). Nato se sprožijo

razni procesi kot so polimerizacija, izomerizacija, ciklizacija, oksidacija in mnogi drugi, ki

smolo sčasoma spremenijo v jantar (1, 4).

2

Jantar najdemo v geoloških skladih, katerih izvor sega od obdobja devona (približno pred

400 milijoni let) pa do kvartarja (približno pred 2,5 milijonoma let do danes) (3), vendar

gre pri primerkih mlajših od okoli 30 milijonov let za kopal in ne za pravi jantar (2).

Večina pravega jantarja izvira iz obdobja krede (pred 145 do 65 milijoni let) (2). Največje

svetovne zaloge so na dnu Baltskega morja in ob njegovih južnih obalah. Pomembnejša

nahajališča so še ob obalah Sicilije in Anglije, v Libanonu, Jordaniji, Mjanmaru,

Dominikanski republiki, Mehiki, Sibiriji, na Kitajskem, Grenlandiji in v nekaterih zveznih

državah Združenih držav Amerike (2, 3).

Jantar se že od časa neolitika uporablja kot dekorativni element v nakitu, umetnosti,

pohištvu in celo gradnji, cenjen pa je tudi kot sestavina raznih dišav in kadil. Pogosto so ga

uporabljali tudi v različnih verskih obredih in tradicionalni medicini (2). Starogrško ime za

jantar je ἤλεκτρον (izg.: élektron), starejše latinsko pa electrum. Ime najverjetneje izhaja iz

dejstva, da se jantar pri drgnenju s kosom tkanine naelektri in privlači lahke delce, kot so

koščki papirja, listje in prah. Iz omenjene lastnosti in imena electrum tudi dobimo današnje

ime za elektriko (5). Ime elektron pa bi lahko izviralo tudi iz starogrške besede ἠλέκτωρ

(izg.: élektor), ki pomeni žareče sonce in se najverjetneje nanaša na barvo jantarja (5, 6).

Latinsko poimenovanje za jantar je succinum, ki pa se ponavadi uporablja le za baltski

jantar (2). To ime nas napelje na nekdanje zmotno prepričanje o izvoru jantarja, saj izhaja

iz latinske besede za sok – succus. Angleško ime amber izvira iz arabske besede anbar ali

iz srednjeveške francoske besede ambre, ki sta se uporabljali za poimenovanje ambre,

izločka kita glavača (Physeter macrocephalus), ki se je nekoč uporabljal v proizvodnji

dišav. Ambro so natančneje imenovali ambre gris, kar v prevodu pomeni sivi jantar, jantar

pa ambre jaune, oziroma rumeni jantar. Ime amber je bilo prevzeto v začetku 15. stol., ko

je bilo na obalah Baltskega morja moč hkrati najti naplavljeni jantar in ambro. Pogosto je

prihajalo do medsebojne zamenjave snovi, a sčasoma se je uporaba ambre zmanjšala in za

jantar se je obdržalo le ime ambre (2, 7). Nemško poimenovanje der Bernstein je iz 13.

stol. in izhaja iz dejstva, da se jantar ob segrevanju sčasoma vname (nemško börnen,

brennen: goreti) (2, 6).

Jantar je lahka, trdna, krhka amorfna snov, brez vonja in okusa. Sestava, barva in druge

fizikalne lastnosti so odvisne od starosti jantarja, vrste drevesa iz katerega je nastal in od

pogojev pri katerih je bila smola zakopana in podvržena fosilizaciji (4). Lahko je bister ali

popolnoma neprosojen, barve pa se spreminjajo od skoraj brezbarvne in mlečno bele, do

3

najbolj pogostih rumene, rjave in oranžnordeče. Redkejše so zelena, modra in črna barva

(8). Je slab toplotni prevodnik, zato je na otip topel, ob drgnenju s kosom tkanine ali volne

pa dobi negativen naboj (9). Včasih v jantarju najdemo razne vključke, kot so različni deli

rastlin ali živali, najpogosteje žuželk, pa tudi bakterije in glive, mehurčke zraka in prašne

delce (3). Specifična gostota baltskega jantarja je 1,04-1,10, trdota po Mohsovi lestvici pa

2-3 (9). Temperatura tališča sega od 200 °C do 380 °C (9). V vodi jantar ni topen, delno se

topi v alkoholu, etru in oljih. Prav tako ni topen v razredčenih kislinah, topi pa se v

žveplovi(VI) kislini (H2SO4), dušikovi(V) kislini (HNO3) in v vreli vodni raztopini močnih

baz (8).

1.2 Jantarno olje

Jantarno olje nastane ob suhi destilaciji jantarja in je tako imenovano empirevmatično in ne

eterično olje (8). To pomeni, da nastaja kot posledica razpada organske snovi pri močno

povišani temperaturi in da pred segrevanjem v snovi ni bilo prisotno. Je rjavorumene barve

in ostrega, neprijetnega vonja po zažgani organski snovi in petroleju. Olje lahko prečistimo

z destilacijo z vodno paro, kar nam da olje svetlejše barve z manj ostrim vonjem (8).

Specifična gostota surovega olja je 0,975, prečiščenega pa 0,915 (8). Prečiščeno olje je

topno v absolutnem etanolu, etru, kloroformu in oljih, v vodi se ne topi (8). Z dušikovo

kislino tvori smolnat oranžen produkt s prijetnim vonjem, ki ga imenujemo umetni mošus

(8).

1.3 Mošus

Začetki parfumerstva segajo v antične čase. Nekoč je veljalo, da nobena dobra dišava ni

nastala brez uporabe mošusa. Na začetku so izdelovalci parfumov uporabljali naravni

mošus, katerega glavni vir so bili samci vrste jelenov pižmarjev iz družine pižmarjev

(Moschidae), ki živijo v gozdnatih in goratih predelih Azije. Snov nastaja v posebnih

mošusnih žlezah, ki so v predelu trebuha blizu genitalij (10). Naravni mošus je bil izjemno

cenjen v perfumerstvu in tradicionalni kitajski medicini, kjer ga uporabljajo še danes.

Temu primerne so bile tudi cene, saj je bil po masi dražji od zlata. Mošusni jeleni so zaradi

prekomernega lova od leta 1979 (11) zaščiteni po CITES-u (Konvencija o mednarodni

trgovini z ogroženimi prosto živečimi živalskimi in rastlinskimi vrstami).

4

Slika 2: Pižmar (Moschus moschiferus) in mošusna žleza (12).

Mošusu podoben vonj imajo tudi izločki žlez mačk iz družine cibetovk (Viverridae),

glodavcev pižmovk (Ondatra zibethicus), moškatnega goveda (Ovibos moschatus),

moškatne race (Biziura lobata), moškatne želve (Sternotherus odoratus), moškatnega

hrošča (Aromia moschata) in aligatorja (Alligator mississippiensis). Danes od izločkov

živalskega izvora uporabljamo le izloček mačk cibetovk – cibet, pridobivanje drugih pa

zlasti iz etičnih vzrokov ni smotrno. Tudi rastline proizvajajo snovi z vonjem po mošusu,

ki danes v glavnem nadomeščajo snovi živalskega izvora. Te rastline so zdravilni gozdni

koren (Angelica archangelica), muškatni krinkar (Mimulus moschatus), mošusni les

(Olearia argophylla) in muškatni oslez (Abelmoschus moschatus) (10).

1.3.1 Makrociklični mošusi

Glavna spojina, ki mošusu daje vonj je makrociklični keton (R)-muskon, ki ga je leta 1906

izoliral Heinrich Walbaum, strukturo pa je leta 1926 ugotovil Leopold Ružička (10). S tem

se je začela sinteza naravnih makrocikličnih mošusov, med katerimi so najpomembnejši

muskon (njegov racemat), ciklopentadekanon (eksalton) in ω-ciklopentadekanolid

(eksaltolid) (10). Od sodobnih sinteznih makrocikličnih mošusov, ki jih v naravi ne

najdemo, pa sta najpomembnejša muscenon in nirvanolid.

Slika 3: (R)-Muskon.

5

1.3.2 Nitro mošusi

Že leta 1888 je Albert Baur (10, 13) odkril skupino visoko substituiranih nitro aromatov z

značilnim vonjem po mošusu. Prvi od teh tako imenovanih nitro mošusov je bil trinitro-m-

terc-butiltoluen, ki je zaradi razširjenosti in nizke cene postal znan kar kot »mošus Baur«

(Musk Baur). Kmalu za tem so odkrili še mošus ksilen, mošus keton, mošus ambret in

mosken. Te spojine so zaradi nizke cene in lažje sinteze v primerjavi z makrocikli postale

bistvenega pomena za industrijo dišav. Tako je ostalo vse do začetka osemdesetih let 20.

stol., ko so odkrili fototoksičnost in nevrotoksičnost teh spojin (10).

Slika 4: Nitro mošusi.

1.3.3 Policiklični mošusi

Odkritje toksičnosti nitro mošusov je vodilo do odkritja naslednje generacije mošusnih

spojin – policikličnih aromatskih mošusov. Najbolj znani predstavniki te skupine so

tonalid (fiksolid), versalid, vulkanolid, galaksolid, celestolid in fantolid. Slednjega je leta

1951 kot prvega iz te skupine spojin odkril Kurt Fuchs (10). Poznamo pa tudi ne-

aromatske policiklične mošuse, kot so kašmeran, moksalon in nebulon (10).

Slika 5: Policiklični mošusi.

6

1.3.4 Linearni mošusi

Leta 1975 sta Karl von Fraunberg in Werner Hoffmann odkrila Cyclomusk, prvo od spojin

naslednje skupine mošusnih spojin – alifatskih in alicikličnih mošusov, imenovanih tudi

linearni mošusi. Sem spadajo še Rosamusk, helvetolid, romandolid in mnogi drugi (10).

Slika 6: Cyclomusk.

1.3.5 Dienonski mošusi

Zadnjo skupino predstavljajo dienonski mošusi, ki jih dobimo iz spojine vodnice, katero so

leta 2002 odkrili Jozef Kula in sodelavci. Različne spojine z vonjem po mošusu so dobili z

odpiranjem enega ali obeh obročev vodnice (10).

Slika 7: Spojina vodnica za dienonske mošuse.

1.4 Kronološki pregled pridobivanja, uporabe in analitike jantarnega olja in iz

njega pridobljenega umetnega mošusa

Georgius Agricola v svojem delu De Natura Fossilium iz leta 1546 že omenja pridobivanje

olja iz jantarja, a še ne govori o njegovi uporabi, niti ne opiše postopka pridobivanja. Bolj

se posveti samemu jantarju, njegovi uporabi, sploh pa izvoru le-tega (14). Pet let kasneje v

7

Succini Historia avtor omenja postopek pridobivanja olja z destilacijo uprašenega jantarja,

a ga podrobneje ne opiše. Uporabo prečiščenega olja pridobljenega s ponovno destilacijo

surovega olja pa svetuje pri paralizi in krčih (15).

V londonski farmakopeji iz leta 1720 je omenjen postopek pridobivanja olja iz

zdrobljenega jantarja z dodatkom kremena ali zdrobljene keramike v retorti, ki jo segrevajo

na peščeni kopeli. Prvič se omenja tudi postopek čiščenja olja z destilacijo z vodno paro.

Prečiščeno olje se uporablja pri živčnih boleznih, omedlevici, konvulzijah, boleznih ledvic

in mehurja pa tudi kot krepčilo za telo in čute (16).

Najstarejši bolj podrobno opisan postopek destilacije jantarja smo našli v The New

Dispensatory avtorja Williama Lewisa iz leta 1753. Uprašen jantar v stekleni retorti zmeša

s trikratno količino peska in segreva na peščeni kopeli s postopnim povečevanjem ognja.

Pesek uporabi, da zmanjša nabrekanje in s tem upočasnjeno destilacijo jantarja ob

morebitnem prehitrem segrevanju. Retorta je z zmesjo jantarja in peska lahko napolnjena

največ do polovice. Najprej dobi vodeno tekočino z malo rumenega olja, postopoma

rumeno olje prevlada, nato se na stenah in vratu retorte začne nabirati sol, na koncu pa

poleg soli dobi rdečečrno olje. Dobljena sol naj bi bila jantarna sol oziroma kislina, ki jo

pred uporabo prečisti s sublimacijo ali rekristalizacijo iz vode. Olje loči od vode in ga

prečisti z destilacijo iz slanice (17). Isti avtor leta 1786 v The Edinburgh New

Dispensatory opusti redestilacijo iz slanice in prvi bolj podrobno opiše postopek čiščenja

surovega olja z destilacijo z vodno paro. Olju doda šestkratno količino vode ter destilira v

stekleni retorti, dokler dve tretjini vode ne predestilirata v zbiralnik. Prečiščeno olje nato

loči od vode (18). Kot prvi že v svojem prvem delu iz leta 1753 navede peroralni odmerek

prečiščenega olja, ki znaša 10 ali 12 kapljic. Olje se uporablja kot stimulans, za povečanje

sekrecije telesnih izločkov, kot emenagog in pri histeričnih napadih. Prvič omeni tudi

zunanjo uporabo olja pri šibkih, paralitičnih udih in revmatičnih bolečinah (17).

Prvi opis postopka pridobivanja umetnega mošusa iz jantarnega olja sega v leto 1761 in je

delo nemškega kemika Andreasa S. Marggrafa. Za pripravo uporabi eno enoto z vodno

paro prečiščenega jantarnega olja, ki mu počasi dodaja pol enote koncentrirane dušikove

kisline. Posodo po dodatku kisline stresa, dokler se le-ta močno ne segreje in se iz nje ne

prične kaditi. Zmes pusti stati 24 ur, da nastane smolnata masa rumene barve, ki plava na

kisli tekočini. Maso najprej spere s toplo vodo in s šibko raztopino kalijevega karbonata,

nato pa še z mrzlo vodo, da odstrani vso odvečno kislino. Dobi rumeno smolo z močnim

8

vonjem po mošusu, neprijeten vonj jantarnega olja pa popolnoma izgine. Zapisov o

uporabi tako mošusa, kot tudi olja ni (19).

Podrobno postopek pridobivanja olja opiše tudi Johann F. Westrumb leta 1797. Postopek

se od prej opisanega Lewisovega postopka iz leta 1753 le malo razlikuje. Retorto napolni

do dveh tretjin samo z zdrobljenim jantarjem in vzdržuje zelo močan plamen tekom

celotnega procesa. Postopek prekine, ko namesto rumenega olja začne teči gosto rjavo olje.

Dobljeno olje spere s toplo vodo in olje prečisti s ponovno destilacijo brez vode, a z

dodatkom uprašenega oglja. Tudi Westrumb opiše sol, ki med destilacijo sublimira in se

nabira po vratu retorte. Šlo naj bi za jantarno kislino, ki se jo pred uporabo prečisti z

rekristalizacijo iz vode. Nato opiše postopek priprave umetnega mošusa iz hamburške

farmakopeje (Pharmacopoea pauperum, medicorum Hamburgensium), vendar ne navede

točno katere. Trije najbolj znani izvodi te farmakopeje so sicer nastali med leti 1781 in

1804. Enemu delu olja (ne definira ali je surovo ali prečiščeno) postopoma dodaja dva do

tri dele kadeče dušikove kisline (Marggraf uporabi koncentrirano kislino in zmes pusti stati

24 ur, ker reakcija verjetno drugače ne poteče do konca), medtem pa iz posode začnejo

izhajati rjave pare dušikovega oksida. Dobi rumeno smolo, ki jo spere z vodo in posuši. V

knjigi ni zapisov o uporabi mošusa (20).

Justus Arnemann v svoji knjigi Praktische Arzneymittelehre iz leta 1799 v poglavju

Moschus zgolj omeni »Moschus artificialis« – umetni mošus. V njem opiše Marggrafovo

delo ter njegovo sintezo mošusa in delo Friedricha C. Stöllerja, ki je prav tako že leta 1777

pripravil in v svojem delu Beobachtungen und Erfahrungen aus der innern und äußern

Heilkunst opisal umetni mošus. Stöller umetnega mošusa ni namesto pravega uporabljal v

medicinske namene, saj bi bili po njegovem mnenju za to potrebni nadaljnji poizkusi. Sicer

pa se Arnemann posveti tudi medicinski uporabi mošusa, a le pravega, ne pa tudi umetnega

(21).

Prve podatke o uporabi umetnega mošusa v medicinske namene najdemo v The Medical

and Physical Journal iz leta 1799. V knjigi je opisana uspešna uporaba umetnega mošusa

Christopha W. Hufelanda pri zdravljenju oslovskega kašlja. Uporablja ga v obliki

emulzije, ki jo pripravi v terilnici s trituracijo 10 do 12 granov (1 gr = 64,8 mg) umetnega

mošusa z nekaj mandlji, nato pa razredči s 5 do 6 tekočinskimi unčami vode (1 fl oz =

29,6 mL). Pri oslovskem kašlju je odmerek za eno do dve leti starega otroka dve čajni

žlički na vsaki dve uri, za starejše otroke pa je odmerek primerno povečan. Umetni mošus

9

naj bi bil učinkovito zdravilo tudi pri raznih živčnih obolenjih. V knjigi sicer najdemo

sledeč postopek priprave mošusa: v en del prečiščenega jantarnega olja nakapajo tri dele in

pol koncentrirane dušikove kisline zmes pa nato pustijo stati 24 ur. Smolnato snov, ki jo

dobijo spirajo najprej s hladno, nato še s toplo vodo, dokler okus po kislini ne izgine.

Dobljeni umetni mošus naj bi imel enak okus in zdravilne lastnosti kot pravi mošus (22).

Naravni mošus so sicer uporabljali za zdravljenje konvulzij, vročic, tetanusa, manije, krčev

in revmatičnih obolenj (21). Uspešnost uporabe umetnega mošusa za zdravljenje

oslovskega kašlja potrdi tudi Stephen W. Williams v svojem članku v The Boston Medical

and Surgical Journal iz leta 1835. Za pripravo uporablja enak postopek kot Hufeland, le da

zmes med dodajanjem kisline segreva, saj kislina, ki je bila takrat na voljo, pogosto ni bila

dovolj koncentrirana za potek celotne reakcije. Najboljše olje za pripravo je po avtorjevem

mnenju slamnate barve in je produkt druge ali tretje redestilacije surovega olja. Williams

za zdravljenje ne uporablja emulzije, temveč tinkturo, ki jo pripravi iz dveh drahem (1 dr =

3,89 g) mošusa in 8 tekočinskih unč alkohola. Povprečni odmerek tinkture je 25 kapljic.

Poleg oslovskega kašlja tinkturo uporablja tudi pri živčnih obolenjih, histeričnih napadih,

konvulzijah, omedlevici, palpitacijah, mrzlicah, tifusu in raznih vnetnih stanjih. Williams

pravi, da umetni mošus, odkar se je pojavil v farmakopejah, uporablja pogosteje in

uspešneje, kot katero koli drugo znano zdravilo. V članku opiše tudi uspešno uporabo

tinkture O. W. Bartleyja pri oslovskem kašlju in celo pri sladkorni bolezni (23).

Leta 1813 je Johann F. John kot prvi podrobneje opisal vse produkte suhe destilacije

jantarja. Pare, ki nastajajo med destilacijo so sestavljene iz različnih ogljikovodikov,

ogljikovega monoksida in ogljikove kisline. Vodena tekočina, ki destilira najprej, poleg

vode vsebuje jantarno in ocetno kislino ter amoniak. John nato tudi poda deleže

posameznih dobljenih produktov destilacije, ki pa niso popolnoma razumljivi. Spodaj je

priložen izsek originalnega teksta (Slika 8). Iz 100 delov jantarja najvišje kakovosti naj bi

pridobil 0,75 olja, 0,4 kristalinične kisline, 0,7 likvorja in 0,7-0,8 ogljenega ostanka.

Slika 8: Izsek iz Naturgeschichte des Succins z navedenimi deleži produktov suhe

destilacije jantarja (24).

10

Pri peroralni uporabi olja na novo omeni zdravljenje astme in odpravljanje trakulje,

zunanje pa za razne tumorne tvorbe in nakapano na kos vate za boleča ušesa. Pridobivanje

umetnega mošusa na kratko opiše, ne govori pa o uporabi (24).

Jöns Jakob Berzelius je v Lehrbuch der Chemie iz leta 1828 navedel elementno sestavo

surovega jantarnega olja, kar je sicer rezultat dela Augusta Drapieza. Drapiez je iz olja

naredil alkoholni izvleček, ki ga je nato analiziral. Izvleček je vseboval 75,53 % ogljika

(C), 14,04 % vodika (H) in 10,63 % kisika (O). V alkoholu netopen, rumenorjav, mehak,

smolnat del je sestavljen iz 81,08 % C, 12,87 % H in 6,05 % O. Ta ostanek je nato raztopil

še v etru in ugotovil, da vsebuje 78,80 % C, 12,82 % H in 8,58 % O. V etru netopen

ostanek je rumena, svetleča, kristalinična snov in vsebuje 79,87 % C, 14,92 % in 5,21 % O.

Po Drapiezu je delež olja v jantarju 0,512. Od tega je 0,165 lahko hlapnega, 0,347 pa težko

hlapnega olja, v slednjem pa je že prej omenjen v etru netopen ostanek, katerega delež

predstavlja 0,075 teže jantarja. Ogljen zaostanek, ki po končani destilaciji ostane v retorti

predstavlja 0,395 teže jantarja (25).

Elsner se je v svojem članku objavljenem leta 1842 v Journal für praktische Chemie še bolj

natančno posvetil analizi kemijske sestave jantarnega olja, kot prvi pa je tudi analiziral

sestavo umetnega mošusa. Olje je sestavljeno iz 84,00 % C, 8,60 % H in 7,40 % O.

Sestavo umetnega mošusa je ugotovil po naslednjem postopku: alkoholno raztopino

mošusa je zmešal z alkoholno raztopino svinčevega acetata in dobil oborino mošusa in

svinčevega oksida, ki jo je nato z različnimi postopki nadaljnje obdelal in analiziral. Prišel

je do izračuna za relativno molekulsko maso umetnega mošusa, ki je 2123, vendar je z

nadaljnjimi analizami rezultat popravil na 2102. Nato je ugotovil še elementno sestavo

umetnega mošusa, ki je sledeča: 53,67 % C, 4,79 % H, 7,33 % N in 34,21 % O (26).

Po letu 1840 zapisi o medicinski uporabi jantarnega olja in umetnega mošusa počasi

začnejo izginjati. George Long v The Penny Cyclopaedia iz leta 1840 celo napiše, da se

umetni mošus nikakor ne sme uporabljati v medicinske namene (27), a ne navede zakaj.

Pregledali smo tudi nemške farmakopeje, od prve do šeste izdaje, saj so bile le-te v času

izhajanja (1872-1926) relevantne tudi za ozemlje današnje Slovenije. Prečiščeno jantarno

olje smo našli le v prvi izdaji iz leta 1872, prav tako smo samo v prvi izdaji našli jantarno

kislino, ki nastaja kot stranski produkt destilacije jantarja. Podatkov o umetnem mošusu

nismo našli, omenjajo pa prve tri izdaje naravni mošus, vendar tudi ta v četrti izdaji iz leta

1900 izgine. Malo kasneje počasi iz literature začnejo izginjati tudi podrobni opisi navodil

11

za suho destilacijo jantarja in za pripravo umetnega mošusa. Najmlajši zapis podrobnejših

navodil za pripravo olja in mošusa, brez njune uporabe, smo našli v delu Johna Charlesa

Sawerja iz leta 1894 (28).

1.5 Nitriranje

S pojmom nitriranje opišemo vrsto kemijskih reakcij, s katerimi v organske, najpogosteje

aromatske, spojine uvajamo nitro skupino (NO2). Mehanizem reakcije aromatskega

nitriranja je elektrofilna aromatska substitucija, ki jo ponavadi izvajamo v zmesi

koncentrirane dušikove(V) kisline in žveplove(VI) kisline. Dušikova kislina služi kot vir

reaktivnega nitronijevega iona (NO2+), ki je reaktivna zvrst potrebna za potek reakcije,

žveplova kislina pa kot katalizator in sušilno sredstvo.

1.5.1 Zgodovina nitriranja

Kot prvi je nitriranje aromata izvedel Michael Faraday. Po odkritju benzena leta 1825, je

le-tega nevede tudi nitriral z dodajanjem dušikove kisline in opisal rdečo snov z vonjem po

mandljih, ki se po spiranju z vodo razbarva (29). Eilhard Mitscherlich je leta 1834 pripravil

nitrobenzen s kadečo dušikovo kislino in tudi on opiše produkt sladkega okusa z vonjem

po grenkih mandljih in cimetu (30). Charles B. Mansfield je kmalu za tem za nitriranje kot

prvi poleg dušikove uporabil še žveplovo kislino, saj je menil, da bo žveplova kislina

odstranila vodo in tako preprečila redčenje dušikove kisline. Postopek s tako imenovano

»mešano kislino« (ang.: mixed acid) je Mansfield leta 1849 patentiral (31). August W. Von

Hofmann in James S. Muspratt sta leta 1846 uporabila postopek z mešano kislino za

sintezo prvega dinitro substituiranega produkta, dinitrobenzena (31).

Od začetkov nitriranja v prvi polovici 19. stoletja do danes, je postopek odprl vrata v

široko področje kemije aromatov, hkrati pa je postal tudi industrijsko zelo pomemben.

Nitroaromate danes večinoma uporabljamo za sintezo anilina in podobnih aromatskih

aminov, te pa dalje uporabljamo v proizvodnji barv, eksplozivov, polimerov, pesticidov in

zdravil.

1.6 Destilacija

Destilacija je ena glavnih tehnik za čiščenje in ločevanje hlapnih spojin, uporabljamo pa jo

tudi za pridobivanje surovin iz materialov, kot sta na primer les in premog. Vsem vrstam

12

destilacije je skupen proces uparevanja tekočin pri povišani temperaturi in nato

kondenzacija par nazaj v tekočino, ki jo imenujemo destilat. Najbolj poznane so navadna,

frakcionirna in suha destilacija, destilacija pod znižanim tlakom ter destilacija z vodno

paro.

1.6.1 Suha destilacija

Jantarno olje dobimo s suho destilacijo. Pri tej vrsti destilacije trdno snov segrevamo, da

le-ta razpade, pri tem pa nastajajo novi produkti, ki v izhodiščni snovi niso prisotni. Iz

aparature pred segrevanjem izženemo zrak in tako preprečimo, da bi snov zagorela.

Postopek je destruktiven, ponavadi pa so zanj potrebne mnogo višje temperature, kot pri

drugih vrstah destilacije in lahko dosežejo 900 °C in več (32). Suho destilacijo

uporabljamo za pridobivanje plina, goriv in oglja iz lesa in premoga.

1.6.2 Destilacija z vodno paro

Olje prečistimo z destilacijo z vodno paro. Ta tehnika je uporabna za destilacijo organskih

spojin, ki se z vodo in vodno paro ne mešajo. Pri zmeseh tekočin, ki se ne mešajo, vsaka

komponenta posebej doprinese svojo vrednost parnega tlaka k skupni vrednosti parnega

tlaka. Parni tlak zmesi je torej seštevek posameznih parnih tlakov komponent v zmesi in se

bo zato prej izenačil z zunanjim parnim tlakom, kar je pogoj za vrenje. Zmes bo tako imela

vrelišče nižje od vrelišč posameznih čistih komponent v zmesi. Destilacijo z vodno paro

uporabljamo za destilacijo spojin z visokimi vrelišči in za termolabilne spojine, saj zanje

druge destilacijske metode niso primerne, zmes z vodo pa bo vedno vrela pod temperaturo

vrelišča vode. Uporabljamo jo za pridobivanje eteričnih olj, v naftnih rafinerijah in za

ločevanje raznih spojin, kot so maščobne kisline, alkoholi, olja in voski (33).

1.7 Plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo

GC-MS aparat je naprava, sestavljena iz plinskega kromatografa (GC), sklopljenega z

masnim spektrometrom (MS). Sistema sta dobro kompatibilna. Oba sta ogrevana

(ponavadi 200-300 °C), uporabljata uparjen vzorec in potrebujeta zelo majhno količino le-

tega. Edina prilagoditev, ki je potrebna za sklopitev sistemov je znižanje tlaka na prehodu

med napravama. Vzorec iz GC namreč pride pod atmosferskim tlakom, medtem ko je za

delovanje MS potreben visok vakuum (10-5-10-6 hPa) (34).

13

1.7.1 Plinska kromatografija

Plinska kromatografija je separacijska tehnika, pri kateri uparjen vzorec s pomočjo

mobilne faze (MF), ki je v primeru GC inertni plin, potuje skozi kolono v kateri je

stacionarna faza (SF). Zaradi selektivnega zadrževanja komponent vzorca na SF, se le-te

ločijo. Glede na agregatno stanje v katerem je SF ločimo plinsko-trdno (GSC) in plinsko-

tekočinsko kromatografijo (GLC). SF je napolnjena v kolone, ki jih razdelimo na polnjene

in kapilarne. Polnjene kolone so narejene iz stekla ali kovine in napolnjene z inertnim

polnilom, ki je prevlečeno s SF. Novejše kapilarne kolone pa so kovinske ali iz staljenega

kremenčevega peska (fused silica), notranjo površino pa imajo prevlečeno s SF (34).

Komponente sistema za plinsko kromatografijo:

1. Izvor nosilnega plina

2. Regulator pretoka in pritiska nosilnega plina

3. Injektor za vnos vzorca

4. Kolona

5. Termostatiran del (pečica)

6. Detektor

7. Integrator – sistem za obdelavo podatkov (34).

Slika 9: Shema plinskega kromatografa (35).

14

Prednosti GC:

hitra analiza

učinkovita (visoka ločljivost) in občutljiva (meri ppm in celo ppb) metoda

nedestruktivna za vzorec, kar omogoča sklapljanje z drugo metodo

zelo natančna kvantitativna analiza

potrebni majhni volumni vzorca (ponavadi μL)

zanesljiva in relativno preprosta metoda

poceni (34).

Slabosti GC:

omejena na hlapne in termostabilne vzorce

ni za velike vzorce (za preparativno kromatografijo)

za potrditev kromatografskih vrhov ponavadi potrebna sklopitev z drugo

metodo (npr. z masnim spektrometrom) (34).

1.7.2 Masna spektrometrija

Masna spektrometrija je analizna tehnika s katero lahko ugotovimo molekulsko maso,

elementno sestavo in strukturo molekul vzorca. Prva stopnja analize je uplinjanje vzorca in

priprava ioniziranih molekul oziroma molekulskih fragmentov. Nastali ioni se nato v MS

ločijo na osnovi razmerja med maso in nabojem (m/z), sistem pa jih zazna glede na

pogostost pojavljanja oziroma njihovo število. Rezultat analize je masni spekter molekule,

ki predstavlja pojavljanje določenega fragmenta v odvisnosti od m/z. Ionizacijo molekul

dosežemo z obstreljevanjem z elektroni, kemično, v induktivno sklopljeni plazmi, s

fotoionizacijo, itd. Ionizirani fragmenti nato v visokem vakuumu potujejo skozi magnetno

in/ali električno polje v masnem analizatorju, ki jim glede na njihovo hitrost in pot leta

ugotovi m/z. Na koncu pridejo fragmenti še na detektor, kjer ugotovimo njihovo število

(34).

15

Komponente sistema za masno spektrometrijo:

1. Injektor za vnos vzorca

2. Vir ionizacije vzorca

3. Pospeševalnik fragmentov

4. Masni analizator (elektromagnet)

5. Detektor

6. Vakuumska črpalka

7. Sistem za obdelavo podatkov (34).

Slika 10: Shema masnega spektrometra (36).

Prednosti MS:

lahko ugotovimo sestavo in molekulsko maso spojin

občutljiva metoda (ppm)

kvalitativna in kvantitativna analiza

potrebe majhne količine vzorca (μg) (37).

Slabosti MS:

destruktivna metoda

ne loči izomerov spojin (37).

16

2 NAMEN DELA

V magistrskem delu bomo po navodilih iz stare literature izolirali olje jantarja, iz njega

pripravili tako imenovani umetni mošus in nato raziskali sestavo obeh pridobljenih snovi.

Tako jantarno olje, kot tudi umetni mošus, so v preteklosti pogosto uporabljali v razne

medicinske namene, opise postopkov njunega pridobivanja in uporabe pa je bilo moč

zaslediti v številnih dispenzatorijih, farmakopejah in kemijskih priročnikih. V drugi

polovici 19. stoletja so tovrstni zapisi iz literature postopoma izginili, prav tako pa po nam

dostopnih podatkih, v sodobni literaturi ni objavljenih nobenih člankov, v katerih bi se

avtorji posvetili analizi kemijske sestave jantarnega olja in umetnega mošusa.

Po pregledu literature bomo izbrali najbolj optimalne postopke suhe destilacije jantarja

oziroma jih bomo zaradi varnosti pri delu priredili. Enako bomo storili pri postopku

čiščenja jantarnega olja in pripravi umetnega mošusa. Za delo bomo uporabili najbolj

dostopen in razširjen jantar - baltski jantar, ki so ga po vsej verjetnosti najpogosteje

uporabljali za pridobivanje olja tudi v preteklosti. Kot primerjalni vzorec bomo uporabili

industrijsko pridelano surovo jantarno olje iz katerega bomo za primerjavo pripravili tudi

prečiščeno olje in umetni mošus.

V literaturi priporočene analizne metode ni, zato smo se odločili, da bomo za analizo

vzorcev uporabili plinsko kromatografijo sklopljeno z masno spektrometrijo (GC-MS).

Metoda je primerna, saj bomo analizirali hlapne, termostabilne snovi, hkrati pa ima visoko

občutljivost. Vzorce bomo pred analizo raztopili v primernem topilu in jih najprej

kvalitativno nato pa še kvantitativno ovrednotili.

17

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Materiali

3.1.1 Jantar in jantarno olje

jantar v koščkih, poreklo: Baltik (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG, Aichstetten,

Nemčija)

surovo jantarno olje, poreklo: Kitajska (Hermitage Oils, Hull, Združeno kraljestvo)

3.1.2 Kemikalije

absolutni etanol, p.a. (Carlo Erba, Milano, Italija)

alkani za ugotavljanje RI: n-alkanes for AART and FFNSC (Restek, Bellefonte,

Pensilvanija, Združene države Amerike)

n-heksan GC kakovsti (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)

n-pentan GC kakovosti (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)

kadeča HNO3 (100 %), ρ=1,50 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)

koncentrirana HNO3 (65 %), ρ=1,39 (Carlo Erba, Milano, Italija)

metanol HPLC kakovosti (J.T. Baker, Deventer, Nizozemska)

referenčne spojine spojin najvišje možne čistote, navadno >99 % (Sigma-Aldrich,

Steinheim, Nemčija in Merck, Darmstadt, Nemčija).

voda HPLC kakovosti (J.T. Baker, Deventer, Nizozemska)

3.1.3 Aparature in laboratorijska oprema

analizna tehtnica, model: BD BH 110 (Sartorius AG, Goettingen, Nemčija)

avtomatske pipete, model: Proline (Biohit, Helsinki, Finska)

centrifuga, model: Centric200R (Tehtnica, Železniki, Slovenija)

magnetno mešalo z gretjem, model: Carousel Advanced (Radleys, Saffron Walden,

Združeno kraljestvo)

nastavki za avtomatske pipete (Eppendorf AG, Hamburg, Nemčija)

plinski gorilnik Primus Gravity EF II S Piezzo (Primus, Boulder, Colorado,

Združene države Amerike)

18

plinske kartuše Primus Power Gas 4 Season Mix (Primus, Boulder, Colorado,

Združene države Amerike)

standardna laboratorijska steklovina

ultrazvočna kadička, model: Sonorax Digitec (Bandelin Electronic GmbH & Co.

KG, Berlin, Nemčija)

3.2 Metode

3.2.1 Suha destilacija jantarja

Jantar smo destilirali po optimiziranem postopku, povzetem iz stare literature (17,18, 20).

Za segrevanje peščene kopeli smo namesto odprtega ognjišča uporabili plinski gorilnik,

namesto retorte pa smo uporabili stekleno bučko na katero smo namestili vodni hladilnik

za vakuumsko destilacijo.

3.2.2 Čiščenje surovega jantarnega olja

Surovo jantarno olje smo prečistili z destilacijo z vodno paro, po postopku povzetem iz

stare literature (18). Olju smo dodali šestkratno količino vode in segrevali, dokler ni

predestiliralo dve tretjini vode. Namesto steklene retorte smo uporabili stekleno bučko in

vodni hladilnik za vakuumsko destilacijo.

3.2.3 Priprava umetnega mošusa

Umetni mošus smo pripravili po optimiziranem postopku, povzetem iz stare literature (19,

20, 22). 1 g olja smo dodali 1 mL kisline. Uporabili smo kadečo HNO3, zmes pa smo med

in po dodajanju kisline ves čas hladili na ledeni kopeli. Zmes smo pustili stati 48 ur in

produkt sprali s hladno vodo.

3.2.4 Plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo

GC-MS sistem, model: GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Kjoto,

Japonska)

koloni:

o nepolarna kapilarna: Rxi-5Sil MS, 30 m × 0,25 mm, df=0,25 μm, SF: 5 %

difenil, 95 % dimetilpolisiloksan

19

o polarna kapilarna: Stabilwax, 30 m × 0,25 mm, df=0,25 μm, SF:

polietilenglikol (obe Restek, Bellefonte, Pensilvanija, Združene države

Amerike)

računalniški program GCMS Solution 4.2 (Shimadzu Corporation, Kjoto,

Japonska)

podatkovni GC-MS knjižnici:

o FFNSC 2

o NIST 08 (obe Shimadzu Corporation, Kjoto, Japonska)

razmere GC-MS analize:

o nepolarna kolona (topilo EtOH)

nosilni plin: helij

pretok plina: 1 mL/min

način injiciranja: »split« 1:100

temperaturni program: 5 min pri 40 °C, 40→250 °C hitrost gretja 3 °C/min,

5 min pri 250 °C

temperatura injektorja: 250 °C

volumen injiciranja: 1 μL

temperatura ionskega izvora: 200 °C

temperatura vmesnika: 270 °C

napetost na detektorju: 1 kV

razpon merjenja m/z: 35-500

frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz

energija ionizacije: -70 eV

način ionizacije: EI

začetek snemanja pri 2,5 min

vklop filamenta pri 2,3 min

celoten čas analize: 80 min

20

o polarna kolona (topilo heksan)

nosilni plin: helij

pretok plina: 1 mL/min

način injiciranja: »split« 1:100

temperaturni program: 5 min pri 40 °C, 40→250 °C hitrost gretja 3 °C/min,

5 min pri 250 °C

temperatura injektorja: 250 °C

volumen injiciranja: 1 μL

temperatura ionskega izvora: 200 °C

temperatura vmesnika: 250 °C

napetost na detektorju: 1 kV

razpon merjenja m/z: 35-500

frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz

energija ionizacije: -70 eV

način ionizacije: EI

začetek snemanja pri 2,5 min

vklop filamenta pri 2,3 min

celoten čas analize: 80 min

o polarna kolona (topilo EtOH)

vse razmere enake, kot zgoraj pri heksanu, razen:

začetek snemanja pri 5 min

vklopa filamenta pri 4,5 min

o polarna kolona (topilo MeOH in vodne faze)

vse razmere enake, kot zgoraj pri heksanu, razen:

začetek snemanja pri 0 min

vklop filamenta pri 0 min

21

4 EKSPERIMENTALNI DEL

4.1 Suha destilacija jantarja

Suho destilacijo jantarja smo izvedli v 250 mL stekleni bučki na peščeni kopeli. Kot vir

toplote smo uporabili prenosni plinski gorilnik za kampiranje, saj grelna plošča zaradi

slabega prenosa toplote ni zagotovila dovolj visoke temperature, Bunsenov gorilnik pa je

bil zaradi točkovno usmerjenega plamena prav tako prešibak. Na bučko smo namestili

vodni hladilnik za vakuumsko destilacijo, ki je enostavnejši za uporabo od klasičnega

vodnega hladilnika, saj ima obruse in ne potrebuje dodatnih nastavkov, in termometer z

250 °C skalo. Destilat smo lovili v erlenmajerico. Na sliki 11 je aparatura, ki smo jo

uporabili za suho destilacijo.

Slika 11: Aparatura za suho destilacijo jantarja

Za destilacijo smo točno natehtali približno 140 g zdrobljenega jantarja, kar je zadostovalo

za polovico bučke (Slika 12, levo). Destilacijo smo ponovili štirikrat, potek le-te je bil

vedno skoraj enak.

Destilacija se je začela pri 95-100 °C, ko je v erlenmajerico začela kapljati vodena tekočina

mlečnato bele barve. Po približno pol ure se je destilacija ustavila, v bučki pa se je začel

22

razvijati bel, gost dim. Kmalu se je po stenah hladilnika začel nabirati rjavooranžen

kristalen sublimat. Jantar v bučki je nato začel nabrekati, masa se je kmalu utekočinila in

začela vreti. Masa je bila zelo viskozna in na videz podobna melasi. Temperatura je

postopoma narasla na 130 °C, destilacija je ponovno intenzivno stekla, novi destilat pa je

postajal bolj rumen in oljnat in se je ločeval od prejšnje vodne frakcije. Temperatura je

nato po dobri uri gretja sunkovito narasla na 200-210 °C. Vodno hlajenje smo ustavili in

nadaljevali z zračnim, vrat bučke in hladilnika pa smo ovili z aluminijasto folijo, da smo

preprečili izgubo toplote in s tem stekanje kondenziranih hlapov nazaj v bučko. Destilacija

olja se je kmalu upočasnila, na stenah hladilnika pa se je začel ponovno hitro in v veliki

količini nabirati rjavooranžen sublimat. Temperatura je nato po približno 20 minutah rahlo

padla, kmalu pa narasla na maksimum, ki je bil pri 235-240 °C. Masa je začela močno vreti

in se peniti, olje, ki je destiliralo je bilo bolj oranžne barve. Po približno dveh urah

destilacije je temperatura počasi začela padati in se ustalila pri 90-100 °C, hitrost

destiliranja pa je ves čas sorazmerno s temperaturo padala. Hlapi so iz mase sicer še

izhajali, vendar niso dosegli vratu hladilnika in so se stekali nazaj v bučko, zato smo se

odločili, da na tej točki destilacijo ustavimo. Tekoč ostanek v bučki, se je kmalu po

prenehanju segrevanja začel zgoščevati. Strjen ostanek je bil temno rjavočrn z gladko,

svetlečo površino, na stenah pa so bile rjavočrne saje prepojene z oljnato tekočino (Slika

12, desno).

Pridobljeno olje smo stehtali in izračunali izplen suhe destilacije.

Slika 12: Bučka z jantarjem pred (levo) in po destilaciji (desno).

23

4.2 Prva kvalitativna GC-MS analiza pridobljenega jantarnega olja na nepolarni

koloni

Pred nadaljnjim delom smo želeli ugotoviti, ali se produkti štirih destilacij med seboj

bistveno razlikujejo in jih tudi primerjati z vzorcem kupljenega olja. Pridobljeno olje smo

ločili od vodne faze in pripravili raztopine olja v n-pentanu s približno koncentracijo 5

μL/mL. Vodne frakcije smo shranili za kasnejšo analizo. Vzorec kupljenega olja smo

pripravili v enaki koncentraciji, prav tako v n-pentanu.

4.3 Čiščenje jantarnega olja z destilacijo z vodno paro

Destilacijo z vodno paro smo izvedli v 250 mL bučki s segrevanjem na grelni plošči. Na

bučko smo namestili vodni hladilnik za vakuumsko destilacijo in termometer z 250 °C

skalo. Produkte suhih destilacij smo združili, stehtali 15,0 g te zmesi in ji dodali približno

šestkratno količino vode ter v zmes natresli vrelne kamenčke. Uporabili smo vodo,

namenjeno za HPLC. Zmes je destilirala pri 95-100 °C. Olje je bilo najprej skoraj

brezbarvno, nato vedno bolj rumeno in na koncu olivno zeleno. Po skoraj štirih urah

destilacije smo gretje ustavili, saj v kapljah destilata ni bilo več oljnih kapljic,

predestiliralo pa je približno dve tretjini vode. Ostanek olja je plaval na površini vode. Bil

je temnorjav in goste, lepljive konsistence (Slika 13).

Slika 13: Ostanek v bučki po čiščenju pridobljenega surovega jantarnega olja z vodno

paro.

Za primerjavo smo postopek ponovili na manjši količini (5,02 g) kupljenega surovega

jantarnega olja. Potek destilacije je bil enak kot pri pridobljenem olju.

24

Prečiščeno olje smo stehtali in izračunali izplen destilacije z vodno paro.

4.4 Priprava umetnega mošusa

Za testno pripravo umetnega mošusa smo najprej uporabili 65-odstotno HNO3. V epruveti

smo k 1 g surovega olja po kapljicah dodali 1 mL kisline. Po dodatku kisline pričakovane

reakcije ni bilo, zato smo epruveto segreli v vreli vodi. Med segrevanjem je prišlo do burne

eksotermne reakcije, iz epruvete pa je izhajal gost rjavooranžen plin. Zmes smo pustili stati

48 ur. Po 48 urah nismo dobili želenega gostega smolnatega produkta.

Postopek smo ponovili s 100-odstotno, tako imenovano kadečo HNO3. Umetni mošus smo

pripravili iz surovega in prečiščenega olja pridobljenega s suho destilacijo in za primerjavo

še iz surovega in prečiščenega kupljenega olja. V 25 mL bučko, ki smo jo opremili z

magnetnim mešalom, smo na ledeni kopeli k 1 g olja počasi po kapljicah dodali 1 mL

kisline. Prišlo je do burne reakcije, zmes je postala rdečerjava, iz bučke je izhajal rdečerjav

plin. Zmes smo pustili stati 48 ur, po tem času je postala podobna smoli.

Po 48 urah smo iz bučk izlili preostalo tekočino in produkt trikrat sprali s po 15 mL vode.

Uporabili smo vodo za HPLC.

Ugotovili smo maso pridobljenega umetnega mošusa.

4.5 GC-MS analiza produktov

4.5.1 Kvalitativna analiza na nepolarni koloni

Umetni mošus v n-pentanu ni bil dobro topen, zato smo se odločili, da kot topilo

uporabimo absolutni etanol (EtOH). Absolutni EtOH smo zato namesto n-pentana

uporabili tudi za pripravo vzorcev olja. Pripravili smo raztopine umetnega mošusa s

približno koncentracijo 5 mg/mL.

Na dobljenih kromatogramih so bili odzivi za vzorce s koncentracijo 5 mg/mL zelo nizki,

hkrati pa so bile razlike v odzivih med vzorci zelo velike. Pripravili smo še vzorce s

koncentracijo 10 mg/mL, ki pa tudi niso imeli zadostnih odzivov, zato smo koncentracijo

povečali na 50 mg/mL. Zaradi nenavadno visokih razlik v odzivih za posamezne spojine

smo vzorce točno natehtali v dveh paralelah za vsak vzorec. Zatehte so podane v tabeli I.

25

Tabela I: Zatehte umetnega mošusa za kvalitativno analizo na nepolarni koloni.

olje iz

katerega je

mošus:

pridobljeno

surovo olje

pridobljeno

prečiščeno olje

kupljeno surovo

olje

kupljeno

prečiščeno olje

masa [mg] 50,0 50,8 50,4 50,5 50,1 50,7 50,8 50,6

Odzivi dobljeni za raztopine mošusa s koncentracijo 50 mg/mL so bili zadosti visoki, še

vedno pa so se pojavljale velike razlike med vzorci in celo znotraj istega vzorca mošusa.

Predpostavili smo, da je bila vzrok za razlike voda prisotna v vzorcih mošusa. 300 mg

vsakega vzorca mošusa smo zato centrifugirali najprej 5 minut pri 10.000 rpm (8944 g),

nato pa še 10 minut pri 15.000 rpm (20.124 g), saj prvo centrifugiranje ni bilo dovolj

učinkovito. Vodo smo odstranili s pomočjo avtomatske pipete. Po postopku odstranjevanja

vode smo lahko izračunali tudi suho maso dobljenega umetnega mošusa. Analizirali smo

tudi olja v EtOH s koncentracijo 10 mg/mL. Olj nismo več pipetirali, temveč smo jih

zaradi večje natančnosti in enakomernosti mase tehtali.

Na isti koloni smo analizirali še združene vodne frakcije dobljene pri suhi destilaciji

jantarja, vodo, ki je skupaj z oljem destilirala med čiščenjem olja z vodno paro in sublimat,

ki je v hladilniku nastal med suho destilacijo. Raztopino sublimata smo pripravili najprej v

EtOH in kasneje še v vodi, vedno v koncentraciji 10 mg/mL.

4.5.2 Kvalitativna analiza na polarni koloni

Zaradi možnosti prekrivanja posameznih vrhov v kromatogramih pridobljenih na nepolarni

koloni, smo se odločili, da vzorce kvalitativno analiziramo še na polarni koloni. Pripravili

smo raztopine olja v EtOH s približno koncentracijo 10 mg/mL in raztopine mošusa v

EtOH s približno koncentracijo 50 mg/mL. EtOH se je zaradi prekrivanja vrhov v

kromatogramu izkazal za neprimerno topilo, zato smo ga nadomestili z n-heksanom.

Umetni mošus v n-heksanu ni bil topen, prav tako tudi ne v dietiletru, zato smo analizirali

raztopino v metanolu (MeOH). Relativna molekulska masa MeOH (Mr =32) je bila namreč

izven območja snemanja masnih spektrov (m/z = 35-500).

Poleg olja smo na isti koloni analizirali še združene vodne frakcije dobljene pri suhi

destilaciji jantarja, vodo, ki je skupaj z oljem destilirala med čiščenjem olja z vodno paro

in sublimat, ki je v hladilniku nastal med suho destilacijo. Vse analize smo izvedli v dveh

paralelah. Raztopino sublimata s koncentracijo 10 mg/mL smo pripravili v EtOH, saj smo

26

predpostavili, da njegov vrh v tem primeru ne bo prekril iskanega vrha, raztopino

sublimata z enako koncentracijo pa smo pripravili tudi v vodi. Rezultate analiz vzorcev

vodnih frakcij in vode, ki je ostala po čiščenju olja smo uporabili tudi za kvantitativno

analizo.

4.5.3 Kvantitativna analiza na nepolarni koloni

Pripravili smo vzorce jantarnega olja s koncentracijo 10 mg/mL in vzorce umetnega

mošusa s koncentracijo 50 mg/mL, vse v absolutnem EtOH. Vse vzorce smo pripravili v

dveh paralelah. Natančne zatehte so podane v tabelah II in III.

Tabela II: Zatehte jantarnega olja za kvantitativno analizo na nepolarni koloni.

vrsta olja: pridobljeno

surovo olje

pridobljeno

prečiščeno olje

kupljeno surovo

olje

kupljeno

prečiščeno olje

masa [mg] 10,4 10,3 10,2 10,6 10,4 10,5 10,2 10,6

Tabela III: Zatehte umetnega mošusa za kvantitativno analizo na nepolarni koloni.

olje iz

katerega je

mošus:

pridobljeno

surovo olje

pridobljeno

prečiščeno olje

kupljeno surovo

olje

kupljeno

prečiščeno olje

masa [mg] 50,4 50,2 50,2 50,5 50,5 50,3 50,1 50,5

4.5.4 Priprava umeritvenih premic za kvantitativno analizo

4.5.4.1 Umetni mošus in jantarno olje na nepolarni koloni

Po pregledu kromatogramov kvalitativne analize smo se odločili, katere spojine bi bilo

smiselno kvantificirati. Pri tem smo upoštevali intenzitete posameznih vrhov spojin (vsaj

105) ter dobavljivost in ceno izbranih referenčnih spojin. Najprej smo pripravili raztopine

referenčnih spojin s koncentracijo 0,100 μL/mL oziroma 0,100 mg/mL v EtOH, da smo

preverili odzive na kromatogramu in se na podlagi le-teh odločili za koncentracije v katerih

smo pripravili raztopine referenčnih spojin za umeritvene premice.

27

Odločili smo se za koncentracije:

200 ppm (0,200 mg/mL)

100 ppm (0,100 mg/mL)

50,0 ppm (0,0500 mg/mL)

20,0 ppm (0,0200 mg/mL)

10,0 ppm (0,0100 mg/mL)

5,00 ppm (0,00500 mg/mL)

1,00 ppm (0,00100 mg/mL)

V 50 mL merilni bučki smo pripravili raztopino referenčnih spojin s koncentracijo 200

ppm, ki smo jo nato v merilnih bučkah ustrezno redčili do želenih koncentracij.

Spojine, ki smo jih uporabili za umeritvene premice so navedene v tabelah IV in V.

Tekočih vzorcev nismo tehtali, temveč smo jih zaradi večje natančnosti in enakomernosti

pipetirali z avtomatskimi pipetami. Ustrezne volumne smo izračunali iz relativnih gostot.

Primer dobljene umeritvene premice na nepolarni koloni je v prilogi 15.

Tabela IV: Referenčne spojine za umeritveno premico za jantarno olje.

ime spojine masa/volumen ime spojine masa/volumen

toluen 11,6 𝜇L kafra 10,0 mg

o-ksilen 11,4 𝜇L borneol 10,4 mg

m-ksilen 11,5 𝜇L naftalen 10,7 mg

p-ksilen 11,6 𝜇L α-pinen 11,6 𝜇L

o-cimen 11,4 𝜇L β-damaskon 1,00 mL*

m-cimen 11,6 𝜇L 1-metilnaftalen 9,78 𝜇L

p-cimen 11,7 𝜇L 2-metilnaftalen 10,4 mg

mezitilen 11,5 𝜇L etilbenzen 11,5 𝜇L

limonen 11,9 𝜇L 1,2,4-trimetilbenzen 11,4 𝜇L

evkaliptol 10,8 𝜇L 1,2,3-trimetilbenzen 11,2 𝜇L

kamfen 10,2 mg kumen 11,6 𝜇L

fenhol 10,7 mg etil-4-metilbenzoat 9,76 𝜇L

*na voljo smo imeli 1-odstotno etanolno raztopino β-damaskona (10 mg/mL)

28

Tabela V: Referenčne spojine za umeritveno premico za umetni mošus.

ime spojine masa/volumen ime spojine masa/volumen

toluen 11,6 𝜇L ocetna kislina 9,53 𝜇L

o-ksilen 11,4 𝜇L dietoksietan 12,0 𝜇L

m-ksilen 11,5 𝜇L pinan 11,7 𝜇L

p-ksilen 11,6 𝜇L 2,4,5-trimetilbenzaldehid 10,7 mg

o-cimen 11,4 𝜇L 2,4,6-trimetilbenzaldehid 9,95 𝜇L

m-cimen 11,6 𝜇L etil-p-anisat 9,07 𝜇L

p-cimen 11,7 𝜇L 2-nitritoluen 8,60 𝜇L

mezitilen 11,5 𝜇L 3-nitrotoluen 8,64 𝜇L

kamfen 10,5 mg 4-nitrotoluen 10,7 mg

kafra 10,3 mg 1-etil-2-nitrobenzen 8,87 𝜇L

etilbenzen 11,5 𝜇L 1,2-dimetil-3-nitrobenzen 8,86 𝜇L

kumen 11,6 𝜇L 2-nitro-p-ksilen 8,85 𝜇L

etil-4-metilbenzoat 9,76 𝜇L 2-nitro-p-cimen 9,35 𝜇L

etilpropanoat 11,3 𝜇L 1-nitronaftalen 10,2 mg

etilbutanoat 11,4 𝜇L 2-metil-1-nitronaftalen 10,8 mg

fenhon 10,6 𝜇L 1,3,5-trimetil-2-nitrobenzen 10,2 mg

etilacetat 11,1 𝜇L 4-etilnitrobenzen 8,94 𝜇L

4.5.4.2 Vodne faze na polarni koloni

Za združene vodne frakcije suhe destilacije in za vodo, ki je ostala po čiščenju olja smo

izvedli enak postopek, kot je opisan pri nepolarni koloni, le da smo namesto v EtOH

referenčne spojine raztopili v vodi. Spojine smo na podlagi njihove topnosti v vodi ločili

na hidrofilne in lipofilne in se skladno s tem tudi odločili za koncentracije v katerih smo

pripravili raztopine za umeritvene premice. Za hidrofilne spojine smo pripravili enake

koncentracije kot na nepolarni koloni (1,00 do 200 ppm), za lipofilne pa le koncentracije

1,00 do 50,0 ppm. Uporabljene spojine so navedene v tabelah VI in VII.

Primer dobljene umeritvene premice na polarni koloni je v prilogi 16.

29

Tabela VI: Hidrofilne referenčne spojine za umeritveno premico za vodne frakcije.

ime spojine masa/volumen ime spojine masa/volumen

hidroksiaceton 9,24 𝜇L 3-metilbutanojska kislina 10,8 𝜇L

sukcinimid 10,4 mg 2-metil-2-pentenojska kislina 10,7 mg

N-metilsukcinimid 10,1mg propenojska kislina 9,51 𝜇L

mono-metilsukcinat 10,1 mg benzojska kislina 10,2 mg

krotonska kislina 10,5 mg acetonitril 12,7 𝜇L

jantarna kislina 10,6 mg 3-hidroksibutanon 10,2 mg

acetaldehid 12,7 𝜇L 1-butanol 12,4 𝜇L

aceton 12,6 𝜇L 3-metil-1-butanol 12,4 𝜇L

metilacetat 10,7 𝜇L fenol 10,2 mg

2-butanon 12,4 𝜇L 2-metilfenol 10,4 mg

2-pentanon 12,4 𝜇L 3-metilfenol 9,67 𝜇L

2,3-butandion 10,2 𝜇L 4-metilfenol 10,3 mg

etanojska kislina 9,53 𝜇L 2-etilfenol 9,64 𝜇L

propanojska kislina 10,1 𝜇L 3-etilfenol 9,99 𝜇L

butanojska kislina 10,4 𝜇L 4-etilfenol 10,8 mg

pentanojska kislina 10,7 𝜇L 2-metoksifenol 8,83 𝜇L

heksanojska kislina 10,8 𝜇L 2-metoksi-4-metilfenol 9,16 𝜇L

2-metilpropanojska kislina 10,5 𝜇L etilacetat 11,1 𝜇L

Tabela VII: Lipofilne referenčne spojine za umeritveno premico za vodne frakcije.

ime spojine masa/volumen ime spojine masa/volumen

2-ciklopenten-1-on 10,1 𝜇L kamfen 10,4 mg

2-cikloheksen-1-on 10,1 𝜇L fenhon 10,6 𝜇L

3-metil-2-ciklopenten-1-on 10,3 𝜇L fenhol 10,0 mg

2-metil-1,3-ciklopentandion 10,7 mg toluen 11,6 𝜇L

1,4-cikloheksandion 10,8 mg o-ksilen 11,4 𝜇L

ciklopentanon 10,5 𝜇L m-ksilen 11,5 𝜇L

cikloheksanon 10,6 𝜇L p-ksilen 11,6 𝜇L

kafra 10,6 mg o-cimen 11,4 𝜇L

borneol 10,8 mg m-cimen 11,6 𝜇L

izoborneol 10,5 mg p-cimen 11,7 𝜇L

evkaliptol 10,8 𝜇L

30

5 REZULTATI IN RAZPRAVA

5.1 Suha destilacija jantarja

Produkti suhih destilacij so se po videzu med seboj precej razlikovali. Prvi in četrti destilat

sta bila temnejše, bolj oranžnorjave barve, medtem ko sta bila drugi in tretji svetlejše,

rumenorjave barve (Slika 14, levo). Vidna razlika je bila tudi v razmerju med dobljeno

vodno in oljno fazo oziroma v količini le-teh. Pri prvem in četrtem destilatu je bilo oljne

faze veliko več kot vodne, pri drugem in tretjem pa je za malenkost prevladovala vodna

faza. Pri medsebojni primerjavi destilatov smo opazili, da je bilo precej več oljne faze v

prvem in četrtem destilatu (skoraj dvakratna količina), v drugem in tretjem pa je bila večja

količina vodne faze kot v drugih dveh. Iz opazovanega smo predvidevali, da bodo izpleni

destilacij primerljivi za prvi in četrti vzorec ter za drugega in tretjega.

Slika 14: Produkti suhih destilacij jantarja (levo) in kupljeno jantarno olje (desno).

Iz podatkov o masi uporabljenega jantarja in o masi iz njega pridobljenega olja smo

izračunali izplen vsake od štirih ponovitev suhe destilacije. Nato smo izračunali še

povprečen izplen destilacij.

31

Mase uporabljenega jantarja za posamezno destilacijo:

1. 140,3 g

2. 140,2 g

3. 140,3 g

4. 140,1g

Mase pridobljenih destilatov (samo oljna faza):

1. 9,64 g

2. 5,61 g

3. 5,37 g

4. 10,1 g

izplen destilacije: masa olja

masa jantarja × 100 %

Izpleni suhe destilacije:

1. 6,87 %

2. 4,00 %

3. 3,83 %

4. 7,21 %

Z izračunom izplena smo svoje domneve o podobnosti prvega in četrtega ter drugega in

tretjega vzorca potrdili. Vzrok za razlike bi lahko bil v višji temperaturi peščene kopeli pri

prvi in četrti destilaciji, saj smo obe izvedli z novo, popolnoma polno plinsko kartušo. Za

drugo in tretjo destilacijo pa smo uporabili isto kartušo kot pri prvi destilaciji.

Produkte smo nato primerjali z opisi iz stare literature (8). Vonj olja se je ujemal z opisi.

Bil je zelo oster in neprijeten ter je spominjal na zažgano organsko snov in petrolej. Barva

in konsistenca olja pa nista bili podobni opisanim. Olje je bilo rumene do oranžnorjave

barve in ne preveč viskozno, opisano olje pa je bilo temnorjavo ter sirupaste konsistence.

Kupljeno olje je bilo približno enake viskoznosti, a temnejše, bolj oranžne barve od

pridobljenega (slika 14, desno), vonj pa se ni bistveno razlikoval. Pri nobeni ponovitvi

povprečni izplen je 5,48 %

32

destilacije nismo dobili gostega rjavega olja, ki ga opisujejo nekateri avtorji, in naj bi

nastajalo proti koncu destilacije (17). Vzrok za to je bila verjetno sprememba aparature za

suho destilacijo. Zelo težko hlapne komponente, ki so najverjetneje v gostem rjavem olju,

so se proti koncu destilacije sicer dvigovale po vratu bučke, a z uporabljenim gorilnikom,

niti z dodatnim gretjem peščene kopeli ob straneh, niso dosegle vratu hladilnika in so se

stekale nazaj v bučko. Da bi te komponente dosegle vrat hladilnika, smo ustavili vodno

hlajenje in nadaljevali le z zračnim, kar prav tako ni pomagalo. V retorti, ki se je grela na

odprtem ognju, so bile verjetno dosežene precej višje temperature, zato so tudi te

komponente lahko destilirale. Hkrati je bila pot, ki so jo morale prepotovati destilirane pare

do vratu retorte, kjer so kondenzirale, krajša kot v primeru bučke na katero je bil nameščen

hladilnik.

Sprememba aparature je tudi možen vzrok za veliko manjše izplene, ki smo jih dosegli v

primerjavi z literaturnimi podatki. Izpleni v literaturnih podatkih so od 25-31 % mase

uporabljenega jantarja (38) pa celo do 52 % (25), povprečen izplen olja, destiliranega v

okviru te raziskave pa je bil le 5,48 %. Zaključimo lahko, da je vzrok za tako nizek izplen

v uporabljeni aparaturi, ki smo jo spremenili zlasti z vidika varnosti pri delu v laboratoriju.

5.2 Prva kvalitativna GC-MS analiza pridobljenega jantarnega olja na nepolarni

koloni

S prvo GC-MS analizo destilatov smo želeli ugotoviti, ali se le-ti med seboj bistveno

razlikujejo, saj smo jih pred nadaljnjim delom želeli združiti. Pripravili smo raztopine

oljnih faz vseh štirih destilacij v n-pentanu s koncentracijo 5 μL/mL. Enako smo storili s

kupljenim surovim oljem.

Po pregledu kromatogramov smo ugotovili, da sta, kot smo pričakovali, zelo podobna

kromatograma prve in četrte destilacije in kromatograma druge in tretje destilacije. Sicer

so si bili vsi štirje kromatogrami v območju nižjih retencijskih časov (tR) precej podobni.

Do razlik je prišlo v območju višjih tR, kjer pri drugem in tretjem destilatu ni bilo več

izrazitejših vrhov, ali pa so se izgubili v šumu bazne linije kromatograma, pri prvem in

četrtem destilatu pa so bili ti vrhovi precej višji. V tem območju so bile verjetno bolj težko

hlapne komponente olja. Taki rezultati so bili pričakovani, saj smo na prisotnost večjih

količin težje hlapnih komponent v destilatih 1 in 4 sklepali že po barvi in količini oljne

frakcije v primerjavi z destilatoma 2 in 3.

33

Analizirali smo tudi vzorec kupljenega olja in kromatogram primerjali s kromatogrami

naših destilatov. Ugotovili smo, da med pridobljenimi olji in kupljenim oljem ni bistvenih

razlik v kvalitativni sestavi in da bomo z združitvijo destilatov dobili kromatografski

profil, ki bo zelo podoben profilu kupljenega olja. Vse štiri oljne faze destilatov smo zato

pred nadaljnjim delom zaradi zmanjšanja števila vzorcev in s tem lažjega dela združili.

5.3 Čiščenje jantarnega olja z destilacijo z vodno paro

Za čiščenje smo uporabili postopek, ki ga v stari literaturi največkrat omenjajo, to je

destilacija z vodno paro. Za čiščenje olja so sicer uporabljali tudi ponovno destilacijo

dobljenega surovega olja brez ali z različnimi dodatki kot je na primer oglje.

Dobljeno prečiščeno olje (Slika 15) se je precej dobro ujemalo z literaturnimi opisi (8).

Bilo je svetlorumene barve s skoraj nespremenjenim močnim, neprijetnim vonjem po

zažgani organski snovi. Našli smo tudi podatke, da naj bi empirevmatični vonj olja po

čiščenju z vodno paro popolnoma izginil, kar se pri redestilaciji samega olja ne zgodi (28).

Kupljeno prečiščeno olje se od pridobljenega prečiščenega olja skoraj ni razlikovalo, ne po

videzu, ne po vonju.

Slika 15: Prečiščeno pridobljeno jantarno olje.

34

Za čiščenje smo uporabili 15,0 g pridobljenega olja in 5,02 g kupljenega surovega olja.

Po postopku smo dobili 10,7 g prečiščenega pridobljenega olja in 2,25 g prečiščenega

kupljenega olja.

izplen destilacije z vodno paro: masa prečiščenega olja

masa surovega olja × 100 %

Izplen pri pridobljenem olju je bil 71,3 %, pri kupljenem olju pa 44,8 %.

Razlika v izplenu je lahko posledica različne kvantitativne sestave pridobljenega in

kupljenega olja. Ker kvantitativne analize še nismo izvedli, lahko le sklepamo, da je v

pridobljenem olju več lažje hlapnih spojin, kot v kupljenem. Edini najdeni literaturni

podatki o izplenu destilacije z vodno paro so 65-70 % (8). To je popolnoma primerljivo z

izplenom pri olju, pridobljenem v laboratoriju, izplen pri kupljenem olju pa je precej nižji.

Sklepamo lahko, da je vzrok za razliko v kvantitativni sestavi olja, ki pa je posledica

različnih načinov in pogojev pridobivanja surovega olja. Sprememba aparature pri tem

postopku ni imela tako velikega vpliva kot pri suhi destilaciji. Tudi z uporabljeno grelno

ploščo smo namreč lahko dosegli zadosti visoke temperature za ustrezno destilacijo.

Originalni postopek so sicer izvajali v retorti na ognjišču.

5.4 Priprava umetnega mošusa

Za pripravo umetnega mošusa smo uporabili kadečo HNO3, saj se koncentrirana 65-

odstotna kislina ni izkazala za dovolj močno. Tudi v stari literaturi smo našli zapise, da je

bilo zmes ob dodatku prešibke oziroma razredčene kisline potrebno segrevati, da je

reakcija potekla do konca (23). Zaradi pričakovane burne reakcije ob uporabi kadeče

kisline smo zmes med dodajanjem kisline mešali in hladili na ledeni kopeli. Zmes je takoj

po dodatku prvih kapljic kisline potemnela, iz nje je začela izhajati gosta rdečerjava para,

ki je najverjetneje vsebovala nitrozne pline, reakcija pa je bila tudi precej glasna. Po

dodatku kisline smo počakali, da se je iz zmesi nehalo kaditi, jo rahlo pokrili in pustili stati

48 ur, saj smo želeli, da reakcija res v celoti poteče. Mošus smo pripravili iz štirih vzorcev

olja, iz pridobljenega surovega in prečiščenega olja ter za primerjavo iz kupljenega

surovega in prečiščenega olja. Avtorji so namreč za pripravo mošusa uporabljali tako

35

surovo, kot tudi prečiščeno olje (8, 19, 20, 22). Med pripravo smo opazili, da je burnejša

reakcija stekla pri uporabi surovega olja, kar lahko sklepamo, da je posledica različne

sestave surovega in prečiščenega olja. Dobljene produkte smo po spiranju z vodo

primerjali z opisi iz stare literature (19, 20, 22). Dobljen intenzivno oranžen smolnat

produkt je ustrezal opisu, imel je rahel vonj po mošusu, vonj po kislini pa je bil prisoten

tudi po večkratnem spiranju z vodo. Sčasoma je produkt potemnel (Slika 16), vonj po

kislini je izginil, vonj po mošusu pa je postal izrazitejši.

Slika 16: Umetni mošus.

Ugotovili smo tudi maso dobljenih produktov. Stehtali smo bučke s produkti z magnetnimi

mešali in zamaški vred. Produkte smo premestili v viale ter bučke z zamaški in magneti

dobro sprali z 10 mL EtOH. Ostanke po stenah bučke smo raztopili s pomočjo ultrazvočne

kadičke. Bučke smo izpraznili, jih dobro posušili ter skupaj z zamaški in mešali ponovno

stehtali.

Mase umetnih mošusov (razlika med maso polne in prazne bučke):

1. iz pridobljenega surovega olja: 1,74 g

2. iz pridobljenega prečiščenega olja: 1,51 g

3. iz kupljenega surovega olja: 2,05 g

4. iz kupljenega prečiščenega olja: 1,58 g

36

Vidimo, da je nastalo več umetnega mošusa iz surovega olja in, da smo malo večje

količine dobili ob uporabi kupljenega olja. Opazna razlika med surovim in prečiščenim

oljem je bila vidna že med potekom reakcije (burnejša reakcija pri surovem olju), razlika

pa je bila tudi v konsistenci pridobljenega mošusa. Pri prečiščenem olju je bil bolj viskozen

in bolj lepljiv. Do razlik najverjetneje pride zaradi razlike v sestavi olja. Prav tako zaradi

enakega razloga pride do razlik v količini med pridobljenim in kupljenim oljem.

5.5 Kvalitativna GC-MS analiza produktov

5.5.1 Kvalitativna analiza na nepolarni koloni

Preizkusili smo topnost umetnega mošusa v n-pentanu, ki smo ga uporabili že za

raztapljanje vzorcev olja. Mošus v n-pentanu ni bil topen, zato smo morali poiskati drugo

primerno topilo. Odločili smo se za absolutni EtOH. Z EtOH smo nadomestili tudi n-

pentan za vzorce olja. Posneli smo spektre vseh štirih vzorcev olj v EtOH s približno

koncentracijo 10 mg/mL (surovo in prečiščeno pridobljeno ter kupljeno). Posneli smo tudi

spektre vseh štirih vzorcev mošusov v EtOH s približno koncentracijo 5 mg/mL.

Koncentracija uporabljena za olja (10 mg/mL) se je izkazala za ustrezno, saj so bili

kromatografski vrhovi dobro ločeni in zadosti visoki. Odločili smo se, da bomo enako

koncentracijo uporabili tudi za kvantitativno analizo olj. Odzivi za vzorce mošusa s

koncentracijo 5 mg/mL niso bili zadosti visoki, pojavile pa so se tudi zelo velike

nepričakovane razlike med samimi vzorci. Odziv za določeno spojino, ki se je sicer

pojavila v vseh štirih vzorcih, se je med vzorci razlikoval tudi za faktor 3 in več. Takih

odstopanj glede na predhodno kvalitativno analizo vzorcev olj, kjer takih razlik ni bilo,

nismo pričakovali. Koncentracijo smo povečali na 10 mg/mL, a tudi ta še ni dala zadostnih

odzivov, še vedno pa so bile prisotne razlike med vzorci, tudi pri spojinah, kjer pri nižji

koncentraciji razlik ni bilo oziroma obratno. Koncentracijo smo povišali na 50 mg/mL in

vse vzorce pripravili v dveh paralelah. Dobljeni odzivi so bili pri tej koncentraciji zadosti

visoki, a so bile razlike med vzorci še vedno prisotne. Pojavile so se celo velike razlike

znotraj paralel istega vzorca. S tem smo potrdili svoje domneve, da vzrok za razlike ni bil

v sestavi vzorcev. Najverjetnejši vzrok za razlike je bila voda v vzorcih, ki je le-te med

pripravo za GC-MS analizo razredčila. Zaradi prisotne vode smo dejansko zatehtali manjše

količine vzorcev, kot smo želeli. Voda se je v obliki drobnih kapljic najverjetneje

37

dispergirala v umetni mošus med spiranjem in stresanjem vzorcev z vodo pri

odstranjevanju odvečne kisline.

Na isti koloni smo nato analizirali še združene vodne faze dobljene pri suhi destilaciji

jantarja, vodo, ki je skupaj z oljem destilirala med čiščenjem olja z vodno paro in sublimat,

ki je v hladilniku nastal med suho destilacijo. Sublimat smo raztopili v EtOH in v vodi s

koncentracijo 10 mg/mL. Kromatografski vrhovi vodnih frakcij so bili zelo razvlečeni,

prišlo pa je tudi do medsebojnih prekrivanj, zato ta kolona ni bila primerna za nadaljnjo

uporabo pri teh vzorcih.

5.5.1.1 Odstranjevanje vode iz umetnega mošusa

Zaradi neponovljivih kromatografskih odzivov v vzorcih umetnega mošusa smo morali

pred nadaljnjo analizo iz njih odstraniti vso vodo. Približno 300 mg umetnega mošusa iz

vsakega vzorca smo prenesli v mikroepruvete za centrifugiranje in jih centrifugirali 5

minut pri 10.000 rpm (8944 g). Po centrifugiranju so bile še vedno vidne drobne kapljice,

zato smo centrifugirali še 10 minut pri 15.000 rpm (20.124 g). Vodo smo s pomočjo

avtomatskih pipet odstranili in stehtali suhe produkte.

Mase vzorcev umetnih mošusov pred centrifugiranjem:

1. iz pridobljenega surovega olja: 300,3 mg

2. iz pridobljenega prečiščenega olja: 316,6 mg

3. iz kupljenega surovega olja: 320,7 mg

4. iz kupljenega prečiščenega olja: 315,2 mg

Mase vzorcev umetnih mošusov po centrifugiranju:

1. iz pridobljenega surovega olja: 248,5 mg

2. iz pridobljenega prečiščenega olja: 287,7 mg

3. iz kupljenega surovega olja: 251,4 mg

4. iz kupljenega prečiščenega olja: 274,7 mg

Masa vode v vzorcih (razlika med maso vzorca pred in po centrifugiranju):

1. 51,8 mg

2. 28,9 mg

3. 69,3 mg

4. 40,5 mg

38

Izračunali smo deleže vode v vzorcih in ugotovili celotne suhe mase posameznih vzorcev

umetnih mošusov.

delež vode: masa vode

masa vzorca pred centrifugiranjem × 100 %

Deleži vode v vzorcih:

1. 17,3 %

2. 9,13 %

3. 21,6 %

4. 12,9 %

suha masa vzorca: (1 – delež vode) × celotna masa umetnega mošusa (ugotovljena v

podpoglavju 5.4 Priprava umetnega mošusa)

Celotne mase suhih vzorcev umetnih mošusov:

1. iz pridobljenega surovega olja: 1,44 g

2. iz pridobljenega prečiščenega olja: 1,37 g

3. iz kupljenega surovega olja: 1,61 g

4. iz kupljenega prečiščenega olja: 1,38 g

Tudi po odstranitvi vode, je bilo produktov pri surovem olju več kot pri prečiščenem in

celokupno gledano jih je bilo še vedno več pri kupljenem olju. Delež vode je bil višji pri

mošusu iz surovega olja. Vzrok za to je bil lahko v že prej omenjeni razliki v konsistenci

med mošusom iz surovega in prečiščenega olja. Pri prečiščenem olju je bil mošus trši ter

bolj lepljiv in pri stresanju z vodo so zato vodne kapljice težje dispergirale v maso mošusa,

kot pri bolj mehkem, tekočem mošusu iz surovega olja.

39

5.5.2 Kvalitativna analiza na polarni koloni

Pred kvantitativno analizo vzorcev olj in mošusov smo se hoteli prepričati, da z uporabo

nepolarne kolone zaradi prekrivanja vrhov ne izgubimo katerega izmed njih. Vzorce smo

zato analizirali še na polarni koloni. Analizirali smo raztopine olja s približno

koncentracijo 10 mg/mL in raztopine mošusa s koncentracijo 50 mg/mL, vse v EtOH.

EtOH se je izkazal za neprimerno topilo, saj je njegov visok in širok vrh (tR ≅ 4 min)

prekril precej vrhov drugih spojin. EtOH je bil za uporabo kot topilo na tej koloni preveč

polaren in se je prepozno eluiral. Kot topilo smo zato uporabili n-heksan, ki pa je bil

primeren le za olja, saj mošus v njem ni bil topen. Mošus smo poizkusili raztopiti še v

dietiletru, v katerem pa se je tvorila netopna oborina, zato smo ga za analizo raztopili v

MeOH.

Na isti koloni smo nato analizirali še združene vodne frakcije dobljene pri suhi destilaciji

jantarja, vodo, ki je skupaj z oljem destilirala med čiščenjem olja z vodno paro in sublimat,

ki je v hladilniku nastal med suho destilacijo. Rezultate analiz vzorcev vodnih frakcij in

vode, ki je ostala po prečiščevanju olja, smo uporabili tudi za kvantitativno analizo. Da

bomo vodne frakcije kvantificirali na polarni koloni smo se odločili zato, ker so bili

kromatografski vrhovi teh frakcij na nepolarni koloni preveč razvlečeni, prišlo pa je tudi

do medsebojnih prekrivanj le-teh. Kvantifikacija iz takega kromatograma zato ne bi dala

pravilnih rezultatov. Vodne frakcije so namreč vsebovale veliko število polarnih spojin,

kot so alkoholi, ketoni, aldehidi in karboksilne kisline, ki jih v vzorcih jantarnega olja in

umetnega mošusa ni bilo. Z uporabo polarne kolone smo tako dosegli boljšo ločbo in s tem

omogočili pravilno kvantifikacijo vzorca. Slabost uporabe polarne kolone pa je bila, da

zanjo ni podatkovne knjižnica spojin, ki nam bi bila v pomoč pri potrjevanju identitet

posameznih spojin. Identitete izbranih spojin smo tako potrjevali izključno z uporabo

referenčnih spojin.

5.5.3 Primerjava rezultatov kvalitativnih analiz na nepolarni in polarni koloni

V tabeli VIII so podatki o številu prepoznanih spojin v posameznih vzorcih na nepolarni in

polarni koloni. Kot je razvidno že iz števila prepoznanih spojin v vzorcih smo imeli

opravka z zelo kompleksnimi vzorci, če pa bi zraven k temu številu dodali še število

zaznanih, a ne prepoznanih spojin bi se ta številka v večini primerov podvojila ali celo

potrojila.

40

Tabela VIII: Število prepoznanih spojin v vzorcih.

vzorec nepolarna kolona polarna kolona

pridobljeno surovo olje 167 156

pridobljeno prečiščeno olje 170 187

kupljeno surovo olje 130 156

kupljeno prečiščeno olje 139 179

mošus iz pridoblj. surovega olja 126 117

mošus iz pridoblj. prečišč. olja 140 118

mošus iz kuplj. surovega olja 79 95

mošus iz kuplj. prečišč. olja 126 123

vodne faze suhe destilacije 86 176

voda po čiščenju pridoblj. olja 64 95

voda po čiščenju kuplj. olja 35 57

Pri analizi jantarnega olja in umetnega mošusa se v povprečju število prepoznanih spojin ni

bistveno razlikovalo med nepolarno in polarno kolono. Za kvantitativno analizo olja in

mošusa smo izbrali nepolarno kolono, saj smo imeli dostop do podatkovne knjižnice spojin

analiziranih na enaki koloni (FFNSC), kar je bilo v veliko pomoč pri ugotavljanju

identitete spojin. Nepolarna kolona je tudi temperaturno bolj obstojna od polarne, kjer

pogosto pride do tako imenovanega »bleedinga« oziroma odpuščanja komponent SF s

kolone. Za kvantitativno analizo vodnih faz pa smo iz že prej omenjenih razlogov (zlasti

boljša ločba), kljub mnogim pomanjkljivostim (ni baz podatkov, slabša temperaturna

obstojnost) izbrali polarno kolono. Pri vodnih fazah je bila vidna velika razlika v številu

prepoznanih spojin v korist polarne kolone pri vseh vzorcih. Zaradi velikega števila

polarnih spojin v vodnih fazah je namreč prišlo do medsebojnega prekrivanja vrhov na

nepolarni koloni, kar se je odražalo v manjšem številu prepoznanih vrhov.

5.5.4 Analiza sublimata

Raztopino sublimata s koncentracijo 10 mg/mL smo kljub velikem vrhu EtOH na polarni

koloni najprej pripravili v njem, saj smo predvidevali, da ta iskanega vrha ne bo prekril.

Sublimat naj bi namreč po literaturnih podatkih bila čista jantarna (sukcinska) kislina (17,

41

20, 24). V kromatogramu sublimata na polarni koloni v EtOH (Priloga 14) je prevladoval

le en vrh, in sicer vrh etilhidrogensukcinata, drugi vrhovi pa so bili zanemarljivi. Vrha

jantarne kisline v vzorcu sploh ni bilo. Sublimat smo zato raztopili še v vodi (koncentracija

10 mg/mL) in analizo ponovili. Tokrat v kromatogramu ni bilo nobenega izrazitega vrha.

Iskana kislina je bila bodisi preveč težko hlapna in na kolono sploh ni prišla, bodisi je

preveč polarna in se zaradi močne vezave v času analize ni sprala s SF.

Sublimat smo analizirali še na nepolarni koloni. V EtOH vzorcu (Priloga 12) smo poleg

etilhidrogensukcinata našli še izrazit vrh anhidrida jantarne kisline. Vrha jantarne kisline v

vzorcu ni bilo. V vodnem vzorcu (Priloga 13) pa smo našli le zelo razpotegnjen vrh

jantarne kisline. Podoben razpotegnjen vrh pri primerljivih tR je bil prisoten tudi v EtOH

vzorcu takoj za vrhom etilhidrogensukcinata, a ga računalniški program ni prepoznal kot

jantarno kislino, zato identitete nismo mogli potrditi.

Iz dobljenih rezultatov smo sklepali, da je bil sublimat dobljen pri suhi destilaciji jantarja

anhidrid jantarne kisline. Njegova prisotnost v vzorcu je bila namreč lahko le posledica

nastanka med suho destilacijo. Pogoji za njegov nastanek iz jantarne kisline »in-situ« v

GC-MS namreč niso bili doseženi (za nastanek so potrebni dodatni reagenti). Domneve o

sestavi sublimata smo potrdili tudi s podrobnejšim pregledom in primerjavo posameznih

kromatogramov. Na kromatogramih vodnih vzorcev je bila na nepolarni koloni vidna samo

jantarna kislina, na polarni pa ni bilo izrazitih vrhov. Anhidridi v vodi namreč zlahka

hidrolizirajo v kisline iz katerih so sestavljeni. Na polarni koloni kislina ni bila vidna

zaradi prevelike polarnosti oziroma preslabe hlapnosti. V EtOH vzorcih pa smo opazili

visok vrh etilnega estra jantarne kisline, ki je zaradi velike reaktivnosti anhidrida in

prisotnosti EtOH kot topila nastal »in-situ«. Reakcija estrenja iz jantarne kisline in EtOH

bi namreč brez dodatnih reagentov potekla veliko težje in verjetno v veliko manjšem

obsegu kot iz reaktivnejšega anhidrida.

Zgornje ugotovitve niso bile v skladu z literaturnimi podatki o sestavi sublimata, saj naj bi

bil sestavljen iz čiste jantarne kisline. Vendar pa tudi ti podatki o identiteti sublimata niso

bili popolnoma napačni. Vsi avtorji, ki so sublimat uporabljali v medicinske namene so le-

tega namreč najprej prečistili, da so odstranili nečistote in vse sledi olja. Večinoma so za

čiščenje sublimata uporabili postopek prekristalizacije iz vode (17, 20, 24). S tem so se res

znebili vseh prisotnih nečistot, a so nevede tudi sprožili hidrolizo anhidrida jantarne kisline

42

v jantarno kislino. Avtorji so torej pravilno ugotovili identiteto jantarne kisline, napačno je

bilo le njihovo sklepanje, da kislina nastaja že med postopkom suhe destilacije.

5.6 Kvantitativna GC-MS analiza produktov

V tabelah IX, X in XI so podani rezultati kvantitativnih analiz pridobljenih produktov.

Jantarno olje (Tabela IX) in umetni mošus (Tabela X) smo kvantificirali na nepolarni

koloni, vodne frakcije suhe destilacije in vodo, ki je ostala po čiščenju surovega olja

(Tabela XI), pa na polarni koloni. Spojine so razvrščene glede na naraščajoč retencijski

indeks (RI), referenčni RI za spojine na nepolarni koloni so iz knjižnic FFNSC in NIST ter

spletne podatkovne zbirke Pherobase (39). Za polarno kolono referenčnih RI ni na voljo.

Koncentracije, ki so podane za olje in mošus, so povprečje meritev dveh vzorcev,

koncentracije pri vodnih fazah pa so podane na podlagi zgolj ene meritve. Pri analizi

vodnih faz smo namreč imeli težave z detekcijo in integracijo posameznih vrhov, ker so

bile v vzorcih prisotne zelo visoke koncentracije nižjih alifatskih karboksilnih kislin. Ta

problem je bil najbolj izrazit pri vzorcu združenih vodnih frakcij suhe destilacije. Največja

težava je bila pri etanojski kislini, ki je imela celo do desetkrat višjo intenziteto vrha, kot

druge spojine v kromatogramu. Vrh kisline, ki je bil na bazni liniji tudi zelo širok, je na

svoji desni strani zamaknil celoten kromatogram v območje višjih tR . Računalniški

program, ki je spojine kvantificiral na podlagi referenčnih spojin z znano koncentracijo,

zato teh spojin ni uspešno prepoznal, saj so se njihovi tR razlikovali od tistih za referenčne

spojine. Tako je pogosto prihajalo do izračuna prenizkih koncentracij, ker je program del

vrha odrezal ali pa vrh sploh ni bil zaznan. Rezultati se niso izboljšali niti s prilagajanjem

različnih parametrov integracije vrhov. Pri vzorcih vod, ostalih po čiščenju surovega olja,

težava sicer ni bila tako izrazita kot pri združenih vodnih frakcijah suhe destilacije, a je še

vedno prihajalo do izračuna napačnih koncentracij. Koncentracije spojin v vseh vodnih

fazah smo zato izračunali ročno.

koncentracija: površina vrha spojine v vzorcu

površina vrha referenčne spojine* × koncentracija [ppm]*

* uporabimo tisto koncetracijo, pri kateri je vrh referenčne spojine po višini najbolj primerljiv z

višino vrha spojine v vzorcu

Kromatogrami posameznih vzorcev olj, mošusov in vodnih faz so v prilogah 1-11.

43

5.6.1 Jantarno olje

Tabela IX: Rezultati kvantitativne analize vzorcev jantarnega olja, spojine v visokih koncentracijah so v krepkem tisku.

koncentracija [ppm]

ime spojine RI (izmer., nepol.

kolona)

RI (ref., nepol.

kolona)

RI (izmer., pol.

kolona)

pridobljeno surovo

olje

pridobljeno

prečiščeno olje kupljeno surovo olje

kupljeno prečiščeno

olje

toluen 760 763 1101 58,5 113 17,2 33,1

etilbenzen 856 857 1168 3,93 3,94 7,32 16,1

m-ksilen 865 867 1174 103 184 44,7 94,0

p-ksilen 867 883 1180 10,9 17,3 15,9 8,07

o-ksilen 889 896 1216 29,8 51,4 15,7 31,6

kumen 919 922 1251 18,0 28,5 11,4 21,0

α-pinen 929 933 1057 4,75 4,53 3,94 4,39

kamfen 946 953 1115 691 1197 228 558

mezitilen 966 994 1298 6,40 12,6 3,10 6,20

1,2,3-trimetilbenzen 991 996 1347 6,30 28,1 16,8 27,2

1,2,4-trimetilbenzen 1017 1023 1281 50,6 151 31,0 53,7

o-cimen 1018 1020 1288 59,0 97,1 30,6 66,1

m-cimen 1023 1023 1289 312 528 148 346

limonen 1028 1030 1226 45,2 72,9 26,3 50,7

evkaliptol 1030 1032 1232 40,7 62,5 26,2 50,2

p-cimen 1033 1027 1317 119 202 87,1 201

fenhol 1117 1123 1584 233 384 71,0 154

kafra 1144 1149 1507 273 434 88,6 192

borneol 1169 1173 1697 254 422 29,1 67,5

naftalen 1180 1188 1731 14,7 17,0 23,0 35,8

etil-4-metilbenzoat 1286 / 1787 58,5 56,4 54,4 62,7

2-metilnaftalen 1291 1281 1841 23,8 23,8 28,4 33,5

1-metilnaftalen 1306 1298 1876 33,8 36,0 43,5 54,2

β-damaskon 1407 1409 1810 16,0 16,3 16,4 16,8

44

Sestava jantarnega olja je zelo kompleksna, zaznali smo med 250 in 300 različnih spojin.

Pri pridobljenem jantarnem olju smo opazili, da so bile koncentracije praktično vseh

kvantificiranih spojin višje v prečiščenem olju. Edini izjemi sta bili etil-4-metilbenzoat in

α-pinen, vendar je bila razlika v koncentracijah majhna. Razlika koncentracij pri α-pinenu

je bila 0,220 ppm, pri etil-4-metilbenzoatu pa 2,10 ppm. Točnosti izračunane

koncentracije α-pinena nismo mogli potrditi, saj v kromatogramu ni bilo izrazitega vrha za

to spojino, računalniški program pa je kot možen vrh za to spojino na izbiro ponudil več

kot enega. Identitete α-pinena nismo uspeli potrditi niti z referenčno spojino. Podobne

težave so se pojavile tudi pri mezitilenu. Vrh, ki naj bi predstavljal mezitilen, je bil namreč

zelo nizek in se je pri bazni liniji stikal z več podobnimi sosednjimi vrhovi. Računalniški

program je zato lahko za izračun koncentracije vzel katerega od sosednjih vrhov. Identitete

mezitilena pa prav tako nismo mogli potrditi z referenčno spojino. Enak problem se je

pojavil tudi pri β-damaskonu, ki se je ravno tako stikal z več podobnimi sosednjimi vrhovi.

Izračuna koncentracije tudi tukaj zaradi zgoraj omenjenih razlogov nismo mogli potrditi.

Za kupljeno jantarno olje je veljalo enako, kot za pridobljeno olje. Koncentracije vseh

spojin z izjemo p-ksilena so bile višje v prečiščenem olju. Pri p-ksilenu je bila razlika

velika (7,83 ppm), kar je skoraj polovica koncentracije v surovem olju (15,9 ppm). Tudi v

tem primeru nismo mogli biti prepričani v točnost izračuna, saj je bil vrh p-ksilena zelo

neizrazit in zlit z veliko višjim vrhom m-ksilena.

Pri primerjavi pridobljenega in kupljenega olja smo opazili, da so bile višje koncentracije

skoraj vseh kvantificiranih spojin, tako v surovem, kot tudi v prečiščenem olju, prisotne v

pridobljenem olju. Izjeme so bile le naslednje spojine: 1-metilnaftalen, 2-metilnaftalen in

naftalen. Obraten trend smo opazili pri nekvantificiranih spojinah pri tR višjih od 35 min.

Tu so bili vrhovi pri kupljenem olju številčnejši in višji, sploh pri prečiščenem kupljenem

olju v primerjavi s pridobljenim prečiščenim oljem. Razlika je bila lahko posledica

drugačnih postopkov in pogojev za pridobivanje olja. Pri kupljenem olju je postopek

verjetno potekal v industrijskem merilu pri višji temperaturi in daljši čas, kar se je v

končnem izdelku pokazalo v višjih koncentracijah težje hlapnih spojin.

45

5.6.2 Umetni mošus

Tabela X: Rezultati kvantitativne analize vzorcev umetnega mošusa, spojine v visokih koncentracijah so v krepkem tisku.

koncentracija [ppm]

ime spojine RI (izmer., nepol.

kolona)

RI (ref. nepol.

kolona)

RI (izmer., pol.

kolona)

pridobljeno surovo

olje*

pridobljeno

prečiščeno olje*

kupljeno surovo

olje*

kupljeno prečiščeno

olje*

etanojska kislina 593 600 1469 243 179 242 174

etilacetat 612 606 932 44,0 26,2 13,2 12,6

etilpropanoat 709 708 1008 14,0 6,38 4,11 3,43

1,1-dietoksietan 724 730 934 63,3 64,3 31,8 47,5

toluen 760 763 1101 95,1 102 22,2 37,4

etilbutirat 803 803 1082 6,75 5,28 5,81 4,35

etilbenzen 856 857 1168 14,3 19,2 6,37 13,6

m-ksilen 866 867 1174 21,2 35,0 8,28 10,4

p-ksilen 867 883 1180 1,57 1,73 0,670 1,37

o-ksilen 889 896 1216 15,1 22,6 7,14 9,60

kumen 921 922 1250 6,44 8,77 2,35 5,45

kamfen 946 953 1118 41,2 39,8 40,0 39,9

mezitilen 965 994 1299 3,42 3,34 3,30 3,34

pinan 975 971 1656 / / 1,05 /

o-cimen 1018 1020 1288 9,46 15,1 5,61 7,08

m-cimen 1022 1023 1290 5,56 7,28 4,13 5,04

p-cimen 1033 1027 1317 80,0 119 54,8 98,8

fenhon 1086 1090 1397 726 989 249 544

kafra 1144 1149 1507 1503 2102 400 851

2-nitrotoluen 1155 / 1776 223 268 80,7 188

4-nitrotoluen 1191 1212 1862 61,7 62,8 51,8 52,5

3-nitrotoluen 1210 / 1825 176 225 43,5 87,1

1-etil-2-nitrobenzen 1224 / 1818 40,6 44,9 34,4 43,9

46

koncentracija [ppm]

ime spojine RI (izmer., nepol.

kolona)

RI (ref. nepol.

kolona)

RI (izmer., pol.

kolona)

pridobljeno surovo

olje*

pridobljeno

prečiščeno olje*

kupljeno surovo

olje*

kupljeno prečiščeno

olje*

2-nitro-p-ksilen 1264 / 1911 85,8 108 47,1 78,2

3-nitro-o-ksilen 1279 / 1911 30,1 35,7 24,2 32,7

etil-4-metilbenzoat 1286 / 1785 218 328 68,6 169

2,4,6-trimetilbenzaldehid 1297 / 1976 7,39 7,40 7,41 7,41

1-etil-4-nitrobenzen 1309 / 1289 123 128 168 153

2,4,5-trimetilbenzaldehid 1316 / 1976 13,1 13,3 13,0 13,2

2-nitro-p-cimen 1411 / 2017 415 667 167 518

etil-p-anisat 1446 1426 2130 23,5 23,8 23,3 23,1

1-nitronaftalen 1595 1600 2556 73,2 72,2 95,1 116

2-metil-1-nitronaftalen 1618 1626 2509 31,4 32,3 39,1 56,5

1,3,5-trimetil-2-

nitrobenzen 1816 / 3108 63,3 62,2 63,1 63,1

* olje iz katerega je bil pripravljen umetni mošus

47

Sestava umetnega mošusa je še bolj kompleksna kot sestava olja, zaznali smo več kot 400

različnih spojin. Pri umetnem mošusu iz pridobljenega olja smo enako kot pri samem olju

opazili, da je večina koncentracij kvantificiranih spojin višja v mošusu iz prečiščenega

olja. Izjeme, pri katerih je bila veliko višja koncentracija spojine v mošusu iz surovega

olja, so bile: etanjoska kislina, etilacetat in etilpropanoat. Pri drugih izjemah so bile razlike

zelo majhne. Spojine, za katere zaradi neizrazitega vrha in množice podobnih sosednjih

vrhov nismo mogli potrditi točnosti izračunane koncentracije so bile etil-p-anisat,

etilbutirat, pinan in 2,4,5-trimetilbenzaldehid. Po primerjavi kromatogramov vzorcev in

kromatograma referenčnih spojin smo ugotovili, da zgoraj omenjenih spojin, razen

etilbutirata, v vzorcih najverjetneje sploh ni bilo, računalniški program pa je za izračun

koncentracij upošteval katerega od podobnih sosednjih vrhov. Tudi v mošusu iz

kupljenega olja je bila večina koncentracij višja pri prečiščenem olju. Izjeme so bile tako

kot pri pridobljenem olju etanojska kislina, etilacetat in etilpropanoat.

Pri medsebojni primerjavi mošusov iz pridobljenega in kupljenega olja smo opazili, da so

bile koncentracije praktično vseh spojin višje pri pridobljenem olju. Ta ugotovitev je držala

tako za surovo, kot tudi za prečiščeno olje. Obraten trend se je, tako kot pri olju, pojavil pri

spojinah s tR višjimi od približno 33 min (naprej od 1-etil-4-nitrobenzena). Edina izjema je

bil 2-nitro-p-cimen, ki je bil v veliko višjih koncentracijah še vedno prisoten v mošusu iz

obeh pridobljenih olj. Zelo velika razlika med mošusom iz pridobljenega in kupljenega olja

pa se je ponovno pojavila v območju nekvantificiranih spojin z visokimi tR. Vrhovi pri

kupljenem olju so bili ponovno številčnejši in višji, kar je lahko, kot smo omenili že pri

olju, posledica drugačnega načina pridobivanja olja.

Poiskali smo tudi spojine, ki smo jih kvantificirali tako v vzorcih olja, kot tudi v vzorcih

mošusa. Koncentracij v vzorcih olj in mošusov med seboj nismo mogli neposredno

primerjati, saj smo mošuse analizirali v petkrat višji koncentraciji kot olja. Prva izmed

takih spojin je bila toluen. V mošusih smo našli čisti toluen, del pa se ga je seveda pretvoril

v nitrotoluene. Koncentracije vseh treh (o-, m- in p-nitrotoluena) so bile precej visoke, o-

in m-toluena je bilo celo veliko več kot preostalega čistega toluena. Odkrili smo tudi

etilbenzen in, v višjih koncentracijah od čistega, tudi dva možna produkta nitriranja le-

tega, 1-etil-2-nitrobenzen in 1-etil-4-nitrobenzen. Naslednji so bili ksileni. V mošusih smo

našli tudi visoke koncentracije dveh najverjetnejših produktov njihovega nitriranja, to sta

2-nitro-p-ksilen in 3-nitro-o-ksilen. V oljih in mošusih je bil prisoten tudi kumen, a v

48

mošusih njegovih predvidenih nitro produktov nismo odkrili. Kamfena, ki ga je bilo v oljih

celo do 1197 ppm (pridobljeno prečiščeno olje), je bilo v mošusih mnogo manj. Možen

vzrok za to je bila lahko preureditvena reakcija kamfena v (izo)borneol in dalje oksidacija

(izo)borneola v kafro zaradi delovanja HNO3. Kafre je bilo v vseh mošusih zelo veliko, v

mošusu iz pridobljenega prečiščenega olja celo 2102 ppm, kar bi lahko potrdilo našo

hipotezo o pretvorbi kamfena. Naslednji so bili cimeni. V mošusih smo našli visoko

koncentracijo le enega od verjetnih produktov nitriranja cimenov, 2-nitro-p-cimen. V oljih

in mošusih pa smo našli še etil-4-metilbenzoat in mezitilen, za katerega pa prisotnosti v

oljih nismo mogli z gotovostjo potrditi.

V olju smo nato poskušali poiskati še druge spojine, ki so se pod vplivom HNO3 lahko

pretvorile v drugačne produkte. Odkrili smo do 384 ppm fenhola, ki se je lahko oksidiral

do fenhona. Tega smo v velikih koncentracijah res našli v vzorcih mošusa. V oljih smo

našli tudi do 35,8 ppm naftalena, ki ga v mošusih ni bilo več, saj se je najverjetneje

pretvoril v 1-nitronaftalen, ki smo ga odkrili v mošusih. V oljih sta bila prisotna tudi 1-

metilnaftalen in 2-metilnaftalen, a smo v mošusih odkrili le 2-metil-1-nitronaftalen. Zadnji

odkrit in kvantificiran nitro produkt v mošusih pa je bil 1,3,5-trimetil-2-nitrobenzen, ki je

lahko nastal iz mezitilena.

V umetnem mošusu nismo našli niti enega večkrat substituiranega nitro produkta, le

monosubstituirane produkte nekaterih izhodnih spojin iz jantarnega olja. Prisotnih je bilo

tudi nekaj oksidiranih produktov, ki smo jih lahko povezali z njihovimi izhodnimi

spojinami v olju. Reakcije oksidacije so potekle v veliko večjem obsegu kot nitriranje, saj

izhodnih spojin iz olja v mošusu nismo več odkrili, pri nitriranju pa so bile v mošusu še

vedno prisotne.

Spojine, ki sicer sodijo v skupini tako imenovanih nitro mošusov so derivati benzena

substituirani z alkilnimi, keto ali metoksi skupinami z vsaj dvema, ponavadi pa celo tremi

nitro skupinami in terc-butilno skupino. Podobnih spojin, vsaj v zadostnih koncentracijah,

da bi bile vidne na kromatogramu, v vzorcih nismo odkrili. Strukturno se je nitro mošusom

še najbolj približal 2-nitro-p-cimen. Tudi vonj dobljenega mošusa je najbolj spominjal na

vonj čistega referenčnega 2-nitro-p-cimena. Za vonj po mošusu pa so bili lahko odgovorni

tudi ostali mono nitro substituirani derivati benzena in naftalena, lahko pa tudi alkilirani

benzaldehidi. V vzorcu smo v nizki koncentraciji našli le 2,4,6-trimetilbenzaldehid,

prisotnosti 2,4,5-trimetilbenzaldehida pa nismo mogli z gotovostjo potrditi.

49

5.6.3 Vodne faze

Tabela XI: Rezultati kvantitativne analize vzorcev vodnih frakcij suhe destilacije in vode,

ki je ostala po čiščenju jantarnega olja, spojine v visokih koncentracijah so v krepkem

tisku.

koncentracija [ppm]

ime spojine RI (izmer., pol.

kolona)

združene vodne

frakcije suhe

destilacije

voda po čiščenju

pridobljenega olja

voda po čiščenju

kupljenega olja

acetaldehid 753 1333 18,2 1,86

aceton 881 5394 300 26,0

metilacetat 899 339 42,1 /

2-butanon 960 593 109 3,49

2-pentanon 1036 102 43,9 2,23

2,3-butandion 1041 143 8,65 /

acetonitril 1066 41,9 1,74 /

toluen 1101 39,4 11,3 0,850

kamfen 1114 268 151 /

p-ksilen 1179 25,6 7,65 /

1-butanol 1190 19,3 2,07 /

ciklopentanon 1215 423 108 10,6

evkaliptol 1230 19,4 11,0 7,00

3-metil-1-butanol 1242 46,1 11,6 /

o-cimen 1288 99,0 29,9 12,6

m-cimen 1290 40,4 / /

cikloheksanon 1302 227 22,5 1,77

3-hidroksibutanon 1305 145 / /

p-cimen 1315 / 33,4 /

hidroksiaceton 1319 207 / /

2-ciklopenten-1-on 1364 410 39,4 1,05

fenhon 1397 9,82 6,66 2,27

2-cikloheksen-1-on 1434 410 70,1 18,6

etanojska kislina 1463 31142 209 121

kafra 1507 132 71,4 39,8

3-metil-2-ciklopenten-1-on 1513 337 38,6 11,2

propanojska kislina 1548 21125 1008 705

2-metilpropanojska kislina 1579 1190 272 126

fenhol 1583 110 72,2 41,5

butanojska kislina 1637 1351 248 103

2-propenojska kislina 1653 231 / /

izoborneol 1664 67,9 / /

3-metilbutanojska kislina 1678 867 327 277

borneol 1697 188 120 33,1

pentanojska kislina 1746 129 69,1 31,3

krotonska kislina 1782 412 18,95 /

heksanojska kislina 1852 37,4 28,4 15,7

50

koncentracija [ppm]

ime spojine RI (izmer., pol.

kolona)

združene vodne

frakcije suhe

destilacije

voda po čiščenju

pridobljenega olja

voda po čiščenju

kupljenega olja

2-metoksifenol 1860 157 72,8 10,3

N-metilsukcinimid 1901 423 / /

1,4-cikloheksanon 1933 164 0,760 0,750

2-metoksi-4-metilfenol 1955 33,1 12,9 4,07

fenol 2009 641 162 50,7

2-etilfenol 2079 0,540 0,500 0,130

4-metilfenol 2086 142 83,6 27,0

3-metilfenol 2093 92,6 79,1 27,2

4-etilfenol 2178 / 8,63 2,92

3-etilfenol 2185 / 4,34 1,89

metilhidrogensukcinat 2354 1192 / /

benzojska kislina 2437 39,3 / /

sukcinimid 2466 656 / /

2-metil-1,3-ciklopentandion 2694 68,7 / /

V združenih vodnih frakcijah suhe destilacije smo našli visoke koncentracije acetaldehida,

mnogih enostavnih alifatskih ketonov in karboksilnih kislin ter nekaterih alkoholov. Ti

rezultati so se ujemali z literaturnimi podatki, ki govorijo o nastajanju kisle vodene

tekočine v začetni fazi suhe destilacije jantarja. V tem kislem likvorju naj bi bili ocetna ter

jantarna kislina in amonijak (24). Prisotnost zelo visoke koncentracije ocetne kisline smo z

analizo potrdili, jantarne kisline pa v vzorcu ni bilo. Odkrili smo le visoke koncentracije

sukcinimida, N-metilsukcinimida in metilhidrogensukcinata, ki so lahko nastali iz jantarne

kisline. V vzorcu smo našli tudi nekaj spojin, ki so bile prisotne že v pridobljenem

surovem olju. To so bile borneol, evkaliptol, fenhol, kafra, kamfen, p-ksilen, o- in p-cimen

ter toluen.

Pri primerjavi vzorcev vod, ki sta ostali po čiščenju surovih olj smo opazili, da je bila

koncentracija čisto vseh kvantificiranih spojin višja v vodi, s katero smo prečistili

pridobljeno surovo olje. Take rezultate smo tudi pričakovali, saj so bile koncentracije

skoraj vseh kvantificiranih spojin višje tudi v samem pridobljenem olju kot v kupljenem. V

nobenem od vzorcev pa nismo našli artefaktov jantarne kisline. Teh ni bilo niti v vzorcih

olja in mošusa, pojavili so se le v združenih vodnih frakcijah in v sublimatu.

51

6 SKLEP

V sodobni literaturi člankov, v katerih bi avtorji pripravili jantarno olje in umetni mošus ter

raziskali njuno sestavo, nismo odkrili. Edini članki, ki so se dotikali te tematike so bili

nekateri ruski članki iz 60. let prejšnjega stoletja, do katerih pa nismo imeli dostopa.

Referenčnih podatkov, na katere bi se lahko oprli, tako nismo imeli, za edino primerjavo

nam je služilo industrijsko pridelano surovo jantarno olje, katerega smo obdelali po enakih

postopkih kot izolirano olje.

Videz jantarnega olja, ki smo ga izolirali, se ni popolnoma ujemal z literaturnimi podatki,

kar je bila verjetno posledica prirejenega postopka suhe destilacije, zaradi česar nismo

uspeli doseči dovolj visokih temperatur, pri katerih bi jantar popolnoma destiliral. Da bi

dobili gosto, temnorjavo olje bi se morali držati nespremenjenega postopka izolacije v

železni retorti z gretjem na večjem odprtem ognjišču. V retorti so bile zagotovo dosežene

višje temperature in tudi pot destiliranih par do vratu, kjer so kondenzirale, je bila mnogo

krajša. Tudi izpleni destilacij so bili zaradi spremembe postopka zelo nizki (5,48 %, v

primerjavi z literaturnimi 25-52 %). Izolirano olje pa je bilo po videzu in sestavi zelo

podobno kupljenemu. V njem so prevladovali terpeni (kamfen), terpenoidi (borneol,

fenhol, kafra) in aromati (alkilnaftaleni, p-cimen, ksileni, toluen, trimetilbenzeni). Sestava

olja je zelo kompleksna, saj smo v njem zaznali med 250 in 300 različnih spojin.

Izpleni čiščenja surovega olja z destilacijo z vodno paro (71,3 % in 44,8 %) so bili

primerljivi z literaturnimi podatki (65-70 %). Pri tem postopku zamenjava retorte z bučko

in hladilnikom ter uporaba grelne plošče ni imela velikega vpliva na rezultat dela. Nižji

izplen smo dobili pri kupljenem surovem olju. Predviden vzrok za to je bila prisotnost

višjih koncentracij težko hlapnih spojin v tem olju v primerjavi s pridobljenim. Domneve

smo z GC-MS analizo po primerjavi kromatogramov potrdili, saj je bilo v območju visokih

tR res veliko več višjih vrhov, najverjetneje težko hlapnih spojin pri kupljenem olju.

Umetni mošus smo pripravili s kadečo HNO3, ker koncentrirana 65-odstotna kislina brez

dodatnega segrevanja zmesi ni bila dovolj močna za potek reakcije. Vonja po kislini se z

mošusa zgolj s spiranjem s hladno vodo nismo uspeli znebiti. Da bi to dosegli, bi lahko

mošus sprali še z nizko koncentrirano raztopino šibke baze, s katero bi nevtralizirali

odvečno kislino, in nato mošus ponovno sprali s čisto vodo. V umetnem mošusu smo

odkrili veliko nitroaromatov (nitrotolueni, nitroksileni, nitrocimen, nitroalkilnaftaleni), ki

so nastali z nitriranjem spojin, prisotnih v olju. Pogosti so bili tudi oksidirani produkti

52

izhodnih spojin iz olja (fenhon, trimetilbenzaldehidi). Večkrat substituiranih nitroaromatov

v mošusu nismo našli, saj sama HNO3 brez dodatnih reagentov oziroma katalizatorjev ni

bila dovolj za uvedbo več kot ene nitro skupine. Za primerjavo bi bilo zanimivo izvesti

nitriranje jantarnega olja v zmesi dušikove in žveplove kisline, kar je sicer standardni

postopek za nitriranje aromatov. Sestava umetnega mošusa je izredno kompleksna, v njem

smo zaznali več kot 400 različnih spojin, kar je bistveno več kot v olju.

Analizirali smo tudi sublimat, ki je nastajal med suho destilacijo. Ovrgli smo zmotno

prepričanje, da je sublimat sestavljen iz jantarne kisline in dokazali, da gre v resnici za

anhidrid jantarne kisline.

Pri analizi vodne frakcije suhe destilacije smo potrdili prisotnost visoke koncentracije

etanojske kisline, ovrgli pa informacije o prisotnosti čiste jantarne kisline. Odkrili smo

sukcinimid, N-metilsukcinimid in metilhidrogensukcinat, ki so najverjetneje nastali iz

jantarne kisline med suho destilacijo.

53

7 LITERATURA

1. Vavra N: The Chemistry of Amber – Facts, Findings and Opinions, Annalen des

Naturhistorischen Museums in Wien 111 A, 2009: 445-474.

2. Ward Aber S: World of Amber, Emporia State University, Kansas. Dostopno na

naslovu: http://academic.emporia.edu/abersusa/amber.htm (datum dostopa: 16. 4.

2015).

3. Szwedo J: Amber and amber inclusions of planthoppers, leafhoppers and their relatives

(Hemiptera, Archaeorrhyncha et Clypaeorrhyncha), Denisia 04,

zugleich Kataloge des OO. Landesmuseums, Neue Folge Nr. 176, 2002, 37-56.

4. Anderson K B, Crelling J C: Introduction, v: Amber, Resinite, and Fossil Resins

(urednika Anderson K B, Crelling J C), ACS Symposium Series Volume 617,

American Chemical Society, Washington, 1995: ix-xvii.

5. Brewer E C: Dictionary of phrase and fable, Henry Altemus Company, Philadelphia,

1898. Dostopno na naslovu: http://www.bartleby.com/81/5704.html (datum dostopa:

14. 5. 2015).

6. Causey F: Ancient Names for Amber, v: Ancient Carved Ambers in the J. Paul Getty

Museum, Getty Publications, Los Angeles, 2012. Dostopno na naslovu:

http://museumcatalogues.getty.edu/amber/contents/ (datum dostopa: 14. 5. 2015).

7. Harper D: Online Etymology Dictionary. Iskana beseda: »amber«. Dostopno na

naslovu: http://www.etymonline.com (datum dostopa: 14. 5. 2015).

8. Felter F W, Lloyd J U: King's American Dispensatory, 18. izdaja, Ohio Valley Co.,

Cincinnatti, 1898. Dostopno na naslovu: http://www.henriettes-

herb.com/eclectic/kings/ambra-flav.html (datum dostopa: 16. 4. 2015).

9. Causey F: The Properties of Amber, v: Ancient Carved Ambers in the J. Paul Getty

Museum, Getty Publications, Los Angeles, 2012. Dostopno na naslovu:

http://museumcatalogues.getty.edu/amber/contents/ (datum dostopa: 14. 5. 2015).

10. Ohloff G, Pickenhagen W, Kraft P: The Molecular World of Odors, Verlag Helvatica

Chimica Acta, Zürich in Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2012:

339-380.

11. Yang Q, Meng X, Xia L, Feng Z: Conservation status and causes of decline of musk

deer (Moschus spp.) in China, Biological Conservation 109, Elsevier Science Ltd.,

2003: 333-342.

54

12. Slika 2: Pižmar (Moschus moschiferus) in mošusna žleza, povzeto po:

http://herbaledu.blogspot.com/2014/08/kasthuri-kastuurii.html (datum dostopa: 20. 8.

2015).

13. Theimer E T: Fragrance Chemistry: The Science of the Sense of Smell, Academic

Press, Inc., New York, 1982: 495-496.

14. Agricola G: De Natura Fossilium (Textbook of Mineralogy), prevod originala iz leta

1546 (prevajalca Chance Bandy M, Bandy J A), Dover Publications, Inc., New York,

2004: 63-77.

15. Aurifaber A: Von des Börnsteins öel XII, v: Succini Historia, Königsberg, 1551.

16. Culpeper N: Pharmacopoeia Londinensis, Royal College of Physicians of London,

Cornhill, 1720: 257.

17. Lewis W: The New Dispensatory, J. Nourse, London, 1753: 299-301.

18. Lewis W: The Edinburgh New Dispensatory, Charles Elliot, Edinburgh, 1786: 501-

503.

19. Marggraf A S: Chymische Schriften, Arnold Weber, Berlin, 1761: 260-262.

20. Westrumb J F: Handbuch für die ersten Anfänger der Apothekerkunst, Gebrüdern

Hahn, Hannover, 1797: 663-668.

21. Arnemann J: Praktische Arzneymittelehre, Mit v. Ghelenschen Schriften, Dunaj, 1799:

272.

22. Bradley T, Willich A F M: The Medical and Physical Journal, G. Sidney, London,

1799: 181-182.

23. Williams S W: Artificial Musk, v: The Boston Medical and Surgical Journal (urednik

Smith J V C), D. Clapp, Boston, 1835: 13-15.

24. John J F: Naturgeschichte des Succins, oder des sogenannten Bernsteins, T. F. Thiriart,

Köln, 1813: 306-313.

25. Freiherr von Berzelius J J: Lehrbuch der Chemie (prevajalec Wöhler F.), Arnoldischen

Buchhandlung, Dresden, 1828: 1204-1207.

26. Elsner L: Chemische Untersuchung des Moschus artificialis und eines neuen, im

rectificirten Bernsteinöl aufgefunden Oeles (Succin – Eupion), v: Journal für praktische

Chemie (urednika Erdman Linee O, Marchand R F), Verlag von Johann Ambrosius

Barth, Leipzig, 1842: 97-106.

27. Long J: The Penny Cyclopaedia of the Society for the Diffusion of Useful Knowledge,

Charles Knight, London, 1840: 27.

55

28. Sawer J C: Odorographia a natural history of raw materials and drugs used in the

perfume industry intended to serve growers, manufacturers and consumers, Gurney &

Jackson, London, 1894: 456-457.

29. Faraday M: On new compounds of carbon and hydrogen, and on certain other products

obtained during the decomposition of oil by heat, v: Philosophical transactions of the

Royal society of London, London, 1825: 447.

30. Mitscherlich E: Ueber die Zusammensetzung des Nitrobenzids und Sulfonbenzids, v:

Annalen der Pharmacie 12, Heidelberg, 1834: 305-308.

31. Russell C A: Chemistry, Society and Environment: A New History of the British

Chemical Industry, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2000: 223.

32. Eagleson M: Concise Encyclopedia Chemistry, Walter de Gruyter & CO, Berlin, 1994:

240.

33. Krell E: Handbook of Laboratory Distillation, 2. Izdaja, Elsevier Scientific Publishing

Company, Berlin, 1982: 307-310.

34. McNair H M, Miller J M: Basic gas chromatography, John Wiley & Sons, Inc.,

Hoboken, New Jersey, 2009: 3-4, 9-12, 14-15, 156-169.

35. Slika 9: Shema plinskega kromatografa, povzeto po:

http://www.chromatographer.com/gas-chromatography/ (datum dostopa: 20. 8. 2015).

36. Slika 10: Shema masnega spektrometra, povzeto po:

http://chemistry.tutorvista.com/analytical-chemistry/biomolecules.html (datum

dostopa: 20. 8. 2015).

37. Iowa State University: Mass Spectrometry Tutorial. Dostopno na naslovu:

http://www.cif.iastate.edu/mass-spec/ms-tutorial (datum dostopa: 26. 7. 2015).

38. Gmelin L: Hand-book of Chemistry (prevajalec Watts H), Works of the Cavendish

Society, London, 1860: 323.

39. Kovats Retention index. Dostopno na naslovu:

http://www.pherobase.com/database/kovats (datum dostopa: 17. 3. 2015).

56

8 PRILOGE

Priloga 1: Kromatogram pridobljenega surovega jantarnega olja (nepolarna kolona, topilo

EtOH).

Priloga 2: Kromatogram pridobljenega prečiščenega jantarnega olja (nepolarna kolona,

topilo EtOH).

Priloga 3: Kromatogram kupljenega surovega jantarnega olja (nepolarna kolona, topilo

EtOH).

57

Priloga 4: Kromatogram kupljenega prečiščenega jantarnega olja (nepolarna kolona,

topilo EtOH).

Priloga 5: Kromatogram umetnega mošusa iz pridobljenega surovega olja (nepolarna

kolona, topilo EtOH).

Priloga 6: Kromatogram umetnega mošusa iz pridobljenega prečiščenega olja (nepolarna

kolona, topilo EtOH).

58

Priloga 7: Kromatogram umetnega mošusa iz kupljenega surovega olja (nepolarna kolona,

topilo EtOH).

Priloga 8: Kromatogram umetnega mošusa iz kupljenega prečiščenega olja (nepolarna

kolona, topilo EtOH).

Priloga 9: Kromatogram vodnih frakcij suhe destilacije jantarja (polarna kolona).

59

Priloga 10: Kromatogram vode, ki je ostala po čiščenju pridobljenega olja (polarna

kolona).

Priloga 11: Kromatogram vode, ki je ostala po čiščenju kupljenega olja (polarna kolona).

Priloga 12: Kromatogram sublimata (nepolarna kolona, topilo EtOH).

60

Priloga 13: Kromatogram sublimata (nepolarna kolona, topilo voda).

Priloga 14: Kromatogram sublimata (polarna kolona, topilo EtOH).

61

Priloga 15: Umeritvena premica na nepolarni koloni (etilbenzen).

Priloga 16: Umeritvena premica na polarni koloni (metilacetat).